DE2029499C3

DE2029499C3 - Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von carcinoembryonalen Antigenen im Blut

Info

Publication number: DE2029499C3
Application number: DE2029499A
Authority: DE
Inventors: Phil Cote St. Luc. Quebec Gold
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1970-06-01
Filing date: 1970-06-15
Publication date: 1983-12-22
Also published as: IL42508A0; FR2095728A5; US3663684A; GB1322000A; DE2029499B2; NL7801570A; JPS5516267B1; IL34722A; GB1321997A; JPS5122047B1; CA964580A; DK144591C; SE400124B; DE2065867A1; ZA704069B; DK144591B; NL7107501A; JPS5617619B1; CH611629A5; GB1321998A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von carcinoembryonalen Antigenen im BIuL

Der neoplastische Prozeß beim Menschen war und ist noch Gegenstand intensiver Forschung. Um ein besseres Verständnis der Krankheit zu erhalten, ist menschliches Krebsgewebe eingehend untersucht worden, um die Ursache, die Behandlung, die Verhütung und Vorbeugung und/oder eine Krebsdiagnose i-j entdekken. Eine Frühdiagnose des Krebses ist sehr wichtig, da sie die Chancen erhöht, eine vollständige Heilung der Krankheit zu bewirken.

Beim Bemühen, bekannte diagnostische Mittel zu verwenden, um das Vorliegen von Krebstumoren zu entdecken, sind Versuche unternommen worden, tumorspezifische Antigene beim menschlichen Karzinom nachzuweisen. Diese Versuche sind bisher nicht erfolgreich gewesen, da es nicht möglich wer, normale Gewebeantigene aus abnormalen Krebsantigenen abzutrennen und nachzuweisen, daß die Krebsantigene spezifisch sind.

Bei den Versuchen, abnormale Krebsantigene zu isolieren und ihre spezifische Wirksamkeit aufzuzeigen, wurden Versuche unternommen, die Bildung von tumorspezifischen Antikörpern zu verursachen und ihr Vorhandensein in Seren zu zeigen, die von Tieren erhalten worden « -nd, die mit menschlichen Krebspräparaten immunisiert worden sind. Wenn sie entsprechend reproduzierbar wären, würde der Beweis für das Vorhandensein von tumorspezifischen Antikörpern in tierischen Antiseren zur Anwendung eines wertvollen diagnostischen Instruments führen.

Um die Existenz von tumorspezifischen Antikörpern in tierischen Antiseren als ein diagnostisches Mittel voll zu nutzen, muß ein Test entwickelt werden, der das Vorhandensein des Tumorantigens im Blut des Patienten beweist. Früher vorgeschlagene Verfahren haben sich bei der Entdeckung eines Karzinoms des Verdauungssystems als nicht braufr::bp.r oder als nicht wirksam erwiesen.

Unter den menschlichen Karzinomen, die von den Forschern am gründlichsten untersucht worden sind, ist das Adenokarzinom des Colon und des Verdauungstrakts, da dies ein von den am weitest verbreiteten Krebsgeschwüren ist und für gewöhnlich einen chirurgischen Eingriff für eine definitive Diagnose erfordert, nachdem eine grobe Symptomatik entwickelt worden ist.

Jedoch wurde die Anwesenheit von Antigenen, die für Adenokarzinome des Colon und des Verdauungssystems spezifisch sind, mittels immunologischer ToIeranz- und Absorptionstechniken nachgewiesen, siehe G ο 1 d et al. in J. Exptl. Med. 121 (1965), S. 439 bis 462.

Weiterhin wurde bereits nachgewiesen, daß das tumorspezifische Antigen ebenfalls in den Verdauungsorganen von Feten zwischen dem zweiten und sechsten Schwangerschaftsmonat vorhanden ist, siehe Gold et al. in J. Exptl. Med. 122 (1965). S. 467 bis 487. Dieses Antigen wurde der Einfachheit halber als carcinoembryonales Antigen, im folgenden kurz als CEA bezeichnet, des menschlichen Verdauungssystems bezeichnet.

