DE2430357A1 - Verfahren zur bestimmung von immunoglobulin oder antigenen (bzw. haptenen) - Google Patents
Verfahren zur bestimmung von immunoglobulin oder antigenen (bzw. haptenen)Info
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Description
DR. JUR. DIPL-CHEM. WALTER BEJl 24. Juni 1974
ALFREDHOEPPENER
DR. JUR/DIPL-CHEM. H.-J, WOUf
DR. JUR. HANS CHR. BEIL
Unsere Nr. 19 354
Pharmacia Akt ie b öl ag
Uppsala, Schweden
Verfahren zur Bestimmung.von Immunoglobulin oder
Antigene*!, (bzw, Haptenen), .
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von Immunoglobulinen,
deren J?ab-Anteil an ein Antigen oder ein Hapten gebunden ist oder zur Bindung mit einem Antigen oder Hapten gebracht
wird, oder zur Bestimmung des Antigens oder Haptens, welches an den Fab-Anteil des Immunoglobulins gebunden ist
oder zur Bindung damit gebracht wird, wobei das Immunoglobulin vor oder nach der Bindung an das Antigen oder Hapten
durch ein oder mehrere analytisch feststellbare Atome oder
Atomgruppen markiert wird mittels Kontakt mit einem Polypepiiid, welches durch das analytisch feststellbare Atom'
bzw. die G-ruppe markiert ist. Unter "Polypeptiden" werden
in diesem Sinne auch Proteine verstanden.
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Ein. Verfahren der oben gekennzeichneten Art ist bekannt. So
ist es bekannt, als markiertes.Polypeptid einen Antikörper zu verwenden, der beispielsweise durch radioaktives Jod
markiert ist. Die Herstellung der Antikörper erfolgt in einem komplizierten Verfahren. Antikörper sind außerdem
ein inhomogenes Material mit veränderlicher Bindungsfähigkeit. 'Werden Antikörper gegen ein Immunoglobulin hergestellt,
z.B. bei Ziegen gegen Kaninchen—Immunoglobulin, so binden sich diese Antikörper nur an Immunoglobuline von
Kaninchen, jedoch nicht generell an Immunoglobuline auch anderer Tiere.
Für jedes zu markierende Immunoglobulin muß man einen spezieller Antikörper herstellen, der mit dem "in Betracht stehenden
Immunoglobulin reagieren kann. Außerdem führt die Markierung der Antikörper mit feststellbaren Atomen oder Molekülgruppen
in den meisten .Fällen zu einem Verlust an Immunoaktivität. Ein Ziel vorliegender Erfindung ist es, diese Nachteile
weitgehend zu beseitigen.
Die vorliegende Erfindung ist im wesentlichen dadurch gekennzeichnet,
daß im vorstehend skizzierten Verfahren ein Immunoglobulin der IgG--Klasse eingesetzt und ein Polypeptid
verwendet wird, welches man aus Mikroorganismen erhält und welches die Fähigkeit zur Bindung des Fc-Anteils des
genannten Immunoglobulins aus der IgG~Klasse besitzt.
Polypeptide mit den bezeichneten Eigenschaften aus Mikroorganismen,
sind relativ leicht erhältlich und können in guten Ausbeuten mit analytisch feststellbaren Atomen oder Atom—
, gruppen markiert werden.
Ein bedeutender Vorteil,- den die markierten Polypeptide
mit den genannten Eigenschaften bei der Verwendung zur
Markierung von Immunoglobulinen gemäii vorliegender Erfindung
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einbringen, besteht darin, daß sie sich mit dem Fc-Anteil
von Immunoglobulineη verschiedener Tierarten verbinden
können, wobei der 3?ab-Anteil frei bleibt und zur Bindung
der 'Antigene und Haptene zur Verfugung steht. Bei den
bisher bekannten Methoden zur Markierung von Antikörpern
gegen den Fc-Anteil von Immunoglobulinen mußte das Fe-■ Fragment des betreffenden Immmunoglobulins in reiner Form
dargestellt werden, was einerseits schwierig ist, ferner mußte die nachfolgende Immunisierung der Tiere mit diesen
Fc-Fragmenten mit jedem Immunoglobulin für jede Tierart durchgeführt werden.
Ein weiterer Vorteil der Markierungsmethode besteht darin, daß im Gegensatz zu Antikörpern das Polypeptid eine einheitliche
Substanz ist, die sich mit dem Immunoglobulin in definierter Weise verbindet.
Das· feststellbare Atom bzw. die Gruppe bzw. Atome und Gruppen,
durch welche das Polypeptid markiert wurde, können radioaktiv und/oder färbend und/oder fluoreszierend sein,
und/oder sie können freie Radikale enthalten und/oder
enzvmatisehe wirkung besitzen. Verfahren zur entsprechenden Markierung von Polypeptiden sind ausreichend bekannt und
können auf die aus Mikroorganismen gewonnenen Polypeptide gemäß vorliegender Erfindung angewandt werden. Beispiele
für geeignete radioaktive Isotope sind z.B. Jodisotöpe, wie I, C und Tritium, die direkt oder durch. Substitution
des Polypeptide mit einer das Isotop enthaltenden Gruppe in das Polypeptid eingeführt werden. Ein einfacher
weg zur Markierung des Polypeptide besteht in der Einführung
einer fluoreszierenden Gruppe, z.B. mit Hilfe von Fluoreszein-Isothiocyanat.
