DE3788229T3 - Verfahren zur isolierung von ca 125-antigen. - Google Patents
Verfahren zur isolierung von ca 125-antigen.Info
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Description
- CA 125 ist ein tumorassoziiertes Antigen, das bei über 80 % aller nichtmuzinigen Eierstockepitheltumore von serösen, endometrioiden, unbewachsenen und undifferenzierten Histologien exprimiert wird (Bast, R.C., Jr., et al., J. Clin. Invest., 69, S. 1331 - 1337, 1981; Kabawat, S.E., et al., Am. J. Clin. Pathol., 79, S. 98 - 104, 1983). Der mit CA 125 reagierende murine, monoklonale Antikörper OC 125 wurde durch Verwendung einer ausgebildeten, humanen, serösen Zystadenokarzinom-Zellinie, OVCA 433, erzeugt (Bast, R.C., Jr., et al., siehe oben). Die quantitative Bestimmung dieser Determinante im Serum von Patienten mit Ovarialkarzinom wurde durch die Entwicklung eines Radioimmunoassay (RIA) mit OC 125 möglich (Klug, T.L., et al., Cancer Res., 44, S. 1048 - 1053, 1984). Es wurde auch berichtet, daß die CA 125 Antigendeterminante auch in Frauenmilch (Hanisch, E.G., et al., Europ. J. Biochem., 149, S. 323 - 330, 1985), in normalem Zervikalschleim (de Bruijn, H.W.A., et al., Am. J. Obstet. Gynecol., im Druck) und in zentralem Luftweg- und normalem Lungengewebe gefunden wurde (Nouwen, E.J., et al., Cancer Res., 43, S. 866 - 876, 1986). Außerdem scheint eine CA 125 Aktivität in Humanspermaplasma zu existieren.
- Wie berichtet wurde, wird die CA 125 Determinante mit einem muzinartigen, hochmolekularen Glykoproteidkomplex assoziiert (siehe z.B. Hanisch, E.G., et al., Eur. J. Biochen., 149, S. 323 - 330, 1985; Niloff, J.M., et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 151, S. 981 - 986, 1986; Bast, R.C., et al., Ovarian Cancer, S. 23 - 35, Boston, MA; Martinus Nihoff, 1985; Masuho, Y., et al., Cancer Res., 44, S. 2813 - 2819, 1984; Bast, R.C., Jr., et al., Cancer Bull., 37, S. 80 - 81, 1985). Ein fehlendes Verfahren zur Isolierung des Antigens CA 125 hat jedoch die Analyse seiner chemischen Zusammensetzung behindert.
- Die vorliegende Erfindung betrifft eine Methode zur Isolierung des Antigens CA 125, die Herstellung des isolierten Antigens und Methoden zur Verwendung des isolierten Antigens.
- Das Antigen CA 125 kann in hoher Reinheit als eine 200 kDa Spezies aus Gewebekulturmedium von Ovarialkarzinomzellen isoliert werden, die das Antigen in das Kulturmedium 'ausschütten', z.B. die humane, seröse Zystadenokarzinom-Zellinie OVCA 433. Die nach dem hier beschriebenen Verfahren isolierte CA 125 Spezies ist dieselbe wie die CA 125 Spezies, die im Serum von Patienten mit nichtmuzinigem Ovarialkarzinom gefunden und durch elektrophoretische Auftrennung und Immunoblot bestimmt wurde.
- Entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der zellfreie Überstand aus einer Kultur humaner Ovarialkarzinomzellen gewonnen. Im ersten Schritt wird das Protein durch Säurebehandlung gefällt, z.B. mit Perchlorsäure (6 M), und das ausgefällte Protein wird entfernt. Die säurelösliche Fraktion mit der CA 125 Aktivität wird dann neutralisiert.
- Die CA 125 Aktivität in der säurelöslichen Fraktion wird mit einem hochmolekularen Komplex (1.000.000 Da) assoziiert. Im nächsten Schritt wird dann mit Hilfe der Molekülausschluß-Chromatographie diese hochmolekulare CA 125 Spezies von niedrigermolekularen Komponenten getrennt. Die säurelösliche Fraktion kann z.B. auf eine Säule aus Sepharose 4B-CL Gel aufgetragen werden. Sepharose 4B-CL hält Moleküle von ca. 60.000 - 2.000.000 Da zurück. Der CA 125 Komplex wird von dieser Säule in das Leervolumen (void volume) eluiert.
- Mit Hilfe eines chaotropen Mittels, z.B. Harnstoff (6 M), wird der durch Molekülausschluß-Chromatographie abgetrennte, hochmolekulare CA 125 Komplex gespalten. Das chaotrope Mittel kann der CA 125-haltigen Fraktion von der Sepharose 4B-CL Säule zugegeben werden. Das CA 125 Antigen wird dann in einem zweiten Molekülausschluß- Chromatographieschritt abgetrennt. Diese Säule wurde gewählt, um eine 200 kDa CA 125 Spezies, z.B. Sepharose 6 B Harz, zurückzuhalten. Die chromatographische Analyse wird mit einem Eluierungspuffer durchgeführt, der das chaotrope Mittel und ein Detergens, z.B. SDS, zur Stabilisierung des gespaltenen CA 125 Antigens enthält. Die zurückgehaltenen, CA 125-haltigen Fraktionen (bestimmt durch die Reaktivität mit OC 125 Antikörper) werden so wie sie von der Säule eluiert werden gesammelt. Das chaotrope Mittel wird von der angesammelten Fraktion entfernt, z.B. durch Dialyse.
- Im letzten Schritt der Isolierung wird das CA 125 mit dem Antikörper OC 125 immunogereinigt. Zu diesem Zweck wird eine immunoaffine Säule, die einen an ein Harz, z.B. Sepharose 4B, gekoppelten, immunoaktiven OC 125 enthält, verwendet.
- Das durch dieses Verfahren isolierte Antigen CA 125 hat ein Molekulargewicht von ca. 200 kDa und eine Dichte des Überstands von ca. 1,36 g/ml. Das Antigen besteht zu 24 Gew.-% aus Kohlehydrat. Die Antikörper-Bindungsaktivität (OC 125) ist labil gegenüber Wärme und Protease, aber unempfindlich gegenüber Exoglykosidase und Perjodat, was darauf hindeutet, daß die verwandte Determinante des OC 125 Antikörpers wahrscheinlich proteinhaltig ist.
- Das isolierte Antigen CA 125 kann zur Erhöhung poly- oder monoklonaler Antikörper, die mit CA 125 reagieren, verwendet werden. Anti-OC 125 Antikörper können für die Diagnose und/oder Therapie von Ovarialkarzinom, z.B. Tumorszintigraphie, passive Immunotherapie und Antitoxintherapie, eingesetzt werden. Ferner kann das isolierte Antigen CA 125 zur Auffindung des Anti-CA 125 Antikörpers, z.B. durch Solid-Phase-RIA oder ELISA, in Serum, Plasma oder anderen biologischen Flüssigkeiten von Patienten verwendet werden. Die Anwesenheit des Anti- CA 125 Antikörpers bei einem Patienten kann ein Hinweis auf das Bestehen oder Wiederaufflackern eines Ovarialkarzinoms sein.
- Abbildung 1 ist das Eluierungsprofil bei Sepharose CL-4B Säulenchromatographie des aus OVCA 433 Gewebekulturüberstand (O-O) und Humanserum ( - ) isolierten Antigens CA 125.
- Abbildung 2 zeigt den Dichtegradienten bei Ultrazentrifugierung im Anschluß an eine Sepharose CL-4B Säulenchromatographie des aus Humanserum ( - ) OVCA 433 Gewebekulturüberstand ( - ) und Frauenmilch ( - ) isolierten Antigens CA 125.
- Abbildung 3 zeigt eine SDS-PAGE Analyse von Antigen CA 125, das aus Frauenmilch/4B (200 Einheiten/Spur) (Spur 1), OVCA 433 Passage 69/4B (300 Einheiten/ Spur) (Spur 3), Humanovarialkarzinomseren/4B (100 - 200 Einheiten/Spur) (Spur 4 - 7) und einem negativen Kontrollserum/4B (23 Einheiten/Spur) (Spur 8) isoliert wurde.
