DE3780527T2

DE3780527T2 - Verfahren zur herstellung von 5'-guanyl-saeure.

Info

Publication number: DE3780527T2
Application number: DE8787304689T
Authority: DE
Inventors: Tatsuro Fujio; Akihiko Maruyama
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1986-06-02
Filing date: 1987-05-27
Publication date: 1993-03-04
Anticipated expiration: 2007-05-28
Also published as: KR880000595A; EP0251489B1; EP0251489A2; JPH0716431B2; JPS62285797A; EP0251489A3; DE3780527D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Guanylsäure (hier nachstehend als "GMP" bezeichnet).
Es besteht eine große Nachfrage nach GMP als Gewürz- Wirkstoff, und im Bereich der Nahrungsmittelindustrie ist die Entwicklung eines kostengünstigeren Verfahrens zur Herstellung von GMP wünschenswert gewesen.
Zu den bisher bekannten Verfahren zur Herstellung von GMP gehören (1) ein Verfahren zum enzymatischen Abbau von aus Hefezellen extrahierten Ribonucleinsäuren, (2) ein Verfahren zur chemischen Phosphorylierung von durch Fermentation erzeugtem Guanosin, (3) ein Verfahren zur Umwandlung von durch Fermentation produzierter 5'-Xanthylsäure (hier nachstehend als "XMP" bezeichnet) zu GMP mit Hilfe von Bakterien, die zur Gattung Brevibakterium oder zur Gattung Corynebakterium gehören (Japanese Published Examined Patent Application No. 39069/71, die dem US-Patent Nr. 3,592,733 entspricht und Japanese Published Unexamined Patent Application No. 78697/84), und (4) ein Verfahren zur Umwandlung von XMP zu GMP unter Verwendung einer Escherichia coli- Transformante, die durch einen rekombinanten DNA-Vektor transformiert worden war, der ein DNA-Fragment umfaßte, das ein XMP-Aminase(GMP-Synthetase)-codierendes Gen enthielt (Japanese Published Unexamined Patent Application No. 224498/85, die der EP-A 0 185 092 entspricht).
Das Verfahren zur Herstellung von GMP aus XMP mit Hilfe einer enzymatischen Umsetzung beruht auf den nachstehend dargestellten, von XMP-Aminase katalysierten Reaktionen:
(1) MMP + ATP + NH&sub3;
↓ XMP-Aminase
GMP + 5'-Adenylsäure + Pyrophosphorsäure
oder
(2) XMP + ATP + L-Glutamin
↓ XMP-Aminase
GMP + 5'-Adenylsäure + L-Glutaminsäure
Ferner wurde berichtet, daß die Aktivität zur Umwandlung von XMP zu GMP durch Ausstattung eines Mikroorganismus, der zur Gattung Brevibakterium gehört, mit einer Resistenz gegen Döcoyinin [Biotechnol. Bioengineer. 13 (1971), 229- 240] erhöht wird.
Wenn die Menge des Mikroorganismus entsprechend der Erhöhung der XMP-Aminaseaktivität abnimmt, wird jedoch in den üblichen Fermentationsverfahren zur Herstellung von GMP die ATP- regenerierende Aktivität ein geschwindigkeitsbestimmender Schritt. Daher ist es zum Ausgleich der niedrigen ATP-regenerierenden Aktivität und zur Erhöhung der GMP-Produktivität erforderlich, entweder dem Medium ATP zuzusetzen, was teuer ist, oder eine relativ große Menge des ATP- produzierenden Mikroorganismus zu verwenden. Dies trifft auch auf das in EP-A 0 185 092 beschriebene Verfahren zu, in dem entweder dem Kulturmedium ATP zugesetzt (Beispiele 1 bis 3) oder eine E. coli-Transformante verwendet wird, die selber zur ATP-Regeneration fähig ist, und in einem solchen Fall kann auf den ATP-Zusatz verzichtet werden (Beispiele 4 und 5).
