DE3789833T2

DE3789833T2 - Isoliertes Phenylalanindehydrogenase-Gen und Verfahren zur Herstellung von Phenylalanindeshydrogenase.

Info

Publication number: DE3789833T2
Application number: DE3789833T
Authority: DE
Inventors: Yasuhisa Asano; Yasuo Hibino; Naganori Numao; Noriko Okazaki
Original assignee: Central Glass Co Ltd; Sagami Chemical Research Institute; Tosoh Corp
Current assignee: Central Glass Co Ltd; Sagami Chemical Research Institute; Tosoh Corp
Priority date: 1986-08-12
Filing date: 1987-08-12
Publication date: 1994-09-01
Anticipated expiration: 2007-08-13
Also published as: EP0256514A3; US5015582A; DE3789833D1; EP0256514B1; US4970157A; EP0256514A2

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft für Phenylalanin-Dehydrogenase kodierende Gene, das Gen enthaltende Plasmide, mit dem Plasmid transformierte Mikroorganismen, ein Verfahren zur Herstellung der Phenylalanin-Dehydrogenase und ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin unter Verwendung eines Enzyms.

2. Beschreibung des verwandten Standes der Technik

Versuche sind unternommen worden, um L-Aminosäuren unter Verwendung einer α-Ketocarbonsäure als Substrat her zustellen. Beispielsweise sind ein Verfahren zum Herstellen von L-Glutaminsäure durch Zufügen von α-Ketoglutarat und verschiedenen Arten von Aminosäuren zu mikrobiellen Zellen (Katagiri et al., Amino Acid and Nucleic Acid, 2, 18, 1960), ein Verfahren zum Gewinnen von L-Phenylalanin durch Zufügen von L-Glutaminsäure oder L-Asparaginsäure zu einer Phenylbenztraubensäure enthaltenden Reaktionsmischung (Asai et al., Amino Acid and Nucleic Acid, 2, 114, 1960, und ein Verfahren zum Synthetisieren von L-Tryptophan durch Zufügen von L-Glutaminsäure oder L-Asparaginsäure zu einer Indolbrenztraubensäure enthaltenden Reaktionsmischung (Aida et al., Journal of General and Applied Microbiology, 4, 200, 1958), beschrieben worden.
Die japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 60- 164493 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin durch entweder Kultivieren einer aus verschiedenen Arten von Mikroorganismen mit Phenylbrenztraubensäure und einem Aminogruppendonor oder Inkubieren von Zellen dieses Mikroorganismus oder eines behandelten Produkts der Zellen mit Phenylbenztraubensäure und einem Aminogruppendonor. Jedoch offenbart diese Beschreibung nicht, welche Art von Enzymen an der Reaktion teilnehmen. Weiterhin verwenden solche Verfahren Aminosäuren, welche teure Aminogruppendonatoren sind.
Alle vorstehend erwähnten Verfahren verwenden als Aminogruppendonor einer gewünschten Aminosäure eine andere Aminosäure und sind grundsätzlich verschieden von einem erfindungsgemäßen Verfahren, welches ein Ammoniumion als Aminogruppendonor verwendet, welches nicht so teuer ist. Die Verfahren des Standes der Technik sind insbesondere teurer als das vorliegende Verfahren. Weiterhin sind die Enzyme, die in dem Verfahren des Standes der Technik eine Rolle spielen, verschieden von denjenigen des vorliegenden Verfahrens.
Die japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 60-43391 offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure, worin ein Mikroorganismus, der fähig ist, eine α-Ketosäure zu einer entsprechenden L-Aminosäure umzusetzen, kultiviert wird und während des Kultivierens die α-Ketosäure in das Kulturmedium eingebracht wird, um die α-Ketosäure zu der L-Aminosäure umzuwandeln. Gemäß dem in der Beschreibung vorgeschlagenen Reaktionsmechanismus wird als Aminogruppendonor für die Bildung einer gewünschten L-Aminosäure aus einer entsprechenden α-Ketosäure L-Glutamat verwendet, was bedeutet, daß die Reaktion von einer Aminotransferase ausgeführt wird. Weiterhin offenbart die Anmeldung nur Brevibacterium, Corynebacterium und Escherichia coli als beteiligte Mikroorganismen.
Die japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 59-198972 beschreibt eine Phenylalanin-Dehydrogenase und ein Verfahren zur Herstellung von L-α-Aminocarbonsäure unter Verwendung dieses Enzyms. Jedoch stammt die darin beschriebene Phenylalanin-Dehydrogenase von Brevibacterium, und die Beschreibung erwähnt nicht, daß Sporosarcina und Bacillus ein ähnliches Enzym herstellen. Weiterhin besitzt die offenbarte Phenylalanin-Dehydrogenase ein Molekulargewicht von 130 000 ± 10 000 und besteht aus Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von 66 000 ± 5000 und ist daher unterschiedlich zu der vorliegenden Phenylalanin-Dehydrogenase.
Die japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 60-160890 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin durch entweder Kultivieren einer aus verschiedenen Arten von Mikroorganismen mit Phenylpyruvat in der Gegenwart einer Energiequelle, einer anorganischen Ammoniumverbindung oder Harnstoff und Sauerstoff oder durch Inkubieren eines kultivierten Produkts des Mikroorganismus oder eines behandelten Produkts davon mit Phenylpyruvat in der Gegenwart einer Energiequelle, einer anorganischen Ammoniumverbindung oder Harnstoff und Sauerstoff. Die Beschreibung erwähnt jedoch nicht die Art der in dem Verfahren beteiligten Enzyme, und das Verfahren ist vermutlich im wesentlichen ein Fermentationsverfahren, da Sauerstoff notwendigerweise vorhanden sein muß. Weiterhin bezieht sich die Beschreibung nicht auf Sporosarcina.
Die japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 60-24192 offenbart die Herstellung von L-Phenylalanin unter Verwendung eines Corynebacterium-Stammes, welcher mit einem Plasmid transformiert ist, das von Corynebacterium stammende Gene enthält, die mit der L-Phenylalanin-Produktion in Beziehung stehen.
Die japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 60- 62992 offenbart das Klonieren von Genen, die mit der Synthese von L-Phenylalanin in Escherichia coli in Beziehung stehen, und die Expression dieses Gens unter der Kontrolle eines trp-Promotors zur Herstellung von L-Phenylalanin.
Die japanischen ungeprüften Patentveröffentlichungen Nr. 60-66984 und 60-210993 offenbaren die Synthese von L-Phenylalanin unter Verwendung eines Brevibacterium- Mikroorganismus, welcher mit einem Plasmid transformiert ist, das ein Gen für ein Enzym, welches mit der L-Phenylalanin-Synthese in Beziehung steht, enthält, wobei das Gen vom L-Glutamat-produzierenden Coryneform stammt. Phenylalanin-Dehydrogenase-Gene von Bacillus und Sporosarcina, dieses Gen enthaltende Plasmide, mit dem Plasmid transformierte Mikroorganismen und ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin sind nicht beschrieben worden.
Ein Phenylalanin-Dehydrogenase produzierender Mikroorganismus, ein Verfahren zur Herstellung von Phenylalanin-Dehydrogenase, Phenylalanin-Dehydrogenase per se und ein Verfahren zur Herstellung einer α-Aminosäure, umfassend L-Phenylalanin, sind ausführlich in der EP-A-0 206 460 beschrieben.
Gewöhnlich ist die Fähigkeit von Wildtyp-Mikroorganismenstämmen, verwendbare Substanzen zu produzieren, gering und daher wird versucht, wenn die Produktion von verwendbaren Substanzen unter Verwendung eines Mikroorganismus beabsichtigt ist, den Mikroorganismus zu verbessern, um die Fähigkeit des Mikroorganismus zu steigern, eine gewünschte Substanz herzustellen. Jedoch sind konventionelle Verfahren zur Verbesserung eines Mikroorganismus, wie eine artifizielle Mutagenese unter Verwendung von beispielsweise einem chemischen Mutagen oder physikalischen Mutagen, wie Uv-Strahlen, zeitaufwendig und größtenteils vom Glück abhängig.

Zusammenfassung der Erfindung

In der vorliegenden Erfindung wird dementsprechend Gentechnologie verwendet, um die Fähigkeit eines Mikroorganismus, Phenylalanin-Dehydrogenase zu produzieren, zu steigern.
Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes Gen bereit, welches für Phenylalanin-Dehydrogenase eines zu der Gattung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Gattungen Bacillus und Sporosarcina gehörenden Mikroorganismus kodiert.
Die vorliegende Erfindung stellt auch die vorstehend erwähnten Gene enthaltende Expressionsplasmide bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt auch mit den vorstehenden Plasmiden transformierte Mikroorganismen bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer Phenylalanin-Dehydrogenase bereit, welches die folgenden Schritte umfaßt:
Kultivieren des vorstehend erwähnten Mikroorganismus und
Gewinnen der Phenylalanin-Dehydrogenase aus dem kultivierten Produkt.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin bereit, welches die folgenden Schritte umfaßt:
Reagieren lassen von Phenylbrenztraubensäure oder eines Salzes davon mit einem Ammoniumion in einem wäßrigen Medium in der Gegenwart der durch das vorstehend erwähnte Verfahren produzierten Phenylalanin-Dehydrogenase und eines reduzierenden Agens zur Bildung von L-Phenylalanin und
Gewinnen von L-Phenylalanin.