- Abbildung 4 zeigt eine konventionelle SDS-PAGE Analyse (Gradient 3 - 12 %) eines aus OVCA 433 isolierten und anschließend durch Immunoblotting nachgewiesenen Antigens CA 125.
- Abbildung 5 A zeigt das Sepharose CL-6B Eluierungsprofil des aus OVCA 433 isolierten Antigens CA 125. Die Eluierung erfolgte in einem SDS-Harnstoff-Trispuffer im Anschluß an eine 30minütige Behandlung in Harnstoff (6 M) bei 45 ºC. Die Fraktionen wurden durch Solid-Phase-RIA auf CA 125 Aktivität untersucht.
- Abbildung 5 B zeigt die SDS-PAGE Analyse (6 %) entsprechender Fraktionen der Sepharose CL-6B Gelfiltration- Säulenchromatographie.
- Abbildung 6 zeigt den Dichtegradienten bei der Ultrazentrifugierung des Antigens CA 125, das im Anschluß an eine Teilreinigung auf einer Sepharose CL-4B Säule ( - ) und immunoaffine Reinigung auf einer immobilisierten OC 125-Protein A-Sepharose CL-4B gaschromatographischen Säule (O-O) aus OVCA 433 isoliert wurde.
- Das Verfahren zur Reinigung von CA 125 umfaßt im allgemeinen vier Schritte, die im folgenden beschrieben werden. Das Verfahren kann zur Isolierung von CA 125 aus Gewebekulturmedien, in denen sich Ovarialkarzinomzellen gebildet haben, verwendet werden. Die Zellen müssen natürlich Ovarialkarzinomzellen sein, die das Antigen exprimieren und es in das Kulturmedium 'ausschütten'. Das Verfahren kann auch zur Isolierung des Antigens aus biologischen Flüssigkeiten, z.B. Serum oder Aszites, verwendet werden. Da in diesen Flüssigkeiten jedoch nur geringe Mengen gefunden werden, sind sie im allgemeinen ungeeignet für die Gewinnung des zu reinigenden Antigens.
- Die bevorzugte Ovarialkarzinom-Zellinie ist die von Bast, R.J., Jr., et al. beschriebene OVCA 433 Zellinie (siehe oben). Andere geeignete Zellinien sind die Ovarialtumor- Zellinien NIH:OVCAR-3 (ATCC # HTB161), SK-OV-3 (ATCC # HTB77), CAOV-3 (ATCC # HTB75) und CAOV-4 (ATCC # HTB76). Bei Kultivierung in einem herkömmlichen Gewebemedium sondern diese Zellinien das Antigen CA 125 in das Medium ab. Das freigesetzte Antigen kann dann von dem Medium in einem vierstufigen Verfahren isoliert werden.
- Zellfreie Überstände werden einer Säurefällung unterzogen. Die bevorzugte Säure ist Perchlorsäure mit einer Endkonzentration von 0,6 M. Das ausgefällte Protein wird entfernt, und die säurelösliche Fraktion, in der die CA 125 Aktivität enthalten ist, wird neutralisiert, z.B. mit KOH. Die säurelösliche Fraktion kann dann gegen destilliertes Wasser dialysiert und konzentriert werden, z.B. auf das Zwanzigfache des ursprünglichen Volumens des Überstands.
- Zur Abtrennung des hochmolekularen CA 125 Komplexes von niedrigmolekularen Komponenten wird die säurelösliche Fraktion einer Molekülausschluß-Chromatographie unterzogen. Ein bevorzugtes Harz ist Sepharose CL-4B, das Moleküle im Bereich von 60 kD bis 2.000 kD zurückhält. Das Antigen CA 125 wird von dieser Säule in das Leervolumen eluiert. Das Antigen kann in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verwendet und eluiert werden.
- Die CA 125-haltige Fraktion wird mit einem chaotropen Mittel behandelt. Das chaotrope Mittel spaltet den hochmolekularen CA 125 Komplex. Harnstoff wird bevorzugt, aber Guanidin-HCl kann auch verwendet werden. Im Anschluß an die Harnstoffbehandlung erfolgt die chromatographische Analyse mit einem Harz, das Moleküle im Bereich von 200 kD zurückhält. Ein bevorzugtes Harz ist Sepharose CL-6B. Die Chromatographie an Sepharose CL-6B erfolgt mit einem Puffer, in dem das chaotrope Mittel enthalten ist, z.B. 6 M Harnstoff, und einem Detergens, z.B. 1 % SDS. Die eluierte Fraktion kann mittels CA 125-RIA auf ihre CA 125 Aktivität überprüft werden.
- Das Antigen CA 125 wird durch immunoaffine Chromatographie gereinigt. OC 125 wird an eine feste Phase gebunden, z.B. Protein A-Sepharose CL-4B Harz, und die antigenhaltige Fraktion aus dem vorangegangenen Gelfiltrationsschritt wird unter Bedingungen über das Harz geleitet, die es dem Antigen ermöglichen, sich spezifisch an die feste Phase zu binden. Das Antigen wird dann mit einem geeigneten Eluierungsmittel, z.B. Diethylamin, eluiert. Die bevorzugte immunoaffine Säule wird im wesentlichen nach den weiter unten beschriebenen Methoden von Schneider et al. hergestellt.
- OC 125 wird mit Hilfe des Kopplungsmittels Dimethylpimelimidat kovalent an Protein A-Sepharose gekoppelt. Durch diese Art der Kopplung wird die Aktivität des Antikörpers OC 125 nicht gestört. Gebundenes Antigen wird mit Diethylamin eluiert.
- In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Antigen CA 125 von überstehenden OVCA 433 Zellkulturen nach dem im folgenden beschriebenen Verfahren gereinigt.
- Zellkulturüberstände einer OVCA 433 Kultur werden von zusammenfließenden Einschichtkulturen gesammelt. Die Überstände werden zehnfach konzentriert und mit Perchlorsäure auf 0,6 M eingestellt. Ausgefälltes Protein wird entfernt. Die säurelösliche Fraktion wird neutralisiert und anschließend gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die CA 125 Reaktivität findet sich in der löslichen Fraktion wieder (95 %), während 80 % des Proteins entfernt werden.
- Die in Perchlorsäure lösliche Fraktion wird konzentriert und durch Gelfiltrationschromatographie fraktioniert (3,2 x 85 cm Säule aus Sepharose 4B-CL, equilibriert in phosphatgepufferter Kochsalzlösung). CA 125 Aktivität und A&sub2;&sub8;&sub0; werden für jede Fraktion bestimmt. Der größte Teil der CA 125 Aktivität wird im Leervolumen (Vo) eluiert, ein kleinerer Peak erscheint später. Dieses Profil weist auf die Anwesenheit einer hochmolekularen Komponente (> 1000 kDa) und einer kleineren Komponente (200 bis 400 kDa) hin. Die Vo-Fraktionen enthalten ca. 35 % der Anfangsreaktivität.
- Die Vo-Fraktion von der Sepharose 4B-CL Säule wird auf 6 M in Harnstoff eingestellt und dann auf einer 1,2 x 95 cm Sepharose 6B-CL Säule in 0,1 % SDS, 6 M Harnstoff, 50 mM Trispuffer-HCL, pH 8,0 eingesetzt. Die Fraktionen werden gesammelt und auf CA 125 Reaktivität untersucht. Die CA 125 Aktivität wird in zwei Peaks eluiert: Peak 1, eine kleine, hochmolekulare Komponente (> 1000 kDa) im Leervolumen und Peak 2, eine große, niedrigermolekulare Komponente (200 bis 400 kDa).
- Die Substanz in Peak 2 wird weiter durch immunoaffine Chromatographie gereinigt. Eine affine Säule wird durch kovalente Kopplung von OC 125 Antikörper mit einer Protein A-Sepharose 4B-CL Säule gemäß der Methode von Schneider et al. hergestellt. Die gepoolte Komponente von Peak 2, immer noch in 6 M Harnstoff und 0,1 % SDS, wird dreimal über die immunoaffine Säule geleitet. Nach dem Waschen wird das Antigen mit 50 mM Diethylamin (DEA), pH 11,5, eluiert. Das Eluat wird umgehend durch Sammeln in einem neutralisierenden Puffer neutralisiert und dann gegen destilliertes Wasser dialysiert.