Enzyme (z.B. eine Peroxydase oder eine Hydrolase wie z.B. Phosphatase) können mit Hilfe von
Bromcyan oder Glutaraldehyd an Polypeptide gebunden werden.
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Das analytisch, feststellbare Atom bzw. die Gruppe öder
die Atome oder Gruppen, durch die das Polypeptid markiert wurde und durch welche das Immunoglobulin ebenfalls markiert
ist, sind leicht durch konventionelle Methoden feststellbar.
Die aus Mikroorganismen stammenden Polypeptide können z.B.
aus sogenanntem Protein A aus Staphylococcus aureus oder einem Fragment dieses Proteins bestehen, welches polypeptidartig
ist und mindestens ein Immunoglobulin am Fc-Teil binden kann. Die erwähnten Polypeptide, d.h. Protein A
und dessen Fragmente aus Staphylococcus aureusj können
Immunoglobuline aus der IgG--Klasse am Fc-Teil binden,
weitere Beispiele für derartige Polypeptide sind Polypeptide aus Staphylococcus epidermis und anderen Bakterienarten.
Die Markierung des Immunoglobulins mit Hilfe des markierten Polypeptids kann mit Vorteil zur qualitativen oder quantitativen
Feststellung des Immunoglobulins oder. Antigens oder xiaptens verwendet werden, wobei Antigen oder Hapten an den
Fab-ieil des Immunoglobulins gebunden sind oder daran
gebunden werden können.
Die Markierung des Immunoglobulins mit Hilfe des markierten Polypeptids erfolgt zweckmäßig in Gegenwart einer Flüssigkeit,
in der das markierte Polypeptid löslich ist, vorzugsweise einer wässrigen Flüssigkeit, unter Bedingungen, unter denen
das Polypeptid an den Fc-'feil des Immunoglobulins gebunden
wird. Der pH-Wert wird entsprechend gewählt, z.B. in der Nähe des ITeutralpunkts, etv/a im Bereich von pH 5 bis 9» insbesondere
6 bis 8.
Falls erwünscht, kann das markierte Iir.munoglobulin gereinigt
werden, z.B. durch Gelfiltration oder spezielle Adsorption
bei Vorliegen in Lösung, oder durch v/aschen bei Vorliegen
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in ungelöster Form, beispielsweise gebunden an ein unlösliches oder unlöslich gemachtes Antigen oder Hapten oder
bei direkter oder indirekter Bindung an ein unlösliches Polymer. Jeder Überschuß an freien markierten Polypeptiden
kann während der .Reinigung des markierten Immunoglobulins entfernt werden.
Die Erfindung betrifft, auch ein Hilfsmittel zur Markierung
von Immunoglobulin in freier oder gebundener Form mit ein oder mehreren analytisch feststellbaren Atomen oder
Gruppen,, das aus einem mit dem analytisch feststellbaren Atom, der Gruppe, den Atomen oder Gruppen markierten
Polypeptid besteht oder ein solches enthält und zur Verwendung
im erfindüngsgemäßen Verfahren geeignet ist. Das
Hilfsmittel ist dadurch, gekennzeichnt, daß das Polypeptid
aus Mikroorganismen erhalten ist und zur Bindung an den Fc-Teil des Immunoglobulins der IgG-Klasse befähigt ist.
Das Hilfsmittel wird mit Vorteil-bei der vorstehend beschriebenen
Markierungsmethode eingesetzt. Es kann in Form einer Lösung, vorzugsweise einer wässrigen Lösung, vorliegen.
Das Hilfsmittel kann jedoch auch feste x'"orm besitzen, z.B.
in gefriergetrockneter Form vorliegen, die zur Verwendung
leicht zur Lösung gebracht werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann eine wichtige Stufe
bei der qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Immunoglobulins darstellen, z.B. in Verbindung mit iinmunochemischen
Reaktionen, bei welchen das Immunoglobulin an ein Antigen oder ein Hapten gebunden ist oder zur Bindung
mit einem Antigen oder einem Hapten veranlaßt wird.
Das Markierungsverfahren kann zur Herstellung eines Reagenses
dienen, welches im erfindungsgemäuen Verfahren zur quantitativen
oder qualitativen Feststellung von Antigenen oder Haptenen in freier oder gebundener Form dient.'Ein solches
Reagens kann aus einem keaktionsprodukt aus einem mit ein
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oder mehreren analytisch feststellbaren Atomen oder ü-ruppen
Biarkierten Polypeptid und einem Immunoglobulin bestehen oder
dieses enthalten. Die .Kennzeichnung gemäß vorliegender Erfindung
besteht darin, daß das Polypeptid aus einem Jilikroorganisinus
stammt und zur Bindung an den Fc-Teil des Immunoglobulins
der IgG--Klasse befähigt ist, derart, daß der antikörper—aktive Fab-ieil des Immunoglobulins Antigene oder
Haptene binden kann.
