DE2126680A1 - Carcinoembryonisches Antigen - Google Patents
Carcinoembryonisches AntigenInfo
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Description
Dr. !ng, A. van der Wen!
Dr. Franriedew ' ■■ ■ 28, Mai 1971
Dr. Franriedew ' ■■ ■ 28, Mai 1971
Λθ6θ/47
Carcinoembryonjsches Antigen-
Die Erfindung betifft eine Fraktionierungsmethode von
carcinoembryonischem Antigenmaterial in die aktiven Komponenten, beispielsweise in die Komponente A und die Komponente B. Es
ist nämlich gefunden worden, dass das bis anhin als carcinoembryonisches
Antigen (CEA) bekannte Material eine Mischung mehrerer Komponenten, mindestens von zweien, ist. Diese beiden
aktiven Komponenten werden Komponente A und Komponente B von carcinoembryonischem Antigen genannt.
Die Erfindung betrifft weiter Methoden der Isolierung und Charakterisierung der carcinoembryonischen Antigenkomponenten
aus Carcinomen für diagnostische Teste und für die Anwendung
der radioaktiv markierten Komponenten A und B von carcinoembryonischem
Antigenmaterial, um im Körper gegebenenfalls anwesende Komponenten A und/oder B von carcinoembryonischem
Antigenmaterial zu entdecken.
1098 5 0/1847
Die Erfindung betrifft des weiteren eine diagnostische ·
Testmethode zur Entdeckung von Carcinomen, die auch geeignet ist.für eine postoperative Ueberwachung von Carcinom-Patienten.
Der Ausdruck: "Carcinom", wie er in der vorliegenden Anmeldung gebraucht wird, soll alle Carcinome und Adenocarcinome des
Menschen umfassen.· Der Ausdruck "careinoembryonisches Antigenmaterial"
umfasst dasjenige Material mit carcinoembryonisigher
Aktivität, das;, die Komponenten A und/oder B enthält.
Um radioaktiv markiertes careinoembryonisches Antigenmaterial
oder dessen einzelne Komponenten A und B herzustellen
ψ und unabhängig voneinander in den verbesserten diagnostischen
Testmethoden, die Gegenstand dieser Erfindung sind, anzuwenden,
ist es zunächst nötig, jedes der genannten Materialien
zu isolieren und zu reinigen, sowie dessen Identität durch spezifische Antikörper nachzuweisen.
Gemäss der vorliegenden Erfindung sind Verfahren "
entwickelt worden für:
a) Die Isolierung, Reinigung und Charakterisierung; von carcinoembryonischem Antigenmaterial, dessen
Komponente A und Komponente B ,sowie zum Nachweise von deren Identität und Spezifität:
b) Anwendung von carcinoembryonischem Antigenmaterial, der Komponente A und/oder B,in radioaktiv markierter
Form, zum Nachweis von vorhandenen Carcinomen durch den Nachweis eines zirkulierenden
Antigens und
c) Unterscheidung zwischen freiem und gesamtem zirkulierendem
carcinoembryonischem Antigenmaterial , bzw. der Komponenten A und/oder B.
1098 5 0/1847
" " Obgleich die vorliegende Erfindung Antigene betrifft,
die mit Carcinomen allgemein zusammenhängen, beziehen sich die im folgenden beschriebenen Methoden der Isolierung
und Reinigung auf Coloncarcinomgewebe und auf Meconium, die Jedoch als"repräsentativ anzusehen sind für die Behandlung von
Material, das CEA bzw. die Komponenten A und/oder B enthält.
Zur Isolierung von carcinoembryonischem Antigenmaterial gemäss vorliegender Erfindung, wird Adenocarcinomgewebe
aus primären oder metastatischen Tumoren, vorzugsweise solchen des Verdauungssystems wie z.B. Colontumoren oder
Meconium homogenisiert.
Zur Isolierung des carcinoembryonisehen Antlgenmaterials,
der Komponenten A und/oder Bi ist es notwendig,zunächst alle
anderen Komponenten des Homogenats zu entfernen, um dann aus dem erhaltenen Material die einzelnen Komponenten zu isolieren.
Dies wird durch an sich bekannte chemische und physikalische Extraktions- und Reinigungsverfahren erreicht. Sollte beispielsweise
nur Komponente A oder Komponente B im Homogenat
anwesend sein, dann entfällt die Fraktionierung des erhaltenen carcinoembryonischen Antigenmaterials.
Nach Abschluss der Extraktion und Reinigung, muss die Identität der schliesslich isolierten Fraktionen als
earcinoembryonisches Antigenmaterial bzw. einer Komponente bestätigt werden. Dies kann durch verschiedene bekannte
Techniken erfolgen, z.B. durch doppelte Agargeldiffusion,
durch Immunoelektrophorese, Hämagglutination, passive kutane Anaphylaxie und dgl. .
Die Anwendung dieser Techniken setzt voraus, dass die verwendeten Antikörper erwiesenermassen spezifisch sind für
CEA-Material, Komponente A und/oder Komponente B. Antikörper, die diese Bedingung erfüllen, können durch immunologische
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Toleranz-oder Absorptionstechniken hergestellt werden.
Bei der immunologischen Toleranztechnik werden Tiere während des Neugeborenenlebensabschnittes gegen normale
Gewebe immunologisch tolerant gemacht. Die toleranten Tiere werden dann mit Tumorpräparaten der gleichen Spenderarten
immunisiert. Wo eine angemessene Unterdrückung der Immunreaktion gegen normale Gewebebestandteile beobachtet werden
konnte, ist die Entwicklung von für den Tumor anscheinend spezifischen Antikörpern erreicht worden.
Bei der Absorptionstechnik wird das Antitumorantiserum
von normalem Gewebe und von normalen Flüssigkeiten (Speichel, Serum, Plasma) absorbiert, um antinormale Komponenten
des Antiserums zu entfernen. Zurückbleibende Antikörperaktivität des absorbierten Antiserums, die gegen das Tumormaterial
gerichtet ist, wird dann als tumorspezifisch bezeichnet. Dieses Verfahren ist nicht fehlerfrei, da die
Möglichkeit besteht, dass tumorspezifische Antikörper entfernt oder durch normale Gewebekomponenteninaktiviert werden
können, die ähnlich, jedoch nicht identisch sind mit den Tumorantigenen, die ursprünglich die Antikörperbildung anregten':
Zur Illustrierung der immunologischen Toleranztechnik kann Adenocarzinomgewebe aus Tumoren des Colons und
normales Colongewebe desselben Individuums verwendet werden, weil sich ein Coloncarzinom im allgemeinen praktisch niemals
submukös mehr als 6 bis 7 cm auf jeder Seite eines sichtbaren Tumors ausdehnt.
Das Tumorgewebe des Colonadenocarzinoms und normales Colongewebe des gleichen Idividuums werden zwar getrennt j
jedoch in gleicher Weise behandelt. Das Gewebe wird gemahlen, in einem Puffer suspendiert und dann homogenisiert. Aus dem
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Homogenat werden dann feste Teilchen, die grosser als 0,22 μ
sind und worunter auch alle Bakterien fallen, entfernt. Dies geschieht vorzugsweise durch Zentrifugieren oder Filtrieren
durch allmählich kleiner werdende Filteröffnungen. Es wird hiermit eine Sterilisierung des Ueberstandes oder Filtrates
erreicht.
In geeignete Gruppen eingeteilte Versuchstiere werden dann mit den Extrakten immunisiert. Nach einem geeigneten
ZeltIntervall entnimmt man den Tieren ein Serum. Das Vorliegen
von Antikörpern in den Testseren kann entweder durch die . Ouchterlony-Technik der zweidimensionalen Agargeldiffusion,
durch Immunoelektrophorese, Hämagglutinationsreaktionen oder durch passive kutane Anaphylaxie bewiesen werden. Bevorzugt
in der Praxis, ist wegen ihrer Einfachheit und ihrer reproduzierbareii. Ergebnisse die Ouchterlony-Technik.
Ist die Anwesenheit von Antikörpern einmal bewiesen, dann ist es möglich, eine besondere Extraktionsmethode auszuarbeiten,
die es gestattet, eine Fraktion zu isolieren, die carcinoembryonisches Antigenmaterial, Komponente A oder
Komponente B,enthält.
Es wurde nun eine Extraktions- und Reinigungsmethode entwickelt, die schliesslich zwei getrennte Fraktionen liefert,
von denen jede stets, eine einzige Präzipitationslinie bei Anwendung der Ouchterlony-Technik liefert, wenn sie gegen
nicht absorbierte Antiseren geprüft wird. Die erfindungsgemasse
Methode gibt auch ein Mittel an die Hand, mit Hilfe dessen die Komponenten A und B von CEA sowohl voneinander
als auch von Material mit dem gleichen Molekulargewicht getrennt und in im wesentlichen reiner Form erhalten 'werden können.
Das carcinoembryonale Antigenmaterial bzw. die Komponenten A und B, werden nach der bevorzugten AusfUhrungs-
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form der Erfindung aus primärem,oder metastatischem Carzinomgeweb.e
isoliert und gereinigt. Erfindungsgemäss kann man das carcinoembryonale Material sowie die Komponenten A und B
aber auch aus embryonalen Verdauungsorganen von Föten im zweiten bis siebenten Schwangerschaftsmonat und aus Meconium
isolieren und reinigen. Die folgende Beschreibung bezieht sich in der Hauptsache auf die Extraktion aus Krebsgewebe,
jedoch kann das Verfahren ebensogut auf embryonisches Gewebe oder auf Meconium übertragen werden.
Carcinoembryonales Antigenmaterial, bzw. Komponente A oder B in embryonischem Verdauungsorgangewebe des ersten
und zweiten Trimesters, Meconium oder Adenocarcinomgewebe, wird mit einem Glycoprotein-Lösungsmittel, in dem CEA
und die Komponenten A und B löslich sind, extrahiert. Dies ist erforderlich, damit präzipitierbare normale Proteine
und störende antigenische Materialien vom CEA-Material oder den Komponenten A und B abgetrennt werden können. Hierfür
geeignete Glycoprotein-Lösungsmittel sind z.B. Perchlorsäure, Trichloressigsäure, Phosphorwolframsäure und dgl.,
wobei Perchlorsäure bevorzugt wird.
Vor dem Zusatz des Glycoprotein-Lösungsmittelswird
das zu behandelnde Material in Wasser homogenisiert, um das CEA-Material oder die KomponentenA und/oder B zu solubilisieren.
Es sollte eine zur Solubilisierung des gesamten CEA-Materials bzw. der KomponentenA und/oder B ausreichende
Menge Wasser verwendet werden. Im allgemeinen ist eine Menge von etwa 2 Liter Wasser pro kg zu behandelnde.m Material ausreichend.
