DE2430356C2 - - Google Patents

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Description

Die Erfindung betrifft das im Patentanspruch 1 beschriebene Verfahren zur Markierung von Immunglobulin der IgG-Klasse oder dessen Fc-Fragment durch eine oder mehrere analytisch feststellbare Gruppen, wobei das Immunglobulin oder sein Fc-Fragment in freier oder gebundener Form vorliegen, und das im Patentanspruch 2 beschriebene Mittel zum Markieren von Immunglobulin der IgG-Klasse oder seinem Fc-Fragment in freier oder gebundener Form durch eine oder mehrere analytisch feststellbare Gruppen.
Ein Verfahren der geschilderten Art, bei dem man ein mit den analytisch feststellbaren Gruppen markiertes Polypeptid mit dem freien oder gebundenen Immunglobulin oder dessen Fc-Fragment in Berührung bringt, ist bekannt. Beispielsweise ist es bekannt, einen markierten Antikörper als Polypeptid zu verwenden. Das Verfahren zur Herstellung von Antikörpern ist jedoch kompliziert. Außerdem stellen Antikörper ein inhomogenes Material mit verschiedener Bindungsfähigkeit dar. Wird ein Antikörper gegen ein Immunglobulin hergestellt, z. B. bei der Herstellung von Antikörpern in einer Ziege gegen Kaninchen-Immunglobulin, so binden diese Antikörper nur Immunglobuline von Kaninchen, im allgemeinen jedoch keine Immunglobuline anderer Tiere. Für jedes zu markierende Immunglobulin muß man daher einen besonderen Antikörper herstellen, der zur Reaktion mit dem fraglichen Immunglobulin befähigt ist. Außerdem führt in den meisten Fällen die Markierung der Antikörper durch analytisch feststellbare Gruppen zu einem Verlust an Immunaktivität.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der vorstehend beschriebenen Art bereitzustellen, welches nicht mit einem Verlust an Immunaktivität verbunden ist und welches nicht für jedes zu markierende Immunglobulin die Herstellung eines besonderen Polypeptids erfordert.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man als Polypeptid Protein A oder ein polypeptidartiges Fragment dieses Proteins, welches zur Bindung an den Fc-Teil des Immunglobulins befähigt ist, verwendet und dieses Polypeptid durch eine oder mehrere fluoreszierende oder enzymatisch wirksame Gruppen als analytisch feststellbare Gruppen markiert.
Das erfindungsgemäß als Polypeptid verwendete Protein A ist bekannt und kann z. B. gemäß Eur. J. Biochem. 29 (1972), S. 572 aus Staphylococcus aureus isoliert werden.
Das erfindungsgemäß als Polypeptid verwendete Protein A und dessen polypeptidartiges Fragment mit Befähigung zur Bindung an den Fc-Teil des IgG lassen sich in guten Ausbeuten mit fluoreszierenden oder enzymatisch wirksamen Gruppen markieren.
Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäß markierten Protein A bzw. markierten Fragments von Protein A besteht darin, daß dieses sich bei Verwendung zum Markieren von Immunglobulin mit Immunglobulinen verschiedener Tierarten am Fc-Teil des Immunglobulins verbinden kann, so daß der Fab-Teil frei und zur Bindung von Antigen und Hapten befähigt bleibt. Frühere Methoden zum Markieren von Antikörpern gegen den Fc-Teil von Immunglobulinen erforderten die Reinigung des Fc-Fragments des betreffenden Immunglobulins, was schwierig ist, und die nachfolgende Immunisierung der Tiere mit diesen Fc-Fragmenten mit jedem Immunglobulin für jede Tierart.
Ein weiterer Vorteil der Markierungsmethode besteht darin, daß das Protein A oder dessen polypeptidartiges Fragment, im Gegensatz zu Antikörpern, eine homogene Substanz darstellt, die zu einer Bindung an das betreffende Immunglobulin in gleichmäßiger und definierter Weise befähigt ist.
Methoden zum Markieren von Polypeptiden mit fluoreszierenden Gruppen sind in der Literatur ausgiebig beschrieben und können auf das erfindungsgemäß eingesetzte Protein A oder dessen polypeptidartiges Fragment angewandt werden. Eine einfache Methode zur Markierung des Polypeptids besteht in der Einführung einer fluoreszierenden Gruppe, z. B. mit Hilfe von Fluoreszein-iosothiocyanat oder von Tetramethylrhodamin-isothiocyanat. Enzyme (z. B. eine Peroxydase oder eine Hydrolase wie Phosphatase) können mit Hilfe von Bromcyan oder Glutaraldehyd oder nach anderen bekannten Methoden an das Protein A oder dessen polypeptidartiges Fragment gebunden werden. Die fluoreszierende oder enzymatisch wirksame Gruppe, mit welcher das Protein A oder dessen polypeptidartiges Fragment und darüber auch das Immunglobulin oder dessen Fc-Fragment markiert wird, kann nach konventionellen Verfahren leicht festgestellt und bestimmt werden.
