CN104342396B - 一种生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法 - Google Patents

一种生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，根据本发明的培养方法，包括以下步骤：1）通过三次扩增获得发酵工作种子液；2）发酵前准备：向发酵罐中添加泡敌、发酵培养基，将发酵工作种子液接种于发酵罐；3）发酵：控制发酵条件，当生长至OD600=20时，开始补料流加培养直至发酵结束；4）当OD600=30时，添加IPTG诱导表达，结束后离心，即得目的菌体。本发明采用的培养方法和培养基具有高稳定表达的特性，通过控制关键的发酵工艺条件，使表达水平较高，且工艺简便，稳定性好，易于工业化大生产。

Description

一种生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法
技术领域
本发明涉及一种重组大肠杆菌的培养方法，尤其是一种生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，属于微生物发酵工程领域。
背景技术
现今心脑血管疾病已是人类健康的最大威胁之一，患病人数逐年上升，而且发病年龄也越发年轻化，田文静等在“乳糖诱导瑞替普酶在大肠杆菌中的可溶性表达”（中国生化药物杂志, 2011, 32(5)）一文中指出全世界每年心血管疾病患者多达1300万。在中国，每年需要进行脑梗塞、心肌梗塞等血栓类疾病治疗的人数就上百万，因此研制和生产高效的溶栓药就显得十分必要。赵友春等在“第三代溶血栓药物研究进展”（药学进展, 2004,28(2): 72-75）中介绍到，目前溶栓药物已发展到第三代，具有快速溶栓，治愈率高，半衰期长，副作用小等优点，在临床上具有较强的竞争性，但价格也比较昂贵。所以，生产出低成本的溶血栓药物具有显著的经济效益和重大的社会意义。另外，赵友春等在“提高溶栓新药瑞替普酶生产得率的中试研究”（化工科技, 2003, 11(1): 15-17）一文中报道，目前多数是对瑞替普酶菌株的构建和复性纯化研究，而鲜有报道实际生产中是如何进行菌株工业化发酵生产。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，从而可以稳定表达瑞替普酶。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：
（1）种子活化：通过三次扩增获得发酵工作种子液：
第一次扩增：将表达瑞替普酶的工程菌株大肠杆菌在 LBA培养基上活化，然后挑取一个单菌落到10ml LBA培养基，在35～37℃，110-140rpm，培养至OD600=0.8-1.0，得到一级种子培养液；
第二次扩增：将一级种子液按5%-10%的接种量接种至100ml LB培养基，在35～37℃，110-140rpm，培养至OD600=0.8-1.0，即得二级种子液；
第三次扩增：将二级种子液以3%-7%的接种量接入1.5L LB培养基，在35～37℃，110-140rpm，培养至OD600=0.8-1.2，即得发酵工作种子液；
（2）发酵前准备：罐体及管道灭菌，配制培养液并添加消泡剂；校正溶氧电极，pH电极，然后在火焰保护下打开发酵罐的接种口，将发酵工作种子液全部接种于发酵罐中；
（3）发酵：控制发酵条件，发酵温度30-37℃，用氨水调节pH值为6.6-6.9，初始溶氧量25-30%，调节转速为150-250rpm，每隔两小时转速提升20-30rpm，当OD600=20-22时，开始用蠕动泵加入补料培养基，进行补料，补料的流加速度为6-7ml/min；
（4）诱导：当OD600=30-32时，开始添加IPTG 10-12ml进行诱导，诱导表达结束后，收集菌液，离心，分离，即得目的菌体。
其中，上述生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，所述步骤（2）中发酵罐为19L的发酵罐，所述培养液由纯化水、发酵培养基、酵母提取液组成，所述酵母提取液浓度为12%-18%。
所述步骤（3）中发酵时间为22-26小时。
所述步骤（4）中IPTG的浓度为120g/L，用量为10-12ml，诱导时间为4-5小时；离心转速为8000-9000rpm，温度4℃，离心25-40分钟。
上述生产瑞替普酶的大肠杆菌工业培养方法，所述培养基组成为：
LBA培养基：每升H2O中蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂10g，氨苄西林钠100mg；
