DE1798170B1 - Verfahren zur bestimmung der anwesenheit von gegen bestimmte allergene gerichteten reagin-immunoglobulinen (reagin-ig) in waessrigen proben - Google Patents

Verfahren zur bestimmung der anwesenheit von gegen bestimmte allergene gerichteten reagin-immunoglobulinen (reagin-ig) in waessrigen proben

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Description

Es ist bekannt, daß eine bestimmte Zahl von immunogenen Substanzen, sogenannte Allergene, von denen viele die Natur eines Proteins, Peptids oder Kohlehydrats aufweisen, allergische Reaktionen, wie beispielsweise Asthma oder Heuschnupfen, hervoraktiven Isotop, insbesondere Jod125, markiert sind. 35 rufen können. (Solche Allergene sind weit verbreitet 4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch und können beispielsweise aus tierischen Schuppen,
Pflanzenpollen, Mikroorganismen, einigen Parasiten usw. gewonnen werden.) In Verbindung damit zeigt sich — in der Regel in sehr niedrigen Konzentrationen — beispielsweise im Blut des Patienten ein
gekennzeichnet, daß das Reagin-Ig oder die Antikörper gegen das Reagin-Ig mit einer fluoreszierenden Gruppe markiert sind.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, da- 4c durch gekennzeichnet, daß das Testallergen aus einer Mischung von 2 oder mehr Allergenen besteht.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, da-
bestimmter Typ von Antikörpern, sogenannte Reagine, welche Immunoglobuline darstellen und welche spezifisch gegen das Allergen oder die Allergene gerichtet sind; die Antikörper können im Blutserum gezeigt
durch gekennzeichnet, daß die Bestimmung der 45 werden. Diese speziellen Immunoglobuline werden
Anwesenheit von Reagin-Ig quantitativ erfolgt.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung zwischen dem Testallergen und dem Polymer kovalenten Charakter aufweist.
8. Hilfsmittel zur Bestimmung von gegen bestimmte Allergene gerichteten Reagin-Immunoglobulinen (Reagin-Ig) in wäßrigen Testproben nach dem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 im folgenden als Reagin-Immunoglobuline oder Reagin-Ig bezeichnet.
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von gegen bestimmte Allergene gerichteten Reagin-Ig in wäßrigen Proben. Es ist besonders wichtig, die Anwesenheit von Reagin-Ig in Verbindung mit der Diagnose der Hypersensitivität von Tieren und Menschen festzustellen.
Bisher hat man für die Bestimmung Hauttests ver-
bis 7, gekennzeichnet durch ein erstes Reagenz, 55 wendet, bei welchen ein Testallergen beispielsweise mit
welches aus einem wasserunlöslichen Polymer, an welches ein Testallergen gebunden ist, besteht, ein zweites Reagenz, welches aus Antikörpern gegen Reagin-Ig besteht und gegebenenfalls ein drittes Reagenz, welches aus Reagin-Ig besteht, wobei — wenn das dritte Reagenz nicht anwesend ist — die Antikörper des zweiten Reagenzes, im anderen Falle das Reagin-Ig des dritten Reagenzes durch Markierung zur Aussendung einer Strahlung befähigt sind.
9. Hilfsmittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das unlösliche Polymer in Teilchenform vorliegt.
Hilfe einer Spritze auf die Haut des Patienten gebracht wurde; ist der Patient überempfindlich bzw. hypersensibel (allergisch), so findet in vivo eine Reaktion statt zwischen dem Allergen und den Antikörpern, die gegen das fragliche Allergen gerichtet sind. Durch diese Reaktion treten bestimmte Symptone, z. B. eine Rötung oder Schwellung der Haut, an der die Injektion gemacht wurde, auf, aus denen auf das Ausmaß der Reaktion geschlossen werden kann.
In-vivo-Tests sind auch sogenannte Provokationstests, bei welchen der Patient ein Allergen in Form eines Aerosols inhaliert. Ist der Patient gegen das Allergen hypersensibel, so beobachtet man eine Re-
ORIGINAL INSPECTED
aktion, die sich beispielsweise in Asthmasymptomen äußern kann. Die beiden vorstehend erwähnten Tests sind zeitraubend und, in bestimmten Fällen, unangenehm und gefährlich für den Patienten. In einer Zahl von Fällen können keine Tests durchgeführt werden. Außerdem muß eine Vielzahl von In-vivo-Tests durchgeführt werden, damit eine sichere Diagnose gestellt werden kann, ob ein Patient gegen ein bestimmtes Allergen bzw. gegen bestimmte Allergene hypersensibel ist.
Die bisher zur Verfügung stehenden In-vitro-Methoden haben keine praktische Bedeutung.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine einfache und verläßtliche In-vitro-Methode zu schaffen, die ohne Unannehmlichkeiten oder Risiko für den Patienten durchgeführt werden kann, so daß die vorstehend erwähnten Nachteile ausgeschaltet werden.
Die Erfindung ist im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe, z. B. eine Körperflüssigkeit, wie Blutserum oder Blutplasma, in vitro mit einem wasserunlöslichen Polymer, an welches ein Testallergen gebunden worden ist, zusammenbringt, so daß eine Reaktion zwischen dem Testallergen an dem Polymer und dem entgegenwirkenden Reagin-Ig stattfindet und das Reagin an das an dem unlöslichen Polymer befindliche Testallergen gebunden wird, worauf man das Polymer mit dem Testallergen und dem Reagin-Ig entweder mit Antikörpern gegen das Reagin-Ig, die mit einem radioaktiven Atom bzw. einer radioaktiven Gruppe markiert worden sind, oder mit Antikörpern gegen das Reagin-Ig und Reagin-Ig, welches mit einem radioaktiven Atom oder einer radioaktiven Gruppe markiert worden ist, zusammenbringt, anschließend das unlösliche Polymer mit den daran befindlichen Substanzen aus der Flüssigkeit abtrennt und schließlich die Strahlung, die von dem unlöslichen Polymer mit den daran befindlichen Substanzen ausgestrahlt wird, oder die Strahlung, die von der abgetrennten Flüssigkeit ausgestrahlt wird, mißt oder die Wirkung derselben untersucht.
