JPS60224498A - ５′−グアニル酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は５′−グアニル酸（以下ＧＭＰと称す）の製造
法に関する。さらに詳しくは、５′−キサンチル酸（以
下ＸＭＰと称す）とアンモニアおよび／またはＬ−グル
タミンとからＧＭＰを生成する能力を有し、かつリン酸
化物以外のエネルギー供与体を利用してアデノシン−燐
酸（以下ＡＭＰと称す）をアデノシン三燐酸（以下ＡＴ
Ｐと称す）に変換する能力を有する大腸菌を用いてＧＭ
Ｐを製造する方法、ならびにグアニル酸合成酵素遺伝子
（以下ｇｕａＡと称することもある）領域が組込まれて
いるベクターを含有する細菌を用いる上記方法によるＧ
ＭＰの製造方法に関する。

ＧＭＰは調味料として多大の需要があり、そのより安価
な製造法の開発が望まれている。これまでＧＭＰの製造
法としては、（１）酵母菌体から抽出したリボ核酸を酵
素的に分解して製造する方法、（２）発酵法により生産
されるグアノシンを化学的に燐酸化する方法、（３）発
酵法により生産されるＸＭＰをブレビバクテリウム属ま
たはコリネバクテリウム属の細菌を用いてＧＭＰに変換
する方法〔特公昭４６−ａ９＋６ｅ９．特願昭５７−１
８７０５０〕などが知られている。（３）の方法は次式
に示すように、転換に必要な高エネルギー化合 ＡＴＰ　ＡＤＰ　八ＭＰ 物であるＡＴＰを安価なエネルギー供与体（グルコース
など）を資化することによりＡＭＰから再生することが
できる優れた方法である。さらに薬剤耐性によりＸＭＰ
からＧＭＰへの変換酵素〔グアニル酸合成酵素、別名：
キサンチル酸アミナーゼ、以下ＧＭＰシンセターヤと称
す〕活性を強化した変異株を用いる方法１：Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ、口ｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ、　。

井、　２２９−２４０　（１９７１））なども知られて
いる。

近年、遺伝子組換え技術を応用することにより大腸菌に
おいて特定の酵素活性を強化することが比較的容易とな
ってきた。

このような背景のもとに種々検討を行った結果、本発明
者らはＸＭＰとアンモニアおよび／またはＬ−グルタミ
ンとからＧＭＰを生成する能力を有し、かつ燐酸化物以
外のエネルギー供与体を利用してＡＭＰをＡＴＰに変換
する能力を有する大腸菌を用いて燐酸イオンおよびマグ
ネシウムイオンの存在下において、ＧＭＰを製造し得る
こと、さらに、大腸菌染色体のグアニル酸シンセターゼ
遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体
ＤＮＡを用いて形質転換を行った上記性質を有する大腸
菌を用いて、さらに効率的にＧＭＰを製造しうることを
見出し本発明を完成するに至った。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明に用いる大腸菌（Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ、以下Ｂ、ｃｏｌｉ　と略記することもある）とし
ては、ＸＭＰ、アンモニアおよび／またはＬ−グルタミ
ン、および大腸菌が利用しつる燐酸化物以外のエネルギ
ー供与体から、ＧＭＰを生成する能力を有するものであ
ればいずれでも用いつる。好適にはＢ、ｃｏｌｉ　ＰＬ
１０６８　ＣＪ、Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　
１２３．２７−３７　（１９８１）参照］　、　Ｂ、ｃ
ｏｌｉ　ＫＬＣ４２１（ｇｕａＡ−。

口、ｃｏｌｉ　Ｋ２９４　／　ｐＸＡｌｏ　ＦＢＲＭ−
ロＰ４９９などを例示することができる。

大腸菌染色体のｇｕａΔ遺伝子を含むＤＮＡ断片をベク
ターであるプラスミドｐＢＲ３２２のテトラサイクリン
耐性部位に挿入し、さらにこのプラスミドのｇｕａＡ遺
伝子の上流にトリプトファンフロモーター（Ｐｔｒｐ）
を連結したプラスミド（ｐＸＡｌｏ）、およびｐＸＡ１
０！、：よッテに２９４株を形質転換して得られるＢ、
ｃｏｌｉ　Ｋ　２９４／ｐＸＡ１０株の造成については
参考例１に示す。

これらの大腸菌を通常の培養方法によって培養すること
によって、ＸＭＰ、アンモニアおよび／またはＬ−グル
タミン、および燐酸化物以外のエネルギー供与体とから
ＧＭＰを生成する強力な活性を有する培養液、菌体また
はそれらの処理物を得ることができる。すなわち、これ
らの大腸菌を炭素源、窒素源、無機物、アミノ酸、ビタ
ミン等を含有する通常の培地中において、好気的条件下
にて温度、ｐＨなどを調節しつつ培養を行えばよい。

炭素源としては、グルコース、フラクトース。

シュー９ｏ−ス、マルトース、マンニ）−７１／、ソル
ビトールなどの炭水化物、糖アルコール、グリセロール
、澱粉加水分解液、糖蜜などが使用でき、またピルビン
酸、乳酸、クエン酸などの各種有機酸、さらにはグルタ
ミン酸、メチオニン等の各種アミノ酸も用いつる。

窒素源としては、アンモニアあるいは塩化アン％＝つＡ
、硫１１２アンモニウム、炭酸アンモニウム。

酢酸アンモニウムなどの各種無機右よび有機アンモニウ
ム塩類、グルタミン酸、グルタミン、メチオニンなどの
アミノ酸、あるいはペプトン、ＮＺ−アミン、コーン・
スチープ・リカー、肉エキス。