- Bei jedem dieser Reinigungsschritte wurde die CA 125 Antigenaktivität durch Western Blots beurteilt. Die meiste Reaktivität aus dem Reinigungsschritt 1 (Perchlorsäure-Extraktion) hat ein sehr hohes Molekulargewicht (> 1000 kDa), während eine geringe oder gar keine Reaktivität im niedrigmolekularen Bereich gefunden wird (< 1000 kDa). Die Analyse des Peaks 2 aus dem Reinigungsschritt 3 deutet darauf hin, daß die meiste Reaktivität im 200 - 400 kDa Bereich liegt. Dies läßt vermuten, daß das 1000 kDa Antigen in eine kleinere Komponente zerfällt. Im Reinigungsschritt 4 schließlich weist die 200-400 kDa Komponente des von der immunoaffinen Säule eluierten Antigens keine erkennbare 1000 kDa Reaktivität auf.
- Zum Beweis dafür, daß die nach den Schritten 3 und 4 festgestellten 200 - 400 kDa Komponenten durch Zerfall der > 1000 kDa Substanz gebildet wurden, wurden mit und ohne Behandlung mit 6 M Harnstoff Western Blots an einem Perchlorsäure-Extrakt durchgeführt. Das unbehandelte Perchlorsäure-Extrakt hatte eine Hauptkomponente von 1000 kDa und eine kleine 200 - 400 kDa Komponente. Nach Behandlung mit 6 M Harnstoff (30 Minuten bei 45 ºC) wurde die meiste Reaktivität im Bereich von 200 bis 400 kDa festgestellt.
- Mit dem erfindungsgemäßen Isolierungsverfahren kann eine 3900-fache Reinigung, bezogen auf den ursprünglichen Überstand (bestimmt durch die Aktivität in Einheiten/mg Protein im Ausgangsmaterial gegenüber dem Endmaterial), erreicht werden. Die nach diesem Verfahren isolierte Antigenspezies CA 125 ist folgendermaßen gekennzeichnet:
- Sie hat ein Molekulargewicht von ca. 200 kDa. Sie enthält 24 % Kohlehydrat. Das Kohlehydrat besteht aus Speichelsäure, Fucose, Mannose, Galaktose, N-Acetylglukosamin und N-Acetylgalaktosamin im Verhältnis 3,6:0,4:3,0:6,6:5,8:2,2.
- Dieser Bereich der OC 125 Determinante scheint proteinhaltig zu sein (siehe nachfolgende Erläuterung).
- Die isolierte, immunoreaktive 200 kDa Spezies des Antigens CA 125 kann als Immunogenpräparat zur Erhöhung des Anti-CA 125 Antikörpers verwendet werden. Monoklonale Anti-CA 125 Antikörper können zum Beispiel nach den Standardmethoden von Kohler und Milstein hergestellt werden. Eine Maus wird mit dem isolierten CA 125 Antigen immunisiert. Milzzellen werden geerntet und mit Myelomzellen fusioniert. Die so gebildeten Hybridomen können für die Herstellung von Anti-CA 125 Antikörpern auf der Basis der Reaktivität mit dem isolierten Antigen CA 125 ausgewählt werden.
- Der Anti-CA 125 Antikörper ist für die Diagnose und Therapie von Ovarialkarzinom nützlich. Der Antikörper kann zum Beispiel in Diagnosetests wie RIA und ELISA zur Feststellung der Anwesenheit von CA 125 in biologischen Flüssigkeiten verwendet werden. Solch ein Antikörper kann in immunohistochemischen Verfahren zur Identifizierung von (Tumortechniken zur Identifizierung von) Ovarialkarzinomzellen verwendet werden. Die Antikörper können auch für die in-vivo Szintigraphie von Ovarialkarzinom sowie für die Immunotherapie von Ovarialkarzinom, z.B. passive Immunotherapie oder Antitoxintherapie, verwendet werden.
- Das isolierte Antigen CA 125 kann auch als Immunoadsorbens zur Auffindung von Anti-CA 125 Antikörper im Blut verwendet werden. Die Anwesenheit von Anti-CA 125 Antikörper kann ein Hinweis auf Ovarialkarzinom bei einem Patienten sein.
- Die Erfindung wird durch die folgenden Erläuterungen weiter veranschaulicht.
- Der murine, monoklonale Antikörper OC 125, erzeugt durch Hybridomen, die in mit Pristan sensibilisierten BALB/c Mäusen kultiviert worden waren (siehe Bast, R.C., et al., J. Clin. Invest., 68, S. 1331-1337, 1991), wurde durch Protein A-Chromatographie isoliert (Kabawat, S.E., et al., Am. J. Clin. Pathol., 79, S. 98 - 104, 1983). Serumproben wurden von Frauen mit fortgeschrittenem Epithelovarialkarzinom (Stadium III und IV) entnommen. Die Milch stammte von einer gesunden Frau 7 Monate nach der Entbindung. Die Exoglykosidasen und Proteasen wurden von Calbiochem, Los Angeles, CA (Pronase) und von Sigma, St. Louis, MO (Chymotrypsin, Trypsin, Chondroitinase ABC, α- und β-Galaktosidase, α-Fucosidase, Hexaminidase und Neuraminidase) gekauft. Der monoklonale Antikörper 1116NS 19-9 (Koprowski, H., et al., Somat. Cell Genet., 5 (6), S. 957-972, 1979; U.S. Patent 4,349,528) wurde von Dr. Zenon Steplewski, Wistar Institute, Philadelphia, PA erhalten. Der polyklonale Anti-CEA Antikörper wurde von den Abbott Laboratories, North Chicago, IL bereitgestellt. Sepharose CL-4B und CL-6B sowie Protein A- Sepharose CL-4B wurden von Pharmacia, Piscataway, NJ gekauft. Die für die Elektrophorese benötigten Reagenzien wurden von Bio-Rad, Rockville Centre, NY gekauft. SeaKem LE Agarose wurde von FMC Corp., Rockland, ME gekauft. Fischgelatine wurde von Norland Products Inc., New Brunswick, NJ bereitgestellt. Alle anderen Reagenzien waren auf dem Markt erhältliche, höchstreine Produkte.
- Die CA 125 Aktivität wurde mit dem Simultan'Sandwich'-Radioimmunoassay (IRMA) gemessen (Klug, T.L., et al., Cancer Res., 44, S. 1048 - 1053, 1984). Mit demselben Test wurde auch die CA 19-9 Aktivität gemessen (Ritts, R.E., et al., Int. J. Cancer, 33, S. 339 - 445, 1984). Im IRMA Test für die CA 125 Aktivität wurde [¹²&sup5;I]-OC125 (100 ul, 1 x 10&sup5; cpm) mit polystyrolimmobilisiertem OC 125 inkubiert (20 Stunden, 23 ºC). Davon wurde eine Probe genommen (100 ul). Die Perlen wurden dreimal gewaschen und in einem Gammazähler gezählt. Testpackungen wurden von Centocor, Malvern, PA hergestellt.
- Für den Plattentest wurden Polyvinylchlorid-Mikrotiterplatten mit 96 Löchern verwendet (Dynatech).
- Die OVCA 433/Perchlorsäure/4B Fraktion (siehe 'Isolierung von Antigen CA 125 aus OVCA 433 Gewebekulturüberständen') wurde für die Beschichtung der Löcher verwendet (100 ul, 500 Einheiten/Loch). Nach Bindung des Antigens auf den Platten (18 Stunden, 4 ºC) wurden die Löcher 1 Stunde mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 5 % (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin enthielt, inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden die Löcher geleert und zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. [¹²&sup5;I]-OC125 (20 ul, 2 x 10&sup4; cpm) wurde anschließend mit immobilisiertem Antigen inkubiert (4 Stunden, 23 ºC). Die Löcher wurden anschließend dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, ausgeschnitten und in einem Gammazähler gezählt.