Ist in der Probe ein Reagin-Ig vorhanden, welches gegen das Allergen gerichtet ist, so wird markiertes Reagenz an die unlösliche Phase gebunden, die anschließend eine Strahlung emittieren wird. Die leztere erhöht sich, wenn die Konzentration an Reagin-Ig in der Testprobe zunimmt. Die Strahlung der flüssigen Phase wird im Gegensatz dazu bei sich erhöhender Konzentration an Reagin-Ig abnehmen, weil mehr markiertes Reagenz an die unlösliche Phase gebunden wird. Die gemessenen Strahlungswerte, die bei dieser Methode für die Testprobe erhalten werden, können mit den Werten von Kontrollproben verglichen werden.
Wasserunlösliche Polymere werden als Trägermaterialien für die Testallergene verwendet. Sie können beispielsweise in Form von Teilchen mit verschiedener Gestalt und Größe vorliegen. Die Polymere können beispielsweise auch die Form von flachen Gegenständen wie Scheiben oder Streifen aufweisen oder in Form von Rohrwänden, z. B. in Form einer Innenauskleidung eines Reagenzrohres vorliegen. Die Bindung zwischen dem Polymer und dem Testallergen sollte derart sein, daß bei normalen Waschvorgängen das Testallergen sich nicht von dem Polymer ablöst. Damit dies erreicht wird, kann das Testallergen chemisch oder gegebenenfalls auch physikalisch gebunden sein. Bei einer geeigneten Form einer chemischen Bindung liegen zwischen dem Polymer und dem Testallergen Brücken mit kovalentem Charakter vor. Um diese Art der Bindung zu erreichen, wird das Polymer so ausgewählt, daß es entweder geeignete reaktive Gruppen, z. B. Aminogruppen, Hydroxylgruppen oder Carboxylgruppen, enthält oder aber mit solchen Gruppen versehen werden kann, die es erlauben, daß das Testallergen leicht an das Polymer gebunden werden kann. Die Bindungsart, bei der zwischen dem Polymer und dem Allergen chemische Bindungen in Form von Brücken mit kovalentem Charakter vorliegen, wird bevorzugt.
Es ist besonders günstig, Polymere auszuwählen, die eine dreidimensionale Netzstruktur aufweisen, die durch Bindungen kovalenten Charakters zusammengehalten wird. Solche Polymere sind, obwohl quellbar in Wasser oder wäßrigen Medien, vollständig unlöslich, so daß nichts von dem polymeren Material oder den Substanzen, die daran gebunden sind, während anschließender Waschverfahren abgegeben werden kann. Beispiele für solche Polymere sind Mischpolymerisate, die man durch Vernetzen von Substanzen mit einer größeren Anzahl von Hydroxylgruppen, wie Kohlehydrate und Zuckeralkohole, z. B. Dextran, Stärke, Dextrine oder andere Polysaccharide sowie Vinylalkohol mit einer bifunktionellen Substanz, beispielsweise einer bifunktionellen Substanz vom Typ X—R—Z erhält, wobei im letztgenannten Fall X und Z Halogen oder Epoxygruppen und R den Rest der bifunktionellen Substanz, z. B. einen aliphatischen Rest mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet.
Für die Zwecke der Erfindung kann beispielsweise ein durch Glyzerin-Ätherbrücken vernetztes Dextran, welches durch Behandlung von Dextran mit Epichlorhydrin gewonnen wird, verwendet werden. Das Produkt kann beispielsweise in Form kleiner Körner verwendet werden. Dieses und in ähnlicher Weise gewonnene Produkte sind in Wasser quellbar, jedoch unlösliche Gele, und können in Teilchenform hergestellt werden. Sie enthalten Hydroxylgruppen, so daß sie leicht mit anderen Gruppen substituiert werden können, z. B. mit Gruppen, die Aminogruppen oder Carboxylgruppen enthalten; diese Gruppen können leicht Brücken in Form von Bindungen kovalenten Charakters zu den Testallergen bilden.
Das Polymer wird vorzugsweise in einer solchen Form verwendet, daß eine große Oberfläche für die Berührung zur Verfugung steht, z. B. in Form von kleinen Teilchen.
Das Testallergen wird an das Trägerpolymer unter milden Bedingungen gebunden, damit die immunochemische Reaktivität des Allergens nicht nennenswert beeinträchtigt wird.
Zur chemischen Bindung des Allergens an das Polymer werden reaktive Gruppen, wie Aminogruppen, Hydroxylgruppen, Mercaptogruppen, Amidogruppen und Carboxylgruppen, verwendet, wobei eine Brücke in Form einer chemischen Bindung mit vorzugsweise kovalentem Charakter zwischen dem Testallergen und dem Polymer gebildet wird, und zwar folgender Art:
Allergen—NH-CS- NH-Polymer
Allergen—NH—CO—NH-Polymer
Allergen—N=N—Polymer
Allergen—O—CO—Polymer Allergen—NH-CO—Polymer Allergen—CO—NH-Polymer Allergen -NH—C—O—Polymer
Allergen—NH—C—NH-Polymer
NH
Die Brücke zwischen dem Allergen und dem Polymer braucht ihrer Struktur nach nicht bekannt zu sein und kann verschiedenen Charakter haben; die Brücke muß nur dem Zweck entsprechen, daß das Allergen von dem unlöslichen Polymer nicht weggewaschen werden kann.
