DE2630380A1

DE2630380A1 - Verfahren zur herstellung einer vakzine

Info

Publication number: DE2630380A1
Application number: DE19762630380
Authority: DE
Inventors: Iii James Henry Rand
Original assignee: MICROLOG Ltd
Current assignee: MICROLOG Ltd
Priority date: 1975-07-14
Filing date: 1976-07-06
Publication date: 1977-02-03
Also published as: GB1554446A; JPS533509A; FR2317940A1

Description

PAT EXTAN VVA LT E

A. GRÜNECKER

CXPL-ING

H. KINKELDEY

DA-IMl

W. STOCKMAIR

OR-ING ■ AsE(CALTtCH

K. SCHUMANN

DRTCRNAT. QPL-PhWS

P. H. JAKOB

CXPL-iNG.

G. BEZOLD

DR RERNAH- QPL-CHEM.

8 MÜNCHEN 22

MAXIMILIANSTRASSE 43

P 10 633-60/co 6. Juli 1976

Verfahren zur Herstellung einer Vakzine

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Vakzine für Brust-, Lungen-, Ovarien- und Zervixkrebs und für Krebs des gastro-intestinalen Trakts beim Menschen. Die Erfindung betrifft außerdem die bei dem Verfahren erhaltene Vakzine. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird als Ausgangsmaterial Tumormaterial verwendet, das von mindestens einem oder mehreren Menschenkarzinomen eines spezifischen, vorbestimmten Organs stammt. Aus dem Material wird ein nichtdena'turiertes Krebsantigen extrahiert, indem man das Material mit hoher Geschwindigkeit ±n der Kälte homogenisiert. Dabei erhält man ein nichtdenaturiertes Krebsantigen, das mit normalen Antigenen vermischt ist. Die normalen Antigene v/erden durch Durchleiten des Gemisches durch ein Säulenbett, das mit einem unlöslichen, anti-normalen, tierischen Poly-γ-glabulin gefüllt ist, entfernt. Das Krebsantigenmaterial

TELEFON (08B) 33 38 63

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TELEX 08-2036O TELEGRAMME MONAPAT TELEKOPIERER

wird dann mit dem gleichen Gewicht eines fremden Tierproteins, wie Kaninchen-γ-Glo.bulin unter Verwendung von etwa 1 ml Natriumchlorid/8 ml des Gemisches gekuppelt. Das Material wird dann durch Standardbakterienfilter filtriert. Das Filtrat wird bei etwa 4°C und steril gehalten, während etwa 5,0 bis 10,0 Gew.% γ-Globulin von angesäuertem bis-diazotiertem Benzidin langsam tropfenweise in ca. 10 bis 30 Minuten unter Bildung eines gekuppelten Komplexes zugegeben werden. Zur Auslaugung des überschüssigen Benzidins wird der gekuppelte Komplex dann gegenüber physiologischer Salzlösung dialysiert. Dabei erhält man die Endvakzine, die in sterile Fläschchen oder Ampullen abgefüllt wird oder die zu einem braunen Pulver lyophilisiert und dosisweise abgemessen wird. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man viele verschiedene Vakzinen, jede für ein anderes Organ des menschlichen Körpers, herstellen. Zur Herstellung einer Vakzinedosis für mehrere Organe für Patienten, die Krebs haben oder von denen vermutet wird, daß sie Krebs in verschiedenen, spezifischen Organen haben, kann man auch verschiedene, spezifische Vakzinenvermischen.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung einer Vakzine, insbesondere zur Behandlung menschlicher Krebserkrankungen der Brust, Lungen, Ovarien, Cervix, Blase, von Melanomen und Krebserkrankungen des gastrointestinalen Trakts, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Tumormaterial, das von mindestens einem oder mehreren Menschenkarzinomen eines spezifischen, vorbestimmten Organs stammt, als Ausgangsmaterial verwendet; das Ausgangsmaterial von. nekrotischem Material und von nicht-kanzerogenem Gewebe, wie es mit dem bloßen Auge erkennbar ist, steril zur Herstellung eines tumorspezifischen Materials reinigt; das tumorspezifische Material wie durch Homogenisierung in einem Waring-Mischer während etwa 10 bis 15 Minuten bei einer Temperatur unter 4⁰C homogenisiert; eine bestimmte Menge des homogenisierten Tumormaterials mit einem gleichen. Gewicht

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an Trifluor-trichloräthan und mit 50 Gew.% phosphatgepufferter Salzlösung bei unter 4⁰C vermischt; das Gemisch bei hoher Geschwindigkeit von 15 000 bis 85 000 U/min homogenisiert; das Homogenat in einer gekühlten Zentrifuge mit etwa 1500 ü/min während etwa 10 bis 20 Minuten zentrifugiert, es dann in einen eisgekühlten Behälter überführt, v/o es sich in drei Schichten, eine obere Schicht aus wäßrigem Überstand plus Nucleinsäure, eine das nichtdenaturierte Krebsantigen, vermischt mit normalen Antigenen, enthaltende Mittelschicht aus Proteingel und eine Fluorkohlenwasserstoff und Lipoid enthaltende Bodenschicht, trennt; die Bodenschicht verwirft, die Mittelschicht kalt isoliert und die obere Schicht zu . Trifluor-trichloräthan zugibt und dann erneut homogenisiert und erneut auf gleiche Weise zur Gewinnung der Mittelschicht durch Zentrifugieren trennt und dies mindestens 6 Mal wiederholt, bis kaum noch Proteingel in der Mittelschicht vorhanden ist; wobei die Mittelschicht normales Protein, Albumin und nichtdenaturiertes, tumorspezifisches Protein enthält; das normale Protein dann abtrennt, indem man ein lösliches, antinormales γ-Globulin in an sich bekannter Weise herstellt, indem man ein nichtdenaturiertes, normales, menschliches Protein in ein Tier injiziert und das wasserlösliche, antinormale γ-Globulin von dem Blut des. Tiers abtrennt und in an sich bekannter Weise das lösliche, antinormale γ-Globulin mit Tetrazobenzidin zur Herstellung eines unlöslichen Ροΐν-γ-globulins umsetzt und das isolierte Gemisch aus normalen und Krebsantigenen und Albumin durch ein Säulenbett aus dem unlöslichen Poly-y-globulin zur Umsetzung de"s normalen Antigens mit ihm zur Abtrennung des Krebsantigens und des Albumins leitet; das Proteinmaterial, das die Krebsantigene und Albumin enthält, durch eine S^andard-Albuminfiltersäule zur Entfernung nur des Albu mins leitet, wobei ein gereinigtes, nichtdenaturiertes Krebsantigenmaterial zurückbleibt; das lösliche Protein in dem gereinigten Krebsantigenmaterial dann nach Standardtestverfahren zur Bestimmung des Prozentgehaltes an Protein

