DE2243237A1

DE2243237A1 - Nachweis der immunreaktion gegenueber krebs

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Publication number: DE2243237A1
Application number: DE19722243237
Authority: DE
Inventors: Chloe Tal
Original assignee: HADASSAH MEDICAL RELIEF ASS IN
Current assignee: HADASSAH MEDICAL RELIEF ASS IN
Priority date: 1971-09-02
Filing date: 1972-09-02
Publication date: 1973-03-08
Also published as: GB1388719A; FR2161896A1; FR2161896B1; JPS4835028A

Description

.; vv/, κν: λ LTK Dipl.-) nc Κ *vr ickmann,

DiPL.-TnG. H₅WEICKMANrJ, DlPL.-PlIYS. DlI. K. Fl «CKE

Dii'L.-lNG. RA.V/eickmann, DIPL.-CHEM. B. Huber

Case 17? 239

Nachweis der Imniunreaktion gegenüber Krebs

Die Vielzahl von Krebsarten, die bekannt sind, ist so gross, dass offensichtlich nicht ein einziger Kausaifaktor dafür verantwortlich ist. Man hab daher angenommen, dass es nicht möglich sein würde, einen diagnostischen Test zu ontwiekeln, der gegenüber einer grossen Vielzahl oder allen Kreb.^ejsorten empfindlich ist. Diese Annahme muss jedoch nicht notwendigerweise richtig sain, da die Iioglichkeit besteht, daao der' Körper beim Vorhandensein von Krebnwachstum mit miiuluatens einer.¹! I^ochanirviu,'» reagieri., bei dem eine einzige nachweisbare VerbindntJg gebildet v;:ird und die bei den meisten oder vielleicht bei o.lleii krebsartigem Gcv.-ächseri oder Wucherungen auftritt;.

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BAD ORIGINAL

Es ist sehr wünschenswert, da sr. die postulierte Verbindung bei einer frühen Ltufe dos Krobnwachstuois auftritt, damit eine frühe Diagnose möglich v;ii-d.

Es wurde gefunden, dass das Blutserum von Menschen, von dcnou bekannt ist, dass sie an Krebs leiden, ein spezifisches Globulin enthält , das cUirch die im folgenden angegebenen Eigenschaften identifiziert wird. Überraschenderweise wurde auch gefunden, dass dieses Globulin va Blut von nicht-lirebs-kranken schwangeren !''rauen vorkommt. Dieses Globulin, das im. folgenden als T-Globulin bezeichnet wird, ermöglicht die Bildung von Anti-Körpern, wenn es in geeignete '.Eierwirte injiziert wird. Liese Anti-Körper können dann verwendet werden, um die Anwesenheit von T-Globulin zu untersuchen und daait den Krebs (oder die Schwangerschaft) von Testpersonen festzustellen. Das Verfahren, das beispielsweise für diesen Zweck verwendet wird, beinhaltet Präzipitin-Reaktionen.

Das T-Globulin wurde bis jetzt im Blut von nicht-kanzerogenen, nicht-schwangeren Personen nicht gefunden. Dieses Globulin hat bis jetzt auch keine Spezifität, bezogen auf die verschiedenen Krebsarten, gezeigt, daher ist nur ein Anti-Serum erforderlich, um die verschiedenen Arten von Krebs zu untersuchen oder festzustellen.

Als erste Stufe entnimmt man einem oder mehreren Patienten, von denen bekannt ist, dass sie Krebs haben, und/oder von einer oder mehreren schwangeren Frauen Blut. Wird das Blut von mehr als einer Person entnommen, dass wird das Blut vereinigt. Im allgemeinen ist ein solches Vereinigen oder Zusammenmischen des Blutes bevorzugt, damit man bei der nachfolgenden Bearbeitung grosse Meiigon verfügbar hat.

Von dem so erhaltenen Blut wird das Le rum getrennt und beispielsweise mit gesättigter Ammoniumsulfatlöaung behandelt, um die vorhandenen Globuline auszufällen. Die Fraktion an ausgefällten Globulin enthält aas T-Globulin.

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BAD

Es int möglich» den gesamten Globulin-Kiodorcchlag in destilliertem Vaster oder Salzlösung aufzunehmen und entweder dieso Lösungen Tür- die Injektion und Immunisierung eines geeigneten tierischen Säugetiers oder eines Vogel« als "Wirt zu verwenden. Das Blutserum von dem immunisierten Tierwirt ; kann -ra.it der gesamten Globulinfraktion von dem Blutserum eine« Versuchspatienten vereinigt werden, um festzustellen, ob Präzipitinreaktion auftritt.

Es ist offensichtlich, dass Jedes der Globuline,die in dem gesammelten Sex^um vorhanden sind, in dem Serum des Tierwirts ihre eigenen -Anti-Körper bilden. Als i'olge davon'Atfird ein Vermischen des Immunserums aus dem injizierten Tierwirt mit der Gesaratglobulinfraktion immer eine Pällungreaktion ergeben, unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit, reiner T-Globulinfraktion. 'Das gleiche würde natürlich für den Agglutinationsversucii gelten.

Es wurde jedoch gefunden, dass T-Globulin eine niedrige elektrophoretisch^ Wanderungsgeschwindigkext besitzt und diese sich von der Wanderungsgeschwindigkext irgendeiner anderen Komponente in dem Gesamtglobulin-Kiederschlag unterscheidet. Als Folge davon kann das Immundelektrophox^ese-Verfahren^ei' dem jedes Antigen-Antikörperpaar eine getrennte Linie in einem anderen Bereich einer Agar-Testplatte ergibt, verwendet werden, um festzustellen, ob T~Globulin in dem Blutserum eines Testpatienten vorhanden ist.

Solche Testverfahren wurden durchgeführt und es wurde eine charakteristische Linie, die nur in dem Blut von kanzerogenen und schwangeren Personen vorhanden ist, festgestellt. Jedoch erschwert die FuIIe von Linien, die als Ergebnis dor verschiedenen Antigen-Antikörperpaare gebildet werden, die Identifizierung der Linie, die durch T-Globulin verursacht wird. Es ist jedoch trotzdem möglich, mit massiger Zu- * verlässigkeit gemäss dem oben zusammengefassten Verfahren festzustellen, ob eine Testperson Krebs hat (oder ob.sie schwanger ißt).

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Das oben angegebene Verfahren ist unpraktisch, wenn es im groBsen Masstab durchgeführt werden soll, da dazu gcschultee Personal erforderlich ist. Weiterhin ist die Vielzahl der Linien, die auftreten, wenn die Gesamtglobulinfraktion auf dem gesammelten Blutserum für die Bildung des Anti-Serums verwendet ist, und das gesamte Anti-Serum für die Immunoelektrophorese eingesetzt ist, so hoch, dass eine hohe Zuverlässigkeit nicht erzielt werden kann. Daher wurden Verfahren entwickelt, um eine gereinigte T-Globulinfraktion aus dem gesammelten Blutserum herzustellen und um Anti-Serum so zu reinigen, dass das Anti-Serum, das mit der Gesamtglobulinfraktion eines Versuchepatienten vermischt wird, keine Anti-Globuline enthält mit Ausnahme von jenen, die die T-Globulinfraktion ausfällen. Unter diesen Bedingungen kann man entweder die Ausfällung oder die Agglutination verwenden, um festzustellen, ob T-Globulin in dem Blutserum eines Versuchspatienten vorhanden ist.

Es wurden zwei heute bevorzugte Verfahren entwickelt, um die T-Globulinfraktion aus gesammeltem Blut zu isolieren. Bei dem ersten Verfahren wird eine Lösung, die die Gesamtglobulinfraktion enthält, in eine Agarschicht, die auf einen pH-Wert von ungefähr 8,4- bis 8,8 gepuffert "ist, der Elektrophorese unterworfen. Die Gesamtglobulinfraktion wird in eine öffnung nahe am Zentrum der Schicht gegeben. Dabei wird die Tatsache ausgenützt, dass die T-Globulinfraktion bei diesen Bedingungen die' niedrigste Wanderungsgeschwindigkeit besitzt und so wird ein Teil der Schicht, die nahe an der öffnung liegt, aufgeschnitten. Es wurde gefunden, dass dieser Teil im wesentlichen reines T-Globulin enthält, das im wesentlichen frei von anderen Globulinen ist.

