DE2644622A1 - Verfahren zur extraktion von mikroorganismen und diese enthaltende diagnostische mittel - Google Patents

Verfahren zur extraktion von mikroorganismen und diese enthaltende diagnostische mittel

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DE2644622A1 DE19762644622 DE2644622A DE2644622A1 DE 2644622 A1 DE2644622 A1 DE 2644622A1 DE 19762644622 DE19762644622 DE 19762644622 DE 2644622 A DE2644622 A DE 2644622A DE 2644622 A1 DE2644622 A1 DE 2644622A1
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Description

BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT Marburg / Lahn
Aktenzeichen: HOE 76/b O2h Ma 263
Datum: . . 24. August 1976 Dr.Li/hs
Verfahren zur Extraktion von Mikroorganismen und diese enthaltende diagnostische Mittel
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von Mikroorganismen, insbesondere Staphylokokken und diagnostische Mittel, die extrahierte Mikroorganismen enthalten, und die z.B. zum Nachweis von Fibrinogen oder Fibrinspaltprodukten oder zum Binden von Immunglobulin bzw. dessen F -Fragment und damit zur Bestimmung eines Antigens verwendet werden können.
Mikroorganismen enthalten bekanntlich eine Vielzahl von Substanzen, die zu unterschiedlichen Reaktionen Anlaß geben können. Wegen der häufigen Überschneidung derartiger Reaktionen sind Einzelabläufe selten beobachtbar. Es besteht oft der Wunsch, differenzierte, durch Einzelbezirke bedingte Reaktionen zu beobachten, wozu unerwünschte Bestandteile entfernt werden müssen.
Es ist bekannt, daß eine Reihe von Staphylococcus aureus Stämmen
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sowohl mit Fibrinogen als auch mit den Abbauprodukten des Fibrins unter Verklumpung zu reagieren vermögen. Der für die Reaktion verantwortliche Faktor ist als Clumping-Faktor (CF) bekannt. Die Clumping-Faktor-Reaktion· hat wegen der Einfachheit ihrer Durchführung zur Diagnose der erhöhten FibrincLyse praktische Bedeutung erlangt. Zur Durchführung der Clumping-Faktor-Reaktion hat man bisher nur ausgewählte CF-positive Staphylokokken verwendet. Insbesonere ist es nicht erwünscht, daß die betreffenden Staphylokokken neben CF auch lösliche Koagulase bilden. Eine Reihe von Staphylococcus aureus Stämme! zeigt zudem die unerwünschte Eigenschaft einer Spon-? tan-Agglutination, für die bestimmte, nicht charaktierisierte Proteine verantwortlich gemacht werden.
Es besteht demnach ein Bedarf an Clumping-Faktor enthaltenden Staphylokokken, die weder lösliche Koagulase enthalten noch Spontan-Agglutination zeigen.
Es ist ferner bekannt, daß bestimmte Mikroorganismen ein PoIypeptid besitzen, das den sog-.- F -Teil von Antikörpermolekülen zu binden vermag. Bei Staphylokokken wird dieses Polypeptid Protein A genannt. F -bindendes Polypeptid enthaltende Mikroorganismen werden, um störender Nebenreaktionen auszuschalten, zur Gewinnung des Polypetids aufgearbeitet, wobei das Polypeptid in der Regel an einen festen Träger gebunden wird. Es besteht ein Bedarf an trägergebundenem Polypeptid zur Bindung des F -Teils von Antikörpermolekülen, welches eine störungsfreie Verwendung bei der Bestimmung von Antigenen gestattet.
Die Aufgaben werden erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß Mikroorganismen, insbesondere Staphylokokken einem besonderen Extraktionsverfahren unterworfen werden.
Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Extraktionsverfahren zur Entfernung unerwünschter Bestandteile eines als Reagens verwendbaren Mikroorganismus, vorzugsweise Staphylococcus aureus, dadurch
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gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus mit einer 4-8 molaren, vorzugsweise 6 molaren wässrigen Lösung eines Guanidinsalzes behandelt, danach von diesem freigewaschen und gewonnen wird. Gegebenenfalls kann danach lyophilisiert werden.
In bevorzugten Ausführungsformen werden im Hinblick auf ihre Verwendung entweder Clumping-Faktor positive Mikroorganismen, insbesondere Clunping-Faktor positive Staphylokokken oder F -Teil bindendes Peptid enthaltende Mikroorganismen, insbesondere Protein A enthaltende Staphylokokken, verwendet.