Das markierte Protein A oder dessen polypeptidartiges Fragment, das die Fähigkeit zur Bindung an den Fc-Teil eines Immunglobulins besitzt, wird sodann an das freie oder gebundene Immunglobulin der IgG-Klasse oder an dessen Fc-Fragment am Fc-Teil gebunden.
Die Markierung des Immunglobulins oder seiner Fc-Fragmente durch das mit einem fluoreszierenden Mittel oder einer enzymatisch wirksamen Gruppe markierte Protein A oder dessen polypeptidartiges Fragment kann mit Vorteil zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung des Immunglobulins oder seines Fc-Fragments oder eines Antigens oder Haptens verwendet werden, wobei das Antigen oder Hapten an den Fab-Teil des Immunglobulins gebunden ist.
Die Markierung des Immunglobulins (oder seines Fc-Fragments) durch das mit einer fluoreszierenden oder enzymatisch wirksamnen Gruppe markierte Protein A oder dessen polypeptidartiges Fragment erfolgt zweckmäßig in flüssigem Millieu, in welchem das markierte Protein A oder dessen polypeptidartiges Fragment ebenfalls löslich ist, vorzugsweise in wäßriger Flüssigkeit, unter Bedingungen, unter denen das Protein A oder dessen polypeptidartiges Fragment an den Fc-Teil des Immunglobulins gebunden wird. Der pH-Wert wird dementsprechend zweckmäßig in der Nähe des Neutralpunktes gewählt, beispielsweise im Bereich von 5 bis 9 oder insbesondere von 6 bis 8.
Falls erwünscht, kann das markierte Immunglobulin oder sein Fc-Fragment in Lösung durch Gelfiltration oder spezifische Adsorption, oder in ungelöster Form, z. B. gebunden an unlösliches oder unlöslich gemachtes Antigen oder Hapten oder nach direkter oder indirekter Bindung an ein unlösliches Polymer durch Waschen gereinigt werden. Ein Überschuß an freiem markiertem Protein A oder dessen polypeptidartigem Fragment kann während dieser Reinigungsoperation entfernt werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Mittel zum Markieren von Immunglobulin der IgG-Klasse oder seinem Fc-Fragment in freier oder gebundener Form durch eine oder mehrere analytisch feststellbare Gruppen, das aus einem mit den analytisch feststellbaren Gruppen markierten Poypeptid besteht oder dieses enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es als Polypeptid Protein A oder ein polypeptidartiges Fragment dieses Proteins, das zur Bindung an den Fc-Teil des Immunglobulins befähigt ist, enthält und dieses Polypeptid durch eine oder mehrere fluoreszierende oder enzymatisch wirksame Gruppen als analytisch feststellbare Gruppen markiert ist.
Das erfindungsgemäße Mittel wird im erfindungsgemäßen Verfahren mit Erfolg eingesetzt. Es kann in Lösung, vorzugsweise in wäßriger Lösung, aber auch in fester Form, z. B. in gefriergetrockneter Form, die leicht vor der Verwendung in Lösung gebracht werden kann, vorliegen.
Das erfindungsgemäße Markierungsverfahren kann als wichtige Stufe bei der qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Immunglobulins in freier oder gebundener Form eingesetzt werden, z. B. in Verbindung mit immunchemischen Reaktionen, bei denen das Immunglobulin z. B. an ein Antigen oder Hapten gebunden vorliegt.
Das erfindungsgemäße Markierungsverfahren kann auch angewandt werden zur Herstellung eines Reagenses zur quantitativen oder qualitativen Bestimmung von Antigenen oder Haptenen in freier oder gebundener Form.
