DE2857506A1 - Verfahren zur herstellung eines stabilen praeparats mit immunoglobulin-bindungseigenschaften - Google Patents

Description

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Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen Präparats mit Immunoglobulin-Bindungseigenschaften bzw. Immunoglobulin bindenden Eigenschaften.

In den meisten Stämmen von Staphylococcus aureus ist ein Protein, das als Protein A bezeichnet wird, zum Teil in Form einer Substanz, die an das Innere der Zellwand gebunden ist, zum Teil in Forin einer löslichen Substanz, die an dasWachstumsmedium der BakLerien abgegeben wird, vorhanden. Ursprünglich wurde Protein A in löslicher Form gewonnen nach anfänglicher Wärmeextraktion aus gewaschenen Bakterien. Durch das Erhitzen von suspendierten Staphylokokken nahe bis zum Siedepunkt wurde das Ze11wand-Protein A solubilisiert. In der Mitte der 60-er Jahre wurde auf mehreren verschiedenen Wegen gezeigt, daß Antikörper von Menschen und vielen Säugetieren, die, wie gezeigt werden kann, mit löslichem Protein A in der Weise reagieren, daß eine Ausfällung (ein Niederschlag) auftritt, an der Reaktion teilnehmen, nicht weil eine vorausgegangene Immunisierung zu Antikörpern führt, die auf Strukturen von Protein A gerichtet sind - eine Begründung, die vernünftig scheint, wenn man das generelle Vor Immunen von Staphylococcus aureus in der Umwelt berücksichtigt - sondern weil Protein A mindestens einen Rezeptor für eine Struktur aufweist, die an dem Fc-Teil einer großen Fraktion der Antikörpermoleküle (Immunoglobulin) bei Menschen und allen Säugetieren vorhanden ist, unabhängig davon, worauf diese mit Protein A reaktionsfähigen Antikörper gerichtet sind aufgrund der Antigen-Bindungsstrukturen ihrer Fab-Teile.

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Beim Menschen und bei bestimmten Säugetieren, wie z.B. beim Kaninchen, Meerschweinchen, Schwein, Hund und Affen, sind mehr als 90 % des Immunoglobulins G reaktionsfähig mit ProteinA.

Es wurde gezeigt, daß Protein A enthaltende Staphylokokken, die auf geeignete Weise hergestellt bzw. behandelt worden sind, auf verschiedenen Wegen in einer Reihe von immunologischen Laborverfahren als Immunoglobulin-Biiidungsreagens (Immunoglobulin bindendes Reagens) verwendet werden können, welches den ihn eigenen Vorteil hat, daß es eine natürliche f'eindispergierte feste Phase darstellt und auch die Fähigkeit hat, sehr schnell Antikörpermoleküle zu binden, unabhängig davon, ob diese bereits an Antigen gebunden sind oder nicht. Es sei darauf hingewiesen, daß ein IgG-Antikörper-Molekül, selbst wenn es durch seinen Fc-Teil an Protein A gebunden ist, auf wirksame Weise ein Antigen binden kann durch einen oder beide seiner Fab-Teile. Eine besonders anschauliche Art der Verwendung von Protein A enthaltenden Staphylokokken als Reagens in immunologischen Laborverfahren ist die, sie als sogenanntes Trennreagens in Radiοimmunoassays (RIA) (radioimmunologischen Nachweisverfahren) zu verwenden.

Radioimmunoassay ist die Bezeichnung für ein heute klassisches radioimmunologisches Nachweisverfahren, mit dessen Hilfe es möglich ist, eine gegebene Substanz (Antigen) quantitativ zu bestimmen, auch wenn diese in sehr geringen Mengen vorhanden ist, durch Anwendung einer konkurrierenden Inhibierung der Reaktion zwischen fixierten Mengen des gleichen Antigens, das gereinigt und mit einer radioakti-

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ven Substanz, wie z.B. radioaktivem Jod, markiert worden ist, und von Antikörpern, wie z.B. solchen aus Kaninchen oder Meerschweinchen, die auf die gleiche Substanz gerichtet sind. Wenn diese Reaktion sich dem Gleichgewicht nähert oder schon eine Zeit-lang abgelaufen ist, die erfahrungsgemäß ausreicht - sie variiert von 4 Tagen bis zu weniger als 15 Minuten - wird das markierte Antigen ■ jeweils in eine freie und in eine an den Antikörper gebundene Fraktion aufgetrennt.