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in ihm prüft; gleiche Gewichtsteile an Proteingehalt des Krebsantigenmaterials und eines fremden Tierproteins, wie Kaninchen-γ-Globulin werden langsam zusammen unter Verwendung eines Stabs verrührt, und das Gemisch dann in Natriumchloridlösung (0,9%) unter Vervrendung von etwa 1 ml Natriumchlorid/8 mg der letztgenannten Mischung plus Merthiolat (1:10 000) löstj das letztgenannte, gelöste Gemisch durch ein Standardbakterienfilter zur Entfernung von Bakterien filtriert, wobei das Filtrat bei 4⁰C und steril gehalten wird, während etwa 5,0 bis 10,0 Gew.% γ-Globulin an angesäuertem, bis-diazotiertem Benzidin langsam tropfenteise unter Rühren mit einem Stab in etwa 10 bis 30 Minuten zugegeben werden, bis die Bildung eines gekuppelten Komplexes durch das Auftreten eines braunen Niederschlags plus eines klaren, braunen Überstands angezeigt wird; das gekuppelte Komplexmaterial in ein steriles Dialyserohr für die Dialyse gegenüber physiologischer Salzlösung zur Auslaugung von überschüssigem Benzidin, das jeden Tag analysiert wird_? überführt, das Dialysebad alle 24 Stunden wechselt, bis kein überschüssiges Benzidin mehr auftritt; den Komplex dann mit ultraviolettem Licht, bis die Sterilisierung beendigt ist, bestrahlt; das Endprodukt in sterile Fläschchen oder Ampullen abfüllt oder, bevorzugt, zu einem braunen Pulver in an sich bekannter Weise lyophilisiert und zu Dosiseinheitsformen abmißt, wobei der Proteingehalt nach einem Standardtest bestimmt wird, damit der Proteingehalt jeder Dosis bekannt ist; und wobei alle Verfahrensstufen auf sterile Weise in der Kälte, bevorzugt bei 2 bis 4°C, durchgeführt werden und das nichtdenaturierte Krebsantigen konserviert.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäßen Vakzinen werden im folgenden anhand der Behandlung von Krebs bzw. Karzinoma des Uteruscervix bzw. Gebärmutterhals (Krebs "in situ") erläutert. Es werden Fälle angegeben, wo die Vakzine mit Erfolg verwendet wurde. Es werden weiterhin

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verschiedene Fälle der erfolgreichen Behandlung von Brustkrebs und bronchogenem Krebs beschrieben.

Kanzeröse Gewebe werden von einem öder mehreren Patienten, die "in situ" Krebs haben, bestimmt durch exfoliative Cytologie oder Biopsie, gesammelt. Diese Gewebe werden nach der sterilen Entfernung der äußeren, nekrotischen Teile und der nichtkrebsartigen Gewebe, wie sie mit dem bloßen Auge zu erkennen sind, gefroren. Diese gefrorenen Gewebe v/erden feinverteilt, wie durch Homogenisieren in einem Waring-Mischer während etwa 10 bis 15 Minuten bei einer Temperatur unter 4⁰C. Das gefrorene, zerkleinerte bzw. vermahlene Gewebe wird dann mit 1-5 bis 1-10 Gew./Vol. GBS bei einem pH»Viert, von 10,4 bei 4°C vermischt. GBS ist ein isotonischer Glycinpuffer der folgenden Zusammensetzung: 7,505 g Glycin; 5,83 g Natriumchlorid, 1,84 g Natriumhydroxid in 1000 ml dreifach destilliertem Wasser.

Zu diesem Gemisch wird das gleiche Volumen eines Fluorkohlenwasserstoffs, Trifluor-trichloräthan, das unter dem Warenzeichen Genetron von der Allied Chemical Corporation verkauft wird, zugegeben. Das zwei-phasige System wird in einen Vir Tis-Kolben gegeben, der von einem . .Bad aus Eis und Aceton umgeben ist und mit einer Rand 85-Homogenisiervorrichtung homogenisiert. Diese Vorrichtung besteht aus einem Luftrotor, der mit 45,4 kg (100 lbs) komprimierter Luft betrieben wird, und einem Schaft, der scharfe, rostfreie Stahlflügel trägt. In die Homogenisiervorrichtung gibt man etwa 50 Gew.%, bezogen auf das Tumorgewebe, einer phosphatgepufferten Salzlösung bei unter 4⁰C. Die Homogenisierung erfolgt mit hoher Geschwindigkeit zwischen 15 000 und 85 000 U/min. Die Innentemperatur des Gemisches beträgt 2 bis 4°C. Das Homogenat wird dann mit 1400 g während etwa 10 Minuten bei 2°C zentrifugiert. Dadurch trennt sich das Gemisch in drei Schichten: Eine obere Schicht aus

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wäßrigem Überstand und Nucleinsäure; eine Mittelschicht aus nichtdenaturiertes Krebsantigen, vermischt mit normalen Antigenen, enthaltendem Proteingel und eine Fluorkohlenwasserstoff und Lipoide enthaltende Bodenschicht. Die Bodenschicht wird verworfen, die Mittelschicht wird kalt isoliert und zu der oberen Schicht gibt man Genetron. Sie wird dann erneut homogenisiert, zentrifugiert und getrennt, und die Mittelschicht wird isoliert. Diese Homogenisierung und Zen™ trifugierung werden mindestens 6 Mal wiederholt, bis nur noch wenig Proteingel in der Mittelschicht vorhanden ist.

.Sämtliche isolierte Proteingel-Schichten enthalten das nichtdenaturierte Krebsantigen zusammen mit normalem Protein und Albumin.

Anschließend wird das normale Protein von den nichtdenaturierten Krebsantigenen getrennt. Die Trennung wird in der US-PS 3 410 839 beschrieben und wird folgendermaßen durchgeführt. Die Proteinlösung aus einem Gemisch aus normalen menschlichen Geweben wird zur Immunisierung von Pferden verwendet. Plasma wird später von dem Pferd isoliert, und das Blut kann sich durch die Schwere bei 2°C über Nacht absetzen. Das Plasma wird abgesaugt, bei 1600 g etwa 10 Minuten zur Abtrennung des γ-Globulins zentrifugiert« Das γ-Globulin wird dann bestimmt und in Polyäthylenbehältern gefroren. Es wird bis zu seiner Verwendung gelagert. Bei diesem Teil des Verfahrens v/erden bifunktionelle Tetrazobenzidingruppen mit dem γ-Globulin umgesetzt, wodurch das letztere in eine unlösliche Form überführt wird. Das entstehende Polyglobulin wirkt als unlösliches Adsorbens für spezifische Antigene. Unter Verwendung einer 50 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS 7,2) und 9,6 g Polyglobulin, hergestellt aus Pferde-antinormalem menschlichem γ-Globulin und frisch hergestelltes Tetrazobenzidin enthaltenden Aufschlämmung, wird eine30 χ 1,25 cm Glassäule durch Schwer-

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kraft gefüllt. Dann wird eine Lösung aus nichtdenaturierten Krebsproteine, vermischt mit normalem Protein, durch das Säulenbett, das mit dem unlöslichen Poly-y-globulin gefüllt ist, zur Umsetzung der normalen Proteinantigene damit geleitet.