Bei dem zweiten Verfahren wird die Gesamtglobulinfraktion in destilliertem Wasser oder Salzlösung gelöst und mit Perchlorsäure behandelt. Der Niederschlag wird in Wasser oder Salzlösung suspendiert und auf einen pH-Wert von ungefähr 7,0 eingestellt. Die überstehende !''lüssißkeit wird verworfen und der Nieclnrychlag wird erneut in Wor>sor oder Salzlösung

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suspendiert. Der pH-Wert wird nun auf genau 8,0 eingestellt. Die überstellende Lösung enthält nun im wesentlichen reines T-Globulin. Zusätzliches T-Globulin kann erhalten werden, indem man den Niederschlag mit V/asser oder Salzlösung mit einem pH-Wert von ungefähr 8,0 wäscht.

Injektion eines Tieres oder eines Vogels (das Huhn' ist ein geeigneter Yogel) in einer geeigneten Reihenfolge mit gereinigtem T-Globu3-in, vorzugsweise in steriler Form, ergibt ein Anti-Serum, das im wesentlichen frei von Anti-Körpern ist, die für andere Globuline spezifisch sind. Man kann ebenfalls Anti-Serum von nicht-erwünschten Anti-Körpern durch Absorption des Serums mit der Gesamtfraktion aus dem Blutserum der nicht-kanzerogenen, nicht-schwangeren Personen befreien. Dieses Verfahren kann verwendet werden, unabhängig davon, ob das Anti-Serum durch Immunisierung der Gesamtglobulinfraktion des gesammelten Blutes oder mit gereinigtem T-Globulin gebildet wurde. Im Hinblick auf die Zuverlässigkeit und Einfachheit, die Präzipitinreaktion zu -beobachten, ist es bevorzugt, dass gereinigtes T-Globulin für die Injektion verwendet wird und dass das so gebildete Anti-Serum durch Absorption, wie beschrieben, gereinigt wird.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren, um die Anwesenheit von T-Globulin im Blut nachzuweisen. Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren, um T-Globulin zu reinigen und zu konzentrieren und . das dabei erhaltene Produkt. Weiterhin ist Gegenstand der*Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Anti-I-Globulinserums sowie ein Verfahren zur Herstellung, Reinigung und Konzentrierung von Anti-1¹-Globulinserum und das dabei entstehende Produkt.

Weiterhin ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren, um Blutserum aus einem Testpatienten mit Anti-T-Globulinserum unter solchen Bedingungen umzusetzen, dass die Bildung eines Niederschlags nachweisbar wird.

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Die Erfindung umfasst somit; mehrere Stufen und die Beziehung von einer oder mehreren solchen Stufen untereinander und die Zusammensetzungen, die die Merkmale, Eigenschaften und die Beziehung der Bestandteile ausmachen, werden im folgenden näher erläutert.

Die beiliegenden Zeichnungen sind beispieishafte Erläuterungen der Erfindung.

In den Fig. 1 bis 3 ist schematisch dargestellt, wie T-GIobulin durch Elektrophorese konzentriert wird;

in Fig. 4 ist eine elektrophoretische Immumreaktion dargestellt, die man mit ungereinigten Materialien erhält;

in Fig. 5 bis 8 sind ähnliche Ergebnisse dargestellt, die man mit Materialien bei verschiedenen Reinigungsstufen erhält;

in Fig. 9 iß* schematisch ein chemisches Verfahren zur Eeinigung von T-Globulin dargestellt und

in Fig. 10 ist gezeigt, wie eine Vielzahl von Inuaunreaktionen auf einem einzigen Objektträger durchgeführt werden kann, wenn man reines Immumserum verwendet.

Im folgenden wird eine bevorzugte, erfindungsgemässe Ausführungsform beschrieben.

Drei Grundstufen sind erforderlich, um den erfindungsgemässen Immunreaktionstest durchzuführen. Diese sind:

1. Herstellung einer T-Globulinfraktion aus Blut, das

man von Personen, von denen bekannt ist, dass sie kanzerogen sind, oder von schwangeren Frauen erhalten hatte.

2. Herstellung eines Anti-T-Globulinserums aus dem Blut.

3. Umsetzung einer Probe von einem Testpatienten mit Anti-

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T-Globulinserum, wobei die Probe geraäss einem ähnlichen Verfahren wie bei Stufe 1 erhalten wurde.

Diese Stufen können auf einer Vielzahl von Wegen durchgeführt werden, wobei die Variationen hauptsächlich bei der Reinigung des Testmaterials auftreten und wobei die Leichtigkeit und Gewissheit bei der Durchführung des Versuche erleichtert wird.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch zu beschränker. In ihnen sind die einzelnen Stufen näher erläutert. Auf welche Weise die Stufen vereinigt werden können, ist aus den Beispielen ersichtlich.

B e i s ν i e 1 1

Herstellung von gereinigter T-Globulinfraktion: Erstes Verfahren

Frisches, steriles Gesamtblut wurde Patienten,von denen bekannt war, dass sie kanzerogen oder krebskrank waren und schwangeren Frauen entnommen. Es wurden keine Anti-Koagulantien oder Präservative zugefügt oder waren erforderlich. Das gesammelte Blut'wurde·1 Std. bei 37⁰C und dann.im Eisschrank Übernacht bei ungefähr 4° C aufbewahrt. Das Serum würde dann abgetrennt, wenn es erforderlich

war, es zu lagern, wurde es bei ungefähr -20^υ C gelagert. Die Globulinfraktion wurde durch Zugabe von einem halben Volumen gesättigter Ammoniumsulfatlösung zu 1 Volumen Serum ausgefällt. Der Globulinniederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt und der aus jeweils 10 ml Serum enthaltene Niederschlag wurde in 2 ml steriler physiologischer Salzlösung gelöst. Anstelle von physiologischer Salzlösung kenn man alternativ bei dieser Stufe auch Wasser verwenden.

Die einzelnen 2 ml-Proben wurden gegen physiologische Salzlösung di.slysiert, bis sie vollständig von Ammonium sulfat befreit waren. Die dialyeiorte Globulinfraktion wurde dann

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zentrifugiert, um alle unlöslichen Materialien zu entfernen. Der Gesamtproteingehalt wurde mit einem Gary Recording Spekti'ophotometer-Modell 14 bei einer Wellenlänge von 280 Angström-Einheiten, bezogen auf die Absorptionsfähigkeit von 1000 Äquivalenten zu 1 mg Protein bestimmt; die gewünschte Konzentration wurde dann hergestellt.

Es ist bekannt, dass die auf diese Weise hergestellte GIobulinfraktion mindestens 6 Proteine enthält, wobei die T-Globulinfraktion in der niedrigsten Konzentration vorhanden ist. Um die T-Globulinfraktion zu reinigen, wurde die relativ niedrige Wanderungsgeschwindigkeit dieses Materials bei der Agar-Elekcrophorese ausgenutzt. Zu diesem Zweck wurden

4 % Nobel Agar in destilliertem Wasser hergestellt, in kleine Würfel geschnitten, unter fliessendem Leitungswasser während 24 Stunden gewaschen und dann 6 χ mit destilliertem Wasser gewaschen und sechsmal geschüttelt, wobei bei jedem Waschen 2 1 Wasser verwendet wurden. Das Agar wurde dann in einem siedendem Bad verflüssigt und mit 0,2 M Natriumbarbital in einem 1 : 1 Volumenverhältnis verdünnt. Barbital ist aas Natriumsalz von 5i5~Diäthylbarbitursäure und hat einen pH von 8,6. Bei diesem Verfahren erhält man einen 2%igen Pufferagar, der während 15 Minuten in einem Autoklaven mit Dampf von 121° C behandelt wurde. Zu jeweils 10 ml verdünntem Agar . wurde als Präservativ 0,1 ml Merthiolat (Thimerosal) (1 : 1000) zugegeben.

