DE2707913A1 - Verfahren zum nachweis von rheumatoiden faktoren - Google Patents
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Description
BE^ WOLFF & BEIL PCCi-: Λ'; ·'".ι.~'-"
6230 Γίί/\;;Λί:ϋ!ίΤ ΛΜ MAiN 80
Pharmacia Diagnostics AB Uppsala / Schweden
809810/0562
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von rheumatoiden
Faktoren.
Anti-Immunoglobuline werden auch als rheumatoide Faktoren
bezeichnet und können den Immunoglobulinklassen IgM, IgG, IgA oder gegebenenfalls auch anderen Immunoglobulinklassen
angehören . Der rheumatoide Faktor kann seinerseits gegen Immunoglobuline der Klassen IgG oder IgM oder gegebenenfalls
anderer Immunoglobulinklassen gerichtet sein, welche durch Immunokomplexbildung oder Aggregation in ihrer
Struktur geändert worden sind.
Bereits vorgeschlagene Testmethoden zum Nachweis von rheumatoiden Faktoren gründen sich auf Agglutination von z.B. Blutkörperchen
oder Latexpartikeln, die mit IgG überzogen sind. Diese Methoden weisen vor allem rheumatoide Faktoren vom
IgM-Typ gerichtet gegen geändertes IgG nach. Patienten mit rheumatoider Arthritis sind in einem solchen Test in der
Regel positiv, aber 20 - 30 % sind negativ.
Erfindungsgemäß wurde nun ein Verfahren zum Nachweis von
rheumatoiden Faktoren in einer wäßrigen Probe geschaffen, bei welchem man in erster Linie darauf abzielt, andere
rheumatoide Faktoren als solche der Immunoglobulinklasse IgM nachzuweisen, welche nicht in erwünschtem Maße mit den
bereits bekannten Methoden nachgewiesen werden konnten.
809810/0562
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
dass die Probe in Gegenwart des Komplementfaktors CiLq in ungebundener
Form mit löslichem, aggregiertem Immunoglobulin, das mit einem oder mehreren analytisch nachweisbaren Atomen
oder Gruppen markiert ist, zur selektiven Fällung solcher rheumatoiden Faktoren umgesetzt wird, welche in Gegenwart von
CIq imstande sind, aggregiertes Immunoglobulin zu präzipitieren,
worauf das oder die analytisch nachweisbaren Atome oder die analytisch nachweisbare Gruppe oder Gruppen in der Fällungsphase
und/oder in der Lösung nachgewiesen werden.
Unter dem Vorliegen des Komplementfaktors CIq in ungebundener
Form versteht man, dass er an übrige C 1-Komponenten nicht gebunden vorliegen soll. Dies kann beispielsweise dadurch
erreicht werden, dass ein kalziumbindender Stoff vom Typ Äthylendiamintetraeesigsäure (EDTA) und andere Stoffe, welche
Kalziumionen komple>jbinden, zugesetzt werden. Der Komplementfaktor
Cig liegt im allgemeinen in der Probe in ausreichender Menge vor. Sollte dies nicht der Fall sein, kann ein
negatives Kontrollserum mit freigesetztem CIq zugesetzt . werden oder wird CIq, hergestellt beispielsweise gemäss ■
Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 69 (1-972), 65, zugesetzt.
809810/0562
Lösliches, aggregiertes Immunoglobulin kann beispielsweise durch Erhitzung einer Lösung eines Immunoglobulins und anschliessende
Trennung löslichen, aggregierten Immunoglobulins von monomerem Immunoglobulin und von etwa entstehender
geringerer Menge unlöslicher Aggregate durch Gelfiltrierung hergestellt werden. Vorzugsweise wird als Immunoglobulin
in diesem Zusammenhang ein solches der IgG-Klasse verwendet.
Die Aggregation wird nicht weiter getrieben, als dass der Hauptteil des aggregierten Immunoglobulins in der wässrigen
Probe löslich ist.
Zur Markierung des aggregierten Immunoglobulins kann jedes
im Zusammenhang mit der Markierung von Immunoglobulinen bekannte analytisch nachweisbare Atom odeT/Gruppe verwendet
werden. Die Markierung von aggregiertem Immunoglobulin mit radioaktivem Isotpp kann somit in konventioneller Weise
durchgeführt werden, wobei ein zweckmässiges Isotop gewählt
wird, z.B. 12^j (siehe z.B- die Methode gemäss Hunter und
Greenwood, Nature, Band 194, 1962, Seite 495). Ebenfalls kann die Markierung mit einer fluoreszenzgebenden Gruppe
in konventioneller Weise gemacht werden, z.B. mit einem Fluoresceinderivat wie Fluoresceinisothiocyanat. Auch eine
Markierung mit beispielsweise enzymatisch aktiven Gruppen oder mit freie Radikale enthaltenden Gruppen zum Nachweis
kann grundsätzlich angewandt werden.
Die rheumatoiden Faktoren, welche in dieser Weise nachgewiesen werden können, gehören in erster Reihe den Immunoglobulinklassen
IgG und IgA an, während man Interferenz mit solchen der Klasse IgM vermeidet. Rheumatoide Faktoren der
erstgenannten Klassen sind imstande1, an aggregiertes Immunoglobulin
(beispielsweise aggregiertes IgG) zur Bildung eines Komplexes gebunden zu werden, an welchen auch CIq zu
einem grösseren Komplex von solcher Grosse gebunden werden kann, daps eine Fällung entsteht.
809810/0582 /
Die Erfindung wird im folgenden anhand einer Anzahl spezifischer
Ausführungsbeispiele näher beschrieben.