Zum Einsatz als CF-Reagens werden die Staphylokokken zweckmäßig in einer Pufferlösung, die gewünschtenfalls einen Suspensionsstabilisator enthält, suspendiert. Als Pufferlösungen können hierfür die bei biochemischen Arbeiten üblichen Puffersystene verwendet werden, beispielsweise Trishydroxymethylaminomethan-Hydrochlorid, Imidazol-Kochsalzpuffer oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Sofern Suspensions-Stabilisatoren erwünscht sind, werden zweckmäßig Proteine vom Albuminoidtyp, beispielsweise Serumalbumin, bevorzugt Rinder-Serümalbumin, verwendet. Deren Konzentration liegt bei etwa 0,005 bis 0,1, vorzugsweise 0,01 % Rinderserumalbumin.
Die Keimkonzentration der Staphylokokken in der betreffenden Pufferlösung, die vorteilhaft auf einen pH-Wert um den Neutralpunkt eingestellt wird, beispielsweise auf einen pH-Wert zwischen 7,0 und 7,5, beträgt etwa 0,1 bis 10 %. Besonders vorteilhaft ist eine Konzentration von um 0,15 - 0,3 %.
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Die Bestimmung wird zweckmäßig im Titrierverfahren vorgenommen. Günstig ist hierbei ein Mikro-Titrierverfahren, bei dem jeweils zu etwa 20 μΐ der gepufferten Keimsuspensiai von etwa 0,15 bis 0,3 \ etwa 50 μΐ einer fortlaufenden Verdünnungsreihe der zu bestimmenden Lösung, beispielsweise Blutplasma oder Blutserum, insbesondere Humanplasma oder Humanserum, zugesetzt werden.
überraschenderweise wurde bei der nachfolgenden Inkubation des Gemisches gefunden, daß die Empfindlichkeit hinsichtlich der Nachweismöglichkeit von Fibrin-Spaltprodukten wesentlich erhöht werden kann, wenn die Reaktionsgemische intensiv geschüttelt werden.
§09314/033?
Eine zeitliche Begrenzung der Schütteldauer bis zur Ablesung des Endpunktes der Reaktion hat sich als vorteilhaft erwiesen. Beim Mikro-Titrierverfahren werden dabei etwa 3-10 Minuten eingehalten.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung wurde gefunden, daß die Verklumpungsreaktion der Mikroorganismen besonders deutlich ablesbar wird, wenn die Mikroorganismen, insbesondere die Staphylokokken, mit einem geeigneten Farbstoff eingefärbt werden. Geeignete . Farbstoffe im Sinne der Erfindung sind solche, die eine ausreichende Affinität zu Proteinen zeigen, direkt aufziehen, Oxydations- und Alkalibeständigkeit besitzen und infolge Fehlens reaktiver Gruppen nicht zur Agglutination der Mikroorganismen beitragen. Besonders günstig hat es sich erwiesen, die Mikroorganismen, mit Farbstoffen der Colour Index Bezeichnung (CI) Basic Red 23, Basic Blue 45 oder Basic Orange 30 einzufärben.
Zur Färbung werden die erfindungsgemäß extrahierten Mikroorganismen in einer wässrigen Lösung suspendiert, mit einer verdünnten Lösung des betreffenden Farbstoffes versetzt und nach einer experimentell als günstig ermittelten Einwirkdauer von der Farbstofflösung getrennt. Zweckmäßig werden die Keime zur Abtrennung der Farbstofflösung hochtourig zentrifugiert, beispielsweise bei etwa 10.000 bis 20.000 χ g.. In einem der oben beschriebenen Puffer suspendiert und mit einem Suspensions-Stabilisator versetzt sind die gefärbten Mikroorganismen besonders geeignete Reagenzien-Bestandteile für den Nachweis von Fibrin-Spaltprodukten. Gewünschtenfalls können die gefärbten Mikroorganismen in gefriergetrockneter Form aufbewahrt und unmittelbar vor dem Gebrauch resuspendiert werden.
Die Einfärbung der Mikroorganismen führt zu besonders günstiger Ablesung der Reaktion, da die gefärbten Partikel zur Erhöhung des Kontrastes gegenüber der Umgebung bedeutend beitragen. Vorteilhaft wirkt sich weiterhin die Möglichkeit aus, die Konzentration der Mikroorganismen im Testsystem herabsetzen zu können. Die Empfindlichkeit kann gesteigert werden, die Endpunkte der Reaktion werden schärfer.