酵母エキス、カゼイン加水分解物、フィッシュ・ミール
あるいはその消化物、蛸加水分解物などの含窒素有機物
などの種々のものが使用可能である。

さらに無機物としては、燐酸二水素カリウム。

燐酸−水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリ
ウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸銅。

塩化マンガン、モリブデン酸アンモン、硫酸亜鉛などを
必要に応じて添加する。微生物の生育に必要なビタミン
、アミノ酸、核酸その他のものは前記したような他の培
地成分に伴って培地に供給されれば特に加えなくてもよ
い。

培養は、振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条
件下に行う。培養温度は２ｏ〜５０℃、好ましくは２８
〜４２℃がよい。培養中の培地のｐＨは中性付近に維持
することが望ましい。培養時間は通常１〜２４時間であ
る。

かくして得られる大腸菌の培養物を、そのまま、または
該培養物を種々処理して得られる処理物を用いて、これ
とＸＭＰ、アンモニアおよび／またはＬ−グルタミン、
および燐酸化物以外のエネルギー供与体と接触させる。

処理物としては、培養物の濃縮物、もしくは乾燥物、培
養物を遠心分離機で処理して得られる上清液もしくは菌
体、菌体の乾燥物、アセトン処理物、界面活性剤および
／または有機溶剤処理物、溶菌酵素処理物、固定化菌体
あるいは菌体からの抽出酵素標品などがあげられる。

接触反応は水性媒体中であればいずれでも行うことがで
き、最も好適には微生物の培養液中にＸＭＰ、アンモニ
アおよび／またはＬ−グルタミン、および燐酸化物以外
のエネルギー供与体、さらに必要に応じて燐酸イオン、
マグネシウムイオン、さらには界面活性剤および／また
は有機溶剤を存在させて培養液中にＧＭＰを蓄積せしめ
るか、培養終了後に培養液、菌体懸濁液、もしくはそれ
らの処理物にＸＭＰ、アンモニアおよび／またはＬ−グ
ルタミン、および燐酸化物以外のエネルギー供与体を加
え、さらに必要に応じて燐酸イオン。

マグネシウムイオン、さらには界面活性剤および／また
は有機溶剤を加え、２０〜５０℃にて１〜４８時間反応
させることにより、ＧＭＰを蓄積させることができる。

この際ｐＨを６〜１０、より好ましくは７〜８に調節す
ることが望ましい。培地中および反応液中の各基質濃度
（ｇ／Ｉｌ）は：ＸＭＰ　１−１００　；　（ＮＨ，）
２　ＳＯ４２５以下；Ｌ−グルタミン２５以下；である
。

ＸＭＰ源としては、高度精製標品のほか、微生物による
ＸＭＰ発酵液をそのまま、またはその濃縮物、さらには
その部分精製標品など、ＧＭＰ蓄積を妨げない限りＸＭ
Ｐを含有するものであればいずれでも用いつる。

エネルギー供与体としては、非燐酸化化合物であって、
使用する大腸菌によって利用されるものであれば、グル
コース、アラビノース、ラクトース、マルトース、シュ
ークロース、マンニトール。

ソルビトール、トレハロース、糖蜜、澱粉加水分解物な
どの炭水化物、ピルビン酸、乳酸、酢酸。

α−ケトゲルタール酸などの有機酸、グリシン。

アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などのアミノ
酸などが用いられる。これらは１〜２００ｇ／Ｒの濃度
で用いられる。

燐酸イオンおよびマグネシウムイオンの濃度は接触反応
液中に４〜４００ｍＭの範囲を保つことが望ましい。培
養液もしくは菌体から反応液中に持込まれる量がこの濃
度範囲を満たす場合は添加する必要はなく、−力不足す
る場合は上記の濃度範囲に入るように添加する。燐酸イ
オンとしては、燐酸のナトリウム塩、カリウム塩、マグ
ネシウム塩などいずれも使用できる。また、マグネシウ
ムイオンとしては無機塩でも、有機酸の塩でも使用でき
る。

界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・ステアリル
アミン（例えばナイミーンＳ−２１５゜日本油脂社製）
、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイド等のカチ
オン性界面活性剤、ナトリウムオレイルアミド硫酸等の
アニオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン
・モノステアレート（例えばノニオン５Ｔ２２１．日本
油脂社製）等の両性界面活性剤等が用いられ、これらは
通常０．１〜５０ｇ／Ｉｌ、好ましくは１〜２０ｇ／β
の濃度にて用いられる。

有機溶剤としては、トルエン、キシレン、脂肪族アルコ
ール、ベンゼン、酢酸エチルなどが用いられ、その濃度
は０．１〜５０ｍ１／Ｉ１１好ましくは１−１−２Ｏ／
ｊ！がよい。

水性反応液中に蓄積したＧＭＰを採取する方法としては
、活性炭やイオン交換樹脂等を用いる通常の方法を用い
ることができる。

以下に本発明の実施例を示す。

（リン酸二ナトリウム６ｇ／ｌ、リン酸−カリウム３ｇ
／Ｃ塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／
Ｒ，チアミン塩酸塩４ｍｇ／β、硫酸マグネシウム２５
０ｍｇ／Ｃグルコース３ｇ／ｌ）を２００ｍｌ含む１１
三角フラスコに植菌し、２８℃にて１晩往復振盪培養を
行った。菌体を遠心分離にて集め、凍結保存（−２０℃
）した。