Es findet keine nicht-spezifische Adsorption von nichtspezifischen Antigenen statt, was durch die Tatsache erkennbar ist, daß die Tumorantigene mit höheren Titern nach der Adsorption durch die Säule als vor der Adsorption, d.h. in ihrem Gemisch mit normalen Antigenen, reagieren. Die Adsorption, die in der Säule auftritt, besitzt die Eigenschaften einer Immunreaktion. Die nichtdenaturierten Krebsantigene liegen nun vermischt mit Albumin vor. Dieses Gemisch wird durch ein Standard-Albuminfilter, wie durch eine Sephadex-Säule, geleitet, so daß nur das Albumin entfernt wird. Zurück bleibt gereinigtes Krebsantigenmaterial.

Das lösliche Protein in diesem gereinigten, nichtdenaturierten Krebsantigenmaterial wird dann nach Standard-Testverfahren, (wie nach dem Folin-Verfahren) zur Bestimmung seines Prozentgehalts an Protein analysiert. Dann v/erden 800 mg des Proteingehalts dieses Krebsantigenmaterials mit 800 mg fremdem Tierprotein, wie Kaninchen-γ-Globulin, unter langsamem Rühren vermischt. Das Gemisch wird dann in etwa 200 ml Natriumchloridlösung (0,9^), die Merthiolat (1x 10 000) enthält, gelöst. Dieses gelöste Gemisch wird dann durch ein Standard-Bakterienfilter, wie durch ein Seitz-L-6-Filter, zur Entfernung von irgendwelchen Bakterien filtriert. Das Filtrat wird bei 4°C und steril gehalten, während etwa 5,0 bis 10,0 Gew.% γ-Globulin von angesäuertem, bis-diazotiertem Benzidin langsam tropfenweise unter Rühren während etwa 10 bis 30 Minuten zugegeben werden, bis die Bildung eines gekuppelten Komplexes durch das Auftreten eines braunen Niederschlags und eines klaren, braunen Überstands angezeigt wird.

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Dieser gekuppelte Komplex wird dann in ein steriles Dialyserohr gegeben. Die Dialyse wird während etwa 200 Stunden gegenüber 100 Vol. Natriumchloridlösung (0,9?S)> die Thiomerosal (1:5000) enthält, durchgeführt. Die Dialyse wird 4 Mal gegenüber 100 Vol. in Intervallen von 24 Stunden zwischen den Dialysatwechseln wiederholt. Nach der Dialyse beträgt der pH-Wert des Komplexes (Niederschlag und Überstand) etwa 7,0. Dadurch wird überschüssiges Benzidin ausgelaugt. Venn kein überschüssiges Benzidin mehr auftritt, wird der Komplex durch Bestrahlung mit Ultraviolettlicht während 2 Minuten in einer Entfernung von 20 cm vor sieben General Electric Germicid-Lampen von 15 W sterisiliert. Die Sterilität wird durch Animpfen von 0,1 bis 1,0 ml des Komplexes in Gelose-Tryptose und Thioglykolat bewiesen. Wenn die Sterilität beendigt ist, wird die fertige Vakzine in sterile Fläschchen oder Ampullen von 10 ml abgefüllt, und diese v/erden mit einem Doppelstopfen aus Kautschuk und Aluminium fest verschlossen. Die fertige Vakzine kann ebenfalls zu einem braunen Pulver lyophilisiert werden und in Dosiseinheitsformen abgemessen werden, wobei der Proteingehalt nach Standardtestverfahren festgestellt wird, so daß der Proteingehalt von jeder Dosiseinheit sichergestellt ist.

Sofern nicht anders angegeben, werden alle beschriebenen Verfahrensstufen auf sterile Weise in der Kälte, bevorzugt unter 4⁰C, durchgeführt.

Zirkulierende Antikörper

Diese werden unter Verwendung des Immunoelektrophoresezählerverfahrens, wie es von Gocke und Howe in Journal of Immunology J_04:1031,1032,1970, beschrieben wird, gemessen. Das Serum wird mit steriler Salzlösung verdünnt.

Immobilisierung der Leukozyt-Migration

Das Verfahren von O'Neill und Favour, wie es in American Review of Tubercular and Pulmonary Disease 72:

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_ ο —

577-600, 1955, "beschrieben ist, wird, etwas modifiziert vorwendet .

10 ml heparinisiertes Blut (0,1 mg/ml) werden durch Inversion mit 10 ml heparinisierter Lösung von Hank (20 ml Hank¹sehe Lösung plus 2 ml Heparin (Sigmaqualität I) mit 1000 Einheiten/ml vermischt. Das Gemisch wird 30 Minuten im Kühlschrank stehengelassen. Eine Zentrifugierung erfolgt bei 1500 χ g während 15 Minuten. Der Überstand wird mit einer sterilen Pasteurpipette abgetrennt und anschließend wird die weiße Schicht sorgfältig entfernt (vermischt mit Erythrocyten). Das Material wird mit dem gleichen Volumen Hank'scher Lösung (zum Waschen und zur Entfernung der Plättchen) verdünnt und erneut während 15 Minuten mit 1500 χ g zentrifugiert.

Das Waschen wird auf gleiche Weise wiederholt. Dor Überstand wird mit einer sterilen Pasteurpipette entfernt und die weiße Schicht wird sorgfältig abgetrennt. Die weiße Schicht wird zwischen zwei Reagenzgläsern 6 χ 7 mm verteilt, und diese v/erden auf 2/3 ihres Volumens mit Serum des gleichen Bluts gefüllt.

Sie werden zur Dispersion der Zellen in einer Vortex-Vorrichtung gerührt. Die zellulare Suspension ist rot, da sie noch Erythrocyten enthält. Zu einem der Reagenzgläser gibt man 4 Tropfen normales Plasma und zu dem anderen 4 Tropfen einer Lösung des Antigens von Uteruscervixkarzinoa (V/o) in einer Puffer-Salz-Phosphatlösung (PBS), pH 7,2. Das Material wird in einer Vortex-Vorrichtung gerührt, und während einiger Minuten werden die RErythrocyten stehengelassen, so daß sie sich durch Sedimentation absetzen können. Von jedem Reagenzglas v/erden 10 Kapillaren durch Kapillarität gefüllt. Sie werden über der Flamme verschlossen und mit

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1500 χ g während 5 Minuten zentrifugiert [die Kapillaren ',.'erden dann als Mikrohaematrocit-Röhrchen verwendet (Clay Adams, heparinisiert und kalibriert bei 60 mm Länge von der Markierung und 75 mm Gesamtlänge; Innendurchmesser 0,5 bis 0,6 mm und Außendurchmesser 1,3 bis 1,4 mm)].