Eine grössere Menge Wasser ist im allgemeinen nicht notwendig. Vorzugsweise wird destilliertes Wasser verwendet,
da damit die Gefahren einer Kontamination herabgesetzt werden. Die Homogenisierung kann bei Temperaturen von etwa 4° bis
etwa 6O°C, vorzugsweise bei Temperaturen von etwa 4° bis etwa
Raumtemperatur (2O-25°C), vorgenommen werden. ·
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Aus dem Homogenat, das das CEA-Material bzw. die
Komponenten A und B in gelöster Form enthalt, werden alle festen Partikel entfernt. Dies kann nach einem der bekannten
Verfahren erfolgen, beispielsweise durch Filtration, Zentrifugieren
oder ähnliches,. Zur Abtrennung wird Zentrifugieren bevorzugt, da dies schnell geht, im allgemeinen mit etwa JOOO 8000
Umdrehungen pro Minute. Um einen Aktivitätsverlust zu vermeiden, wird vorzugsweise bei niedrigen Temperaturen,
etwa bei 4-100C getrennt. Bei diesen Temperaturen nimmt auch
die Sedimentationsgeschwindigkeit zu. Der Ueberstand wird dann mit einem Glycoprotein-Lösungsmittel zwecks Entfernung
von Proteinen und störenden antigenischen Materialien behandelt.
Jede Temperatur von Raumtemperatur und darunter ist für die Zugabe des Glycoprotein-Lösungsmittels zum Ueberstand
des Homogenates geeignet. Vorzugsweise jedoch arbeitet man bei einer Temperatur von 4°C bis etwa Raumtemperatur.
Die Temperatur des Glycoprotein-Lösungsmittels, das dem Ueberstand zugefügt wird, kann ebenfalls variieren, jedoch
wird auch hier vorzugsweise die gleiche Temperatur wie bei der Extraktion angewandt. Als Glycoprotein-Lösungsmittel
wird im allgemeinen eine konzentrierte Säure, beispielsweise mit einer Normalität ν cn etwa 0,5-2, vorzugsweise 2 verwendet. Dem Ueberstand
wird zweckmässigerwelse innerhalb von etwa J50 Minuten
die etwa gleiche Volumenmenge Lösungsmittel zugefügt. Ein langsamerer Zusatz kann zum Verlust der Antigenwirksamkeit
führen.
Man erhält ein Präzipitat. Das Präzipitat wird vom Ueberstand, der gelöstes CEA-Material bzw. die Komponenten
A und/oder B enthält, nach einer der üblichen Trennungsmethoden, ζ. ·Β·. Filtration oder Zentrifugieren, vorzugsweise durch
Zentrifugieren, nach den bereits oben beschriebenen Methoden abgetrennt.
109850/ 1847
Zur weiteren Reinigung, d.h. zur Entfernung von niedermolekularen
Substanzen, wie Perchlorsäure oder Salzen, wie Natriumchlorid, hat sich die Dialyse gegen Polyathylenglykol
mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 15 000 - 20
und einem Erweichungspunkt von 6O0CaIs am geeignesten erwiesen. Ein für diese Dialyse geeignetes Handelsprodukt ist
2OM Carbowachs der Firma Mann Research Laboratories. Die Dialyse ist ein kritischer Teil des Verfahrens, da durch sie
alle diffusionsfähigen löslichen Substanzen mit Ausnahme der
Substanzen von höherem Molekulargewicht, wozu auch die CEA-Fraktion
gehört, entfernt werden. Die Dialyse kann bei Tem-" peraturen von 4 bis 10°C, vorzugsweise bei 4 0C durchgeführt
werden und dauert etwa 18 Stunden. Das gesammte Verfahren bis zu diesem Punkt nürmt etwa 24 Stunden in Anspruch.
Die Verwendung von Polyathylenglykol mit einem Molekulargewicht von 15 000 bis 20 000 in der Dialyse ist ein
kritisches Merkmal der Erfindung, da dadurch eine schnellere Isolierung des CEA-Materials bzw. der Komponenten A und/oder
B erreicht wird. Durch die einmalige Dialyse unter Verwendung von Polyathylenglykol wird eine mehrfache Dialyse
gegen Wasser sowie die Notwendigkeit der Lyophylisierung
κ des Rückstandes vermieden. Der erhaltene Rückstand hat überwiegend
festen Charakter und enthält verschiedene Verbindungen mit sowohl höherem wie niedrigerem Molekulargewicht als das
CEA-Material bzw. die Konponenten A und/oder B.
Die Abtrennung des CEA-Materials bzw. der Komponenten A und/oder B aus dem erhaltenen Rückstand kann erfindungsgemäss
durch subsequente Chromatographie an 2 verschiedenen Gelsäulen und anschliessende Chromatographie an einem Ionenaustauscher
erfolgen. Diejenigen Fraktionen der nach Durchführung der Säulenchromatographie erhaltenen Eluate, die
ein Molekulargewicht von etwa 200 000 - 500 000 und ein definiertes Absorptionsmaximum bei 280 nni aufweisen, enthalten
.109850/1847
das„ CEA-Material bzw. die Komponenten A und/oder B.
Die Säulenchromatographie kann in der Weise erfolgen, dass man den gelösten Rückstand der subsequenten Säulenchromatographie
an zwei verschiedenen Gelen in beliebiger Reihenfolge unterwirft. Ausgehend vom Carzinomgewebe,' wird
man jedoch zweckmässigerweis'e so vorgehen, dass man zunächst eine Agarosegelsäule verwendet. Agarose ist der neutrale
Anteil von Agar. Das Gel ist unter dem Warenzeichen Sepharose der Firma AB Pharmacia, Uppsala, Schweden im Handel erhältlich
und zwar in Form von wässrigen Suspensionen in 0,02^-iger Natriumazidlösung als Schutzmittel. Die Struktur des Gels
beruht auf Wasserstoff-BrUckenbindungen. Die Eigenschaften
des Gels werden bestimmt durch die Partikelgrösse und den
Anteil an Agarose, wobei dieser Agaroseanteil den Fraktionierungsbereich des Gels bestimmt.
Die erfindungsgemäss geeigneten Gele sind diejenigen
mit einer Teilchengrösse von 4o bis 210 μ und 6 Gewichtsprozent
Agarose. Dieses Material, genannt "Sepharose βΒ"
hat einen solchen Fraktionierungsbereich* dassVerbindungen
mit einem Molekulargewicht von 4 χ 10 oder weniger abgetrennt
werden. Sepharose βΒ wird darum erfindungsgemäss verwendet,
weil es die Atitennung von CEA-Material bzw. der Komponenten A und/oder B aus Carzinomgewebe von fremden
Komponenten mit wesentlich höherem oder niedrigerem Molekulargewicht sowie von Koloidpartikeln erlaubt. .
Die zweite Säule enthält ein hydrophiles wasserunlösliches quervernetztes Dextrangel. Dieses Material und die
Methode zu seiner Herstellung sind im britischen Patent No. 854 715 beschrieben. Dieses Gelmaterial, das unter dem Namen
"Sephadex" der Firma AB Pharmacia, Uppsala, Schweden, im Handel erhältlich ist,,besteht aus einem dreidimensionalen
makroskopischen Netzwerk von quervernetzten oder gebundenen
109850/184 7
Dextransubstanzen, das unter Quellung Wasser absorbieren kann.
Die Fähigkeit der Wasseraufnähme des Gels ist umgekehrt
proportional dem Quervernetzungsgrad der Dextransubstanzen.
Es sind verschiedene Sorten des Gelmaterials mit unterschiedlichem Porositätsgrad erhältlich. Das bei der erflndungsgemässen
Verwendung bevorzugte Gel hat eine annähernde Ausschlussgrenze von 100 000, ein Wasserretentionsvermögen
von 10 - 1,0 g HpO/g trockenes Gel, eine Teilehengrösse
von 40-120 μ und ein Bettvolumen von 15 bis 20 ml/g
trockenes Gel, Dieses Gel trägt die Bezeichnung "Sephadex
G-IOO".
Sephadex G-IOO wird zu weiteren Reinigung der das CEA-Material bzw. die Komponente A oder Komponente B enthaltenden
Fraktion verwendet. Da die Sephadex G-100-Säule ein grösseres Auftrennungsvermögen für den Molekulargewichtsbereich von 100 000 - 200 000 als die Agarosegelsäule aufweist
,wird eine weitere Abtrennung von CEA-Materlal bzw.
der Komponenten A oder B von Verbindungen mit niedrigerem Molekulargewicht erreicht. Die zweite Säule sollte nur verwendet
werden, nachdem die kolloidalen Teilchen durch die erste Säule entfernt worden sind, da diese Teile die Sephadexsäule
sonst verstopfen und sie unwirksam machen würden. Das gilt vor allem für die Behandlung von Tumorgewebe. Wird hingegen
von Meconium ausgegangen, dann ist es zweckmässig ,zuerst
die Sephadex G-100-Säule zu verwenden ,da diese Salze von
Gallensäuren entfernt. Nach Entfernung dieser Salze wird vorteilhaft
erweise die Sepharose 6B-Säule verwendet.
Die Chromatographie wird zweckmässigerweise so ausgeführt, dass man den Rückstand in einem wässrigen Puffer
bei einem pH-Wert von etwa 5 bis 9* vorzugsweise bei pH 7/
löst, Eine_typischer,für das erfindungsgemässe Verfahren geeigneter Puffer besteht aus einer Lösung von 0,1 m Tris-OH
in 0,135 m NaCl mit 0,02$ Natriumazid als Schutzmittel und mit
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HCl auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Die mit diesem Puffer von der ersten Säule eluierten Fraktionen, die CEA-Aktivität
aufweisen, werden vereinigt und dann gegen Polyäthylenglykol,
•wie oben beschrieben,dialysiert. Der Rückstand wird dann
nochmals in dem wässrigen Tris-OH-Puffer vom pH 5 bis 9,
der gleichen Zusammensetzung wie bereits oben beschrieben, gelöst, die Lösung wird über die zweite Säule gegeben und
die mit dem Puffer eluierten Fraktionen, die"GEA-Aktivität
•aufweisen, werden gesammelt und,wie oben beschrieben,dialysiert.
Der Vorteil des Arbeitensbei tiefen Temperaturen ,d.h.
bei etwa 4 bis 1O°C, ist der, dass Stabilität gewährleistet ist und dass eine grössere Trennschärfe erreicht wird. Es
werden diejenigen Fraktionen des Eluats der zweiten Säule gesammelt, die ein Molekulargewicht von. 20.0 000 bis 500
und ein Absorptionsmaximum bei 280 nm aufweisen. Aus dem Eluat der ersten Säule wurden ebenfalls diejenigen Fraktionen,
die diese Kriterien erfüllen, gesammelt, obgleich sie auch noch Material mit höherem und geringerem Molekulargewicht (bis
hinunter zu einem Molekulargewicht von 70 000) enthielten. Die gesammelten Fraktionen enthalten je nach Herkunft des
Ausgangsmaterials das CEA-Material bzw. die Komponenten A oder B, was entweder durch die Präzipitininhibition oder
direkt durch Ouchterlony-Prüfung gegen nicht absorbiertes
Tumorserum bewiesen werden kann. Eine einzige Präzipitationslinie zeigt reine CEA-Aktivität an.
Die nach der Gelchromatographie erhaltene Fraktion wird dann zwecks weiterer Reinigung und Fraktionierung der
Chromatographie an einer Ionenaustauschersäule unterworfen. Es hat sich herausgestellt, dass in den meisten Fällen, bei
denen von Adenocarcinomgewebe des Colons ausgegangen wurde, die die CEA-Aktivität enthaltende Fraktion drei verschiedene
Komponentenenthält (in einigen Fällen allerdings wurde auch
nur die Komponente A oder die Komponente B gefunden), die alle
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ein Molekulargewicht zwischen etwa 200 000 und 500 000 besitzen.