发酵培养基：A液：每升H2O中含KH2PO4 25-40g、K2HPO4 ·2H2O 57.5-80g、(NH4)2SO417.5-25.8g、FeSO4·7H2O 0.008-0.015g；
B液：每升H2O中含CaCl2·2H2O 0.8-1.6g、CoCl2·6H2O 1.60-2.93g、CuSO4·5H2O1.5-2.5g、FeSO4·7H2O 1.80-2.87g、MnSO4·H2O 1.0-1.93g、Na2MoO4·2H2O 1.60-2.67g；
C液：每升H2O中含20%酪蛋白25.0-42.0ml、1M MgSO4 16.0-37.0ml、50mg/ml卡那霉素10.0-23.5ml、70%葡萄糖772.5-867.5ml、40%(NH4)2SO4 80-120ml、5%柠檬酸1.5-5.0ml；
补料培养基：D液：每升H2O中含20%酪蛋白1.67-2.22ml、1M MgSO4 10.42-17.36ml、50mg/ml卡那霉素0.56-1.11ml、A液55.56-83.33ml、70%葡萄糖208.33-347.22ml、40%(NH4)2SO4 20-30ml、水518.76-703.46ml。
优选地，上述生产瑞替普酶的大肠杆菌工业培养方法，所述培养基组成为：
LB培养基：每升H2O中蛋白胨10g，酵母提取液5g，氯化钠5g，琼脂10g；
发酵培养基：A液：每升H2O中含KH2PO4 30-35g、K2HPO4 ·2H2O 62.5-75.0g、(NH4)2SO4 20-23.33g、FeSO4·7H2O 0.010-0.013g；
B液：每升H2O中含CaCl2·2H2O 1.0-1.4g、CoCl2·6H2O 2.0-2.53g、CuSO4·5H2O1.8-2.2g、FeSO4·7H2O 2.0-2.67g、MnSO4·H2O 1.20-1.73g、Na2MoO4·2H2O 1.80-2.47g；
C液：每升H2O中含20%酪蛋白30.0-37.0ml、1M MgSO4 21.5-32.0ml、50mg/ml卡那霉素13.0-20.0ml、70%葡萄糖797-843ml、40%(NH4)2SO4 90-110ml、5%柠檬酸2.5-4.0ml；
补料培养基：D液：每升H2O中含20%酪蛋白1.80-2.08ml、1M MgSO4 12.50-15.28ml、50mg/ml卡那霉素0.69-0.97ml、A液62.50-76.39ml、70%葡萄糖243.05-312.50ml、40%(NH4)2SO4 22-28ml、水564.78-657.46ml。
进一步地，一种生产瑞替普酶的大肠杆菌工业培养方法，制备步骤如下：
（1）种子活化：通过三次扩增获得发酵工作种子液：
第一次扩增：将表达瑞替普酶的大肠杆菌工程菌株在 LBA培养基上活化，然后挑取一个单菌落到10ml LBA培养基，在37℃，125rpm，培养至OD600=0.8-1.0，得到一级种子培养液；
第二次扩增：将一级种子液按5%的接种量接种至100ml LB培养基，在37℃，125rpm，培养至OD600=0.8-1.0，即得二级种子液；
第三次扩增：将二级种子液以5%的接种量接入1.5L LB培养基，在37℃，125rpm，培养至OD600=0.8-1.2，即得发酵工作种子液；
（2）发酵前准备：在19L发酵罐中添加纯化水8L、5ml泡敌和1200mlA液、150mlB液，121℃灭菌20分钟，冷却至30℃时，再加入之前单独灭菌的15%酵母提取物500ml，600mlC液；校正溶氧电极，pH电极，然后在火焰保护下打开发酵罐的接种口，将发酵工作种子液全部接种于发酵罐中；
（3）发酵：控制发酵条件，发酵温度37℃，用氨水调节pH值为6.6-6.9，初始溶氧量30%，调节转速为200rpm，发酵20-26小时，每隔两小时转速提升25rpm，当OD600=20时，开始用蠕动泵进行补料，加D液，补料的流加速度为6-7ml/min；
（4）诱导：当OD600=30时，开始添加浓度为120g/L的IPTG 12ml进行诱导，5小时诱导表达结束后，收集菌液，4℃、转速为9000rpm条件下离心30分钟，分离，即得目的菌体。
利用本发明的培养方法和培养基，通过有效控制发酵过程中的关键参数，提高了瑞替普酶的单位产量，降低了生产成本，具有工艺简便，表达稳定的特点，对大规模工业生产具有非常重要的意义。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
制备实施例：
下面制备实施例中制备各目的菌体的试剂所用的方法、仪器和操作方式均为本领域常规的方法、仪器和操作方式，其中所用的各种试剂均为生化试剂、分析纯，购自普通生化试剂公司，其余设备等来源如下表1所示：
表1