凍結菌体を室温にて加水し、湿潤菌体重量にて最終濃度
が２００ｇ／ｊ！となるように懸濁した液に、ＸＭＰ−
Ｎａ２　・７ＨａＯ４０ｇ／Ｌグルコース５０ｇ／Ｌフ
ィチン酸ソーダ２ｇ／Ｉｔ。

Ｎａ２　ＨＰＯ４５ｇ／Ｉｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０５
ｇ／Ｉｔとなるように各成分を溶解し、２００ｍｌビー
カーに２０ｒＩｌｌずつ分注した。各々を恒温水槽にて
３７℃に保温し、マグネチック・スターラーにて９．０
Ｏｒｐｍにて攪拌し、かつ９％のアンモニア水にてｐＨ
を７．４に調節しつつ、２４時間保ちＸＭＰからＧＭＰ
への転換を行わしめた（第１表参照）。第１表の（１）
では、上記組成の反応液そのままを、（２）では上記組
成にナイミーン（以下ＮＩＭと略称す）Ｓ−２１５を４
ｇ／ｉｔおよびキシレンを１０ｍ１／Ｒ添加したものを
用いた。

第　１　表 （１）　２．２ （２）＋　５．２ 実施例２ Ｂ、ｃｏ！ｉ　Ｋ２９４株およびグアニル酸合成酵素遺
伝子を含むプラスミドを保持しているＢ、ｃｏｌｉ　Ｋ
２９４／ｐＸＡ１０　（本文参照）を実施例１と同様に
（ただし、Ｋ２９４　／ｐＸＡ１０株の培養にはアンピ
シリン５０ｍｇ／ｊ！を添加したＭ９培地を使用）培養
した。

ＮＩＭ　Ｓ−２１５およびキシレンを含む実施例１−（
２）と同じ条件で反応した結果、［＋、ｃｏｌｉ　Ｋ２
９４株では２３時間で５．５ｇ／、ｉ！、またＢ、ｃｏ
ｌｉ　Ｋ２９４／ｐＸＡ１０株では６時間で２３．８ｇ
／ＩｌのＧＭＰ　・Ｎａ２　・７Ｈ２０が生成した。

実施例３゜ 口、ｃｏｌｉ　Ｋ２９４　／ｐＸＡｌＯ株を、アンピシ
リン５０ｍｇ／Ｉｌを含むＭ９培地にて実施例１と同様
に培養した。菌体量は湿潤菌体重量にて７．５　ｇ　／
　Ｒであった。この培養液に、ＸＭＰ、グルコース、フ
ィチン酸ソーダ、　Ｎａａ　ＨＰＯ４、Ｍｇ５Ｏ＜　’
　７Ｈ２０，ＮＩＭ　Ｓ−２１５，キシレンを各々４０
ｇ／Ｌ　５０ｇ／β、２ｇ／ｊ！、５ｇ／Ｃ５ｇ／Ｉｌ
、４ｇ／ｊ２．１０ｍｌ／Ｉｌとなるように添加し、実
施例１と同様にＸＭＰからＧＭＰへの転換を行わせた結
果、２３時間でＧ　Ｍ’　Ｐ−Ｎ　ａ　２　・７Ｈ２０
が５．２　ｇ　／　Ｉｌ生成した。

参考例１゜ ＧＭＰシンセターゼを効率よく発現する組換え体プラス
ミドの造成： １）ｇｕａＡのｐＢＲ３２２へのサブクローニング二〇
、ｃｏｌｉ染色体由来のｇｕａオペロン（ｇｕａＡとｇ
ｕａＢを含む）とＣｏ１Ｅ＋　とのハイブリッド・プラ
スミドであるｐＬＣ３４−１０を保有しているＢ、ｃｏ
ｌｉ　Ｊ　Ａ　２００株を、バタトトリプトン（ディフ
コ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ
／Ｃ食塩５ｇ／ｌを含み、ｐＨを７．２に調整したし培
地に植菌し、３０℃で１８時間培養した。得られた培養
菌体から、公知の方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈユ、　１５１３　（１９７９）　］に
従ってプラスミドｐＬｃ３１１０を分離・精製した。ベ
クターとして用いるｐＢＲ３２２も同様の方法でその保
有株であるＢ、ｃｏｌｉ　Ｊ　Ａ　１９４株１：　Ｂ、
　Ｒａｔｚｋｉｎ　＆Ｊ、　Ｃａｒｂｏｎ、　Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　
７４４８７　（１９７７））から分離・精製した。なお
、以下特記しないかぎり、菌の培養および保存にはＬ培
地を用いた。

ｐＬＣ３４−１０は約１５キロベース（以下Ｋｂと略記
する。）の大きさで、制限酵素Ｅｃ。

Ｒ１で１個所、Ｐｓｔｌで３個所切断された（第１図参
照）。そのうち、Ｐｓｔｌ切断部位のプラスミド断片（
約３．６Ｋｂ）を精製した。

このようにして得た約０．２μｇのｐＬＣ３４−１０由
来のＤＮＡ断片と、約０．０５μｇのｐＢＲ３２２由来
のＤＮＡ断片を２０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，６）、
１０ｍＭ　Ｍｇ、ＣＲ２゜１０ｍＭジチオスレイトール
、および０．５　ｍ　ＭＡＴＰを含む緩衝液（以下“Ｔ
４ＤＮＡ！ｊガーゼ緩衝液”と称す）４０μβ中にて２
単位のＴ４リガーゼにより４℃、１８時間処理した。か
くして得られた組換え体プラスミドＤＮＡを用い、ｇｕ
ａＡに変異のある０、ｃｏｌｉ　ＰＬ１０６８株をＣｏ
ｈｅｎ　らの方法［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ。