Kurze Beschreibung der Figuren

Die Fig. 1 und 2 stellen ein Verfahren zur Konstruktion der Plasmide pBPDH3, pBPDH1-DBL und pBPDH1-DBR von dem Plasmid pBPDH1 dar, wobei alle ein Phenylalanin-Dehydrogenase-Gen enthalten;
die Fig. 3-1 bis 3-3 stellen eine Nukleotidsequenz (obere Zeile) eines DNA-Fragments in dem Plasmid pBPDH1 dar, welches einen für die vorliegende Phenylalanin-Dehydrogenase kodierenden Bereich enthält, und eine Aminosäuresequenz (untere Zeile), welche der vorstehend erwähnten Nukleotidsequenz entspricht;
die Fig. 4 stellt eine Karte der Restriktionsendonuklease-Schnittstellen für die Plasmide pSPDH1 und pSPDH2 dar;
die Fig. 5-1 bis 5-3 stellen eine Nukleotidsequenz (obere Zeile) eines DNA-Fragments in dem Plasmid pSPDH1 dar, welches einen für die vorliegende Phenylalanin-Dehydrogenase kodierenden Bereich enthält, und eine Aminosäuresequenz (untere Zeile), welche der vorstehend erwähnten Nukleotidsequenz entspricht; und
die Fig. 6 stellt eine Karte der Restriktionsendonuklease-Schnittstellen für das Plasmid pBBPDH19 dar.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Erfindungsgemäß wird die DNA aus einem Mikroorganismus extrahiert, welcher zu der Gattung Bacillus oder Sporosarcina gehört und fähig ist, Phenylalanin-Dehydrogenase zu produzieren, wird ein Phenylalanin-Dehydrogenase-Gen durch Schneiden der extrahierten DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen erhalten, wird das Gen in einen geeigneten Vektor eingebracht, um ein Expressionsplasmid zu konstruieren und wird ein Mikroorganismus mit dem Expressionsplasmid transformiert, um eine Phenylalanin-Dehydrogenase-produzierende Transformante zu bilden. Dieser transformierte Mikroorganismus wird verwendet, um Phenylalanin-Dehydrogenase herzustellen, welche dann verwendet wird, um L-Phenylalanin herzustellen.

1. Mikroorganismus als Genquelle

Mikroorganismen, die als eine Genquelle für die vorliegende Erfindung verwendet werden können, sind solche, die zu den Gattungen Sporosarcina oder Bacillus gehören und fähig sind, Phenylalanin-Dehydrogenase zu produzieren. Solche Mikroorganismen können aus dem Bestand von Hinterlegungsstellen ausgewählt oder aus natürlichen Quellen isoliert werden.
Die zu der Gattung Sporosarcina gehörenden Mikroorganismen umfassen Sporosarcina ureae. Solche Arten umfassen beispielsweise die Stämme Sporosarcina ureae IFO 12698 und Sorosarcina ureae IFO 12699 (ATCC 6473) als aus dem Bestand einer Hinterlegungsstelle ausgewählte Arten und Sporosarcina ureae SCRC-R04, welcher zuerst von dem Erfinder isoliert wurde. Die erstgenannten Stämme können vom Institut für Fermentation Osaka (IFO), 17-85 Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan oder von der American Type Culture Collection (ATCC), 12301, Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A. erhalten werden; und der zuletztgenannte Stamm, Sporosarcina ureae SCRC-R04, wurde beim Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (FRI), 1-1-3 Yatabe-cho Higashi, Tsukuba-gun, Ibaraki-ken, Japan als FERM P-8178 am 16. April 1985 hinterlegt und am 3. April 1986 als FERM BP-1012 zur internationalen Hinterlegung unter dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren (Budapester Vertrag) überführt.
Die Mikroorganismen, die als Genquelle für die vorliegende Erfindung verwendet werden können und zu der Gattung Bacillus gehören, umfassen beispielsweise Bacillus alvei IFO 3343, Bacillus thiaminolyticus IAM 1034, am 28. November 1986 hinterlegt beim FRI als FERM P-8528, Bacillus badius IAM 11059, ATCC 14574, am 28. November 1985 hinterlegt beim FRI als FERM P-8529, Bacillus sphaericus IFO 12622, Bacillus sphaericus IAM 1228, am 28. November 1985 hinterlegt beim FRI als FERM P-8527. Alle vorstehend erwähnten Stämme sind in Katalogen aufgelistet, die vom IFO, ATCC oder für IAM durch die Japanese Federation of Culture Collections of Microorganismus (JFCC), Institute of Medical Science, University of Tokyo, Shiroganedai 4-6-1, Minato-ku, Tokyo 108, Japan, veröffentlicht wurden, und sind öffentlich zugänglich.
Weiterhin umfaßt der Mikroorganismus, der als Genquelle für die vorliegende Erfindung verwendet werden kann, neue von den Erfindern isolierte Stämme, wie Bacillus sp. SCRC-R53b, Bacillus sp. SCRC-R79a, am 16. April 1985 hinterlegt beim FRI als FERM P-8179 und am 3. April 1986 als FERM BP-1013 zur internationalen Hinterlegung nach Budapester Vertrag überführt, Bacillus sp. SCRC- 101A und Bacillus sp. SCRC 114D, am 3. April 1986 beim FRI als internationale Hinterlegung FERM BP-1011 hinterlegt.
Gemäß dem Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage, 1974, wurden die vorstehend aufgelisteten Stämme wie folgt charakterisiert:
(a) SCRC-R04 ist aerob, beweglich, zur Sporenbildung fähig, Gram-positiv und bestehend aus 2 bis 4 Cocci. Daher gehört der Stamm zur Gattung Sporosarcina. Da Sporosarcina Sporosarcina ureae als einzige Art umfaßt und die vorstehend erwähnten Eigenschaften von SCRC-R04 fast vollständig mit den in der Literatur beschriebenen übereinstimmen, wird der Stamm SCRC-R04 als Sporosarcina ureae identifiziert.
(b) SCRC-R53b, SCRC-R79a, SCRC-101A und SCRC-114D sind alle Gram-positiv, Stäbchen, zur Bildung von Endosporen und Katalase fähig. Daher gehören sie zu Bacillus.
Einzelheiten der Eigenschaften der vorstehend erwähnten Stämme sind in EP-A-0 206 460 beschrieben.

2. Klonierung eines Phenylalanin-Dehydrogenase-Gens und Konstruktion eines Expressionsplasmids

Erfindungsgemäß kann jeder der vorstehend erwähnten Phenylalanin-Dehydrogenase produzierenden Mikroorganismen als Genquelle verwendet werden, und eine Ausführungsform, worin Bacillus sphaericus SCRC-R79a (FERM BP-1013), Sporosarcina ureae SCRC-R04 (FERM BP-1012) und Bacillus badius IAM 11059 (FERM P-8529) verwendet werden, ist hierin definitiv beschrieben. Das Verfahren zur Genklonierung ist genau in den Beispielen beschrieben.
Obwohl als Expressionskontrollregion für das vorliegende Phenylalanin-Dehydrogenase-Gen diejenige, die natürlicherweise das Phenylalanin-Dehydrogenase-Gen begleitet, verwendet werden kann, um die Expression zu verstärken oder die Expressionsinduktion möglich zu machen, wird vorzugsweise ein fremder Promotor/Operator verwendet. Wenn E. coli als Wirt verwendet wird, können trp, tac, lacUV5, PL, PR, lpp oder ähnliche als Promotor/Operator verwendet werden, und als SD-Sequenz können diejenigen des trp-Leaderpeptids, von lacZ, des Metapyrocatechase-Gens, CII-Gens oder ähnlichen verwendet werden. Weiterhin kann ein Transkriptionsterminator, wie ein rrnBT&sub1;, T&sub2;-Terminator eines Ribosomgens von E. coli stromabwärts der kodierenden Region bereitgestellt werden. Weiterhin kann für die Expression eines Phenylalanin-Dehydrogenase-Gens ein Wirt/Vektor-System von Saccharomyces cerevvisiae verwendet werden. Als Hefe-Promotor kann ein Promotor eines Alkoholdehydrogenase-Gens, ein Promotor eines für saure Phosphatase kodierenden Gens, ein Promotor eines für eine Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase kodierenden Gens, ein Promotor eines für eine Enolase kodierenden Gens oder ähnliche verwendet werden. Das Hefe-Plasmid enthält vorzugsweise einen Hefe-Replikationsursprung und einen selektiven Marker für eine Selektion der das Plasmid enthaltenden Hefezellen, wie beispielsweise ein Gen, das einem auxotrophen Wirt Prototrophie vermittelt, wie ein LEU-, TRP-, HIS-Gen oder ähnliche.
Allgemein hängt die Menge der Expression eines bestimmten Proteins in Hefezellen von der Kopienanzahl des zu exprimierenden Gens, von der Transkriptionseffizienz, von der Stabilität der mRNA, von der Translationseffizienz und von der Stabilität des produzierten Proteins ab. Um die Expressionskontrollregionen, wie Promotor, SD-Sequenz, Terminator und ähnliche, modifizieren zu können, ist das Plasmid vorzugsweise klein. Bemerke, daß der Anstieg der Kopienanzahl um so größer ist, je kleiner das Plasmid ist. Nachdem ein DNA-Fragment, welches ein Phenylalanin-Dehydrogenase-Gen enthält, in ein Plasmid eingebaut worden ist, wird daher vorzugsweise die Subklonierung des Plasmids wiederholt, um einen nicht-kodierenden Bereich des DNA-Fragments zu beseitigen und auf diese Weise die Größe des Plasmids zu reduzieren.
Erfindungsgemäß ist der Wirt vorzugsweise ein E. coli-Stamm, wie beispielsweise ein von E. coli K-12 abgeleiteter Stamm, wie JM83, JM101, JM103, JM105, JM109, RR1, RB791, W3110, C600, HB101, DH1 und ähnliche. Andererseits werden als Hefewirt vorzugsweise Saccharomvces cerevisiae-Stämme, wie AH22, DC5, D-13-1A, YNN140 und ähnliche verwendet.