Die Isolierung von CEA und eine gewisse Charakterisierung hiervon durch eine Präzipitationsbande und eine Aminosäureanalyse sind in Nature, Vol. 215 (1967), S. 67/68, beschrieben. Die Verwendung von gefärbten Markierungsmitteln bei Untersuchungen von carcinoembryonalen Antigenen ist in j. Exp. Med., 128 (3), 1968, S. 387 bis 398, beschrieben. Diese vorbekannte Nachweismethode unterscheidet sich jedoch in mehreren

kritischen Punkten von dem erfindungsgemäßen Verfahren, so wird beispielsweise keine aufeinanderfolgende Chromatographie an zwei verschiedenen Gclsäurcn bei den vorbekannten Verfahren durchgeführt, weiterhin wird die einzige Chromalographieslufc gemäß dieser vorbekannten Arbeitsweise nach der Elektrophorese und nicht vorher durchgeführt

Die Schwierigkeit eines Nachweisverfahrens für CEA im Blut von Personen, die ein Adenokarzinom des Colon haben, liegt darin, daß sich die im Hinblick auf das CEA gebildeter Antikörper mit dem CEA zu einem Komplex vereinigen, so daß deshalb das Antigen aus dem Blut entfernt wird.

Aufgabe der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von carcinoembryonalen Antigenen im Blut, bei weichen der Antikörper-Anligen-Komplex ohne Veränderung der antigenentscheidendcn Regionen zerstört wird und bei dem ein Markierungsmittel für CEA eingesetzt wird, so daß dessen Nachweis niQ°!ich ist.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, diß durch eine ganz spezielle Kombination von Verfahrensschritten ein solcher Nachweis möglich isL

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von carcinocmbryonalen Antigenen im *5 Blut, ist durch die folgenden Verfahrensstufen gekennzeichnet:

a) Zusatz einer abgemessenen Menge von Anti-CEA-Aniiserum zu einer Probe von mit Perchlorsäure extrahiertem Blutserum.

b) Inkubieren des Gemisches,

c) Zufügen einer abgemessenen Menge von radioaktiv markiertem CEA zum inkubierien Gemisch,

d) Inkubieren des Gemisches, 35·

e) Zusatz eines Proieinfällungsmittcls /um inkubierten Gemisch, wobei alle CEA-Anii-CEA-Komplcxe copräzipitiert werden, und

f) Messen der Radioaktivität des Copräzipitates oder des Überstandes,

wobeizur Herstellungdes radioaktiv markierten CEA reines CEA verwendet wird, das ein Molekulargewicht von etwa 200 000 und ein Absorptionsmaximum bei 280 nm aufweist, das mit seinem spezifischen Antikörper in nicht absorbierjcm Antiserum beim Geldiffusionstest eine einzige Präzipitationslinie bildet und das wie folgt erhältlich ist:

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g) Homogenisieren eines Adcnokar/inomgewebes J₀ auf Vcrda-jungssystemcpiihcltumorcn,

h) Behandlung des Homogenisales mit einem Glycoprotein-Lösungsmittel,

i) Abtrennung des Niederschlages und Klären der erhaltenen Lösung,

j) Dialyse der geklärten Lösung,

k) Konzentrierendes Dialysats,
I) Klären der erhaltenen Lösung,

m) Trocknender geklärten Lösung,

n) Chromatographie des erhaltenen Materials an zwei verschiedenen Gelsäulcn, von denen die erste ein Agarosegel mit etwa 4 Gcw.-% Agarose und einer Teilchengröße von 40— 190 μ und die zweite ein hydrophiles wasserunlösliches qucrvcmctztes Dextrarsgcl darstellt, ·

o) Sammeln und Konzentrieren der Fraktionen des Eluats mit einem Absorptionsmaximum bei 280 nm und einem Molekulargewicht von etwa 200 000,

p) präparative Elektrophorese der gesammelten Eluate durch eine Blockelektrophorese, durchgeführt bei 300-500 V und etwa 2OmA mit Ferritin als Standard, Lösung des Aktivmaterials in einem Boratpuffer vom pH 8,2 -9,2 und einer Ionenstärice von 0,0125-0,10, und Verwendung eines wasserunlöslichen, hydrophilen, quervernetzten Dextrangels mit einer Ausschlußgrenze von 5000, einer Wasseraufnahmekapazität von 2^ ± 0,2 g/g Trokkensubstanz und einer Korngröße von 20 - 80 als elektrophoretisches Trägermaterial, und

r) Sammeln derjenigen Fraktionen, die bei der Elektrophorese von der Startzone etwa 10—14 cm in anodischer Richtung gewandert sind, wenn gleichzeitig Ferritin vom Kathodenende 18 cm in anodischer Richtung wandert

Es sei darauf hingewiesen, daß die zuvor genannten Verfahrensstufen a) bis f) bis auf die spezielle Art der Extraktion des Blutserums eine a« sich bekannte, radioimmunologische Verfahrenstechnik darstellen, siehe Farrin J. Infect Dis, 103 (1958), S. 239.

Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren beispielhaft näher erläutert

CEA wird durch Homogenisieren von Adenoka rzinomgewebe aus primären oder metastatischen Tumoren, die ihren Ursprung im Verdauungssystem haben, isoliert und gereinigt

Um das mit dem homogenisierten Tumorgewebe vergesellschaftete Antigen zu isolieren, ist es erforderlich, alle anderen Substanzen aus dem Homogenisat abzutrennen. Dies erreicht man durch chemische und physikalische Extraktions- und Reinigungsverfahren.

Wenn die Extraktions- und Reinigungsverfahren beendet sind, muß die Identität der isolierten Fraktion als CEA bestätigt werden. Dies wird mittels verschiedener bekannter Techniken erreicht, . zum Beispiel doppelte Diffusion an Agargel, Immunoelektrophorese, Hämagglutination, passive kutane Anaphylaxie und dergleichen.

Um diese Techniken anzuwenden, muß bei den verwendeten Antikörpern nachgewiesen werden, daß sie für CEA spezifisch sind. Antikörper, mit diesem Kriterium übereinstimmen, können durch immunologische Toleranz- oder Absorptionstechniken gewonnen werden.

Bei der Absorptionstechnik wird das Antitumorantiserum an normalem Gewebe absorbiert, um antinormale Komponenten des Antiserums zu entfernen. Zurückbleibende Antikörperaktivität bei dem absorbierten Antiserum, das gegen das Tumormaterial gerichtet ist, wird dann als tumorspezifisch bezeichnet. Dieses Verfahren ist nicht fehlerfrei, da die Möglichkeit besteht, daß tumorsp^zifische Antikörper entfernt oder durch normale Gewebekomponenten inaktiviert werden können, ähnlich den — jedoch nicht mit ihnen identischen — Tumorantigenen, die ursprünglich die Antikörperbildung anlegten.

Bei der immunologischen Toleranztechnik werden Tiere während des Neugeborenenlebensabschnittes gegen normale Gewebe immunologisch widerstandsfähig (tolerant) gemacht Die widerstandsfähigen, Tiere werden dann mit Tumorpräparaten der gleichen Spenderarten immunisiert Wo eine entsprechende Unterdrückung der immunen Reaktion gegen normale Gewebebestandteile erreicht worden ist, ist die Entwicklung von für den Tumor anscheinend spezifischen Antikörpern erreicht worden. Bei Studien von

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menschlichem Krebs eröffnet diese Technik eine zum Gewebehomogenisat geeignet. Vorzugsweise wenmögliche Fehlinterpretation, da die Quellen normalen det man jedoch Raumtemperatur, zum Beispiel und des Tumormaterials verschiedene Spender sind. 20-25'C, an. Die Temperatur des Glycoprotein-Lö-Wenn jedoch Extrakte von Geweben verwendet sungsmittels, das dem Gewebehomogenisat zugefügt werden, ist dieses Problem nicht signifikant, da alle j wird, kann ebenfalls variieren, jedoch wird Raumtempe-Extrakte im wesentlichen ähnlich sind. ratur bevorzugt Im allgemeinen wird eine konzentrierte

Es hat sich gezeigt, daß Tumorgewebe vom Säure als Glycoprotein-Lösungsmittel verwendet, bei-Adenokarzinom und normales Colongewebe von dem spielsweise von einer Konzentration von 0,5 bis etwa gleichen Individium verwendet werden können, weil 2 n, wobei 2-n-Säure bevorzugt wird. Das Lösungsmittel sich ein Colonkarzinom praktisch niemals submukös io wird in etwa dem gleichen Volumen zum Homogenisat mehr als 6-7 cm auf jeder Seite eines sichtbaren zugefügt. Die Zeit, in der dies erreicht wird, beträgt Tumors im allgemeinen ausdehnt. gewöhnlich etwa 10-30 Minuten. Längere Zeiten