- Da mit dem IRMA Test für CA 125 nur polyvalente Antigene entdeckt werden können, wurde ein Inhibierungstest zur quantitativen Bestimmung von ein- und mehrwertigen Antigenen entwickelt. Der Inhibierungstest wurde in ähnlicher Weise wie der obenbeschriebene Plattentest durchgeführt, wobei der einzige Unterschied darin bestand, daß [¹²&sup5;I]-OC125 (20 ul, 2 x 10&sup4; cpm) gleichzeitig mit verschiedenen Antigenpräparaten, die möglicherweise die Bindung des radioaktiv markierten OC 125 an die Platte inhibieren, inkubiert wurde (30 ul, 4 Stunden, 23 ºC). Die Löcher wurden dreimal gewaschen, ausgeschnitten und in einem Gammazähler gezählt. Der sowohl im Plattentest als auch im Inhibierungstest verwendete radiojodierte OC 125 stammte aus den Centocor RIA-Testpackungen.
- Die herkömmliche SDS:PAGE Analyse wurde im wesentlichen gemäß der Methode von Laemmli durchgeführt (Laemmli, U.K., Nature, 227, S. 680 - 685, 1970). Der Probenpuffer enthielt keine Sulfhydryl-reduzierenden Mittel oder SDS und wurde nicht erwärmt, da das Antigen CA 125 unter diesen Bedingungen inaktiviert worden wäre. In einigen Versuchen war ein aus Polyacrylamid und Agarose zusammengesetztes Gel für die Abtrennung der Probenkomponenten erforderlich, da das Antigen CA 125 ein herkömmliches, 3 %iges (Gew./Vol.) Polyacrylamidgel nicht durchdringen konnte.
- Typischerweise enthielten die zusammengesetzten Gels 2,5 % Polyacrylamid und 1,0 % Agarose. Die Lösungen wurden auf 65 ºC erwärmt, dann wurde Ammoniumpersulfat zugegeben. Die vorgewärmten Lösungen wurden anschliessend sofort in den Gelierapparat geschüttet, der auf einer Temperatur von 37 ºC gehalten worden war. Der gesamte Apparat wurde dann auf 4 ºC gekühlt bis die Agarose erstarrte. Nach Überschichtung eines Gels aus 2,5 % Polyacrylamid und 1,0 % Agarose bei Raumtemperatur wurden die Proben (300 Einheiten/Spur) in einem Harnstoffpuffer (10 M) eingesetzt, der keine Sulfhydryl-reduzierenden Mittel oder SDS enthielt und nicht erwärmt wurde. Die Elektrophorese erfolgte bei 4 ºC. Alle bei der Herstellung und beim Einsatz der zusammengesetzten Gele verwendeten Puffer waren die von Laemmli beschriebenen (siehe oben).
- Nach der Elektrophorese wurden die Proteine elektrophoretisch auf Nitrozellulose übertragen (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 76, S. 4350 - 4354, 1979), mit radioaktiv markiertem OC 125 immunoblotted und einer Autoradiographie unterzogen. Jeder Immunoblot enthielt mindestens eine Negativantigen-Kontrollspur. Der elektrophoretische Transfer wurde über Nacht bei 100 mA durchgeführt. Immunoblotting erfolgte durch Überschichtung der Nitrozellulose mit radiojodiertem OC 125 (2 ml, 2 x 10&sup6; cpm) in Fischgelatinepuffer (1 % Fischgelatine, 50 mM Zitrat, pH 6,0, 0,05 % NP-40) über einen Zeitraum von 6 Stunden. Die Nitrozelluloseschicht wurde anschließend durch Röntgenstrahlen mit Hilfe eines Cronex Quanta III Fluorschirms (Dupont) 18 Stunden bei -80 ºC autoradiographiert.
- Vollserum ließ man 1 Stunde koagulieren, bevor es zentrifugiert wurde (3000 x g, 10 Minuten). Ein Teil (2 ml) des Überstands wurde auf einer 1,2 x 47 cm Sepharose CL-4B Säule (Humanserum/4B), equilibriert in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, fraktioniert. Fraktionen (1 ml) mit CA 125 Aktivität, durch CA 125- RIA bestimmt, wurden gepoolt und konzentriert. Frauenmilch wurde durch Zentrifugieren bei 10 ºC entfettet (3000 x g, 1 Stunde). Der Überstand wurde weiter, wie oben für das Serum beschrieben, durch Säulenchromatographie gereinigt (Frauenmilch/4B).
- OVCA 433 Humanovarialkarzinomzellen wurden in Minimum Essential Eagle Medium kultiviert, dem 2 mM Glutamin, 1 mM Pyruvat, 1 % nichtessentielle Aminosäuren und 10 % durch Wärme inaktiviertes Kalbfetusserum zugesetzt worden waren. In die Kulturflaschen (T-150, Costar) wurden 1 x 10&sup6; Zellen eingesät. Sobald ein Zusammenfluß der Zellen erkennbar war, wurde das Medium entfernt. Frisches Medium wurde zugesetzt und über einen Zeitraum von 10 bis 12 Wochen alle 5 bis 7 Tage gesammelt. Die OVCA 433 Zellen schienen in der Wachstumsphase Go die größte Menge an Antigen CA 125 zu bilden. Die Konzentration des unter diesen Bedingungen erzeugten Antigens CA 125 betrug etwa 1.000 Einheiten/ml. Die gepoolten Zellüberstände wurden bei 10.000 x g zentrifugiert, filtriert (Sartorius Kaskadenfilterkapsel, Porengröße 0,2 µ) und auf ein Zehntel des ursprünglichen Volumens in einem Hohlfaserapparat (Amicon DC-2) mit Filterpatrone (HP 100-200) konzentriert, so daß das Molekulargewicht 100 kDa betrug. Die Konzentrate wurden bei -20 ºC gelagert. Unter diesen Bedingungen blieb die CA 125 Aktivität mindestens 12 Monate stabil.
- Das verbrauchte, zehnfache Gewebekulturkonzentrat des OVCA 433 Zellüberstands wurde zunächst einer Fällung mit Perchlorsäure unterzogen (Endkonzentration 0,6 M) (Krupey, J., et al., J. Exp. Med., 128, S. 387 - 398, 1968). Die CA 125 Aktivität blieb in der perchlorsäurelöslichen Fraktion vollständig erhalten. Die säurelösliche Fraktion wurde mit Kaliumhydroxid (1,2 M) neutralisiert, gegen destilliertes Wasser dialysiert (24 Stunden, 4 ºC) und auf das Zwanzigfache des ursprünglichen Volumens des Überstands konzentriert. Diese Probe wurde als OVCA 433/Perchlorsäure bezeichnet, und 35 ml davon wurden auf eine Sepharose CL-4B Säule (3,2 x 70 cm), equilibriert in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, aufgetragen. Die CA 125-haltigen Fraktionen (7 ml), bestimmt durch CA 125-RIA, wurden gepoolt und konzentriert. Diese Fraktion wurde als OVCA 433/Perchlorsäure/4B bezeichnet. Sie wurde, wenn nicht anders angegeben, in allen Versuchen verwendet.
- Für die weitere Fraktionierung war die Behandlung der OVCA 433/Perchlorsäure/4B Fraktion mit Harnstoff erforderlich (6 M, 30 Minuten, 45 ºC) sowie die anschließende chromatographische Analyse auf einer Sepharose CL-6B Säule, equilibriert in Trispuffer Harnstoff-SDS (50 mM Trispuffer, 6 M Harnstoff, 0,1 % SDS, pH 8,0). Die letzte Fraktionierung wurde durch Immunoaffinitätschromatographie auf einer OC 125- Protein A-Sepharose CL-4B Säule erreicht. Der monoklonale Antikörper OC 125 wurde kovalent an die Protein A-Sepharose CL-4B Säule gebunden, gewaschen und im wesentlichen nach der von Schneider et al. beschriebenen Methode gekoppelt (siehe J. Biol. Chem., 257, S. 10766 - 10769, 1982). Geringfügige Modifizierungen betrafen die Verwendung von Zitratpuffer (0,05 M, pH 6,0) anstelle von Trispuffer-HCl sowie von Taurodeoxycholat (TDC) anstelle von Deoxycholat (DDC). Ein dreimaliger Durchlauf der CA 125-reaktiven, niedrigermolekularen Fraktion von der Sepharose CL-4B Säule in 0,1 % SDS und 6 M Harnstoff durch die affine Säule ergab eine über 80 %ige Bindung der CA 125 Aktivität. Das Antigen CA 125 wurde von der Säule unter Verwendung von Diethylamin (DEA) (50 mM, pH 11,3) eluiert. Dieses durch Affinität gereinigte Antigen wurde als OVCA 433/4B/DEA bezeichnet.