６９２１１０　（１９７２）］により形質転換し、テト
ラサイタリン（２０μｇ　／ｍｌ　）に耐性で、かつ宿
主が示すグアニン要求性を失った形質転換株を得た。

この形質転換株からプラスミドを分離精製し、該ＤＮＡ
をＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔ　Ｉなどの制限酵素で消化するこ
とにより、プラスミドの構造解析を行った結果、ｐＢＲ
３２２のＥＣ０ＲＩ−ＰｓｔＩ部位にｐＬＣ３４−１０
由来のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔｌＤＮＡ断片（約７Ｋｂ）が
挿入された組換え体プラスミドであることを確認し、ｐ
ＸＡＩと名付けた。ｐＸＡｌを用いて形質転換したＢ、
ｃｏｌｉ　ＫＬＣ４２１（ｇｕａＡ−、ｇｕａＢ　）　
ＣＪ。

Ｂａｃｔ、　１３９．３２０　（１９７９）　］をＭ９
平板培地（Ｎ）１４ＣＩ　Ｉｇ、ＮａＪＰＯ＜　６ｇ、
ＫＨ２ＰＯ＜　３ｇ。

Ｎａ、ＣＩ　５　ｇ、Ｍｇ５Ｏ１・ＴＨ２００，２５ｇ
　、グルコース３ｇ、ビタミンＢ＋４ｇ、カザミノ酸２
ｇを水１１に含み、寒天１，５％を加えたもの）に塗布
し生育を調べたところ、５■／ｌのキサンチンもしくは
グアニンを含む平板培地では生育し、５＋ｎｇ／ｊ！の
ヒポキサンチンを含むＭ９平板上では生育しなかった。

この結果はｐＸＡｌにはｐＬＣ３４−１０由来のｇｕａ
Ａ、ｇｕａＢ両遺伝子のうちｇｕａＡのみが存在するこ
とを示している。ｐＸＡＩを用いてＢ、ｃｏｌｉ　Ｋ２
９４を形質転換し、得られた菌株はＢ、ｃｏｌｉ　Ｋ２
９４／ｐＸＡＩ　ＦＥＲＭＢＰ−４９８として、昭和５
９年３月８日付で微工研に寄託されている。

２）ｇｕａＡ上流へのｔｒｐプロモーター（以下Ｐｔｒ
ｐと略称する）の連結： ｐＸＡＩ　ＤＮＡ３μｇをＹ−５０緩衝液３０μβに溶
かし、１５単位のＨｉｎ、ｄｌＩ［を加え、３７℃で２
時間消化反応を行い、これに２ＭＮａＣＣ２μｊ！１５
単位のＭＩｕＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行っ
た。６５℃、１０分間の熱処理後ｇｕａＡを含む小さい
方のＤＮＡ断片（約３．３Ｋｂ）を精製した。一方、Ｐ
ｔｒｐを有するプラスミドとしてはｐＧＢＫ３を用いた
。なお、ｐＧＢＫ３の造成法については参考例２および
参考例３で示す。ｐＧＢＫ３プラスミドはｐｔｒｐの下
流にＨｉｎｄｌｌｌ切断部位がある（第１図参照）。

ｐＧＢＫ３　ＤＮＡ　３μｇを上記と同様の方法でＨｉ
ｎｄＩＩ［、ＭｌｕＩで消化し、Ｐｔｒｐを含む大きい
方のＤＮＡ断片（約４Ｋｂ）を精製した。得られた約０
．２μｇのｐｘＡ１由来のＤＮＡ断片と約０．１μｇの
ｐＧＢＫ３由来のＤＮＡ断片を２０μβのＴ　４　Ｄ　
Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼ緩衝液中で１単位のＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを加え、４℃で１８時間結合反応を行った。このよ
うにして得られた組換え体プラスミドを用い、Ｂ、ｃｏ
ｌｉＫ　２９４株を形質転換させてアンピシリン耐性の
形質転換株を得た。この形質転換株よりプラスミドＤＮ
Ａを分離精製し、その構造解析を行ったところ、ｐＧＢ
Ｋ３由来のＰｔｒｐの下流にｐｘＡ１由来のｇｕａＡを
含むＤＮ’Ａ断片が挿入されている構造を有することを
確認し、該プラスミドをｐＸＡｌｏと名付けた（第１図
参照）。ｐＸＡｌｏを保有する口、ｃａｄｉ菌株は、Ｂ
、ｃｏｌｉ　Ｋ　２９４／ｐＸΔ１ｏ、ＦＥＲＭ　ＢＰ
−４９９として昭和５９年３月８日付で微工研に寄託さ
れている。

３）組換え体プラスミド保有株のＧＭＰシンセターゼ活
性： ＧＭＰシンセターゼ活性の測定は公知の方法［Ｊ、口ｉ
ｏ＋、　Ｃｈｅｍ、、　２２６．３５１−３６３（１９
５７）］を下記のように若干改変して実施した。

活性測定実験に供するＢ、ｃｏｌｉの種培養をＭ９液体
培地に接種し、３０℃にて１８時間振盪培養した後、培
養液を蒸留水により希釈もしくは遠心分離後適当量の蒸
留水に懸濁することにより濃縮し、これにトルエンを終
濃度２０ｍ１／ｊ！になるように添加し、３７℃にて２
０分間振盪した。

