DE1598928C - Reagenz zum Nachweis der infektiösen Mononukleose - Google Patents

Reagenz zum Nachweis der infektiösen Mononukleose

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DE1598928C
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English (en)
Inventor
Gail Monmouth Junction N J Hoff (V St A)
Original Assignee
Princeton Laboratories Ine , Princeton, NJ (VStA)
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Description

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Die Erfindung betrifft ein Reagens zum Nachweis' Probe vorhanden sind, zu adsorbieren. So adsorbiert der infektiösen Mononukleose, das in einer Kochsalz- zum Beispiel ein Antigen, das aus Pferdenieren herlösung suspendierte Erythrozyten zur Agglutination gestellt ist, den Forssmannschen und den Serumder heterophilen Antikörper in dem zu titrierenden krankheits-Antikörper, während ein Antigen, das aus Testserum enthält. 5 Rindererythrozyten hergestellt ist, die Antikörper der
Die infektiöse Mononukleose ist eine akute Krank- infektiösen Mononukleose und der Serumkrankheit heit, die am häufigsten bei Patienten in der Alters- adsorbiert. Die Adsorption dieser Antikörper nach gruppe von 16 bis 25 Jahren auftritt; sie ist gekenn- Behandlung mit den Antigenen zeigt sich durch den zeichnet durch Fieber, eine allgemeine Lymphknoten- Verlust der Fähigkeit des Serums, Schaferythrozyten vergrößerung und eine Lymphozytose mit atypischen io zu agglutinieren. So können nach Abtrennung der mit Lymphozyten. Im Blut der Mononukleosepatienten dem Antigen behandelten Proben diese in Reihenfinden sich gewöhnlich heterophile Antikörper, d. h. Verdünnung titriert werden,, um die Titer ihres rest-Antikörper mit einer Affinität zu verwandten oder liehen Antikörpergehaltes zu bestimmen, die ausidentischen Antigenen, die in Schafzellen, Meer- reichen, um eine Agglutination der Schaferythrozyten schweinchengewebe und vielen anderen damit nicht 15 zu erzeugen.
verwandten biologischen Substanzen festgestellt wur- Wenn man dann die im Präsumptivtest bestimmten
den; auf ihnen beruht der allgemein angewendete Gehalte mit den Gehalten nach der Adsorption zweier heterophile Antikörpertest für diese Krankheit. weiterer Serenproben im Differentialtest vergleicht,
Obgleich heterophile Antikörper in den Seren von so kann man die Art der im Testserum vorhandenen 90% aller mit Mononukleose infizierten Patienten 20 Antikörper bestimmen. Zum Beispiel ist bei Vergefunden werden, so ist bemerkenswert, daß diese Wendung von Pferdenieren- und Rinderzellenantigenen Antikörper auch im Blut von Personen, die diese der heterophile Antikörpertest für infektiöse Mononu-Krankheit nicht haben, vorhanden sind. So können kleose positiv, wenn beim Differentialtest bei der Addie Antikörper durch Injektion von biologischen Sub- sorption des Serums am Pferdenierenantigen keine stanzen, die Pferdeserum enthalten, erzeugt werden, 25 vollständige Entfernung der Antischafzellen-Aggluinsbesondere bei Personen, die nach diesen Injektionen tinine stattfindet, wogegen durch Adsorption an dem eine Serumerkrankung zeigen. Weiterhin können sie Rinderzellenantigen die Antischafagglutinine vollauf natürliche Weise in geringen Mengen als so- ständig entfernt werden.