Das Reagens kann in Form einer Lösung, vorzugsweise einer
wässrigen Lösung vorliegen. Es kann auch feste Form besitzen und beispielsweise gefriergetrocknet sein, wobei diese
IPorm vor der Verwendung leicht in Lösung gebracht werden
kann. Das'Reagens wird zweckmäßig in Gegenwart einer
Flüssigkeit, vorzugsweise einer wässrigen Flüssigkeit,
unter solchen Bedingungen eingesetzt, daß der antikörper—aktive
Fab-i'eil des Immunoglobulins Antigene oder Haptene binden kann. Das Antigen oder Hapten kann in freier oder gebundener
Form vorliegen, es kann z.B. an eine Zelloberfläche oder
ein Polymer, beispielsweise ein unlösliches Polymer, gebunden sein. Das Antigen kann ebenfalls an einen weiteren
Antikörper gebunden sein.
A. Herstellung des Protein A-Rohextrakts aus S. aureus. S. aureus der Spezies Cowan I wurde nach den Vorschriften
von Sjöquist et al., European J. Biochem., 29 (1972) 572 gezüchtet.
Das Protein Ä wurde aus den Bakterien mittels des Enzym-
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Präparats Lysostaphin freigesetzt. Unlösliches Material
wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, die flüssige
Phase wurde aufgearbeitet. Der pH-Wert wurde mit Salzsäure auf 3,5 eingestellt, unlösliches Material wurde dann.abfiltriert
und die Flüssigkeit wurde aufgefangen, worauf der pH-Wert mit Natriumhydroxydlösung auf 7,ο eingestellt
wurde. Diese Maßnahmen entsprechen der vorstehend zitierten Vorschrift. .Die so erhaltene Flüssigkeit besteht aus einem
Rohextrakt, der Protein A im Gemisch mit verunreinigenden Substanzen enthält.
B. Herstellung von Agarose, an die IgG gebunden ist. Die Agarose wurde in diesem Fall in Form des Handelsprodukts
"Sepharose" 4 B"(Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden)
verwendet.
Die Agarose lag in Form kleiner Teilchen (4o bis 19o Mikrometer)
vor, die in Wasser gequollen wurden. Die Teilchenmasse enthielt 4 Gew.-yS Agarose. Sie wurde zunächst mit Wasser gewaschen.
Zu 1oo ml gepackter Teilchenmasse und 5o ml Wasser wurden 1o g .ß.romcyan in 5o ml Wasser bei 2o C unter
Rühren zugesetzt, wobei der pH-Wert durch Zusatz von 5n-Natriumhydroxydlösung
bei 1o bis 11 gehalten wurde. Nach 1o Minuten wurde die Teilchenmasse sorgfältig mit eiskaltem
Wasser und dann mit o,2-molarer wässriger Natriumcarbonat/
Natriumbicarbonat-Pufferlösung vom pH 9»o bei-4 C gewaschen.
Die mit Bromcyan aktivierte Teilchenmasse wurde in I2o ml
des obigen Puffers von pH 9jO, der 3}o g menschliches IgG
(Hersteller Kabi AB, Stockholm, Schweden) enthielt, 'bei
4 ü unter Bahren aufgeschlämmt. Nach 4 Stunden wurde die
Teilchenmasse abfiltriert und mit dem obigen Puffer von pH 9>o
gewaschen und dann· unter 18-stündigem Kühren bei 4°C in
1,5 1 einer wässrigen Lösung suspendiert, die o,o5M 2—Aminoäthanol
und o,2M Natriumcarbonat/Natriumbicarbonat enthielt
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"(pH 9jo). Dann wurde die i'eilchenmasse mit einer wässrigen
0,1-molaren Natriumphosphatpufferlösung von pH β,ο, die
4M Harnstoff enthielt, danach mit o,1~molarer wässriger Natriumphosphatpufferlösung vom pH 7,ο gewaschen, bis die
OJD der V/aschflüssigkeit bei 28o Nanometer weniger als o,o1
betrug. Die G-elmasse wurde sodann mit einem o,1M Glycin-HCl-Puffer
in Wasser von pH 3, ο gewaschen, danach wurde nochmals mit dem obigen 0,1-molaren Natriumphosphatpuffer
vom pH 7,o gewaschen. Das so erhaltene Produkt enthielt etwa 3o mg gebundenes IgG- pro ml gepackte Teilchenmasse.
C. Abtrennung des Protein A aus dem liohextrakt.
Eine Chromatographiersäule wurde mit 1oo ml der gepackten Teilchenmasse mit gebundenem IgG und dem pH 7,o (siehe Stufe
B) gefüllt. 5oo ml des Protein A-Hohextrakts aus Stufe A
mit pH 7».ο wurden langsam bei 2o C durch die Säule geleitet?
wobei die Durchschnittsgeschwindigkeit auf 5o ml pro Stunde eingestellt wurde. Die Teilchenmasse der Säule wurde dann
sorgfältig mit o, 1-c:olarer Natriumphosphat-Pufferlösung
vom pH 7,ο gewaschen, bis die OD der "Waschflüssigkeit bei
28o Nanometer weniger als o,o2 betrug. Das so erhaltene Produkt enthielt ca. 3 mg gebundenes Protein A pro ml
gepackte Teilchenmasse.