3. Herstellung von Phenylalanin-Dehydrogenase

Erfindungsgemäß kann Phenylalanin-Dehydrogenase durch ein konventionelles Verfahren, das zur Herstellung eines Proteins durch gentechnische Verfahren verwendet wird, hergestellt werden. Beispielsweise wird ein Mikroorganismus, wie E. coli, der mit einem das Phenylalanin-Dehydrogenase-Gen enthaltenden Expressionsplasmid transformiert ist, in einem geeigneten Medium kultiviert; wenn die Zellkonzentration eine vorbestimmte Rate erreicht, wird eine Induktionsbehandlung, die von der Natur der Kontrollregion des verwendeten Plasmids abhängt, durchgeführt, um Phenylalanin- Dehydrogenase herzustellen.
L-Phenylalanin-Dehydrogenase wird gewonnen und gemäß einer Kombination konventioneller Verfahren, die zur Reinigung eines Enzyms verwendet werden, aus dem kultivierten Medium gereinigt. Beispielsweise wird das kultivierte Medium zentrifugiert werden, um Bakterienzellen zu sammeln. Die Zellen werden danach durch ein konventionelles Verfahren, wie Ultraschall- oder Dynomill-Behandlung, aufgebrochen, und die Zelltrümmer werden durch ein konventionelles Verfahren, wie Zentrifugation oder Filtration, entfernt, um einen Überstand oder ein Filtrat zu erhalten, welcher bzw. welches das gewünschte Enzym enthält. Eine weitere Reinigung, wie beispielsweise eine Behandlung mit Protaminsulfat, eine Behandlung mit Streptomycinsulfat, Aussalzen, eine Präzipitation mit einem organischen Lösungsmittel, Absorptionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie und Kristallisation unter Verwendung von beispielsweise Ammoniumsulfat oder Polyethylenglykol kann durchgeführt werden.
Die Aktivität der vorliegenden Phenylalanin-Dehydrogenase wird gemäß den folgenden Verfahren bestimmt:
100 umol Glycin-KCl-KOH-Puffer (pH 10,5), 2,5 umol NAD&spplus;, 10 umol L-Phenylalanin und eine geeignete Probenmenge werden zu einem Gesamtvolumen von 1 ml gemischt, um die Komponenten reagieren zulassen, und der Anstieg der NADH-Menge wird über den Anstieg der Absorption bei 340 nm gemessen. Die Menge des Enzyms, welche die Menge von NADH um 1 umol pro 1 Minute ansteigen läßt, wird als 1 Einheit definiert.

4. Herstellung von L-Phenylalanin

Gemäß einer Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens läßt man Phenylbrenztraubensäure, NADH und ein Ammoniumion in Gegenwart von Phenylalanin-Dehydrogenase reagieren, um L-Phenylalanin zu bilden, und L-Phenylalanin wird gewonnen.
Die Formen der Enzympräparationen der Phenylalanin-Dehydrogenase sind nicht beschränkt. Die Präparationen umfassen beispielsweise ein vollständig gereinigtes Enzym, Zellen enthaltendes kultiviertes Medium, lebende Zellen, getrocknete Zellpulver, die durch Behandeln von Zellen mit beispielsweise Aceton oder Ethanol hergestellt werden, aufgebrochene Zellen und partiell gereinigte Enzympräparationen, die zu verschiedenen Reinigungsstadien gereinigt sind. Weiterhin können immobilisierte Enzympräparationen, wie immobilisierte Enzyme und immobilisierte Enzyme enthaltende Produkte, die gemäß konventionellen Verfahren hergestellt werden, verwendet werden. Für eine industrielle Produktion werden lebende Zellen oder immobilisierte Enzympräparationen bevorzugt verwendet.
Die Menge der von der vorstehend erwähnten Enzympräparation stammenden Phenylalanin-Dehydrogenase in einem Reaktionsmedium ist nicht kritisch, liegt vorzugsweise jedoch zwischen ungefähr 10 und 10 000 Einheiten pro 1 Liter, abhängig von der Natur und Menge des Substrats, α-Ketocarbonsäure, und anderen Bedingungen.
Als Substrat können sowohl Phenylbrenztraubensäure als auch dessen Salze verwendet werden. Die Salze umfassen beispielsweise das Natriumsalz, Kaliumsalz, Lithiumsalz und Calciumsalz, etc. Die Menge an Phenylbrenztraubensäure oder dessen Salz in dem Reaktionsmedium ist nicht kritisch, beträgt jedoch vorzugsweise ungefähr 1 bis 500 g/l, abhängig von der Enzymkonzentration. Wenn das Substrat in niedrigerer Konzentration verwendet wird, kann es als freie Säure verwendet werden, und wenn es in relativ hoher Konzentration verwendet wird, wird es vorzugsweise als Salz verwendet, um die Einstellung des pH im Reaktionsmedium zu erleichtern. Das Natriumsalz der Phenylbrenztraubensäure ist in einer hohen Konzentration nicht gelöst, jedoch ist die Gegenwart eines festen Salzes im Reaktionsmedium nicht nachteilig. Wenn ein Ammoniumsalz der Phenylbrenztraubensäure verwendet wird, kann das Ammoniumsalz sowohl als Quelle des Ammoniumions als auch als Quelle für Phenylbrenztraubensäure dienen. In einer chargenweisen Reaktion kann Phenylbrenztraubensäure oder dessen Salz auf einmal am Reaktionsbeginn oder während der Reaktion in Portionen oder fortlaufend zugefügt werden. Die Salze der Phenylbrenztraubensäure können solche sein, die kommerziell erhältlich sind oder solche, die durch Neutralisieren von Phenylbrenztraubensäure mit einer entsprechenden Base, wie Natriumhydroxid oder Ammoniak, hergestellt wurden.
Als Quelle des Ammoniumions kann ein Ammoniumsalz, wie Ammoniumchlorid oder Ammoniumsulfat, verwendet werden.
Weiterhin kann Ammoniakgas oder ein wäßriges Ammoniumhydroxid in das Reaktionsmedium eingebracht werden, um den pH-Wert innerhalb eines vorbestimmten Bereichs zu halten. Wenn, wie vorstehend beschrieben, ein Ammoniumsalz der Phenylbrenztraubensäure als Substrat verwendet wird, dient das Salz auch als Quelle des Ammoniumions. Die Menge des verwendeten Ammoniumions ist bezogen auf die Molmenge der verwendeten Phenylbrenztraubensäure stöchiometrisch oder liegt darüber, und liegt bezogen auf die Molmenge der verwendeten Phenylbrenztraubensäure spezifischer zwischen 1 und 100 mol. Durch Anheben der Menge des verwendeten Ammoniumsalzes wird das Gleichgewicht der beteiligten Enzymreaktion auf die Seite der L-Phenylalanin-Bildung verschoben, woraus sich ein Anstieg hinsichtlich der Ausbeute an L-Phenylalanin im Verhältnis zu Phenylbrenztraubensäure ergibt.
NADH kann in einer äquivalenten Menge zu Phenylbrenztraubensäure verwendet werden. Da NADH sehr teuer ist, wird jedoch aus einem industriellen Gesichtspunkt zusätzlich zu dem Reaktionssystem, worin Phenylbrenztraubensäure mit NH&sub4;&spplus; und NADH reduktiv aminiert wird, um L-Phenylalanin und NAD&spplus; zu bilden, vorzugsweise ein NADH-regenerierendes System verwendet, worin das gebildete NAD&spplus; zu NADH zurückreduziert wird. Als ein solches NADH-regeneriendes System kann eine Kombination eines Enzyms, welches NAD&spplus; zu NADH umwandelt und ein Substrat für die Reaktion verwendet werden, wie beispielsweise eine Kombination aus Formiatdehydrogenase (EC 1.2.1.2) und Formiat, L-Glutamatdehydrogenase (EC 1.4.1.2) und L-Glutamat, Alkoholdehydrogenase (EC 1.1.1.1) und Ethanol, Aldehyddehydrogenase (EC 1.2.1.3) und Acetaldehyd oder eine Kombination aus Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.49) und Glucose-6-phosphat. Weiterhin kann die Reduktion von NAD&spplus; zu NADH mit Hydrogenase (EC 1.18.3.1) unter Verwendung von molekularem Wasserstoff als Elektronendonor oder die Reduktion von NAD&spplus; zu NADH, begleitet von der Oxidation von Methylbiologen oder Dihydrolipoamid mit Diaphorase (EC 1.6.4.3) durchgeführt werden. Wenn Formiat-Dehydrogenase und Formiat verwendet werden, wird gleichzeitig mit der Reduktion von NAD&spplus; zu NADH Ameisensäure zu Kohlendioxidgas oxidiert, welches leicht aus dem Reaktionssystem beseitigt werden kann, mit dem Ergebnis, daß das Gleichgewicht der Reaktion in die gewünschte Richtung verschoben wird. Daher ist als NADH-regenerierendes System die Kombination aus Formiat-Dehydrogenase und Formiat besonders bevorzugt.
Formiat-Dehydrogenase ist kommerziell erhältlich oder wird gemäß einem von Kato et al., Agricultural and Biological Chemistry, 38, 111-116 (1974) beschriebenen bekannten Verfahren, ausgehend von Candida boidinii Nr. 2201 (AKU 4705) oder Hansenula polymorpha ATCC 26012 hergestellt. Wenn Formiat-Dehydrogenase in der Form von Zellen, welche dieselbe enthalten, verwendet wird, kann die Behandlung der Zellen gemäß einem von Izumi et al. in Journal of Fermentation Technology, 61, 135-142 (1983) beschriebenen bekannten Verfahren durchgeführt werden.
Die Enzymkonzentration für das NADH-regenerierende System variiert in Abhängigkeit von der Konzentration der Phenylalanin-Dehydrogenase etc. und ist gewöhnlich eine Konzentration, bei der NAD&spplus; in einer Rate zu NADH reduziert wird, die einer Rate entspricht, in welcher eine α-Ketocarbonsäure reduktiv aminiert, d. h. NADH&spplus; gebildet wird. Wenn beispielsweise Formiat-Dehydrogenase in Kombination mit 10 bis 10 000 Einheiten/l Phenylalanin-Dehydrogenase als ein Enzym für das NADH-regenerierende System verwendet wird, liegt die Konzentration der Formiat-Dehydrogenase vorzugsweise bei ungefähr 10 bis 10 000 Einheiten/l. Als Substrat für die Formiat-Dehydrogenase wird geeigneterweise ein Salz der Ameisensäure, wie Natriumformiat, Kaliumformiat oder Ammoniumformiat, verwendet. Die Formiatmenge entspricht vorzugsweise einer bis zwei äquivalenten Mengen des verwendeten α-Ketocarboxylats. Wenn das NADH-regenerierende System verwendet wird, kann NAD&spplus; oder NADH zu 0,1 bis 10 mM zugefügt werden, was einer gewöhnlichen, physiologischen Konzentration entspricht.
Als Reaktionsmedium können Wasser oder verschiedene Arten einer wäßrigen Lösung, wie beispielsweise eine wäßrige Pufferlösung oder eine wäßrige Lösung, welche ein organisches Lösungsmittel, wie Aceton, Acetonitril, Dimethylsulfoxid oder Dimethylformamid enthält, verwendet werden. Die Pufferlösungen umfassen Tris-HCl-Puffer, Glycin-NaOH-Puffer etc.
Wenn das NADH-regenerierende System nicht verwendet wird, wird die Reaktion bei einem pH durchgeführt, der für die reduktive Aminierung der Phenylbrenztraubensäure durch die verwendete Phenylalanin-Dehydrogenase geeignet ist. Von Sporosarcina stammende Phenyl-Dehydrogenase wird bei einem pH von 8 bis 10, vorzugsweise bei einem pH von ungefähr 9, verwendet, während von Bacillus stammende Phenylalanin-Dehydrogenase bei einem pH von 9 bis 11, vorzugsweise bei einem pH von ungefähr 10 verwendet wird. Wenn das NADH-regenerierende System in Kombination mit der reduktiven Aminierung von Phenylbrenztraubensäure verwendet wird, wird der pH-Wert des Reaktionsmediums innerhalb des Bereichs gewählt, in dem sowohl die reduktive Aminierung von α-Ketocarbonsäure als auch die Reduktion von NAD&spplus; zu NADH zufriedenstellend verläuft. Ein solcher pH-Bereich ist in dem Fall, bei dem eine Kombination der Phenylalanin-Dehydrogenase von Sporosarcina und Formiat-Dehydrogenase von Candida boidinii verwendet wird, gewöhnlich pH 7,5 bis 9,5, vorzugsweise pH 8,0 bis 9,0; während in dem Fall, bei dem eine Kombination aus Phenylalanin-Dehydrogenase von Bacillus und Formiat-Dehydrogenase von Candida boidinii verwendet wird, der pH-Bereich gewöhnlich 8 bis 10, vorzugsweise 8,5 bis 9,5, ist.
Die Reaktionstemperatur wird unter denselben Erwägungen ausgewählt, wie diejenigen, die für die Wahl des pH-Bereichs angestellt wurden, und die Reaktionstemperatur beträgt gewöhnlich 20ºC bis 50ºC, vorzugsweise 25ºC bis 40ºC.
Die Reaktionszeit ist nicht kritisch und wird dahingehend ausgewählt, daß ein Substrat, Phenylbrenztraubensäure, mit einer zufriedenstellenden Umwandlungsrate in Abhängigkeit von der Konzentration des Substrats und der Menge der im Reaktionsmedium vorhandenen Enzyme in L-Phenylalanin umgewandelt wird.
Die Reaktion kann chargenweise oder kontinuierlich durchgeführt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens wird das Substrat Phenylbrenztraubensäure in der Gegenwart einer wachsenden Kultur, wie ein lebende Zellen enthaltendes Medium, vom kultivierten Medium abgetrennte lebende Zellen, Zellen, die in einem Ausmaß behandelt wurden, daß ein für die Umwandlung von Phenylbrenztraubensäure zu L-Phenylalanin notwendiges Enzymsystem nicht zerstört wird, und in der Gegenwart einer Energiequelle ohne die artifizielle Zugabe von NADH, NAD&spplus; und des NADH-regenerierten Systems zu L-Phenylalanin umgewandelt. Die Energiequelle wird zu einem Reaktionsmedium zugefügt, und die Energiequelle kann als Elektronendonor für eine reduktive Aminierung von Phenylbrenztraubensäure wirken. Die Energiequellen umfassen beispielsweise Zucker, wie Arabinose, Ribose, Ribulose, Xylose, Fucose, Rhamnose, Fructose, Galactose, Gluconat, Trehalose, Glucose, Mannitol, Mannose, Sorbitol, Sorbose, Inositol, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Glycerin, Stärken, Inulin, Glycogen, Carboxymethylcellulose und ähnliche. Weiterhin umfassen Energiequellen Alkohole, wie Ethanol und Methanol, organische Säuren, wie Propionsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Zitronensäure, Brenztraubenäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, α-Ketoglutarsäure und ähnliche.
Für die zweite Ausführungsform werden das Reaktionsmedium, der Reaktions-pH, die Reaktionstemperatur und die weiteren Bedingungen ausgewählt, wie für die erste Ausführungsform beschrieben ist. Die zweite Ausführungsform benötigt ebenfalls keine aeroben Bedingungen.
Das auf diese Weise gebildete L-Phenylalanin wird gewonnen und gemäß irgendeinem konventionellen Verfahren gereinigt. Beispielsweise wird die Reaktionsmischung zu Trichloressigsäure zugefügt, um Protein zu präzipitieren, und sowohl das Präzipitat, wenn vorhanden, als auch die Zellen werden durch Filtration oder Zentrifugation entfernt, um ein Filtrat oder einen Überstand, welches bzw. welcher L-Phenylalanin enthält, zu erhalten. Das Produkt im Filtrat oder Überstand wird danach durch beispielsweise Ionenaustauschharz gereinigt und letztendlich kristallisiert.
Eine quantitative Analyse von L-Phenylalanin wird durch einen Bioassay unter Verwendung von beispielsweise Leuconostoc mesenteroides ATCC 8042 oder durch Papierchromatographie, bei welcher eine L-Aminosäure enthaltende Probe im Filterpapier getrennt, ein Fleck aus L-Phenylalanin mit Ninhydrin entwickelt und der entwickelte Fleck für eine spektrophotometrische Analyse eluiert wird, durchgeführt.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird jetzt durch die folgenden Beispiele näher dargestellt, wobei sie jedoch keineswegs darauf beschränkt ist.