Zur Durchführung dieser Trennungsstufe wurde bereits eine große Anzahl von Verfahren angewendet, beispielsweise die chemische Fällung mit Reagentien, wie Ammoniumsulfat und Äthanol, die einen chemischen Unterschied zwischen dem

freien (markierten) Antigen und den Antigen-Antikörper-Komplexen bedingt, und das bereits klassische doppelte Antikörperverfahren, bei dem der spezifische Antikörper, beispielsweise aus einem Kaninchen, immunologisch ausgefällt wird nach der Zugabe eines Antiserums, das auf das Kaninchen-Immunoglobulin gerichtet ist. Probleme, die bei dem zuletztgenannten Verfahren auftreten, sind z.B. die für die Ausfällung erforderliche lange Zeitdauer, die manchmal 24 Stunden beträgt, die relative Empfindlichkeit gegenüber irrelevanten störenden Faktoren und die Tatsache, daß die Trennung - beendet durch Zentrifugieren und Eliminieren der überstehenden Flüssigkeit - unvollständig sein kann.

Es hat sich jedoch gezeigt, daß ProteinAenthaltende Staphylokokken, die in Form einer feindispergierten Suspension zu-

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gegeben werden, den Endpunkt in ihrer Reaktion mit Immunoglobulin innerhalb einer Minute erreichen. Dann wird die Zentrifugierung durchgeführt, die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert und das Röhrchen wird in einen Gammastrahlen-Zähler eingeführt zur Bestimmung der an den Antikörper gebundenen Fraktion des markierten Antigens, assoziiert mit den Bakterien auf dem Boden des Röhrchens.

Die Staphylokokken-Präparate, die zuerst für die obengenannten Zwecke verwendet wurden, stammten in der Regel aus einer Kulturbrühe, wobei dieBakterien durch wiederholtes Waschen in einer Zentrifuge behandelt, in einer 0,5 Vol/Vol %-igen Formalinlösung in einem neutralen Puffer, in dem die Staphylokokken drei Stunden lang unter konstantem Mischen inkubiert wurden, und schließlich wiederholt in einer Zentrifuge gewaschen wurden. Die dabei erhaltene Suspension wurde in einer neutralen, mit einem Phosphat gepufferten Salzlösung mit einem zugesetzten Konservierungsmittel, wie Natriumazid (NaISL),in einer Menge von 1 g pro Liter aufbewahrt. Die zuerst von Lind und Mansa beschriebene Formalinbehandlung der Staphylokokken diente dazu, die das Protein A enthaltenden Oberflächenschichten der Bakterien "zu fixieren" und auf diese Weise wurde die spontane Abgabe des Proteins A an das umgebende Suspensionsmedium hinausgezögert. Die Bakterien wurden jedoch nicht abgetötet und nach zweiwöchiger Aufbewahrung in einem Kühlschrank neigten die Bakterien zur Autolyse. Außerdem mußte die erforderliche Reagensmenge unmittelbar vorder Verwendung erneut gewaschen werden.

Die obengenannten Nachteile und auch dieTatsache, daß po-

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tentiell pathogene lebende Bakterien verwendet wurden, stimulierte die Entwicklungsarbeit, die initiiert worden war durch G. Kronvall und die in erster Linie basierte auf der offensichtlichen Wärmebeständigkeit des Proteins A, die durch das Wärmeextraktionsverfahren demonstriert worden ist, das früher zur Herstellung von löslichem Protein A angewendet wurde, die aber auch basierte auf der Möglichkeit der Fixierung von Protein A mit Formalin an der Zellwand während der Wärmebehandlung, die dazu neigte, Protein A freizusetzen. Das Ergebnis ist in dem Hauptartikel der beiden Autoren S. Jonsson und G. Kronvall über den ersten Radioimmunoassay mit Staphylokokken als Trennreagens beschrieben: "The use of protein Α-containing Staphylococcus aureus as a solid phase anti-IgG reagent in radio-immunoassays as exemplified in the quantitation of alpha-foetoprotein in normal human serum", Eur. J. Immunology 4:29, 1974. In diesem Artikel wird die Wärmebehandlung beschrieben die bezüglich der Temperatur und der Zeit reproduzierbar ist und die dazu dienen soll, die mit Formalin behandelten Staphylokokken (Staphylococcus aureus) vom Stamm Cowan I auf wirksame Weise abzutöten,und dieses Verfahren wurde durchgeführt durch Hindurchpumpen einer solchen Suspension in einer gegebenen Geschwindigkeit durch ein verhältnismäßig enges Metallrohr, das in ein Wasserbad einer Temperatur von 80 C eingetaucht war, und anschließendes direktes Einpumpen in ein ähnliches Metallrohr, das in ein Eiswasserbad oder in ein gekühltes Wasserbad eingetaucht war. Bei dieser Anordnung bestimmten das Volumen des gesamten Rohrsystems, in dem die Suspension bei 80 C gehalten wurde, und die Pumpgeschwindigkeit

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die sogenannte Haltezeit, wobei 4 bis 6 Minuten als bei dieser speziellen Temperatur geeignet gefunden wurden.Auf diese Weise erhielt man eine Suspension von abgetöteten Staphylokokken, die eine IgG-Bindungskapazität von etwa 80 % der Bindungskapazität der Staphylokokken hatte, die nur mit Formalin behandelt worden waren.