Das Tumorgewebe des Colonadenokarzinoms und können zum Verlust der Antigen Wirksamkeit führen,
normales Colongewebe von dem gleichen Individuum Man erhält ein Präzipitat. Dieses Präzipitat wird von

werden zwar getrennt, jedoch in paralleler Weise ij dem Überstehenden abgetrennt, das das gelöste CEA behandelt. Das Gewebe wird gemahlen, in einem Puffer enthält. Man kann beliebige übliche Trennungsverfahjuspcfiuicri und dann homogenisier Das Homogenisat ren anwenden, wie Zentrifugieren, Filtrieren oder wird dann zur Entfernung fester .suchen behandelt. Ein dergleichen.

Zentrifugieren oder Filtrieren durch allmählich kleiner Man bevorzugt das Zentrifugieren, weil es schneller

werdende Filteröffnungen werden bevorzugt. Dies io durchführbar ist und weil dabei eine ausreichende Kraft erfolgt zu dem Zweck, alle Teilchen von etwa 0,22 μ entwickelt werden kann, um im wesentlichen alle festen oder größer zu entfernen, wobei alle Bakterien Teilchen zu entfernen. Im allgemeinen sind zum gleichzeitig mit entfernt werden. Das Überstehende Erreichen dieser Wirkung etwa 3000 bis etwa 8000 oder das Filtrat wird dadurch sterilisiert zur Sicherung Umdrehungen pro Minute (UpM) ausreichend. Dieses gegen bakterielle Verseuchung. 15 Zentrifugieren wird vorzugsweise bei niedrigen Tempeln geeignete Gruppen eingeteilte. Versuchstiere ratureh, wie etwa 4— 10⁰C, durchgeführt, da bei diesen werden dann mit den Extrakten immunisiert, und nach Temperaturen die Sedimentationszeit wesentlich herabeinem geeigneten Zeitintervall nimmt man von den gesetzt wird.

Tieren ein Serum. Das Vorliegen von Antikörpern in Perchlorsäure, Salze, wie Natriumchlorid, und andere

den Prüfseren wird entweder durch die Ouchterlony- 30 Substanzen von niedrigem Molekulargewicht werden Technik einer doppelten Diffusion in Agargel, durch dann entfernt, um das System weiter zu reinigen. Hierzu Immunoelektrophorese, durch Hämagglutinationsreak- wird eine Dialyse durch eine semipermeable Membran tionen oder durch passive kutane Anaphylaxie bewie- gegen Wasser durchgeführt. Die Dialyse ist ein sen. Die bevorzugte praktische Methode ist wegen ihrer kritischer Teil des Verfahrens, da sie alle diffusionsfähi-Einiachhcit and reproduzierbaren Ergebnisse die 33 gen löslichen Substanzen mit Ausnähme der Substanzen Ouchterlony-Technik. von höherem Molekulargewicht, die die CEA-Fraktion

Wenn man die Anwesenheit von Antikörpern einschließen, entfernt. Die Dialyse kann zuerst mit bewiesen hat ist es möglich; das Antigen zu bestimmen, Leitungswasser etwa 24—48 Stunden durchgeführt wenn tatsächlich eine besondere Extraktionstechnik werden. Dann kann die nachfolgende Dialyse mit eine Fraktion isolieren läßt die CEA enthält 40 kaltem destilliertem Wasser bei Temperaturen von etwa

Die erfindungsgemäSe Extraktions- und Reinigungs- 4-I0°C durchgeführt werden. Jedoch ist es möglich, technik ergibt eine Fraktion, die stets eine einzige lediglich destilliertes Wasser bei der Dialyse zu Präzipitationslinie bei der Ouchterlony-Technik er- verwenden, vorausgesetzt daß die Temperatur niedrig zeugt, wenn sie gegen den Antikörper geprüft wird, der bleibt und daß das Wasser häufig gewechselt wird. Das für CEA spezifisch ist, oder wenn sie gegen nicht 45 vollständige Dialyseverfahren nimmt etwa 48-96 Stunabsorbierte Antiseren geprüft wird den in Anspruch.