Gemäß der vorliegenden Erfindung fand man, daß die GMP-Ausbeuten der in EP-A 0 185 092 beschriebenen E. coli- Transformante durch Kopplung der Umsetzung der E. coli- Transformante mit der Reaktion eines XMP/ATP-produzierenden Mikroorganismus der Gattung Brevibakterium und Corynebakterium wesentlich erhöht werden kann, wobei die gekoppelte Umsetzung in einem Kulturmedium stattfindet, das ein organisches Lösungsmittel, ein grenzflächenaktives Mittel oder ein lytisches Enzym enthält.
Die vorliegende Erfindung liefert so ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Guanylsäure (GMP) aus 5'-Xanthylsäure (XMP), das die Züchtung einer E. coli-Transformante, die einen rekombinanten DNA-Vektor enthält, der ein 5'-Xanthylsäureaminase(5'Guanylsäuresynthetase)Gen enthaltendes DNA- Fragment enthält, und die die Fähigkeit zur Erzeugung von GMP aus XMP, ATP, Ammoniak und/oder Glutamin in einem Kulturmedium besitzt, das Ammoniak und/oder Glutamin, eine Kohlenstoffquelle und weitere für das Wachstum des Mikroorganismus essentielle Nährstoffe, einschließlich einer Phosphationen- und Magnesiumionenquelle, einer XMP- und ATP- Quelle und ein organisches Lösungsmittel, ein grenzflächenaktives Mittel oder ein lytisches Enzym enthält, das Anreichern des Produkts GMP im Kulturmedium und die Gewinnung des angereicherten GMP umfaßt, wobei die XMP- und ATP-Quelle einen IP- und ATP-produzierenden Mikroorganismus der Gattung Brevibakterium oder Corynebakterium umfaßt, der die Fähigkeit zur XMP-Produktion im Medium zur Umwandlung in GMP durch die Transformante sowie die Fähigkeit zur Umwandlung von AMP, das von der E. coli-Transformanten produziert wird, zurück in ATP besitzt, um als ATP-Quelle der Transformanten zur Umwandlung von XMP in GMP zu dienen, und dadurch die beiden durch die zwei Mikroorganismen katalysierten Umsetzungen zu koppeln.
Die XMP- und ATP-produzierenden, zur erf indungsgemäßen Verwendung geeigneten Mikroorganismen schließen zum Beispiel Brevibakterium ammoniagenes ATCC 21076, Brevibakterium ammoniagenes ATCC 21154, Brevibakterium ammoniagenes X-21 ATCC 21263, Corynebakterium glutamicum ATCC 15135 und Corynebakterium glutamicum X-31 ATCC 21265 ein. Durch Züchtung dieser Mikroorganismen nach einem üblichen Züchtungsverfahren in einem üblichen Medium, das geeignete Kohlenstoffquellen, geeignete Stickstoffquellen, geeignete anorganische Materialien, Aminosäuren, Vitamine etc. enthält, unter aeroben Bedingungen bei Einstellung der Temperatur, des pH-Werts etc., kann sowohl eine beträchtliche XMP-Menge im Medium angereichert, als auch die ATP-Quelle geliefert werden, die zur Umwandlung von XMP in GMP erforderlich ist.
Geeignete Kohlenstoffquellen für die XMP/ATP-produzierenden Mikroorganismen schließen Kohlenhydrate ein, wie Glucose, Fructose, Sucrose und Maltose, Zuckeralkohole, wie Mannit, Sorbit und Glycerin, verschiedene organische Säuren, wie Brenztraubensäure, Milchsäure und Zitronensäure, sowie verschiedene Aminosäuren, wie Glutaminsäure, Methionin und Lysin. Weitere geeignete Quellen schließen Stärkehydrolysat, Molassen, Reiskleie, Manioka, Zuckerrohrrückstand und Maisquellwasser ein.