Das erfindungsgemäße neue Verfahren beruht auf der Beobachtung, daß Reagin-Ig sowohl an ein Allergen, gegen welches es spezifisch gerichtet ist, als auch an Antikörper, die allgemein gegen Reagin-Ig gerichtet sind, gebunden werden kann. Solche Antikörper sind wenigstens zweiwertig, d. h., sie können an wenigstens 2 Moleküle Reagin-Ig gebunden werden. Antikörper, die gegen Reagin-Ig gerichtet sind, wie auch Reagin-Ig selbst können mit Atomen oder Gruppen, die eine Strahlung hervorrufen, markiert werden, z. B. mit radioaktiven Isotopen oder fluoreszierenden Gruppen.
webe aufweisen, gewonnen werden. Reagin-Ig kann mit den verschiedenen Methoden zur Abtrennung von Proteinen gereinigt werden, z. B. durch Gelfiltration, Ionenaustauscher-Chromatographie und Elektrophorese. Ähnlich wie andere Immunoglobuline kann Reagin-Ig chemisch oder enzymatisch in ein Antigen-bindendes Fragment und ein Fragment, welches die Trägersubstanz für die klassenspezifisch bestimmenden Gruppen ist, gespalten werden.
Antikörper gegen Reagin-Ig können nach bekannten Methoden zur Immunisierung von Versuchstieren hergestellt werden, z. B. durch wiederholte subkutane Injektionen kleiner Mengen von Antigenen in Mischung mit einem geeigneten Zusatzmittel, z. B.
Freundscher Mineralölsuspension. Die Antikörper, die von dem Tier, ζ. Β. einem Kaninchen, gebildet werden, können aus dem Blutserum des Tieres gewonnen werden.
Spezifische Antikörper, das sind Antikörper, die gegen die klassenspezifischen bestimmenden Gruppen des Reagin-Ig gerichtet sind, können erhalten werden, indem man die Immunisierung mit den aus den Reagin-Ig-Molekülen abgespalteten Fragmenten, die die bestimmenden Gruppen enthalten, vornimmt oder indem man die spezifischen Antikörper aus einer Mischung von Antikörpern isoliert, die durch Immunisieren mit nativem Reagin-Ig gewonnen worden sind.
Spezifische Antikörper, die gegen Reagin-Ig gerichtet sind, können gegebenenfalls aus dem Antiserum
Im Vergleich zu bekannten Methoden zur Durch- 30 auch durch übliche immunosorbierende Techniken
führung von Hauttests und Provozierungstests weist das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil auf, daß die Anwesenheit und auch die Menge von Reagin-Ig, welches befähigt ist, mit einer bestimmten Art eines
Allergens oder einer bestimmten Gruppe von Aller- 35 werden.
isoliert werden; beispielsweise kann Reagin-Ig mit Bromacetylcellulose gekuppelt werden, worauf die Antikörper, die an das gekuppelte Reagin-Ig gebunden sind, durch Erniedrigung des pH-Wertes freigesetzt
genen, z. B. Tier- oder Pflanzenallergenen, zu reagieren, in vitro in einer Blutprobe des Patienten bestimmt werden kann, und zwar mit Hilfe einer sehr empfindlichen und einfachen Methode, die für den Patienten vollkommen sicher ist. Es ist wesentlich für das Verfahren, daß das Testallergen, gegen welches das zu bestimmende Reagin-Ig gerichtet ist, sehr fest an das wasserunlösliche Trägermaterial gebunden ist. Das Reagin-Ig, welches mit dem Allergen reagiert hat, kann dann leicht von den nicht-Allergen-gebundenen Immunoglobulinen abgetrennt werden. Während der weiteren Stufe des Verfahrens lassen sich die Antikörper und das Reagin-Ig, die nicht an das Polymer gebunden worden sind, außerdem sehr leicht von denen abtrennen, die an das Polymer gebunden worden sind.
Das Polymer mit den daran befindlichen Substanzen kann sehr leicht von der Flüssigkeit abgetrennt werden. Die Abtrennung ist unempfindlich gegen Ver-Es ist in einigen Fällen vorteilhaft, spezifische Antikörper gegen die klassenspezifischen bestimmenden Gruppen in dem Reagin-Ig zu verwenden, damit eine besonders hohe Sicherheit und Genauigkeit während der Versuche erreicht werden.
Die Markierung von Reagin-Ig und Antikörpern gegen Reagin-Ig mit radioaktiven Isotopen kann in üblicher Weise vorgenommen werden, wobei ein für diese Zwecke geeignetes Isotop z. B. aus 12M besteht (Methode nach H u η t e r und Greenwood). Auch die Markierung mit einer fluoreszierenden Gruppe kann in üblicher Weise durchgeführt werden, z. B. mit einem Fluoreszeinderivat, wie Fluoreszeinisothiocyanat.
Allergenhaltige Extrakte, z. B. von Hunde- oder Pferdeepithel, Timothy-Gras- oder Birkenpollen, sind im Handel erhältlich.
Die Bestimmung der Radioaktivität kann in üblicher Weise durchgeführt werden, z. B. mit Hilfe von
änderungen des Salz- und Proteingehaltes der Flüssig- 55 Leuchtdetektoren. Auch die Fluoreszens kann in üb-
keit innerhalb der physiologischen Grenzen. Das vollständige Bestimmungsverfahren einschließlich der Abtrennung der freien, markierten Antikörper und des Reagin-Ig bzw. der Polymer-gebundenen markierten licher Weise gemessen werden.