In eine 10 cm Petri-Schale gab man ungefähr 30 ml des oben hergestellten Agars und liess diesen verfestigen. Ein Glasobjektträger· 75 x 50 mm wurde auf den Agar gegeben. Auf diesen Objektträger goss man weitere 30 ml Agar und liess diesen verfestigen. Man erhielt dabei auf dem Glasobjektträgor eine Agar-Schicht mit einer Dicke von 4 mm. Die Petri-Schäle wurde bedeckt und bei 4° C während 24 Stunden aufbewahrt. Bei Bedarf wurde der Objektträger zusammen mit der 4'tnm Agar-Schicht auf ihn aus den umgebenden Agar ausgeschnitten. Ein rundes Loch mit einem Durchmesocr von

5 mm wurde in der lutte des ^bjektträgerD in den Agar ge-

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schnitten. In dieses Loch gab man 0,08 ml einer Fraktion mit 20 mg/ml Gesamtprotein der Gesaratglobulinfraktion und diese wurde während 2 Stunden bei einem Strom vom 20 mA der Elektrophorese unterworfen. Das. Aussehen des Objektträgers zu diesem Zeitpunkt ist in Fig. 1a dargestellt. Ein Agar-Streifen 40 χ y mi, der das oben erwähnte Loch enthielt, wurde dann wie in den Fig. 1b und 1c dargestellt ist, ausgeschnitten. Von einem zweiten Objektträger, der ebenfalls mit Agar überzogen war, wurde eine Mulde in den gleichen Dimensionen wie die erste ausgeschnitten, die aber in entgegengesetzter Eichtung, wie in Fig. 2a dargestellt ist, ausgerichtet war. Der Agar-Teil, der aus dem ersten Objektträger entfernt wurde, wurde in den Trog des zweiten Objektträgers gegeben, wobei man die in Fig. 2b gezeigte Anordnung erhielt und die erneut während 2 Stunden 20 mA · der Elektrophorese unterworfen wurde.

Nach der zweiten Elektrophorese hatten sich die Proteine, wie in den schwarzen Flächen der Fig. 2b angezeigt ist, getrennt. Der offene Kreis zeigt, wo eine 5 mm-Scheibe aus dem Agar ausgeschnitten wurde, wobei das Agar in diesem Bereich im wesentlichen reines Tq?Globulin enthielt. '■

i^vian nimmt an, dass das T-Globulin, wenn es in Blut gelöst ist, in konjugierter Form vorliegt. Als Folge davon ist T-Globulin·, das gemäss dem obigen Verfahren oder gemäss dem Verfahren von Beispiel 2 isoliert wurde, frei von lebensfähiger Umgebung und kann als neue Verbindung, die durch eine extrem niedrige Mobilität bzw. Beweglichkeit bei der Elektrophorse gekennzeichnet ist,betrachtet werden.Bei einem Strom von 20 mA durch ane 4 mm dicke Schicht von Agar,gepuffert auf einem pH-Wert von 8,6 auf einem Objektträger 75 nun χ 50 ram mit einem Stromfluss in der Längsrichtung . beträgt die Wanderungsgeschwindigkeit von T-Globulin in Eichtung auf die positive Elektrode ungefähr 5 mm/Stunde. Der Spannungsgradient unter diesen Umständen beträgt ungefähr 4,5 Volt/cm. Das Molekulargewicht von T-Globulin wird zwischen 115 000

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und 170 000 geschätzt, wobei man die Sedinentationsgeschwindigkeit unter Verwendung von Ultrazentrxfugieren zugrundelegtc.

Beispiel 2

Herstellung einer gereinigten T-Globulinfraktion: Zweites Verfahren

Zu 1 Liter gesammeltem Serum, das man von Tumorpatienten entnommen hatte, fügte man 5OO ml gesättigte, wässrige Ammoniumsulfatlösung. Die gesamte Globulinfraktion, die dabei ausgefällt wurde, wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und in 5OO ml sterilem, destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung enthielt ungefähr 36 mg/ml an Protein.

Die Verfahrens st df en werden an Hand eines 10 ml-Teils der obigen Lösung erläutert. In ein Reagensglas gab man zu 0,6 ml Salzlösung 0,6 ml PercHorsäure 70 bis 72 %. Bei dem Vermischen der beiden Verbindungen wurde etwas Wärme gebildet. Die Lösung wurde daher vor der Zugabe der Proteinlösung gekühlt, um eine mögliche Denaturierung zu vermeiden. Die Proteinlösung wurde dann schnell unter heftigem Rühren zugefügt. Die gebildete Suspension wurde zentrifugiert und danach wurde die Flüssigkeit, die als "überstehende Lösung I" bezeichnet wurde, entfernt. Der Feststoff, der als "Niederschlag I" bezeichnet wurde, wurde in 2 ml Salzlösung plus 1 ml 1H NaOH suspendiert. Weitere NaOH wurcle zugefügt um .den pH-Wert auf 7>0 einzustellen. Die Suspension wurde zentrifugiert, dann wurde die überstehende Lösung II, die 3 mg/ml Protein in den 3 ml Volumen enthielt, abgetrennt. In dieser überstehenden Lösung war kein T-Globulin enthalten und sie wurde entfernt. Der Feststoff, der als "Niederschlag II" bezeichnet wurde, wurde in 2 ml Salzlösung (pH 7»0) plus 2 ml Salzlösung mit einem pH von 10,0 suspendiert. Dieso letztere Salzlösung wurde hergestellt,indem man 0,2 ml 1M NaOIi au 15 ml Salzlösung zufügte. Der pH-Wert wurde dann unter Verwendung von Im-NaOH auf 8,0 eingestellt.

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Bei diesem pH-Wert geht das T-Globulin in Lösung, so, dass man beim Zentrifugieren überstehende Lösung III erhält, die ind?« 4· ml Volumen 23 mg/ml Frotein enthält. Das Protein war gereinigtes T-Globulin. Die Fraktion an Feststoffen, die als "Niederschlag III" ' bezeichnet wurde, wurde mit 2 ml Salzlösung mit einem pH-Wert von 8,0 gewaschen. In diesem Verfahren wird solches T-Globulin, das am Niederschlag III haftet, gelöst und man erhält eine weitere Charge an T-Globulin. Die Waschlösungen wurden mit der überstehenden Lösung III vereinigt und die vereinigte Lösung war dann fertig, um bei der Herstellung von Inokulum, das in ein geeignetes Tier injiziert wurde, verwendet werden zu können.

Der Niederschlag IV, der durch weiteres Zentrifugieren erhalten wurde, enthielt kein T-Globulin und wurde verworfen. Die Reihenfolge der Stufen ist in Fig. 9 dargestellt und in Tabelle I zusammengefasst.

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Verteilung der 1-rotoine , die in der Amraoniunißu] . fatfraktion bei ve rs chi ο den Oji pJI-V/erton vorhanden sind in Beziehung au

T-Globulin

Fraktion

pH Vol. (cm?)

Ursp riixigl i ehe s Material

Überstehende Lösung 1 neutralisiert auf

Überstehende Lösung II, eingestellt auf

7,6

7,0

Überstehende Lös-Bung III, eingestellt auf 8,0

Waschwasser vom Niederschlag II 8,0

Niederschlag IV, eingestellt auf

mg/cra"'
Protein

Ge S amtpro toin

360

Kein T-Globulin

Hauptsächlich T-Globulin

240
KeinT-Globulin

359

Die letzte Stufe, wie sie in Fig. 9 und Tabelle I gezeigt wird, nämlich die Re-Suspension und das Lösen von Niederschlag IV wird im allgemeinen nicht durchgeführt. Diese Stufe wird jedoch nur angezeigt, um den Bestand der Proteine, die ursprünglich in der Ammoniumsulfatfraktion vorhanden waren, zu vervollständigen.