Geeignete Stickstoffquellen schließen Ammoniak, verschiedene anorganische und organische Ammoniumsalze ein, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumacetat, Aminosäuren, wie Glutaminsäure, Glutamin und Methionin, und Stickstoff-enthaltende organische Materialien wie Peptone, NZ-Amine, Maisquellwasser, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Caseinhydrolysat und Fischmehl oder seine Spaltprodukte.
Verschiedene weitere anorganische Stoffe, wie Kaliumdihydrogenphosphat, Natriummonohydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Calciumchlorid, Eisenchlorid, Kupfersulfat, Manganchlorid, Ammoniummolybdat und Zinksulfat können, falls es für das Wachstum des Mikroorganismus erforderlich ist, neben sämtlichen erforderlichen Vitaminen, Aminosäuren, Nucleinsäuren etc. zum Medium zugesetzt werden. Es ist selbstverständlich nicht erforderlich, diese speziellen Nährstoffe dem Medium gesondert zuzusetzen, wenn sie durch andere, vorstehend beschriebene Mediumbestandteile zugeführt werden.
Die Züchtung wird üblicherweise unter aeroben Bedingungen durchgeführt, zum Beispiel durch Schütteln oder durch Luftzufuhr und Rühren. Die bevorzugte Züchtungstemperatur beträgt üblicherweise 20 bis 40ºC, stärker bevorzugt 25 bis 35ºC, und der pH-Wert des Mediums wird während der Züchtung vorzugsweise etwa auf dem Neutralpunkt beibehalten. Die Züchtungsdauer beträgt üblicherweise 10 bis 120 Stunden.
Als GMP-produzierender Mikroorganismus kann jede E. coli-Transformante verwendet werden, die ein rekombinantes DNA-Fragment trägt, das das 5'-Xanthylsäureaminase(5'Guanylsäuresynthetase)-Gen enthält. Eine solche Transformante ist Escherichia coli K294/pXA10, FERM BP-499, dessen XMP- Aminaseaktivität durch Transformation mit einem Plasmid erhöht wird, das das Gen enthält, das die in den Vektor pBR322 inserierte XMP-Aminase (guaA) von Escherichia coli K-12 codiert. Die genauen Verfahren zur Konstruktion dieses Plasmids, Plasmid pXA10, und die nachfolgende Transformation des E. coli-Stammes K294 werden in EP-A 0 185 092 beschrieben, auf die hier Bezug genommen wird.
Diese Transformanten können im wesentlichen unter denselben Bedingungen und unter Verwendung derselben Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, derselben Quellen für anorganische Salze und weiterer erforderlicher Nährstoffe, wie sie schon vorstehend für den XMP/ATP-produzierenden Mikroorganismus beschrieben und aufgeführt sind, gezüchtet werden, mit der Ausnahme, daß zur Umwandlung von XMP in GMP eine spezielle Ammoniak- und/oder Glutaminquelle erforderlich ist. Mit E. coli K294/pXA10, FERM BP-499, werden besonders gute Ergebnisse erzielt, wenn der Tryptophangehalt des Mediums unter 5 mg/l gehalten wird.
Die Züchtung der Transformante wird üblicherweise unter aeroben Bedingungen durchgeführt, zum Beispiel durch Schütteln oder durch Luftzufuhr und Rühren. Die bevorzugte Züchtungstemperatur beträgt 20 bis 50ºC, stärker bevorzugt 28 bis 45ºC. Der pH-Wert wird vorzugsweise etwa auf dem Neutralpunkt beibehalten. Die Züchtungszeit beträgt üblicherweise 1 bis 48 Stunden.