Das CEA wird aus primärem oder metastatischem Die trübe Lösung, die nach der Dialyse zurückbleibt,

Adenokarzinomgewebe isoliert und gereinigt, das wird dann getrocknet Man kann ein Sprühtro"5cnen seinen Ursprung im Verdauungssystemepithel hat, das anwenden, jedoch ist die Lyophylisierung das bevorzugsich von embryonalen entodermalen Zellen ableitet. jo te Verfahren! Wasser zu entfernen. Es sind beliebige CEA enthaltendes Gewebe wird mit einem Glycopro- Lyophylisierungsverfahren geeignet Das bevorzugte tein-Lösungsmittel extrahiert in dem das CEA löslich Verfahren besteht darin, daß das Material zuerst ist Dies ist erforderlich, so daß fällbare normale schalengefroren und dann lyophylisiert wird. Dies Proteine und störende antigenische Materialien vom nimmt etwa 32-36 Stunden für das zu lyophylisierende CEA-Material getrennt werden können. Geeignete 55 Produkt bis zur vollständigen Trockne in Anspruch. Glycoprotein-Lösungsmittel sind zum Beispiel Per- Bevorzugt wird jedoch die Lyophylisierung etwa chlorsäure, Trichloressigsäure, Phosphorwolframsäure 24 — 30 Stunden durchgeführt so daß das Produkt nicht und dergleichen. Perchlorsäure wird jedoch wegen ihrer vollständig trocken ist

leichten Verfügbarkeit und Anwendbarkeit bevorzugt Das teilweise lyophylisierte Material kann dann bei

Das zu prüfende Gewebe wird mit Wasser homogeni- 60 Raumtemperatur oder höherer Temperatur, wie etwa siert, um das Antigen zu solubilisieren. Die Menge des 37⁰C, aufgetaut werden. Es kann auch durch Verdünnen verwendeten Wassers sollte ausreichend sein, um das mit einer sehr geringen Menge Wasser aufgetaut gesamte CEA zu !ösen, im allgemeinen sind etwa 2 Liter werden. Danach werden die zurückbleibenden Teilchen Wasser pro Kilogramm Gewebe ausreichend. Man kann entfernt Es ist auch gefunden worden, daß, wenn das mehr Wasser verwenden, jedoch ist dies im allgemeinen 65 Volumen auf einem Minimum gehalten wird, die nicht erforderlich. Klärung durch Filtrieren und/oder Zentrifugieren

- Eine beliebige Temperatur unterhalb Raumtempera- erreicht werden kann. Alle Teilchen einer Größe, die tür ist für die Zugabe des Glycoprotein-Lösungsmittels nicht durch ein O,22^-Filter gehen (d. h. einer Größe der

kleinsten Bakterien), werden demnach unter Klären und Reinigen der Lösung entfernt.

Das bevorzugte Verfahren besteht darin, die Lösung bei einer hohen Geschwindigkeit, d. h. mit etwa 14 000 bis 30 000UpM, vorzugsweise etwa 14 000UpM, bei 5 Temperaturen unterhalb etwa 1O⁰C, d. h. etwa 4 - 10⁰C, etwa '-5 — 45 Minuten lang zu zentrifugieren. Höhere Tempei aturen sind anwendbar, jedoch verzögern sie die Sedimentationsgeschwindigkeit und sind daher nicht zweckmäßig. Nach dem Zentrifugieren ist es erforder-10 lieh, die überstehende Lösung weiter zu klären und zu sterilisieren. Dies kann man durch Filtrieren durch Filter von sich allmählich verringernder PorengröBe erreichen, um im wesentlichen verbleibende Feststoffe und Bakterien zu entfernen. Die Porengröße der Filter kann etwa 1,2 —0,20 μ variieren. Bevorzugt verwendet man Filter mit 1,2 μ, 0,45 μ, 0,22 μ in der angegebenen Reihenfolge.

Die Abtrennung eines Teils des erhaltenen lyophylisierten, das CEA unter Ausschluß anderer Substanzen enthaltenden Pulvers wird durch Chromatographie mit zwei verschiedenen Gelsäulen und anschließende Elektrophorese erreicht.