Es zeigte sich, daß diese Suspension bezüglich der Immunoglobulin-Bindungskapazität stabil war bei der Aufbewahrung bei der Kühlschranktemperatur über einen Zeitraum von mehr als einem Jahr, daß jedoch die Neigung bestand, daß ein Teil der Bakterien zerbrach, die Protein A freisetztenund das Suspensionmedium gelb verfärbten.Auch bei dieser Herstellung des Staphylokokken-Reagens ist es zweifellos erfprderlich, die gewünschte Staphylokokkenmenge vor der Verwendung zu waschen. Bei der Aufbewahrung in einem Kühlschrank für einen Zeitraum von mehr als drei Jahren bilden die Bakterien eine schleimige Masse, deren erneute Suspendierung vor der Verwendung schwierig oder unmöglich ist.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, die Herstellung von Präparaten mit Immunoglobulin-Bindungseigenschaften (Immunoglobulin bindenden Eigenschaften) auf drastische Weise zu vereinfachen und ein solches Präparat herzustellen, das stabil, leicht zu transportieren, und leicht zu verteilen ist und das auch für eine praktisch unbegrenzte Zeitdauer aufbewahrt bzw. gelagert werden kann, ohne daß eine signifikante Zerstörung auftritt.

Das obengenannte Ziel wird erreicht.mit dem erfindungs gemäß en

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Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Bakterienspezies mit einer Immunoglobulin-Bindungskapazität, die über diejenige hinausgeht, die auf einer Reaktion zwischen Antigenen der Bakterien und spezifischen Antikörpern, die auf diese Antigene gerichtet sind, basiert, wie z.B. Staphylococcus aureus oder Streptococcus pyogenes, in einem Substrat gezüchtet werden, in dem die Bakterien eine Immunoglobulin bindende Substanz bilden, daß die Bakterien abgetötet werden und daß die abgetöteten Bakterien lyophilisiert werden zur Herstellung einer Bakteriensuspension, die mit einer Flüssigkeit wieder-hergesteilt werden kann. Ein auf diese Weise hergestelltes Präparat kann zu jedem beliebigen Zeitpunkt während einer Zeitspanne von wahrscheinlich mehreren Jahren wieder in eine Suspension von abgetöteten Bakterien überführt werden, die ohne weiteres Waschen direkt verwendet werden kann, beispielsweise bei der Anwendung von Staphylokokken in einem Radioimmunoassay,, wie weiter oben angegeben.

Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen Bakterienpräparats mit nicht-spezifischen Immunoglobulin-Bindungseigenschaften. Die Bakterien, wie z.B. Staphylococcus aureus oder Streptococcus pyogenes, mit einer nichtspezifischen Immunoglobulin bindenden Komponente, wie z.B. dem ProteinAvon Staphylococcus aureus, auf der Oberfläche der Bakterien, werden in einem Substrat gezüchtet, in dem die Bakterien die Immunoglobulin bindende Komponate bilden. Dann werden die Bakterien abgetötet und lyophilisiert, wobei die Lyophilisierungsstufe bald nach dem Abtöten der

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Bakterien durchgeführt wird. Nach dem erneuten Suspendieren werden die lyophilisierten Bakterien als Reagens in immunologischen Reaktionen verwendet.

Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Präparaten von Immunoglobulin bindenden Bakterien, die zu den Spezies Staphylococcus aureus gehören, anhand eines Beispiels,auf cas dfeErfindung jedoch nicht beschränkt ist, näher beschrieben.

Die für die hier angegebenen Zwecke verwendeten Staphylokokken werden am besten in einem flüssigen Substrat gezüchtet, das auch als Nährmedium oder Kulturbrühe bezeichnet wird, da es häufig aus einem Extrakt besteht, der durch Kochen aus Fleisch gewonnen worden ist. Im Labormaßstab werden Schüttelflaschen mit einem Volumen von etwa 1 1 und sogenannte Fermentatoren mit einem Volumen von etwa 10 1, d.h. Gefäße verwendet, in denen es möglich ist, durch wirksames Mischen, Belüften, Neutralisieren mit pH-Kontrollmitteln und dgl., die Wachstums- bzw. Züchtungsbedingungen zu optimieren. Entsprechende Möglichkeiten gibt es bei der Durchführung im industriellen Maßstab durch Verwendung von

Tanks mit einer Größe von bis zu mehreren m ₀ Das Verfahren wurde mit Erfolg angewendet auf ein aus 250 1 Nährmedium gewonnenes Material in einem Standard-Fez-men ta tor im Department of Bacteriology im Karolinska Institute in Stockholm, Schweden,, Nach einer Fermentation, die sich über etwa 8 Stunden nach der Inoculation erstreckte, hatte die Masse der Bakterien in dem Substrat Gahalte von 25 g/l (Naßgewicht) erreicht; wenn kein technisches

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Versagen auftritt, sind in der Regel Ausbeuten von mindestens 15 g pro 1 zu erwarten.