序号 名称 生产厂商 规格/型号
1 发酵罐 瑞士比欧生物工程公司 19L，NLF22型
2 泡敌 江苏省海安石油化工厂 20Kg,消泡王FAG470
3 补料瓶 上海堪鑫仪器设备有限公司 5000ML
实施例1
一种生产瑞替普酶的大肠杆菌工业培养方法，制备步骤如下：
（1）种子活化：通过三次扩增获得发酵工作种子液：
第一次扩增：将表达瑞替普酶的工程菌株大肠杆菌在 LBA培养基上活化，然后挑取一个单菌落到LBA培养基中，培养基为18*180mm试管中装入10mlLB培养基，在37℃，125rpm，培养至OD600=0.8-1.0，得到一级种子培养液；
第二次扩增：将一级种子液按5%的接种量接种至100ml LB培养基，培养基为500ml三角瓶装入100mlLB培养基，在37℃，125rpm，培养至OD600=0.8-1.0，即得二级种子液；
第三次扩增：将二级种子液以5%的接种量接入1.5L LB培养基，培养基为5L三角瓶装入1.5L LB培养基，在37℃，125rpm，培养至OD600=0.8-1.2，即得发酵工作种子液；
（2）发酵前准备：在19L发酵罐中添加纯化水8L、5ml泡敌和1200mlA液、150mlB液，121℃灭菌20分钟，冷却至30℃时，再加入之前单独灭菌的15%酵母提取物500ml，600mlC液；校正溶氧电极，pH电极，然后在火焰保护下打开发酵罐的接种口，将发酵工作种子液全部接种于发酵罐中；
（3）发酵：控制发酵条件，发酵温度为37℃，用氨水调节pH值为6.6-6.9，初始溶氧量30%，调节转速为200rpm，发酵时间为24小时，每隔两小时转速提升25rpm，当OD600=20-22时，开始用蠕动泵进行补料，加D液，补料的流加速度为7ml/min；
（4）诱导：当OD600=30-32时，开始添加浓度为120g/L的IPTG 12ml进行诱导，5小时诱导表达结束后，收集菌液，4℃、转速为9000rpm条件下离心30分钟，分离，即得目的菌体。
上述各培养基组成如下：
LBA培养基：每升H2O中蛋白胨10g，酵母提取液5g，氯化钠5g，琼脂10g，氨苄西林钠100mg；
发酵培养基：A液：1200ml，含KH2PO4 39g、K2HPO4 ·2H2O 82.5g、(NH4)2SO4 26g、FeSO4·7H2O 0.014g；
B液：150ml，含CaCl2·2H2O 0.18g、CoCl2·6H2O 0.34g、CuSO4·5H2O 0.3g、FeSO4·7H2O 0.35g、MnSO4·H2O 0.22g、Na2MoO4·2H2O 0.32g；
C液：600ml，含20%酪蛋白20ml、1M MgSO4 16ml、50mg/ml卡那霉素10ml、70%葡萄糖480ml、40%(NH4)2SO4 60ml、5%柠檬酸2ml；
补料培养基：D液：3800ml，含20%酪蛋白7ml、1M MgSO4 50ml、50mg/ml卡那霉素3ml、A液300ml、70%葡萄糖1000ml、40%(NH4)2SO4 100ml、水2340ml。
实施例2
一种生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，包括以下步骤：
（1）种子活化：通过三次扩增获得发酵工作种子液：
第一次扩增：将表达瑞替普酶的工程菌株大肠杆菌在 LBA培养基上活化，然后挑取一个单菌落到LBA培养基中，培养基为18*180mm试管中装入10mlLBA培养基，在35℃，140rpm，培养至OD600=0.8，得到一级种子培养液；
第二次扩增：将一级种子液按6%的接种量接种至100ml LB培养基，培养基为500ml三角瓶装入100mlLB培养基，在35℃，140rpm，培养至OD600=0.8，即得二级种子液；
第三次扩增：将二级种子液以3%的接种量接入1.5L LBA培养基，培养基为5L三角瓶装入1.5L LBA培养基，在35℃，140rpm，培养至OD600=0.8，即得发酵工作种子液；
（2）发酵前准备：在19L发酵罐中添加纯化水8L、5ml泡敌和1200mlA液、150mlB液，121℃灭菌20分钟，冷却至30℃时，再加入之前单独灭菌的12%酵母提取物500ml，600mlC液；校正溶氧电极，pH电极，然后在火焰保护下打开发酵罐的接种口，将发酵工作种子液全部接种于发酵罐中；
（3）发酵：控制发酵条件，发酵温度为30℃，用氨水调节pH值为6.6-6.9，初始溶氧量25%，调节转速为250rpm，发酵时间22小时，每隔两小时转速提升20rpm，当OD600=20-22时，开始用蠕动泵进行补料，加D液，补料的流加速度为6ml/min；
（4）诱导：当OD600=30-32时，开始添加浓度为120g/L的IPTG 10ml进行诱导，4小时诱导表达结束后，收集菌液，4℃、转速为9000rpm条件下离心25分钟，分离，即得目的菌体。