Eine dieser Komponenten, sie macht 5 Gew.$ der
Fraktion aus, ist nicht reaktionsfähig. Die zweite Komponente, sie macht etwa 10 Gew.^ der Fraktion aus, besitzt antigenisch
wirksame Stellen, die mit dem CEA-spezifischen Antikörper reagieren und wurde hier als Komponente B von CEA
identifiziert. Die dritte Komponente, die etwa 85 "Gew.^
der Fraktion ausmacht, hat ebenfalls antigenisch wirksame Stellen ,die mit dem CEA-spezifischen Antikörper reagieren
und wurde hier als Komponente A von CEA identifiziert.
fe Es wurde ferner festgestellt, dass je nach Ausgangsmaterial
,z.B. aus Meconium, Lungen-oder Brusttumoren, unterschiedliche
Gewichtsverhältnisse der einzelnen Komponenten vorliegen und dass diese generell von Patient zu Patient und
von Tumor zu Tumor variieren. Meconium z.B. weist nur die Komponente B auf.
Um die reinen Komponenten der CEA-Aktivität zu erhalten
ist die Verwendung einer Ionenaustauschersäule nötig. Wenn nur eine Komponente vorliegt, dient diese Ionenaustauschersäule
lediglich zu deren Reinigung und Bestätigung dieses Sachverhaltens. .
Das für die gewünschte Trennung geeignete Ionenaustauschermaterial
ist ein Gemisch aus einem Kationenaustauscher,z.B. Carboxymethylcellulose, und einem Anionenaustauscher,
z.B. Diäthylaminoathylcellulose. Am geeignetsten für
die Ausführung der vorliegenden Erfindung ist eine Carboxymethylcellulose in mikrogranularer Form, mit einer Teilchengrösse
von etwa 20 bis όθμ, einer Kapazität von 1,0 - 0,1
mÄequiv./g und einem Wasserretentionsvermögen von 2,^ bis
2,7 g/g Trockensubstanz. Die bevorzugte Form ist die Natriumform. Ein geeigneter Ionenaustauscher ist, unter dem Warenzeichen
11CM 52" der Firma H. Reeve Angel Inc., Clifton, New
1 098 50/ 1 8 Λ 7
Jersey, in vorgequollenem Zustand im Handel erhältlich.
Eine andere geeignete Carboxymethylcellulose ist "CM 32", ebenfalls erhältlich von der Firma H, Reeve Angel
Inc., Clifton, New Jersey. Dieser Austauscher unterscheidet sich von"CM 52"durch eine andere Kapazität pro Volumen;
er ist ähnlich in der Teilch'engrösse, der Kapazität pro Gramm und dem Wasserretentionsvermögen.
Die erfindungsgemäss geeignete Diäthylaminoäthylcellulose
ist eine solche von mikrogranularer Form mit einer Teilchengrösse von etwa 20 bis 6θμ, einer Kapazität
von i,0 - 0,1 mAequiv./g und einem Wasserretentionsvermögen von 2,3 - 2,8 g/g Trockensubstanz in der freien basischen
Form. Ein solcher Austauscher ist beispielsweise unter dem Warenzeichen "DE 52" der Firma H. Reeve Angel Inc., Clifton,
New. Jersey im Handel erhältlich.
Die Mischbettsäule wird dadurch hergestellt, dass man die feinsten Artikel aus beiden Austauscherharzen in üblicher
Weise entfernt, jedem Harz eine Lösung aus Ammoniumacetat in 1,2 m Natriumchlorid zufügt und gleiche Volumina der
entstehenden Aufschlämmungen vermischt und in eine Säule mit
den Dimensionen 2,5 χ 4θ cm füllt, sodass ein Bett von
2,5 χ 18 cm entsteht.
Das Eluat der Gelsäulen wird gegen Polyäthylenglykol,
wie oben beschrieben, dialysiert und das erhaltene Material dann in einem wässrigen gepufferten Lösungsmittel, das Proteine
löst aber keine Affinität für die Säule aufweist gelöst.Ein typisches
geeignetes Lösungsmittel ist eine Ammoniumacetatlösung vom pH-Wert 4, die aus 0,1 m Essigsäure und aus Ammoniumhydroxyd
hergestellt werden kann.
Die erhaltene Lösung wird dann geklärt, vorzugsweise
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2126880
durch Zentrifugieren, wodurch alle nicht gelösten. Teilchen
entfernt werden. Besonders geeignet ist Üitrazentrifugieren mit solchen Geschwindigkeiten,· dass mindestens die 100 ÖOO-fache
Erdbeschleunigung erreicht wird.
Der resultierende Üeberstand wird auf die Mischbett-Ionenaustauschersäule
gegeben Und mit einer Arnmoniumacetat-Natriumchlorid-Lösung vom pH 4 eluiert. Andere Alkalimetallchloride
,wie beispielsweise Kaliumchlorid^ind ebenfalls geeignet. Es wird im Sinne einer diskontinuierlichen Gradient- elution
gearbeitet, wobei Lösungen von Ämmoniumacetat in 0,05, 0,1, 0,25 und 1,0 m Natriumchlorid verwendet werden.
Wie bereits oben erwähnt,variiert das Verhältnis der einzelnen
Komponenten mit CEA-Aktivität entsprechend dem Herkommen. Beispielsweise werden in einem typischen Fall, in dem Coloncarzinom
die Quelle der Antigenaktivität ist, etwa 85 Gew.%
des Materials mit CEA-Aktivität mit einer Lösung von Ammoniumaoetat
in 0,05 rä Natriumchlorid eluiert-etwa 10 Gew.$ des
Materials mit CEA-Aktivität werden mit einer Lösung von Ammoniumacetat
in 0,1 m Natriumchlorid eluiert (Komponente B). Das restliche Material wird mit Ammoniumacetat in 0,25 m Natriumchloridlösung
eluiert. In denjenigen Fällen, in denen nur die Komponente A oder die Komponente B anwesend ist, werden diese
mit denjenigen Elutionsmitteln eluiert,, die auch nötig sind,
um die entsprechenden Komponenten aus dem Gemisch zu eluieren.
Charakteristische Daten der Komponente A von CEA sind: Molekulargewicht zwischen 120 000 und 2l\Q 000; gleiches
elektrophoretisches Verhalten wie CEA, d.h. wenn bei Verwendung eines Boratpuffers vom pH Wert 8,6 und einer Ionenstärke
von 0,05, bei 2JOO Volt und etwa 20 mA Ferritin als
Standard 18 cm anodisch wandert, wandert die Komponente A 10-Ί4 cm anodisch; Elution von einer Mischbett-Ionenaus-
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/15
tauschersäule der .oben beschriebenen Zusammensetzung mit
einem Ammoniumacetat-Natriumchlorid-Losungsmittel vom pH Wert 4(Ammoniumacetat in 0,05 m Natriumchloridlösung)j
Absorptionsmaximum bei 280' nm; Löslichkeit in Perchlorsäure und Bildung einer einzigen Präzipitationslinie
mit seinem spezifischen Antikörper in nicht absorbiertem Antiserum im Geldiffusionstest.
Die Komponente B von CEA hat die folgenden charakteristischen
Eigenschaften: Molekulargewicht zwischen 120 und 240 000; gleiche elektrophoretische Eigenschaften wie
CEA; Absorptionsmaximum bei 280 nm; Löslichkeit in Perchlorsäure;
Elution aus einer Mischbett-Ionenaustauschersäule der oben beschriebenen Zusammensetzung mit einer Ammoniumazetat-Natriumchloridlösung
vom pH-Wert 4 (Ammoniumacetat in 0,1 m Natriumchlorid) und Bildung einer
einzigen Präzipitationslinie mit seinem spezifischen Antikörper in nicht absorbiertem Antiserum in Geldiffusionstests.
Das CEA Material oder seine Komponenten A oder B werden entweder durch die PrazipitinJriiiibition oder direkt
durch Ouchterlcny-PrUfung gegen nicht absorbiertes Tumorantiserum bestimmt. Eine einzige Präzipitationslinie ist
ein Indiz für reine CEA"Aktivität. Hieraus folgt also, dass
jedes Material, das eine einzige Präzipitationslinie mit nicht absorbiertem CEA Antiserum entweder bei der Präzipitininhibition
oder in der direkten Ouchterlony-Prüfung der zweidimensionalen
Agargeldiffusion liefert, unter die Erfindung
fällt und damit geeignet ist, in dem diagnostischen Test, wie hiervor beschrieben ",verwendet zu werden.
Um die genannten Techniken der Präzipitininhibition
oder Ouchterlcny-PrUfung anwenden zu können,muss gesichert sein,dassdie verwendeten Antikörper spezifisch für CEA-Material
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" - - 11266SE)
Ab
bzw. 4is Komponenten A iin4/pder B sind. Antikörper 4ie digse;
Bedingungen erfüllen, können 4"41^Ph immunologische Toleranz-
oder £bsor,ptipnsteeliniken, wie bereits beschrieben, gewonnen
wer4en.
iintep Anwendung dieser fechniken wurde gefunden, dass
wenn OEA-Material vorhanden ist, die Komponenten A und B,
die vom iyiis.phlaett-JonenaustajisGher erhalten werden, praktisch
die gesagte GgA-Aktivität, 4ie vorhanden ist, enthalten. p|e
flip die Anwendung im fladipimniunoassay von CJ5Ä bevorzugte
ϊζρπφρηβηίλβ ist Kpipponente Bf jedoch können auch das ,CEA-fe
Material 94er die Koinponente A rnit Erfolg angewendet werden.
pie vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die
Entwicklung von iiadipifnrnunoassay-JviethQden, die einfach auszuführen
sind und einen hohen Grad der Reprpdμzierbarkeit und
Spezifität aufweisen.
Bei Radioinimunpassayr-l^ethoden ist es wichtig, dass 4.as
radioaktive Atom init dem zu kennzeichnenden Molekül hinreichend
reagiert, um eine entsprechende Intensität der Radioaktivität für die Bestimmung zu schaffen, und dass das
radioaktive Atom eine hinreichend grosse Zerfallsrate be-" sitzt ,um eine ausreichende Empfindlichkeit und Genauigkeit
der Bestimmung zu gewährleisten. Weiterhin darf im Fall des Radioimmunpassays von Antigenen die Antigenwirksamkeit durch
die Bindung des radioaktiven Atoms an das Antigen nicht beeinträchtigt werden.
Mittels der vorliegenden Erfindung ist es nun möglieh,
die Existenz menschlicher Garzinome dadurch festzustellen, dass man prüft? ob ein tumorspezifisches Antigen im Organismus
zirkuliert. Die vorliegende Erfindung erlaubt den Nachweis von mindestens 1 ng von CEA-Material bzw. der Komponenten A
oder B pro ml Serum oder Plasma. Diese Empfindlichkeit reicht '"■ 109 8 Π0/1.8 A7
aus,um abnorme Mengen von CEA-Aktivitat zu erfassen. Geringere
Mengen, beispielsweise unter 0,05 ng CEA-Aktivltät pro ml können unter normalen Bedingungen vorliegen. Die Empfindlichkeit
der Methode wird nur durch die spezifische Aktivität des radioaktiven Atoms begrenzt.
Das carcinoembryonale.' Aktivität aufweisende Material kann mit solchen radioaktiven Atomen markiert werden, die
mit reaktiven Gruppen des Moleküls chemisch reagieren und die Antigenspezifität nicht wesentlich he;
sich als besonders geeignet erwiesen.