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Clumping-Faktor-positive Mikroorganismen sind aus der Literatur bekannt. Durch Hitze inaktivierte Clumping-Faktor-positive Mikroorganismen werden zur Bestimmung von Fibrhspaltprodukten verwendet. Mit all diesen Literatur-bekannten Stämmen von Mikroorganismen ist das erfindungsgemäße Verfahren durchführbar. Es können aus ihnen Reagenzien mit verminderter Störanfälligkeit hergestellt werden. Besonders günstige Ergebnisse hinsichtlich der Empfindlichkeit und einer geringen Störanfälligkeit des Verfahrens zum Nachweis von Fibrinogen und Fibrin-Spaltprodukten liefert ein Staphylococcus aureus mit der Bezeichnung K 807 (ATCC-Nr. 31.243) dessen Charakteristica in folgender Weise beschrieben werden;
Der Stamm wurde von einer an Mastitis erkrankten Kuh isoliert. In flüssigem Nährmedium wächst er diffus. Er ist grampositiv. Weitere charakteristische Eigenschäften:
Kristallviolett: Typ A
Clumpiig Faktor +
Koagulase +
Protein A +
Panton Valentine Leuko-
zidin (PVL) -
PVL R (Rind) +
Hämolysine O£
/3 		+
+
Saure Phosphatase +
Alkalische Phosphatase -
Fibrinolysin +
Eigelbfaktor
Penicillinase ··
Nuclease +
Wachstum auf festen Medien:
Staphylococcus Medium 110 (Baltimore Biological Lab.): gutes Wachstum/ weißlich-graue Kolonien mit einem Durchmesser von 1 - 2 mm.
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-fr-
Pferdeblutagar: gutes Wachstum, weißlich-graue Kolonien, kaum hämolytisch ο
Nähr-Ägar: weißlich-graue Kolonien, zuweilen unregelmäßig ausgebildet. ' Mac Concey-Agar Nr. 3 (Oxoid): kein Wachstum
Antibiogramm:
Chloramphenicol empfindlich
Erythromycin empfindlich
Sulphafurazol resistent '
Methicillin empfindlich
Penicillin empfindlich Ampicillin _ .. empfindlieh
Streptomycin empfindlich
Tetracyclin empfindlich
Der Stamm Staphylococcus aureus K 807 zeigt folgende Stoffwechselleistungen:
Vergärung von: ,
Dextrose nach 6 Tagen bei 370C ++
Lactose . * nach 6 Tagen bei 37°C. ++
Saccharose nach .6 Tagen bei-37°C ++
Maltose nach 6 Tagen bei 370C ++
Mannit nach 6 Tagen . bei 370C ++
Salizin ' nach 13 Tagen bei 370C
Inulin nach 13 Tagen bei 37°C
Äskulin nach 13 Tagen bei 37°C
Wachstum in Gegenwart von NaCl:
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Im besonderen ist demnach Gegenstand der Erfindung ein Reagens zum Nachweis von Fibrinogen und/oder Fibrin-Spaltprodukten, das als wesentlichen Bestandteil eine 0,1 - 10 %ige Suspension homogen verteilter, erfindungsgemäß extrahierter Clumping-Faktor-positiver Mikroorganismen, verzugsweise eines Clumping-Faktor-positiven Staphylococcus aureus, insbesondere den Staphylococcus aureus K 807 (ATCC-Nr. 31243) enthält, der gegebenenfalls mit einem geeigneten Farbstoff eingefärbt ist.
Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der genannten, Mikroorganismen-Suspension für die Bestimmung von Fibrinogen und/ oder Fibrin-Spaltprodukten in Körperflüssigkeiten, vorzugsweise in Plasma oder Serum, nach bekannten Verfahren. Nach Inkubation je eines Anteils der Reagenziensuspension mit je einem Anteil der zu bestimmenden Lösung in steigender Verdünnung werden die Ansätze vorteilhaft wenige Minuten geschüttelt und diejenige höchste Verdünnung der Körperflüssigkeit registriert, die noch eine positive Verklumpung der Keime aufweist. Wird dieser Wert mit einem durch Verdünnung von Serum gesunder Personen erhaltenen Wert in Beziehung gesetzt, kann danach das Resultat als Abweichung vom Normalwert festgestellt werden.