D. Abtrennung des Protein A von der Teilchenmasse.
Das an die gemäß Stufe C erhaltene Teilchenmasse gebundene
Protein A wurde durch Eluieren der Säule bei saurem pH^
beispielsweise mit 1oo ml o,1M G-lycin/HCl-Puffer in Wasser
bei pH 3»o freigesetzt. Die das Protein A enthaltende
aufgefangene Glycin/HCl-Pufferlösung wurde gegen destilliertes
Vvasser dialysiert, worauf das Protein A durch Gefriertrocknung
in fester -ö'orm erhalten wurde. Man erhielt etwa 25o mg
Protein A in reiner j?orm (anstelle der Dialyse kann eine
Entsalzung auch durch Gelfiltration durchgeführt werden).
Durch immunologische Tests wurde festgestellt, daß das
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so erhaltene, Protein A keine verunreinigenden Substanzen
enthielt.
E. Herstellung von markiertem Protein A.
Das auf obige Weise erhaltene Protein A wurde unter Ver~
125
wendung von Jodmonochlorid als Reagens mit I markiert.
Die Markierung kann wie folgt durchgeführt werden:
Man verwendet Jod-125, trägerfrei und als Natriumiodid in
o,1-molarer Hydroxydlösung gelöst, frei von Reduktionsmittel.
Jodmonochlorid wurde nach der Methode von J.L.Izzo, W.F.Bale,
M.J.IZZQ und A.Uoncone, J.Biol.Chem. _239, ITr. 11 (1964),
3742 hergestellt; der Jodgehalt wurde durch Reduktion von sämtlichem Jod zu Jodid 'mit Arsentrioxyd. und anschließende
Titration mit ο,Ί-molarer Silbernitratlösung bestimmt. Die Jodmonocülorid-Stammlösung enthielt 2,54 mg Jod/ml
in o,o2-M KCl, 2,o-M" EaCl und 1,0-MHCl, sie ist bei Raum- ·
temperatur mindestens 18 Monate beständig. Vor der Verwendung wurde die basische Jodmonochloridlösung auf die erforderliche
Konzentration verdünnt. Das verwendete Verdünnungsmittel war eine Salzsäure/Natriumchlorid-Lösung, deren Konzentration
für Jeden Versuch, einzeln eingestellt wurde, derart, daß sie jeweils hinreichend, oberhalb der Minimalkonzentration
an Chlorwasserstoff und Natriumchlorid lag, bei der Jodmonpchlorid
bekanntlich beständig ist (R.«V. Helmkamp, M..A.
Contreras und W.DV Bale: Int. J. Appl. Radiat. Isotopes, _18
(196?) 737). : ' ■ -·-
Ma rki e rungsverfah ren . . · '
Die Jodierung erfolgte nach der Helmkamp'sehen Abwandlung
des Verfahrens mit Jodmonochlorid nach tocffairlane (A.ö.Fairlane,
Nature, .182 (1958) 53) unter Anwendung weiterer Modifizierungen
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(J.L. Izzo, W.j?. Bale, M.J. Izzo und A. Roncone, J.Biol.
Ciiem. £39, Nr. 11 (1964) 3743;" W".F. Bale, R.W. Helmkamp,
T.P. Davis, M-J. Izzo, R.E. Cooland. M.A. Contreras und
J.L. Spar, Proe.Soc.Exp.Med., Λ22 (1966) 4o7; und
R.W. Helmkamp, M.A. Contreras und V/.F-. Bale, Int.J.Appl.
Radiat. Isotopes, J8 (1967) 737). Ioo/Ug-Protein A wurden
mit einem Molverhältηis Jodmonochlorid zu Protein A von
125 1,875 zu 1 und Jodmonochlorid "zu I von 2 zu 1 markiert.
Folgende Lösungen wurden verwendet:
lösung Ir Protein A wurde in o,o5-molarer Natriumphosphatpufferlösung
von pH 7>4 in einer Konzentration von 5 mg/ml gelöst.
Lösung II: Das Verdünnungsmittel (p,12-M HCl, 1,o-M ITaCl)
für die Jodmonochlorid-Stammlösung wurde hergestellt durch Lösen von 5»84 g Natriumchlorid in 12 ml 1,o-molarer
Salzsäure und 5o ml destillierten V/assers, worauf mit weiterem destilliertem Vi/asser auf ein Endvolumen von I00 ml
verdünnt wurde.
Lösung III: Die endgültige Jodmonochlorid—Lösung wurde'
hergestellt durch Verdünnen von I00/ul der Jodmonochlorid-Stammlösung
mit 15,85 g der Lösung-II.