Die Kapillaren werden in vertikaler Stellung 16 Stunden bei 37⁰C inkubiert. Die Emigration der Leukocyten wird unterdem Mikroskop von der Grenzfläche der weißen Schicht und des Plasmas bis zu dem Teil der Kapillaren bestimmt, wo der gesamte Umkreis von Leukocyten bedeckt ist. Die Messungen erfolgen in mm, wobei man das trocken-schwache Target (dryweak target) für jede der zehn Kontrollkapillaren und der zehn Kapillaren mit dem Krebsantigen verwendet.

Der Prozentgehalt der Inhibierung der Leukocytenmigration wird erhalten, indem man die durchschnittliche Migration mit dem Krebsantigen durch die durchschnittliche Migration in den Vergleichsröhrchen dividiert, mit 100 multipliziert und das Ergebnis von 100 subtrahiert.

Auswahl von Patienten mit "in situ" Krebs des Gebärmutterhalses

In 8300 Akten des Materno-Infantile Center Maximino Avila Camacho of Mexico City D.F. werden 32 Patienten gefunden, die in situ Krebs haben- Davon werden 19 ausgewählt. Nachdem den Patienten die Art der Untersuchung erklärt wurde, erklärten sie sich mit der immunotherapeutischen Behandlung einverstanden.

Beweiszeit

Von den 19 ausgewählten Patienten werden jeweils 4 vaginale Zytologien einmal pro V/oche entnommen, wodurch bewiesen wird, daß noch kein Karzidat vorhanden ist. Solche Änderungen werden durch verstärkte zytoplasmische und Kerri-

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vakuolisierung (Koylocytosis), Emperipolesis oder ZeIlaufnahme von leukocytären Zellen und Lymphtocyten in abnormalen Elementen (dyplasischen Zellen und neoplasischen Zellen) initiiert. Während der Entnahme der letzten Zytologie "bzw* des zytologischen Abstrichs wird eine ectoendocerviale Biopsie erhalten, so daß man die Morphologie des Karzinoms kennt und diese histologisch bestätigen kann. Da die Möglichkeit besteht, daß durch die Biopsie des Cervix das Karzinom entnommen wurde, werden erneut an unterschiedlichen Tagen 3 zytologische Abstriche entnommen, so daß das Vorhandensein des in situ Krebses nach der Biopsie sichergestellt wird. Der Krebs wird bei allen Patienten bestätigt.

Ergebnisse

Immunotherapeutische Untersuchung

Jedem Patienten wird 1 ml SC-TA-A (gekuppeltes, spezifisches Tumorantigen, wie es zuvor beschrieben wurde, plus unvollständiges Adjuvans von Freund) an 4 oder 5 Stellen der Haut oder der Außenseite des Schenkels intradermical injiziert. Die Hautreaktion wird nach 24, 48 und 72 Stunden bestimmt, wobei ihre Intensität gemessen wird und Photos von der Reaktion aufgenommen werden. 10 Tage nach der ersten Immunisierung werden wieder 1 ml SCTA-B (gekuppeltes, tumorspezifisches Antigen ohne Freund'sches Adjuvans) an der Schenkelgegenseite injiziert. In Intervallen von 10 bis 12 Tagen wird die Injektion von 1 ml Antigen ohne Adjuvans auf gleiche Weise wiederholt.

Die Patienten zeigten keine allgemeine Reaktion und sie zeigten nur eine lokalisierte Temperaturerhöhung, Hautrötungen und gelegentlich Hautjucken. Die lokalisierte Reaktion bleibt während unterschiedlicher Zeiten zwischen 10 und 20 Tagen erhalten. Danach konnten nur noch geringe Zonen von knötchenförmigen Hautverhärtungen an den Injektionsstellen festgestellt werden, die noch einige Wochen bleiben. Bei

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keinem Patienten beobachtete man irgendwelche unerwünsclii::?:. Erscheinungen entweder sofort oder später.

Zytologische Untersuchung

In der Zeit, während der die Behandlung erfolgte, wurde jede Woche Material für die zytologischen Untersuchungen entnommen. Man stellte fest, daß bis zu'Tagen danach zellulare Änderungen auftreten. Diese Änderungen wurden durch andere, ausgeprägtere, wie Kernpyknose, auf sehr ausgeprägte Weise, Fragmentierung des Chromatins in grobe Klümpchen und ein Fehlen der Kontinuität in der Kernmembran von atypischen Zellen ersetzt. Bei den Zytologien, die während des dritten bis vierten Monats entnommen wurden und die als Endabstriche anzusehen sind, beobachtete man bösartige Zellen mit dickem, granulärem Chromatingehalt. Das Cytoplasma zeigt mehrere feine Vakuolen und schon die eindeutige Erscheinung, dass sehr feines und pulverförmiges Chromatin aufgelöst wird, sehr wenig Cytoplasma, das sehr schwierig zu färben ist. Dadurch kann man diesen Zellen große und nackte oder blanke Kerne zuordnen. Schließlich treten mit bestimmter Frequenz Zellen mit Caryorrhexis und Klümpchen von dickem Chromatin in dem zellularen Zytoplasma auf.

Alle diese Änderungen stellt man bei den zytologischen Abstrichen bei den Patienten während der Auswahlzeit nicht fest, so daß man annimmt, daß sie ein Ansprechen auf die angewandte Behandlung sind.

Histologische Untersuchung

Bei der histologisehen Untersuchung von operativ entfernten Stücken ist es schwieriger, die fortschreitenden Änderungen zu zeigen, verglichen mit den eindeutigen Änderungen bei den Zytologien. Bei Stücken, die durch Histerektonie' oder Conisation entnommen wurden und die in der Tabelle I als "ohne Krebs" bezeichnet werden, beobachtet man in dem Belag-

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epithel keine zellularen Änderungen, und die Anwesenheit von Krebs wird nicht festgestellt. Wenn ein in situ Krebs vorhanden ist, bleibt das histologische Bild erhalten mit der charakteristischen Morphologie und den Erscheinungsformen, ähnlich wie man sie bei der Kontrollbiopsie feststellt. Nur bei Dysplasieänderungen konnte gezeigt v/erden, daß Zusammenhänge mit den zytologischen Ergebnissen vorhanden sind. Diese Änderungen sind eine Vakuolisierung der außenliegenden Elemente des Apetheliums, wobei die Vakuolisierung manchmal in der gesamten Dicke der Epithelschicht sehr intensiv ist. Weiterhin tritt ein lyinphocytäres Infiltrat unter den Epithelzellen auf, und einige Elemente auo Epithelium mit diskreten Kernänderungen sind vorhanden. Diese Patienten mit Dysplasie zeigten danach eine negative Zytologie während einer Zeit von mehr als 2 Jahren nach der chirurgischen Behandlung der cervikalen Conisation (vergl. Tabelle I).