Das hier beschriebene Verfahren kann auch in grössercm ßtab durchgeführt werden, je nachdem, in welchen Mengen dns T-Globulin gebraucht wird. Es ißt nur erfordorlich, dass lU

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-Afc::

BAD ORIGINAL

erit-,\;pricher·.do Vorrat von kanzerogen Patienten odor schwangc:i';.n i'rauon zur Verfugung steht. Es ist ersichtlich, dass die Clu.vlkalien, die bei ciom Verfahren verwendet worden, billig Kind und leicht zur Verfügung stehen. Weiterhin ist auch nicht viel Arbeit erforderlich, um das Verfahren in gro r, 3 cn] K as e t ab d ur oh ζ u führen.

Herstellung von Anti-I'-Globuliriseruia: Erstes Verfahren

Zur Herstellung von Anti-T-Globulinserum ( das ebenfalls als "Immunserum" bezeichnet wird) wird ein Junges, erwachsenes Kaninchen mit einem Körpergewicht von ungefähr 2 kg verwendet. Gemäss Beispiel 2 erhaltenes T-Globuliii wurde in Salzlösung auf einem Gehalt von 2,5 mg/ml verdünnt. 6 ml dieser Lösung wurden mit 6 ml vollständigen Freund¹s-Adjuvans vermischt. Diese Mischung wurde als Inokulum verwendet.

Die Zusammensetzung von Freund¹s-Adjuvanslosung war 5 ml Salzlösung, 3 ml Arlacel A, 6 ml Bayol.F, 25 mg in der Wärme getöteten Mycobactcrium tuberculous Typ H37KU var. hominis und 2 rag Merthiolat (Thimerosal). Arlacel A ist ein Mannitester-monooleat und Bayol F ist ein Paraffinöl. Beide werden in dem Katalog von Difco Laboratories, Detroit, Michigan, angegeben. Andere Öle können ebenfalls verwendet werden. Anstelle der Tuberkelbazillen als antikörper-stimulierendes Adjuvans bei der Herstellung von Anti-T-Globulinserura kann man ebenfalls eine ölemulsion aus Aluminiumphosphat gemäss dem von Hayuard & Augustin, Int. Arch. Allergy, 2_, 192 (lsi??) beschriebenen Verfahren verwenden. Andere Adjuvantien, die verwendet werden, sind Tapioka, phosphoryliertos Hesperidin und Erdnussöl.

Das Kaninchen wurde zuerst intra-kutan mit 2 ml des Itnokulunifj an 10 getrennten Mollen am rasierten Abdomen inokuliert

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Die so Inokulierung wurde 'zweimal im. Verlauf von 1 IVoehe v;iederholt, berechnet von der ersten Inolculierung und danach konnte das Kcininchc-n 1 Woche ausruhen. Im Verlauf der dritten Woche wiuxj.en dro.L ähnliche Injektionen durchgeführt, so dass das Kuninchen scb.liesr.lich mit insgesamt 15 nip; !'-Globulin ixiokaliert war.

10 Tage nach der letzten Inokulation wurden eine Blutprobe von 2 "bis 5 ^ml aus einem Ohr entnommen und das Imraunaorum wurde aus der Probe gewonnen und erneut gegen ein Serum eines Krebspatienten getestet, dessen Zustand genau bekannt war. Das Testverfahren wird im folgenden näher erläutert.

Als Kegel ermöglicht das Immunserum bei dieser Stufe eine Immunreaktion, die für diagnostische Zwecke ausreicht. Wenn jedoch die Reaktion zu schwach ist,verabreich man dem Kaninchen ein oder mehrere Zusatzinokulationen. Wenn die Immunreaktion der Testprobe stark genug ist, wird das Kaninchen durch Herzpunktur vollständig ausgeblutet, dabei erhält man ungefähr 100 ml Blut. Das Blut wird ungefähr 24 Stunden bei ungefähr ^l\ C aufbewahrt und stand zur Gewinnung des Iramunserums zentrifugiert.

Bei spiel 4

Herstellung von Anti~T-Globulinscrum: Zweites Verfahren

Zur Immunisierung von einem Kaninchen wurden 60 Scheiben hergestellt, wie es in Beispiel 1 und Fig. Ja beschrieben wurde, mit 2^L\ ml Freund's vollständigem Adjuvans der in Beispiel 5 gegebenen Zusammensetzung vermischt. Diese Bestandteile wurden in einem Glasrohr mit einem TefIon-Rotationsraischer emulgiert.

Injektionen den obigen Materials .Ln ein Kaninchen wurden fο 1 gοiιderinas: ;Jι durchgο führt:

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BAD ORIGINAL

Erste Woche, Tog 1 (erste Injektion; i.e. in die rasierten abdominalen Wände, insgesamt 4 ml, verteilt an 10 verschiedenen-Injektionsstellen/ Tag 3 (.weite Injektion).; 2 Tnl'i.m. in jeden Schenkel; Tag 5 (dritte Injektion): genau wie bei der zweiten Injektion.

Zweite Woche keine Injektionen

Dritte Woche, Tage 1, 3 und 5^: i.m. Injektionen wie am Tag 3 und. 5 der ersten Woche, unter Verwendung des oben erhaltenen Inokulums.

Das Ausbluten wurde durch Herzpunktur 10 Tage nach .der letzten Injektion durchgeführt. Das entstehende Serum wurde bei -20° C gelagert.

B e i s p, i e 1 ^

Reinigung von Immunserum

Das aus dem Kaninchen wie in den Beispielen 3 und 4 beschriebene beschrieben erhaltene Immunserum enthält eine Vielzahl unerwünschter Antikörper, die mit dem Serum der schwangeren Prauen oder von ICrebspatienten eine nicht-spezifische Immunreaktion ergeben können. Wenn das Immunserum für die Immunreaktion mit der Globulin fraktion einem Testpatienten durcli Elektrophorese, wie im folgenden beschrieben, untersucht wird, zeigt das Testobjektiv so viele Linien von

Niederschlagen, dass es schwierig wird, die Linie auszuwählen, die der Anwesenheit von Anti-T-Globulin entspricht.

Um das gewünschte reine Immunserum zu erhalten, wird ein Gesamtglobulin-Niederschlag mit Ammoniumsulfat aus dem Serum einer gesunden, nicht-schwangeren Person hergestellt. Der Niederschlag wird mit Wasser gewaschen und so in Wasser suspendiert, dass die Suspension 20 mg/ml Protein enthält. Diese Suspension wird mit dem Immunserum in einem Verhältnis von 1 Vol.teil Suspension mit 5 Teile Serum vermischt und die Mischung wird dann 2 Stunden boi 37° 0 inkubiert. Die

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Wischung wird zentrifugiert und die j^;'c«t«toffe werden entfernt; die überstehende Flüssigkeit v.\.a- gereinigtes Immunserum.

Be is ρ i e 1 6

Überziehen von Erythrocyten mit Immunserum

V/enn die Anwesenheit von T-Globulin in dem Serum eines Testpatienten gemäss einer Agglutinationsreaktion mit dem Immunserum bestimmt werden soll, ist es zweckdienlich, das Anti-T-Globulin des Immunserums als Überzug auf Teilchen der geeigneten Grosse zu verwenden, da diese Technik den Nachweis einer Immunreaktion erleichtert. Eine Art von Teilchen, die verwendet werden, sind Erythrocyten. Zu diesem Zweck werden Erythrocyten von Schafen dreimal mit physiologischer Salzlösung gewaschen, wobei das Waschwasser durch Filtration entfernt wird. 1 ml des gepackten Filterrückstands wird in 40 ml Salzlösung, die auf einen pH-Wert von 7»2 gepuffert ist, suspendiert, wobei eine Suspension mit eine*¹ Konzentration von 2,5 % Erythrocyten erhalten wird.