Lösung IV: 19f4/ul des Radiojodids (5,9 mCi) wurden zu
40 /XkX der Lösung III zugegeben und vor Verwendung in ein
Eisbad gestellt.
Sämtliche Lösungen wurden kalt gestellt und die Jodierungsreaktion
wurde bei O0C durchgeführt. Die Reagentien wurden
-in folgender Eeihenfolge in ein kleines Glasrohr eingefüllt:
5o /ul der Lösung IV wurden zu 7o /ul Natriumborat und Carbonatpuffer
(0,24-iaolar hinsichtlich Borat und 0,16-molar hinsichtlich
Carbonat, pH 9>1) und 2o/ul Losung I (ioo/ug
Protein A) zugegeben und sofort kräftig vermischt. Nach 12o Sekunden wurden 2o/ul o,o1-M Ifa^S^-, 5o/ul 2°/o EI und
2oo/Ul 3^ige wässrige Lösung eines üextrans νοητ mittlere»
Molekulargewicht 2o 000 der Mischung zugegeben. Das mit Jod 125 markierte Protein Α-Präparat kann durch G-elfiltration
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unter -Verwendung von mit Spichlorhydrin in alkalischer
Lösung vernetztem Dextran ("Sephadex" eingetrages Warenzeichen) oder-Polyacrylamid, oder durch Dialyse gereinigt werden-Die
Fraktionen aus der G-elfiltrations-Säule wurden bei ca.
+40O in ρ,ο-5-Hiolarer Natriumphosphatpufferlösung vom. pH 7»4»
die ö,o5$ "Iween 2oir (Polyäthylenglycol 9oo - Sorbitmonolaurat)
und yfa Dextran vom mittleren Molekulargewicht 2o ooo
enthielt, aufgearbeitet. Diejenigen Fraktionen, die einen
Gehalt an markiertem Protein A anzeigten, wurden "vereinigt
und in'gefrorenem Zustand gelagert.
Die Metpde liefert eine Ausbeute von ca. 15$, bezogen auf
die theoretisch berechnete Jodmenge, die gebunden werden kann.
Das markierte Protein A enthielt ca. o, 5 «Tod-125-Atome und
etwa 1 Jod-T27-Atom pro Molekül (Molekulargewicht 42 ooo),
spezifische Aktivität ca. 24 .mCi/mg.
Herstellung von Polypeptidf ragmenten d.es Protein A aus
S. aureüs für Markierungszwecke.
A. Herstellung eines Rohextrakts von Polypeptid-FraJctionen
des Proteins A aus S. aureus.
S. aureus der Spezies Cowan I wurde nach der in European. J. ·
Bioc'hem, 29 (1972) 572 (Sjöquist et al.) beschriebenen Vorschrift
gezüchtet.
Die Bakterien wurden abzentrifugiert und dann mit wässriger
o,geiger Uätriumchlpridlösung gewaschen· 1oo g Bakterien
(NaßgewieKt.) wurden in 15o ml physiologischer Kochsalzlösung
auf geschlämmt. Hierzu werden 1o mg Trypsin (von Chymotrypsin.
frei) bei pH 7j2 zugegeben. Die Enzymbehandlung erfolgt bei
3o°0 und pH 7,2 während 3o Minuten, worauf 2o mg eines Trypsins—Inhibitors aus Sojabohnen zugesetzt werden. Dann
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wird.die Suspension zentrifugiert, die überstehende flüssigkeit
wird aufgefangen und einer Sterilfiltration durch. Milliporenfilter
unterworfen.
Die sterile filtrierte Flüssigkeit enthielt Protein A-Fragmen
te von Polypeptidcharakter im Gemisch mit verunreinigenden Substanzen. Zum Reinigen der zur Bindung an den Fc-Teil
von IgG-Molekülen befähigten Fragmente werden diese mit Hilfe von Agarose, an welche IgG gebunden ist, isoliert.
B. Herstellung von Ägarose mit gebundener IgG.
Agarose, an'Mie IgG gebunden ist, wird nach der Vorschrift
von Beispiel 1, Teil B hergestellt. Das Produkt enthielt ca. 3o mg gebundenes IgG pro ml gepackte Teilchenmasse.
C. Abtrennung der Polypeptidfragmente des Protein A aus
S. aureus.
Eine Chromatographiersäule wurde mit 1oo ml der gepackten Teilchenmasse mit gebundenem IgG vom pH 7»o, die nach Stufe B
hergestellt worden war, gefüllt. 1oo ml des Rohextrakts aus Stufe A vom pH 7»o, v/elcher die Protein A-Polypeptidfragmente
enthält, werden langsam bei 2o°0 durch die die Teilchenmasse enthaltende Säule geleitet, wobei die
Durchflußgeschwindigkeit auf 5o ml pro dtunde eingestellt wird. Die Teilchenmasse in der Säule wird dann sorgfältig
mit wässriger o,1-molarer Hatriumphosphatpufferlösung vom
pH 7,o gewaschen, bis die OD der Vvaschflüssigkeit bei 28o Nanometer weniger als o,o2 beträgt. Das so erhaltene
Produkt enthielt etwa 1 mg gebundenes Polypeptid pro ml gepackte Teilchenmasse.