Die Menge an Polymer, an welches Allergen gebunden ist, wird unter anderem im Hinblick auf die Empfindlichkeit, die während des Tests erforderlich
Antikörper und des Reagin-Ig kann beispielsweise in 60 ist, ausgewählt. Die Menge an Antikörpern gegen das
demselben Reagenzrohr ohne Zugabe von Fällungsmitteln u. ä. durchgeführt werden.
Für das erfindungsgemäße Verfahren werden isoliertes Reagin-Ig sowie dagegenwirkende Antikörper benötigt.
Reagin-Ig kann aus dem Serum allergischer Patienten sowie in seltenen Fällen aus dem Serum von Patienten, die Reagin-Ig-bildende Tumoren im Ge-Reagin-Ig, das der Reaktion zugesetzt wird, wird beispielsweise so ausgewählt, daß ein Überschuß im Hinblick auf die Zahl der Haftstellen für diese Antikörper an den an die Polymeren gebundenen Substanzen vorhanden ist, nachdem die Allergene vollständig mit Reagin-Ig gesättigt worden sind. In entsprechender Weise wird die Menge an markierten Antikörpern mit markiertem Reagin-Ig so ausge-
wählt, daß ein Überschuß mit Bezug auf die maximale Zahl der Haftstellen an den an das Polymer gebundenen Substanzen vorhanden ist.
Erfindungsgemäß kann das Testallergen ein einzelnes Allergen oder eine Mischung aus zwei oder mehr Allergenen sein. Im letzteren Fall bringt das Verfahren den Vorteil mit sich, daß während der Untersuchung ein schnelles »ja« oder »nein« auf die Frage möglich ist, ob eine Uberempfindlichkeit gegen ein oder mehrere Allergene in einer großen Gruppe von Allergenen existiert. Ist die Antwort »ja«, so müssen weitere Bestimmungen durchgeführt werden, um festzustellen, gegen welche Allergene die Uberempfindlichkeit des Patienten in der großen Gruppe gerichtet ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zur quantitativen Bestimmung von Reagin-Ig dienen. Für diesen Zweck wird eine serielle Verdünnung des Testserums analysiert; das Ergebnis ergibt sich durch Vergleich mit der Wirkung einer Standardlösung, die in analoger Weise analysiert worden ist.
Zum Gegenstand der Erfindung gehören auch die Mittel zur Bestimmung von gegen bestimmte Allergene gerichteten Reagin-Immunoglobulinen (Reagin-Ig) in wäßrigen Testproben. Diese Hilfsmittel umfassen ein erstes Reagenz, welches aus einem wasserunlöslichen Polymer, an welches ein Testallergen gebunden ist, besteht, ein zweites Reagenz, welches aus Antikörpern gegen Reagin-Ig besteht und gegebenenfalls ein drittes Reagenz, welches aus Reagin-Ig besteht, wobei—wenn das dritte Reagenz nicht anwesend ist — die Antikörper gegen das Reagin-Ig durch Markierung zur Aussendung einer Strahlung befähigt sind oder das Reagin-Ig des dritten Reagenzes durch Markierung zur Aussendung einer Strahlung befähigt ist, wobei weiterhin das erste Reagenz dazu dient, in vitro aus einer Reagin-Ig enthaltenden wäßrigen Testprobe das Reagin-Ig an das an das unlösliche Polymer gebundene Testallergen zu binden und das zweite Reagenz, gegebenenfalls zusammen mit dem dritten Reagenz, zur Umsetzung mit dem unlöslichen Polymer und dem daran gebundenen Testallergen und Reagin-Ig dient, so daß sich eine Mischung ergibt, die aus einem strahlenden unlöslichen Material besteht, welches aus dem unlöslichen Polymer mit den daran gebundenen Substanzen und einer strahlenden flüssigen Phase besteht, wobei sowohl die Strahlung des unlöslichen Materials als auch die Strahlung der flüssigen Phase eine Funktion der Konzentration des Reagin-Ig, welches gegen das Testallergen in der Testprobe gerichtet ist, darstellt.
Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt das unlösliche Polymer in Teilchenform vor.
Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahrens benötigten Hilfsmittel können in einer Testpackung enthalten sein, die zur Untersuchung von Proben, die allergischen Patienten entnommen worden sind, dient.
Erfindungsgemäß können die benötigten Hilfsmittel aus einer Ampulle od. ä., die die Antikörper gegen das Reagin-Ig (vorzugsweise) in getrockneter, z. B. lyophilisilierter Form enthält, sowie gegebenenfalls einer Ampulle, welche markiertes Reagin-Ig, vorzugsweise in getrockneter, z. B. lyophilisierter Form enthält, bestehen; für den Fall, daß die letztgenannte Ampulle nicht verwendet wird, sind die Antikörper gegen das Reagin-Ig markiert.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 1
Bestimmung von Reagin-Ig, welches gegen ein Tierallergen (Hundeepithel) gerichtet ist
A. Herstellung von Teilchen mit chemisch
gebundenem Allergen
Feine Teilchen eines Mischpolymeren aus Dextran und Epichlorhydrin wurden als Ausgangsmaterial benutzt; das Dextran war mit Glycerin-Ätherbrücken vernetzt (Teilchengröße 1 bis 10 Mikron). Dieses Mischpolymerisat ist in Wasser unlöslich, aber quellbar; die Substanz absorbiert etwa 2,5 g Wasser pro Gramm trockner Substanz. Das Ausgangsmaterial wurde zunächst mit Cyanogenbromid in alkalischer Lösung aktiviert, worauf die Teilchen des aktivierten Mischpolymerisates gewaschen wurden. Ein handelsüblicher Allergenextrakt von Hundeepithel wurde zu der wäßrigen Suspension der Teilchen gegeben, so daß der Extrakt 0,2 mg pro Millimliter im Verhältnis von 1 ml Allergenextrakt auf 100 mg aktiviertes Polymer enthielt. Das Allergen wurde dann chemisch an das aktivierte Mischpolymerisat gebunden. Im Anschluß an die Umsetzung wurden die Mischpolymerteilchen mit dem daran gebundenen Allergen abzentrifugiert und zweimal mit 0,5 m NaHCO3,0,1 m Acetatpuffer und 0,1 m Trispuffer mit 1% Schweineserumalbumin gewaschen. Die Teilchen wurden homogenisiert und in 0,1 m Trispuffer mit 1% Schweineserumalbumin suspendiert.