このトルエン処理培養液を１６０ｍＭ）！Ｊスス−酸（
ｐＨ８，６）、１２ｍＭ　ＡＴＰ、２５ｍＭ　ＸＭＰ、
’１６ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ＜　・７Ｈ２０，４０ｍＭ　（Ｎ
Ｈ＜）２Ｓｏ、からなる組成の反応液中に共存せしめ、
４２℃にて振盪し、ＸＭＰからＧＭＰへの転換反応を行
った。

ＧＭＰの生成は、経時的に反応液を採取し、４０倍容量
の３．５％過塩素酸と混合し、遠心分離後上清の２９０
ｎｍの吸光度を測定することにより定量した。

第２表に本発明で使用もしくは取得した菌株のＧＭＰシ
ンセターゼ活性を示す。

活性は１分間に１μｍｏｌのＧＭＰを生成する活性の量
を１単位とした。

第　２　表 ＢＪ’−５２６ に２９４−　ＦＢＲＭ　Ｏ，８８ に２９４　ｐＸＡＩ　Ｆ［ｌＲＭＢＰ−４９８１７，０
８に２９４　ｐＸＡｌｏ　ＦＢＲＭ　ＢＰ−４９９１６
，９１参考例２゜ ヒトインターフェロン（ＩＦＮ）−ｒを発現する組換え
体プラスミドｐＧＫＡ２の造成（第２．３図参照）　： （ａ）発現ベクターｐＫＹＰ１１へのヒトＩＦＮ−ｒＤ
ＮＡの組み込みニ プラスミドｐｌＦＮγ−Ｇ４　（ＡＴＣＣ３９１２３か
ら前述のプラスミド単離方法で採取した）６μｇを２０
ｍＭ）リス−塩酸（Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＪり（ｐＨ７，
５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ１ｘ　、１０ｍＭジチオスレ
イトールおよび５ＯｍＭ　ＮａＣ１を含む全量５０μ矛
の溶液に溶かし、制限酵素Ｐｖｕ１１１２単位とＨｉｎ
ｄｌｎ１２単位を加え、３７℃で４時間消化反応を行っ
た。反応液を６５℃、７分間加熱処理して酵素を失活さ
せ、低融点アガロースゲル電気泳動法にて精製し、１．
３　Ｋ　ｂのヒトＩＦＮ−ｒＤＮＡを含むＤＮＡ断片１
．２μｇを得た。

別にｐＫＹＰｌｌの４μｇを２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ１２゜１０ｍＭ
ジチオスレイトールおよび５０ｍＭ　ＮａＣｊ！を含む
全量４０μβの溶液に溶かし、ＢａｍＨＩを３単位加え
、３７℃で３時間消化反応を行った。

反応液を６５℃、５分間加熱して酵素を失活させた。こ
れにｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰを
各々３０μＭになるように加え、さらに８単位の大腸菌
ＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｋｌｅｎｏｗ断片、　Ｎｅｗ
　ＢｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製、Ｌｕｊりを加え
て１５℃で１時間埋め込み（ｆｉｌｌ　ｉｎ）反応を行
った。ＤＮＡポリメラーゼＩを失活させるため６８℃で
１５分間加熱処理後、ＨｉｎｄＩＩ１１０単位を加え３
７℃でさらに３時間消化反応してから、再び６５℃で５
分間加熱し、）ｌｉｎｄＩ［Ｉを失活させた。

このようにして得たプラスミドｐＫＹＰ１１の消化反応
液より低融点アガロースゲル電気泳動法にて精製し、Ｐ
ｔｒｐを含む約４．７　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片約２．５μ
ｇを得た。

ヒトＩＦＮ−ｒＤＮＡを含むＤＮＡ断片（１，３Ｋｂ）
０．５μｇとプラスミドｐＫＹＰ　１１より得たＰｔｒ
ｐを含む約４．７　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片１．　Ｏｐ　ｇ
を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、６ｍ
Ｍ　ＭｇＣｌ、、５ｍＭジチオスレイトールおよび５０
０μＭ　ＡＴＰを含む溶液２０μｌに溶かし、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ
社製）４単位を加え、４℃で１８時間結合反応を行った
。得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて常法通
り大腸菌８８１０１株を形質転換し、ＡｐＲのコロニー
を得た。このコロニーの培養液よりプラスミドを分離し
、第２図に示したｐＧＣ７を得た。ｐＧＣ７の構造は、
旧ｎｄ　ＩＩＩ、　ＢａｍＨＩ　。

Ｈｐａ　Ｉ、　ＳａＲＩ、口ｃｏＲＩおよびＣｊｌ！ａ
ｌで消化後、アガロースゲル電気泳動法により確認した
。ｐＧＣ７を含む大腸菌菌株は微工研にＢｓｃｈｅｒｉ
、ｃｈｉａ　ｃｏ旦Ｉ　Ｇ　Ｃ７（ＦＢＲＭ　Ｐ−６８
１４，同ＢＰ−４９７）として寄託されている。

（ｂ）組換え体プラスミドｐＧＫＡ２の造成：参考例２
（ａ）で得られたｐＧＣ？ＤＮＡ　’６／ｊｇを２０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　Ｍ
ｇＣＲｗ　、１０ｍＭジチオスレイトールおよび１０ｍ
Ｍ　ＮａＣｌ１を含む全量５０ｐＨの溶液に溶かし、制
限酵素Ｂ　ｓ　ｔ　Ｎ　Ｉ　（Ｎｅｗ　Ｂｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏ＋ａｂｓ社製）１２単位を加え、６０℃で３時間
反応させた後、ＮａＣＲを１５０ｍＭとなるように加え
、５ａＩｌＩ　８単位を加えて３７℃でさらに３時間消
化反応を行った。再び６５℃で５分間加熱して５ａＩｌ
Ｉを失活させ、低融点アガロースゲル電気泳動法にて精
製し、ヒ）　ＩＦＮ−ｒＤＮＡの大部分を含む約１１２
５．ｂｐのＤＮＡ断片約０．８μｇを得た。