上述各培养基组成如下：
LBA培养基：每升H2O中蛋白胨10g，酵母提取液5g，氯化钠5g，琼脂10g，氨苄西林钠100mg；
发酵培养基：A液：每升H2O中含KH2PO4 25g、K2HPO4 ·2H2O 57.5g、(NH4)2SO417.5g、FeSO4·7H2O 0.008g；
B液：每升H2O中含CaCl2·2H2O 0.8g、CoCl2·6H2O 1.6g、CuSO4·5H2O 1.5g、FeSO4·7H2O 1.8g、MnSO4·H2O 1.0g、Na2MoO4·2H2O 1.6g；
C液：每升H2O中含20%酪蛋白25ml、1M MgSO4 16.0ml、50mg/ml卡那霉素10ml、70%葡萄糖867.5ml、40%(NH4)2SO4 80ml、5%柠檬酸1.5ml；
补料培养基：D液：3800ml，每升H2O中含20%酪蛋白1.67ml、1M MgSO4 10.42ml、50mg/ml卡那霉素0.56ml、A液55.56ml、70%葡萄糖208.33ml、40%(NH4)2SO4 20ml、水703.46ml。
实施例3
一种生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，包括以下步骤：
（1）种子活化：通过三次扩增获得发酵工作种子液：
第一次扩增：将表达瑞替普酶的工程菌株大肠杆菌在 LBA培养基上活化，然后挑取一个单菌落到LBA培养基中，培养基为18*180mm试管中装入10mlLB培养基，在37℃，110rpm，培养至OD600=1.0，得到一级种子培养液；
第二次扩增：将一级种子液按10%的接种量接种至100ml LB培养基，培养基为500ml三角瓶装入100mlLB培养基，在37℃，110rpm，培养至OD600=1.0，即得二级种子液；
第三次扩增：将二级种子液以7%的接种量接入1.5L LB培养基，培养基为5L三角瓶装入1.5L LB培养基，在37℃，110rpm，培养至OD600=1.0，即得发酵工作种子液；
（2）发酵前准备：在19L发酵罐中添加纯化水8L、5ml泡敌和1200mlA液、150mlB液，121℃灭菌20分钟，冷却至30℃时，再加入之前单独灭菌的18%酵母提取物500ml，600mlC液；校正溶氧电极，pH电极，然后在火焰保护下打开发酵罐的接种口，将发酵工作种子液全部接种于发酵罐中；
（3）发酵：控制发酵条件，发酵温度为37℃，用氨水调节pH值为6.6-6.9，初始溶氧量30%，调节转速为150rpm，发酵时间26小时，每隔两小时转速提升30rpm，当OD600=20-22时，开始用蠕动泵进行补料，加D液，补料的流加速度为7ml/min；
（4）诱导：当OD600=30-32时，开始添加浓度为120g/L的IPTG 12ml进行诱导，5小时诱导表达结束后，收集菌液，4℃、转速为9000rpm条件下离心40分钟，分离，即得目的菌体。
上述各培养基组成如下：
LBA培养基：每升H2O中蛋白胨10g，酵母提取液5g，氯化钠5g，琼脂10g，氨苄西林钠100mg；
发酵培养基：A液：每升H2O中含KH2PO4 40g、K2HPO4 ·2H2O 80g、(NH4)2SO4 25.8g、FeSO4·7H2O 0.015g；
B液：每升H2O中含CaCl2·2H2O 1.6g、CoCl2·6H2O 2.93g、CuSO4·5H2O 2.5g、FeSO4·7H2O 2.87g、MnSO4·H2O 1.93g、Na2MoO4·2H2O 2.67g；
C液：每升H2O中含20%酪蛋白42.0ml、1M MgSO4 37.0ml、50mg/ml卡那霉素23.5ml、70%葡萄糖772.5ml、40%(NH4)2SO4 120ml、5%柠檬酸5.0ml；
补料培养基：D液：3800ml，每升H2O中含20%酪蛋白2.22ml、1M MgSO4 17.36ml、50mg/ml卡那霉素1.11ml、10倍A液83.33ml、70%葡萄糖347.22ml、40%(NH4)2SO4 30ml、水518.76ml。
实施例4
一种生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，包括以下步骤：
（1）种子活化：通过三次扩增获得发酵工作种子液：
第一次扩增：将表达瑞替普酶的工程菌株大肠杆菌在 LBA培养基上活化，然后挑取一个单菌落到LBA培养基中，培养基为18*180mm试管中装入10mlLBA培养基，在36℃，130rpm，培养至OD600=0.9，得到一级种子培养液；