B. Herstellung von Reagin-Ig
Reagin-Ig wurde aus dem Serum gewonnen, welches einem Myeloma-Patienten entnommen worden war, dessen Blut einen hohen Gehalt an Reagin-Ig aufwies. Reagin-Ig wurde aus dem Serum durch Salzfällung, Gelfiltration und Ionenaustauscher-Chromatographie isoliert.
Proben von aufgetautem oder frisch gesammeltem Plasma eines Patienten mit Myelomatosis wurden mit 0,15 m Natriumchlorid verdünnt, so daß sich ein Gehalt von etwa 15 mg/ml mit Bezug auf die M-Komponente (Reagin-Ig) ergab. Die Fällung mit wasserfreiem Natriumsulfat (18 g/100 ml) wurde bei 25° C durchgeführt. Nach einer Stunde wurde der Niederschlag abzentrifugiert (10000 χ g, 20 Minuten, 25°C). Das Sediment wurde abgetrennt, mit Natriumsulfatlösung (18 g/100 ml) gewaschen und in 0,8 Volumteilen einer O,lm-Natriumphosphatpufferlösung mit pH = 7,5 gelöst. Das Material wurde noch einmal wie beschrieben ausgefällt. Im Anschluß an die letzte Fällung wurde das Sediment in 0,1 m Tris-HCl-Puffer mit pH = 8,0 (2O0C) gelöst und auf eine Kolonne mit einer Größe von 3,2 χ 30 cm aus einem mit Glycerin-Ätherbrücken quervernetztem Dextran, das mit Diäthylaminoäthylgruppen substituiert ist, aufgebracht und mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht. Das Eluieren des Materials wurde mit Tris-HCl, dessen Stärke allmählich von 0,1 auf 1 m zunahm, bei konstantem pH-Wert von 8,0 bei 200C durchgeführt. Die Fraktionen, die das Reagin-Ig enthielten, wurden aufgefangen, eingeengt und auf eine Kolonne (Größe 3,2 χ 95 cm) aus einem mit Glycerin-Ätherbrücken quervernetztem Dextran mit einem Perldurchmesser von 40 bis 120 μ und einer Wasseraufnahme von etwa 15 ml Wasser pro Gramm trockener Substanz aufgebracht, die mit 0,1 m Tris-
209518/216
HCl — 0,2 m NaCl — 0,002 m EDTA Na2 — pH = 7,7 — ins Gleichgewicht gebracht worden war und 0,02% Natriumazid enthielt. Man ließ das Material die Kolonne dreimal passieren (Rücklaufchromatographiertechnik). Fraktionen, welche das Reagin-Ig enthielten, wurden aufgefangen und durch Ultrafiltration bei 4° C konzentriert (Visking-Rohre 8/32").
Das auf diese Weise hergestellte Reagin-Ig war mit weniger als 0,1% an Gesamtprotein von anderen Immunoglobulinen (IgA, IgD, IgG und IgM) verunreinigt. Das gereinigte Reagin-Ig gab bei der Elektrophorese bei pH 8,6 einen einzelnen Peak, I = 0,05, welcher im /i-y-Bereich wanderte. Untersuchungen bei der Ultrazentrifugation zeigten das Vorliegen einer einzigen Grenzschicht: die Sedimentationskonstante, S2O1M- wurde mit 8,20 S berechnet. Das Molekulargewicht des Reagin-Ig wurde mit 200000 ± 5000 berechnet, wobei man ein partielles spezifisches Volumen von 0,713 cm3/g benutzte, das auf der Basis der Aminosäure- und Kohlehydratzusammensetzung des Reagin-Ig bestimmt worden war. Die Diffusionskonstante, D20, w wurde mit 3,71 χ 10~7 cm~2/Sek. berechnet.
Reduktionsversuche zeigten, daß das Reagin-Ig aus zwei Arten von Polypeptidketten besteht, so daß es anderen Serum-Immonoglobulinen entspricht. Die Anwesenheit von zwei leichten Polypeptidketten mit einem Molekulargewicht von 22 600 konnte in dem Reagin-Ig erwiesen werden. Das Molekulargewicht der schweren Polypeptidketten, einschließlieh der prosthetischen Kohlehydratgruppe(n) wurde mit etwa 77 400 berechnet, wobei ein Molverhältnis von 1:1 für die schweren und leichten Polypeptidketten in nativem Reagin-Ig angenommen wurde. Die Aminosäure- und Kohlehydratzusammensetzung ist in der Tabelle angegeben.