genannte Forssmannsche Antikörper oder native Man sieht also, daß eine verhältnismäßig kompli-
Heterophile im Blutstrom erscheinen. Infolge dieser 30 zierte und zeitraubende serologische Testreihe erVielzahl von heterophilen Antikörpern, die in den forderlich ist, um die Anwesenheit von heterophilen Testseren vorhanden sein können, war es bisher nötig, Antikörpern, die für die infektiöse Mononukleose verhältnismäßig komplizierte, mehrstufige serologische charakteristisch sind, festzustellen und diese AntiTests anzuwenden, um die heterophilen Antikörper, körper von den natürlich auftertenden Antikörpern die für die Mononukleose charakteristisch sind, zu 35 und von den Antikörpern, die für die Serumkrankheit identifizieren und zu unterscheiden. charakteristisch sind, zu unterscheiden. Weiterhin
Die üblichen serologischen Tests für die hetero- wurde gefunden, daß die Titration mit Schaferythrophilen Antikörper beruhen darauf, daß diese Anti- 2yten häufig falsche positive Ergebnisse im Glaskörper durch ihre Fähigkeit, eine Agglutination von plattentest liefert, was weitere zeitraubende Versuche Schaferythrozyten hervorzurufen, nachgewiesen wer- 40 erfordert, bei denen der Präsumptivtest und der den können. Um Mononukleose nachzuweisen, wurde Differentialtest, wie sie vorstehend beschrieben sind, unter Ausnutzung dieser Erscheinung ein dreistufiger angewendet werden müssen. In einem Fall wurden diagnostischer Test entwickelt. Zuerst wird ein »Glas- 9 °/0 falsch positiv reagierende Seren gefunden (Daplattentest« durchgeführt, bei dem das auf heterophile ν i d s ο h η I., Further Studies on Heterophile AntiAntikörper verdächtige Serum mit Schaferythrozyten 45 bodies in Serum Sickness, J. Immunolog., 18, S. 31 titriert wird, um alle darin vorhandenen Antikörper bis 49 [1930]).
zu agglutinieren. Es wurde weiterhin vorgeschlagen, für den heteroFalls die Agglutination positiv ist und das Vor- philen Antikörpertest auf infektiöse Mononukleose handensein dieser Antikörper anzeigt, wird ein rohe Pferdeerythrozyten an "Stelle von Schaferythrozweiter »Präsumptivtest« durchgeführt, bei dem meh-. 50 zyten zu verwenden (P. B e e r, The Heterophile Antirere Proben des Testserums in Reihenverdünnung mit bodies in Infectious Mononucleosis and after the den Erythrozyten titriert werden. Mit diesem Test soll Injection of Serum, J. Clin. Invest, 15, S. 591 bis 599 der Titer des gesamten heterophilen Antikörper- [1936]; A. M. Barrett, The Serological Diagnosis gehalts des Testserums bestimmt werden, der aus- of Glandular Fever [Infectious Mononucleosis)]:- A reicht, um eine Agglutination der Erythrozyten zu 55 New Technique, J. Hyg., 41, S. 330 bis 343 [1941]).
erzeugen; Es wurde jedoch gefunden,' daß dadurch die Spe-
Um den »Präsumtivtest« zu bestätigen und um die zifität des Agglutinationstests nicht verbessert wurde, Art der im Testserum vorhandenen heterophilen Anti- weshalb ' dieser Ersatztest nicht empfohlen wurde körper zu unterscheiden, ist es gewöhnlich erwünscht, (A. M. B a r r e 11, a. a. O., S. 334).