D. Abtrennung der Protein A-Polypeptidfragmente von der
Teilcheniaa ss e.
Die an die Teilchenrnasse gebundenen Polypeptide werden dann freigesetzt, indem man die Säule bei saurem pH-Wert, beispielsweise
mit 1oo ml o,1-M Glycin/HCl-Puffer in V/asser
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■J* - . ■■ · 243035?
A3
von pH 3* ο-, eluiert.
Die hierbei aufgefangene Glycin/Hül-Pufferlösung, die die
zur Bindung des HO-Teils von IgG--Molekülen befähigten
Polypeptide enthält, wird durch Gelfiltration mit Hilfe von
ilSephädex G 25" (eingetragenes Warenzeichen, mit Epichlorhydrin
vernetztes Dextran) entsalzt. Beim Gefriertrocknen werden ca. 1oö mg Polypeptid mit einem Molekulargewicht von
etwa 7000 isoliert. Chromatographisch kann gezeigt werden, daß die Polypeptidfraktion aus mehreren sehr ähnlichen
Polypeptiden besteht, die sämtliche zur Bindung des Fc-Teils
von IgG-Molekülen befähigt sind. Unter anderem konnte auch
durch immunologische Tests gezeigt werden, daß die Polypeptidf raktion von verunreinigenden Substanzen frei ist.
Es ist auch möglich, Polypeptidfragmente, die zur Bindung
des iO-Teils von IgG-Molekülen befähigt sind, auf entsprechende
Weise zu isolieren, indem man zunächst Protein A gemäß der DOS 2 322 552 isoliert und dann das Protein A ·
in Lösung, z.B. bei pH 8,2, mit Trypsin -analog obiger
Vorschrift behandelt, worauf die Polypeptidfragmente mit
den gewünschten Eigenschaften nach der Vorschrift von
obigem Beispiel 2 abgetrennt werden, indem man sie an Agarosej welche IgG gebunden enthält, bindet und dann
Trennung vornimmt. - ■
Die so erhaltenen Polypeptide können zur Markierung verwendet
"werden, beispielsweise .mit fluoreszierenden Gruppen oder
radioaktiven Atomen oder Molekülen. Ähnlich wie das Protein A können die Polypeptidprodukte markiert werden, beispielsweise
unter Verwendung der bekannten Methode mit I1Iu ores zein-Isothiocyanat.
Das mit J?luoreszein-Isothiocyanat markierte Produkt kann zur Markierung von Immunoglobulin aus der IgG-Klasse
eingesetzt werden. Dieses kann im erfindungsgemäßen.
Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung·
409883/103 7
eines Immunoglobulins oder Antigens oder Haptens, welch.es
an den Fab-l'eil des Immunoglobulins gebunden ist oder
daran gebunden werden kann, benutzt werden.
Die Markierung mit ffluoreszeinisothiocyanat erfolgt z.B.
in folgender Weise: 1o mg des Polypeptidprodukts werden in 1 ml o,25-molarer wässriger ITatriumcarbonat/ifatriuinbicarbonat-Pufferlösung
vom pH 9 gelöst, wobei die Lösung noch o, 4-5°/° Natriumchlorid enthält. Hierzu werden 1 mg JPluoreszeinisothiocyanat
zugegeben^ worauf das Gemisch einige Minuten
bewegt und dann 12 Stunden bei 4° C stehen gelassen wird. Dann wird das Gemisch, zentrifugiert. Zum Heinigen der Lösung
mit dem markierten Polypeptid von nichtjumgesetztem Fluoreszein-isothiocyanat
wird das Gemisch einer Gelfiltration unterworfen, wobei die zur Verwendung kommende Säule mit Gelteilchen
aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran ("Sephadex
G 25" eingetragenes Warenzeichen) gefüllt ist, welche in o, 9^iger wässriger ETatriumchloridlösung gequollen wurden;
die Eluierung erfolgt mit der gleichen Lösung. Der pH-Wert
der Eluatfraktionen mit markiertem Polypeptid wird auf 7 eingestellt, die Lösung wird in gef-rorenem Zustand gelagert
und das Produkt kann gefriergetrocknet werden. Im UV-Licht
fluoresziert dieses Produkt. Eine analoge Markierung kann auch beispielsweise mit fetramethylrhodamin-isothiocyanat
durchgeführt werden. Das markierte Polypeptid kann sich
mit dem Fc-Ieil der IgG-Jkolekiile yerbindengund im erfindungsgemäßen
Verfahren eingesetzt werden. Dies läßt sich demonstrieren, indem man beispielsweise Zellen, aus welchen sich
Antikörper der IgG-Klasse immunochemisch an Zelloberflächen-Anfcigene
gebunden befinden, mit einer Lösung von mit Fluoreszein-isothiocyanat markiertem Protein A in Phosphatpuffer
bei pH 7,2 behandelt. ETach dem Waschen der Zellen mit
dem gleichen Puffer kann die Fluoreszenz des markierten
Proteins A, welches an das antigen-gebundene IgG auf der Zelloberfläche gebunden ist, festgestellt und gemessen werden.