Präparat 1 Herstellung von Protein A aus S. aureus für Markierungszwecke. A. Herstellung von Protein A-Rohextrakt aus S. aureus
S. aureus Spezies Cowan I wurde nach der Vorschrift von Sjöquist et al., Eur. J. Biochem. 29 (1972), S. 572 gezüchtet.
Das Protein A wurde aus den Bakterien mit Hilfe des Enzympräparats Lysostaphin (vgl. Merck Index, 8. Aufl. (1968), S. 633) freigesetzt. Unlösliches Material wurde abzentrifugiert, die flüssige Phase wurde gesammelt. Der pH-Wert wurde mit Salzsäure auf 3,5 eingestellt, dann wurde unlösliches Material abzentrifugiert und die Flüssigkeit wurde gesammelt, ihr pH-Wert wurde mit Natriumhydroxidlösung auf 7,0 eingestellt (entsprechend der vorstehend zitierten Vorschrift). Die so erhaltene Flüssigkeit stellt einen Rohextrakt dar, welcher Protein A im Gemisch mit verunreinigenden Substanzen enthält.
B. Herstellung von Agarose, an die IgG gebunden ist.
Die Agarose lag in Form kleiner Teilchen (40 bis 190 µm) vor, die in Wasser gequollen wurden. Die Teilchenmasse enthielt 4 Gew.-% Agarose. Sie wurde zunächst mit Wasser gewaschen. Zu 100 ml gepackter Teilchenmasse und 50 ml Wasser wurden 10 g Bromcyan in 50 ml Wasser bei 20°C unter Rühren zugesetzt, wobei der pH-Wert durch Zusatz von 5n-Natriumhydroxidlösung bei 10 bis 11 gehalten wurde. Nach 10 Minuten wurde die Teilchenmasse sorgfältig mit eiskaltem Wasser und dann mit 0,2-molarer wäßriger Natriumcarbonat/Natriumbicarbonat-Pufferlösung vom pH 9,0 bei 4°C gewaschen.
Die mit Bromcyan aktivierte Teilchenmasse wurde in 120 ml des obigen Puffers vom pH 9,0, der 3,0 g humanes IgG enthielt, bei 4°C unter Rühren aufgeschlämmt. Nach 4 Stunden wurde die Teilchenmasse abfiltriert und mit dem obigen Puffer vom pH 9,0 gewaschen und dann unter 18stündigem Rühren bei 4°C in 1,5 l einer wäßrigen Lösung suspendiert, die 0,05 M 2-Aminoethanol und 0,2 M Natriumcarbonat/Natriumbicarbonat enthielt (pH 9,0). Dann wurde die Teilchenmasse mit einer wäßrigen 0,1-molaren Natriumphosphatpufferlösung vom pH 6,0, die 4 M Harnstoff enthielt, danach mit 0,1-molarer wäßriger Natriumphosphatpufferlösung vom pH 7,0 gewaschen, bis die optische Dichte der Waschflüssigkeit bei 280 nm weniger als 0,01 betrug. Die Gelmasse wurde sodann mit einem 0,1 M Glycin-HCl-Puffer in Wasser vom pH 3,0 gewaschen, danach wurde nochmals mit dem obigen 0,1-molaren Natriumphosphatpuffer vom pH 7,0 gewaschen. Das so erhaltene Produkt enthielt etwa 30 mg gebundenes IgG pro ml gepackte Teilchenmasse.
C. Abtrennung des Protein A aus dem Rohextrakt
Eine Chromatographiesäule wurde mit 100 ml der gepackten Teilchenmasse mit gebundenem IgG und dem pH 7,0 (siehe Stufe B) gefüllt. 500 ml des Protein A-Rohextrakts aus Stufe A mit pH 7,0 wurden langsam bei 20°C durch die Säule geleitet, wobei die Durchschnittsgeschwindigkeit auf 50 ml pro Stunde eingestellt wurde. Die Teilchenmasse der Säule wurde dann sorgfältig mit 0,1-molarer Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,0 gewschen, bis die optische Dichte der Waschflüssigkeit bei 280 nm weniger als 0,02 betrug. Das so erhaltene Produkt enthielt etwa 3 mg gebundenes Protein A pro ml gepackte Teilchenmasse.
D. Abtrennung des Protein A von der Teilchenmasse
Das gemäß Stufe C erhaltene, an die Teilchenmasse gebundene Protein A wurde durch Eluieren der Säule bei saurem pH beispielsweise mit 100 ml 0,1 M Glycin/HCl-Puffer in Wasser bei pH 3,0 freigesetzt. Die das Protein A enthaltende aufgefangene Glycin/HCl-Pufferlösung wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert, worauf das Protein A durch Gefriertrocknung in fester Form erhalten wurde. Man erhielt etwa 250 mg Protein A in reiner Form (anstelle der Dialyse kann eine Entsalzung auch durch Gelfiltration durchgeführt werden). Durch immunologische Tests wurde festgestellt, daß das so erhaltene Protein A keine verunreinigenden Substanzen enthielt.