別にｐＫＹＰｌ　０の３μｇを２０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣ
Ｉ　（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ１２゜１０
ｍＭジチオスレイトールふよび１００ｍＭＮａＣｊ！を
含む全量４０μｌの溶液に溶かし、制限酵素ＨｉｎｄＩ
［［と５ａＩｌＩを各々６単位づつ加え、３７℃で３時
間消化反応を行った。６５℃で５分間加熱してＨｉｎｄ
ｎ［と５ａｉｌを失活させた。この消化反応液を低融点
アガロースゲル電気泳動法にて精製し、ｐｔｒｐを含む
約４．　Ｉ　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片約１．８μｇを得た。

一方、成熟ヒトＩＦＮ−ｒポリペプチドのＮ末端はＣｙ
ｓであるので、成熟ＩＦＮ−ｒＤＮＡを発現させるため
には、５′末端のＴＧＴ（Ｃｙｓ）の直前に開始コドン
（ＡＴＧ）を付与する必要があること、またｐｔｒｐの
下流のＳＤ−配列とＡＴＧとの距離は、６〜１８ｂｐの
間の適当な長さが必要であることなどの理由から、下記
のＤＮＡリンカ−を合成した。

まず、１木調Ｄ　Ｎ　Ａ　％　１８−ｍｅｒと１５−ｍ
ａｒを通常のトリエステル法［Ｒ，Ｃｒｅａ　ら：　Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、　７５．５７６５　（１９７８）　］により
合成した。１８−ｍａｒおよび１５−ｍａｒの各々２μ
ｇを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）、
１０ｍＭ　ＭｇＣＲ２。

５ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡおよ
び１ｍＭ　ＡＴＰを含む全量２０μｌの溶液に溶かし、
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ３０単位（ベーリンガー
・マンハイム社製）を加えて、３７℃で６０分間リン酸
化反応を行った。

リン酸化した１８−ｍａｒと１５−ｍａｒを２μｇづつ
混合し、７０℃で５分間加熱後室温に放置してアニーリ
ングを行うことにより上記構造を有するＤＮＡリンカ−
を得た。

上記で得たｐＧＣ７由来のＢｓｔＮＩ−３ａｉｌ断片（
１１２５ｂｐ）　０．４μｇと発現ベクターｐＫＹＰ　
１０をＨｉｎｄＩＩＩと５ａｌＩで消化して得たＤＮＡ
断片（４，ＩＫｂ）　１．ＯＡｌｇを２０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｆ　（ｐＨ７，５）、６ｍＭ　ＭｇＣｌ１２　。

５ｍＭジチオスレイトールおよび５００μＭ　ＡＴＰを
含む全量２５μｌの溶液に溶かし、この混合溶液に上記
ＤＮＡＩＪンカーを約０．１μｇ加えた。この混合液に
さらにＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼ６単位を加え、４℃で１７
時間結合反応を行った。得られた組換え体プラスミドの
混合物を用いて、常法通り、大腸菌８８１０１株を形質
転換し、Ａｐｌのコロニーを得た。このコロニーの培養
液よりプラスミドを分離し、第３図に示したｐＧＫＡ２
を得た。

ｐＧＫＡ２の構造は、ＥｃｏＲＩ、Ｃ４！ａＩ。

ＨｉｎｄｌＩ［、ＢｓｔＮＩ、５ａｉｌで消化後、アガ
ロースゲル電気泳動法によりｆｉｌ　Ｋｉｔした。プラ
スミドｐＧＫＡ２のＳＤ−配列（ＡＡＧＧ）から開始コ
ドン（ＡＴＧ＞までの塩基配列は ＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡ’ＧＣＴＴＡＴＧである
ことを、マキサム・ギルバートの方法〔＾、　Ｍ９Ｍａ
ｘａｒｒＩら：　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、。

７４、５６０　（１９７７）］で確認した。

ｐＧＫＡ　２のヒトＩＦＮ−ｒＤＮＡはＲｓａ　１部位
を有すること、このＤＮＡがコードするヒトＩ　ＦＮ−
ｒポリペプチドは９番目のアミノ酸がグルタミン（Ｇｊ
！ｎ）である点で公知のものとは異なる。

さらに上記で用いた合成りＮＡは、Ｐ、１１．　Ｇｒａ
ｙらが用いた合成りＮＡ とは下線の部分で異なる。このようにｐＧＫＡ２にはヒ
トＩ　Ｆ’Ｎ　−ｒをコードするＤＮＡ領域内に［ＣＣ
ＡＧＧ］なるＢｓｔＮＩに対する制限酵素部位が存在し
、ｐＧＫＡ２はこの点でも公知のものと異なる。またＳ
Ｄ−配列とＡｒ１間の距離と構造は、大腸菌での蛋白質
の発現に大きく影響するので重要であるが、ｐＧＫＡ２
のＳＤ−配列とＡｒ１間の塩基配列は公知の組換え体プ
ラスミドｐｌＦＮ−ｒｔｒｐ４８　（Ｐ、１１．Ｇｒａ
ｙら）のそれとは明らかに異なるものである。