In Tabelle II sind die zytologischen und histologischen Ergebnisse von allen 19 Fällen aufgeführt.

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Tabelle I Hauptmerkmale der Immunotherapie "bei in situ Krebs

Nr. Identifizierung
Nr.der Krankenhaus akte

Alter

Anzahl d. Injektionen

Behandlung-

4 s a (Monate)^a

Immobilisie- Conisation(Co) Histologische

rung d.Leuko- oder Hyster- Untersuchung an

cythenmigra- ektomie(Kys) operativen

tion (?0 Proben

O.Z.J.(12457)

C.Ch.M.(18031)

V.S.Ma.(i65O1)

G.V.M. (10127)

G.L.T. ( 8104)

P.V.R. ( 7219)

G.G.M.J.(148O7)

L.C.J. (17483E)

O.S.I. (7420E)
G.H.M.Lj(17314)

F.R.J.

A.A.H.

M.C.F.

G.M.C.

N.C.T.

(17478)
(15125)
(7259E)
(13132E)
(12203E)

V.M.J. (17935E)

H.T.M.LO7936E)

M.V.G. (16913)

R.M.M. J. (6393)

34 44 28 30 35 36 42 36 23 33 36 28

47 34 35 26 42 33 37

19 10 5 3 4 2 7 2 1

21 5 4 4 9 6

2 12

7(12) 3( 7) 2( 6) K 7) 2( 4) 1(10) 3( 6)

K 8) 2(10)

13(18) 9(19)

12(16) 8(12) 2 ( 9) 7(19) 1(12)

K 5) 7(17)

1(18) 99,5 99,6 93,4

99,2 99,0 60,9

nicht durchgeführt 100,0 99,6 76,4 99,0 99,0 ' 78,7 99,3 95,0 98,6 S9,0 65,3

Co Hys Co Hys

Co Hys Hys Hys Co Co Co Hys

Zytologie Co Hys

Zytologie Co

Zytologie Hys Co

a s= die Zahl in Klammern gibt die Zahl nach der oder die Zytologie durchgeführt wurde.

ersten Injektion in Monaten an,

kein Krebs

It It

Dysplasie

Il Il

in situ Krebs

It ti tt Il ti tt Il ti tt

Dysplasie ^ in situ Krebs

tt Il It

kein Krebs

It It

in situ Krebs

kein Krebs

Dysplasie

in situ Krebs κ)

Dysplasie &>

H CO

wann die Operativ

Tabelle II

Histologische und zytologische Ergebnisse der Immunotherapie in 19 Fällen von in situ Krebs der Cervix uteri

Anzahl der Patienten

Zytologische Änderungen Histologische Diagnose

11

57,8%

CO OO OO

O CO OT

zelluläre Vakuolisierung

große Kerne

nackte Kerne

Einperipolesis

starke Chromatinfragmentierung

Karyο rrhe sis, Pykno s e

Chromatolyse vollständige Regression 5 Fälle
zonale Dysplasie in 6 Fällen

8 42,2%

Vakuo Ii s oarung

nackte und große Kerne

mit freinem Chroniatin

Gruppen mit bösartigen Zellen Fortdauer des in situ
Krebses in 8 Fällen

In keinem Fall tritt ein eindringender Krebs während der Untersuchung
auf

In allen Fällen Serienteile der Ecto-Endocervix (Hysterektomie oder Conisation)

Diskussion

Entsprechend den Ergebnissen der Tabellen I und Il

zeigen 57»δ % der Patienten eine Regression (5 Patienten) oder Involution zu Dysplasie (6 Patienten), während nur bei 42,2 % eine Fortdauer des in situ Krebses beobachtet wird. Es wird darauf hingewiesen, daß in keinem Falle eine Progression des Intraepithelkrebses in Richtung auf einen eindringenden Krebs beobachtet wurde, da leider die Furcht bestand, daß bei der immunotherapeutischen Behandlung von Krebs eine Steigerung der Entwicklung des Krebses möglich sei.

Aus den in Tabelle I aufgeführten Ergebnissen geht ebenfalls hervor,-daß die Immobilisierungstests der Migration von peripheren Leukocythen bei allen untersuchten Patienten positiv sind. Die Variationen sind jedoch so groß, daß man den Ergebnissen keinen wesentlichen Wert beimessen kann. Man kann keine klare Korrelation zwischen dem Prozentgehalt der Immobilisierung und dem therapeutischen Ansprechen angeben.

Die Immobilisierung (die zu Beginn der Immunisierung auftritt) erhöht sich bei steigender Zahl. Dies steht im Zusammenhang mit einer Erhöhung in der Reaktion der verzögerten Hyperempfindlichkeit, die bei den Patienten beobachtet wird. Die Suche nach zirkulierenden Antikörpern (bestimmt mit dem nichtgekuppelten, Krebsantigen) zeigt ihre Anwesenheit, aber nur in der nachfolgenden Phase, d.h. während 2 bis 4 Monaten nach der ersten Immunisierung und mit sehr unterschiedlichen Titrationen. Beispielsweise besitzt die Patientin''Nr. 10 (G.Z.M.L.) einen Titer von 1:16, 384, wohingegen die Patientin Nr. 7 (G-.G.M.S.) einen Titer von 1:32, 768 besitzt.

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Die erste Patientin zeigt eine Regression und die zweite ein Fortdauern des in situ Krebses. Andere Patientinnen haben zirkulierende Antikörper, aber mit wesentlich niedrigeren Titern.

Die zytologischen Untersuchungen zeigen Erscheinungen bei den zellularen Änderungen, die nicht als charakteristisch angesehen werden. Diese zellularen Änderungen treten in allen Fällen auf; sie sind jedoch bei den Fällen, bei denen danach eine vollständig Regression der Neoplasie auftritt, besonders offenkundig und ebenfalls bei solchen Fällen, bei denen eine Involution in Richtung auf die Dysplasie beobachtet wird.

Die Anzeigen der Regression, die durch die erv/ähnten zytologischen Änderungen angezeigt werden, werden innerhalb der ersten zwei Monate nach der Behandlung beobachtet. Sie scheinen eine Folge des Ansprechens auf die imaunotherapeutische Behandlung zu sein. Diese Anzeichen können von Viert sein, da diese Anzeichen für die zellularen Änderungen als Parameter für das günstige Ansprechen dieser Patientinnen auf die immunotherapeutische Behandlung verwendet v/erden können.