einen dritten oder einen »Differehtialtest« auf Hetero- 60 Die Verwendung von rohen Schaferythrozyten als phile durchzuführen.' Bei diesem Test werden zwei Testreagens für den serologischen Nachweis der Moweitere Proben des ursprünglichen Testserums. mit nonukleose wurde auch deswegen für unzweckmäßig zwei Antigenen getestet, von denen das erste in der angesehen, weil man die frischen Zellen nach einer Lage ist, alle Forssmannschen und Serumkrankheits- Lagerzeit von einer Woche wegwerfen und häufig neue Antikörper, die in der behandelten Probe vorhanden 65 Erythrozytenreagenssuspensionen herstellen muß. Es sind, zu adsorbieren und von denen das zweite in der wurde bereits vorgeschlagen (C. D. C ο x, Preserva-Lage ist, alle Antikörper, der infektiösen Mononu- tion of Sheep Erythrocytes and Their Use in a Rapid· kleose und der Serumkrankheit, die in der anderen Plate Titration of Heterophilic Antibodies in Infec-
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tious Mononucleosis, J. Lab. & Clin. Med., 48, S. 298 trhozyten der Gattung Equus eine starke positive
bis 303 [1956]), diese Schwierigkeit dadurch zu um- Agglutination bei Seren von Patienten mit infektiöser
gehen, daß man die Schaferythrozyten durch Behänd- Mononukleose zeigen, reagieren Seren mit niedrigen
lung mit Formaldehyd konserviert. Leider wird jedoch Gehalten an heterophilen Antikörpern, außer denen,
durch die Konservierung dieser Zellen die Anzahl der 5 die für die infektiöse Mononukleose charakteristisch
falschen positiven Versuchsergebnisse bei der Titration sind, nicht mit den mit Aldehyd behandelten Ery-
der konservierten Schaferythrozyten mit heterophilen throzyten der Gattung Equus. Glasplattentests mit
Agglutinen nicht vermindert, weshalb auch die Spe- diesen Erythrozyten liefern deshalb mehr spezifische
zifität des heterophilen Antikörpers für die infektiöse positive oder negative Hinweise und machen in vielen
Mononukleose nicht erhöht wird. io Fällen die weiteren zeitraubenden serologischen Tests
Die Behandlung von Erythrozyten verschiedener unnötig oder vermindern zumindest die Anzahl der
Herkunft mit Aldehyden, insbesondere Formaldehyd, Präsumptiv- und Differentialtests, die noch erforder-
und anderen Stoffen, zur Stabilisierung und Konser- lieh sind, um die Anwesenheit der für die infektiöse
vierung ist an sich bekannt (Herstellung menschlicher Mononukleose charakteristischen Antikörper zu be-
Test-Erythrozyten aus Zeitschrift für Immunitäts- und 15 stätigen.
Allergieforschung, 127, S. 459 bis 468 [1964]; Behänd- Vorzugsweise enthält das Reagens gemäß der Erlung menschlicher Erythrozyten mit Formaldehyd, findung Pferdeerythrozyten, die mit 0,2 bis 1 Voluma. a. 0.125, S. 326 bis 337 [1963]; Behandlung mensch- teil eines geeigneten Aldehyds, vorzugsweise Formlicher und verschiedener tierischer Erythrozyten, dar- aldehyd, je Volumteil Erythrozyten, behandelt sind, unter auch Pferdeerythrozyten mit Formaldehyd, 20 Die Behandlung kann bei jeder geeigneten Temperatur a.a.O., 126, S. 312 bis 324 [1964]). Den genannten durchgeführt werden, wobei die Reagenzien vorzugs-Literaturstellen ist jedoch nicht zu entnehmen, daß weise bei Temperaturen von etwa 4 bis etwa 400C derartig behandelte Erythrozyten als Testreagens für umgesetzt werden. Die so mit dem Aldehyd behaninfektiöse Mononukleose verwendet wurden. delten Zellen sind in einer Kochsalzlösung suspen-Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein 25 diert, derart, daß die Suspension etwa 2 bis 6 Volum-Reagens zum Nachweis der infektiösen Mononukleose prozent Zellen und zweckmäßig noch ein geeignetes zu schaffen, das spezifischer ist als das bekannte Schaf- Konservierungsmittel, wie Natriumazid, Phenol oder erythrozyten enthaltende Reagens und das wegen Natriumäthylenmercurithiosalicylat, enthält. Es wurde seiner besseren Spezifität praktisch keine falschen gefunden, daß die so hergestellten Reagenzien auch positiven Ergebnisse liefert, so daß die bisher erfor- 30 noch nach 6 Wochen oder mehr stabil sind, wenn sie derlichen zeitraubenden Präsumptiv- und Differen- bei Temperaturen von etwa 4° C gelagert werden,
tialtests nicht mehr nötig sind. Weiterhin soll das Die mit Formaldehyd behandelten Pferdeerythro-Reagens stabil und auch noch nach langer Lagerzeit zyten bzw. die anderen, mit Aldehyd behandelten Eryverwendbar sein. throzyten der Gattung Equus werden gegen die Test-Gegenstand der Erfindung ist ein Reagens zum 35 seren titriert, wobei ein Glasplattentest, wie er vorNachweis der infektiösen Mononukleose, das in einer stehend beschrieben wurde, angewendet wird. Diese Kochsalzlösung suspendierte Erythrozyten zur Agglu- Glasplattentests liefern einen eindeutigen makroskotination der heterophilen Antikörper in dem zu titrie- pischcn Nachweis für die Anwesenheit von heterorenden Testserum enthält; dieses Reagens ist dadurch philen Antikörpern, wobei positiv reagierende Seren gekennzeichnet, daß die Erythrozyten von der Gattung 40 eine grobe Agglutination zeigen, die sich gewöhnlich Equus stammen und in an sich bekannter Weise mit innerhalb einer Minute nach dem Titrieren ausbildet einem wasserlöslichen, mit den Erythrozyten vertrag- In den Figuren sind Agglutinationsbilder von tylichen Aldehyd behandelt sind. Die Suspendierung von ' pischen Glasplattentests bei Verwendung von mit Erythrozyten in physiologischer Kochsalzlösung ist bei Formaldehyd behandelten Pferdeerythrozytenreagenserologischen Untersuchungen bekannt (vgl. zum 45 zien gemäß der Erfindung angegeben.