125 Antigenspezifität nicht wesentlich herabsetzen. Jod hat
Die Radiojodierung des die carclnoenibryonale Aktivität
aufweisenden Materials kann mittels bekannter Verfahren
unter Ejnsdiluss geringer Modifikationen bezüglich der Konzentrationen
und Volumina, erfolgen. Die "Chloramin T-Methode"
von Hunter und Greenwood (Biochem. J. 91* 46 {1964]), bei
125
der ^ Jod benutzt wird, ist besonders vorteilhaft; die Jodierung erfolgt hier mit 20-50$iger Ausbeute. Die Radiojodierung kann sowohl auf das isolierte und gereinigte CEA Material vor -der Fraktionierung in die Komponenten A und B als auch auf"ir<ä-ie einzelnen Komponenten selbst angewandt werden. Bevorzugt' itiif:Bahmen dieser Erfindung ist jedoch die Verwendung der Komponente B-.
der ^ Jod benutzt wird, ist besonders vorteilhaft; die Jodierung erfolgt hier mit 20-50$iger Ausbeute. Die Radiojodierung kann sowohl auf das isolierte und gereinigte CEA Material vor -der Fraktionierung in die Komponenten A und B als auch auf"ir<ä-ie einzelnen Komponenten selbst angewandt werden. Bevorzugt' itiif:Bahmen dieser Erfindung ist jedoch die Verwendung der Komponente B-.
Die Reaktion wird ausgeführt, beispielsweise unter
Verwendung eines Gemisches ,das 100 /xg Chloramin T, das ist
Na[P-CH-C6H^-SO2NCl), 0,025-0,4 mg CEA-Material bzw.
einer der Komponenten A oder B und 4 mCi ^^5jod
in der Form von Kaliumjodid oder Natriumiodid enthält. Die
Reaktion verläuft bei Raumtemperatur in etwa 1 Minute und wird" vorteilhaft durch Zugabe von Natrium- oder Kaliummetabisulfit
unterbrochen. Die Funktion des Chloramin T ist das Jodid zum Jöd zu oxidieren, während das Metabisulfit nicht
- 125
umgesetztes -Jod zum Jödid reduziert. Man kann auch andere
umgesetztes -Jod zum Jödid reduziert. Man kann auch andere
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Oxydations- und Reduktionsmittel verwenden, doch darf durch
sie das CEA-Material oder seine Komponenten nicht geschädigt
werden. Das Produkt kann durch Chromatographie an einer Säule . mit einem vernetzten Dextrangel, z.B. "Sephadex G-IOO", gereinigt werden. Das,erhaltene Produkt hat eine spezifische
Aktivität von etwa 1000 - 25 000, -vorzugsweise von etwa~10 000 ■.-bis
20 000 Impulsen pro Minute und ng, d.h. etwa 5-10 Ci/g.
Um den Erfolg der erfindungsgemässen Diagnosenmethode
zu gewährleisten, muss dafür gesorgt sein, dass das Blut des fc Patienten in einer Weise behandelt wird, die gewährleistet,
dass das careinoembryonale Antigenmaterial ohne .
störende Komponenten sehliesslieh in dem verwendeten
Serum oder Plasma vorliegt. Dies kann dadurch erreicht werden,
dass man das Blutserum oder-plasma des Patienten mit einem
Glykoprotein-Lösungsmitte^,r d^s^, das CEA-Material, bzw. dLe Komponenten
A oder B, löst und die erhaltene Lösung klärt. Es hat sich gezeigt das sowohl Blutserum wie auch Blutplasma für,
die Untersuchung geeignet sind obwohl Blutplasma bevorzugt ist.
Das für dieses Verfahren geeignete Glykoprotein-Lösungsmittel
ist Perchlorsäure, vorzugsweise 1,2 m Perchlorsäure oder " eine solche Menge, dass eine Endkonzentration von etwa 0,6 m
oder darunter erreicht wird, Die erhaltene Lösung wird dann, vorzugsweise durch Zentrifugieren,, geklärt. Der Ueberstand wird
gesammelt und zunächst gegen destilliertes Wasser, dann gegen gepuffertes Wasser (pH 6 -6,25, Ammoniumacetat mit 0,01 m
Acetat) dialysiert. Dies nimmt gewöhnlich etv/a 6-10 Stunden
in Anspruch. Der Rückstand der Dialyse kann dann durch Lyophylisierung
getrocknet werden, ohne dass dieser Schritt wesentlich' wäre. Durch Anwendung dieser Methode erhält man einen
gereinigten Extrakt mit einem Gehalt von über 95$ des im Ausgangsmaterial
vorhandenen CEA-Materialsbzw. der Komponenten A
und/oder "B."" ·
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Es ist wesentlich für das "Verfahren* dass 4er Extrakt
Wie beschrieben behandelt, wird, da das Glykoprotein-Läsungsmittel,
das das GEA Material , bzw. die Komponenten A und/odep
B löst, anfangs, vorhandene GEÄ-anti-CEA-Komplexe spaltet
und die antigeniseh wirksamen Stellen im Jodserum oder -plasma des Patienten aktiviert,wodurch im wesentlich die gesamte
ursprünglich vorhandene.OEA-Aktivität wiedergefunden wird. Man besetzt hiermit eine Methode zum Nachweis von CEA-Aktivität
bei Patienten mit primären und metastätischen Carzinomen unterschiedlichen Ursprungs.
In einer anderen erfindungsgemässen Ausführurigsform
der Radioimmunoassay-Technik ist es auch möglich, den
Antikörper direkt dem Üeberstand des Extraktes des mit dem Glycoprotein-Lösungsmittel behandelten HLutserums oder -plasmas,
zuzusetzen. Bei dieser Methode können die zeitraubenden pialyseverfahren vermieden werden. Die Methode erlaubt den
Nachweis von CEÄ-Materialj bzw. der Komponenten A und/oder
B, bei Patienten mit Carzinomen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemässen Immunoassay-Technik,
ist es möglich,das Blutserum oder -plasma durch Verdünnung so
zu behandeln, dass seine Ionenstärke herabgesetzt wird, und dann den Antikörper der Verdünnung direkt zuzusetzen.
Die Verdünnung kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass man Wasser oder eine Salzlösung von geringer Ionenstärke in
einem Verhältnis von mindestens 100:1 Volumenteilen dem Blutserum oder -plasma zufügt. Vorzugsweise wird das Blutplasma
verwendet. Im allgemeinen kann jedes Salz verwendet werden, sofern es nicht mit dem anschliessend verwendeten Zirconylphosphat
interferiert. Entsprechende geeignete Salze sind beispielsweise Ammoniumacetat, Natriumchlorid oder Natriumborat
(pH 8,4). Das bevorzugte Salz ist Ammoniumacetat in p'ner Konzentration von 0,01 m oder darunter. Wichtig bei
der Verwendung von Salzlösungen als Verdünnungsmitteln ist, dass die Molarität genügend niedrig ist, um eine Veringerung der
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I12I6SQ
io.nen^fcgrk;e 4£S .Serums, odjsr Plasmjas, in einem, solchen Gfrad
zu erreichen! da!§s. disf antigenisch wirksamen Stellen aktiviert
I)a jä.iige Methode unfegr. Umgehung der Dialy§.esehritte
wird,, ist sis nicht sehr zeitraubend und
tup ein erstes "scpeeninj;» ziuir Entdeckung von
freier zirkulierender ÖIA-Aktivität·
die wirkungsvolle Durchführung des RadiQirjimunoassays
igt es. ferner erforderlioli, dasjs Antikörper vorhanden
L·' sijidi die spezifisoh sind für das ÖBA-Material bzv/. die
. A und/pder B. Dies wird durch jBimunisierung von Tieren
depj gereiiiigten CEA-Material oder einer der Kojuponenten
in Üblicher Weise und wie beispielsweise ±m fpignden beschrieben,
erreicht,
Sin Emuljgierrnitteli z.B. komplettes Freund1 sches
'Adjuvans * wird einer Lösung des GlA-Materials od.er einer der
KQiTjpQnenten in einer Salzlösung zugefügt. 'Die Emulsion kann
bei Tieren intramuskulär in den Fussballen und/oder subcutan
indiziert werden. Geeignete Tiere sind z.B. Geflügel, Kaninchenj Pferde, Ziegen oder Schafe. Bei Kaninchen werden
Ψ z.B. wöchentlich 2-5 Injektionen vorgenommen. Nach der letzten
Injektion wird dem Tier Blut entnommen. Das Serum aus diesem Blut ist nicht absorbiertes CEA-Antiserum.
Gemäss einer Methode werden 4θΟ ptg des CEA-Materials
bzw. einer der Komponenten in 1 ml 0,9^iger Salzlösung verwendet.
Der im Antiserum vorhandene Antikö'per ist nach Absorption
an normalen. Gewebebestandteilen spezifisch gegen CEA-Material
bzw. die Komponenten A und/oder B.
Bei der Ausführung des Radioimmunoassays von CEA
können beide Techniken, sowohl die der Isotopenverdünnunc
1 Π 9 8 E Π / 1 8 4 7
als auch die der kompetitiven Hemmung verwendet werden.
Die Methode der kompetitiven Hemmung ist jedoch die im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugte. Bei beiden Methoden
wird zunächst eine Titrationskurve und dann eine Standard-Xnhibitionskurve
erhalten.
Die Standard-Inhibitionskurve kann nach der Farr-Methode
erhalten werden. Sie ist ein Mass fur die Komplexbildung mit den spezifischen Antikörpern. Die Kurve gibt die
pro Einheit des Serums vorhandene Menge CEA-Material bzw. der Komponenten A und/oder B an. Es werden ng/ml gemessen,
die gegen einen bekannten Prozentsatz von radioaktiv markiertem CEA-Material bzw. markierter Komponente A oder B aufgetragen
werden/ Die erhaltene Kurve dient zur Bestimmung der im Blutserum des Patienten vorhandenen Menge an CEA-Material bzw.
der Komponenten A und/oder B.
Nach einer bevorzugten Methode, kann eine Standard-Inhibitionskurve
auch durch die Methode der kompetitiven Hemmung erhalten werden, bei der man Standard-CEA-Material einer
Anzahl von Reagenzgläsern, die gepuderten Perchlorsäureextrakt aus normalem menschlichen Blutserum oder -plasma enthalten,
zuse-fö2t,;. Eine bestimmte Menge von CEA-Antiserum, die
vorgängig mitbsi^-eifier Standard-Verdünnungskurve bestimmt wurde,
wird in Gläsern, die den wie oben^beschrieben erhaltenen
dialysierten Perchlorsäureextrakt von normalem Blutserum oder -plasma oder aber mit einem 0,01 m Ammoniumacetatpuffer
vom pH 6 bis 6,25 verdünntes Blutserum oder -plasma enthalten,
zugesetzt. Bei der Alternativmethode, bei der die Testflüssigkeit verdünnt wird, sollte die maximale Normalität des
Puffers nicht grosser als 0,01 sein; niedrigere Normalitäten indessen sind erlaubt.