Beispiel 1

Präparation chromosomaler DNA welche das Phenylalanin-Dehydrogenase-Gen enthält (1)

Bacillus sphaericus SCRC-R79a (FERM BP-1013) wurde in 3 l eines Mediums, welches 2 g/l L-Phenylalanin, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Pepton, 2 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 1 g/l Nacl und 0,5 g/l MgSO&sub4; · 7 H&sub2;O, pH 7,0 enthielt, eingeimpft und darin für ungefähr 10 Stunden bei 30ºC unter Schütteln bis zu einer Zellkonzentration von OD&sub6;&sub1;&sub6; = 1,1 kultiviert, wobei früher bestätigt worden war, daß dieser Wert der logarithmischen Wachstumsphase entspricht.
Das kultivierte Produkt wurde zentrifugiert, um Zellen zu sammeln, und 10 g der feuchten Zellen wurden verwendet, chromosomale DNA gemäß dem Doi-Verfahren (siehe Literaturstelle 1) zu extrahieren. Die Zellen wurden insbesondere in 40 ml TEN-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 6,7, 1 mM EDTA und 10 mM Nacl) suspendiert, und die Suspension wurde zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Die präzipitierten Zellen wurden in 20 ml SET-Puffer (20% Saccharose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,6 und 50 mM EDTA) suspendiert, 10 mg Lysozym wurden zu der Suspension zugefügt, und die gesamte Mischung wurde bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Nachdem die Bildung von Sphäroplasten unter einem Mikroskop bestätigt worden war, wurden 10 ml TEN-Puffer und 0,25 g Natriumdodecylsulfat zu der vorstehend erwähnten Suspension zugefügt, um die Sphäroplasten zu lysieren. Das Lysat wurde in gewöhnlicher Weise mit Phenol/Chloroform extrahiert, worauf eine Ethanol-Präzipitation der DNA folgte, die danach mit einem Glasstab aufgenommen wurde. Die DNA wurde in 10 ml TEN-Puffer gelöst, 0,5 mg RNase wurde zu der Lösung zugefügt, und die gesamte Mischung wurde bei 37ºC für zwei Stunden inkubiert. 1 mg Pronase wurde zu der Lösung zugefügt, welche danach für eine Stunde bei 37ºC inkubiert wurde.
Nach Phenol/Chloroform-Extraktion wurde die DNA mit Ethanol präzipitiert und unter reduziertem Druck getrocknet. Die getrocknete DNA wurde in TEN-Puffer gelöst.

Beispiel 2

Einsetzen chromosomaler DNA in einen Vektor (1)

Das Plasmid pUC9 oder pBR322 wurde als Vektor verwendet, und dementsprechend wurden 10 ug pUC9 oder pBR322 mit der Restriktionsendonuklease Hind III für zwei Stunden bei 37ºC gespalten, für eine Stunde bei 37ºC mit Kalbsthymus-Phosphatase und danach mit Phenol behandelt.
Die auf diese Weise behandelte Lösung wurde einer Agarose (1%)-Elektrophorese ausgesetzt, und ein 2,7 kb DNA-Fragment von pUC9 oder ein 4,4 kb DNA-Fragment von pBR322 wurde durch Elektroelution isoliert. Das Eluat wurde mit Phenol/ Chloroform extrahiert, worauf eine Ethanol-Präzipitation der Vektor-DNA folgte, die danach in 20 ul sterilem Wasser gelöst wurde.
Andererseits wurden 50 ug der in Beispiel 1 hergestellten chromosomalen DNA mit 50 Einheiten Hind III für 16 Stunden bei 37ºC gespalten, mit Phenol/Chloroform behandelt und mit Ethanol präzipitiert. Die präzipitierte DNA wurde danach in 50 ul sterilem Wasser gelöst, und 0,5 ug Vektor-DNA und 2 ug der wie vorstehend beschrieben hergestellten chromosomalen DNA wurden gemischt und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase in der Gegenwart von ATP und Dithiothreitol für 16 Stunden bei 12,5ºC ligiert.
Die Reaktionsmischung wurde verwendet, um E. coli gemäß einem konventionellen Verfahren zu transformieren. Der verwendete Wirt war E. coli K-12/JM103 für den Vektor pUC9 und E. coli K-12/PR1 für den Vektor pBR322.

Beispiel 3

Screening auf einen Phenylalanin-Dehydrogenase-positiven Klon

Die Transformationsmischung wurde zu einer Rate von 500 bis 1000 Klone pro Filter auf Nitrocellulosefilter ausplattiert, die auf eine mit 50 ug/ml Ampicillin ergänzten LB-Platte gelegt worden waren. Nachdem die Kultur für 16 Stunden bei 37ºC inkubiert worden war, wurden Replika-Filter mit frischen Nitrocellulosefiltern hergestellt, die danach für 3 Stunden bei 37ºC inkubiert wurden.
Die Nitrocellulosefilter wurden in eine Lysozym-Lösung (5 mg/ml Lysozym, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 1 mM EDTA) eingetaucht und für mehrmals 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, um die E. coli-Zellen zu lysieren. Die Filter wurden danach in 0,5 ml Tetrazolium-Lösung (50 mM L-Phenylalanin, 0,2 M Tris-HCl, pH 8,5, 1,5 mM NAD&spplus;, 0,8 mM 2-p-Jodphenyl-3-p-nitrophenyl-5-phenyltetrazoliumchlorid und 0,32 mM Phenazinmethosulfat) eingetaucht, und Transformanten mit einer dunkel-rötlich-violetten Farbe wurden ausgewählt.
Jeweils ungefähr 2000 Ampicillin-resistente Transformanten ausgehend von den Vektoren pUC9 und pBR322 ergaben jeweils einen Phenylalanin-Dehydrogenase-positiven Klon.