Dabei hat sich gezeigt, daß die eluierten Fraktionen aus der Säulenchromatographie, die ein Molekulargewicht von etwa 200 000 und ein definiertes Maximum bei der spektrophotometrischen Absorptionswellenlänge von 280 ηιμ besitzen, das CEA enthalten. Es hat sich weiter gezeigt, daß, wenn die das CEA enthaltenden Frak'..onen einer Elektrophorese unterworfen werden, sie ein charakteristisches Wanderungsbild, das anodisch zur Aufbringungszone an der Kathode ist, bei pH 8,6 mit einem Boratpuffer mit einer lonenstärke von 0,05 haben. Das Ausmaß der Wanderung hängt von der angewendeten Stromstärke und Spannung, wie auch vom pH-Wert. vom Puffer und von der lonenstärke des Puffers ab. Wenn beispielsweise 400 V und 20 mA angewendet werden, wandert das CEA etwa 10-14 cm in anodischer Richtung (anodisch) zur Aufbringungszone in der gleichen Zeit, wie das als Markierungsmittel verwendete Ferritin (ein gefärbtes Protein) anodisch 18 cm wandert, wenn es am kathodischen Ende aufgebracht wird.

Die Säulenchromatographie kann in der Weise durchgeführt werden, daß man das lyophylisierte Material in Lösung der anschließenden Chromatographie an zwei verschiedenen Gelsäulen in beliebiger Reihenfolge unterwirft. Die eine Gelsäule ist ein Agarosegel. Agarose ist der neutrale Anteil von Agar. Ein solches Gelmaterial ist im Handel erhältlich. Die Gele sind als wäßrige Suspensionen in 0,02%igem Natriumazid als Schutzmittel erhältlich. Die Gelstruktur ist einer Wasserstoffbindung zu danken. Das Gel wird in Perlform mit einer ausgewählten Teilchengröße und einem Prozentsatz Agarose hergestellt Die Konzentration der Agarose im Gel Bestimmt seinen Fraktionierungsbereich.

Die zur erfindungsgemäßen Verwendung geeigneten Gele besitzen eine Teilchengröße von etwa 40—190 μ und enthalten 4 Gew.-% Agarose. Solche Materialien to haben einen Fraktionierungsbereich von 3XlO⁵ bis 3x10*. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird ein solches Gelmaterial verwendet, da es die Abtrennung der das CEA enthaltenden Fraktion von Fremdmaterialien mit höherem oder niedrigerem Molekulargewicht ^fi5 als auch kolloidalen Teilchen gestattet

Die zweite Säule enthält ein Gelfiltermaterial, das ein hydrophiles wasserunlösliches vernetztes Dextrangel ist. Dieses Material und sein Herstellungsverfahren sind in der britischen Patentschrift 8 54 715 beschrieben. Ein solches Gelmaterial, das im Handel erhältlich ist, besteht aus einem dreidimensionalen makroskopischen Netzwerk von miteinander verbundenen oder vernetzten Dextransubstanzen, die beim Absorbieren von Wasser quellen können. Die Fähigkeit des Gelmaterials, Wasser aufzunehmen, ist dem Vernetzungsgrad der Dextransubstanzen im Gelmaterial umgekehrt proportional. Das Gelmaterial ist in einer Vielzahl von Graden erhältlich, die sich im Hinblick auf den Porositätsgrad unterscheiden. Das bei der erfindungsgemäßen Verwendung bevorzugte Gel hat eine annähernde Molekulargewichtsausschlußgrenze von 200 000, ein Wasserzurückhaltevermögen von 20±2,0hHjO/g trockenes Gel, eine Teilchengröße von 40—120 μ und ein Betlvolumen/ml/g trockenes Gel von 30 — 40.