第二次扩增：将一级种子液按9%的接种量接种至100ml LB培养基，培养基为500ml三角瓶装入100mlLB培养基，在36℃，130rpm，培养至OD600=0.9，即得二级种子液；
第三次扩增：将二级种子液以6%的接种量接入1.5L LB培养基，培养基为5L三角瓶装入1.5L LB培养基，在36℃，130rpm，培养至OD600=0.9，即得发酵工作种子液；
（2）发酵前准备：在19L发酵罐中添加纯化水8L、5ml泡敌和1200mlA液、150mlB液，121℃灭菌20分钟，冷却至30℃时，再加入之前单独灭菌的15%酵母提取物500ml，600mlC液；校正溶氧电极，pH电极，然后在火焰保护下打开发酵罐的接种口，将发酵工作种子液全部接种于发酵罐中；
（3）发酵：控制发酵条件，发酵温度为35℃，用氨水调节pH值为6.6-6.9，初始溶氧量28%，调节转速为220rpm，发酵时间24小时，每隔两小时转速提升25rpm，当OD600=20-22时，开始用蠕动泵进行补料，加D液，补料的流加速度为6ml/min；
（4）诱导：当OD600=30-32时，开始添加浓度为120g/L的IPTG 11ml进行诱导，4小时诱导表达结束后，收集菌液，4℃、转速为9000rpm条件下离心35分钟，分离，即得目的菌体。
上述各培养基组成如下：
LBA培养基：每升H2O中蛋白胨10g，酵母提取液5g，氯化钠5g，琼脂10g，氨苄西林钠100mg；
发酵培养基：A液：每升H2O中含KH2PO4 30g、K2HPO4 ·2H2O 62.5g、(NH4)2SO4 20g、FeSO4·7H2O 0.01g；
B液：每升H2O中含CaCl2·2H2O 1.4g、CoCl2·6H2O 2.53g、CuSO4·5H2O 2.2g、FeSO4·7H2O 2.67g、MnSO4·H2O 1.73g、Na2MoO4·2H2O 2.47g；
C液：每升H2O中含20%酪蛋白30ml、1M MgSO4 21.5ml、50mg/ml卡那霉素13.0ml、70%葡萄糖843ml、40%(NH4)2SO4 90ml、5%柠檬酸2.5ml；
补料培养基：D液：3800ml，每升H2O中含20%酪蛋白2.08ml、1M MgSO4 15.28ml、50mg/ml卡那霉素0.97ml、A液76.39ml、70%葡萄糖312.5ml、40%(NH4)2SO4 28ml、水564.78ml。
实施例5
一种生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，制备步骤如下：
（1）种子活化：通过三次扩增获得发酵工作种子液：
第一次扩增：将表达瑞替普酶的工程菌株大肠杆菌在 LBA培养基上活化，然后挑取一个单菌落到LBA培养基中，培养基为18*180mm试管中装入10mlLBA培养基，在36℃，120rpm，培养至OD600=1.0，得到一级种子培养液；
第二次扩增：将一级种子液按8%的接种量接种至100ml LB培养基，培养基为500ml三角瓶装入100mlLB培养基，在36℃，120rpm，培养至OD600=1.0，即得二级种子液；
第三次扩增：将二级种子液以4%的接种量接入1.5L LB培养基，培养基为5L三角瓶装入1.5L LB培养基，在36℃，120rpm，培养至OD600=1.0，即得发酵工作种子液；
（2）发酵前准备：在19L发酵罐中添加纯化水8L、5ml泡敌和1200mlA液、150mlB液，121℃灭菌20分钟，冷却至30℃时，再加入之前单独灭菌的15%酵母提取物500ml，600mlC液；校正溶氧电极，pH电极，然后在火焰保护下打开发酵罐的接种口，将发酵工作种子液全部接种于发酵罐中；
（3）发酵：控制发酵条件，发酵温度为37℃，用氨水调节pH值为6.6-6.9，初始溶氧量26%，调节转速为180rpm，发酵时间23小时，每隔两小时转速提升30rpm，当OD600=20-22时，开始用蠕动泵进行补料，加D液，补料的流加速度为7ml/min；
（4）诱导：当OD600=30-32时，开始添加浓度为120g/L的IPTG 10ml进行诱导，5小时诱导表达结束后，收集菌液，4℃、转速为9000rpm条件下离心30分钟，分离，即得目的菌体。
上述各培养基组成如下：
LBA培养基：每升H2O中蛋白胨10g，酵母提取液5g，氯化钠5g，琼脂10g,氨苄西林钠100mg；
发酵培养基：A液：每升H2O中含KH2PO4 35g、K2HPO4 ·2H2O 75g、(NH4)2SO4 23.33g、FeSO4·7H2O 0.013g；
B液：每升H2O中含CaCl2·2H2O 1.0g、CoCl2·6H2O 2.0g、CuSO4·5H2O 1.8g、FeSO4·7H2O 2.0g、MnSO4·H2O 1.2g、Na2MoO4·2H2O 1.8g；