Das so erhaltene Protein A kann zur Markierung durch eine oder mehrere fluoreszierende Gruppen (z. B. mit Fluoreszeinisothiocyanat) oder mit Enzymen verwendet werden.
Präparat 2 Herstellung von Polypeptidfragmenten des Protein A aus S. aureus für Markierungszwecke. A. Herstellung eines Rohextrakts von Polypeptid-Fraktionen des Proteins A aus S. aureus.
S. aureus der Spezies Cowan I wurde nach der in Eur. J. Biochem. 29 (1972) 572 (Sjöquist et al.) beschriebenen Vorschrift gezüchtet.
Die Bakterien wurden abzentrifugiert und dann mit wässriger 0,9%iger Natriumchloridlösung gewaschen. 100 g Bakterien (Naßgewicht) wurden in 150 ml physiologischer Kochsalz­ lösung aufgeschlämmt. Hierzu wurden 10 mg Trypsin (frei von Chymotrypsin) bei pH 7,2 gegeben. Die Enzymbehandlung erfolgt bei 30°C und pH 7,2 während 30 Minuten, worauf 20 mg eines Trypsins-Inhibitors aus Sojabohnen zugesetzt wurden. Dann wird die Suspension zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit wurde aufgefangen und einer Sterilfiltration unterworfen.
Die sterilfiltrierte Flüssigkeit enthielt Protein A-Frag­ mente von Polypeptidcharakter im Gemisch mit verunreini­ genden Substanzen. Zum Reinigen der zur Bindung an den Fc-Teil von IgG-Molekülen befähigten Fragmente wurden diese mit Hilfe von Agarose, an welche IgG gebunden ist, isoliert.
B. Herstellung von Agarose mit gebundener IgG.
Agarose, an die IgG gebunden ist, wurde nach der Arbeitsweise von Präparat 1, Teil B hergestellt. Das Produkt enthielt ca. 30 mg gebundenes IgG pro ml gepackte Teilchenmasse.
C. Abtrennung der Polypeptidfragmente des Protein A aus S. aureus.
Eine Chromatographiesäule wurde mit 100 ml der gepackten Teilchenmasse mit gebundenem IgG vom pH 7,0, die nach Stufe B hergestellt worden war, gefüllt. 100 ml des Roh­ extrakts aus Stufe A vom pH 7,0, welcher die Protein A- Polypeptidfragmente enthielt, wurden langsam bei 20°C durch die die Teilchenmasse enthaltende Säule geleitet, wobei die Durchflußgeschwindigkeit auf 50 ml pro Stunde eingestellt wurde. Die Teilchenmasse in der Säule wurde dann sorgfältig mit wäßriger 0,1-molarer Natriumphosphatpufferlösung vom pH 7,0 gewaschen, bis die optische Dichte der Waschflüssigkeit bei 280 nm weniger als 0,02 betrug. Das so erhaltene Produkt enthielt etwa 1 mg gebundenes Polypeptid pro ml gepackte Teilchenmasse.
D. Abtrennung der Protein A-Polypeptidfragmente von der Teilchenmasse.
Die an die Teilchenmasse gebundenen Polypeptide wurden dann freigesetzt, indem man die Säule bei saurem pH-Wert, bei­ spielsweise mit 100 ml 0,1-M Glycin/HCl-Puffer in Wasser von pH 3,0, eluierte.
Die hierbei aufgefangene Glycin/HCl-Pufferlösung, die die zur Bindung des Fc-Teils von IgG-Molekülen befähigten Polypeptide enthielt, wurde durch Gelfiltration mit Hilfe von Sephadex G 25 ® (mit Epichlor­ hydrin vernetztes Dextran) entsalzt. Beim Gefriertrocknen wurden ca. 100 mg Polypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 7000 isoliert. Chromatographisch konnte gezeigt werden, daß die Polypeptidfraktion aus mehreren sehr ähnlichen Polypeptiden bestand, die alle zur Bindung des Fc-Teils von IgG-Molekülen befähigt waren. Es konnte auch durch immuno­ logische Tests gezeigt werden, daß die Polypeptidfraktion von verunreinigenden Substanzen frei war.