Die charakteristischen Erscheinungen, die bei den zytologischen Untersuchungen (Pyknose, Carvorrhese, Fragmentierung des Chromatins, Chromatolyse, Erhöhung der Zellgröi3e, Vakuolisierung usw.) auftreten, werden üblicherweise bei zytologischen Routineuntersuchungen beim in situ Krebs und bei nichtbehandelten Patienten festgestellt, aber immer in isolierter oder gelegentlicher Weise und niemals mit der · Häufigkeit, wie bei der immunotherapeutischen Behandlung. Diese zytologischen Änderungen werden bei den gleichen Patientinnen während der Durchführung der zytologischen Untersuchungen nicht beobachtet, während der Auswahlzeit vor der Verabreichung des Antigens.

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Neoplasische Zellen oder abnorme Dysplasiezelleii zeigen häufig "beide Erscheinungen, Leukocyten, eingeschlossen in Yakuolen des zellularen Cytoplasmas. Diese Erscheinung wurde als Emperipolese bezeichnet und bei anderen Untersuchungen erwähnt und ihr \tfird ein beachtlicher Wert als Ausdruck der immunologischen Ansprechbarkeit zugemessen.

' In einigen Arbeiten wird von einer Regression des in situ Krebses bei einigen therapeutischen Mitteln (Antibiotika) gesprochen. Dies wurde bei allen Patientinnen der vorliegenden Untersuchung vermieden, da diese keine lokale oder allgemeine Behandlung während der Zeit des immunotherapeutisehen Versuchs erhielten. So wird angenommen, daß all diese Faktoren die erhaltenen Ergebnisse nicht störten.

Zur Zeit besteht ein großes Interesse an der spontanen Regression des in situ Krebses. Die spontane Regression von cervikalem Krebs in situ ist und war Gegenstand konträrer Ansichten, bedingt durch die Tatsache, daß während der ersten Zeiten der exfoliativen . Zytologie einige Bilder von nichtneoplasischer Dysplasie für solche von intrapithelialem Karzinom mißgedeutet wurden. Gegenwärtig wurde das Wissen über die exfoliative Zytologie und die histologischen Untersuchungen verbessert, und es ist eine Differenzierung und Trennung mit weniger Fehlerquellen der verschiedenen Formen der Dysplasiemuster oder -bilder möglich, die für in situ Krebs typisch sind. Aus diesen Gründen spricht man heute immer weniger von einer spontanten Regression dieser Art von Krebs. Koss führt in Cancer 16: 1160-1211, 1963, aus: "Das spontane Verschwinden von Krebs in situ tritt offensichtlich nicht auf und ist ein ausgesprochen seltener Fall." J.E. Ayre gibt bei seinen persönlichen Versuchen die Möglichkeit der Regression von Krebs in situ zu und fügt hinzu, daß, obgleich sie möglich ist, sie nur langsam und all-

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mählich abläuft mit einer Dauer von Monaten oder Jahren, aber daß niemals eine "plötzliche" neoplastische Regression auftritt.

Diese Meinungen werden nur aufgeführt, da bei den vorliegenden Versuchen eine zytologische Regression des Krebses in den ersten vier Monaten der iminuno therapeutisch en Behandlung auftritt. Das Phänomen der Regression tritt zusammen mit bemerkenswerten zytologischen Änderungen auf, die sich von denen unterscheiden, die man bei den gleichen Patienten und bei anderen in situ Karzinomen nach einer langen Zeit feststellt.

Ein Projektjdas ähnlich ist, wie das oben beschriebene, wurde mit Patienten, die primäre und sekundäre Lungenkarzinome hatten, durchgeführt. Die Patienten wurden der Iminuno therapie unterworfen, wobei genau, wie oben beschrieben, hergestellte Vakzine verwendet wurde, ausgenommen, daß als Aus gang srip.terial Lungenkrebsstücke genommen wurden, die aus verschiedenen menschlichen Patienten entnommen wurden. Das als Ausgangsmaterial verwendete Krebsmaterial wurde genau, wie oben beschrieben, behandelt.

Alle Patienten, die nach dieser Immunotherapie behandelt wurden, waren fortgeschrittene oder Endfälle, und es gab keine Anzeichen für irgendeine .andere Art von Behandlung. Im allgemeinen- kann das Überleben der Patienten während einer Zeit über -5 Jahre als bemerkenswert angesehen werden.

Eine Teiluntersuchung dieser Patienten zeigt die Ergebnisse der Behandlung während einer Zeit von 2 Jahren bei primärem Lungenkrebs und bei metastatischem Krebs und die Evolution während eines oder mehreren Jahren in anderen Fällen, die seit 1973 behandelt wurden und die derzeitigen von sol-

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chen, die seit 1974 (6 Monate) in Behandlung sind.

Die günstigen Ergebnisse der Immunotherapie bei dieser. Patentienbehandlungen bei primärem Krebs der Lunge wird durch das Verschwinden der klinischen Symptome (Verschwinden des Schmerzes, der Hämaptysie, Erhöhung des Körpergewichts, Verschwinden von Fieber usw.) bei der untersuchten Patientengruppe angezeigt. Insbesondere ist das Verschv/lnden der kontralateralen Metastasis und in einigen Fällen die Verminderung des primären Tumors beachtlich. Ein weiteres wesentliches Merkmal, das man bei den behandelten Patienten beobachtet ist das, daß, wenn die Behandlung aus verschiedenen Gründen unterbrochen wird, die Symptome des Patienten zurückkehren und die Röntgenbilder ähnlich sind, wie die das Patienten vor Beginn der Immunologiebehandlung. Nach der Wiederaufnahme der Behandlung mit der nichtdenaturierten Krebsantigen-Vakzine verschwinden die Symptome wieder und sehr offensichtliche Änderungen im klinischen und im Röntgenbild treten auf.

Aus der folgenden Tabelle III, wo 12 der ersten 50 behandelten Fälle aufgeführt sind, ist erkennbar, daß Patienten, die, wie zuvor beschrieben, der Iinmunotherapiebehsiidlung unterworfen wurden, eine Überlebensrate von 6 Monaten bis 2 Jahren besitzen und daß von diesen Fällen Lungensquarnazellkrebs und die metastasischen Arten besonders gut ansprechen. Im allgemeinen wird ein besseres Ansprechen von den Fällen des Squamazellkrebses bemerkt als bei den Fällen von anaplastischem Lungenkrebs. Das Ansprechen auf die immunologische Behandlung des Nieren- und Brustdrüsenkrebses bei metastatischen Karzinomen der"Lunge ist ebenfalls günstig.

Im folgenden werden die Analysen von einigen der ersten 50 Fälle aufgezeigt. Sie zeigen eine Kontrolle des

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Krebses während einer Zeit, die länger ist als 6 Monate "bis zu 2 Jahren.

Die untersuchten Fälle zeigen ein ausreichend gutes Ansprechen auf die beschriebene immunologische Behandlung.

Fall Nr. 2 - 11 Monate und 22 Tage - Squamazellkrebs der Lunge.

Fall Nr. 5 - Behandlung 19 Monate bis zum 10.12.73, beendigt; keine Symptome oder Anzeichen von Abnormalitat im Atmungstrakt.