Beispiel N. Heuming, Klin. Labotaroriumsdia- Fig. 1 zeigt eine negative Kontrollprobe einer gnostik, Verlag Urban und Schwarzenberg, 1. Auf- Salzlösung und
lage, 1959, S. 220). F i g. 2 ein grobes Agglutinationsbild bei einem
Die Erythrozyten der Gattung Equus können mit positiven Glasplattenversuch.
einem geeigneten wasserlöslichen Aldehyd, der mit 5° Die nachstehenden Beispiele erläutern bevorzugte
den behandelten roten Blutkörperchen verträglich ist, Ausführungsformen des Reagens gemäß der Er-
d. h. diese nicht zerstört, behandelt sein. Geeignete findung.
Aldehyde sind z. B. Formaldehyd, Glutaraldehyd oder Beispiel 1
Pyruvaldehyd.
Es wurde gefunden, daß bei Verwendung der mit 55 Es wurde eine 4%ige Suspension von mit Form-Aldehyd behandelten Erythrozyten der Gattung Equus aldehyd behandelten Pferdeerythrozyten in einer Salzeine bedeutend niedrigere Anzahl an falschen positiven lösung, die 0,1 % Natriumazid als Konservierungs-Ergebnissen als bei Verwendung von Testantigenen mittel enthielt, hergestellt. Die mit Formaldehyd beaus Schaferythrozyten erhalten wird. In einem Fall handelten Erythrozyten wurden wie folgt erhalten: ergab bei Verwendung von mit Formaldehyd behan- 60 Pferdeblut wurde direkt in Alseversche Lösung eindelten Pferdeerythrozyten als serologisches Reagens geblutet, so daß das fertige Gemisch zur Hälfte aus von 300 getesteten Seren nur eines eine falsche po- Pferdeblut und zur anderen Hälfte aus Alseverscher sitive Agglutination, was einem Anteil von nur 0,4 °/0 Lösung bestand. Zu 50 ml dieses Gemisches wurden an falschen positiven Ergebnissen entsprach. An- 20 ml 5O°/oige Formaldehydlösung gegeben, und das dererseits ist, wie schon gesägt, aus der Literatur be- 65 Gemisch wurde in einen Brutschrank von 37° C gekannt, daß bei einer Titration mit Schaferythrozyten bracht.
9 % der Seren falsch positiv reagierten. Ein Tropfen der Suspension in der Salzlösung wurde
Während also die mit Aldehyd behandelten Ery- jeweils zu einem Tropfen eines zu untersuchenden
Serums auf einer ebenen Glasplatte gegeben, bei Raumtemperatur mit einem Holzstäbchen vermischt, 2 Minuten verrieben und innerhalb dieser Zeit unter indirektem Licht auf die Agglutination geprüft. Bei jedem Glasplattenversuch wurde gleichzeitig ein Kontrollversuch mit Kochsalzlösung durchgeführt. Bei den Glasplattentests wurden mit der Salzkontrollösung regelmäßig klare oder feinkörnige Bilder, wie sie in F i g. 1 dargestellt sind, beobachtet. Positiv reagierende Seren erzeugten dagegen grobe Agglutinationsbilder, wie sie in F i g. 2 dargestellt sind.