- Die Ultrazentrifugierung des aus Humanserum, Frauenmilch oder OVCA 433 Gewebekulturüberstand nach chromatographischer Analyse auf einer Sepharose CL-4B Säule isolierten Antigens CA 125 erfolgte in einer Zäsiumchloridisopyknotischen Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (2,276 g CsCl gelöst in 3,414 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung). Die Dichte des Überstands der β-Galaktosidase wurde als Standard festgelegt. Fraktionen (0,2 ml) wurden nach Equilibrierung gemäß der von Miller beschriebenen Methode auf β-Galaktosidase untersucht (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1972). Gradienten wurden durch Ultrazentrifugierung in einem Beckman SW 50.1 Rotor (33.000 U/Min., 68 Stunden, 10 ºC) unter den von Magnani, J.L., et al. beschriebenen Bedingungen gebildet (siehe Cancer Res., 43, S. 4589 - 5492, 1983). Fraktionen (0,2 ml) wurden gesammelt und auf Aktivität mit dem obenbeschriebenen CA 125-RIA untersucht. Die Dichte jeder Fraktion wurde durch Wiegen eines bekannten Volumens bestimmt.
- Die Perjodatoxidierung des Antigens CA 125 wurde mit 0, 0,1, 1,0, 10,0 und 100 mM Perjodat in Azetatpuffer (pH 4,5, 50 mM, 4 ºC) im Dunkeln gemäß der von Stahl et al. beschriebenen Methode durchgeführt (siehe Proc. Natl. Acad. Sci., 73, S. 4045 - 4049, 1976) Reduktion und Alkylierung wurden nach anderweitig beschriebenen Methoden durchgeführt (siehe Glazer, A.N., et al., Chemical Modifications of Proteins, in T.S. Work und E. Wbrk (Herausgeber), Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, S. 104, New York, Elsevier Publishing Co., 1975). Die Reduktion wurde mit DTT (10 mM, 50 mM Trispuffer, pH 8,1, 4 Stunden, 45 ºC) in Gegenwart oder Abwesenheit von Guanidin-HCl (6 M) erreicht Die Alkylierung wurde mit Jodessigsäure (20 mM, 30 Minuten) nach Abkühlung der Proben auf Raumtemperatur durchgeführt. Die Proben wurden unmittelbar gegen destilliertes Wasser dialysiert (4 ºC, 18 Stunden).
- Exoglykosidase-Digestionen wurden in Azetatpuffer durchgeführt (0,01 M, pH 4,5, 48 Stunden, 37 ºC). Durch Auswahl von Einheitenwerten (unit values) der Exoglykosidasen wurde sichergestellt, daß innerhalb einer angemessenen Zeitspanne eine vollständige Digestion der Oligosaccharidreste erfolgte. Alle Exoglykosidase-Digestionen wurden unter Bedingungen durchgeführt, bei denen die geeigneten Substrate vollständig hydrolysiert wurden (bewiesen durch Dünnschichtchromatographie). Die nach der Behandlung vorhandene CA 125 Aktivität wurde sowohl durch CA 125-RIA als auch durch Plattentest, wie oben beschrieben, gemessen.
- Verschiedene Proteasedigestionen wurden in THAM-HCl Puffer durchgeführt (0,2 M, pH 8,0, 10 mM Kalziumchlorid). Die Proteasen Trypsin, Chymotrypsin und Pronase (2 % Gew./Vol., 50 ul) wurden in die das Antigen enthaltenden Löcher gegeben und inkubiert (48 Stunden, 37 ºC). Die Proteasedigestionen erfolgten unter Bedingungen, die zur Hydrolyse von Albumin führten (bewiesen durch Dünnschichtchromatographie). Die Proben wurden sowohl durch CA 125-RIA als auch durch Plattentest, wie oben beschrieben, auf CA 125 Aktivität untersucht.
- OVCA 433/4B/DEA Proben wurden in 0,1 % phenolhaltiger, 6 N HCl aufgelöst, vakuumdicht versiegelt und 24 Stunden bei 110 ºC hydrolysiert. Aminosäurederivate wurden mit Phenylisothiozyanat (PITC) gebildet, abgetrennt und quantitativ durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) auf einer Waters PICO-TAG Säule unter den von Bidlingmeyer, B.A., et al. beschriebenen Eluierungsbedingungen bestimmt (siehe J. Chromatogr., 336, S. 93 - 104, 1994).
- Proben aus derselben Partie OVCA 433/4B/DEA, die quantitativ durch Aminosäure bestimmt worden waren, wurden nach der von Yang und Hakomori beschriebenen Methode zur Bestimmung der Kohlehydratzusammensetzung analysiert (siehe J. Biol. Chem., 246, S. 1192 - 1200, 1971). Die Proben wurden einer Azetolyse mit anschließender Hydrolyse und Reduktion unterworfen. Die resultierenden Alditole waren per-O-azetyliert mit Essigsäureanhydrid. Die quantitative Bestimmung der Speichelsäure erfolgte durch Trimethylsilyl-Derivatisierung (TMS) (siehe Laine, R.A., et al., Meth. Enzymol., 29, S. 159 - 167, 1972). Sowohl das Alditolazetat als auch die TMS-Methylglykoside wurden mit Hilfe eines Gaschromatographen (Hewlett Packard 5790) abgetrennt und mit einem Massenselektionsdetektor (Hewlett Packard 5790) identifiziert.
- Das aus OVCA 433 und Humanserum von Patienten mit Ovarialkarzinom durch Perchlorsäurefällung isolierte Antigen wird in erster Linie im Leervolumen der Sepharose CL-4B Säule eluiert (Abbildung 1). Außerdem wird auf der Säule später ein kleinerer CA 125 Peak eluiert, der auf ein viel geringeres Molekulargewicht hindeutet. Diese CA 125 Peaks entsprechen einem Molekulargewicht von über 1.000 und ca. 200 - 400 kDa. Das Eluierungsmuster für Antigen CA 125 bei Frauenmilch gleicht dem für OVCA 433 und Humanserum von Krebspatienten.
- In einem Versuch, die physikalischen Eigenschaften des aus OVCA 433 Zellüberständen, Humanovarialkarzinomserum und Frauenmilch isolierten Antigens zu vergleichen, wurde jeweils die Dichte des Überstands bestimmt (Abbildung 2). Die durchschnittliche Dichte des Überstands des aus OVCA 433 isolierten Antigens nach Überleiten über eine Sepharose CL-4B Säule (OVCA 433/4B) beträgt etwa 1,42 g/ml, während die Dichten der Überstände des Humanserums/4B und der Milch/4B 1,46 bzw. 1,39 g/ml sind. Als Standard wurde die Dichte des Überstands von β-Galaktosidase bestimmt. Sie betrug 1,32 g/ml. Dies stimmt gut mit dem von Costini, N.V., et al. veröffentlichten Wert von 1,316 g/ml überein (siehe J. Biol. Chem., 254, S. 11242 - 11246, 1979). In Abbildung 3 wird die elektrophoretische Mobilität immunoreaktiver Spezies von OVCA 433/4B, Frauenmilch/4B und Ovarialkarzinomserum/4B auf einem aus 2,5 % Polyacrylamid und 1,0 % Agarose zusammengesetzten Gel verglichen. Die Proben wurden in einem Harnstoffpuffer (10 M) aufgetragen, der weder DTT noch SDS enthielt und nicht erwärmt wurde. Das durch Immunoblot markierte, reaktive Antigen OC 125 liegt bei jeder der Proben als hochmolekularer Komplex mit 200 bis 1.000 kDa vor. Die elektrophoretischen Profile sind sich ähnlich. Diese Ergebnisse, die auf Mehrfachaggregate des CA 125 Antigenkomplexes hindeuten, stimmen sehr gut mit dem in Abbildung 1 dargestellten Sepharose CL-4B Eluierungsprofil überein. Beide Versuche zeigen, daß das Antigen als hochmolekulare (über 1.000 kDa) und niedrigermolekulare Spezies (ca. 200 - 600 kDa) vorliegt.