C液：每升H2O中含20%酪蛋白37.0ml、1M MgSO4 32.0ml、50mg/ml卡那霉素20.0ml、70%葡萄糖797ml、40%(NH4)2SO4 110ml、5%柠檬酸4.0ml；
补料培养基：D液：3800ml，每升H2O中含20%酪蛋白1.8ml、1M MgSO4 12.5ml、50mg/ml卡那霉素0.69ml、A液62.5ml、70%葡萄糖243.05ml、40%(NH4)2SO4 22ml、水657.46ml。
实施例6：培养基低用量制得的对照产品1
按照实施例1的制备方法制备，其中各培养基组成如下：
LBA培养基：每升H2O中蛋白胨10g，酵母提取液5g，氯化钠5g，琼脂10g，氨苄西林钠100mg；
发酵培养基：A液：每升H2O中含KH2PO4 20g、K2HPO4 ·2H2O 50g、(NH4)2SO4 15g、FeSO4·7H2O 0.006g；
B液：每升H2O中含CaCl2·2H2O 0.5g、CoCl2·6H2O 1.4g、CuSO4·5H2O 1.3g、FeSO4·7H2O 1.5g、MnSO4·H2O 0.8g、Na2MoO4·2H2O 1.5g；
C液：每升H2O中含20%酪蛋白20ml、1M MgSO4 15ml、50mg/ml卡那霉素8ml、70%葡萄糖886ml、40%(NH4)2SO4 70ml、5%柠檬酸1.0ml；
补料培养基：D液：3800ml，每升H2O中含20%酪蛋白1.5ml、1M MgSO4 9.2ml、50mg/ml卡那霉素0.5ml、A液50ml、70%葡萄糖180ml、40%(NH4)2SO4 15ml、水743.8ml。
实施例7：培养基高用量制得的对照产品2
按照实施例1的制备方法制备，其中各培养基组成如下：
LBA培养基：每升H2O中蛋白胨10g，酵母提取液5g，氯化钠5g，琼脂10g，氨苄西林钠100mg；
发酵培养基：A液：每升H2O中含KH2PO4 45g、K2HPO4 ·2H2O 85g、(NH4)2SO4 26.8g、FeSO4·7H2O 0.016g；
B液：每升H2O中含CaCl2·2H2O 1.8g、CoCl2·6H2O 3.2g、CuSO4·5H2O 2.8g、FeSO4·7H2O 3.1g、MnSO4·H2O 2.03g、Na2MoO4·2H2O 2.8g；
C液：每升H2O中含20%酪蛋白45.0ml、1M MgSO4 38.5ml、50mg/ml卡那霉素25.0ml、70%葡萄糖756ml、40%(NH4)2SO4 130ml、5%柠檬酸5.5ml；
补料培养基：D液：3800ml，每升H2O中含20%酪蛋白2.5ml、1M MgSO4 20ml、50mg/ml卡那霉素1.3ml、A液90ml、70%葡萄糖355ml、40%(NH4)2SO4 35ml、水496.2ml。
上述实施例1-7任一所述各培养基及IPTG的制备方法如下：
1、LBA培养基的制备方法
按上述各组分的配比精确称取规定的重量份，用氢氧化钠调节pH为7.0，然后用蒸馏水定容至1000ml，在121℃下灭菌30min，冷却至50-60℃，加入氨苄西林钠100mg，混匀，即得。
2、发酵培养基的制备方法
A液：按上述各组分的配比精确称取规定的重量份，在蒸馏水中溶解，用氢氧化钠调节pH为7.0，然后定容至1200ml，即得；
B液：按上述各组分的配比精确称取规定的重量份，在适量蒸馏水中溶解，然后定容至150ml，即得；
C液：按上述各组分的配比精确称取规定的重量份，其中70%葡萄糖加热溶解后，单独在115℃下灭菌20min；其余组分除卡那霉素外，充分混匀，然后在121℃下灭菌20min，冷却后加入已灭菌的葡萄糖，混合均匀后，再加入卡那霉素，混匀，用蒸馏水补至600ml，即得。
3、补料培养基的制备方法
D液：按上述各组分的配比精确称取规定的重量份，其中70%葡萄糖加热溶解后，单独在115℃下灭菌20min；其余组分除卡那霉素外，充分混匀，然后在121℃下灭菌20min，冷却后加入已灭菌的葡萄糖，混合均匀后，再加入卡那霉素，混匀，用蒸馏水补至3800ml，即得。
4、IPTG
IPTG（异丙基硫代-β-半乳糖苷）120g，溶解定容至1000ml，用0.22um过滤器将溶液过滤至已灭菌的试剂瓶中，密封，-20℃保存，即得浓度为120g/L的IPTG。
实验例：
实验例1：发酵结果评价
按照前述实施例1-7的技术方案，得到实验样品，按顺序编号为样品1-7；按照任启生等“重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体基因的克隆、表达与生物活性鉴定”（生物技术,2004, 14(5): 6-8）的方法制备得到对照样品1。观察各方法得到的目的菌体，见表2。