Eine Mischung aus gleichen Volumen, beispielsweise jeweils 20 ml, dieser Suspension und einerO,OO5%igen Lösung an Gerbsäure in Salzlösung, gepuffert auf pH 7»2, wurden 10 Minuten bei 37° C inokubiert. Die Gerbsäure wurde zugegeben, um die Haftung des Anti-T-Globulins an die Erythrocyten zu erhöhen. Man kann für diesen Zweck ebenfalls bisdiazotiertes Benzidin verwenden.

Die Mischung wurde zentrifugiert und die Feststoffe wurden erneut in soviel Salzlösung suspendiert, dass die Suspension 2,5 % Erythrocyten enthielt; die Suspension wurde bei 5° C aufbewahrt und innerhalb von 18 Stunden verwendet, um Erythrocyten-Zellen mit T-Globulin-Anti-Körperserua zu überziehen. Herthiolat (Thimerosal) oder Natriumazid können ale Präservative zugefügt werden.

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Die Beschichtungsreakt.i on. wurde durchgeführt, indem man 1 ml dor Suspension zu einer Mischung auf 1 ml Serum und 4 al Salzlösung, gepuffert auf pH 6,5, zugügte, und danach die Mischung mit ausreichend Salzlösung verdünnte, so dafiß der Proteingehalt der Suspension 5 mg/ml "betrug. Gehalte zwischen ungefähr 0,1 und 10 mg/ml sind zufriedenstellend. Der genaue G-rad der Verdünnimg,der erforderlich ist, um die gewünschte Proteinkonzentration zu ergeben, kann durch Vorversuche bestimmt werden.

B ei s ρ i,,e 1 7

überziehen von Latexteilchen mit Immunserum

Die Verwendung von Erythrocyten ist wünschenswert im Hinblick darauf, dass die Agglutinationsreaktion sichtbar wird; Latexteilchen können für diesen Zweck ebenfalls verwendet werden.

Eine Suspension von im Handel erhältlichen Polyvinyltoluoi-Latex, die ungefähr 11 % Feststoffe mit einer Teilchengrösse von ungefähr 0,77 Hikrön erhielt, wurden mit der lOfachen Volumenmenge, an Wasser verdünnt. Die Suspension wurde durch ein Papier filtriert und das PiItrat wurde dann verdünnt, um eine Stocklösung bzw. Vorratslösung zu ergeben. Die Konzentration der Stocklösung wird vorzugsweise so eingestellt,' dass, wenn in einem Verhältnis von 1 : 100 mit Salzlösung ' pH 8,2 durch Borat oder Glycin gepuffert, verdünnt wird, die entstehende Lösung eine Transmission von 6 % bei 6500 S, besitzt, bestimmt in einem Coleman Universal Spektrophotometer.

Die Suspension wurde dann mit T-Globulin-Antikörperserum vermischt, wobei man eine solche Menge verwendete, dass die -iMidproteinkonzentration der Mischung 0,25 mg/ml betrug.

Andere Latices,beispielsweise ein Polystyrollatex mit einer Teilchengrößse von ungefähr 0,81 Mikron oder ein Bakterio-

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phng können ebenfalls zufriedenstellend verwendet werden. Mit Bakteriophag konn Toluol--2,4--diisocyanat als Haftmittel verwendet werden. Beispielcv/oise ist die Verwendung von Bakteriophagen für diesen Zweck in Science 1J>. Juni 1969, 164, Seite 1279 bis 1280 von Joseph. Haimovich und Michael SeIa, "Protein-Bacteriophage Conjugates" Application in Detection of Antibodies end Antigens" beschrieben.

Nachweis von JL¹-Globulin im Serum

Wenn einmal ein reines Anti-T-Globulinserum zur Verfugung steht, dann kann das Serum eines Testpatienten "auf die Anwesenheit von T-61obulin untersucht werden, bei spiel f;wei se durch relativ einfache Techniken, wie Ausfällung und Agglutination wie auch durch Immunoelektrophorese. Diese Verfahren werden zeigen, ob eine Präzipitinreaktion aufgetreten ist. Sie geben aber nicht an, welches Globulin für den Niederschlag verantwortlich ist. Wenn reines Immunseruai nicht zur Verfügung steht, ermöglicht das Immunoelektrophorese-Verfahren die Anwesenheit von T-Globulin festzustellen. Dieses Verfahren ermöglicht, ausserdem die Wirkung der Reinigungs- und Konzentrierverfahren für das Material das als T-Globulin bezeichnet wird und für.das Iminunserum festzustellen. Verfügbare Verfahren, um de Antigen-Antikörperreaktion und den Nachweis, die Immunoelektrophorese, die Ausfällung und die Agglutination durchzuführen, wie auch Verfahren, um die Injektion desTieres zur Herstellung des Serums durchzuführen, sind in einer Anzahl von Veröffentlichungen beschrieben, beispielsweise "Structural Concepts In Immunology and Immunochemistry" von Elvin A. Kabat, beginnend auf Seite 29, publiziert von Holt, Rinehart & Winston, Inc. in 1968 und in "Experimental Iminunochoaiistry" von Elvin A. Kabat und Manfred H. liayer, publisziert von Charles C. Thomas, Springfield, Illinois, Edition 2, 19&1· Diese Verfahren werden daher nicht in Einzelheiten in der Anmeldung beschrieben.

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BAD ORIGINAL

ft _^e-A ß ρ, \. ^e„Λ ..-8

nachweis von T~Globulinserum von Testpatienten durch Immunelektrophorese

Objektträger in einer Grosse von 75 fflin χ 25 Dim wurden gemäßs dem gleichen Verfahren hergestellt, wie es oben beschrieben wurde und bei der elektrophoretisehen Reinigung von !'-Globulin 'verwendet wurde. Ein Trog und zwei Löcher wurden in jedem Objektträger,wie in den Pig. 4- bis 8 gezeigt wird, geschnitten. Diese Figuren sind Zeichnungen,, die den Photograp-hien entsprechen,, wie sie in.Israel Journal of Medical Sciences, Vol. 6, November bis Dezember 1970, Seite 708, reproduziert sind. Bei allen Versuchen wurde das Immunserum in den Trog gegeben und die Ammoniumsulfatfraktion aus Serum aus einem Testpatienten oder aus gesammeltem Blut wurde in ein Loch gegeben und eine ähnliche Fraktion aus von nicht-kanzerogenen, nicht-schwangeren Personen wurden in das andere Loch gegeben. Die Ammoiiiumsulfat-fraktionen wurden in zwei Verdünnungen, nämlich 20 mg/ml und 10 mg/ml hergestellt,. In den Fig. 4· bis 8 sind nur Objektträger aufgeführt, die mit 20 mg/ml hergestellt wurden. Die Immunoelektrophorese wurde_iwährend 1 Stunde bei einem Strom von 10 mA pro Objektträger durchgeführt, wobei man ein O,O5m-Natriumbarbital-Pufferbad mit einem pH-Wert von 8,6 verwendete. Die Objektträger.wurden dann in eine Petrischale, die mit feuchtem Filterpapier aufgelegt war, gegeben, um zu verhindern, dass das Agar trocknete und dann wurde bei 37° C Übernacht inkubiert. Die Proben wurden anschliessend bei 4° C Übernacht aufbewahrt und untersucht. Das Ergebnis wurde als positiv betrachtet, wenn die T-GIobulin-Niederschlagslinie in beiden Verdünnungen vorhanden war und negativ, worin sie in beiden Verdünnungen abwesend war. Grenzfälle waren solche, wo sie nur bei der 20 mg/ml-Verdünnung positiv war.

Das Verfahren,gemäss dem festgestellt wurde, dass eine spezifische Linie in einem Objektträger, der eine Vielzahl von !Anion enthielt, zu einem gemeinsamen Faktor zugeordnet

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werden kann, ist aus den Fig. 4 bis 8 ersichtlich. In dor Fig. 4- enthält das Loch A die Ammoniumsulfatfraktion aus gesammeltem ßeruin von Krebspatienten. Das Loch B enthält ein ähnliches Material von nicht-kenzerogonen Patienten. In beiden Löchern betrug die Konzentration 20 mg/in] an Gesamtprotein. Der Trog enthielt Immunserum, hergestellt aus der Ammoniumsulfat.fraktion von Serum von Krebspatienten. In Fig. 4- ist die Linie, die als T-Globulinliiiie durch den Pfeil angezeigt ist, kaum nachweisbar,'da so viele andere Präzipitinlinien vorliegen.