Aminosäure- und Kohlehydratzusammensetzung
von Reagin-Ig
40
Kohlehydrat Kohlehydratrest,
Gramm pro 100 g
Protein
N-Acetyl-glucosamin
Hexose (Galaktose + Mannose)
L-Fucose
N-Acetyl-neuraminsäure 		4,60
5,34
0,51
1.26
11.71
Aminosäure Aminosäurerest,
Gramm pro 100 g
Protein
Tryptophan
Lysin
Histidin
Amid-N
Arginin
Asparaginsäure
Threonin
Serin
Glutaminsäure
Prolin
Glycin
Alanin
Halb-cystin
Valin
Methionin
Isoleucin
Leucin
Tyrosin
Phenylalanin 		3.67
4,20
2,16
1,34
5,63
6,73
9,01
8,52
8,93
5,24
3,13
3,92
2,15
5,59
1,17
2,29
6,08
4,63
3,91
88,29
45
55
60
C. Herstellung von Antikörpern gegen Reagin-Ig
Kaninchen wurden intramuskulär mit einer Mischung aus 0,5 mg Reagin-Ig in 0,2 ml 0,15 m Natriumchloridlösung und 0,8 ml vollständiger Freundscher Zusatzlösung injiziert. Die Immunisierung wurde nach 14 Tagen und dann jede Woche 3 Wochen lang wiederholt. Nachdem weitere 10 Tage vergangen waren, wurde den Kaninchen Blut entnommen, aus welchem das Antiserum durch Koagulieren und Entfernung des Koagulates gewonnen wurde.
Das Antiserum wurde durch Adsorption während einer Stunde bei 37;C und 16 Stunden bei 4°C spezifisch gemacht. Nach dem Abzentrifugieren wurde die Spezifität des Antiserums durch Immunoelektrophorese gegen normales Menschenserum und durch Ochterlony-Geldiffusionsanalyse gegen reine Immunoglobuline A, G und M, sogenannte leichte Polypeptidketten aus normalem Immunoglobulin G und Bence-Jones-Proteine getestet; dabei konnte die Spezifität gegen Reagin-Ig festgestellt werden. Das Antiserum wurde als Antikörpermaterial für das Bestimmungsverfahren verwendet.
D. Herstellung von markiertem Reagin-Ig
Reagin-Ig wurde mit !2dJ nach der Methode von H u η t e r und G r e e η w ο ο d, »Nature« 144 (1962), S. 495, markiert.
E. Bestimmungsverfahren
Die Analysen wurden in Glas- oder Plastikreagenzgläsern mit einer Größe von 50x 10 mm durchgeführt.
1. 0,5 ml einer Suspension aus Teilchen mit chemisch gebundenem Allergen, die gemäß A (vgl. weiter vorn) erhalten worden waren, wurden in jeweils zwei Reagenzgläser eingefüllt; die Suspension enthielt 1 mg Partikeln pro Milliliter.
2. 0,05 ml des zu untersuchenden Serums eines Patienten wurde in eines der beiden Reagenzgläser gegeben.
3. 0,05 ml Kontrollserum aus einer nicht allergischen Herkunftsstelle wurden in das zweite Reagenzglas eingefüllt.
4. Der Inhalt dieser Reagenzgläser wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Reagenzgläser langsam in senkrechter Ebene rotiert wurden.
5. Die Teilchen wurden dann bei 3000 UpM 1 Minute lang abzentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit entfernt wurde.
6. Die Teilchen wurden dreimal mit 0,1 m Trispuffer (pH 7,4), welches 1 Gewichtsprozent Schweineserumalbumin enthielt, gewaschen, worauf die Suspension wiederum abzentrifugiert wurde und die überstehende Flüssigkeit nach
jedem Waschvorgang abgesaugt wurde. Bei dem Absaugen wurde jeweils sichergestellt, daß feste Teilchen nicht mitgerissen wurden.
7. 0,1 ml des Antiserums, das gemäß C (vgl. weiter vorn) erhalten worden war, wurde in jedes Reagenzglas gegeben.
8. Der Inhalt der Reagenzgläser wurde wie bei Stufe 4 inkubiert.
9. Die Teilchen wurden wie bei Stufe 5 abzentrifugiert. ίο
10. Die Teilchen wurden wie bei Stufe 6 gewaschen.
11. 0,1 ml einer Lösung, welche125 J-Reagine gemäß D (vgl. weiter vorn) enthielt, wurde in die Reagenzgläser gegeben.
12. Die Reagenzgläser mit dem Inhalt wurden wie bei Stufe 4 inkubiert.
13. Die Teilchen wurden wie bei Stufe 5 abzentrifugiert.
14. Die Teilchen wurden wie bei Stufe 6 gewaschen.
15. Die Reagenzgläser wurden vor einen Schirmbilddetektor gesetzt, damit die Gammastrahlung gemessen werden konnte.
Zur Auswertung wurde die Intensität der Strahlung des einen Reagenzglases mit der Intensität der Strahlung des anderen Reagenzglases, welches das Kontrollserum eines nicht allergischen Patienten enthielt, verglichen. Es ist auch möglich, im Anschluß an das Zentrifugieren gemäß Stufe 13 eine bestimmte Volumenmenge der überstehenden Flüssigkeit in Zählröhrchen zu überführen, worauf die Gammastrahlung des 125J-Reagins frei in der Lösung bestimmt werden kann.
Zur quantitativen Bestimmung können 0,05 ml Testserum in verschiedenen Stadien der Verdünnung in Stufe 2 jedem einer Reihe von Reagenzgläsern zugesetzt werden. Eine Reihe von Reagenzgläsern wurde in derselben Weise mit unterschiedlichen Verdünnungen eines Standardserums versetzt. Die Aktivität kann dann im Vergleich zu der des Standardserums ausgedrückt werden.