In Versuchen wurde gezeigt, daß frisch gezüchtete Staphylokokken direkt nach dem Waschen, nach dem gleichen pasteurisierungsartigen Verfahren, wie es in dem obengenannten Artikel beschrieben worden ist und das auf mit Formalin behandelte Bakterien angewendet wurde, direkt abgetötet werden können. Überraschenderweise hat es sich dabei als eine falsche Annahme herausgestellt - obgleich diese für einen langen Zeitraum die Gedanken und Handlungen bestimmt hatte - daß die vor dem Abtöten durch Wärme durchgeführte Formalinbehandlung eine notwendige Voraussetzung zur Vermeidung der Wärmeextraktion des Proteins A ist; tatsächlich haben Bakterien, die direkt nach der Züchtung (dem Wachstum) durch Wärme abgetötet worden sind, großenteils die gleiche Bindungskapazität wie mit Formalin und durch wärmebehandelte Staphylokokken aus der gleichen Kultur oder mindestens 90 % der Bindungskapazität der letzteren.

Außerdem haben die Versuche gezeigt, daß die chemische Zusammensetzung des Substrats während der nachfolgenden Behandlung, des Materials von Einfluß sein kann. So wurde gezeigt, daß das sogenannte GCY-Medium, ein besonders reiches Substrat für das Züchten (Wachsen) von Staphylokokken, nachteilig ist, wenn man versucht, die Bakterien direkt nach der Züchtung durch Wärme abzutöten, während sie noch in diesem Substtat suspendiert sind, in dem man die Bakterien etwa 4 Minuten lang bei 80 C hält; offensichtlich enthält das Substrat eine oder mehrere Substanzen, welche die Neigung haben, auszufallen und/oder eine

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Aggregation der Bakterien selbst bei 80 C aufrechtzuerhalten, wie z.B. Proteine, die bei dieser Temperatur denaturiert werden. Es gibt jedoch einige alternative Medien, die zum Züchten von Staphylokokken verwendet werden können, wie z. B. das sogenannte TSß-Medium, das bereits mit Vorteil verwendet worden ist, gerade weil es die Abtötung durch Wärme der darin bei 80 C suspendierten Bakterien erlaubt ohne eine signifikante Ausfällung oder Aggregation.

Andererseits wurde auch gefunden, daß die Abtötung von Staphylococcus aureus durch Wärme auch nach der Züchtung in einem CCY-Medium durchgeführt v/erden kann unter Vermeidung des Phänomens der Ausfällung und/oder Aggregation, die beim Abtöten durch Wärme bei \G C wie oben angegeben beobachtet wurde, d_oh. wenn die Abtötung durch Wärme beispielsweise, worauf die Erfindung jedoch nicht beschränkt ist, bei 60 C während einer entsprechend längeren Inkubationszeit, nach Erfahrung der Anmelderin etwa 30 Minuten, durchgeführt wird. Der Übergang zu der Abtötungstemperatur sollte jedoch vorzugsweise schnell erfolgen, beispielsweise in einem Wärmeaustauscher, der in einem Wasserbad mit der gewünschten Temperatur angeordnet ist, und sie sollte nicht angerechnet v/erden als Teil der sogenannten Ilaltezeit (Inkubationszeit) von etwa 30 Minuten, die für die vollständige Abtötung erforderlich ist_o Es wurde auch gezeigt, daß es möglich ist, Staphylococcus aureus bei 56 C durch Wärme abzutöten ohne das Aftreten der Ausfällungs- oder Aggregationsphänomene, die vollständige Abtötung erfordert jedoch eine etwa dreistündige Inkubation bei dieser,Temperatur und offenbar bietet die Abtötung der

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Bakterien für die erfindungsgemäßen Zwecke bei dieser niedrigeren Temperatur keine zusätzlichen Vorteile.