Das oben beispielhaft beschriebene Gfilf-ncrial wird zur weiteren Reinigung der das CEA enthaltenden Fraktion verwendet. Da die Säule ein größeres Auftrennungsvermögen als die erste Säule für den Molekulargewichtsbereich von 150 000 bis 250 000 besitzt, wird eine weitere Abtrennung des CEA von Substanzen mit höherem oder niedrigerem Molekulargewicht erreicht. Die zweite Säule sollte in praktischer Hinsicht nur verwendet werden, nachdem die kolloidalen Teilchen durch die erste Säule entfernt worden sind, da diese Teilchen die Säule verstopfen und sie unwirksam machen. Die Chromatographie wird zum Beispiel durch Lösen des lyophylisierten Materials in einem wäßrigen Puffer bei einem pH-Wert, bei dem das CEA elektrisch neutral ist, d. h. pH 4,5, dann durch Leiten der Lösung durch die erste Säule, durch Sammeln, durch Dialysieren, wie oben beschrieben, und Lyophylisieren der aktiven Fraktion zur Entfernung von Salzen, dann durch Wiederlösen der gesammelten aktiven Fraktion in einem wäßrigen Puffer bei einem pH-Wert, bei dem das CEA elektrisch neutral ist, durch Leiten der Lösung durch die zweite Säule, durch Sammeln der aktiven Fraktionen, durch Dialysieren wie oben und durch Lyophylisieren durchgeführt Der Grund, die Lösung des CEA elektrisch neutral zu machen, liegt darin, die Wechselwirkung des Antigens mit den Säulen und die nachfolgende Überlagerung der Fremdstoffe bei den aktiven Fraktionen herabzusetzen. Obwohl beliebige wäßrige übliche Puffer geeignet sind, wird die Verwendung einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung (03%) bevorzugt Der Vorteil der Anwendung niedriger Temperaturen, d.h. von etwa 4 —10⁰C, liegt darin, daß man ein verbessertes Auflösevermögen erreicht Die aus der zweiten Säule gesammelten Fraktionen haben ein Molekulargewicht von 200 000 und ein Maximum bei 280 πιμ im UV-Absorptionsmeßgerät Die aus der ersten Säule gesammelten Fraktionen werden auf den gleichen Kriterien basierend ausgewählt, jedoch enthalten sie Materialien, die ein etwas höheres oder etwas niedrigeres (bis herunter zu 70 000) Molekulargewicht als 200 000 haben.

Die aktiven Fraktionen aus der zweiten Säule werden einer Elektrophorese unterworfen, um das CEA von Verunreinigungen weiter zu befreien. Dies erreicht man durch Auflösen der aktiven, zuvor konzentrierten Fraktion in einem Puffer bei einem pH von etwa 82-92 und einer lonenstärke von etwa 0.0125—0,10. Obwohl beliebige wäßrige Puffer mit diesen Eigenschaften geeignet sind, verwendet man vorzugsweise einen Puffer, der die Beweglichkeit der aktiven Fraktion steigert, d. h. einen Boratpuffer vom pH etwa 8,6 und

einer lonenstärke von etwa 0,05. Diese Eigenschaften lassen das CEA in der gleichen Weise wie das verwendete Markierungsmittel Ferritin wandern.

Die angewendete Stromstärke und Spannung bestimmen das Ausmaß der Trennung der Moleküle in der Fraktion. Ek hat sich gezeigt, daß bei dem angewendeten Verfahren der Blockelektrophorese etwa 300-500 V, vorzugsweise 400 V, mit einer Stromstärke von etwa 20 mA geeignet sind.

Das bei der Blockelektrophorese verwendete Material sollte das zu prüfende Material tragen und elektrisch leitend sein, wenn es mit einem Puffer imprägniert wird. Erfindungsgemäß wird ein hydrophiles quervernetztes Dextrangel, z. B. ein Dextranpolymergel, verwendet, das eine Molekulargewichtsausschlußgrenze von 5000, ein Wasserzurückhaltevermögen "on 2,5 ± 0,2 g HjO/g trockenes Gel und eine Teüche.igröüe von 2U -80 μ aufweist. Bevorzugt wird ein Bettvolumen/ml/g trockenes Gel von 5. Das Gel wird in dem Puffer angequollen und auf einem nichtleitfähigen Block, z. B. Acrylglas, angeordnet.