A. Herstellung von aggregiertem Human-IgG (agg IgG)
Human-IgG (Fraktion II der Cohn-Fraktionierung) aus zusammengezogenen
Humansera wurde von der Kabi AB, Schweden, erhalten und in Form einer 2%-igen IgG-Lösung 20 Minuten bei 600C erhitzt.
Somit erhaltenes aggregiertes IgG (agg IgG) wurde von monomerem IgG getrennt durch Gelfiltrierung auf einer
90 χ 1,5 cm Kolonne von mit Epichlorohydrin vernetztem Dextran
(Sephadex^ ' G-200 von Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) äquivilibriert mit 0,1 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCl-Puffer
enthaltend 0,5 M NaCl mit pH 7,4. Konzentrationen von agg IgG wurde bei 2Ö0 nm spektrophotometrisch
bestimmt.
B. Herstellung von markiertem agg IgG
20 /Ul einer Lösung enthaltend 40/ug agg IgG, erhalten gemäss
A, wurden 500/uCi Na 125I und 10 /ul 0,5 M Natriumphosphatpuffer
mit pH 7,4 und 10/Ug Chloramin T in 10/ul Wasser
zugesetzt. Nach 50 Sekunden wurden 24/Ug Natriummethabisulfit
zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Sephadex* '
G-200 getrennt (d.h. Gelpartikel bestehend aus mit Epichlorohydrin vernetztem Dextran), wobei die erste Fraktion mit dem
Voidvolumen aufbewahrt wurde. Das eluierte, markierte agg Ig wurde bei 3500 g 5 Minuten geschleudert, um spontan präzipitierbares
IgG zu entfernen. Das markierte Protein wurde mit einer Pufferlösung, hergestellt aus 500 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer
pH 7,5, 500 ml 0,15 M NaCl, 10 ml 5 % (w/v) NaN- und 5 ml Tween*R' 20, auf etwa 40/Ug/l (40 000 cpm in
0,1 ml) verdünnt.
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C. Bestimmung der rheumattbiden Faktor-Aktivität
Blutproben wurden den Patienten -aseptisch entnommen und man liess das Blut bei Raumtemperatur"gerinnen, worauf bei 3000 g
geschleudert wurde und Sera aufbewahrt wurden.
Serum wurde 1:20 mit einer Lösung verdünnt, die wie folgt zusammengesetzt war: 500 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer
pH 7,5, 500 ml 0,15 M NaCl, 1 ml 1 M BDTA, 10 ml 5$ NaN3,
5 ml Tween*R' 20. 200/ul der Serumverdünnung sowie 100 /ul
von I 5 markiertem agg IgG (40 000 cpm) (erhalten gemäss B)
wurden Kunststoffröhren zugeführt. Die Röhren wurden zugepfropft und 16 Stunden bei +40C unter konstanter Drehung inkubiert.
Dann wurden die Röhren 3 Minuten bei 3500 g geschleudert. Die Kunststoffpfropfen wurden entfernt und 2 ml
der 0,9 M der 0,9 M NaCl-Lösung enthaltend 0,5$ Tween^R' 20
wurden jeder Röhre zugesetzt. Die Röhren wurden erneut 3 Minuten bei 3500 g geschleudert. Die Oberflüssigkeit wurde
dann abgesaugt. Dieser Waschvorgang wurde dreimal wiederholt. Die Röhren wurden dann zugepfropft und in einem automatischen
Gammarechner untergebracht.
Es wurde gefunden, dass man an Proben von Patienten mit rheumatoider Arthritis oder systemischem Lupus erythematosus
mit rheumatoiden Faktoren der IgG- und IgA-Klasse hohe
Messwerte erhielt, während konventionelle Methoden, welche rheumatoide Faktoren der IgM-Klasse messen, keinen Ausschlag
geben.
Für: Pharmacia Diagnostics AB Uppsala /· Schweden
Lla /. Schwei
Dr.H.epr.Beil
Rechtsanwalt
809810/0562
Claims (2)
- PatentansprücheΙ.λ Verfahren zum Nachweis von rheuraatoiden Faktoren in —S einer wässrigen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe in Gegenwart des Koraplementfaktors CIq in ungebundener Form mit löslichem, aggregiertem Immunoglobulin, das mit einem oder mehreren analytisch nachweisbaren Atomen oder Gruppen markiert ist, zur selektiven Fällung solcher rheumatoiden Faktoren umgesetzt wird, welche in Gegenwart von CIq imstande sind, aggregiertes Immunoglobulin zu präzipitieren, worauf das oder die analytisch nachweisbaren Atome oder die analytisch nachweisbare Gruppe oder Gruppen in der Fällungsphase und/oder in der Lösung nachgewiesen werden.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das markierte, aggregierte Immunoglobulin der IgG-Klasse angehört.809810/0562ORIGINAL INSPECTED
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1977
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- 1977-07-20 NL NL7708077A patent/NL7708077A/xx not_active Application Discontinuation
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- 1977-07-25 CA CA283,448A patent/CA1098014A/en not_active Expired
- 1977-07-26 FR FR7722924A patent/FR2364455A1/fr active Granted
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- 1977-07-28 JP JP52090877A patent/JPS6015022B2/ja not_active Expired
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3689632A (en) * | 1969-01-06 | 1972-09-05 | Kowa Co | Rheumatoid agglutination test and reagent |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Clin. exp.Immunol., Vol. 8, 1971, S. 249-262 * |
Also Published As
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|---|---|
| JPS5334916A (en) | 1978-03-31 |
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