In entsprechender Weise ist es möglich, zur Bindung mit dem Fc-Teil von IgG-Molekülen befähigte Polypeptidfragmente zu isolieren, indem man zunächst das Protein A gemäß der DE-OS 23 22 552 isoliert und dann das Protein A in Lösung, z. B. bei pH 8,2, mit Trypsin analog obiger Vorschrift behandelt, worauf man die Polypeptidfragmente mit den entsprechenden Eigenschaften gemäß vorstehender Arbeitsweise durch Bindung an Agarose, die IgG gebunden aufweist, absondert, worauf die Polypeptidfragmente abgetrennt werden. Das Polypeptidprodukt kann zu Markierungen verwendet werden.
Beispiel 1 Markierung von IgG mit Fluoreszein. A. Markierung von Protein A oder Protein A-Fragmenten mit Fluoreszein-isothiocyanat
Das nach der Arbeitsweise von Präparat 1 oder 2 erhaltene Polypeptidprodukt wurde wie folgt mit Fluoreszeinisothiocyanat markiert:
10 mg des Polypeptidprodukts wurden in 1 ml 0,25-molarer wäßriger Natriumcarbonat/Natriumbicarbonat-Pufferlösung vom pH 9, die noch 0,45% Natriumchlorid enthielt, gelöst und mit 1 mg Fluoreszein-isothiocyanat vermischt, worauf das Gemisch einige Minuten geschüttelt und dann 12 Stunden bei 4°C stehenge­ lassen wurde. Dann wurde zentrifugiert. Zum Reinigen der das markierte Polypeptid enthaltenden Lösung von nicht umgesetztem Fluoreszein-isothiocyanat wurde eine Gelfiltration in einer Säule durchgeführt, die mit Gelteilchen aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran (Sephadex G-25 ®), welche in 0,9%iger wäßriger Natriumchloridlösung gequollen waren, gefüllt war; die Eluierung erfolgte mit der gleichen Lösung. Die das markierte Polypeptid enthaltende Eluatfraktion wurde aufge­ fangen, der pH-Wert wurde auf 7 eingestellt. Die Lösung ließ sich in gefrorenem Zustand lagern oder auch gefriertrocknen. Das Produkt fluoreszierte im UV-Licht.
B. Bindung des markierten Polypeptids an IgG.
Das markierte Polypeptid aus Stufe A wurde wie folgt an IgG gebunden, welches sich auf lymphoiden Zellen befand:
Lymphoide Zellen (Seraphinazellen), auf welchen sich IgG be­ fand, wurden in einer Konzentration von 5 × 106 pro ml eines Phosphatpuffers vom pH 7,2 (sogenannter PBS-Puffer) verwendet. Zu 50 µl der Zellsuspension wurden 50 µl einer Lösung des mit Fluoreszein markierten Protein A im PBS-Puffer (0,6 mg markier­ tes Protein A pro ml) gegeben. Nach einer Stunde wurden die Zellen 3 × bei 4°C mit kaltem PBS-Puffer (4°C) gewaschen. Danach ergab die Untersuchung mit einem UV-Mikroskop, daß das mit Fluoreszein-isothiocyanat markierte Protein A sich an das IgG an den Zellen gebunden hatte. Bei Vergleichsver­ suchen mit Zellen, auf deren Oberfläche sich kein IgG befand, oder bei denen das IgG durch Trypsinbehandlung entfernt worden war oder bei denen der Fc-Teil des IgG durch unmarkiertes Protein A blockiert worden war, erhielt man von der Zellober­ fläche keine Fluoreszenz.
Beispiel 2 Markierung von Protein A und IgG mit Peroxydase.