- Bei Durchführung der SDS:PAGE Elektrophorese mit einem Gel mit einem 3 - 12 %igen Polyacrylamidgradienten und nachfolgendem Immunoblotting an der OVCA 433/Perchlorsäure/4B Fraktion (Abbildung 4) entsteht durch die Spur, die mit dem radiojodierten, monoklonalen Antikörper OC 125 reagiert, eine Bande mit einem Molekulargewicht von über 1.000 kDa und eine mit einem niedrigeren Molekulargewicht von ca. 400 kDa. Der verwendete Probenpuffer enthielt nur 10 % Glyzerin, 0,08 M Trispuffer, pH 6,8, und Bromphenolblau. Nach Überschichtung der angrenzenden Spur mit radiojodiertem, monoklonalen Antikörper 19-9, der die sialolierte Lakto-N-fucopentaose II Kohlehydratdeterminante erkennt, wird nur die höhermolekulare Bande festgestellt. Die mit dem radiojodierten Anti-CEA überschichtete Spur zeigt keine Immunoreaktivität. Außerdem entstehen durch Western Blots mit dem monoklonalen Antikörper 19-9 als Überschichtung mit der durch OC 125 Affinität gereinigten CA 125 Antigenfraktion (OVCA 433/4B/DEA) keine Bande. Auch wird mit dem CA 19-9-RIA keine CA 19-9 Aktivität gemessen (Ergebnisse nicht aufgeführt). Dieses Ergebnis zeigt deutlich, daß sich die Antigendeterminanten CA 125 und CA 19-9 auf demselben hochmolekularen Glykoproteidkomplex befinden, die CA 125 und CA 19-9 Determinanten jedoch nicht in demselben Glykoproteidmolekül vorhanden sind.
- Die Ergebnisse der Sepharose CL-4B Säulenchromatographie und SDS:PAGE Analyse lassen darauf schließen, daß die niedrigermolekulare Substanz wahrscheinlich ein Derivat der höhermolekularen Spezies ist. Versuche, die hochmolekulare Substanz sowohl mit ionischen (SDS) als auch mit nichtionischen (NP-40) Detergentien aufzulösen, schlugen fehl. Jedoch die Behandlung der gepoolten und konzentrierten Fraktion aus dem Leervolumen der Sepharose CL-4B Säule von OVCA 433/Perchlorsäure mit 6 M Harnstoff über einen Zeitraum von 30 Minuten bei 45 ºC mit anschließender chromatographischer Analyse auf einer Sepharose CL-6B Säule in 0,1 % SDS und 6 M Harnstoff ergab zwei Peaks (siehe Abbildung 5). Nach diesem Schritt war der größte Teil (80 %) der CA 125 Aktivität mit dem viel niedrigermolekularen Peak von ca. 200 kDa assoziiert. Bewiesen wurde dies durch Elektrophorese und Immunoblotting von Fraktionen der Sepharose CL-6B Säulenchromatographie (Abbildung 5). Ein Teil des Antigens verharrt noch in seiner hochmolekularen Aggregatform.
- Die chromatographische Analyse auf einer Sepharose CL-4B Säule und anschließende Behandlung mit 6 M Harnstoff und Wärme sowie die nachfolgende chromatographische Analyse auf einer Sepharose CL-6B Säule in Gegenwart von 6 M Harnstoff und 0,1 % SDS (Abbildung 5) führt zu einer 1.400-fachen Reinigung des Antigens CA 125 von OVCA 433 Überständen (Ergebnisse nicht aufgeführt). Dieses Präparat hat eine spezifische Aktivität von 117 Einheiten CA 125/ug Protein. Die spezifische Aktivität wurde durch Messung der CA 125 Aktivität mit der Centocor CA 125-RIA Ausrüstung und Bestimmung der Proteinmenge durch Aminosäureanalyse an besagter Menge gereinigtem CA 125 Antigen bestimmt. Die letzte Fraktionierung des Antigens erfolgte durch Immunoaffinität auf einer immobilisierten OC 125- Protein A-Sepharose CL-4B Säule. Das mit Diethylamin (DEA) von der Säule eluierte Antigen hat eine spezifische Aktivität von 317 Einheiten CA 125/ug Protein.
- Proben von dem auf einer Sepharose CL-4B Säule und einer OC 125 immunoaffinen Säule eluierten Antigen wurden einer Dichtegradient-Ultrazentrifugierung unterzogen. Dieses Verfahren deckt verschiedene Durchschnittsdichten der Überstände für die beiden Antigenpräparate auf (Abbildung 6). Das höhergereinigte DEA Eluat hat eine Dichte des Überstands von ca. 1,36 g/ml, während die Dichte des Überstands der OVCA 433/4B etwa 1,42 g/ml beträgt. Dies läßt darauf schließen, daß das weniger reine Antigen mit höherreinen, glykosylierten Proteinen assoziiert ist, was zu der polydispersen Beschaffenheit des Dichteprofils des Überstands sowie zu der beobachteten höheren Durchschnittsdichte des Überstands führt.
- Die vorläufige Kohlehydratzusammensetzung der OVCA 433/4B/DEA zeigt, daß Speichelsäure, Fucose, Mannose, Galaktose, N-Acetylglukosamin und N-Acetylgalaktosamin im Verhältnis 3,6 : 0,40 : 3,0 : 6,6 : 5,8 : 2,2 vorliegen (Ergebnisse nicht aufgeführt). Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, daß sowohl N- als auch O-verknüpfte Oligosaccharide vorhanden sind. Außerdem enthielt dieses immunogereinigte CA 125 Antigen 24 Gew.-% Kohlehydrat, was sehr gut mit dem aufgrund der Dichte des Überstands von 1,36 g/ml errechneten Wert übereinstimmt. Daher ist das Antigen CA 125 kein typisches Muzin und weist keine signifikante Menge, wenn überhaupt, eines mit ihm assoziierten Lipids auf.
- Die Beschaffenheit der CA 125 Determinante wurde durch eine Reihe chemischer und physikalischer Behandlungen sowie durch erschöpfende Exoglykosidase- und Protease digestionen des Antigens untersucht. Eine Perjodatoxidierung (Tabelle I) des aus OVCA 433/4B und Frauenmilch/4B isolierten immunoreaktiven Antigens CA 125 hat keine Auswirkungen auf die Aktivität bei Perjodatkonzentrationen und Reaktionszeiten, die die Aktivität der CA 19-9 Kohlehydratdeterminante, der sialolierten Lakto-N-fucopentaose II, völlig zerstörten. Bei der niedrigsten Perjodatkonzentration, mit der die CA 19-9 Aktivität (0,1 mM) zerstört wurde, scheint die CA 125 Aktivität eigentlich anzusteigen. Nur bei sehr hohen Perjodatkonzentrationen (100 mM) oder sehr langen Reaktionszeiten (24 Stunden) gibt es einen deutlichen Rückgang der CA 125 Aktivität, was wahrscheinlich auf eine nichtspezifische Oxidation des Proteingerüsts des Antigens zurückzuführen ist. Tabelle I Auswirkungen der Perjodatoxidation auf die CA 125 Aktivität bei verschiedenen Konzentrationen und Reaktionszeiten
- Chemische und physikalische Behandlungen (Tabelle II), die die meisten Proteine denaturieren, d.h. Reduktion und Alkylierung in 6 M Guanidin-HCl, 8 M Harnstoff und Kochen, führen zu einer deutlichen Verminderung der CA 125 Immunoreaktivität. Eine Reduktion alleine scheint jedoch die Immunoreaktivität des CA 125 Antigens nicht zu beeinträchtigen. Somit ist der beobachtete Aktivitätsrückgang bei Reduktion oder Alkylierung in Gegenwart von Guanidin-HCl hauptsächlich das Ergebnis der Guanidin-HCl Wirkung auf das Antigen. Reduktion und Alkylierung in Gegenwart von Guanidin-HCl führen zu fast vollständigem Aktivitätsverlust. Außerdem beeinträchtigen weder das anionische Detergens SDS noch das nichtionische Detergens NP-40 die Immunoreaktivität des CA 125 Antigens. Tabelle II Auswirkungen chemischer Behandlungen auf die CA 125 Aktivität
- ND = nicht durchgeführter Test
- Es wurden verschiedene Kombinationen von Exoglykosidasebehandlungen an dem Antigen CA 125 durchgeführt (Tabelle III). Der Solid-Phase-IRMA Test zeigt bei Behandlung mit α-Galaktosidase und/oder β-Galaktosidase nur geringe Verluste an CA 125 Immunoreaktivität. Andererseits wird beim Plattentest kein Verlust an Immunoreaktivität festgestellt. Tatsächlich erhöht sich nach den meisten Exoglykosidase-Behandlungen die Fähigkeit des immobilisierten Antigens, radiomarkierten OC 125 Antikörper zu binden. Dieses Ergebnis bestätigt das der Perjodatoxidation, d.h. die Abtrennung endständiger Kohlehydratanteile kann tatsächlich den Zugang von OC 125 zur CA 125 Determinante erhöhen.