Es wurden auch verschiedene Immunoglobulin bindende Stämme von Streptococcus pyogem-s in einer sogenannten Todd-iiewitt-Brühe, einem anerkannten flüssigen Medium für gute Ausbeuten an Streptokokken, gezüchtet und sie wurden nach den gleichen Prinzipien wie für Staphylococcus aureus in dem obengenannten Artikel von Jonsson und Krönva11 angegeben bei 80 C durch Wärme abgetötet. Auch im Falle der Streptokokken behielten diese nach dem direkten Abtöten durch Wärme, d.h. ohne vorherige Formalinbehandlung,einen Großteil der Immunoglobulin-Bindungskapazität der lebenden Stämme. Außerdem bildeten Streptokokken, die in dem reichen Todd-Hewitt-Medium gezüchtet und aufbewahrt worden waren, während des Abtötens durch Wärme bei 80 C ähnlich wie die StaphylokokkenAggregate. Diese Effekte können ebenso wie im Falle der Streptokokken minimal gehalten werden, entweder durch Austausch des Todd-Hewitt-Mediums gegen einen frischen Puffer vor dsm Abtöten durch Wärme bei 80 C oder durch Durchführung der Wärme-Abtötung in dem verwendeten Wachstumsmedium bei etwa 60 C. Das zuletzt genannte Verfahren ist bevorzugt, da es eine geringere Bearbeitung der Bakterien erforderte

Die durch Wärme auf eine der vorstehend erwähnten Arten ohne vorherige Formalinbehandlung abgetöteten Bakterien warden gewaschen und in Form von Suspensionen in einem neutra.len Puffer bei Kühlschranktemperaturen aufbewahrt«, Es wurde- jedoch der ganz signifikante Nachteil festgestellt, daß solche Bakterien-suspensionen, beispielsweise von Staphylokok-

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ken, die zum Zwecke der Abtötung der Bakterien nur mit Wärme behandelt worden sind, bzw. daß bei solchen Suspensionen schon nach einer Aufbewahrung im Kühlschrank von wenigen Wochen, selbst wenn sie ein chemisches Konservierungsmittel in dem Puffer enthielten, abgebaut wurden durch Zerbrechen der die abgetöteten Bakterien aufbauenden Teilchen. Deis gleiche Problem wurde beobachtet bei mit Formalin und Wärme behandä-ten Staphylokokken, insbesondere dann, wenn sie unter Bedingungen gezüchtet worden waren, die optimale Ausbeuten ergeben, beispielsweise unter maximaler Belüftung und maximalem Mischen,, Eine mögliche Erklärung dieser unerwarteten Probleme ist möglicherweise die, daß die absolute Menge (nicht die Konzentration) des den gewonnenen Bakterien zugesetzten Formalins für die Erzielung eines ausreichenden Effektes auf die große Bakterienmasse möglicherweise zu gering war.

Aus verschiedenen Gründen scheint es in einigen Fällen vorteilhaft zu sein, die ßnkterienmasse von ihrem Subsuat vor den nachfolgenden Stufen auf wirksame Weise zu trennen; ein bereits erwähnter Grund ist die Möglichkeit des Auftretens von negativen Effekten des Substrats auf die Bakterien während der Wärmebehandlung und ein anderer Grund kann der Wunsch. sein_s aus dem Substrat eine oder eine Reihe von Substanzen zu gewinnen, die durch das Wärmeabtötungsverfahren zerstört würde(n). Zum Waschen der Bakterienmasse können Zentrifugier- oder Filtrierverfahren angewendet werden. In einer anderen Situation kann es ausreichend und erwünscht sein, das Volumen der Bakteriensuspension, die wärmebehandelt v/erden soll, etwas herabzusetzen, ohne daß die Zusammensetzung des Substrats geändert werden muß.

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Nach dem Abtöten durch Wärme ist es vorteilhaft, die Bakterien von ihrem vorhandenen Substrat zu trennen, insbesondere deshalb, weil letzteres oft eiiie bestimmte Menge einer Immunoglobulin bindenden Substanz gelöst enthält. Auch in diesem Falle können Zentrifugier- oder Filtrierverfahren angewendet werden. Danach liegen die gewaschenen Bakterien in Form einer konzentrierten Suspension oder in Form eines verdichteten feuchten Sediments vor.