Peroxydase wurde an Protein A aus S. aureus (siehe Präparat 1) in folgender Weise gekuppelt: 15 mg Peroxydase (aus Meerettich) wurden in 0,2 ml einer 1,25%igen Lösung von Glutar­ aldehyd in 0,1-molarer wäßriger Natriumphosphatlösung vom pH 6,8 gelöst. Die Lösung wurde bei 20°C 18 Std. stehengelassen und dann durch eine Säule (Länge 50 cm, Durchmesser 1 cm) geleitet, welche mit gequollenen Teilchen aus mit Epichlor­ hydrin vernetztem Dextran (Sephadex G-25 ®) und 0,1-molarer wäßriger Natriumphosphatlösung vom pH 6,8 gefüllt war. Zum Eluieren der Säule wurde die gleiche Phosphatpufferlösung verwendet. Die im Hohlraumvolumen eluierten gefärbten Fraktionen wurden bei dieser Gelchromatographie gewonnen. Die aufgefangenen gefärbten Fraktionen wurden durch Ultra­ filtration (Membran, welche Proteine vom Molekulargewicht oberhalb 10 000 zurückhält) auf 1 ml eingeengt. Zu der mit Glutaraldehyd aktivierten Peroxydaselösung (1 ml) wurden 5 mg Protein A gelöst in 1 ml des obigen Phosphatpuffers gegeben. Dann erfolgte Zusatz von 0,2 ml einer wäßrigen 1-molaren Natriumcarbonat/Natriumbicarbonat-Pufferlösung vom pH 9,5, dann wurde das Gemisch 24 Stunden bei 4°C stehengelassen. Sodann wurden 0,2 ml einer 0,2-molaren wäßrigen Lysinlösung zugegeben (der pH-Wert der Lysinlösung war mit 5-molarer wäßriger Natriumhydroxidlösung auf 7,0 eingestellt worden). Nach dem Lysinzusatz wurde das Gemisch 2 Stunden bei 20°C stehengelassen, dann wurde die Lösung durch eine Säule von 10 cm Länge und 1 cm Durchmesser geleitet, die mit gequollenen IgG-Agarose-Teilchen und 0,1-molarer wäßriger Natriumphosphat­ lösung vom pH 6,8 gefüllt war (Herstellung der IgG-Agarose analog der Arbeitsweise von Präparat 1). Das mit Peroxydase gekuppelte Protein A haftete an der IgG auf den Agaroseteil­ chen. Durch die Säule wurde 0,1-molare Natriumphosphatlösung vom pH 6,8 geleitet, die nicht gebundene Substanzen auswusch. Dann wurde die Säule mit einem wäßrigen 0,1-molaren Glycin/HCl-Puffer vom pH 3,0 eluiert. Die gefärbten Fraktionen wurden aufgefangen und vereinigt. Die Lösung wurde mit 5-molarer wäßriger Natriumhydroxidlösung neutralisiert und dann durch Ultrafiltration (Membran, welche Substanzen vom Molekulargewicht oberhalb ca. 2000 zurückhält) auf 1 ml einge­ engt. Die Lösung wurde dann 12 Stunden gegen einen Puffer vom pH 7,2 dialysiert (Herstellung des Puffers aus 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na2HPO4 und 0,2 g KH2PO4 pro Liter Lösung in Wasser).
Die Lösung des mit Peroxydase markierten Protein A kann steril­ filtriert werden und wird dann zweckmäßig bei 4°C gelagert.
Protein A mit daran gebundener Peroxydase wurde in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet, wobei man die Peroxy­ dase-Aktivität in konventioneller Weise bestimmte. Entsprechend dem Beispiel 1 konnte aufgrund der Anwesenheit von Peroxydase gezeigt werden, daß das obige Protein A mit daran gebundener Peroxydase an das IgG auf Zelloberflächen gebunden wurde.

Claims (2)

1. Verfahren zur Markierung von Immunglobulin der IgG- Klasse oder dessen Fc-Fragment durch eine oder mehrere analytisch feststellbare Gruppen, wobei das Immunglobulin oder sein Fc-Fragment in freier oder gebundener Form vor­ liegen, indem man ein mit den analytisch feststellbaren Gruppen markiertes Polypeptid mit dem freien oder gebundenen Immunglobulin oder dessen Fc-Fragment in Berührung bringt, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polypeptid Protein A oder ein polypeptidartiges Fragment dieses Proteins, welches zur Bindung an den Fc-Teil des Immunglobulins befähigt ist, verwendet und dieses Polypeptid durch eine oder mehrere fluoreszierende oder enzymatisch wirksame Gruppen als analytisch feststellbare Gruppen markiert.
2. Mittel zum Markieren von Immunglobulin der IgG-Klasse oder seinem Fc-Fragment in freier oder gebundener Form durch eine oder mehrere analytisch feststellbare Gruppen, das aus einem mit den analytisch feststellbaren Gruppen markierten Polypeptid besteht oder dieses enthält, dadurch gekennzeichnet, daß es als Polypeptid Protein A oder ein polypeptidartiges Fragment dieses Proteins, das zur Bindung an den Fc-Teil des Immunglobulins befähigt ist, enthält und dieses Polypeptid durch eine oder mehrere fluores­ zierende oder enzymatisch wirksame Gruppen als analytisch feststellbare Gruppen markiert ist.
DE2430356A 1973-06-28 1974-06-25 Verfahren zur markierung von immunoglobulin oder dessen fc-fragment und mittel zur durchfuehrung des verfahrens Granted DE2430356A1 (de)

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