In Fig. 5 enthalten die Löcher A und B das gleiche Material wie in Fig. 4. Der Trog enthält jedoch Serum, das aus einer gereinigten Fraktion hergestellt wurde, die man wie in Fig. Ja angegeben, durch Elektrophorese erhalten hatte. Es sind weniger Linien als in Fig. 4- vorhanden, so dass die T-Globulinlinie jetzt leicher in dem Bereich des Loches A erkennbar ist. Es ist ersichtlich, dass diese Linie in dem Bereich des Loches B nicht auftritt. Dieses Ergebnis ist schematisch in Fig. 3b dargestellt.

Der in Fig. 6 dargestellte Objektträger enthält ebenfalls in &em Trog ein Anti-Serum_fhergestellt gegen gereinigtes T-Globulin in dem Trog und hat in den Löchern A und B Scheiben, die jeweils von der Ammoniumsulfatfraktion eines Krebspatienten und eines nicht-kanzerogenen Patienten hergestellt wurden. Die Anzahl der Linien in dem Objektträger ist erneut erniedrigt und die T-Globulinlinie ist nur bei dem Serum von Krebspatienten identifizierbar.

Der Objektträger von Fig. 7 wurde hergestellt mit absorbiertem Kaninchen-Anti serum im Trog, der Ammoniumsulfatfraktion von gesammeltem Krebspatienten im Loch A und der Ammoniumsulfatfraktion von gesunden, nicht-schwangeren Personen im Loch B. In diesem Objektträger ist die T-Globulinlinie noch stärker bei dem Loch A zu erkennen und im Teil des Objektträgers nahe am Loch B tritt sie nicht auf.

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- 2Λ -

Der Objektträger von Fig. 8 wurde mit elektrophoretisch gereinigten Scheiben aus der iviamoni ums ulf at fraktion von Krebspatienten in Loch A und einem ähnlichen Material von gesunden, nicht-schwangeren Personen in Loch B hergestellt. Nun verbleibt nur noch eine einzige Linie und es ist ersiehtlieh, dass gesunde, nicht-schwangere Personen nicht die Linie ergeben, die der Verbindung, die als "!•-Globulin" bezeichnet wurde, zugeordnet wird.

Der Stufenverlauf,gemäss dem die gewünschte Linie identifiziert wurde, ist in der folgenden Tabelle II angegeben.

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BAD ORlQlNAt

T a b eile II

Immunruaktion-Zusammensetz.unßen

Bestandteil des Lochs Bestandteil des Trogs

Ungereinigte, gesammelte PiObe von Krebspatienten

Ungereinigte, gesammelte Probe von Krebspatienten

Gereinigte Scheibe von Krebspatienten

Ungereinigte, gesammelte Probe von Kxebspatienten

Gereinigte Scheibe von Krebspatienten

Ungereinigte,
gesammelte Probe
von nicht-kanzerogenen, nichtschwangeren Patienten

Gereinigte Scheibe von nichtkanzerogenen ,
nicht-schwangeren Patienten

Gereinigte Scheibe von nichtkanzerogenen ,
nioht-schwangeren Patienten

Anti-Serum, hergestellt gegen eine ungereinigte _t gesammelte Probe von Krebspatienten

Anti-Serum, hergestellt gegen gereinigtes T-Globulin

Anti-Serum, hergestellt gegen gereinigtes T-Globulin und dann absorbiert

Anti-Serum, hergestellt gegen gereinigtes T-Globulin, dann absorbiert

Bemerkung:

Die gesammelten Proben, die in Loch A verwendet wurden, umfassten Blut von schwangeren Frauen

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Ein Vergleich der I'lg. 4 bis 7 mit Tabelle II zeigt, dass man durch Reinigung des !-Globulins in dem gesammelten Serum von Krebapatienten und schwangeren Frauen,durch Reinigung des Serums von Testpatienten und durch Absorption des Anti-Serums eine Verbesserung in der Klarheit der Objektträger erhält.

Unter Verwendung der oben beschriebenen Reinigungsverfahren wurden.520 kodierte Blutproben untersucht, jede bei Verdiinnungen von 10 mg und 20 mg/ml Gesamtprotein. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

A. 343 positiv bei beiden Verdünnungen

B. 13 positiv nur bei der 20 mg/ml-Verdünnung G. 164 negativ bei beiden Verdünnungen.

Die kodierten Blutproben stammten aus Patienten eines Krenkenhauses, wobei die Patienten von Personen ausgewählt wurden, die mit den Untersuchungen in keinem Zusammenhang standen. . ^J

Man fand später, dass die 343. positiven Proben von den folgenden Fällen stammten:

337 Krebs von verschiedenen Formen und bei verschiedenen Entwicklungsstufen; eine Schwangerschafts-Toxikämie, eine Thrombophlebitis, 1 Woche, nach Entbindung; eine Lungenembolie, 2 Wochen nach Entbindung und drei Fälle von vermutetem, aber noch nicht bestätigtem Krebs.

Es ist. bemerkenswert, dass von den 337 Krebsfällen 12 zu dem Zeitpunkt, als die Blutproben entnommen waren, noch nicht diagnosti-ziert waren. Innerhalb von 1 Jahr wurde die Krebsdiagnose bestätigt.

Man fand, dass die 13 Proben, die nur in einer 20mg/ml-Verdünnung positiv waren, alle Fälle von fortgeschrittenem

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Krebs waren und dass man bei allen stärke P>e strahl uncütherapie und cytotoxische Therapie augewanät hatte.

Die 164 negativen Proben stammten von 163 nicht-schwangeren Patienten mit einer Vielzahl von nicht-neoplastiscben Zuständen und von einem Patient mit cystojarcoma phylloden der Brust.

In allen Fällen, sowohl in den positiven als auch den negativen, bestand keine Verbindung zwischen den serologischen Ergebnissen und der Art oder »Stufe des Krebses,' der Natur des nicht-kanzerogenen Zustandes oder dem Geschlecht oder dem Alter des Patienten. Er erscheint daher, dass die Anwesenheit von T-Globulin im Serum ein Beweis dafür ist, dass der Spender des Blutes entweder Krebs hat oder schwanger ist (oder kürzlich war) und dass daher eine Immunreaktioii gegenüber Anti-T-Globulinserum die Anwesenheit von einem oder beiden dieser Zustände anzeigt.

Beispiel 9

Nachweis von T-Globulin im Testserum durch Ausfällen oder Agglutination

Verwendet man reines Immunserum, hergestellt wie oben beschrieben, ist es auf einfache Wej.se möglich, Serum von einem Patienten auf die Anwesenheit von T-Globulin durch Ausfällung oder Agglutination zu untersuchen, wobei man bekannte Verfahren, wie sie von Kabat beschrieben wurden, verwendet. Da die Reaktion auf T-Globulin spezifisch ist, muss das Serum von dem Testpatienten nicht gereinigt werden, obgleich eine solche Reinigung gewünschtenfalls durchgeführt werden kann.

Es sei bemerkt, dass hier von dem Serum selbst von einer Testperson und nicht \^ron dem Aranioniumsulf at-Niederechlag gesprochen wird. Hat man einen Lagorbentund an reinem Immunserum zur Verfügung, so kann e;in Ü.V:i.rtpatic\nt auf Krobr,

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(oder Schwangerschaft) untersucht werden, indem mfm einfach eine Blutprobe entnimmt, die roten Blutzellen, von dem Serum abtrennt und das Serum in geeigneter Verdünnung mit reinem Immunserum unter solchen Bedingungen "behandelt, dass die Präzipitinreaktion sichtbar ist.