Die erhaltenen Lösungen werden bei etwa 45°C während einer ausreichend langen Zeit, im allgemeinen während 30-45
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Minuten, inkubiert, bis die Reaktion vollständig ist. Dann
wird eine definierte Menge von radiojodiertem CEA-Material...:.
bzw. radiojodierter Komponente A oder B jedem der Gläser zugesetzt. Es wird dann nochmals etwa 30 Minuten bei etwa
45°C inkubiert. Nach Beendigung der Inkubation wird ein
Fällungsmittel, das den Antikörper und die Ant.igen-An.tikörperkomplexe;nicht
aber das Antigen fällt, vorzugsweise ein Zirkonylphosphatgel,der Lösung zugesetzt, um die an
CEA-Material bzw. die KomponentenA und/oder B gebundenen
Antikörper· zu copräzipitieren.
Unter den obigen Bedingungen bleibt freies CEA-Material, Komponente A und/oder Komponente B in Lösung.
125
Es wird dann der Jod-Gehalt des Präzipitats oder des lieber Standes bestimmt; die Menge des' vorhandenen CEA-Materials, und der Komponente A und/oder B im Blutserum oder -plasma wird dann durch Vergleich mit einem Standard festgestellt.
Es wird dann der Jod-Gehalt des Präzipitats oder des lieber Standes bestimmt; die Menge des' vorhandenen CEA-Materials, und der Komponente A und/oder B im Blutserum oder -plasma wird dann durch Vergleich mit einem Standard festgestellt.
Der in der gleichen Art wie beim Standard-CEA-Material
der Komponente A und/oder Komponente B durchgeführte Radio-
Ρθιγ
immunoassay der gepulvertenNphlorsäureextrakte von Blutserum
oder -plasma, liefert Ergebnisse über die vorhandene Menge von CEA-Material bzw. der Komponenten A und/oder B
im Blut des Patienten, die wiederum Rückschlüsse auf die Anoder Abwesenhej t von Carzinomen beim Patienten zulassen.
Die Isotopenverdünnungsmethode ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine bestimmte Menge von markiertem CEA-Material
,bzw. markierter Komponente A oder B ,einem Perchlor
säureextrakt von Blutserum oder Blutplasma zusetzt, der
dann dialysiert wird. Der Extrakt wird dann neutralisiert, beispielsweise mit MaOH,und eine definierte Menge von Antikörpern
wird zugesetzt. Das Gemisch wird dann gegen PoIyäthylenglykol,wie
oben beschrieben ,dialysiert. Man löst den Rückstand in einem Borsäurepuffer vom pH 6>25* setzt der
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2116815
Lösung Zirkonylphosphatgel zu, zentrifugiert; lffid bestimmt
im Niederschlag die Radioaktivität,
Pie bevorzugte Methode der kompetitiven Inhibition wie oben begehrieben, ist dadurch gekennzeichnet:, dass rap
den festen Perehlorsäureextrakt des piutserurns oder Blutplasmas
in einem geeigneten gepufferten Lösunggniittel bei
einem pH Wert von 5-8, vorzugsweise von 6,25, löst. Jeder
der üblichen Puffer,wie beispielsweise ein Phosphatpuffer,
ist geeignet. Es hat sich jedoch herausgestellt, das Borsäurepuffer
besonders geeignet sind. Diese Tatsache ist insofern überraschend, als die Anwendung von Boratpuffern mit saurem
pH-Wert im Radioimmunoassay oder in der Isotopenverdünnungsmethode
als nicht geeignet galten. Die Anwendung saurer Bedingungen ist deswegen obligatorisch, weil das ßEA-Material
bzw. die Komponenten A und B im neutralen oder alkalischen pH-Bereich nicht hinreichend stabil sind und damit auch ihre
antigenischen Eigenschaften verlieren.
Eine definierte Menge von-Antikörpern wird der Lösung
zugesetzt. Eine geeignete Menge sind etwa J5Q bis JOO Einheiten;
bevorzugt werden >0 Einheiten zur Bestimmung verwendet.
Die Einheit der CEA-Aktivität ist 1 ng CEA-Material
bzw. die äquivalente Menge an Komponente A oder Komponente B. Die Einheit des Antikörpers ist diejenige Menge, die durch
• 1 ng CEA-Material bzw. die äquivalente Menge der Komponente
A oder Komponente B gebunden wird.
Das erhaltene Gemisch wird dann für etwa 2k Stunden
inkubiert. Danach werden 50 Einheiten von markiertem CEA-
¥' ' erial bzw. einer äquivalenten Mengen der Komponente A oder
B hinzugefügt und das Gemisch wird nochmals etwa 2k Stunden inkubiert. Obgleich etwa 20 bis 500 Einheiten zugesetzt werden
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körinen, beträgt die bevorzugte Menge 20 bis 50 Einheiten.
Wenn im Bluts.er-um oder -plasma GEA-Material bzw. Komponente
A oder Komponente B vorlag, kann die Menge von nicht umgesetztem markiertem GEA-Material bzw. Komponente A oder Komponente B
qualitativ öder quantitativ festgestellt werden. Die Radioaktivität
.des Niederschlages, der nach Zusatz von Zirkonylphosphatgel zu der Lösung durch Zentrifugieren erhalten wurde,
wird bestimmt.
In einer weiteren bevorzugten AusfUhrungsform der
erfindungsgemassen Bestimmung von freiem zirkulierendem CEA-Material bzw. Komponente A oder B wird Blutserum oder
) Blutplasma mit mindestens 100 Vplumenteilen Wasser oder einer
Salzlösung mit geringer Ionenstärke wie oben beschrieben,
verdünnt. Der Lösung werden dann 30 Einheiten von CEA-Antiserum zugefügt und das Gemisch wird bei etwa 45-°C 30-45
Minuten inkubiert. Dann werden 20-5-0.ng von radiojodiertem
CEA-Material oder einer.äquivalenten Menge der Komponente A-
oder B, mit einer spezifischen Aktivität von etwa 10 000 bis 20 000 Impulsen pro Minute und ng,zugesetzt. Das Gemisch
wird etwa 30 Minuten bei etwa 45°C inkubiert. Ist im Blutserum
oder Blutplasma freies CEA-Material bzw. Komponente A oder Komponente B vorhanden, dann kann der Gehalt des nicht
umgesetzten markierten CEA-Materials bzw. der Komponente A
™ oder Komponente B im Serum oder Plasma qualitativ oder quantitativ
bestimmt werden. Es wird die Radioaktivität des Rückstandes
gemessen, der nach Zusatz von Zirkonylphosphatgel zu der Lösung durch Zentrifugieren isoliert wurde.
Diese Methode ist besonders deswegen vorteilhaft, weil sie innerhalb von etwa 2 Stunden durchgeführt werden kann.
Sie ist geeignet, um nur die freie GEA-Aktivität zu bestimmen. In Verbindung mit den Methoden der kompetitiven Hemmung ist
man somit in der Lage breit angelegte Untersuchungen auf Carzinome hin durchzuführen.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung. 10 9 8 5 0/1847
150 g von gefrorenem primärem Adenocarcinomgewebe des
Colons wurden in 5 Volumenteilen destillierten Wassers bei 50G
2 Minuten lang homogenisiert. Nach weiterer Behandlung des
Homogenates. in einem Mischer während 5 Minuten wurde J>0 Minuten
lang bei 5000 U/min zentrifugiert. Der Ueberstand wurde abdekantiert
und mit einem Volumenteil einer lO^igen Perchlorsäurelösung
versetzt. Das Gemisch wurde 10 Minuten bei 50C gerührt
und dann 30 Minuten mit 5000 U/min zentrifugiert. Der Ueberstand
wurde abdekantiert, durch Glaswolle filtriert und das Filtrat
durch Dialyse gegen eine Lösung von 20 "M Carbowax in einem
Boratpuffer von pH 8,4 getrocknet. Der feste Rückstand wurde
in 8 ml einer Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan/NaCl-Lösung
gelöst. Die Lösung wurde 50 Minuten mit I05 000 χ g zentrifugiert,
5 ml des erhaltenen Ueberstandes wurden auf eine Sepharose 6B-Säule gegeben und mit der Tris-NaC1-Lösung eluiert.
Es wurden 5 ml-Fraktionen gesammelt bei einer Elutionsgeschwindigkeit
von 0,5 ml/min. Die Fraktionen 45-57 wurden vereinigt
unddprch Dialyse gegen 20 U Carbowax konzentriert. Das Konzentrat
wurde auf eine Sephadex G-100-Säule gegeben und mit der Tris-NaCl-Lösung eluiert. Es wurden 5 ml-Fraktiönen gesammelt,
Die 4- Fraktionen, die den ersten Peak enthielten,
wurden vereinigt und durch Dialyse gegen 20 jj Carbowax getrocknet.
Das erhaltene feste Material wurde in 2 ml der Tris-NaCl-Lösung gelöst und 1 ml davon wurde nach bekannten
Methoden mit ^Jod markiert. Das mit ^jod markierte Material
wurde auf eine Sepharose βΒ-säule gegeben und mit der Tris-NaCl-Lösung eluiert. 5 ml-Fraktionen wurden gesammelt.
Die Fraktionen 45-57 wurden vereint, eingefroren und bei -20°C
aufbewahrt, [Bezeichnung: Tumorextrakt No. 1 (TE-I)). Bei der Geldiffusionsprüfung gegen Ziegenantiserum erschien ein einziges
starkes Band. Bei gewissen Tumorextrakten erschien noch ein zweites kleineres Band»
10 9 8 5 0/1847
2 ml von markiertem TE-I in 50 ml einer wässrigen
' r. Ammoniumacetat lösung (pH 4) wurden auf eine CM-52/DE-52-Säule
aufgegeben. Die Säule wurde mit 150 ml Ammoniumacetat gewaschen.
125
Fast das gesamte Jod wurde zurückgehalten. Die Säule wurde dann mit jeweils 50 ml von Ammoniumacetat-NaCl-Lösungen (mi.t 0,05 vci, 0,1 m, 0,25.m und 1,0 m NaCl) eluiert. Mit der 0,05 m~ Lösung wurden zwei Peaks eluiert, .von denen der erste der Komponente A von CEA zuzuordnen war. Beim zweiten Peak schien es sich um zersetztes Material mit einem Molekulargewicht von 120 000 zu handeln, das M-120 genannt wurde. -Ein weiterer grosser Peak wurde mit der 0,1 m-Lösung eluiert, wobei es sich
Fast das gesamte Jod wurde zurückgehalten. Die Säule wurde dann mit jeweils 50 ml von Ammoniumacetat-NaCl-Lösungen (mi.t 0,05 vci, 0,1 m, 0,25.m und 1,0 m NaCl) eluiert. Mit der 0,05 m~ Lösung wurden zwei Peaks eluiert, .von denen der erste der Komponente A von CEA zuzuordnen war. Beim zweiten Peak schien es sich um zersetztes Material mit einem Molekulargewicht von 120 000 zu handeln, das M-120 genannt wurde. -Ein weiterer grosser Peak wurde mit der 0,1 m-Lösung eluiert, wobei es sich
^ um ein reines Material mit einem Molekulargewicht von 240 000
handelte, das als Komponente B von CEA identifiziert wurde.