Suspensionen von durch Wärme abgetöteten - jedoch nicht spezifisch mit Formalin behandelten - Staphylokokken und Streptokokken wurden gefriergetrocknet (lyophilisiert), in erster Linie zur Aufbewahrung der durch Wärme abgetöteten Bakterien, die als solche nicht in Suspension aufbewahrt werden können, und mit dem Ziel, mittels eines geeigneten Puffers aus diesen Materialien wieder Bakteriensuspensionen herzustellen. Im vorliegenden Falle wurden die lyophilisierten Materialien nach der im Vakuum durchgeführten Lyophilisierung mit trockener Luft in Kontakt gebracht. Nach der Wiederherstellung der Suspensionen wären Suspensionen mit reproduzierbaren Eigenschaften einschließlich der früheren Neigung zur Autolyse der Bakterienteilchen innerhalb einiger weniger Wochen wie in den entsprechenden Suspensionen der nicht-lyophilisierten Bakterien zu erwarten gewesen. Diese Erwartungen wurden bestätigt bezüglich der Immunoglobulin-Bindungseigenschaften und der Verwendbarkeit, dieser wiederhergestellten Bakteriensuspensionen für verschiedene Zwecke₀ Es fehlte jedoch die Neigung zur Autolyse, eine Beobachtung, die völlig überraschend, unerwartet und bisher nicht beschrieben worden ist, die potentiell eine

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große praktische Bedeutung haben kann.

Der Einfluß der Einwirkung von trockener Luft auf das lyophilisierte Material wurde bisher nicht ineinem solchen Ausmaß untersucht, daß daraus geschlossen werden kann, daß die eine oder andere Komponente der trockenen Luft zu der Suspensionsstabilität beiträgt, die ein Charakteristikum des erfindungsgetnäß hergestellten Präparats ist. Das Präparat aus abgetötetem Staphylococcus aureus, gezüchtet in einem TSP-Medium und behandelt nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren einschließlich der Uärmeabtötung bei 80 C für einen Zeitraum voncaAM:nuten, hat, wie wiederholt gezeigt wurde, eine Bindungskapazität gegenüber menschlichem IgG von mehr als 1,5 mg IgG pro ml einer 10 Vol/Vol %-igen Suspension, entsprechend mindestens 0,75 mg auf 20 mg der lyophilisierten Staphylokokken, in der Regel etwa 2 mg bzw. 1 mg. Diese Werte sollten mit den Daten verglichen werden, die in dem genannten Artikel (Jonsson und Kronvall iy74) 3;ür mit formalin und Wärme behandelte Staphylokokken angegeben worden sind;, deren Bindungskapazität mit etwa 1 mg pro ml einer 10 Vol/Vol %-igen Suspension angegeben wurde,, In diesem Zusammenhang sei jedoch betont, daß die Wachstumsbedingtmgen von denjenigen, wie sie in dem genannten Artikel angegeben sind, ziemlich verschieden waren. Es wurde ein anderes Substrat verwendet und es wurde eine verbesserte Vorrichtung zur Sauerstoffbehandlung unter Zugabe des pH-Wertkontroi!mittels verwendet.

Entsprechende Versuche haben gezeigt, daß äquivalente Präparate von Immunoglobulin bindenden Staphylokokken und Streptokokken auch nach Abänderungen der Bedingungen für

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die Wärmebehandlung (die Abtötung) der Bakterien erhalten werden können, wobei die erste Abänderung die Wärmebehandlung der Bakterien bei niedrigeren Temperaturen als 80 C darstellt.Zs wurde gefunden, daß Staphylococcus aureus des Stammes Cowan I nach einer 30-minütigen Inkubation bei 60 C abgetötet wird, unabhängig davon, ob dieser Mikroorganismus in einer Nährbrühe suspendiert ouer in einem Puffer erneut suspendiert worden ist und großenteils unabhängig von der Dichte der Suspension. Entsprechend wurde einer der beiden im labor untersuchten Itnmunoglobulin bin-

o denden Stämme der Streptokokken nach 30 Minuten bei 56 G abgetötet, während für die Abtötung des anderen 60 Minuten bei 56 C erforderlich waren.

Darüber hinaus wurde gezeigt, daß die Wärrneabtötung bei wesentlich niedrigeren Temperaturen, beispielsweise bei 37 C, durchgeführt werden kann, wenn man Formaldehyd in einer Endkonzentration zugibt, die weit unterhalb der Formaldehydkonzentration liegt, die erforderlich wäre zum Abtöten mit Formaldehyd bei Raumtemperatur, Aus den Versuchen geht hervor, daß die Formaldehydbehandlung (Formalinbehandlung) eine sehr strenge Kontrolle der Parameter, wie Temperatur, pH-Wert, Konzentration der abzutötenden Bakterien, des mit dem Aldehyd reagierenden Materials in dem Puffer (insbesondere der primären Amine, d.h. der Proteine, Aminosäuren und dgl«,, die in den Substaten vorliegen) und natürlich der Menge des zugegebenen aktiven Formaldehyds (unter Berücksichtigung der Neigung des Formaldehyds, während der Lagerung zu polymerisieren oder anderweitig zu reagieren) erforderlich macht. Da die Formalinbehandlung von Immunoglobulin bindenden Bakterien vor der Wärmebehandlung bisher