Geeignete Verfahren für die Präaipitinreaktionen sind oben bereits beschrieben. Ein besonders geeignetes Verfahren ist jedoch in Fig. 10 dargestellt. Hier wird reines Immunserum in einem langen Trog gegeben und Serumproben· von verschiedenen Versuchspersonen können in jedes Loch gegeben werden. Alternativ kann das Serum einer einzigen Testperson bei verschiedenen Verdünnungen (mit Salzlösung) untersucht werden. Der Bereich der Verdünnungen kann beispielsv^eise im Bereich 1 : 40, 1 : 80, 1 : 160, 1 : 320 und 1 : 640 liegen. Die Ergebnisse, die man erhält, wenn man Serum in solchen Verdünnungen untersucht, sind in den Löchern C, D, E, F und G der Fig. 10 dargestellt. liier beobachtet man eine positive Reaktion nur bei Verdünnungen bis zu 1 : 160. Bei grösseren Verdünnungen erhält man negative Ergebnisse.

Es wurde gefunden, dass eine Verdünnung von 1 : 80 zufriedenstellend ist, wenn jede Probe nur bei einer Verdünnung untersucht wird. Fünf Testergebnisse, die man bei dieser Verdünnung erhalten hat, sind in den Löchern M, H, 0, P und Q dargestellt. Eine positive Reaktion wird nur von den Proben in den Löchern II, 0 und Q gegeben.

Es soll bemerkt werden, dass bei der hier beschriebenen Anordnung, obgleich diese ähnlich ist, wie eine solche, die bei der Immunoelektrophorese verwendet wird, kein.Strom durch den Objektträger geleitet werden muss. Der Grund ist der, dass Strom verwendet werden muss, um die verschiedenen Präzipitinlinien durch die V/anderungsgeschwindigkeiten der verschiedenen Antikörper zu trennen; die Trennung ist erforderlich, wenn mehr als ein Antikörper vorhanden ist. Da das reine Immunsorum monospezifisch ist, kann nur eine Linie 'gefunden werden. D era ent sprechend kann keine Trennung

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auftreten und Strom ist nicht erforderlich. Wenn die Präzipitinreaktion in einer gelierten Schicht auf dem Objektträger ohne Stromdurchgang durchgeführt wird, ist dies somit eine Variante eines doppelten Diffusionsverfahrens; doppelte Diffusionsverfahren sind ebenfalls von Kabat,in der oben angegebenen Literaturstelle beschrieben. Der Vorteil eines Objektträgers mit einer Vielzahl von Löchern besteht darin, dass eine Vielzahl von Proben gleichzeitig untersucht werden können.

Es erscheint besonders bemerkenswert, dass eine einzige Verbindung, nämlich T-Globulin, im Serum von Krebspatienten auftritt, ohne dass eine offensichtliche Beschränkung auf die Krebsart beobachtet wird. Die erfindungsgemässen Verfahren wurden entwickelt, um die Identifizierung von T-Globulin in dem Serum von Testpatienten zu erleichtern und sicher zu machen. Die Erfindung soll nicht auf die in den Beispielen beschriebenen Verfahren beschränkt werden, da diese Verfahren variiert werden können. Solche Variationen umfassen die Verwendung der Technik hängender Schleier (hanging curtain technique), (kontinuierliche Elektrophorese) für die Isolierung und Reinigung von T-Globulin, die Verwendung anderer Säugetiere oder"Vögel für die Herstellung des Immunserums in Mengen und die Herstellung von Antigen als Emulsion in öl unter Verwendung von Emulgiermitteln, beispielsweise Lanolin.

Die oben beschriebenen Verfahren können ebenfalls mit entsprechender Änderung beim Nachweis von Krebs in Tieren verwendet werden. Weiterhin können die beschriebenen Versuche, wenn der Testpatient eine Krau im Alter ist, wo sie Kinder bekommen kann, mit üblichen Schwangerschaftcnachweis-Testen verbunden werden$ ein negatives Ergebnis bei dem Schwangerschaftsnachweis, zusammen mit einem positiven Ergebnis für die Anwesenheit von T-Globulin zeigt an, dass Krebs vorhanden ist.

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Aus diesen Ausführungen ist ersichtlich, dass es viele Variationen der vorliegenden Erfindung gibt, die alle vom Rahmen der vorliegenden Erfindung mitumfasst werden sollen.

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Claims

F at e η t a_ii_.s.p r üC_- he

Im wesentlichen reines T-Globulin, wobei dieses T-Globulin die Globulinfraktion ist, die ein Molekulargewicht von ungefähr 115 000 "biß 1?0 000 besitzt und im Blut von schwangeren .Frauen und Leuten mit Krebs nachweisbar ist und die, wenn sie aus dem Serum von einem solchen Blut ausgefällt wurde, das Protein mit niedriger elektrophoretischer Beweglichkeit ist und gegen die positive Elektrode mit einer Geschwindigkeit von ungefähr 5 mm/Std. wandert, wenn ein Strom von 10 mA in dfer Längsrichtung durch eine Agar-Schicht mit einer Dicke von 4 mm auf einem 75 mm χ 25 »m Objektträger geleitet wird, wobei der Spannungsgradient längs des Objektträgers ungefähr 4,5 Volt/cm "beträgt und wobei die Agar-Schicht auf einen pH-Wert von 8,6 gepuffert ist.

2. Im wesentlichen reines T-Globulin gemäss Anspruch 1 in Salzlösung.

3. Im wesentlichen reines T-Globulin gemäss Anspruch 1 in reinem Wasser.

4. Eine Zusammensetzung, enthaltend im wesentlichen reines T-Globulin gemäss Anspruch 1 und ein Anti-Körper stimulierendes Adjuvans.

5. Zusammensetzung gemäss Anspruch 4, dadurch gekeimzeichnet, dass man als Adjuvans vollständiges Freund ¹S-Adjuvans verwendet.

6. Anti-T-Globulinserum, dadurch gekennzeichnet, d3ss das Anti-T-Globulinserum das Blutserum aus einem geeigneten Säugetier oder einem Vogel ist, denen man im wesentlichen reines ü'-Globulin von Anspruch 1 verabreicht hatte, bi:; die Tiere ßcgenübcr dem T-Globulin iii'iruiniaiert. v/nron.

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7- Anti-T-Globulinserum geiaäss Anspruch. 6, dadurch gekennzeichnet, dass das T-Globulin durch. Elektrophorese gereinigt wurde«

8. Anti-T--Globulinserum gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, class das T-Globulin durch Ausfällen mittels Perchlorsäure und Lösen bei einem pH-V/ert von ungefähr 7,8 bi3 8,2 gereinigt wurde.

9· Diagnostisches Krebstestreagens, enthaltend das Anti-T-Globulin von Anspruch 6 als Schicht auf !Teilchen aus einem Material, wie Erythrocyten, Polyvinyl-Toluollatex, Polystyrollatex und/oder Bacteriophage.

10. Gereinigtes Anti-T-Globulin im wesentlichen frei von anderen Anti-Globulinen, dadurch gekennzeichnet, dass das gereinigte Anti-T-Globulin das nicht-ausgefällte Produkt aus einer Mischung aus Anti-T-Globulinserum und dem gesamten Globulin-Niederschlag aus dem Serum einer nichtkanzerogenen, nicht-schwangeren Person ist.

11. Die gereinigte Anti-T-Globulinfraktion gemäss Anspruch

10, dadurch gekennzeichnet, dass das Anti-T-Globulin vor dem Vermischen mit dem Gesamtglobulin-Uiederschlag aus im wesentlichen reinem T-Globulin hergestellt wurde.

12. Die gereinigte Anti-T-Globulinfraktion gemäss Anspruch

11, dadurch gekennzeichnet, dass das Anti-T-Globulinserum vor dem Vermischen mit dem Gesamtglobulin-Niederschlag aus T-Globulin gereinigt durch Elektrophorese hergestellt wurde.