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Feststellung des antigen-gebundenen Immunoglobulins aus
der IgG--Klasse mithilfe von markiertem Protein A
In diesem Test wurde mit Jod 125 markiertes Protein A
gemäß Beispiel 1 zur Ermittlung von Kaninehen-IgG-Antikörpern
gegen menschliches IgE verwendet. Die IgG-AntikÖrper waren immunochemisch mittels ihrer jPab-Teile an menschliches
IgE (das Antigen) gebunden, das seinerseits mit Bromcyan
kovalent an kleine Teilchen aus in alkalischer Lösung mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran ("iSephadex G 25", eingetragenes
Warenzeichen, ultrafein) gebunden war.
Während des Tests wurden o,o5 mg dieser Teilchen mit gebundenem
IgE in 1 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert, Die lösung wurde dann 3 Stunden mit 1oo/ul physiologischer
Kochsalzlösung, welche 75 Nanogramm Kaninchen-Anti-IgE-Antikörper
enthielt, imkubiert. Danach wurden die Teilchen 3 χ mit ge 2,5 ml physiologischer Kochsalzlösung unter
Verwendung einer Zentrifuge gewaschen."
Sodann wurden looyul physiologische Kochsalzlösung mit
2 Nanogramm mit Jod 125 markiertem Protein A zugesetzt und
das Gemisch wurde 18 Stunden inkubiert, dann 5 χ mit je
2,5 ml physiologischer Kochsalzlösung unter Verwendung einer Zentrifuge gewaschen. Dann wurde die ^-Strahlung
der Teilchen mit einem Wallac-Jf-Zähler gemessen. Man erhielt
etwa 25 obο Zählungen pro 5 Minuten im Vergleich
zur Blindprobe, woraus hervorgeht, daß auf den Teilchen an das Antigen (IgE) gebundene IgG-Antikörper vorhanden
waren. -
409883/1037
-Feststellung von IgE (Antigen) mithilfe von markiertem
Protein A, welches an Antikörper gegen IgE gebunden ist.
Mit Jod 125 markiertes Protein A (siehe Beispiel 1), welches an den Fc-Teil von Antikörpern (der IgG--Klasse)
gegen IgE gebunden war, wurde für den Test verwendet. Das Reagens wurde erhalten, indem 4o Nanogramm mit Jod 125
markiertes Protein A und 1oo Nanogramm Kaninchen-Anti-IgE
in 2 ml physiologischer Kochsalzlösung 2 Stunden inkubiert wurden, (Überschuß an markiertem Protein A).
o,o5 mg "Sephadex G--25" (durch Epichlorhydrin vernetztes
Dextran, ultrafein) an welches menschliches IgE (Antigen) mit Bromeyan gebunden worden war, wurden in 1 ml physiologischer
Kochsalzlösung suspendiert. Dann wurden 1oo/ul der obigen Reagenslösung zugesetzt. Nach 13 Stunden wurden
die Teilchen unter Zentrifugieren 5 x mit je 2,5 ml
physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Danach wurde die ^"-Strahlung ( ^"-Zähler von Wallac) gemessen. Man erhielt
4o ooo Zählungen pro 2 Minuten im Vergleich zum Blindversuch, woraus hervorgeht, daß sich IgE (Antigen) auf den
Teilchen befand.
Peroxydase wurde an Protein A aus Ü- aureus (siehe Beispiel 1)
in folgender Weise gekuppelt: 15 mg Peroxydase (aus Meerettich, Hersteller Sigma) wurden in o,2 ml einer 1,25/oigen Lösung
von üiutaraldehyd in o,1-molarer wässriger Natriumphosphatlösung
vom pH 6,8 gelöst. Die Lösung wurde bei 2o°U 18 cJtd.
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stehen gelaasen und dann durch'eine Säule (Länge 5o cm,
Durchmesser 1 cm)rgeleitet, welche mit gequollenen Teilchen
aus mit Ep ic hl or hy drin vernetztem Dextran (Sephadex G--25,
eingetragenes Warenzeichen, Hersteller Pharmacia ifine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) und o,1-molarer wässriger
Natriumphosphatlösung vom pH-6,8 gefüllt war. Zum Eluieren
der Säule wurde die gleiche Phosphatpufferlösung verwendet. Die im Hohlraumvalumen eluierten gefärbten Fraktionen
wurden bei dieser Gelehromatographie gewonnen. Die aufgefangenen
gefärbten -Fraktionen wurden durch Ultrafiltration
(PM-io-ffiembran, hält Proteine vom Molekulargewicht oberhalb
1o ooo zurück)"auf 1 ml eingeengt. Zu der mit Glutaraldehyd
aktivierten Peroxydaselösung (1 ml) v/erden 5 mg Protein A in 1 ml des obigen Phosphatpuffers gelöst, zugegeben.