表2
样品 最终菌体湿重（g/L） 目的蛋白表达率
样品1 42 33%
样品2 38 34%
样品3 43 34%
样品4 36 32%
样品5 38 34%
样品6（对比） 29 26%
样品7（对比） 33 27%
对照样品1 25 20%
以上结果表明，采用本发明所述方法，表达水平较高，制备得到的重组大肠杆菌得到了稳定的生长，样品1-5与对比样品1相比，湿重增加约0.68倍，表达率提高了0.65倍，样品1-5与对比样品6-7相比，各考察指标均优于样品6-7，说明本发明所采用的发酵条件范围合理且优于现有技术的培养方法，得到的目的菌体产率高、且工艺简便，有效降低了生产成本。
实验例2 关键工艺参数研究
重组大肠杆菌的发酵培养中，影响发酵的因素除了培养基成分及用量以外，环境条件如培养温度、pH、比生长速率、溶解氧以及营养物的合理流加等也至关重要。
2.1培养温度、pH值
通过长期对重组大肠杆菌培养以及瑞替普酶工艺的研究，可知发酵pH值恒定为6.6-6.9，种子活化时期培养温度在35-37℃范围内，发酵时期温度在30-37℃范围内，菌种生长速度合理，长势好。
2.2关键工艺参数研究
乙酸是大肠杆菌的主要副产物，它对细菌生长和产物的表达都有抑制作用。细菌比生长速率（µ）高乙酸的比生成率就高，当重组菌的生长速率超过临界值便产生乙酸，因此需选取合适的µ才能达到高密度、高表达的发酵。故本研究人员除了对培养基、培养温度、pH等进行控制，还对溶氧量、搅拌转速、补料流加的速度等也进行了研究。采用实施例1的方法，其中各参数考察结果见表3。
表3-1
表3-2
表3-3
实验结果表明，初始溶氧量为25-30%、提升转速为20-30rpm、补料流加速度为6-7ml/min，所得目的产物的重量和表达率均较好，其中初始溶氧量为30%、提升转速为25rpm、补料流加速度为7ml/min最优。
2.3诱导表达研究
在重组大肠杆菌高密度培养中，合适的诱导时间和诱导强度才能达到重组产物的最大比生产率，以菌体OD600、湿重、产率为指标，观察下表中IPTG的浓度、用量和诱导时间对其的影响。
表4
结果表明，采用IPTG的浓度为120g/L、用量为12ml、诱导4小时，效果最佳。
实验例3 产品稳定性试验
采用上述优选的培养基和培养方法连续进行100批次的培养，然后检测最终菌体湿重和目的蛋白表达率。
长期的监测结果表明，稳定性良好。

Claims (6)

1.一种生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，其特征在于，制备步骤如下：
(1)种子活化：通过三次扩增获得发酵工作种子液：
第一次扩增：将表达瑞替普酶的大肠杆菌工程菌株在LBA培养基上活化，然后挑取一个单菌落到10ml LBA培养基，在35～37℃，110-140rpm，培养至OD600＝0.8-1.0，得到一级种子培养液；
第二次扩增：将一级种子液按5％-10％的接种量接种至100ml LB培养基，在35～37℃，110-140rpm，培养至OD600＝0.8-1.0，即得二级种子液；
第三次扩增：将二级种子液以3％-7％的接种量接入1.5L LB培养基，在35～37℃，110-140rpm，培养至OD600＝0.8-1.2，即得发酵工作种子液；
(2)发酵前准备：罐体及管道灭菌，配制培养液，在19L发酵罐中添加纯化水8L、5ml泡敌和1200mlA液、150mlB液，121℃灭菌20分钟，冷却至30℃时，再加入之前单独灭菌的15％酵母提取物500ml，600mlC液；校正溶氧电极，pH电极，然后在火焰保护下打开发酵罐的接种口，将发酵工作种子液全部接种于发酵罐中；
(3)发酵：控制发酵条件，发酵温度30-37℃，用氨水调节pH值为6.6-6.9，初始溶氧量25-30％，调节转速为150-250rpm，每隔两小时转速提升20-30rpm，当OD600＝20-22时，开始用蠕动泵加入补料培养基，进行补料，补料的流加速度为6-7ml/min；
(4)诱导：当OD600＝30-32时，开始添加IPTG 10-12ml进行诱导，诱导表达结束后，收集菌液，离心，分离，即得目的菌体；
(5)上述培养基组成为：
LBA培养基：每升H2O中蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂10g，氨苄西林钠100mg；
发酵培养基：A液：每升H2O中含KH2PO4 25-40g、K2HPO4·2H2O 57.5-80g、(NH4)2SO417.5-25.8g、FeSO4·7H2O 0.008-0.015g；