Die mit Formaldehyd behandelten Pferdezellen wurden bei Glasplattentests mit 978 verschiedenen Testseren verwendet, und die Ergebnisse wurden mit serologischen Diagnosen verglichen, die unter Verwendung des Glasplattentests, des Präsumptivtests und des Differentialtests nach Davidsohn (David s ο h n, I. Serologie Diagnosis of Infectious Mononucleosis, J. A. M. Α., 108, S. 289 bis 295 [1937]) erhalten wurden. Bei den 978 Tests differierten die Ergebnisse, die nach dem einfachen Glasplattentest unter Verwendung von mit Formaldehyd behandelten Pferdeerythrozyten erhalten wurden, von den nach dem Differentialtest erhaltenen nur in neun Fällen, was einer Nachweisgenauigkeit von 99 °/o entspricht. In der Tabelle I sind die positiven und negativen Indikationen über das Vorliegen der infektiösen Mononukleose (IM) nach den jeweiligen Tests miteinander verglichen.
Tabelle I Gesamtergebnisse der Tests
Reaktion
der mit
Formaldehyd
behandelten
Pferdezellen
Positiv
Negativ
Insgesamt
Gesamtzahl der Fälle
295 683 978 Differentialtest
nach Davidsohn
pos. IM
290
4
neg. IM
5
679
Diagnosegenauigkeit
99%
Mehrere Testseren, die mit dem mit Formaldehyd behandelten Pferdeerythrozyten titriert wurden, wurden auch gegen Schafzellen titriert, um die Leistungsfähigkeit der Glasplattentests mit dem üblichen rohen Schafzellenreagenz gegenüber den mit Formaldehyd behandelten Pferdezellenreagenz gemäß der Erfindung zu vergleichen. Bei diesen Tests wurden 250 Seren, die von Blutspendern und von Patienten mit einer Vielzahl von Krankheiten erhalten wurden, als Kontrollproben verwendet. Von diesen Seren bewirkte ein Serum eines Patienten mit Bronchialasthma eine positive Agglutination, während 249 Seren bei den mit Formaldehyd behandelten Pferdezellen negativ reagierten.
Weiterhin wurden 117 Seren von Patienten mit klinischen Symptomen, die auf infektiöse Mononukleose schließen ließen, untersucht. Von diesen Seren agglutinierten 28 sowohl frische Schafzellen, als auch mit Formaldehyd behandelte Pferdezellen; 41 Seren reagierten weder mit frischen Schafzellen, noch mit den mit Formaldehyd behandelten Pferdezellen; 47 Seren reagierten positiv mit Schafzellen und negativ mit den mit Formaldehyd behandelten Pferdezellen. Alle letztgenannten Seren wurden dann gegen frische Schafzellen titriert. Von den 47 Seren ergaben 25 einen Titer von 1:7, 16 einen Titer von 1:14 und 6 einen Titer von 1: 28. Keines dieser Seren erfüllte die serologischen Kriterien für die Diagnose der infektiösen Mononukleose. Von den 28 Seren, die positiv mit den Schafzellen und den mit Formaldehyd behandelten Pferdezellen reagierten, wurden 25 nach dem Differentialtest als infektiöse Mononukleose diagnostiziert.
Tabelle II erläutert die unterschiedliche Reaktivität der Schafzellen und der mit Formaldehyd behandelten Pferdezellen beim Nachweis der infektiösen Mononukleose.
Tabelle II
Vergleich der Reaktivität von Schafzellen und mit Formaldehyd behandelten Pferdezellen bei Seren von Patienten, bei denen Verdacht auf auf infektiöse Mononukleose bestand
Seren, reaktiv gegenüber Schafzellen + mit Formaldehyd
behandelter
Pferdezellen
Gesamtzahl
der Fälle
Schafzellentiter 1:7 von Seren
1:14
ohne IM
1:28
1:56 Differentialtest 'idsoh η
negativ
für IM
+ + 57 0 0 3 0 nach Das
positiv
für IM
3<e)
69 36 22 10 1 54 69
105 0 105
Kontrollseren + 1 0
Kontrollseren 249 (7) 249
+ 1 0 1(8)
(6) Patienten mit Bronchialasthma, Diabetes mellitus bzw. nichtidentifizierte Infektion der Atmungsorgane,
(7) Serum eines Rekonvaleszenten,
(8) Patient mit Bronchialasthma.