45
Beispiel 2
Bestimmung von Reagin-Ig, welches gegen ein
Pflanzenallergen (Birkenpollen) gerichtet ist
A. Herstellung von Teilchen mit chemisch
gebundenem Allergen
Feine Teilchen eines mit Glycerin-Ätherbrücken vernetzten Dextrans, welches nach der Methode von R. A χ e η und J. P ο r a t h, Acta Chem. Scand., 18 (1964), S. 2193, mit Isothiocyanatophenoxyhydroxypropylgruppen substituiert war, wurden als Ausgangsmaterial verwendet. Zu einer Suspension von 100 mg dieser Teilchen in einer wäßrigen Natriumbicarbonatlösung gab man 100 ml eines handelsüblichen Allergenextraktes, der etwa dieselbe Konzentration aufwies wie die Allergenlösung im Beispiel 1. Die Mischung wurde 3 Tage bei Raumtemperatur inkubiert und dabei langsam in vertikaler Ebene rotiert. Die Teilchen wurden dann zentrifugiert und zweimal mit je 0,5 m NaHCO3, 0,1 m Acetatpuffer, 0,1 m Trispuffer mit 1% Schweineserumalbumin gewaschen. Die Teilchen wurden homogenisiert und in 0,1 m Trispuffer mit 1% Schweineserumalbumin suspendiert.
B. Isolierung von Fragmenten des Reagin-Ig, welche klassenspezifische bestimmende Gruppen enthalten
(sogenannte Fc-Fragmente)
100 mg Reagin-Ig, welches gemäß Beispiel 1 B hergestellt worden war, in 0,1 m Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) mit 0,1 m Cystein wurden bei 37° C 4 Stunden mit 1 mg Papain inkubiert, worauf die Reaktion durch Zugabe von Jodacetamidlösung bis zu einer Endkonzentration von 0,05 m unterbrochen wurde. Das Reaktionsgemisch wurde durch Gelfiltration fraktioniert, wobei ein Mischpolymerisat aus Dextran und Epichlorhydrin verwendet wurde; die Wasserrückgewinnung lag bei 15 g pro Gramm feste Substanz, und die Eluierung des Gelbettes wurde mit 0,1m Tris-HCl, 0,2 m NaCl-Puffer (pH 7,7) durchgeführt. Die Fraktionen, welche das Fc-Fragment enthielten, wurden für Immunisierungszwecke aufgefangen.
C. Herstellung von Antikörpern gegen das
Fc-Fragment des Reagin-Ig
Antiserum gegen das wie vorstehend angegeben gemäß B gewonnene Fc-Fragment des Reagin-Ig wurde in einer der Gewinnung von Antiserum gegen Reagin-Ig gemäß Beispiel 1 C entsprechenden Weise gewonnen. Antikörper gegen das Fc-Fragment wurden aus diesem Antiserum isoliert, welches in einer der Arbeitsweise von Beispiel 1 C entsprechenden Weise wie folgt absorbiert worden war: 2 g eines Komplexes aus Bromacetylcellulose und Reagin-Ig wurden mit 34 ml einer Lösung vermischt, die etwa 95 mg Immunoglobulin enthielt, die aus dem Antiserum durch Ionenaustauscherchromatographie isoliert worden war. Die gewonnene Suspension wurde bei pH 7 und 4° C 2 Stunden aktiviert und anschließend mit 20 000 xg 20 Minuten bei 10° C zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt, die Cellulose wurde mit 0,15 m NaCl — 8m Harnstoff (pH 6 bis 7) gewaschen, anschließend wurde wieder zentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit entfernt wurde. Dieses Waschverfahren wurde so lange wiederholt, bis die überstehende Flüssigkeit frei von Protein war. Der Cellulose-Protein-Komplex wurde zu 9 ml 0,1 m Glycin-HCl-Puffer (pH 3,1) gegeben und unter Rühren bei 37°C 40 Minuten inkubiert. Die ganze Lösung wurde dann zentrifugiert; die überstehende Flüssigkeit wurde gegen 1200 ml 0,01m Tris-HCl, 0,1m NaCl (pH 7,1) bei 4°C 48 Stunden dialysiert. Diese Lösung enthielt Antikörper in einer Menge von ungefähr 1 mg pro Milliliter, die gegen das Fc-Fragment des Reagin-Ig und damit also auch für das gesamte Reagin-Ig spezifisch sind. Dieses Antikörpermaterial reicht zur Durchführung von mehr als 10 Millionen Bestimmungen aus.
D. Markierung von Antikörpern, die gegen das Fc-Fragment des Reagin-Ig spezifisch sind
Die Markierung wurde in entsprechender Weise durchgeführt, wie dies im Beispiel 1 für das Reagin-Ig beschrieben ist.
E. Bestimmungsverfahren
1. 0,5 ml einer Suspension gab man in jedes von zwei Reagenzgläsern. Die Suspension enthielt Teilchen mit chemisch gebundenen Pflanzen-
allergenen und war wie vorstehend unter A beschrieben hergestellt worden; die Suspension enthielt 1 mg Teilchen pro Milliliter.
2. 0,05 ml des zu untersuchenden Serums eines Patienten wurde in eines der Reagenzgläser gegeben.
3. 0,05 ml eines Kontrollserums, welches von einem nicht allergischen Patienten genommen worden war, wurde in das andere Reagenzglas eingeführt.
4. Die Reagenzgläser mit dem Inhalt wurden 5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Reagenzgläser langsam in senkrechter Ebene rotiert wurden.
