CH646259A5 - Diagnostisches mittel zur bestimmung eines antigens. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein diagnostisches Mittel zur Bestimmung eines Antigens.

Mikroorganismen enthalten bekanntlich eine Vielzahl von Substanzen, die zu unterschiedlichen Reaktionen Anlass geben können. Wegen der häufigen Überschneidung derartiger Reaktionen sind Einzelabläufe selten beobachtbar. Es besteht oft der Wunsch, differenzierte, durch Einzelbezirke bedingte Reaktionen zu beobachten, wozu unerwünschte Bestandteile entfernt werden müssen.

Es ist bekannt, dass bestimmte Mikroorganismen ein Polypeptid besitzen, das den sogenannten Fc-Teil von Antikörpermolekülen zu binden vermag. Bei Staphylokokken wird dieses Polypeptid Protein A genannt. Fc-bindendes Polypeptid enthaltende Mikroorganismen werden, um störende Nebenreaktionen auszuschalten, zur Gewinnung des Polypeptids aufgearbeitet, wobei das Polypeptid in der Regel an einen festen Träger gebunden wird. Es besteht ein Bedarf an trägergebundenem Polypeptid zur Bindung des Fc-Teils von Antikörpermolekülen, welches eine störungsfreie Verwendung bei der Bestimmung von Antigenen gestattet.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein diagnostisches Mittel zur Bestimmung eines Antigens des dadurch gekennzeichnet ist, dass es als wesentlichen Bestandteil eine Suspension eines Mikroorganismus enthält, der ein den Fc-Teil von Antikörpern bindendes Peptid enthält und eine störungsfreie Bestimmung von Antigenen gestattet, wobei die Suspension 3 bis 50% mindestens eines darin löslichen mehrwertigen Alkohols enthält.

Dieses Mittel kann hergestellt werden, indem man den Fc-Teil bindendes Peptid enthaltenden Mikroorganismus, vorzugsweise einen Protein A enthaltenden Staphylococcus, insbesondere einen Staphylococcus aureus, mit einer 4- bis 8molaren, vorzugsweise 6molaren, wässrigen Lösung eines Guanidinsalzes behandelt, danach von diesem freiwäscht und die erforderliche Alkoholmenge zugibt. Gegebenenfalls kann danach lypophilisiert werden.

Zur Bestimmung von Antigenen sowohl in Lösung wie auch an der Oberfläche von feinen Teilchen, wie Bakterien oder Viren, werden Mikroorganismen, die den Fc-Teil von Immunglobulinen zu binden vermögen, nach dem oben beschriebenen Verfahren extrahiert. Über die antigenbinden-den Teile der Immunglobuline entsteht eine wirksame Bindung mit den zu bestimmenden Antigenen. Die Agglutination erläutert werden.

der mit dem Immunglobulin beladenen Mikroorganismen kann leicht beobachtet und registiert werden. Ein besonders geeigneter Mikroorganismus mit einem Fc-bindenden Polypeptid ist, wie erwähnt, Staphylococcus aureus. Ausserdem 5 seien noch einige Stämme des Streptococcus pyogenes als Polypeptid-Träger genannt, die mit dem Fc-Teil von Immunglobulinen zu reagieren vermögen.

Das erfindungsgemässe diagnostische Mittel lässt sich zur Diagnostik von physiologischen oder pathologischen Zuständen, an denen ein Antigen beteiligt ist, einsetzen, und zwar sowohl bei Tieren als auch bei Menschen. Dabei wird eine Probe, die das Antigen enthält, mit spezifischen Antikörpern in Kontakt gebracht, die an die Oberfläche der Mikroorganismen gebunden sind. Es erfolgt eine Agglutination, wenn die Probe ein entsprechendes Antigen enthält.

Guanidiniumchlorid-extrahierte unbekapselte Staphylokokken (S. aureus und S. epidermidis) aktivieren den Komplementfaktor C3 und adsorbieren ihn an ihrer Oberfläche. Das erfolgt nach Inkubation in frischem Menschen- und Meerschweinchenseram. Die mit aktiviertem C3 behafteten Staphylokokken bilden Rosetten mit B-Lymphozyten von Menschen. Damit ermöglichen die guanidiniumchlorid-extra-hierten Staphylokokken die Erkennung und Isolierung von B-Lymphozyten. Ebenso können guanidiniumchlorid-extrahierte protein-A-positive Staphylokokken direkt-dafür verwendet werden.

Die Bestimmung kann als quantitative Bestimmung nach üblichen Agglutinations verfahren durchgeführt werden, beispielweise, indem man eine Verdünnungsreihe von Proben testet und das Ergebnis mit einer Probe von bekannten Anti-genkonzentrationen vergleicht. Der Agglutinationstext wird im allgemeinen in einer wässrigen Lösung, beispielsweise in einer physiologisch gepufferten Salzlösung mit einem neutralen pH-Wert durchgeführt.

In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsge-mässen diagnostischen Mittels können die extrahierten Mikroorganismen, die einem Fc-Teil der Antikörper zu binden vermögen, wie nachfolgend beschrieben gefärbt sein, um die Beobachtung der Agglutination zu erleichtern.