Beispiel 4

Analyse des Plasmids aus dem Transformanten

Die Plasmide wurden aus Phenylalanin-Dehydrogenase-positiven Klonen extrahiert, und ein rekombinantes Plasmid, welches von pUC9 als Vektor abgeleitet war, wurde als pBPDH1 bezeichnet. Alle Plasmide wurden geschnitten, um eine entsprechende Karte der Restriktionsnuklease-Schnittstellen herzustellen. Die Karte ist in Fig. 1 dargestellt.
Eine Nukleotidsequenz eines DNA-Fragments, welches einen für Phenylalanin-Dehydrogenase kodierenden Bereich im Plasmid pBPDH1 enthält, und eine der Nukleotidsequenz entsprechende Aminosäuresequenz sind in den Fig. 3-1 bis 3-3 dargestellt. Diese Sequenz ist ebenso sowohl in den Plasmiden pBPDH1-A und pBPDH1-BS als auch weiteren in den Fig. 1 und 2 gezeigten erfindungsgemäßen Plasmiden vorhanden.

Beispiel 5

Subklonierung von pBPDH1 (Fig. 1)

In diesem Beispiel wurden 10 ug des Plasmids pBPDH1 mit Hind III geschnitten, das Produkt des Schneidens wurde einer Agarosegel-Elektrophorese (0,7%) ausgesetzt, und ein DNA-Fragment von ungefähr 8 kb wurde durch Elektroelution isoliert. Danach, wurden 2 ug pUC9 mit Hind III geschnitten und mit Kalbsthymus-Phosphatase behandelt, worauf Phenol/Chloroform-Extraktion folgte. Beide Reaktionsmischungen wurden gemischt, über eine Elutip-d-Säule (Schleicher & Schuell) gereinigt, und die DNA wurde mit Ethanol präzipitiert.
Das Präzipitat wurde danach in T4-Ligase-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 1 mM ATP) gelöst und die Ligierung wurde unter Verwendung von T4-Ligase durchgeführt.
Die Reaktionsmischung wurde verwendet, um E. coli JM103 zu transformieren. Ein Klon hatte eine weiße Farbe auf einer LB-Platte, welche 50 ug/ml Ampicillin, 0,3 mM Isopropyl-β-D-thiogalactosid und 0,03% 5-Brom-4-chlor- 3-indolyl-β-D-galactosid enthielt, was ein Fehlen von β-Galactosidase-Aktivität anzeigt. Ein Plasmid wurde aus diesen Klonen extrahiert, und ein rekombinantes Plasmid, worin ein Hind III-Fragment von ungefähr 6 kb in die Hind III-Stelle von pUC9 eingesetzt war, wurde selektioniert. Das rekombinante Plasmid wurde als pBPDH1-A bezeichnet.

Beispiel 6

Konstruktion des Plasmids pBPDH3 (Fig. 1)

In diesem Beispiel wurden 2 ug pBR322 mit Hind III geschnitten, mit Kalbsthymus-Phosphatase behandelt, worauf Phenol/Chloroform-Extraktion folgte. Zu dem behandelten Produkt wurde das im Beispiel 5 isolierte DNA-Fragment von ungefähr 6 kb zugefügt, und die DNA-Mischung wurde über eine Elutip-d-Säule gereinigt und mit Ethanol präzipitiert. Das Präzipität wurde in 10 ul T4-Ligase-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM Mg&sub2;Cl&sub2;, 10 mM DTT und 1 mM ATP) gelöst, und die Ligierung wurde unter Verwendung von T4-Ligase durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde verwendet, um E. coli RR1 zu transformieren. Die Transformanten wurden gemäß einem konventionellen Verfahren durchmustert, und ein Plasmid pBPDH3 wurde erhalten.

Beispiel 7

Subklonierung von pBPDH1-A (Fig. 1)

In diesem Beispiel wurden 10 ug pBPDH1-A mit Bam HI und Sal I geschnitten, der Verdau wurde einer Agarosegelelektrophorese (0,7%) ausgesetzt, und ein DNA-Fragment von ungefähr 3 kb wurde durch Elektroelution isoliert.
Danach wurden 2 ug pUC9 mit Bam HI und Sal I geschnitten und mit Kalbsthymus-Phosphatase behandelt, worauf Phenol/Chloroform-Extraktion folgte. Gemäß demselben, wie im Beispiel 5 beschriebenen Verfahren wurden beide Reaktionsmischungen gemischt, und nach Reinigung über eine Elutip-d-Säule wurde die DNA unter Verwendung von T4-Ligase ligiert, und die Reaktionsmischung wurde verwendet, um E. coli JM103 zu transformieren. Ampicillinresistente Transformanten wurden gemäß demselben Verfahren, wie im Beispiel 5 beschrieben, durchsucht, um weiße Klone auszuwählen, welche keine α-Galactosidase-Aktivität ausüben. Die Plasmide wurden aus diesen Klonen extrahiert, und auf der Grundlage des Musters aus dem Restriktionsenzymverdau wurde ein rekombinantes Plasmid, worin ein Bam HI - Sal I-Fragment von ungefähr 3,2 kb in die Bam HI - Sal I-Stelle von pUC9 eingesetzt war, selektioniert und als pBPDH1-BS bezeichnet. Die Nukleotidsequenz eines DNA-Fragments im Plasmid pBPDH1-BS, welches einen für Phenylalanin-Dehydrogenase kodierenden Bereich enthält, und eine entsprechende Aminosäuresequenz sind in den Fig. 3-1 bis 3-3 dargestellt. Die Nukleotidsequenz wurde gemäß einem Didesoxy-Kettenabbruchverfahren (Literaturstelle 4) bestimmt.

Beispiel 8

Subklonierung von pBPDH1-BS (Fig. 2)

In diesem Beispiel wurden 10 ug pBPDH1-BS mit Dra I geschnitten, und die geschnittene DNA wurde mit Ethanol präzipitiert. Die Dra I-geschnittene DNA und 0,01 OD&sub2;&sub6;&sub0;-Einheiten eines am 5'-Ende phosphorylierten Bam HI-Linkers wurden in 20 ul eines T4-Ligase-Puffers unter Verwendung von 350 Einheiten einer T4-Ligase für 5 Stunden bei 22ºC ligiert, und die ligierte DNA wurde mit Ethanol präzipitiert. Die auf diese Weise hergestellte DNA wurde mit Bam HI geschnitten, der Verdau wurde einer Agarosegel-Elektrophorese (0,7%) ausgesetzt, und ein DNA-Fragment von ungefähr 2 kb wurde durch Elektroelution isoliert.
Andererseits wurden 2 ug pUC9 mit Bam HI geschnitten, mit Kalbsthymus-Phosphatase behandelt, worauf Phenol/Chloroform-Extraktion folgte. Gemäß demselben Verfahren, wie im Beispiel 5 beschrieben, wurden beide Reaktionsmischungen gemischt, über eine Elutip-d-Säule gereinigt und unter Verwendung einer T4-Ligase ligiert. Die Reaktionsmischung wurde verwendet, um E. coli JM109 zu transformieren. Gemäß demselben Verfahren, wie im Beispiel 5 beschrieben, wurden β-Galactosidase- negative Klone selektioniert.
Die Plasmide wurden aus diesen Klonen extrahiert, und auf der Basis des Musters aus dem Restriktionsverdau wurde ein rekombinantes Plasmid, worin ein DNA-Fragment von ungefähr 1,8 kb in die Bam HI-Stelle von pUC9 eingesetzt war, selektioniert und als pBPDH1-Dr bezeichnet.

Beispiel 9

Subklonierung von pBPDH1-Dr (Fig. 2)

In diesem Beispiel wurden 10 ug pBPDH1-Dr mit Bal I geschnitten und mit Ethanol präzipitiert. Die Bal I- geschnittene DNA und 0,01 OD&sub2;&sub6;&sub0;-Einheiten eines am 5'-Ende phosphorylierten Bam HI-Linkers wurden in 10 ul eines Ligase-Puffers unter Verwendung von 350 Einheiten einer T4-Ligase für 6 Stunden bei 16ºC ligiert, und die ligierte DNA wurde mit Ethanol präzipitiert. Die DNA wurde mit Bam HI geschnitten, der Verdau wurde einer Agarosegel-Elektrophorese (0,7%) ausgesetzt, und ein DNA-Fragment wurde durch Elektroelution isoliert. Das Eluat wurde dreimal mit Phenol/Chloroform behandelt, und die DNA wurde mit Ethanol präzipitiert.
Andererseits wurden 2 ug pUC8 mit Bam HI geschnitten und mit Kalbsthymus-Phosphatase behandelt, worauf Phenol/Chloroform-Extraktion folgte, und die geschnittene DNA wurde mit Ethanol präzipitiert.
Beide Reaktionsmischungen, die wie vorstehend beschrieben hergestellt wurden, wurden unter Verwendung einer T4-Ligase ligiert, und die Reaktionsmischung wurde verwendet, um E. coli JM109 zu transformieren. Gemäß demselben Verfahren, wie in Beispiel 5 beschrieben, wurden Klone, die keine β-Galactosidase-Aktivität ausübten, selektioniert. Die Plasmide wurden aus diesen Klonen extrahiert, und auf der Grundlage des Musters aus dem Restriktionsendonukleaseverdau wurden zwei rekombinante Plasmide, worin ein DNA-Fragment von ungefähr 1,3 kb in die Bam HI-Stelle von pUC8 eingesetzt war, selektioniert und als pBPDH1-DBL bzw. pBPDH1-DBR bezeichnet. Diese Plasmide sind hinsichtlich der Orientierung des darin eingesetzten DNA-Fragments unterschiedlich.
E. coli-Transformanten, welche das auf diese Weise erhaltene Plasmid enthalten, üben Phenylalanin-Dehydrogenase-Aktivität aus.
Escherichia coli JM109/pBPDH1-DBL, enthaltend das Plasmid pBPDH1-DBL, wurde am 24.07.1986 bei der FRI als FERM P-8873 hinterlegt, und Escherichia coli JM109/pBPDH1-DBL, enthaltend das Plasmid pBPDH1-DBR wurde am 3. Juni 1986 bei der FRI als FERM P-8794 hinterlegt.