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nicht mit einem großen Ausmaß von Kontrolle durchgeführt wurde mit Ausnahme der berechneten Endkonzentration an Formaldehyd, d.h. ohne gebührende Berücksichtigung der Bakterienkonzentration, der Pufferbedingungen und der Temperatur, stellt die erfindungsgemäße Stufe, die Wärmebehandlung durch Zugabe einer geringen Menge Formaldehyd welche die Bakterien bei der sogenannten RäumtemperaLur nicht abtöten kann - einen Signifikaten Fortschritt bei der Bearbeitung von Immunoglobulin bindenden Bakterien dar, eine Stufe, auf die die Lyophilisierung folgen soll zur Ausnutzung des zusätzlichen Stabilisierungseffektes dieser Behandlung.

Erfindungsgemäß hergestellte Präparate wurden als Reagens in verschiedenen Radioimmunoassays getestet, beispielsweise für das Hepatitis B-Antigen, den Antikörper zu diesem Antigen und Aminoglycosid-Antibiotika, wie Gentamicin. In diesen Tests wurde eine Suspension von Staphylokokken verwendet, die aus lyop-hilisierten Staphylokokken stammten, die in einer neutralen, mit einem Phosphat abgepufferten Salzlösung aufgeschlämmt worden waren unter Zugabe eines sogenannten nicht-ionischen Detergens (TweerPzO) bis zu einer Endkonzentration von 0,1 Vol/Vol %, die sich als vorteilhaft erwiesen hatte bei solchen Präparaten von Keagens-Staphylokokken (Jonsson und Kronvall 1974), wie sie früher verfügbar waren. Es wurde gefunden, daß die wiederhergestellte Suspension ohne weiteres Waschen für die obengenannten Zwecke direkt verwendet werden kann. Für spezielle Anwendungszwecke ist jedoch eine einzige Stufe der Zentrifugierung und erneuten Suspendierung in einem frischen

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Puffer zu empfehlen für die Eliminierung von Spuren von löslichem Protein A oder von Protein A, das auf minimalen Fragmenten von Zellbruchstücken getragen wird, die aus den abgetöteten Bakterien freigesetzt werden, beispielsweise als Folge des Einfrierens vor dem Gefriertrocknen (der Lyophilisierung).

Das Reagens aus erneut suspendierten Staphylokokken wurde erfolgreich getestet in einem anerkannten Verfahren zur Klassifizierung von spezifischen Antikörpern, die auf Infektionsagentien, wie z.B. Kubella-Virus oder Toxoplasma-Parasiten, gerichtet sind. Infektionen mit einem dieser Agentien während der Schwangerschaft stellen ein beträchtliches Risiko für die Infektion und Mißbildung des Fötus dar. Deshalb wurden verschiedene Routineverfahren zur Untersuchung der Immunansprechempfindlichkeit gegenüber diesen Antigenen und vielen anderen entwickelt» Es ist allgemein anerkannt, daß die primäre Antikörper-Ansprechempfindlichkeit von Säugetieren gegenüber Fremdsubstanzen (Antigenen) mit der Bildung von spezifischen Antikörpern der IgM-Klasse beginnt, woran sich die Bildung von spezifischen Antikörpern (d.h. Antikörpern, die. auf das gleiche fragliche Antigen gerichtet sind), die zu der IgA-Klasse gehören, und späteren Antikörpern der IgG-Klasse anschließt» Letztere haben die Neigung, in dem Serum/Plasma für einen langen Zeitraum nachweisbar zu verbleiben und bei nachfolgenden Einwirkungen des Antigens permanent anzusteigen,, IgG-Antikörper stellen die Langzeitschutz-Antikörperimmunität gegenüber Infektionsagentien dar, die häufig durch mehrere Injektionen von Impfstoffen^ wo dies möglich ist, verstärkt wird. Andererseits haben IgM- und IgA-Antikörper