Fall Nr.10 - Behandlung vom 6.9.72 bis 15.6.74, offensichtlich 22 Monate ohne Symptome.

Fall Nr.17 - 7.10.72 bis 3.12.73, 13 Monate ohne Symptome in den AtmungsOrganen.

Fall Nr.21 - 3.12.72 bis 30.4.74, 16 Monate ohne Symptome in den Atmungsorganen.

Fall Hr.27 - 12.4.73 bis 20.5.74, 13 Monate chna Symptome in den Atmungsorganen.

Fall Nr.34 - 2.10.73 bis 7.5.74, 7 Monate ohne Symptome in den Atmungsorganen.

Fall Nr.40 - 21.11.73 bis heute, δ Monate.

Fall Nr.42 - vom 6.12.73 bis zum letzten Bericht am 9.4.74.

Fall Nr.44 - Nefrectomie und Cervixkrebs; Verbesserung vom 28.9.73 bis 5.7.74, 6 Monate.

Fall Nr.47 - 10.9.73 bis Juli 74, Verbesserung, Stabilisierung der Knochenmetastasen eines Thyroidkrebses; der ambulante Patient ist ohne Schmerzen, 10 Monate.

Die meisten Patienten werden ambulant und somit außerhalb des Krankenhauses behandelt. Einige kehren zur weiteren Behandlung nicht zurück. Obgleich man- keine Mühe gescheut hat, diese Patienten zu finden, müssen sie jetzt von der Untersuchung ausgeschlossen werden.

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Im folgenden wird eine kurze Zusammenfassung von acht lebenden Patienten gegeben. Diese Zusammenfassung wurde im Juli 1974 erstellt.

Patient Nr. 5 - Squamazellkrebs etwas differenziert. 12 Dosen, 26 Monate, ausgezeichnetes klinisches Ansprechen.

Patient Nr.10 - differenzierter Squamazellkrebs. 8 Dosen, 22 Monate, ausgezeichnetes klinisches Ansprechen.

Patient ITr.21 - zystischer adenoider Krebs der Speicheldrüse. 15 Dosen, 19 Monate, guter Zustand.

Paüent Nr.27 - Squamazellkrebs etwas differenziert. 12 Injektionen, 15 Monate, guter Zustand.

Patient Nr.28 - schleimartiges Squama.zellkarzinom. 8 Injektionen, 12 Monate, guter Zustand.

Patient Nr.34 - Squamazellkarzinom . sehr wenig differenziert; 4 Injektionen, 9 Monaten, guter Zustand.

Patient Nr.36 - anaplastischer· Lungenkrebs. 15 Injektionen, 7 Monate, guter Zustand.

Patient Nr.44 - Squamazellkrebs, klare Zellen, wenig differenziert; Nefrectomie und cervicaler Krebs. Verbesserung vom 28.11.73 bis 5.JuIi 1974, 6 Monate.

Die klinischen Vierte sind für die folgenden Patienten unvollständig, obgleich man alles unternommen hat_s die Patienten zu finden.

Patient Nr.17 - indifferenzierter anaplastischer Krotut 3 Injektionen, Behandlung beginnt am 1.9.72, der Patient kehrt dann am 3.12.73 in gutem Zustand zurück, 15 Monate. Der Patient ist verschwunden.

Patient Nr.40 - Lungensquamazellkrebs,superclaviculares Ganglion; 5 Injektionen, Behandlungsbeginn 24.11.73 und die Behandlung wird fortgesetzt. Der Patient ist verschwunden.

^; Patient Nr.42 - Squamazellkrebs differenziert; 7 In- · jektionen, beginnend am 6.12.73, ausgezeichnetes klinisches Ansprechen. Ergebnisse nach dem 6.3.73 fehlen.

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Drei Patienten starben nach einem guten klinischen Ansprechen.

Patient Nr.2 - Squamazellkrebs, klare Zellen, wenig differenziert; 16 Injektionen, lebt 11 Monate, 22 Tage.

Patient Nr.39 (nicht auf der obigen Liste aufgeführt) anaplastischer Lungenkrebs; 7 Injektionen, beginnend am 13·11·73· Verbesserungen vom Beginn der Impfung. Januar 74 Metastasen im Gehirn, er stirbt am 26.3.74.

Patient Nr.40 - Brustkrebs, eindringend und ganglionär; 10 Injektionen, beginnend am 18.12.73» ausgezeichnetes klinisches Ansprechen, stirbt am 30.4.74, 4 1/2 Monate.

In dem Bericht vom Juli 1974 v/erden Patienten erwähnt, die langer als 6 Monate behandelt v/urden. 51 weitere Patienten wurden weniger als 6 Monate behandelt. Von diesen erhielten 15 weniger als 4 Injektionen und 5 Patienten fehlen. Von den verbleibenden 31 Patienten zeigen 27 günstige klinische Ergebnisse und 4 sind gestorben.

Andere Fälle, die seit 1974 unter immunotherapeutischer Behandlung stehen, sind Fälle von Brustdrüsenkrebs, Harnblasenkrebs, Kolonkrebs und rectosigmoider Krebs, Leberkrebs und andere bösartige Tumore (Melanomas). In allen Fällen wird die Vakzine, genau wie oben in Zusammenhang mit dem in situ Krebs beschrieben, hergestellt, wobei Stücke von Krebsgewebe aus Patienten mit Krebs an dem spezifischen Körperorgan als Ausgangsmaterial verwendet werden. Ein guter Prozentgehalt dieser Fälle zeigt klinische Verbesserungen.

Von der Gruppe der untersuchten Patienten ist besonders das Verschwinden von kontralateraler Metastase und in einigen Fällen die Verminderung des primären Tumors spektakulär.

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Ein Afeiteres, interessantes Merkmal, das man bei. diesen Patienten beobachtet, ist das, daß, wenn die Behandlung der Patienten aus verschiedenen Gründen unterbrochen wird, die Symptome und Röntgenbilder auftreten, wie sie die Patienten vor Beginn der immunologischen Behandlung hatten. Wird die Behandlung mit der hierin beschriebenen Vakzine wieder aufgenommen, so verschwinden die Symptome, und eine stark ausgeprägte klinische Verbesserung tritt auf und die Röntgenbilder sind verbessert.