Beispiel 10

Herstellung von Phenylalanin-Dehydrogenase unter Verwendung eines das rekombinante Plasmid enthaltenden Transformanten (1)

E. coli JM103/pBPDH1, enthaltend das Plasmid pBPDH1, E. coli RR1/pBPDH3, enthaltend das Plasmid pBPDH3, und E. coli JM103/pBPDH1-DBL, enthaltend das Plasmid pBPDH1-DBL, wurden getestet, um deren Fähigkeit, Phenylalanin-Dehydrogenase zu produzieren, zu bestimmen.
Die vorstehend erwähnten E. coli-Transformanten wurden in 140 ml LB-Medium, enthaltend 50 ug/ml Ampicillin, für 6 Stunden bei 37ºC kultiviert. Als Kontrolle wurde Bacillus sphaericus SCRC-R79a in 140 ml eines Mediums, enthaltend 0,1% L-Phenylalanin, 1% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,2% K&sub2;HPO&sub4;, 0,1% NaCl und 0,02% MgSO&sub4; · 7 H&sub2;O (pH 7,0), über Nacht bei 37ºC kultiviert.
Für jede Kultur wurden kultivierte Zellen durch Zentrifugation gesammelt, und die Zellen wurden mit 70 ml einer 0,85%-igen Nacl-Lösung gewaschen. Nachdem die Zellen in 10 ml 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,0) suspendiert worden waren, wurde die Suspension bei 2ºC, 200 W für 20 Minuten ultrabeschallt. Die durch Ultraschall behandelte Suspension wurde in 10 l eines 0.01 M Kaliumphosphat-Puffers (pH 7,0) bei 4ºC über Nacht dialysiert. Das Dialysat wurde getestet, um die Phenylalanin-Dehydrogenase-Aktivität gemäß dem vorstehend erwähnten Verfahren zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Produzierender Mikroorganismus Enzymaktivität (Einheiten/l Kultur) ungefähr
Wie aus Tabelle 1 entnommen werden kann, produzierte der mit einem erfindungsgemäßen Plasmid transformierte E. coli 25 bis 50 mal mehr Phenylalanin-Dehydrogenase verglichen mit der Menge, die von B. sphaericus produziert wird.

Beispiel 11

Synthese von L-Phenylalanin (1)

L-Phenylalanin wurde unter Verwendung von E. coli RR1-Zellen, welche das Plasmid pBPDH3 enthalten, synthetisiert. Als NADH-regenerierendes System wurden Enzyme für die Glycolyse in E. coli verwendet. Der vorstehend erwähnte E. coli wurde in ein LB-Medium, enthaltend 50 ug/ml Ampicillin, zu einer Rate von 1% eingeimpft und für 6 Stunden bei 37ºC kultiviert. 5 ml des kultivierten Mediums wurden zentrifugiert, um Zellen zu sammeln, die danach mit einer 0,85%-igen NaCl-Lösung gewaschen wurden. Die Zellen wurden in 3 ml einer Reaktionsmischung, enthaltend 200 umol eines NH&sub4;Cl-NH&sub4;OH-Puffers (pH 9,0) 109 umol Natriumphenylpyruvat und 267 umol Lactose, suspendiert, und die Suspension wurde für 24 Stunden bei 30ºC stehengelassen. Als Ergebnis wurden 20 mg/ml (Ausbeute 33%) L-Phenylalanin angehäuft, wie durch das vorstehend erwähnte L-Phenylalanin-Assayverfahren bestimmt wurde.

Beispiel 12

Synthese von L-Phenylalanin (2)

In diesem Beispiel wurden als NADH-regenerierendes System Zellen von Candida boidinii Nr. 2201, enthaltend Formiat-Dehydrogenase, verwendet. Candida boidinii Nr. 2201 wurde gemäß dem Tani-Verfahren (Literaturstelle 2) kultiviert, und C. boidinii-Zellen und E. Coli RR1/pBPDH3-Zellen, enthaltend das Plasmid pBPDH3 und wie vorstehend beschrieben kultiviert, wurden getrennt mit Aceton behandelt (Literaturstelle 3). Danach wurden 15 mg der Aceton-behandelten E. coli-Zellen,, entsprechend 6,3 ml des kultivierten Mediums mit 6,3 Einheiten Phenylalanin-Dehydrogenase-Aktivität und 30 mg der Aceton-behandelten c. boidinii-Zellen in 3 ml einer Reaktionsmischung, enthaltend 250 umol Tris-HCl-Puffer (pH 8,2), 728 umol (0,136 g) Phenylbrenztraubensäure, 2 mmol (0,122 g) Ammoniumformiat und 25 umol (18 mg) NAD&spplus;, suspendiert, und die Suspension wurde zur Synthese von L-Phenylalanin für 53 Stunden bei 30ºC stehengelassen. Als Ergebnis wurde 0,126 g (42 mg/ml) L-Phenylalanin erhalten. Diese Ausbeute entspricht einer 100%-igen Umwandlung.

Beispiel 13

Präparation chromosomaler DNA (2)

Gemäß dem Verfahren von Doi et al. (Literaturstelle 1) wurde chromosomale DNA von Sporosarcina ureae SCRC-R04 (FERM BP-1012) präpariert.
1 l eines Mediums, enthaltend 1% L-Phenylalanin, 0,5% Hefeextrakt, 1,0% Pepton, 0,2% KH&sub2;PO&sub4;, 0,1% NaCl und 0,02% MgSO&sub4; · 7 H&sub2;O wurde autoklaviert, und der vorstehend erwähnte Mikroorganismus wurde in das Medium eingeimpft und über Nacht bei 30ºC kultiviert.
Das kultivierte Medium wurde zentrifugiert, um Zellen zu sammeln, die danach in 20 ml TEN-Puffer suspendiert wurden. Die Suspension wurde nochmals zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln, die danach resuspendiert wurden. Zu der Suspension wurde 1 ml einer 5 mg/ml Lysozym-Lösung zugefügt, und die gesamte Mischung wurde für 30 Minuten bei 37ºC geschüttelt. Die Mischung wurde zentrifugiert, um ein Präzipitat zu erhalten, welches danach in 5 ml TEN-Puffer suspendiert wurde. Zu der Suspension wurden 0,5 ml 25%-iges Natriumdodecylsulfat, 1 ml 5 M NaCl und 10 ml mit Wasser gesättigtes Phenol zugefügt, um DNA zu extrahieren. Die Mischung wurde zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten, und der Überstand wurde mit Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1, v/v) gewaschen. Die gesamte Mischung wurde danach zentrifugiert, und der Überstand wurde langsam zu 50 ml Ethanol zugegeben, um DNA zu präzipitieren, welche danach gewonnen wurde. Nach Trocknen der DNA wurde die DNA in TEN-Puffer gelöst.

Beispiel 14

Präparation einer Bank chromosomaler DNA (2)

50 ug der in Beispiel 13 präparierten chromosomalen DNA wurden mit 20 Einheiten der Restriktionsendonuklease Eco RI für 2 Stunden bei 37ºC geschnitten, die Reaktionsmischung wurde mit Phenol/Chloroform (1 : 1 v/v) extrahiert, und 2,5 Volumen Ethanol wurden zu der Mischung zugefügt, um DNA zu präzipitieren.
Andererseits wurden 5 ug des Vektorplasmids pUC9 mit 10 Einheiten der vorstehend erwähnten, entsprechenden Restriktionsendonuklease für 2 Stunden bei 37ºC geschnitten. Die DNA wurde, wie vorstehend beschrieben, gewonnen.
Danach wurde 0,5 ug des geschnittenen Vektorplasmids pUC9 und 4 ug des chromosomalen DNA-Fragments unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert, um rekombinante Plasmide zu bilden. Die Plasmide wurden danach verwendet, um E. coli K-12/JM103 zur Konstruktion einer Bank chromosomaler DNA zu transformieren. Jede Bank umfaßte 20 000 bis 30 000 Transformanten.

Beispiel 15

Klonierung des Phenylalanin-Dehdrogenase-Gens (2)

Die vorstehend erwähnte Bank wurde auf Nitrocellulosefilter (0,45 um, TYP TM-1, Toyo Roshi, Japan), die auf eine LB-Agarplatte, enthaltend 50 ug/ml Ampicillin, gelegt worden waren, zu einer Rate von 1000 bis 2000 Kolonien pro Filter ausplattiert und für 8 Stunden bei 37ºC inkubiert. Zwei Replika-Nitrocellulosefilter wurden von jedem Filter angelegt, und die Kultivierung wurde fortgesetzt. Einer der Replika-Nitrocellulosefilter wurde in 0,5 ml einer 4 mg/ml Lysozym-Lösung bei Raumtemperatur eingetaucht und danach für 1 Stunde bei 45ºC getrocknet. Der Filter wurde danach in 0,5 ml einer aktiven Färbelösung, enthaltend 50 mM L-Phenylalanin, 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0,625 mM NAD&spplus;, 0,064 mM Phenazinmethosulfat (PMS) und 0,24 M Nitroblau-Tetrazolium (INT), für 1 bis 5 Minuten bei Raumtemperatur eingetaucht, um rötlich-braun gefärbte Kolonien zu selektionieren (Literaturstelle 5). Einige selektionierte Kolonien wurden getrennt in einem LB-Medium, enthaltend 50 ug/ml Ampicillin, über Nacht bei 37ºC kultiviert, und die kultivierten Zellen wurden beschallt. Die beschallte Suspension wurde danach zentrifugiert, um einen zellfreien Extrakt zu erhalten, und zu dem Extrakt wurde die vorstehend erwähnte aktive Färbelösung zugefügt, um Enzymaktivität nachzuweisen. Als Ergebnis wurde eine Transformante, E. coli JM103/pSPDH1, erhalten. Das Plasmid pSPDH1 enthielt das Phenylalanin-Dehydrogenase-Gen.