Mit der 0,1 m-Lösung wurde noch ein weiterer grosser Peak eluiert, der mit dem Antiserum nicht reagierte, und daher wahr-
- scheinlich eine normale Komponente enthielt. Die Identität der
Komponenten A und B mit CEA-Aktivität wurde durch eine einzige
Präzipitationslinie bei Geldiffusionstests an nicht absorbiertem Antiserum nach der Ouchterlony-Technik bewiesen. Bei der Blockelektrophorese
unter Verwendung von Sephadex G-25, fein (ein quervernetztes Dextrangel mit einer Ausschlussgrenze von etwa
5000, einer Teilchengrösse von 20-80μ, einem Wasserretentions-
. vermögen von 2,5 + 0,2 g Wasser pro g Trockensubstanz und
einem Bettvolumen von 5 ml pro g trockenes Gel), auf einem
nicht leitenden Block, beispielsweise Lucite, verhielten sich die Komponenten A und B identisch und zwar:
Die Blockelektrophorese wurde folgendermassen ausgeführt:
Das Elektrophoresematerial, Sephadex G-25, fein, wurde 2 Stunden bei 8o°C in V/asser gequollen, mit Boratpuffer (pH 8,6}
Ionenstärke 0,05) gewaschen und dann durch eine gesinterte^ Glasplatte unter Anwendung von Unterdruck filtriert.
Die Gelaufschlämmung wurde gleichmässig auf einem Lucite-Block
(Masse 6l χ 7,5 x 1 cm) verteilt und die Oberfläche mit
109850/1847
einem Wattebausch behandelt, bis sie festaber nicht vollstänaig
trocken war.
Der Block wurde dann mit Chromatographiepapierkontakten (3 mm), die alle in Fliessrichtung des Papiers ausgerichtet
waren, versehen und 1 Stunde unter den Betriebsbedingungen (400 V und etwa 20 mA) bei 4°C äquilibriert. Dann entfernte man
von der Mitte des Blocks einen Streifen von 1 cm, vermengte das Material gut mit 60 mg CEA-Material, das zuvor in 0,5 nil einer
0,05 m Boratlösung gelöst worden war und goss den erhaltenen Brei in den Mittelstreifen zurück. Dann tupfte man 1-2 Tropfen
einer Perritinlösung (6 χ umkristallisiert; Konzentration 100 mg/ml) auf das Kathodenende des Blocks und begann die
Elektrophorese. Nach 24 Stunden hatte sich der Perritin-Standard
etwa 18 cm in anodischer Richtung bewegt. Nach beendeter Elektrophorese wurden aus dem Block Streifen von 2 cm zwischen
der Startzone und dem Anodenende geschnitten, die mit 2 m NaCl-Lösung
eluiert wurden. Die Hauptaktivität wurde in einer Entfernung von 10-14 cm von der Startzone in anodischer Richtung
lokalisiert; eine schwächere Aktivität liess sieh in einer Entfernung von 8-10 cm nachweisen.
6 5 ml-Proben von normalem Blutserum und 6 5 ml-Proben von
Serum von Patienten mit Verdacht auf Colonkrebs wurden durch 20-minütiges Schütteln mit der gleichen Volumenmenge 1,2 bis
2 molarer Perchlorsäure und anschliessendes 5-minütiges Zentrifugieren
bei 5°C mit 8000 χ g extrahiert. Die überstehenden Lösungen wurden gesammelt und 5 Stunden gegen eine Lösung von
20 M Carbowax in einem Boratpuffer vom pH 8,4 dialysiert. Der e «haltene Rückstand wurde in 1 ml Boratpuffer vom pH 6,25 gelöst.
Dann wurde jeder Probe 0,1 ml normales menschliches Blutserum zugesetzt und schliesslich den 6 Proben mit den Ex-
1098 50/1847
|1?i§§Q
νρ,η nprnialejii Blutserun? O, 10, £50, 1(3Q, 2§Q μησ] pQQ
Nanograijim, GEA. Djsnn wurden alle.iR· 12 Proben 3QQ-E)QO Einheiten
CEA-AjQt isjr.ujn ziigesetzt. Es wur4e 12 Stufen b;e4 5qß im Eiskasten
"au^b^wjlir.t* jevj.eils i?]it 5QQ Einheiten -.Jpd-CEA ver-
setzf; un4 ί§· 3fcunjäen I2^i §PP i-^W^i6^; i^aph Zusatz vqn jeweils
5 ipl gipkgnfIp)IQspliafcgel sowie eines ArnnionipmacetatpHffeps vom
RlI 6^25 wuKjäen die Proben geschüttelt und dann 5 Minuten mit .
150p. χ β zentriifugiert. Der erlialtene U.eberstand wurde verwarfen,
die er.jaaltenen Niederschläge mit dem Ammoniumja.Getatpiiffer
gewaschen und die erhaltenen Dispersionen nochmals unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert. In den Ri|cK-
^ ständen wurde das gebundene 3Jod bestiinmt (Packard 3QQ3 Tri-
carb S,cintil3.at|pnszähler). Durch Yergleich der aus d/en untersuchten
Serumproben erhaltenen Ergebnisse mit dem Standard konnte der gehalt der unterspchfcen Seren an CEA-Material bzw.
Komponenten A oder B bestimnit werden.
Q1 JLC)1 50, 100 und 5pQ Nanogramm von GEA-Standardmaterial
wurden 4eweüs zu einer 5, ml-Probe eines normalen Serums gegeben.
Die Standarde und das Serum von Patienten mit Krebsverdacht
wurdgn mit Perchlorsäure extraliiert, zentrifugiert und gegen
eine liösung von 20 IM Carbowax,., in der in Beispiel 2 beschriebenen.
Weise dialysiert. Das erhaltene Präzipitat wurde in 1 ml Boratpuffer vom pH 6,25 gelöst, den Lösungen wurden 500 Einheiten
radioaktiv markiertes CEA-Material zugesetzt, es wurde
sorgfältig gemischt und schliesslich mit 300 Einheiten CEA-Antiserum
versetzt. Die Mischung wurde dann etwa 2-3 Stunden gegen eine frische Lösung von 20 M Carbowax .■ zur Trockene
dialysiert. Der Rückstand wurde in 1 ml Boratpuffer vom pH 6,25
125
Bestimmung von Jod in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise
Bestimmung von Jod in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise
gelöst. Nach Zusatz von 5 ml Zirkonylphosphatgel wurde die
Bestimmung voJ
durchgeführt.
durchgeführt.
1098 50/184
" 29 - 21 2668Ό
Menschliches Meconium wurde mit 3 Volumenteilen lO^iger
Perchlorsäure bei 5°C homogenisiert^, das Homogenisat wurde
30 Minuten mit 4000 U/min zentrifugiert und der Ueberstand
dann gegen eine Lösung von 20 Vb Carbowajt ^ dialysiert.
Der Rückstand wurde in einem möglichst geringen Volumen einer Tris-NaCl-Lösung vom pH 7 aufgenommen und 30 Minuten mit
105 000 χ g zentrifugiert.
5 ml des Ueberstandes wurden dann auf eine Sephadex G-100-Säule gegeben und mit Tris-NaCl-Lösung eluiert. Es wurden
5 ml Fraktionen gesammelt. 4 Fraktionen des ersten Peaks wurden vereinigt und durch Dialyse gegen 20 M Carbowax,*#lösung zur
Trockene gebracht. Der Rückstand wurde mit 8 ml einer NaCl-Tris-Lösung
aufgenommen und 30 Minuten mit 105 000 χ g zentrifugiert.
5 ml des erhaltenen Ueberstandes wurden dann auf eine Sepharose βΒ-Säule gebracht und mit Tris-NaCl-Lösung eluiert,
wobei 5 ml Fraktionen gesammelt wurden bei einer Elutionsgeschwindigkeit
von 0,5 ml/min. Die Fraktionen 45-57 wurden vereinigt und durch Dialyse gegen 20 qt Carbowax auf ein Volumen
von 1 ml gebracht. Im Geldiffusionstest gegen Ziegenantiserum zeigte sich eine starke Bande. Das erhaltene Material war
identisch mit der Komponente B von CEA.
125 CEA-Materlal wurde Isoliert und mit Jod
wie in Beispiel 1 beschrieben, markiert.
Ein für CEA-Materiäl spezifisches Ziegenantiserum wurde
mit dem radiomarkierten CEA-Material umgesetzt unter Bildung eines Antikörperantigenkomplexes. Ueberflüssiges radiomarkiertes
10 9 8 5 0/1847
CEA-Material wurde von dem Komplex durch Adsorption an ZlrkonyL·-
phosphatgel (pH 6,25) wie in den Beispielen 2 und Jt beschrieben,
abgetrennt.
Das radiomarkierte CEA wurde dann mit dem Antiserum folgendermassen inkubiert:
100 Nanogramm radiojodiertes CEA-Material wurden 30
Minuten bei 4-50C inkubiert mit durch Wasser im Verhältnis
1:10 000 verdünntem Antiserum in jeweils 1 ml von normalem Serum ^ (Ziege, Mensch, Ratte, Kaninchen), 0,15 m NaCl, 0,075 m
Na2HPO2,, 0,15 m Tris-HCl (pH 7,5) und 0,1 m Ammoniumacetat lösung.
Es erfolgte geringe Komplexbildung.
Wenn das radiojodierte CEA-Material und das Antiserum inkubiert wurden in jeweils 1 ml Wasser, 0,01 m NaCl, 0,01 m
Ammoniumacetat, l#igem normalem Serum in Wasser oder 0,05 m
Natriumboratlösung (pH 8,4),fand Antigen-Antikörper-Komplexbildung
statt.
Das Antiserum bildete ebenfalls einen Komplex mit dem
. radiojodierten CEA-Material, wenn in 10 ml einer 0,01 m Ammoniumacetat-,
0,005 m Natriumboratlösung (pH 8,4) oder verdünntem normalem Serum (Verdünnung 1:100) inkubiert wurde.
10· Nanogramm CEA-Material, zugesetzt dem dialysierten
Ueberstand von 5 nil normalem Serum und 5 ml von 1 m Perchlorsäure,
neutralisierten 10$ des Antiserums, Wenn 30 Minuten lang
bei 45°C vor der Zugabe definierter Mengen radiojodierten Materials inkubiert wurde.
CEA-Material wurde festgestellt in 28 von j50 Perchlorsäureextrakten
von Blutserum von Patienten mit Adenocarcinomen des Colons und direkt in den Seren von metastatischen Patienten
nach der Verdünnung mit Wasser im Verhältnis 1:100. Dies
109850/1847
IHSIiQ
zeigt, dass die Verdünnung, die die Ionenstärke de
Serums herabsetzt, antigeniseh wirksame Stellen des
zugänglich macht.
Serums herabsetzt, antigeniseh wirksame Stellen des
zugänglich macht.
5 nfl-Proben von Blutseruni oder -plasma wurden unter.
Rühren mit J> ml 2 m Perchlorsäure versetzt. Die Qemische wurden 15 Minuten' bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann 5 Minuten bei Raumtemperatur mit IQQO χ g zentrifugiert. Die Ueberstände wurden 36 Stunden lang gegen 25 Liter destilliertes passer bei Raumtemperatur dialysiert. Der Rückstand wurde für die Untersuchung verwendet. Alle Proben wurden doppelt ausgeführt.
Rühren mit J> ml 2 m Perchlorsäure versetzt. Die Qemische wurden 15 Minuten' bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann 5 Minuten bei Raumtemperatur mit IQQO χ g zentrifugiert. Die Ueberstände wurden 36 Stunden lang gegen 25 Liter destilliertes passer bei Raumtemperatur dialysiert. Der Rückstand wurde für die Untersuchung verwendet. Alle Proben wurden doppelt ausgeführt.