Verschiedene Kulturtechniken können im erf indungsgemäßen Verfahren angewendet werden und entweder eine getrennte oder gleichzeitige Züchtung von zwei Mikroorganismen einschließen. Nach dem Ende der getrennten Züchtung der zwei Mikroorganismen können somit eine XMP-enthaltende Fermentationsflüssigkeit und eine Kulturflüssigkeit der E. coli- Transformante, die die Fähigkeit zur Umwandlung von XMP in GMP besitzt, gemischt werden. In einer anderen Ausführungsform kann eine die E. coli-Transformante enthaltende Kulturflüssigkeit zu jeder Zeit vom Beginn bis zum Abschluß der XMP-Fermentation, oder umgekehrt, zum XMP-Fermentationsmedium zugesetzt werden. Der XMP-produzierende Mikroorganismus und die E. coli-Transformante können immer wieder in einem einzigen Medium gleichzeitig gezüchtet werden.
Der Kulturbrühe, die XMP, XMP-fermentierende Zellen und die transformierten E. coli-Zellen enthält, werden Ammoniak und/oder Glutamin, ein ATP-regenerierendes Substrat, ein grenzflächenaktives Mittel, ein organisches Lösungsmittel, z. B. Xylol, oder ein lytisches Enzym zugesetzt.
Die Umwandlung von XMP in GMP wird durch Zusatz von Phosphat- und Magnesiumionen zum Gemisch durchgeführt, wobei der pH-Wert auf 6 bis 10, vorzugsweise auf 7 bis 8, eingestellt und die Temperatur 1 bis 48 Stunden bei 20 bis 50ºC gehalten wird. Es ist wünschenswert, daß die XMP-Konzentration bei der Umwandlung von XMP in GMP in einem Bereich von 1 bis 100 mg/ml in Bezug auf XMP · Na&sub2; · 7 H&sub2; 0 liegt, das hier nachstehend für Konzentrationsangaben verwendet wird.
In diesem Stadium können sämtliche geeigneten Kohlenhydrate, zum Beispiel Glucose, Arabinose, Lactose, Maltose, Sucrose, Mannit, Sorbit, Trehalose und Stärkehydrolysat, organische Säuren, zum Beispiel Brenztraubensäure, Milchsäure, Essigsäure und alpha-Ketoglutarsäure und Aminosäuren, zum Beispiel Glycin, Alanin, Asparaginsäure und Glutaminsäure verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform können phosphorylierte Verbindungen, zum Beispiel das Natrium- oder Kaliumsalz der Acetylphosphorsäure, Carbamylphosphorsäure und Creatinphosphorsäure, verwendet werden.
Zu den verwendeten grenzflächenaktiven Mitteln gehören kationische grenzflächenaktive Mittel, wie Polyoxyethylenstearylamin (zum Beispiel Nymeen S-215, von Nihon Yushi hergestellt), Cetyltrimethylammoniumbromid etc., anionische grenzflächenaktive Mittel, zum Beispiel Natriumoleylamidsulfat etc., und amphotere grenzflächenaktive Mittel, zum Beispiel Polyoxyethylensorbitanmonostearat (zum Beispiel Nonion ST221, von Nihon Yushi hergestellt). Die geeigneten Konzentrationen von grenzflächenaktiven Mitteln liegen im Bereich von 0,1 bis 50 mg/ml, vorzugsweise 1 bis 20 mg/ml.
Zu den geeigneten organischen Lösungsmitteln gehören Toluol, Xylol, aliphatische Alkohole, Benzol und Ethylacetat, und sie können in Konzentrationen von 0,1 bis 50 ul/ml, vorzugsweise 1 bis 20 ul/ml, verwendet werden.
Es ist wünschenswert, daß bei der Umwandlung von XMP in GMP die Konzentration von Phosphat- und Magnesiumionen in einem Bereich von 4 bis 400 mM gehalten wird. Diese können, falls erforderlich, durch Zusatz von geeigneten Phosphatund/oder Magnesiumsalzen zum Kulturmedium zugeführt oder zugesetzt werden. Zu den geeigneten Phosphatsalzen gehören die Natrium-, Kalium- und Magnesiumsalze der Phosphorsäure. Als Magnesiumsalz können sämtliche Salze des Magnesiums mit anorganischen und organischen Säuren verwendet werden.