13· Gereinigte Anti-T-Globulinfraktion gemäss Anspruch

12, dadurch gekennzeichnet, dass das Anti-T-Globulinserum vor dem Vermischen mit dem Gescntglobulin-Niederschlag aus T-Globulin, das durch Ausfällung mit Perchlcressißsäure und Lösen bei einem pll-W'erfc von ungefähr 7>6 bis 8,2 gereinigt wurde, hergestellt wurde.

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14. Verfahren zur Herstellung von im wesentlichen reinem T~ Globulin gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Globuline aus dem Serum von mindestens einer Blutart, wie Blut von schwangeren Prauen und Blut von Personen mit Krebs ausfällt, aus diesen ausgefällten Globulinen das Globulin mit einem Molekulargewicht von ungefähr 115 000 bis 170 000 und dass eine niedrige elektrophoretische Beweglichkeit besitzt, und dass mit einer Geschwindigkeit von ungefähr 5 mni/Std. in Richtung auf die positiven Elektrode wandert, wenn ein Strom von 20 mA in Längsrichtung durch-eine Agar-Schicht von einer Dicke von 4 mm auf einen Objektträger mit einer Grosse von 75 x 50 nim geleitet wird, wobei der Spannungsgradient längs des Objektträgers ungefähr 4,5 Volt/cm beträgt und wobei die Agar-Schicht auf einen pH-Wert von ungefähr 8,6 gepuffert ist, isoliert.

15· Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das T-Globulin ausgefällt wird, indem man ausreichend gesättigte Ammoniumsulfatlösung zu dem Serum zufügt, um alle Globuline auszufällen.

16. Verfahren gemäss Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet, dass der Niederschlag in Wasser wieder gelöst wird.

17· Verfahren gemäss Anspruch 15> dadurch gekennzeichnet, dass der Niederschlag in Salzlösung wieder gelöst wird.

18. Verfahren gemäss Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet, dass der Niederschlag wiedergelöst wird und dass das T-Globulin durch Elektrophorese isoliert wird.

19· Verfahren gemäss Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Globulin-Uiederschlag in Wasser suspendiert wird und mit Perchlorsäure behandelt wird, wobei eine erste Suspension eines ersten lüederschlu.^ü in einer ersten überstehenden Flüssigkeit erhalten werden, und

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wobei die überstehende Flüssigkeit durch Zen.trifig.eren entfernt wird, der erste niederschlag in Salzlösung suspendiert und auf einen pH-Wert von ungefähr 6,8 bis 7}2 eingestellt wird, wobei eine zweite Suspension aus einem zweiten Niederschlag in einer zweiten überstehenden Lösung erhalten wird, und wobei die zweite überstehende Lösung durch Zentrifugieren entfernt wird, der aweite Niederschlag in Salzlösung suspendiert wird und auf einen pH-Wert von ungefähr 7»8 bis 8,2 eingestellt wird, wobei eine dritte Suspension eines dritten Niederschlags in einer dritten überstehenden Lösung erhalten wird und wobei die dritte überstehende Lösung gesammelt wird, wobei die dritte überstehende Lösung reiner T-Globulin in Lösung enthält.

20. Verfahren gemäss Anspruch 19» dadurch gekennzeichnet, dass der dritte Niederschlag mit Salzlösung, deren pH-Wert auf ungefähr 7»8 Ms 8,2 eingestellt wurde, gewaschen wird, man anschliessend zentrifugiert, wobei weiteres reines T-Globulin in Lösung erhalten wird.

21. Verfahren zur Herstellung des Anti-T-Globulinserums ' von Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man einem geeigneten Säugetier oder Vogel das T-Globulin, das man gemäss Anspruch 14 erhalten hatte, verabreicht, bis das Säugetier oder der Vogel gegenüber dem T-Globulin immunisiert ist, das Blut aus dem Säugetier oder Vogel- entnimmt, und das Serum aus dem entnommenen Blut gewinnt.

22. Verfahren gemäss Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das T-Globulin zusammen mit einem Antikörper stimulierenden Adjuvans injiziert wird.

25· Verfahren gemäss Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass man als Adjuvans vollständiges i'reund' s-Adjuvans verwendet.

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2Jv. Verfahren zur Herstellung des initl-T-GlobulIriseruirtc
Gemäßs Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man
einem geeigneten Säugetier oder Vogel das gemäss
Anspruch 19 erhaltene T-Globulin vorabreicht, bis das Säugetier oder der Vogel gegenüber dem T-Globulin immunisiert sind, Blut aus dem Säugetier oder Vogel
nimmt und das Serum aus dem entnommenen Blut gewinnt.

25· Verfahren zur Herstellung von Anti-T-Glubulinserum
gemäsE Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man
einem geeigneten Säugetier oder Vogel das gemäss Anspruch 19 erhaltene T-Globulin verabreicht, bis das
Säugetier oder der Vogel gegenüber dem T-Globulin immunisiert sind, Blut aus dem Säugetier oder Vogel entnimmt und das Serum aus dem entnommenen Blut gewinnt.

26. Verfahren zur Bestimmung, ob ein Patient Krebs hat oder ob er keinen Krebs ι hat oder ob ein Patient schwanger ist oder nicht-schwanger ist, dadurch gekennzeichnet, dass man die Globulinfraktion aus dem Blut des Patienten mit dem Anti-T-Globulinserum von Anspruch 6 unter solchen Bedingungen behandelt, dass eine positive
Reaktion des T-Globulins mit dem Anti-T-Globulinserum die Anwesenheit von T-Globulin in der Globulinfraktion bestätigt und dabei anzeigt, ob ein Patient Krebs hat oder ob er schwanger ist.

27· Verfahren gemäss Anspruch 26, bei dem die Globulinfraktion aus dem Blut eines Patienten mit dem Anti-T-Globulin umgesetzt wird» dadurch gekennzeichnet, dass eine Immunoelektrophoresestufe durchgeführt wird, wobei eine positive Reaktion die Bildung einer Linie
beinhaltet, die für die Anwesenheit von T-Globulin
charakteristisch ist.

28. Verfahren gemäss Anspruch 26, bei dem mindestene
die Globulinfraktion und/oder rtns Anti—T-Globulin

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gereinigt wurden, und wobei einö positive Reaktion in einem sichtbaren Präzipatinprodukt stellt.

29. !'erfahren gemäss Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Präzipitinreaktion durch doppelte Diffusion beobachtet wird.

30. Verfahren gemäss Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Präzipitinreaktion durch Ausfällung beobachtet wird.

31. Verfahren gemäss Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Präzipitinreaktion durch Agglutination beobachtet wird.

32. Verfahren gemäss Anspruch 24-, dadurch, gekennzeichnet, dass die Globulinfraktion, die mit dem Anti-T-Globulinserum umgesetzt wird, Serum ist, das aus dem Gesamtblut der Testperson stammt und wobei das Serum , ausser dass es verdünnt wurde, nicht behandelt wurde.

33· Verfahren gemäss Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet,-dass mindestens entweder die Globulinfraktion und/oder das Anti-T-Globulinserum gereinigt wurden und dass das Anti-T-Globulin in Form eines Überzugs absorbiert an fein-verteiltem Material, wie Erythrocyten, Polyvinyl-ToIuo11atex, Polystyrollatex und/oder Bacteriophage vorliegt und dass eine positive Reaktion ein sichtbares Agglutinationsprodukt ergibt.

34. li'ein-verteiltes Material, enthaltend Anti-T-Globulin, haftend an einem fein-verteilten Material., wie Erythrocyten, Polyvinyl-Toluollatex, Polystyrollatex und/oder Bacteriophage.

35· Produkt go:juiss Anspruch 3^> dadurch 'gekennzeichnet, dass das Anti-T-GIotmlin, bevor es mit dem feinver-

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teiltem Material verbunden wurde, gereinigt wurde.

36. Produkt gemäss Anspruch 3^> dadurch gekennzeichnet, dass das Anti-T-Globulin an die Erythrocyten mit Gerbsäure an die Latices mit bis-diazotiertem Benzidin und an die Bacteriophagen mit Tolylen-diisocyanat gebunden wurde.

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