Beispiel 16

Herstellung einer Restriktionskarte und Subklonierung (2)

Die Transformante E. coli JM103/pSPDH1 wurde in 200 ml eines LB-Mediums, enthaltend 50 ug/ml Ampicillin, bei 37ºC über Nacht kultiviert, und gemäß dem Verfahren von Birnboim und Doly (Literaturstelle 6) wurden 150 ug Plasmid-DNA erhalten. Die auf diese Weise erhaltene pSPDH1-Plasmid-DNA wurde mit der Restriktionsendonuklease Bam HI, Eco RI, Bgl II, Pvu II, Nae I, Hinc II oder einer ähnlichen geschnitten, um eine Restriktionskarte (Fig. 4A) herzustellen.
Ein DNA-Insert von ungefähr 5,6 kb in pSBPDH1 wurde fragmentiert, um ein Nae I - Hind III-DNA-Fragment von ungefähr 1,4 kb herzustellen, die DNA wurde an der Hind III - Sma I-Stelle des Vektorplasmids puc19 eingesetzt, und die resultierenden rekombinanten Plasmide wurden verwendet, um E. coli K-12/JM103 mit dem Ziel zu transformieren, E. coli JM103/pSPDH2-Transformanten zu erhalten, die zur Produktion von Phenylalanin-Dehydrogenase fähig sind. Die Restriktionskarte von pSPDH2 ist in Fig. 4-B dargestellt.
Sowohl die Nukleotidsequenz des DNA-Fragments, welches einen für Phenylalanin-Dehydrogenase kodierenden Bereich in den Plasmiden pSPDH1 und pSPDH2 enthält, als auch eine der Nukleotidsequenz entsprechende Aminosäuresequenz sind in den Fig. 5-1 bis 5-3 dargestellt. Die Nukleotidsequenz wurde durch ein Didesoxy-Verfahren (Literaturstelle 4) und MB Didesoxy-Kettenabbruchverfahren (Literaturstelle 7) bestimmt.
Die Escherichia coli JM103/pSPDH2-Transformanten wurde am 03. Juni 1986 bei der FRI als FERM P-8793 hinterlegt.

Beispiel 17

Produktion von Phenylalanin-Dehydrogenase (2)

E. coli JM103/pSPDH2 und JM103/pSPDH1 wurden in einem LB-Medium, enthaltend 50 ug/ml Ampicillin, für 6 Stunden bei 37ºC kultiviert. Andererseits wurde als Kontrolle Sporosarcina ureae SCRC-R04 in dem in Beispiel 1 beschriebenen Medium für 16 Stunden bei 30ºC kultiviert. Jedes kultivierte Medium wurde zentrifugiert, um Zellen zu sammeln, die danach in einem 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,0), enthaltend 0,1 MM EDTA und 5 mM 2-Mercaptoethanol, suspendiert und beschallt wurden. Die beschallte Suspension wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde in einem 10 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,0), enthaltend 0,1 mM EDTA und 5 mM 2-Mercaptoethanol, über Nacht bei 4ºC dialysiert. Diese Präparationen wurden gemäß dem vorstehend erwähnten Verfahren untersucht, und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Produzierender Mikroorganismus Enzymaktivität (Einheiten/l Kultur)
Wie aus Tabelle 2 entnommen werden kann, produzierte der erfindungsgemäße rekombinante E. coli sechs mal mehr Phenylalanin-Dehydrogenase verglichen mit der Menge, die von einem Wildtyp-Stamm von S. ureae produziert wird.

Beispiel 18

Synthese von L-Phenylalanin (3)

E. coli JM103/pSPDH2 wurde gemäß dem in Beispiel 17 beschriebenen Verfahren kultiviert. Andererseits wurde Candida boidinii Nr. 2201 gemäß dem Tani-Verfahren (Literaturstelle 2) kultiviert, um ein NADH-Regenerierungssystem herzustellen. Jedes kultivierte Medium wurde zentrifugiert, um Zellen zu sammeln, welche danach mit Aceton behandelt wurden (Literaturstelle 3), um 0,48 g/l Aceton-behandelte Trockenzellen bzw. 1,3 g/l Aceton-behandelte Trockenzellen von E. coli bzw. C. boidinii herzustellen.
Danach wurden 3 ml einer Reaktionsmischung, enthaltend 0,136 g (728 umol) Natriumphenylpyruvat, 0,122 g (2 mmol) Ammoniumformiat, 1,8 mg (2,5 umol) NAD&spplus;, 250 mmol Tris-HCl (pH 8,5), 15 mg der Aceton-behandelten E. coli-Zellen (entsprechend 30 ml Kultur, 6 Einheiten Phenyl72anin-Dehydrogenase) und 3 mg der Aceton-behandelten c. boidinii-Zellen, entsprechend 2,3 ml Kultur, 0,14 Einheiten Formiat-Dehydrogenase) für 53 Stunden bei 30ºC inkubiert. Dementsprechend wurden 0,120 g (Ausbeute 100%) L-Phenylalanin erhalten.

Beispiel 19

Präparation chromosomaler DNA (3)

Chromosomale DNA wurde von Bacillus badius IAM 11059 (FERM P-8529) gemäß dem Verfahren von Doi et al. (Literaturstelle 1) präpariert.
D.h., der vorstehend erwähnte Stamm wurde in 1,2 l eines Mediums, enthaltend 1% L-Phenylalanin, 0,5% Hefeextrakt, 1,0 % Pepton, 0,2% K&sub2;HPO&sub4; und 0,02% MgSO&sub4; · H&sub2;O (pH 7,0), für 6 Stunden bei 30ºC kultiviert. Die Extraktion der chromosomalen DNA wurde gemäß dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durchgeführt.

Beispiel 20

Präparation einer Bank chromosomaler DNA (3)

Als nächstes wurden 50 ug der in Beispiel 19 präparierten chromosomalen DNA mit 300 Einheiten der Restriktionsendonuklease Eco RI bei 37ºC über Nacht geschnitten, der Verdau wurde mit Phenol/Chloroform (1 : 1, v/v) extrahiert, und die DNA wurde mit 2 Volumen Ethanol präzipitiert. Andererseits wurden 10 ug des Vektorplasmids pUC19 mit 60 Einheiten Eco RI bei 37ºC über Nacht geschnitten, und die DNA wurde auf dieselbe Art und Weise, wie vorstehend beschrieben, gewonnen.
Danach wurden 0,5 ug des Eco RI-geschnittenen Vektorplasmids pUC19 und 1 ug der Eco RI-geschnittenen chromosomalen DNA unter Verwendung von DNA-Ligase ligiert, und die Reaktionsmischung wurde verwendet, um E. coli K-12/JM103 zu transformieren und eine Bank chromosomaler DNA herzustellen. Diese Bank chromosomaler DNA umfaßte 23 000 Transformanten.

Beispiel 21

Klonierung des Phenylalanin-Dehydrogenase-Gens (3)

Die vorstehend erwähnten Transformanten wurden auf Nitrocellulosefilter, die auf eine LB-Agarplatte, enthaltend 50 ug/ml Ampicillin, gelegt worden waren, zu einer Rate von 1000 bis 2000 Kolonien pro Nitrocellulosefilter ausplattiert und danach kultiviert. Nach ungefähr 10 Stunden wurden von den Kolonien auf der Nitrocellulose frische Replika-Nitrocellulosefilter angelegt, und das Kultivieren wurde fortgesetzt. Ein Replika-Nitrocellulosefilter wurde in 1,0 ml einer wäßrigen 4 mg/ml Lysozym-Lösung bei 30ºC und danach für 10 Minuten bei 50ºC in 10 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0) eingetaucht. Die Nitrocellulosefilter wurden in 1,0 ml einer aktiven Färbelösung, enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,625 mM NAD&spplus;, 0,065 mM PMS und 0,24 mM INT, für 1 bis 5 Minuten bei Raumtemperatur eingetaucht, und die mit einer rötlich-violetten Farbe gefärbten Kolonien wurden selektioniert (Literaturstelle 5). Aus ungefähr 23 000 Transformanten wurden ungefähr 50 eine Aktivität ausübende Transformanten erhalten. Unter diesen Transformanten wurden 12 Transformanten getrennt in 1 l eines LB-Mediums, enthaltend 50 ug/ml Ampicillin, kultiviert, und gemäß dem Verfahren von Birnboim und Doly (Literaturstelle 6) wurde aus jeder Kultur Plasmid-DNA präpariert. Diese Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung eines Agarosegels analysiert, um deren Gengröße zu bestimmen. Als Ergebnis wurde bestimmt, daß ein Klon ein Genfragment von ungefähr 7 kb darin eingebaut hatte, und 11 Klone hatten ein Genfragment von ungefähr 3,8 kb darin eingebaut. Alle diese Transformanten übten Phenylalanin-Dehydrogenase-Aktivität aus. Unter diesen Transformanten wurde eine Transformante, welche ein Plasmid mit dem 3,8 kb Genfragment enthält, als E. coli JM103/pBBPDH19 bezeichnet.

Beispiel 22

Herstellung einer Restriktionskarte (3)

Die E. coli JM101/pBBPDH19-Transformante wurde in 1 l eines LB-Mediums, enthaltend 50 ug/ml Ampicillin, über Nacht bei 37ºC kultiviert, und gemäß dem Verfahren von Birnboim und Doly (Literaturstelle 6) wurden ungefähr 150 ug Plasmid-DNA präpariert. pBBPDH19-Plasmid-DNA wurde getrennt mit der Restriktionsendonuclease Sma I, Xma I, Bam HI, Eco RI, Hind III, Pst I, Sal I, Acc I und ähnlichen geschnitten, um eine Restriktionskarte (Fig. 6) herzustellen.
Die E. coli JM103/pBBPDH19-Transformante wurde kultiviert, und das Plasmid pBBPDH19 wurde, wie vorstehend beschrieben, isoliert. Dieses Plasmid wurde verwendet, um E. coli RRI mit dem Ziel zu transformieren, eine Escherichia coli RR1/pBBPDH19-Transformante zu erhalten, welche am 7. August 1986 bei der FRI als FERM P-8890 hinterlegt wurde.