Als Quelle für Ammoniak und/oder Glutamin können gasförmiges Ammoniak, anorganische und organische Ammoniumsalze, Glutamin und Glutamin-enthaltende natürliche Produkte, wie Hefeextrakt, Casaminosäuren und Maisquellwasser verwendet werden.
Die GMP-Gewinnung aus der Kulturbrühe kann nach üblichen Verfahren unter Verwendung von Aktivkohle, Ionenaustauscherharzen etc. durchgeführt werden.
Das erf indungsgemäße Verfahren wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Schritt (a) Ein sterilisiertes, 70 ml Teströhrchen, das 10 ml eines Saatmediums (pH-Wert 7,2) enthielt, das 1% Polypepton, 0,5% Fleischextrakt, 0,5% Hefeextrakt und 0,25% Natriumchlorid umfaßt, wurde mit einer Öse voll Escherichia coli K294/pXA10 (FERM BP-499) angeimpft und die Züchtung 16 Stunden bei 30ºC durch einen Reziprokschüttler (280 reziproke Bewegungen/Min.) durchgeführt. Anschließend wurden 200 ml M9-Medium (pH-Wert 7,4), das aus 6 mg/ml Na&sub2;HPO&sub4;, 3 mg/ml KH&sub2;PO&sub4;, 5 mg/ml NaCl, 1 mg/ml NH&sub4;Cl, 4 ug/ml Thiamin · HCl, 3 mg/ml Glucose und 0,25 mg/ml MgSO&sub4; · 7 H&sub2;O und 2 mg/ml Casaminosäuren bestand, in einem 1 l Erlenmeyerkolben mit 2 ml des kultivierten Saatmediums angeimpft, und die Züchtung wurde in einem Rundschüttler (220 UpM) 16 Stunden bei 30ºC durchgeführt. Die Zellen wurden durch 20-minütige Zentrifugation bei 13000 · g gesammelt und zur Konservierung auf -20ºC eingefroren.
Schritt (b) Ein sterilisiertes Teströhrchen, das 10 ml eines Saatmediums enthielt, das aus 1% Polypepton, 0,5% Fleischextrakt, 0,5% Hefeextrakt und 0,25% Natriumchlorid (pH-Wert 7,2) bestand, wurde mit einer Öse voll Brevibakterium ammoniagenes ATCC 21154 angeimpft und die Züchtung 24 Stunden bei 30ºC durch einen Reziprokschüttler (280 reziproke Bewegungen/Min.) durchgeführt. Anschließend wurden 300 ml Erlenmeyerkolben mit Prallblechen, die 20 ml eines Mediums enthielten, das aus 15% Glucose, 0,01% Caseinhydrolysat, 0,7% Hefeextrakt, 1,0% Ammoniumsulfat, 0,3% KH&sub2;PO&sub4;, 0,3% K&sub2;HPO&sub4;, 0,5% MgSO&sub4; · 7 H&sub2;O, je 10 ug/ml Adenin und Guanin und 10 ug/l Biotin (pH-Wert 7,2) bestand, mit 2 ml des kultivierten Saatmediums angeimpft, 20 Minuten bei 120ºC autoklaviert und durch einen Rundschüttler (220 UpM) bei 30ºC gezüchtet, wobei der pH-Wert, falls erforderlich, durch Zusatz von Harnstoff zum Medium etwa bei 7 gehalten wurde. Bis zur 92sten Stunde nach Beginn der Züchtung wurden 38,0 mg/ml XMP gebildet.
Schritt (c) Die eingefrorenen, in Schritt (a) produzierten Escherichia coli-Zellen wurden in Wasser suspendiert und der in Schritt (b) produzierten XMP-Fermentationsflüssigkeit zugesetzt, so daß die Naßzell-Konzentration 7,5 mg/ml betrug. Dem Gemisch wurden anschließend 50 mg/ml Glucose, 2 mg/ml Natriumphytat, 5 mg/ml Na&sub2;HPO&sub4;, 5 mg/ml MgSO&sub4; · 7 H&sub2;O, 4 mg/ml Nymeen S-215 und 10 ul/ml Xylol zugesetzt. 20 ml-Mengen des so erhaltenen Gemisches wurden anschließend in 200 ml Bechergläser gegossen und zur Durchführung der Umwandlungsreaktion von XMP in GMP 24 Stunden bei 42ºC durch einen Magnetrührer mit 900 UpM gerührt, wobei der pH-Wert durch Zusatz von wäßrigem Ammoniak auf etwa 7,4 eingestellt wurde. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß in 23 Stunden 32,0 mg/ml GMP (berechnet als GMP · Na&sub2; · 7 H&sub2;O) gebildet und angereichert wurden.