Dann erfolgt Zusatz von o,2 ml einer wässrigen 1-molaren Natriümearbonat/Jüatriumbicarbonat-Pufferlösung vom pH 9,5,
dann -wird das Geniisch 24 Stunden bei 4°C stehen gelassen.
Sodann werden o,2 ml einer o,2-molaren wässrigen Lysinlösung zugegeben (der pH-Wert der Lysinlösung war mit 5-molarer
wässriger Natriumhydroxydlösung auf 7,ο eingestellt y/orden).
Nach dem Lysinzusatz wird das Gemisch 2 Stunden bei 2o°C
stehen gelassen, dann wird die Lösung durch eine Säule von Io cm: Länge und 1 cm Durchmesser geleitet, die mit gequollenen
IgG-Agarose-Teilchen und q,1-molarer wässriger
Natriumphosphatlösung vom pH 6,8 gefüllt ist (Herstellung
der IgG-Agarose analogder Vorschrift von Beispiel 1).
Das mit Peroxydase gekuppelte Protein A haftet an der IgG
auf den Ägaroseteilchen. Durch die 'Säule wird o,1-molare
Natriumphosphatlösung vom pH 6,8 geleitet, die nicht gebundene Substanzen auswäscht. Dann wird die Säule mit einem
wässrigen o,1-molaren Glycin/HCl-Puffer vom pH 3,ο eluiert.
Die gefärbten Fraktionen werden aufgefangen und vereinigt. Die Lösung wird mit 5-molarer wässriger Natriumhydroxydlösung
neutralisiert und dann durch Ultrafiltration (UM-2-Membran,
hält Substanzen vom Molekulargewicht oberhalb
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ca. 2ooo zurück) auf 1 ml eingeengt. Die Lösung wird dann 12 Stunden gegen einen Puffer vom pH 7}2 dialysiert
(Herstellung des Puffers aus 8, ο g ITaCl,- o,2 g KOl, 1,15 g Na2HPO und o,2 g KHpPO. pro liter Lösung in Wasser).
Die Lösung des mit Peroxydase markierten Protein A kann durch Filtration durch einen Milliporenfilter sterilisiert
werden, sie wird zweckmäßig bei 4 C gelagert.
Protein A, an welches Peroxydase gebunden ist, kann im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, wobei die
Peroxydase-Aktivität in konventioneller Weise bestimmt wird. ITach dem Verfahren von Beispiel 2 kann man zeigen,
daß das an Peroxydase gebundene Pratein A gegen ein Antigen gerichtete IgG-Antikörper bindet, die immunochemisch an
auf Zellflächen befindliche . Antigene gebunden sind, wobei in diesem Fall die Peroxydase zu ermitteln ist. Auf diese
Weise läßt sich das durch Antigen gebundene Immunoglobulin IgG- feststellen, während das an das IgG- gebundene Antigen
ebenfalls durch einfache enzymchemische Bestimmung festgestellt werden kann.
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Claims (2)
- Pa t e η t a n s ρ r ii c b. e.1 .Yverfahren zur qualitativen oder quantitativen Feststellung von Immunoglobulin, dessen Fab-'Xeil an ein Antigen oder ein Hapten gebunden ist oder daran gebunden werden kann, oder zur Bestimmung des Antigens oder Haptens, welches an den Fab-Teil des Immunoglobulins gebunden ist oder daran gebunden werden kann, wobei das Immunoglobulin vor oder nach der Bindung an das Antigen oder Hapten mit ein oder mehreren analytisch feststellbaren Atomen oder Gruppen markiert wird durch Kontakt mit einem mit den analytisch feststellbaren Atomen oder Gruppen markierten Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß das Immunoglobulin der IgG-Klasse angehört und das Polypeptid aus einem Mikroorganismus stammt und zur Bindung an den Fc-Teil des genannten Immunoglobulins der IgG-Klasse befähigt ist.
- 2. Mittel zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 1, zur Markierung von Immunoglobulin in freier oder gebundener ii'orm mit ein oder mehreren analytisch feststellbaren Atomen oder Gruppen, bestehend aus oder enthaltend ein mit dem analytisch feststellbaren Atom oder der Gruppe markierten Polypeptid, welches aus Mikroorganismen stammt und zur Bindung des I*c-Teils des Immunoglobulins der IgG-Klasse befähigt ist.3» Mittel zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 1, zur quantitativen oder qualitativen Feststellung von Antigenenortoder Hapten in freier oder gebundener Form, bestehend aus oder enthaltend ein Reaktionsprodukt aus einem mit ein oder mehreren analytisch feststellbaren Atomen oder Gruppen markierten Polypeptid und einem Immunoglobulin, wobei das Polypeptid aus Mikroorganismen stammt und zur Bindung des i-c:-Teils des Immunoglobulins der IgG-Klasse befähigt ist409883/1037derart, dau der antikörper-aktive i^ab-Seil des Immunoglobulins ein Antigen oder Hapten binden kann.Jb1Ur: Pharmacia Aktiebolag, Uppsala, üchv/edenR.H.J. Wolff( Rechtsanwalt )3/1037
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