Beispiel 23

Produktion von Phenylalanin-Dehydrogenase (3)

E. coli RRI/pBBPDH19 wurde in einem LB-Medium, enthaltend 50 ug/ml Ampicillin, für 12 Stunden bei 37ºC kultiviert. Andererseits wurde als Kontrolle Bacillus badius IAM 11059 (FERM P-8529) in dem in Beispiel 1 beschriebenen Medium für 20 Stunden bei 30ºC kultiviert. Jedes kultivierte Medium wurde zentrifugiert, um Zellen zu sammeln, welche danach in 0,1 mM Kaliumphosphat-Puffer, enthaltend 0,1 mM EDTA und 5 mM 2-Mercaptoethanol suspendiert und beschallt wurden, die beschallte Suspension wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde in einem 10 mM Kaliumphosphat-Puffer, enthaltend 0,1 mM EDTA und 5 mM 2-Mercaptoethanol, über Nacht dialysiert. Diese zellfreien Extrakte wurden untersucht, um deren Phenylalanin-Dehydrogenase-Aktivität gemäß dem vorstehend erwähnten Verfahren zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 Produzierender Mikroorganismus Enzymaktivität (Einheiten/l Kultur)
Wie aus Tabelle 3 entnommen werden kann, übte der das erfindungsgemäße rekombinante Plasmid enthaltende E. coli eine Phenylalanin-Dehydrogenase-Aktivität aus, die ungefähr 6 bis 7 mal größer war als diejenige eines Bacillus badius Wildtyp-Stammes.

Beispiel 24

Reinigung der Phenylalanin-Dehydrogenase aus E. coli RR1/pBBPDH19

E. coli RR1/pBBPDH19 wurde in 1,8 l eines LB-Mediums, enthaltend 50 ug/ml Ampicillin, für 12 Stunden bei 37ºC kultiviert. Das kultivierte Medium wurde zentrifugiert, um Zellen zu sammeln, welche danach mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen und in 1 l 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 7,0), enthaltend 0,1 mM EDTA und 5 mM 2-Mercaptoethanol, suspendiert wurden. Die Suspension wurde für eine Stunde bei 9 kHz beschallt, um die Zellen aufzubrechen, und die beschallte Suspension wurde für 20 Minuten bei 14 000 · g zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu entfernen, so daß ein zellfreier Phenylalanin-Dehydrogenase enthaltender Rohextrakt erhalten wurde. Nachdem der zellfreie Extrakt für 10 Minuten bei 50ºC erhitzt worden war, wurde festes Ammoniumsulfat zu einer Konzentration einer 30%-igen Ammoniumsulfatsättigung zu dem zellfreien Extrakt zugefügt. Die gesamte Mischung wurde für 30 Minuten zur Bildung eines Präzipitats gerührt und für 20 Minuten bei 14 000 · g zentrifugiert, um das Präzipitat zu entfernen. Festes Ammoniumsulfat wurde zu einer 60%-igen Ammoniumsulfatsättigung zu dem Überstand zugefügt. Die gesamte Mischung wurde für 20 Minuten bei 14 000 · g zentrifugiert, um ein die Enzymaktivität enthaltendes Präzipitat zu gewinnen, und das Präzipitat wurde in einem kleinen Volumen 0,01 M Phosphat-Puffer (pH 7,0) gelöst, und die resultierende Lösung wurde in 0,01 M Phosphat-Puffer (pH 7,0), enthaltend 0,1 mM EDTA und 5 mM 2-Mercaptoethanol, dialysiert. Diese Enzymlösung wurde auf eine DEAE-Toyopearl 650 M-Säule aufgetragen, die vorher mit einem 0,01 M Phosphat-Puffer (pH 7,0), enthaltend 0,1 mM EDTA und 5 mM 2-Mercaptoethanol, equilibriert worden war, und die Elution wurde unter Verwendung eines 0,1 M Phosphat-Puffers (pH 7,0), enthaltend 0,1 mM EDTA und 5 mM 2-Mercaptoethanol, durchgeführt.
Aktive Fraktionen wurden danach vereinigt und dialysiert, und das Dialysat wurde konzentriert und einer Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung von Sephadex G-200, welches mit einem 0,05 M Phosphat-Puffer (pH 7,0), enthaltend 0,1 mM EDTA und 5 mM 2-Mercaptoethanol equilibriert worden war, ausgesetzt. Durch dieses Verfahren wurde die Phenylalanin-Dehydrogenase zu einem ungefähr 15-fachen Grad mit einer Ausbeute von ungefähr 54% gereinigt. Die spezifische Aktivität und das Ausbeuteverhältnis während dieses Reinigungsverfahrens sind in Tabelle 4 dargestellt. Es wurde bestätigt, daß die letztendliche Enzympräparation homogen war, wie durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese und SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese gezeigt wurde. Tabelle 4 Schritt Gesamtaktivität (Einheiten) Gesamtprotein spezifische Aktivität (Einheiten/mg) Ausbeute zellfreier Extrakt Hitzebehandlung Ammoniumsulfatfraktion DEAE-Toyopearl Sephadex G-200

Beispiel 25

Synthese von L-Phenylalanin (4)

E. coli RR1/pBBPDH19 wurde, wie vorstehend beschrieben, kultiviert. Andererseits wurde Candida boidinii Nr. 2201 gemäß dem Verfahren von Tani et al. (Literaturstelle 2) kultiviert, um ein NADH-Regenerierungssystem herzustellen. Jedes kultivierte Medium wurde zentrifugiert, um Zellen zu sammeln, welche danach mit Aceton behandelt wurden, um eine 0,5 g/l Kultur Aceton-behandelter E. coli-Zellen und eine 1,3 g/l Kultur von Aceton-behandelten c. boidinii-Zellen zu erhalten.
Danach wurden 3 ml einer Reaktionsmischung, enthaltend 0,136 g (728 umol) Natriumphenylpyruvat, 0,122 g (2 mmol) Ammoniumformiat, 1,8 mg (2,5 umol) NAD&spplus;, 250 umol Tris-HCl (pH 8,5), 5 mg Aceton-behandelte E. coli-Zellen (entsprechend 10 ml der Kultur, 69 Einheiten L-Phenylalanin-Dehydrogenase) und 3 mg der Aceteon-behandelten c. boidinii-Zellen (entsprechend 2,3 ml der Kultur, 0,14 Einheiten Formiat-Dehydrogenase) für 48 Stunden bei 30ºC inkubiert. Dementsprechend wurde 0,120 g (Ausbeute 100%) L-Phenylalanin erhalten.
Für die folgenden Mikroorganismen wurden die nationalen Hinterlegungen am 7. August 1987 in internationale Hinterlegungen unter dem Budapester Vertrag überführt: Stamm Nationale Hinterlegung Nr. Internationale Hinterlegung Nr.

Literatur

1) R. L. Rodriguez et al. Recombinant DNA Technique, An Introduction, Addison-Wesley Publishing Company (1983) S. 162.
2) Y. Tani et al., Agric. Biol, Chem., 36, 68, (1972).
3) Y. Izumi et al., J. Ferment. Technol., 61, 135 (1983).
4) H. Hattori et al., Nucl. Acids Res., 13, 7813 (1985).
5) H. Mollering et al., Methods of Enzymatic Analysis, Academic Press, 1, 136-144 (1974).
6) H. C. Birnboim et al., Nucl. Acids Res. 7 1513 (1979).
7) F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 20, 5463 (1977).

Claims

1. Isoliertes Gen kodierend für Phenylalanin-Dehydrogenase, welches in einem DNA-Fragment enthalten ist, das ausgewählt ist aus einem von Bacillus sphaericus stammenden 1,3 Kb Bam HI DNA-Fragment, einem von Bacillus badius stammenden 3,8 Kb Eco RI-Fragment und einem von Sporosarcina ureae stammenden 1,4 Kb NaeI-HindIII DNA-Fragment.

2. Isoliertes Gen nach Anspruch 1, worin Bacillus sphaericus der Stamm Bacillus sphaericus SCRC-R79a (FERM BP-1013) ist.

3. Isoliertes Gen nach Anspruch 2, worin das Gen die folgende Nukleotid-Sequenz umfaßt:

4. Isoliertes Gen nach Anspruch 1, worin Bacillus badius der Stamm Bacillus badius IAM 11059 (FERM P-8529) ist.

5. Isoliertes Gen nach Anspruch 1, worin Sporosarcina ureae der Stamm Sporosarcina ureae SCRC-R04 (FERM BP-1012) ist.

6. Isoliertes Gen nach Anspruch 5, worin das Gen die folgende Nukleotid-Sequenz umfaßt:

7. Expressionsplasmid, enthaltend das Gen nach Anspruch 1.

8. Expressionsplasmid nach Anspruch 7, worin das Plasmid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus pBPDH1-DBL (FERM BP-1433), pBPDH1-DBR (FERM BP-1434), pSPDH2 (FERM BP-1435) und pBBPDH19 (FERM BP-1436).

9. Mikroorganismus, transformiert mit dem Plasmid nach Anspruch 7.

10. Mikroorganismus nach Anspruch 9, worin der Mikroorganismus E. coli ist.

11. Mikroorganismus nach Anspruch 10, worin E. coli ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus JM109/pBPDH1-DBL (FERM BP-1433), E. coli JM109/pBPDH1-DBR (FERM BP-1434), E. coli JM103/pSPDH2 (FERM BP-1435) und E. coli RR1/pBBPDH19 (FERM BP-1436)

12. Verfahren zur Herstellung von Phenylalanin-Dehydrogenase, umfassend die Schritte des:

Kultivierens des Mikroorganismus nach Anspruch 9, und

Gewinnens von Phenylalanin-Dehydrogenase aus dem kultivierten Mikroorganismus.

13. Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin, umfassend die Schritte des:

Reagierenlassens von Phenylpyruvinsäure oder eines Salzes davon mit einem Ammoniumion in einem wäßrigen Medium in der Gegenwart von Phenylalanin-Dehydrogenase, hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 12, und einem reduzierenden Agens, um L-Phenylalanin zu bilden, und

Gewinnens von L-Phenylalanin.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin das reduzierende Agens Nikotinamid-adenin-dinukleotid vom reduzierten Typ ist.

15. Verfahren nach Anspruch 13, worin das Verfahren zusätzlich ein System für das Regenerieren des Nikotinamid-adenindinukleotids vom reduzierten Typ aus dem Nikotinamid-adenin-dinukleotid vom oxidierten Typ, welches durch die L-Phenylalanin-bildende Reaktion erzeugt wird, verwendet.