Zur Bestimmung von Antigenen sowohl in Lösung wie auch an der Oberfläche von feinen Teilchen, wie Bakterien oder Viren, werden Mikroorganismen, die den F -Teil von Immunglobulinen zu binden vermögen, nach dem oben beschriebenen Verfahren extrahiert. Über die antigenbindenden Teile der Immunglobuline entsteht eine wirksame Bindung mit den zu bestimmenden Antigenen. Die Agglutination der mit dem Immunglobulin beladenen Mikroorganismen kann leicht beobachtet und registriert werden. Ein besonders geeigneter Mikroorganismus mit einem F -bindenden Polypeptid ist, wie erwähnt, Staphylococcus aureus. Außerdem seien noch einige Stämme des Streptococcus pyogenes als Polypeptid-Träger genannt, die mit dem F -Teil von Iminunglobu-
linen zu reagieren vermögen.
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Diese Mikroorganismen lassen sich nach erfindungsgemäßer Extraktion zur Diagnostik von physiologisch oder pathologischen Zuständen an denen ein Antigen beteiligt ist, einsetzen und zwar sowohl bei Tieren als auch bei Menschen. Dabei wird eine Probe, die das Antigen enthält, mit spezifischen Antikörpern in Kontakt gebracht, die an die Oberfläche der Mikroorganismen gebunden sind. Es erfolgt eine Agglutination, wenn die Probe ein entsprechendes Antigen enthält.
" Guanidiniumchlorid-extrahierte unbekaps.elte Staphylokokken (S. aureus und S. epidermidis) aktivieren. den Komplementfaktor C3 und adsorbieren ihn an ihrer Oberfläche. Das erfolgt nach Inkubation in frischem Menschen- und Merschweinchenserum. Die mit aktiviertem. C3 behafteten Staphylokokken bilden Rosetten mit B-Lymphozyten von Meschen. Damit ermöglichen die guanidiniumchloridextrahierten Staphylokokken die Erkennung und Isolierung von B-Lymphozyten. Ebenso können guanidiniumchloridextrahierte Α-positive Staphylokokken direkt dafür verwendet werden.
Die Bestimmung kann als quantitative Bestimmung nach üblichen Agglutinationsverfahren durchgeführt werden, beispielsweise, indem man eine Verdünnungsreihe von Proben testet und das Ergebnis mit einer Probe von bekannten Antigenkonzentrationen vergleicht. Der Agglutinationstest wird im allgemeinen in einer wässrigen Lösung, beispielsweise in einer physiologisch gepufferten Salzlösung mit einem neutralen pH-Wert durchgeführt.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung können die extrahierten Mikroorganismen, die einen F -Teil der Antikörper zu binden vermögen, wie beschrieben gefärbt sein, um die Beobachtung der Agglutination zu erleichtern.
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1Z
Gegenstand der Erfindung ist schließlich das erfindungsgemäß hergestellte Mittel in seiner allgemeinsten Form und insbesondere ein Verfahren zur Bestimmung eines Antigens unter Verwendung eines erfindungsgemäß extrahierten Mikroorganismus nach an sich bekannten Verfahren,der Agglutination, des Radioimmunoassay oder des enzym— markierten Immunoassay, um nur einige beispielhaft zu nennen.
Die Erfindung soll am nachstehenden Beispiel näher erläutert werden:
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- y-12
Beispiel
I Staphylococcus aureus K 807 (ATCC-Nr. 31243) wird in einem Medium j
folgender Zusammensetzung vermehrt: . I
Vorkultur: TSB (Tryptone Soya Broth, Oxoid)
100 ml in 1.000 ml Erlenmeyer-Kolben
Hauptkultur: 14 1 TSB in 16-1-Fermenter unter Zusatz von
0,25 % Liebig Fleischextrakt (B.B.L.B.); Beimpfung mit 6 Vorkulturkolben.
Die Keime werden nach Zentrifugation bei 74.000 χ g gewonnen, danach 2 mal in destilliertem Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Aus einem 16 1 Fermenter werden ca. 50 g Staphylokokken erhalten. Die Bakterien aus einem Fermenter werden mit 200 ml 6 M Guanidinhydrochloridlösung 18 Stunden stehengelassen. Danach werden die Keime von der Guanidinhydrochloridlösung abgetrennt und die Behandlung mit Guanidinhydrochlorid insgesamt 4 mal wiederholt. Schließlich werden die Staphylokokken so lange gewaschen oder dialysiert, bis mit alkalischer 1,2 Naphttochinon-4-Sulfonsäure und und Hydroxylamin nach Sullivan und Hess (1936) .in Hoppe Seyler Thierfeider, Physiologie undjpathol. Chemische Analyse 10. Aufl. Band III,2,S. 1091.