B液：每升H2O中含CaCl2·2H2O 0.8-1.6g、CoCl2·6H2O 1.60-2.93g、CuSO4·5H2O 1.5-2.5g、FeSO4·7H2O 1.80-2.87g、MnSO4·H2O 1.0-1.93g、Na2MoO4·2H2O 1.60-2.67g；
C液：每升H2O中含20％酪蛋白25.0-41.67ml、1M MgSO4 16.67-36.67ml、50mg/ml卡那霉素10.0-23.33ml、70％葡萄糖600-1000ml、40％(NH4)2SO4 80-120ml、5％柠檬酸1.67-5.0ml；
补料培养基：D液：每升H2O中含20％酪蛋白1.67-2.22ml、1M MgSO4 10.42-17.36ml、50mg/ml卡那霉素0.56-1.11ml、A液55.56-83.33ml、70％葡萄糖208.33-347.22ml、40％(NH4)2SO4 20-30ml、水518.76-703.46ml。
2.根据权利要求1所述的生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，其特征在于：所述步骤(2)中发酵罐为19L发酵罐，所述酵母提取液浓度为12％-18％。
3.根据权利要求1所述的生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，其特征在于：所述步骤(3)中发酵时间为22-26小时。
4.根据权利要求1所述的生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，其特征在于：所述步骤(4)中IPTG的浓度为120g/L，用量为10-12ml，诱导时间为4-5小时。
5.根据权利要求1所述的生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，其特征在于：所述步骤(4)中离心转速为8000-9000rpm，温度4℃，离心25-40分钟。
6.根据权利要求1-5任一所述的培养方法，其特征在于：制备步骤如下：
(1)种子活化：通过三次扩增获得发酵工作种子液：
第一次扩增：将表达瑞替普酶的大肠杆菌工程菌株在LBA培养基上活化，然后挑取一个单菌落到10ml LBA培养基，在37℃，125rpm，培养至OD600＝0.8-1.0，得到一级种子培养液；
第二次扩增：将一级种子液按5％的接种量接种至100ml LB培养基，在37℃，125rpm，培养至OD600＝0.8-1.0，即得二级种子液；
第三次扩增：将二级种子液以5％的接种量接入1.5L LB培养基，在37℃，125rpm，培养至OD600＝0.8-1.2，即得发酵工作种子液；
(2)发酵前准备：在19L发酵罐中添加纯化水8L、5ml泡敌和1200mlA液、150mlB液，121℃灭菌20分钟，冷却至30℃时，再加入之前单独灭菌的15％酵母提取物500ml，600mlC液；校正溶氧电极，pH电极，然后在火焰保护下打开发酵罐的接种口，将发酵工作种子液全部接种于发酵罐中；
(3)发酵：控制发酵条件，发酵温度37℃，用氨水调节pH值为6.6-6.9，初始溶氧量30％，调节转速为200rpm，发酵22-26小时，每隔两小时转速提升25rpm，当OD600＝20时，开始用蠕动泵进行补料，加D液，补料的流加速度为6-7ml/min；
(4)诱导：当OD600＝30时，开始添加浓度为120g/L的IPTG 12ml进行诱导，5小时诱导表达结束后，收集菌液，4℃、转速为9000rpm条件下离心30分钟，分离，即得目的菌体；
(5)上述培养基组成为：
LBA培养基：每升H2O中蛋白胨10g，酵母提取液5g，氯化钠5g，琼脂10g，氨苄西林钠100mg；
发酵培养基：A液：每升H2O中含KH2PO4 32.50g、K2HPO4·2H2O 68.75g、(NH4)2SO421.67g、FeSO4·7H2O 0.012g；
B液：每升H2O中含CaCl2·2H2O 1.20g、CoCl2·6H2O 2.27g、CuSO4·5H2O 2.0g、FeSO4·7H2O 2.33g、MnSO4·H2O 1.47g、Na2MoO4·2H2O 2.13g；
C液：每升H2O中含20％酪蛋白33.33ml、1M MgSO4 26.67ml、50mg/ml卡那霉素16.67ml、70％葡萄糖800ml、40％(NH4)2SO4 100ml、5％柠檬酸3.33ml；
补料培养基：D液：每升H2O中含20％酪蛋白1.94ml、1M MgSO4 13.89ml、50mg/ml卡那霉素0.83ml、A液69.44ml、70％葡萄糖277.78ml、40％(NH4)2SO4 25ml、水611.12ml。
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