Beispiel 2
Es wurde eine 4%ige Suspension von mit Glutaraldehyd (C5H8O3) behandelten Pferdeerythrozyten in einer Kochsalzlösung, die 0,1% Natriumazid als Konservierungsmittel enthielt, hergestellt. Die mit Glutaraldehyd behandelten Erythrozyten wurden wie folgt erhalten: Pferdeblut wurde direkt in Alseversche Lösung eingeblutet, so daß das endgültige Gemisch zur Hälfte aus Pferdeblut und zur Hälfte aus Alseverscher Lösung bestand. Zu 50 ml dieses Gemisches wurden 50 ml 25%iger Glutaraldehyd, 16 ml 10%ige Natriumcarbonatlösung (bis zu einem pH-Wert von 7,0) und 50 ml 0,15molarer Phosphatpuffer (bis zu einem pH-Wert von 7,2) gegeben. Das Gemisch wurde dann 8 Stunden auf 25° C gehalten.
Die mit Glutaraldehyd behandelten Zellen wurden bei Glasplattentests mit zwanzig verschiedenen Testseren verwendet, und die Ergebnisse wurden mit den Diagnosen des Präsumptivtests und des Differentialtests nach Davidsohn verglichen. Die Ergebnisse des so durchgeführten Tests wichen von den Ergebnissen des Davissohn-Tests nur in einem Fall ab.
Beispiel3
Es wurde eine 4%ige Suspension von mit Pyruvaldehyd behandelten Pferdeerythrozyten in Kochsalzlösung mit 0,1% Natriumazid als Konservierungsmittel hergestellt. Die mit Pyruvaldehyd behandelten Erythrozyten wurden zuerst wie folgt erhalten: Pferdeblut wurde direkt in Alseversche Lösung eingeblutet so daß das endgültige Gemisch zur Hälfte aus Pferdeblut und zur anderen Hälfte aus Alseverscher Lösung bestand. Zu 50 ml dieses Gemisches wurden 50 ml einer Pyruvaldehydlösung, die 8 ml 43%igen Pyruvaldehyd, 17 ml einer l%igen Natriumcarbonatlösung und 25 ml eines 0,15molaren Phosphatpuffers enthielt, gegeben. Das gebildete Gemisch hatte einen pH-Wert von 6,5 und wurde dann auf einer Temperatur von 25 0C gehalten.
Die mit Pyruvaldehyd behandelten Pferdezellen wurden bei Glasplattentests mit zwanzig verschiedenen Testseren verwendet, und die Ergebnisse wurden mit den serologischen Diagnosen des Präsumptivtests und des Differentialtests nach Davidsohn verglichen. Die Ergebnisse der zwanzig einfachen Glasplattentests nach diesem Beispiel wichen nur in einem Fall von den Ergebnissen des Davidsohn-Tests ab.

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Reagens zum Nachweis der infektiösen Mononukleose, das in einer Kochsalzlösung suspendierte Erythrozyten zur Agglutination der heterophilen Antikörper in dem zu titrierenden Testserum enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Erythrozyten von der Gattung Equus stammen und in an sich bekannter Weise mit einem wasserlöslichen, mit den Erythrozyten verträglichen Aldehyd behandelt sind.
2. Reagens nach Anspruch I5 dadurch gekennzeichnet, daß die Erythrozyten mit Formaldehyd, Glutaraldehyd oder Pyruvaldehyd behandelt sind.
3. Reagens nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Pferdeerythrozyten mit 0,2 bis 1 Volumteil Formaldehyd je Volumteil Erythrozyten behandelt sind und die Suspension 2 bis 6 Volumprozent der mit Formaldehyd behandelten Zellen enthält.
4. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich Natriumazid, Phenol oder Natriumäthylenmercurithiosalicylat als Konservierungsmittel enthält.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen 109537/234'

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