Für CEA-Material spezifisches Ziegenantiserum wurde mit
einer Lösung von lQ^igem normalem menschlichem Serum in Qj 05 Ψ
Boratpuffer (pH 8,4) im Verhältnis l:2pQQ verdünnt. GEA-Material
125 wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und mit Jod
markiert.
Es wurde eine Verdünnungskurve der Antiseren gegen eine
konstante Menge radiojodierten Materials in den in 1 ml des
Q,05 m Boratpuffers (pH 8,4) gelösten Dialysaten des Perchlorsäure extrakt es aufgenommen.
Q,05 m Boratpuffers (pH 8,4) gelösten Dialysaten des Perchlorsäure extrakt es aufgenommen.
Sechs Serumproben, die J>0 Minuten in einem Wasserbad bei
45°C inkubiert worden waren, wurden je mit 5 ml einer 0,1 m
Ammoniumacetatlösung (pH 6,25),hergestellt aus 0,1 m Essigsäure und konz. Ammoniak, und 4 ml Zirkonylphosphatgel (pH 6,25)
versetzt und gut vermischt. Es wurde 15 Minuten mit JOOO U/min zentrifugiert, die Ueberstände wurden verworfen, und die Rückstände nochmals in 10 ml der Ammoniumacetatlösung suspendiert, . ntrifugiert und mit einem Scintillationszähler auf ge-
Ammoniumacetatlösung (pH 6,25),hergestellt aus 0,1 m Essigsäure und konz. Ammoniak, und 4 ml Zirkonylphosphatgel (pH 6,25)
versetzt und gut vermischt. Es wurde 15 Minuten mit JOOO U/min zentrifugiert, die Ueberstände wurden verworfen, und die Rückstände nochmals in 10 ml der Ammoniumacetatlösung suspendiert, . ntrifugiert und mit einem Scintillationszähler auf ge-
125
bundenes Jod hin untersucht. =
bundenes Jod hin untersucht. =
109850/1847
EineTitrationskurve wurde aufgestellt durch Zusatz
bekannter Mengen von nicht markiertem CEA-Material zu den Rückständen
der Perchlorsäureextrakte von Serum. Jeder der sechs Proben wurden 1 ml 0,5 m Boratpuffer (pH 8/4) und 0,5 ml einer
auf .1:1000 Verdünnten Anti se ruinlö sung zugesetzt. Dann wurde
30 Minuten in einem Wasserbad bei 45°C inkubiert, jeweils 0,1 ml
radiojodiertes CEA-Material miteiner Aktivität von 24 000 Impulsen
pro Minute zugesetzt, gut vermischt, und nochmals 30
Minuten inkubiert. Nach Zusatz von jeweils 5 ml 0,1 m Ammoniumacetatlösung
(pH6,25) und Zirkonylphosphatgel (pH 6,25) wurde
15 Minuten bei Raumtemperatur mit 1200 χ g zentrifugiert, der
Ueberstand verworfen, der Niederschlag nochmals in 0,1 m Ammoniumacetatlösung (pH 6,25 ) suspendiert,- zentrifugiert und
dann auf gebundenes -Jod hin untersucht.
In-der gleichen Weise wurden Proben von Patienten behandelt,
jedoch ohne Zusatz von nicht markiertem Antigen,
125
Etwa 75$ des mit Jod markierten Materials reagierte
Etwa 75$ des mit Jod markierten Materials reagierte
mit den Antiseren. Eine Verdünnung von 1:10 000 der CEA-Antisereri
mit den Perchlorsaureserumextrakten reagiert mit 70$
der maximalen Menge markiertem Antikörpermaterial.
Durch Inkubation der im Verhältnis' 1:10 000 mit Wasser verdünnten Antiseren mit nicht markiertem CEA-Material vor
der Zugabe von markiertem Antigen konnte gezeigt werden, dass die Antigen-Antikörper-Reaktion im Konzentrationsbereich 1,5-10
ng Antigen/ml linear verläuft und dass s-ie weniger empfindlich
ist bei Antigenkonzentrationen über 20 ng/ml.
Von 487 untersuchten Patienten konnte bei denjenigen mit Brust-, Lungen- oder Colonkarzinomen CEA-Material im Serum
nachgewiesen werden.
Von 229 Pfitienten ohne maligne Erkrankungen konnten
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bei 11 Antigene im Serum festgestellt werden. Bei zweien davon
entwickelte sich später Krebs, einer besass einen adenomatösen
Colonpolyp,während fünf an schweren Emphysemen litten.
•Beispiel 7
1 ml Blutplasma von Patienten mit Krebsverdacht wurde
mit 4 ml physiologischer Salzlösung verdünnt. Ein gleiches Volumen 1,2 η HClOw wurde zugefügt, das Gemisch. 20 Minuten gerührt
und dann 5 Minuten bei Raumtemperatur mit BOOO χ g
zentrifugiert. Der Ueberstand wurde über Nacht gegen destilliertes Wasser dialysiert und der erhaltene Rückstand nochmals
3 Stunden bei Raumtemperatur gegen eine 0,01 m Ammonlümacetatlösung
(pH 6-6,25) dialysiert. Dem Rückstand wurden 30 Einheiten
CEA-Antiserum zugesetzt und das Gemisch wurde 30-45 Minuten
bei 45°C inkubiert. Nach Zusatz von 50 mg 12^jOd-CEA (Aktivität
IO 000-20 000 Impulse pro Min. und ng) wurde nochmals 30 Minuten
bei 45°C inkubiert, pas Gemisch wurde weiter mit 5 ml Zirkonylphosphatgel (pH 6,25) und 5 ml 0,01 m Ammoniumacetatlösung
(pH 6,25) versetzt; dann wurde 5 Minuten bei Raumtemperatur mit 15OO χ g zentrifugiert, der Ueberstand verworfen, der
feste Rückstand mit der Ammoniumacetatlösung gewaschen und
nochmals 5 Minuten mit 1500 χ g zentrifugiert. Das im Rückstand
gebundene -5JOd wurde mit einem Scintillationszähler (Packard
3003 Tri-carb) bestimmt. Bei Anwesenheit von CEA im Blutplasma
ist die Menge an gebundenem ^Jod -CEA entsprechend herabgesetzt.
0,1 ml Blutplasma wurde mit 10 ml Wasser und 30 Einheiten
CEA-Antiserum versetzt. Das Gemisch wurde 30-45 Minuten bei 450C inkubiert. Nach Zusatz von 50 mg 12^jOd-CEA (Aktivität
10 000-20 000 Impulse pro Min. und ng) wurde nochmals 30-45
109850/1847
Minuten bei 450C inkubiert. Das Gemisch wurde weiter mit 5 ml
Zirkonylphosphatgel (pH 6,25) und 5 ml 0,01 m Ammoniumacetatlösung
(pH 6,25) versetzt; dann wurde 5 Minuten bei Raumtemperatur mit 15OO χ g zentrifugiert, der Ueberstand verworfen,
der feste Rückstand mit der Ammoniumacetatlösung gewaschen
und nochmals 5 Minuten mit 1500 x.g zentrifugiert. Das im Rückstand
gebundene ^ Jod wurde'mit einem Scintillationszähler
(Packard 3OO3 Tri-carb) bestimmt.
109850/1847
Claims (1)
- Patentansprüche1. Verfahren zur Herstellung von menschlichem carcinoembryonalem Antigen (CEA) 3 gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensstufen: ·a) Homogenisierung von Adenocarzinomgewebejb) Abtrennung der festen Partikel aus dem Homogenat;c) Behandlung der erhaltenen Lösung mit einem Glykoprotein-Lösungsmittel, in dem CEA löslich ist;d) Abtrennung des Niederschlages und Klären der Lösung;e) Dialyse der geklärten Lösung gegen ein PoIy-'äthylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 15 000 - 20 000 und einem Erweichungspunkt von 6o°C;f) Lösen des Dialysates in einem wässrigen Puffer mit einem pH-Wert zwischen 5 und 9;g) Subsequente Gelchromatographie an zwei Säulen, von denen die erste ein Agarosegel mit etwa 6 Gew.-^ Agarose und einer Partikelgrösse von 4θ-210μ und die zweite ein hydrophiles, wasserunlösliches quervernetztes Dextrangel enthält und h) Sammeln und Konzentrieren derjenigen Fraktionen des Eluates, die ein Absorptionsmaximum bei 280 nm und ein Molekulargewicht von etwa 200 000 - 500 000 besitzen.2. Verfahren zur Herstellung von menschlichem carzinoembryonalem Antigen, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Extrakt aus Adenocarzinomgewebe der subsequenten Gelchromatographie an zwei Säulen unterwirft, von denen die erste ein Agarosegel mit 6 Gew.-^ Agarose und einer Partikelg1 )sse von 40-210 μ und die zweite ein hydrophiles, wasserunlösliches quervernetztes Dextrangel enthält und diejenigen Fraktionen sammelt, die ein Absorptionsmaximum bei 280 nm und109850/1.847ein Molekulargewicht von etwa 200 000 - 500 000 besitzen.3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die nach Stufe d) erhaltene geklärte Lösung vor Stufe e) gegen Wasser dialysiert wird.4. Verfahren nach den Ansprüchen "1-3*· dadurch gekennzeichnet, dass die Dextrangelsäule ein höheres Trennvermögen besitzt als die Agarosegelsäule.5· Verfahren nach den Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Agarosegelsäule einen Praktionierungsbereich von bis zu 4x10 aufweist.6. Verfahren nach den Ansprüchen 1-5* dadurch gekennzeichnet, dass die Dextrangelsäule eine Ausschluss-5
grenze von etwa 10 aufweist.7. Verfahren nach den Ansprüchen 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass diejenigen Fraktionen des Eluates der Agarosegelsäule mit einem Absorptionsmaximum bei 280 nm und einem Molekulargewicht von etwa 200 000 - 500 000 gesammelt, gegen Polyathylenglykol mit einem mittleren ,Molekulargewicht von etwa 20 000 dialysiert und in einem wässrigen Puffer von pH .5 - 9 gelöst werden, um dann auf die Dextrangelsäule aufgegeben zu werden.8. Verfahren nach den Ansprüchen 1-7* dadurch gekennzeichnet* dass die wässrigen Puffer einen pH-Wert von etwa 7 aufweisen.9· Verfahren nach den Ansprüchen 1-8* dadurch gekennzeichnet, dass Komponente A von menschlichem carcinoembryonalem Antigen hergestellt wird.10 9850/184710. Verfahren nach den Ansprüchen 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass Komponente B von menschlichem carcinoembryonalem Antigen hergestellt wird.11. Verfahren nach den Ansprüchen 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass das Adenocarzinomgewebe von Tumoren des Verdauungssystemepithels,stammt, das sich von embryonalem entodermalem Gewebe ableitet.12. Verfahren zur Herstellung, von menschlichem carcinoembryonalem Antigen gemäss den Ansprüchen 1-11, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende zusätzliche Verfahrensstufe durchführt:i) Chromatographie der gesammelten und konzentrierten Dextrangeleluate an einer Mischbett-Ionenaustauschersäule mit einer Lösung von Ammoniumacetat in wässrigem Natriumchlorid, wobei das Austauschermaterial eine Mischung von trockener oder vorgequollener Carboxymethylcellulose mit einer Partikelgrösse von 2Ο-6θμ, einer Kapazität von 1,0 - 0,1 mAequiv./g und einer Wasseraufnahmekapazität von 2,j5-2,7g/g Trockensubstanz und mikrogranulierter Diäthylaminoäthylcellulose in freier basischer Form mit einer Partikelgrösse von 2Ο-6θμ, einer Kapazität von 1,0 - 0,1 mAequiv./g und einer Wasseraufnahmekapazität von 2,3 - 2,8 g/g Trockensubstanz ist.IJ. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischbett-Ionenaustauschersäule aus gleichen Gewichtsmengen von Diäthylaminoäthyl- und Carboxymethylcellulose besteht.14. Verfahren nach den Ansprüchen 12 und IJ, dadurch gekennzeichnet, dass die gesammelten und konzentrierten Dextrangeleluate in einer Lösung aus einem wässrigen Puffer mit niedriger Ionenstärke vom pH etwa 4 auf die Mischbettsäule aufgegeben werden.109850/184 715· Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der wässrige Puffer ein 0,1m Arnmoniumacetat-Puffer ist.16. Verfahren nach den Ansprüchen 12-15/ dadurch gekennzeichnet, dass die als Elutionsmittel verwendete Lösung von Ammoniumacetat' in wässrigem Natriumchlorid einen pH-Wert von 4 bestitzt.17'. Verfahren zur Herstellung von Komponente A von menschlichem carcinoembryonalem Antigen nach den Ansprüchen 12-16, dadurch gekennzeichnet, dass mit Ammoniumacetat in ) 0,05m wässriger Natriumchloridlösung eluiert wird.18. Verfahren zur Herstellung von Komponente B von menschlichem carcinoembryonalem Antigen nach den Ansprüchen 12-16,dadurch gekennzeichnet, dass mit Ammoniumacetat in 0,1m wässriger Natriumchloridlösung eluiert wird.19. Verfahren zur Herstellung von menschlichem carcinoembryonalem Antigen (CEA), dadurch gekennzeichnet, dass man CEA enthaltendes Material an einer Mischbett-Ionenaustauschersäule mit einer Lösung von Ammoniumacetat in wässrigem Natriumchlorid chromatographiert, wobei das Aus-™ tauschermaterial eine Mischung von trockener oder vorgequollener Carboxymethylcellulose mit einer Partikelgrösse von 20-βθμ, einer Kapazität von 1,0 - 0,1 mAequiv./s und einer Wasseraufnahmekapazität von 2,3 - 2,7 g/g Trockensubstanz und mikrogranulierter Diäthylaminoäthylcellulose in freier basischer Form mit einer Partikelgrösse von 2Ο-6θμ, einer Kapazität von 1,0-0,1 mAequiv./g und einer Wasseraufnähmekapazität von 2,3-2,8 g/g Trockensubstanz ist.20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Mlschbett-Ionenaustauschersäule aus gleichen Gewichtsmengen von Diäthylaminoäthyl- und Carboxymethylcellulose besteht'.109850/184721. Verfahren nach den Ansprüchen 19 und 20, dadurch gekennzeichnet, dass die als Elutionsmittel verwendete Lösung von Ammoniumacetat in wässrigem Natriumchlorid einen pH-Wert von 4 hat.22. Verfahren zur Herstellung von Komponente A von menschlichem carcinoembryonalem Antigen nach den Ansprüchen 19-21, dadurch gekennzeichnet, dass mit Ammoniumacetat in wässriger Natriumchloridlösung eluiert wird.23. Verfahren zur Herstellung von Komponente B von menschlichem carcinoembryonalem Antigen nach den Ansprüchen 19-21, dadurch gekennzeichnet, dass mit Ammoniumacetat in 0,1m wässriger Natriumchloridlösung eluiert wird.24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-23, dadurch gekennzeichnet, dass diejenigen Eluatfraktionen mit einem Absorptionsmaximum bei 28Ο nm gesammelt werden, die ein Molekulargewicht von etwa 200 000 - 240 000 aufweisen.25· Verfahren zur Herstellung von menschlichem carcinoembryonalem Antigen (CEA), der Komponente A und/oder der Komponente B, dadurch gekennzeichnet, dass man einen mit einem Glykoprotein-Lösungsmittel, in dem CEA, Komponente A und Komponente B löslich sind, behandelten Extrakt aus homogenisiertem Adenocarzinomgewebe gegen Polyäthylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 15 000 - 20 000 und einem Erweichungspunkt von 60°C dialysiert.26. Verfahren zur Herstellung von menschlichem carcinoembryonalem Antigen, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensstufen:a) Homogenisierung von menschlichem Meconium in einem Glykoprotein-Lösungsmittelj109850/18 W]b) Abtrennung fester Partikel aus dem Homogenat;c) Dialyse der erhaltenen Lösung gegen Polyäthylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 15 000 bis 20 000 und einem Erweichungspunkt .von 6o°Cjd) Lösen des erhaltenen Rückstandes in einem wässrigen Puffer von pH etwa·' 7;e) Entfernen des Niederschlages;f) Subsequente Ge!Chromatographie an zwei Säulen, von denen die erste ein hydrophiles, wasserunlösliches quervernetztes Dextrangel und die zweite ein Agar'osegel mit etwa 6 Gew. -% Agarose und einer Partikelgrösse von 4θ-21Ομ enthält undg) Sammeln und Konzentrieren derjenigen Fraktionen des Eluates, die ein Absorptionsmaximum bei 280 nm und ein Molekulargewicht von etwa 200 000 - 500 000 besitzen,27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass man die Komponente B von menschlichern, carzinoembryonalem Antigen erhält.28. Verfahren nach den Ansprüchen 26 und 27, dadurch gekennzeichnet, dass man in Stufe g) die Fraktionen mit einem Molekulargewicht von 200 000 - 240 000 sammelt.29. Verfahren zur Herstellung der radiokodierten Komponente A von menschlichem carzinoembryonalem Antigen (CEA), dadurch gekennzeichnet, dass man die Komponente A von CEA radiojodiert.30. Verfahren zur Herstellung der radiojodierten Komponente B von menschlichem carzinoembryonalem Antigen (CEA), dadurch gekennzeichnet, dass man die Komponente B von CEA radiojodiert.10 98 5 0/18473l) Menschliches carzinoembryonales Antigen, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Molekulargewicht von 120 000 bis 240 000 und ein Absorptionsmaximum bei 280 nm aufweist, in Perchlorsäure löslich ist, in Geldiffusions'tests mit seinem spezifischen Antikörper in nicht absorbiertem Antiserum eine •einzige Präzipitatlinie liefert und dass es von einer Mischbett-Ionenaustauschersäule mit einer Lösung von Ammoniumacetat in wässrigem Natriumchlorid eluierbar ist, wobei das Austauschermaterial eine Mischung von trockener oder vorgequollener Carboxymethylcellulose mit einer Partikelgrösse von 20-βΟμ, einer Kapazität von 1,0 - 0,1 mAequiv./g und einer Wasseraufnahmekapazität von 2,5 - 2,7 g/g Trockensubstanz und mikrogranulierter Diathylaminoäthylcellulose in freier basischer Form mit einer Partikelgrösse von 20-βΟμ, eine Kapazität von 1,0 - 0,1 mAequiv./g und einer Wasseraufnahmekapazität von 2,3 - 2,8 g/g Trockensubstanz ist.■32. Menschliches carzinoembryonales Antigen gernäss Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass das Austauschermaterial aus gleichen Gewichtsteilen Carboxymethyl- und Diathylaminoäthylcellulose besteht.• 3^· Menschliches carzinoembryonales Antigen ß^rnäss den Ansprüchen 31 und ä2, dadurch -gekennzeichnet, dass' die Lösung von Ammoniumacetat in wässrigem Natriumchlorid einen pH-Wert von 4 besitzt. ·34. Komponente A von menschlichem carzinoembryonalem Antigen, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Molekulargewicht von 120 000 bis 240 000 und ein Absorptionsmaximum bei 280 nm hat, in Perchlorsäure löslich ist, in Geldiffusionstests mit seinem spezifischen Antikörper in nicht absorbiertem Antiserum eine einzige Präzipitatlinie liefert und dass es von einer10 985a/1847Mischbett-Ionenaustauschersäule mit einer Lösung von Ammoniumacetat in wässrigem Natriumchlorid eluierbar ist, -wobei das Austauschermaterial eine Mischung von trockener oder ,vorgequollener Carboxymethylcellulose mit einer Partikelgrösse von 20-βΟμ, einer Kapazität von 1,0 - 0,1 mAequiv./g und einer Wasseraufnahmekapazität von 2,3 - 2,7 g/g Trockensubstanz und mikrogranullerter Diäthylaminoäthylcellulose in freier basischer Form mit einer Partikelgrösse von 20-όθμ, einer Kapazität von 1,0 - 0,1 mAequiv./g und einer Wasseraufnahmekapazität von 2,3 - 2,8 g/g Trockensubstanz ist.% r 35. Komponente A von menschlichem carzinoembryonalern Antigen gemäss Anspruch 3^,.dadurch gekennzeichnet,- dass das Austauschermaterial aus gleichen Gewichtsteilen Carboxymethyl- und Diäthylaminoäthylcellulose besteht.36. Komponente A von menschlichem carzinoembryonalern Antigen gemäss den Ansprüchen 3-4 und 3 5-, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung von Ammoniumacetat in wässrigem Natriumchlorid einen pH-Wert von 4 besitzt.3/f. Komponente B von menschlichem carzinoembryonalern Antigen, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Molekulargewicht " von 120 000 bis 24o 000 und ein Absorptionsmaximum bei 28o nm hat, in Perchlorsäure löslich ist, in Geldiffisionstests mit seinem spezifischen Antikörper in nicht absorbiertem Antiserum eine einzige Präzipitatlinie liefert und dass es von einer Mischbett-Ionenaustauschersäule mit einer Lösung von Ammoniumacetat in wässrigem Natriumchlorid eluierbar ist, wobei das Austauschermaterial eine Mischung von trockener oder vorgequollener Carboxymethylcellulose mit einer Partikelgrösse von 20-βΟμ, einer Kapazität von 1,0 - 0,1 mAequiv./g und einer Wasseraufnahmekapazität von 2,3 - 2,7 ß/s Trockensubstanz und mikrogranulierter Diäthylaminoäthylcellulose in freier basischer Form mit einer .Partikelgrösse von 20-βΟμ,■10985071847-einerKapazität von 1,0 - 0,1 mAequiv./g und einer Wasseraufnahmekapazität von 2,3 - 2,8 g/g Trockensubstanz ist.33. Komponente B von menschlichem carzinoembryonalem Antigen gemäss Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass das' Austauschermaterial· aus gleichen Gewichtsteilen Carboxymethyl- und Diäthylaminoäthylcellulose besteht.39· Komponente B von menschlichem carzinoembryonalem Antigen gemäss den Ansprüchen 37 und 3.8, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung von Ammoniumacetat in wässrigem Natriumchlorid einen pH-Wert von 4 besitzt.40. Rädiojodierte Komponente A von menschlichem carzinoembryonalem Antigen, gekennzeichnet durch eine spezifische Aktivität von 5-10 Ci/g und durch die gleichen Eigenschaften wie das nicht kodierte Material gemäss Anspruch41. Radiojodierte Komponente B von menschlichem carzinoembryonalem Antigen, gekennzeichnet durch eine spezifische Aktivität von 5-10 Ci/g und durch die gleichen Eigenschaften wie das nicht jodierte Material gemäss Anspruch. 37.lfi98S0./18A7
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