5. Die Teilchen wurden 1 Minute bei 3000 UpM abzentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit entfernt wurde.
6. Die Teilchen wurden dreimal mit 0,1 m Tris-Puffer (pH 7,4) mit 1% Schweineserumalbumin gewaschen. Die überstehende Flüssigkeit wurde nach jedem Zentrifugieren abgesaugt. Dabei wurde sichergestellt, daß beim Entfernen der überstehenden Flüssigkeit keine festen Teilchen mitgerissen wurden.
7. 0,1 ml der wie vorstehend unter C erhaltenen Lösung mit Antikörpern gegen das Fc-Fragment des Reagin-Ig, die mit 125J markiert worden war, wurde in alle Reagenzgläser gegeben.
8. Die Teilchen wurden 1 Minute bei 3000 UpM abzentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit entfernt wurde.
9. Die Reagenzgläser mit dem Inhalt wurden 15 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Reagenzgläser in senkrechter Ebene langsam rotiert wurden.
10. Die Teilchen wurden dreimal mit 0,1 m Tris-Puffer (pH 7,4) mit 1 Gewichtsprozent Schweineserumalbumin gewaschen, wobei nach jedem Waschvorgang zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit abgesaugt wurde. Es wurde sichergestellt, daß während der Entfernung der überstehenden Flüssigkeit keine festen Teilchen mitgerissen wurden.
11. Die Reagenzgläser wurden vor einen Leuchtschirmdetektor gesetzt, so daß die Gammastrahlung gemessen werden konnte.
Zur Abschätzung der Intensität der Strahlung des ersten Reagenzglases wurde mit der Strahlungsintensität des zweiten Reagenzglases, welches Kontrollserum von einem nicht allergischen Patienten enthielt, verglichen.
Es ist auch möglich, nach dem Zentrifugieren gemäß Stufe 8 eine bestimmte Volumenmenge der überstehenden Flüssigkeit in Zählröhrchen zu überführen, worauf die Gammastrahlung der markierten Antikörper m gegen das Fc-Fragment frei in der Lösung gemessen werden kann.
Zur quantitativen Bestimmung können jeweils 0,05 ml Testserum in verschiedenen Verdünnungen in Stufe 2 zugesetzt werden. Eine Anzahl von Reagenzgläsern wurde in derselben Weise mit verschiedenen Verdünnungen eines Standardserums versehen. Die Aktivität kann im Verhältnis zur Aktivität des Standardserums ausgedrückt werden.

Claims (1)

  1. Patentansprüche:
    1. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von gegen bestimmte Allergene wirkenden Reagin-Immunoglobulinen (Reagin-Ig) in wäßrigen Testproben, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe, z. B. eine Körperflüssigkeit, wie Blutserum oder Blutplasma, in vitro mit einem wasserunlöslichen Polymer, an welches ein Testallergen gebunden worden ist, zusammenbringt, so daß eine Reaktion zwischen dem Testallergen an dem Polymer und dem entgegenwirkenden Reagin-Ig stattfindet und das Reagin an das an dem unlöslichen Polymer befindliche Testallergen gebunden wird, worauf man das Polymer mit dem Testallergen und dem Reagin-Ig entweder mit Antikörpern gegen das Reagin-Ig, die mit einem radioaktiven·Atom bzw. einer radioaktiven Gruppe markiert worden sind, oder mit Antikörpern gegen das Reagin-Ig und Reagin-Ig, welches mit einem radioaktiven Atom oder einer radioaktiven Gruppe markiert worden ist, zusammenbringt, an- ' schließend das unlösliche Polymer mit den daran befindlichen Substanzen aus der Flüssigkeit abtrennt und schließlich die Strahlung, die von dem unlöslichen Polymer mit den daran befindlichen Substanzen ausgestrahlt wird, oder die Strahlung, die von der abgetrennten Flüssigkeit ausgestrahlt wird, mißt oder die Wirkung derselben untersucht.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer in Teilchenform vorliegt.
    3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagin-Ig oder die Antikörper gegen das Reagin-Ig mit einem radio-
    10. Hilfsmittel nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagin-Ig oder die Antikörper gegen das Reagin-Ig mit einem radioaktiven Isotop, insbesondere Jod125, markiert sind.
    11. Hilfsmittel nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagin-Ig oder die Antikörper gegen das Reagin-Ig mit einer fluoreszierenden Gruppe markiert sind.
    12. Hilfsmittel nach den Ansprüchen 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Testallergen eine Mischung aus zwei oder mehreren Allergenen ist.
    13. Hilfsmittel nach den Ansprüchen 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung zwischen dem Testallergen und dem Polymer kovalenten Charakter aufweist.
    14. Hilfsmittel nach den Ansprüchen 8 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß diese in Form einer Testpackung vorliegen.
    15. Hilfsmittel nach den Ansprüchen 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß ein Reagenz oder mehrere Reagenzien jeweils in einer Ampulle vorhanden sind, und zwar vorzugsweise in getrockneter, z. B. in lyophilisierter Form.
DE19681798170 1967-09-06 1968-09-03 Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von gegen bestimmte Allergene gerichteten Reagin-Immunoglobulinen (Reagin-Ig) in wäßrigen Proben Expired DE1798170C2 (de)

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DE2624814A1 (de) * 1975-06-10 1976-12-23 Bent Dr Med Weeke Verfahren zum nachweis von antikoerpern in koerperfluessigkeiten mit hilfe bekannter antigene oder zur bestimmung von antigenen mit hilfe bekannter antikoerper aus koerperfluessigkeiten

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