Bei der Behandlung eines Patienten mit der erfindungsgemäßen Vakzine wurde gefunden, daß, wenn der Patient beispielsweise Nierenkrebs mit Metastasen an der Lunge hat oder Lungenkrebs mit Metastasen an der Brustdrüse usw., die Dosiseinheitsfora hergestellt werden kann, indem man 1 ml der spezifischen IJierenvakzine und 1 ml der spezifischen Lungenvakzine (oder 1 ml der spezifischen Lungenvakzine und 1 rr·! der spezifischen Brustdrüsenvakzine) verwendet. In allen diesen Fällen werden die verschiedenen spezifischen Vakzine miteinander mit oder ohne unvollständiges Adjuvans von Freund vermischt und dem Patienten intradermal jede Woche oder alle 10 Tage, wie bei .der immunotherapeutisehen Untersuchung beschrieben, verabreicht. In allen Fällen sind die Vakzine von den verschiedenen spezifischen Körperorganen miteinander verträglich und jede Vakzinmischung ergibt Verbesserungen im Krebszustand eines gegebenen Organs des Patienten.

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Claims

- 25 Patentansprüche

^ΓΛ .' Verfahren zur Herstellung einer Vakzine, insbesondere zur Behandlung menschlicher Krebserkrankungen der Brust, Lungen, Ovarien, Cervix, Blase, von Melanomen und Krebserkrankungen des gastro-intestinalen Trakts, dadurch gekennzeichnet, daß man.

Tumormaterial, das von mindestens einem oder nehrerc;n Menschenkarzinoinen eines spezifischen, vorbestimmten Organs stammt, als Ausgangsmaterial verwendet;

das Ausgangsmaterial von nekrotischem Material uud von nicht-kanzerogenem Gewebe, wie es mit dem bloßen A·¹;.,e erkennbar ist, steril zur Herstellung eines tuniorspezifiL-cnen Materials reinigt;

das tumorspezifische Material z.B. durch Homogeniciü-· rung in einein V/aring-Hincher während etwa 10 bis 15 Minuton bei einer Temperatur unter 4° C homogenisiert;

eine bestimmte Menge des homogenisierten Tumomaterials mit einem gleichen Gewicht an Trifluor-trichloriri.^an und mit 50 Gew.% phosphatgepufferter Salzlösung bei unt^r 4°C vermischt;

das Gemisch bei hoher Geschwindigkeit von 15 000 bis 85 000 U/min homogenisiert;

das Homogenat in einer gekühlten Zentrifuge mit etwa 1500 U/rnin während etwa 10 bis 20 Minuten zentrifugiert, es dann in einen eisgekühlten Behälter überführt, wo es sich in drei Schichten, eine obere Schicht aus wäßrigem Überstand plus Nucleinsäure, eine das nichtdenaturierte Krebsantigon , vermischt mit normalen Antigenen, enthaltende Mittelschicht aus Proteingel und eine Fluorkohlenwasserstoff und Lipoid enthaltende Bodenschicht, trennt;

'■ die Bodenschicht verwirft, die· Mittelschicht kalt isoliert und die obere Schicht zu Trifluor-trichloräthan zugibt und dann erneut homogenisiert und erneut auf gleiche V/eise zur Gewinnung der Mittelschicht durch Zentrifugieren

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trennt und dies mindestens 6 Mal wiederholt, bis kaum noch Proteingel in der Mittelschicht vorhanden ist;

wobei die Mittelschicht normales Protein, Albumin und nichtdenaturiertes, tumorspezifisches Protein enthältj

das normale Protein dann abtrennt, indem man ein lösliches, antinormales γ-Globulin in an sich bekannter Weise herstellt, indem man ein nichtdenaturiertes, normales, menschliches Protein in ein Tier injiziert und das wasserlösliche, antinormale γ-Globulin von dem Blut des Tiers abtrennt und in an sich bekannter Weise das lösliche, antinormale y~ Globulin mit Tetrazobenzidin zur Herstellung eines unlöslichen Poly-y-globulins umsetzt und das isolierte Gemisch aus normalen und Krebsantigenen und Albumin durch ein Säulenbett aus dem unlöslichen Poly-y-globulin zur Umsetzung des normalen Antigens mit ihm zur Abtrennung des Krebsantigens uncl des Albumins leitet;

das Proteinmaterial, das die Krebsantigene und Albumin enthält, durch eine Standard-Albuminfiltersäule zur Entfernung nur des Albumins leitet, wobei ein gereinigtes j. nichtdenaturiertes Krebsantigenmaterial zurückbleibt;

das lösliche Protein in dem gereinigten Krebsantigenmaterial dann nach Standardtestverfahren zur Bestimmung des Prozentgehaltes an Protein in ihm prüft;

gleiche Gewichtsteile an Proteingehalt des Krebsantigenmaterials und eines fremden Tierproteins, wie Kaninchen-γ-Globulin, langsam zusammen unter Verwendung eines Stabs verrührt und das Gemisch dann in Natriumchloridlösung (0,9/0 unter Verwendung von etwa 1 ml Natriunichlorid/8 mg der letztgenannten' Mischung plus Merthiolat (1:10 000) löst;

das letztgenannte, gelöste Gemisch durch, ein Standardbakterienfilter zur Entfernung von !Bakterien filtriert, wobei das Filtrat bei 4⁰C und steril gehalten wird, während etwa 5,0 bis 10,0 Ge\'f.% y-Globulin an angesäuertem, bis-diazotiertem Benzidin langsam tropfenweise unter Rühren mit einem Stab in etwa 10 bis 30 Minuten zugegeben werden, bis die Bildung

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eines gekuppelten Komplexes durch das Auftreten eines brav^w Niederschlags plus eines klaren, braunen Überstands angeze j.(_:;.. wird;

das gekuppelte Komplexmaterial in ein steriles Dialy&erohr für die Dialyse gegenüber physiologischer Salzlösung zur Auslaugung von überschüssigem Benzidin, das jeden Tag analysiert wird, überführt, das Dialysebad alle 24 Stunden wechselt, bis kein überschüssiges Benzidin mehr auftritt;

den Komplex dann mit ultraviolettem Licht, bis die Sterilisierung beendigt ist, bestrahlt;

das Endprodukt in sterile Fläschchen oder Ampullen abfüllt oder, bevorzugt, zu einem braunen Pulver in an sich bekannter Weise lyophilisiert und zu Dosiseinheitsformen abmißt, wobei der Proteingehalt nach einem Standardtest bestimmt wird, damit der Proteingehalt jeder Dosis bekannt ist;

und wobei alle Verfahrensstufen auf sterile ¥eise in der Kälte, bevorzugt bei 2 bis 4⁰C, durchgeführt werden,und das nichtdenaturierte Krebsantigen konserviert.
2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung einer Mehr-· fachvakzine, insbesondere für die intradermale Injektion an Patienten, dadurch gekennzeichnet , daß man Vakzine herstellt, die für jeweils nur ein menschliches Organ spezifisch sind, eine Dosiseinheit für den Patienten, der in einer Vielzahl seiner Organe Krebs hat oder vermutlich Krebs hat, festlegt und die Dosiseinheit die die erforderliche Menge an jeder der Vakzinen enthält, die spezifisch für die einzelnen infizierten Organe des Patienten sind, durch Mischen der von Dosiseinheiten der einzelnen spezifischen Vakzinen herstellt.

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