- Schließlich führt eine erschöpfende Proteasedigestion mit Pronase, Trypsin oder Chymotrypsin zum vollständigen Verlust der Antigenaktivität, wie sowohl in IRMA- als auch in Plattentests gemessen wurde (Tabelle III). Tabelle III Auswirkungen enzymatischer Digestion auf die Aktivität von aus OVCA 433 isoliertem CA 125 Antigen
- Der murine, monoklonale Antikörper OC 125 erkennt eine Humanovarialkarzinom-assoziierte Antigendeterminante (CA 125). Wir haben Glykoproteid-Komplexe aus der Ovarialkarzinom-Zellinie OVCA 433, Humanserum und Frauenmilch isoliert. Bei allen wurde die CA 125 Determinante exprimiert. Außerdem haben wir dem Beweis, daß in Spermaplasma CA 125 Aktivität vorhanden ist, was im Gegensatz zu den Beobachtungen von de Bruijn et al. steht (siehe oben). Durch chemische Behandlung und chromatographische Analyse des aus den OVCA 433 Zellüberständen isolierten, hochmolekularen Komplexes wurde eine 200 kDa immunoreaktive Spezies erhalten. Es ist jedoch möglich, daß das eigentliche Protein, das die Antigendeterminante exprimiert, ein noch geringeres Molekulargewicht hat. Weitere Versuche zur Isolierung einer immunoreaktiven Spezies mit niedrigerem Molekulargewicht schlugen bisher fehl. Außerdem führt das hier beschriebene Isolierungsverfahren nicht zu einer vollständig homogenen und reinen Spezies.
- Das von verschiedenen Quellen isolierte, die CA 125 Determinante ausbildende Antigen besteht als hochmolekularer Glykoproteid-Komplex mit einer durchschnittlichen Dichte des Überstands von 1,36 bis 1,46 g/ml. Darüberhinaus zeigten diese durchschnittlichen Dichten, daß jedes der von drei Quellen isolierten Antigene möglicherweise eine etwas andere Protein- und Kohlehydratzusammensetzung hatte. Wenn ein Muzin als hochmolekulares Glykoproteid definiert wird, das zu 50 % oder mehr aus Kohlehydrat mit überwiegend 0-verknüpften Oligosacchariden besteht, die wenige oder keine N-verknüpften Ketten enthalten, so ist das CA 125 Antigen kein typisches Muzin. Diese Schlußfolgerung basiert auf einer Kohlehydratzusammensetzung des CA 125 Antigens von 24 %, dem hohen Gehalt an Mannose, dem überwiegenden Teil an N-verknüpften Oligosacchariden und der Dichte des Überstands des CA 125 Antigens. Die durchschnittliche Dichte des Überstands von nichtglykosyliertem Protein liegt zwischen 1,25 und 1,35 g/ml, während die durchschnittliche Dichte des Überstands von Muzin etwa 1,50 g/ml beträgt. Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zu dem für andere Epitheltumorassoziierte Antigene erhaltenen, die durch monoklonale Antikörper, z.B. 19-9, erkannt werden (siehe Magnani, J.L., et al., J. Biol. Chem., 257, S. 14365 - 14369, 1992), B 72.3 (Johnson, V.G., et al., Cancer Res., 45, S. 850 - 957, 1986), DU-PAN-2 (Lan, M.S., et al., Cancer Res., 45, S. 305 - 310, 1985) und F 36/22 (Croghan, G.A., et al., Cancer Res., 43, S. 4980 - 5989, 1983). Aufgrund der höheren Dichten ihrer Überstände wurden alle als hochmolekulare, muzinige Glykoproteide eingestuft.
- Der höhermolekulare, aus dem Überstand der OVCA 433 isolierte Antigenkomplex reagierte mit dem monoklonalen Antikörper 19-9 (siehe oben, Magnani et al.), woraus geschlossen wurde, daß in diesem Komplex die CA 19-9 Determinante vorhanden ist. Wir haben jedoch eindeutig durch Elektrophorese und Immunoblotting dargelegt, daß keine CA 19-9 und CA 125 Determinanten in demselben Glykoproteid vorhanden waren, da das durch OC 125 Immunoaffinität gereinigte CA 125 Antigen keine Reaktivität für den monoklonalen Antikörper 19-9 zeigte. Diese Beobachtung widerspricht der von Hanisch et al. (siehe oben), der sowohl CA 19-9 als auch CA 125 Aktivität aus Frauenmilch isoliert hatte.
- Das CA 125 Antigen wurde chemischen und physikalischen Behandlungen unterworfen, um die Beschaffenheit der durch den monoklonalen Antikörper OC 125 erkannten Antigendeterminante besser verstehen zu können. Durch Perjodatoxidation des CA 125 Antigens wurde die Immunoreaktivität nur bei hohen Konzentrationen des Perjodats oder längeren Reaktionszeiten gesenkt. Tatsächlich nahm die Aktivität des Antigens bei Konzentrationen und Reaktionszeiten, die zu einem völligen Verlust der Immunoreaktivität der CA 19-9 Determinante führten, zu. Nichtspezifische Oxidation des Proteingerüsts verursachte wahrscheinlich den Verlust der CA 125 Aktivität bei höheren Perjodatkonzentrationen. Während der Reinigung des CA 125 Antigens kam es zu einem Verlust von 82 % der ursprünglichen Aktivität im Anschluß an eine Behandlung mit Harnstoff und Wärme. Dieser offensichtliche Aktivitätsverlust wurde sehr wahrscheinlich durch den Zerfall des Antigenkomplexes in eine weniger zusammengelagerte Form oder durch teilweise Denaturierung des Antigens hervorgerufen. Eine geringere Zusammenlagerung kann zu einem geringeren Einheitenwert führen, da der CA 125-RIA empfindlich gegenüber der Valenz des CA 125 Antigens ist, d.h. der Zahl der OC 125 Bindungsplätze pro Antigenmolekül.
- Die von Hanisch et al. (siehe oben) gemachten Beobachtungen, die vermuten ließen, daß die CA 125 Determinante von ihrer Natur her Kohlehydrat ist, beruhten auf zwei Kriterien: ihre Empfindlichkeit gegenüber Perjodat-Oxidation (bei einer Konzentration von 100 mM und einer Reaktionszeit von 18 Stunden) und der Verlust ihrer Aktivität unter Bedingungen, bei denen N- Acetylneuraminsäure selektiv gespalten wird (pH 3,3, 100 ºC). Diese Ergebnisse deuteten auch darauf hin, daß die Behandlung mit Neuraminidase allein nur zu einer geringen Verminderung der Immunoreaktivität führt, obwohl ca. 97 % der Muzin-verknüpften Speichelsäure gespalten wurde. Unsere Ergebnisse zeigen deutlich, daß Perjodatkonzentrationen in einer Höhe, in der Kohlehydrate oxidiert werden, die CA 125 Aktivität nicht beeinträchtigen. Es ist daher nicht überraschend, daß ein pH Wert von 3,3 bei 100 ºC die CA 125 Antigenaktivität zerstörte. Außerdem ging mehr als 95 % der Aktivität bei Reduktion und Alkylierung in Gegenwart von Guanidin-HCl verloren. Schließlich führten Behandlungen mit Exoglykosidase zu einem Anstieg der CA 125 Aktivität, während die Antigenaktivität durch erschöpfende Proteasedigestion vollständig vernichtet wurde. Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, daß die CA 125 Determinante von proteinhaltiger Natur ist oder zumindest proteinassoziiert mit Kohlehydrat in einem konformationsabhängigen Epitop ist. Dies mag eine Erklärung für die Ähnlichkeit des aus verschiedenen Quellen (z.B. Humanserum, OVCA 433 und Frauenmilch) isolierten Antigens sein. Bei einer Peptiddeterminante wurde man einen höheren Erhaltungsgrad als bei der Kohlehydratdeterminante erwarten, d.h., daß eine Proteinreihe mit größerer Wahrscheinlichkeit mit einem einzelnen, einzigartigen Protein assoziiert wird, während eine Kohlehydratstruktur auf mehreren verschiedenen Proteinen existieren kann. Diese Ergebnisse mögen nicht ganz außergewöhnlich sein, da die Beschaffenheit des tumorassoziierten Glykoproteidepitops (TAG-72), das von dem monoklonalen Antikörper B 72.3 erkannt wird, auf Protein zusätzlich zum Kohlehydrat als formendem Bestandteil der konformationsabhängigen Determinante TAG-72 hinzuweisen schien.