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die Neigung, innerhalb weniger Wochen nach ihrem ersten Auftreten zu verschwinden. Umgekehrt wird die Gegenwart von spezifischen IgM-Antikörpem *■ und bis zu einem gewissen Grade auch die Gegenwart von spezifischen IgA-Antikörpern - allgemein als Anzeichen für eine neue Infektion angesehen, die durch das Infektionsagens, welches das fragliche Antigen bildet, hervorgerufen wurde. Wie mehrere Forscher unabhängig voneinander festgestellt haben, können mit Formalin und Wärme Lr.liaudelte,Protein A enthaltende Staphybkokken diesbezüglich mit Vorteil verwendet werden für die Charakterisierung von spezifischen Antikörpern. Dies ist darauf zurückzuführen, daß mehr als 90 % des Serum-IgG und nicht mehr als etwa 25 % des IgM und 25 % des IgA von Protein A absorbiert werden und daß in dem verbleibenden IgG, das zu der Unterklasse IgG 3 gehört, die Anwesenheit von Antikörpern gegenüber Rubella-Virus nicht nachgewiesen werden konnte. Die Erfahrung hat jedoch gezeigt, daß bei einigen Staphylokokken-Präparaten unspezifische Reaktionen auftreten können, offensichtlich zum Teil als Folge der Fragmentierung von Staphylokokken beim Altern von Suspensionen, die als solche in einem Kühlschrank aufbewahrt werden. Diese Fragmente scheinen sich während des Zentrifugierens der Serum-Reagens-Mischung nicht in normaler Weise abzusetzen und beispielsweise die Sedimentation der roten Blutzellen in sogenannten Mikrotiter-Platten in dem sogenannten Hämagglutinations-Inhibierungstest für Rubella-Virus-Antikörper zu stören. Ausnahmslos lieferten die erfindungsgemäß hergestellten Staphyloknkken-Präparate in diesen serologischen Untersuchungen auf Rubella-Antikörper zuverlässige Ergebnisse und sie stimmten im allgemeinen sehr gut überein,

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wie erwartet, mit den Ergebnissen, die mit davon unabhängigen Kontro11systemen, beispielsweise der teuren und umständlichen Ultrazentrifugierungstechnik, erhalten wurden.

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erstmals möglich ist, Präparate mit Immunoglobulin bindenden Eigenschaften auf eine radikal vereinfachte Weise herzustellen. Diese Präparate sind derart, daß sie die leichte Verteilung und Aufbewahrimg (lagerung) erlauben bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung ihrer Eigenschaften für sehr lange Zeiträume - wahrscheinlich für Jahre nach der derzeitigen Beurteilung - welche die Absicht erfüllen, durch gewöhnliche Wiederaufschlämmung bzw. erneute Suspendierung ein erstklassiges Präparat für die Anwendung in immunologischen Testverfahren zu ergeben. In diesem Zusammenhang sei insbesondere betont, daß gemäß der vorliegenden Erfindung eine Suspension von erneut suspendierten ,Immunoglobulin bindenden Bakterien erhalten wird, die in bezug auf ihre Eigenschaften als Teilchen bemerkenswert stabil sind. Das Lyophilisierungsverfahren scheint, entsprechend dem, was aus den angegebenen Fakten geschlossen werden kann, diese Teilchenstabilität zu erklären, die niemals zuvor erzielt worden war bei der Abtötung mit Wärme oder bei der klassischen Formalinbehandlung vor der Abtötung mit Wärme. Der Teilchenstabilisierungseffekt der Formalinbehandlung vor der Wärmeabtötung kann somit - obgleich er allgemein anerkannt ist - erfindungsgemäß nicht nur in bezug auf seine Wirksamkeit ersetzt ₉ sondern auch beträchtlich übertroffen werden durch den Effekt der Lyophilisierung der gerade durch Wärme abgetöteten Bakterien.

Claims (7)

1. Patentansprüche

   l.j Verfahren zur Herstellung eines stabilen Präparats mit Immunoglobulin-Bindungseigenschaften, dadurch gekenn zeichnet, daß Spezies von Bakterien, die eine Immunoglobulin-Bindungskapazität aufweisen, die über diejenige hinausgeht, die auf der Reaktion zwischen Antigenen der Bakterien und gegen diese Antigene gerichteten spezifischen Antikörpern beruht, wie z.B. Staphylococcus aureus oder Streptococcus pyogenes, in einem Substrat gezüchtet werden, in dem die Bakterien eine Immunoglobulin bindende Substanz bilden, daß die Bakterien, welche diese Immunoglobulin bindende Substanz enthalten, ohne irgendeine andere Vorbehandlung als Waschen abgetötet werden und daß die abgetöteten Bakterien lyophilisiert werden zur Herstellung einer Bakteriensuspension, die mit einer Flüssigkeit wieder-hergestellt werden kann.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien durch Erhitzen abgetötet werden.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekenn-

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   zeichnet, daß die Bakterien in Gegenwart einer Substanz mit Bakterienabtötungseigenschaften abgetötet werden,
4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß diese Substanz enthält oder besteht aus Formaldehyd.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien,beispielsweise durch Zentrifugieren oder Filtrieren,zu einer höheren Konzentration angereichert werden, bevor sie abgetötet werden.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterienmasse vor dem Abtöten gewaschen wird, so daß sie praktisch frei von Substrat ist.
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakterienpräparat nach der Lyophilisierung einem Gemisch aus trockenen Gasen, wie z.B. Luft, ausgesetzt wird.

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