ｐＧＫＡ２を含む大腸菌は微工研にＢｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ−卑すュ　ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ　ｐ−ｅ７９ｇ、
同ＢＰ−４９６）として寄託されている。

参考例３゜ ｔａｃＩプロモーターの制御下でヒ）　Ｉ　ＦＮ−γを
発現する組換え体プラスミドｐＧＢＫ３の造成： まず、組換え体プラスミドの第１段階として、ＩＦＮ−
ｒ発現プラスミドｐＧＫＡ２　（ｐＧＫＡ２の造成につ
いては参考例２を参照）への大腸菌リボプロティイン（
Ｉｐｐ）遺伝子の転写終結部位（以下、ｌｐｐターミネ
ータ−と略記する）の導入を、以下の（ａ）　、　（ｂ
）　、　（Ｃ）　、（社）の手順に従い行った（第４図
参照）。

（ａ）ｐＧＢＤｌの造成ニ プラスミドｐｌＦＮｒ−０４（約３．６Ｋｂ）２μｇを
２０μｌのＹ−５０緩衝液中に溶かし、６単位のｐｖｕ
ＩＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った後、６５
℃、１０分間の熱処理によって反応を止めた。この消化
物０．１μｇを、５ピコモルの５′−リン酸化ＢａｍＨ
Ｉリンカ−（５′−ｐＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ−３’　；
コラボレイティブ・リサーチ社製）の存在下、２０μｍ
のＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液中、２単位のＴ４ＤＮΔリ
ガーゼにより４℃で１８時間結合反応を行った。

このようにして得た組換え体プラスミドＤＮＡを用い、
大腸菌ＨＢＩＯＩ株を形質転換させ、Ａｐ耐性のコロニ
ーを得た。この形質転換株よりプラスミドＤＮＡを単離
し、該ＤＮＡをＢａｍＨＩなどの制限酵素で消化するこ
とによりプラスミドの構造解析を行った結果、ｐｌＦＮ
ｆ’−Ｇ４のＰｖｕＩ［部位にＢａｍＨＩ！Ｉンカーが
挿入された組換え体プラスミドｐＧＢＤ１が得られたこ
とを確認した。

（６）ｐＫｙｐ　１４の造成： 次に、ｌｐｐターミネータ−の供給源として用いた組換
え体プラスミドｐＫＹＰ　ｌ　４の造成について述べる
。

ｔｒｐプロモーターを運ぶプラスミドｐＫＹＰ１０〔特
開昭５８−１’１０６００］　５μｇを４０μ矛のＹ−
１００緩衝液に溶かし、１０単位のＢａｍＨＩを加え、
３７℃で２時間消化反応を行った。続いて、１μｌのＹ
−１００緩衝液、２．５μｐのＩＭ　ＮａＣＣ５，５μ
ｆの蒸留水および２０単位のＳａ′ＩｌＩを加え、３７
℃でさらに２時間反応を行った。６５℃、１０分間の熱
処理後、低融点アガロースゲル電気泳動法を用い、大き
い方のプラスミドＤＮＡ断片（約４．９　Ｋ　ｂ　）を
精製した。一方、Ｉｐｐターミネータ−を運ぶプラスミ
ドｐ　Ｉ　Ｎ　−ＩＩ　−Ａ　１　［Ｋ、　Ｎａｋａｍ
ｕｒａ　ら：　Ｔｈｅ［ＩＭ口ＯＪｏｕｒｎａｌ　１．
７７１　（１９８２）］　（特開昭５７＝１４０８００
公報のｐＫＥＮｏ　４５と同じもの）５μｇを上と同じ
ようにしてＢａｍＨＩとＳａｊ！Ｉによって消化した。

生じたＩｐｐターミネータ−を含む約０．９５ＫｂのＢ
ａｍＨＩ−５ａｊ！　Ｉ断片を精製した。

このようにして得た約０．１μｇのｐＫＹＰ　１０由来
のＤＮＡ断片と約０．０５μｇのｐＩＮ−ＩＩ−Ａ１由
来のＤＮＡ断片を２０μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液
中で、１単位のＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼを加え、４℃で１
８時間結合反応を行った。

このようにして得た組換え体プラスミドＤＮＡを用い、
形質転換した大腸菌ＨＢＩＯＩ株よりプラスミドＤＮＡ
を単離し、その構造解析を行ったところ、ＩＫＹＰ１４
株が持つプラスミドｐＫＹＰ１４の下流にＩｐｐターミ
ネータ−が挿入されていることを確認した。

（ｃ）　ｐ　Ｇ　Ｂ　Ｊ　２の造成： 上記（ａ）、（ハ）で得た組換え体プラスミドｐＧＢＤ
１とｐＫＹＰ　１４とを組み換えて、ＩＦＮ−ｒＤＮＡ
の下流へのｌｐｐターミネータ−の挿入を以下のように
行った。