Guanidinhydrochlorid nur noch in Spuren nachweisbar ist. Nach Resuspension der Staphylokokken in destilliertem Wasser werden die Keime lyophilisiert.
Zur Färbung werden'lyophilisierten, extrahierten Keime in einer Konzentration von 1,5 mg/ml in 0,14 M NaCl suspendiert und pro ml
(R)
mit 0,3 ml einer 0,1 %igen Lösung von Astrazonrot BBL (eingetragenes Warenzeichen der Farbenfabriken Bayer AG, Leverkusen) = CI Basic Red 23, in 0,14 M Kochsalzlösung versetzt und 5 Minuten gerührt. Danach werden die Staphylokokken bei 14.600 χ g abzentri- fugiert und die Keime in dem ursprünglichen Volumen 0,14 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 6,4 suspendiert. Der ΡμίΐβΓ enthält 0,05 % Rinderserumälbumin
Für die Clumping-Faktor Reaktion im Röhrchentest werden die Staphylokokken in einer 1 %igen Suspension, beispielsweise in 0,05 M
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Tris-hydroxymethyl- aminomethan-Puffer pH 7,4 mit einem Zusatz von 0,01 % Rinderserumalbumin eingesetzt.
Im Mikrotitrationsverfahren nach Leavelle: (Amer.J.Clin.Path., Vol. 55, S. 452 - 457 (1971) werden die Staphylokokken in 0,3 %iger Suspension in 0,017 M Imidazol-NaCl-Puffer pH 7,4 eingesetzt. Für die Mischung des Reaktionsansatzes hat sich besonders vorteilhaft ein Plattenschüttler (Mikro-Shaker AM 69 der Flow Laboratories, Bonn) erwiesen.
Für Nachweisverfahren von Antigenen haben sich extrahierte, Protein A enthaltenden Staphylokokken, besonders der Staphylococcus aureus Stamm COWAN I (NCTT 8 530), bewährt. Er wird in der gleichen Weise wie K 807 extrahiert.
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Claims (13)

HOE 76/B 024 Patentansprüche
1. Verfahren zur Extraktion von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroorganismen mit einer 4-8 molaren wässrigen Lösung eines Guanidinsalzes behandelt, danach von diesem freigewaschen und gewonnen werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus ein Staphylococcus verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus ein Clumping-Faktor positiver Mikroorganismus verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Staphylococcus aureus K 807 (ATCC 32143) als Mikroorganismus verwendet wird.
5. Mittel, enthaltend einen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 extrahierten Mikroorganismus.
6. Mittel zum Nachweis von Fibrinogen und/oder Fibrinspaltprodukten enthaltend als wesentlichen Bestandteil eine Suspension eines gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 behandelten Mikroorganismus.
7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2„ dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus ein Mikroorganismus verwendet wird, der ein den F -Teil von Antikörpern bindendes Peptid enthält.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Staphylococcus aureus Cowan I verwendet wird.
9. Mittel, enthaltend als wesentlichen Bestandteil eine. Suspension eines nach einem der.Ansprüche 1, 2S 3, 4, 7 und 8 erhältlichen Mikroorganismus, welcher mit einem Farbstoff eingefärbt ist.
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HOE 76/B 024
10. Mittel zur Bestimmung eines Antigens enthaltend als wesentlichen Bestandteil eine Suspension eines nach einem der Ansprüche 1, 7 und 8 erhältlichen, gegebenenfalls mit einem Antikörper beladenen Mikroorganismus.
11. Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus mit Basic Red 23 gemäß Color Index eingefärbt ist.
12. Mittel zum Nachweis von Fibrinogen und/oder Fibrinspaltprodukten enthaltend als wesentlichen Bestandteil eine Suspension eines nach Anspruch 1 behandelten Staphylococcus aureus K 807 eingefärbt mit CI Basic Red 23.
13. Mittel zur Charakterisierung von Rezeptor tragenden Lymphozyten enthaltend als wesentlichen Bestandteil eine Suspension eines nach einem der Ansprüche 1 oder 2 erhältlichen Mikroorganismus.
8098U/0337
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