Beispiel 2

Beispiel 1 wurde wiederholt, abgesehen davon, daß anstelle der gefrorenen Escherichia coli-Zellen 2 ml der Escherichia coli-Kulturbrühe direkt den 20 ml Brevibakterium ammoniagenes-Kulturbrühe, die 33 mg/ml XMP enthielten, zugesetzt wurden. Die Umwandlung von XMP in GMP in der vereinigten Kulturbrühe wurde in der dem Beispiel 1 entsprechenden Weise durchgeführt. Im Ergebnis wurden 23,1 mg/ml GMP gebildet.
Die relevanten Einzelheiten der Hinterlegung der E. coli-Transformante, auf die hier vorstehend Bezug genommen und die in der EP-A 0 185 092 beschrieben wird, sind nachstehend angegeben:
Escherichia coli K294/pXA10 wurde am 8. März 1984 nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM BP- 499, hinterlegt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von 5'-Guanylsäure (GMP) aus 5'-Xanthylsäure (XMP) umfassend das Kultivieren einer E. coli-Transformante, die einen rekombinanten DNA-Vektor enthält, der ein 5'-Xanthylsäureaminase (5'-Guanylsäuresynthetase)-Gen enthaltendes DNA-Fragment enthält, und die die Fähigkeit zur Erzeugung von GMP aus XMP, ATP, Ammoniak und/oder Glutamin in einem Kulturmedium besitzt, in einem Ammoniak und/oder Glutamin, eine Kohlenstoffquelle sowie andere für das Wachstum der Mikroorganismen essentielle Nährstoffe einschließlich einer Phosphat- und Magnesiumionenquelle, einer XMP- und ATP- Quelle und ein organisches Lösungsmittel, grenzflächenaktives Mittel oder lytisches Enzym enthaltenden Kulturmedium, Anreichern von GMP im Kulturmedium und das Gewinnen des angereicherten GMP, dadurch gekennzeichnet, daß die XMP- und ATP-Quelle ein MMP und ATP bildender Mikroorganismus der Gattung Brevibacterium oder Corynebacterium ist, der die Fähigkeit zur Bildung von XMP für die Umwandlung in GMP durch die Transformante sowie die Fähigkeit zur Umwandlung von durch die E. coli-Transformante erzeugtem AMP zurück in ATP hat, um so als ATP-Quelle für die Transformante bei der Umwandlung ,vom XMP in GMP zu wirken und dabei die durch die zwei Mikroorganismen katalysierten beiden Reaktionen miteinander zu koppeln.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die E. coli-Transformante Escherichia coli K294/pXA10, FERM BP-499 ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der XMP und ATP bildende Mikroorganismus

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21076

Brevibacterium ammoniaqenes ATCC 21154

Brevibacterium ammoniagenes X-21 ATCC 21263

Corynebacterium glutamicum ATCC 15135 oder

Corynebacterium glutamicum X-31 ATCC 21265

ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium ein Polyoxyethylenstearylamin als grenzflächenaktives Mittel und Xylol als organisches Lösungsmittel enthält.