Geeignete Farbstoffe im Sinne der Erfindung sind solche, die eine ausreichende Affinität zu Proteinen zeigen, direkt aufziehen, Oxydations- und Alkalibeständigkeit besitzen und infolge Fehlens reaktiver Gruppen nicht zur Agglutination der Mikroorganismen beitragen. Besonders günstig hat es sich erwiesen, die Mikroorganismen mit Farbstoffen der Colour-Index-Bezeichnung (CI) Basic 23, Basic Blue 45 oder Basic Orange 30 einzufärben.

Zur Färbung können die extrahierten Mikroorganismen in einer wässrigen Lösung suspendiert, mit einer verdünnten Lösung des betreffenden Farbstoffes versetzt und nach einer experimentell als günstig ermittelten Einwirkdauer von der Farbstofflösung getrennt werden. Zweckmässig werden die Keime zur Abtrennung der Farbstofflösung hochtourig zentri-fugiert, beispielsweise bei etwa 10 000 bis 20 000 x g.

Die Einfärbung der Mikroorganismen führt zu besonders günstiger Ablesung der Reaktion, da die gefärbten Partikel zur Erhöhung des Kontrastes gegenüber der Umgebung bedeutend beitragen. Vorteilhaft wirkt sich weiterhin die Möglichkeit aus, die Konzentration der Mikroorganismen im Testsystem herabsetzen zu können. Die Empfindlichkeit kann gesteigert werden, die Endpunkte der Reaktion werden schärfer.

•Pas erfindungsgemässe diagnostische Mittel lässt sich zur Bestimmung von Antigenen nach an sich bekannter Verfah-05 reri, der Agglutination, das Radioimmunoassay oder des enzymmarkierten Immunoassay, um nur einige beispielhaft zu nennen, verwenden.

Die Erfindung soll am nachstehenden Beispiel näher

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Beispiel

Für Nachweisverfahren von Antigenen haben sich extrahierte, Protein A enthaltende Staphylokokken, besonders der Staphylococcus aureus Stamm COWANI (NCTC 8 530/ATCC 12598), bewährt. Er wird auf folgende Weise s extrahiert:

Staphylococcus aureus Stamm COWAN I wird in einem Medium folgender Zusammensetzung vermehrt:

Vorkultur: TSB (Tryptone Soya Broth, Oxoid) 100 ml in io

1000 ml Erlenmeyer-Kolben Hauptkul- 141 TSB in 16-1-Fermenter unter Zusatz von tur: 0,25% Liebig Fleischextrakt (B.B.L.B.);

Beimpfung mit 6 Vorkulturkolben.

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Die Keime werden nach Zentrifugation bei 74 000 x g gewonnen, danach zweimal in destilliertem Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Aus einem 161 Fermenter werden etwa 50 g Staphyllokokken erhalten. Die Bakterien aus einem Fermenter werden mit 200 ml 6 M Guanidinhydro-chloridlösung 18 Stunden stehengelassen. Danach werden die Keime von der Guanidinhydrochloridlösung abgetrennt und die Behandlung mit Guanidinhydrochlorid insgesamt viermal wiederholt. Schliesslich werden die Staphylokokken so lange gewaschen oder dialysiert, bis mit alkalischer 1,2-Naphthoch-inon-4-sulfonsäure und Hydroxylamin nach Sullivan und Hess (1936) in Hoppe Seyler Thierfelder, Physiologie und Pathol. Chemische Analyse, 10. Auflage, Band III, 2, S. 1091, Guanidinhydrochlorid nur noch in Spuren nachweisbar ist. Nach Resuspension der Staphylokokken in destiliertem Wasser werden die Keime lyophilisiert.

Zur Färbung werden die lyophilisierten, extrahierten Keime in einer Konzentration von 1,5 mg/ml in 0,14 M NaCl suspendiert und pro ml mit 0,3 ml einer 0,l%igen Lösung von Astrazonrot BBL® (eingetragenes Warenzeichen der Farbenfabriken Bayer AG, Leverkusen) = CI Basic Red 23, in 0,14 M Kochsalzlösung versetzt und 5 Minuten gerührt. Danach werden die Staphylokokken bei 14 600 x g abzentrifugiert.

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Claims (5)

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1. Diagnostisches Mittel zur Bestimmung eines Antigens, dadurch gekennzeichnet, dass es als wesentlichen Bestandteil eine Suspension eines Mikroorganismus enthält, der ein den Fc-Teil von Antikörpern bindendes Peptid enthält und eine störungsfreie Bestimmung von Antigenen gestattet, wobei die Suspension 3 bis 50% mindestens eines darin löslichen mehrwertigen Alkohols enthält.

2. Diagnostisches Mittel nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus ein Staphylococ-cus ist.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Diagnostisches Mittel nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Staphy-lococcus aureus Cowan I ist.

4. Diagnostisches Mittel nach einem der Patentansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus mit einem Antikörper beladen ist.

5. Diagnostisches Mittel nach einem der Patentansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus mit einem Farbstoff, vorzugsweise Basic Red 23 gemäss Colour Index, eingefärbt ist.