Claims (13)
1. Isolierte immunoreaktive Spezies des Antigens CA 125,
welche ein Glykoprotein ist mit einem
Molekulargewicht von ca. 200 kDa, bestimmt durch SDS:PAGE
Chromatographie, eine Carbohydratzusammensetzung von
ca. 24 Masse-% hat und mit dem monoklonalen
Antikörper OC-125, aber nicht mit Anti-CA-19-9
Antikörpern reagiert.
2. Verfahren zur Isolierung des Antigens CA 125 nach
Anspruch 1 aus Eierstockkrebszellen in folgenden
Schritten:
a) Verschaffen eines Zellkulturmediums aus einer
Kultur von Eierstockkrebszellen, die CA 125 in
das Medium absondern;
b) Säurefällung des Mediums (z.B. mit
Perchlorsäure) um eine säurelösliche und eine
säureunlösliche Fraktion zu erhalten;
c) Rückgewinnung und Neutralisation der
säurelöslichen Fraktion;
d) Abtrennung der CA 125 Spezies in der
säurelöslichen Fraktion von niedrigmolekularen
Bestandteilen der Fraktion durch
Molekülgrößenausschluß-Chromatographie (z. B. an Sepharose
4B-CL Harz) und Rückgewinnung der CA 125
Spezies;
e) Behandlung der zurückgewonnenen CA 125 Spezies
mit einem chaotropen Mittel, um CA 125 Spezies
mit hohem Molekulargewicht zu spalten;
f) Abtrennung der CA 125 Spezies mit niedrigem
Molekulargewicht durch Molekülgrößenausschluß
Chromatographie (z. B. an Sepharose 6B Harz) in
Gegenwart des chaotropen Mittels;
g) Gewinnung der eluierten, CA 125-haltigen
Fraktion;
h) Kontaktierung der CA 125 Spezies mit einem
Immunoadsorbens, das einen Antikörper enthält, der
an ein Harz gekoppeltes CA 125 unter Bedingungen
bindet, die eine selektive Adsorption des CA 125
durch das Immunoadsorbens erlauben; und
i) Gewinnung des 200 kDa CA 125 aus dem
Immunoadsorbens.
3. Immunoreaktive Spezies des Antigens CA 125, das nach
der in Anspruch 2 beschriebenen Methode aus
Eierstockkrebszellen isoliert wurde, mit folgenden
Merkmalen:
a) Molekulargewicht von ca. 200 kDa;
b) Dichte des Überstands von ca. 1,36 g/ml;
c) Carbohydratzusammensetzung von ca. 24 Masse-%;
d) Carbohydratzusammensetzung aus Speichelsäure,
Fucose, Mannose, Galactose, N-Acetylglukosamin
und
n-Acetylgalactosamin in einem Verhältnis von ca.
3,6 : 0,4 : 3,0 : 6,5 : 5,8 : 2,2; und
e) Reaktivität gegenüber dem Antikörper OC-125,
nicht jedoch gegenüber dem CA-19-9 Antikörper.
4. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das chaotrope
Mittel Harnstoff oder Guanidin-HCl ist.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei das chaotrope
Mittel von dem CA 125 Antigen im Anschluß an die
Molekülgrößenausschluß-Chromatographie gemäß Schritt
(f) durch Dialyse abgetrennt wird.
6. Methode gemäß Anspruch 5, wobei der sich an das CA125
bindende Antikörper OC 125 ist.
7. Verfahren zur Isolierung des Antigens CA 125 aus
Eierstockkrebszellen gemäß Anspruch 1 in folgenden
Schritten:
a) Gewinnung eines zellfreien Überstands aus einer
Eierstockkrebszellenkultur;
b) Ansäuern des Überstands (z.B. mit Perchlorsäure)
zur Fällung des Proteins;
c) Abtrennung des gefällten Proteins aus der
säurelöslichen Fraktion des Überstands;
d) Neutralisation der löslichen Fraktion;
e) Abtrennung des CA 125 von hohem Molekulargewicht
(1000kD) von der CA 125 Spezies mit niedrigerem
Molekulargewicht und anderen Komponenten in der
löslichen Fraktion durch Molekülgrößenausschluß-
Chromatographie (z.B. an Sepharose 4B-CL Harz);
f) Behandlung der CA 125 Spezies mit höherem
Molekulargewicht mit Harnstoff (z.B. ca. sechsmolarem
Harnstoff) zur Spaltung der hochmolekularen
Spezies;
g) Abtrennung der CA 125 Spezies durch
Molekülgrößenausschluß-Chromatographie an einem Harz
(z.B. Sepharose B), das in Gegenwart von
Harnstoff Moleküle im Bereich von 200 kD zurückhält;
und
h) Immunoreinigung der CA 125 Spezies.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die
Eierstockkrebszellen aus einer Gruppe bestehend aus OVCA 433,
NIH, OVCAR-3, SK-OV-3, CAOV-3 und CAOV-4
ausgewählt werden.
9. Verfahren zur Isolierung des Antigens CA 125 nach
Anspruch 1 aus Eierstockkrebszellen in folgenden
Schritten:
a) Gewinnen eines zellfreien Überstands aus einer
Kultur von Eierstockkrebszellen, die CA 125 in
das Kulturmedium absondern;
b) Ansäuern des Überstands mit Perchlorsäure zur
Fällung des Proteins;
c) Entfernen gefällten Proteins und Neutralisation
der säurelöslichen Fraktion;
d) Molekülgrößenausschluß-Chromatographie der
neutralisierten säurelöslichen Fraktion an Sepharose
CL-4B Harz und Gewinnung der Fraktion
(Leervolumen) mit CA-125 Aktivität von der Säule;
e) Behandeln der CA 125-aktiven Fraktion mit
Harnstoff von ca. 6 M;
f) Molekülgrößenausschluß-Chromatographie der mit
Harnstoff behandelten Fraktion an Sepharose CL-6B
in gepuffertem Harnstoff 6 M und ca. 1 % SDS
sowie Gewinnung der eluierten Fraktion mit CA 125
Aktivität;
g) Entfernen des Harnstoffs aus der zurückgewonnenen
Fraktion;
h) Aufgeben der Fraktion auf eine immunoaffine Säule
mit dem an Protein A Sepharose gebundenen
Antikörper OC 125 via Dimethylpimelimidat;
i) Eluieren der CA 125 Spezies von der immunoaffinen
Säule mit Diethylamin.
10. Immunoadsorbens zur spezifischen Adsorption eines mit
CA 125 reaktiven Antikörper, das eine isolierte
immunoreaktive Spezies des Antigens CA 125 gemäß
Anspruch 1 aufweist.
11. Immunogenzusammensetzung zur Immunisierung eines
Tieres gegen das Antigen CA 125, die das isolierte CA
125 Antigen gemäß Anspruch 1 in einem physiologisch
akzeptablem Trägermittel enthält.
12. Immunogenzusammensetzung gemäß Anspruch 11, worin das
isolierte CA 125 Antigen eine immunoreaktive Species
des CA 125 mit einem Molekulargewicht von ca. 200 kDa
ist.
13. Verwendung des Immunogens gemäß Anspruch 11 zur
Herstellung eines Antikörpers gegen CA 125.
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