プラスミドｐＧＢＤ１　（約３．６Ｋｂ）５μｇを、１
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ　（ｐＨ７，５）、７ｍＭＭ
　ｇ　ＣＲ２および６ｍＭ　２−メルカプトエタノール
を含む緩衝液（以下、“Ｙ−ｏ緩衝液”と略称する）３
０μβ中に溶かし、１０単位のＣｌ１ａｌを加え、３７
℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処
理に続き、水中で冷やした後、１０倍濃度のＹ−０緩衝
液を２／ＪＪ、ＩＭ　ＮａＣｆを５μ１１蒸留水を１２
μｌ、そして制限酵素ＢａｍＨＩを２．０単位加え、混
合した後、３７℃で２時間消化反応を行った。この反応
により、プラスミドＤＮＡはＢａｍＨＩによって部分的
に消化された。生じたＩＦＮ−ｒＤＮＡを含むＣｊ！ａ
Ｉ−ＢａｍＨＩ　ＤＮＡ断片（約１．　ａ　Ｋ　ｂ　）
を精製した。一方、ｌｐｐターミネータ−を含むプラス
ミドｐＫＹＰ１４（約５．８　Ｋ　ｂ　）、　５μｇを
、５０ｐＨのＹ−５０緩衝液中で、１０単位のＣｊ！ａ
ｌと２０単位のＢａｍＨＩで２時間消化した後、１ｐｐ
ターミネータ−を含む約５．　ＯＫ　ｂの大きい方のプ
ラスミドＤＮＡ断片を精製した。このようにして得たｐ
ＫＹＰ　１４由来のＤＮＡ断片（約０．１μｇ）とｐＧ
ＢＤ１由来のＤＮＡ断片（約０．０５μｇ）を２０μ！
のＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液中で、１単位のＴ　４　Ｄ
ＮＡ　！ｌガーゼを加え、４℃で１８時間結合反応を行
った。

このようにして得た、組換え体プラスミドを用い形質転
換した大腸菌８８１０１株よりプラスミドＤＮＡを単離
し、その構造解析を行ったところ、ＩＧＢＪ２株がもつ
プラスミドｐＧＢＪ２がＩＦＮ−ｒＤＮＡの下流にｌｐ
ｐターミネータ−が挿入されている構造を有することを
確認した。

（ｄ）　ｐ　Ｇ　Ｂ　Ｋ　３の造成： 上記（Ｃ）で得た組換え体プラスミドｐＧＢＪ　２とＩ
ＦＮ−ｒ発現プラスミドｐＧＫＡ２１：参考例２を参照
〕とを組換えて、ＩＦＮ−ｒＤＮＡの下流へｌｐｐター
ミネータ−が挿入された構造を持つプラスミドｐＧＢＫ
３を以下のようにして造成した。

プラスミドｐＧＫＡ２　（約５．２　Ｋ　ｂ　）約５μ
ｇを３０μβのＹ−５０緩衝液に溶かし、１０単位以上
のＰｓｔＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。

６５℃、１０分間の熱処理に続き、水中で冷やした後、
１０倍濃度のＹ−１５０緩衝液２μｊ！、ＬＭ　ＮａＣ
１１３ｐＨ，蒸留水１４ｐＨ。

そして１０単位の制限酵素Ｎ　ＣＯＩ　（ｌｉｅｗ　Ｂ
ｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製、以下同じ）を加え、
３７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の
熱処理後、ＩＦＮ−ｒＤＮＡを含む約１．８５Ｋｂのプ
ラスミドＤＮＡ断片を精製した。次に、上で得た組換え
体プラスミドｐＧＢＪ２（約６．４　Ｋ　ｂ　）約５μ
ｇに対し、ｐＧＫＡ２に加えた処理と同じ処理を施し、
生じた約４．７　Ｋ　ｂのＰｓｔｌ−Ｎｃｏｌプラスミ
ドＤＮＡ断片を精製した。このようにして得たｒ＋ＧＫ
Ａ２由来のＤＮＡ断片（約０．１μｇ）とｐＧＢＪ　２
由来のＤＮＡ断片（約０．１μｇ）を２０μｌのＴ４Ｄ
ＮＡ！Ｊガーゼ緩衝液中で１単位のＴ４ＤＮＡ！ｌガー
ゼを加え、４℃で１８時間結合反応を行った。このよう
にして得られた組換え体プラスミドを用い形質転換した
大腸菌８８１０１株よりプラスミドＤＮＡを分離精製し
、その構造解析を行ったところ、ＩＧＢＫ３株が持つプ
ラスミドｐＧＢＫ３が目的の構造を有することを確認し
た。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＸＡ’ｌＯの造成工程を示す。 第２図はプラスミドｐｃｌ、Ｃ７の造成工程を示す。 第３図はプラスミドｐＧＫＡ２の造成工程を示す。 第４図はプラスミドｐ、　Ｇ　Ｂ　Ｋ　３の造成工程を
示す。 ｉＬ　１　目 第２図 上用Σｌ工４ｎ竺広− 第３図 」ツ役■Ａａ生励侶

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記イと口とをハを奈有する水性培地中で接触さ
   せて培地中に５′−グアニル酸を生成蓄積させ該培地中
   から５′−グアニル酸を採取することを特徴とする５′
   −グアニル酸の製造法イ：５′−キサンチル酸とアンモ
   ニアおよび／またはＬ−グルタミンとからアデノシン三
   燐酸の存在下に５′−グアニル酸を生成する能力を有し
   、かつ燐酸化物以外のエネルギー供与体を利用してアデ
   ノシン−燐酸をアデノシン三燐酸に変換する能力を有す
   る大腸菌の培養物。 菌体もしくはそれらの処理物 Ｄ：５’４”ｌ−ンチル酸、アンモニアおよび／または
   Ｌ−グルタミン ハ：燐酸化物以外のエネルギー供与体
2. （２）グアニル酸合成酵素の遺伝子を含むＤＮＡ断片と
   ベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用い大腸菌を形質
   転換して得られる形質転換株を用いる特許請求の範囲第
   １項記載の方法。
3. （３）水性培地中に界面活性剤および／または有機溶剤
   を存在せしめる特許請求の範囲第１項または第２項記載
   方法。