Bevorzugt wird das Gel mit dem gleichen Puffer, in dem auch die aktive Fraktion gelöst wird, in dem Block angeordnet und dann die Papierkontakte auf dem Gel angebracht. Der Block wird dann in dem gleichen Puffer in einem Elektrophoresegerät unter Arbeitsbedingungen ins Gleichgewicht gebracht. Nachdem die Gleichgewichtseinstellung durchgeführt worden ist, wird ein Streifen des Gels entfernt und mit der gepufferten, lyophilisierten CEA-Fraklion aus der zweiten Säule vermischt. Die erhaltene Aufschlämmung wird dann auf den Block an die gleiche Stelle gegossen, von der der Streifen entfernt worden war, vorzugsweise in der Mitte des Blocks. Als Markierungsmittel wird Ferritin, ein Eisen enthaltendes rföiein, verwendei. Es wird dann am Kathodenende des Blocks aufgetupft. Nachdem die . Elektrophorese eine vorbestimmte Zeitdauer betrieben worden ist, in diesem Falle etwa 24 Stunden, wird der die CEA-Aktivität enthaltende Bereich, d. h. 10-14 cm anodisch zur Aufbringungszone, entfernt. Dieser Bereich wird nur entfernt, wenn sich das Markierungsmittel eine zuvor bestimmte Entfernung bewegt hat. in diesem Falle 18 cm in anodischer Richtung. Die CEA-Aktivität wird unter Saugen durch ein verfügbares O^O^-Celluloseacetatfilter eluiert und vorzugsweise durch Dialyse gegen destilliertes Wasser zur Entfernung des bei der Eluierung verwendeten Salzes gewonnen. Man erhält eil· Material, das im wesentlichen reines CEA ist. Dies kann entweder durch die Precipitin-Inhibition oder unmittelbar durch die Ouchterlony-Prüfung gegen nichtabsorbiertes Tumor-Antiserum gezeigt werden. Eine einzelne Präzipitationslinie zeigt reine CEA-Aktivität an.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Höhe des CEA-Gehaltes in Körperflüssigkeiten von Personen mit Krebs oder Krebsvermutung wird eine Radioimmuntechnik angewandt, die einfach durchzuführen ist und einen hohen Reproduzierbarkeitsgrad hat und spezifisch ist

Bei Radioimmunverfahren ist es wichtig, daß das radioaktive Atom ausreichend reaktionsfähig mit dem zu kennzeichnenden Molekül ist, um eine entsprechende Konzentration der Radioaktivität zur Bestimmung zu schaffen, und daß das radioaktive Atom eine ausreichende Zerfailszahl pro Zeiteinheit zur Verfugung stellen muß, um eine ausreichende Empfindlichkeit für genaue Bestimmungen zu schaffen. Weiterhin darf im Falle einer Radioimmunanalyse von Antigenen die Antigenwirksamkeit durch die Verbindung des radioaktiven Atoms mit dem Antigen nicht schädlich beeinflußt werden.

Gemäß vorliegender Erfindung ist es zum ersten Male möglich, die Existenz eines menschlichen Tumors dadurch zu bestimmen, daß man ein zirkulierendes tumorspezifisches Antigen nachweist. Mittels vorliegender Erfindung ist es möglich, wenigstens etwa 1,0 ng CEA pro ml Serum zu entdecken. Die Empfindlichkeit

ίο der Prüfung wird nur durch die spezifische Aktivität des radioaktiven Atoms begrenzt. Diese Begrenzung wird jedoch weitgehend überwunden, da praktisch das gesamte, in einem Teilvolumen des Serums vorhandene CEA durch das erfindungsgemäße Extraktionsverfuh-

'5 ren extrahiert werden kann, wodurch es mögüch wird, die spezifische Aktivität des ■ ' lioaktiven Atoms zu konzentrieren. Weiterhin kann die Copräzipitations-inhibition des markierten CEA ■ '.Tgrößert werden, um die Empfindlichkeit der Prüfung zu erhöhen.

ίο Das CEA kann durch radioaktive Atome markiert werden, die mit dessen chemisch reaktionsfähigen Gruppen reagieren können und nicht wesentlich die Antigenwirksamkeit herabsetzen. Es zeigt sich, daß • 2⁵]od besonders geeignet ist.

Das CEA kann mittels in der Technik bekannter Verfahren mit geringen Modifikationen bezüglich der Konzentration und der Volumina mit radioaktivem Jod umgesetzt (radiojodiert) werden. Die »Chloramine-T-Methode« von Hunter und Greenwood, Biochem.

J, 91 (1964), Seite 46. unter Verwendung von ¹²⁵Jod ist besonders vorteilhaft.

Dieses Verfahren ergibt eine Radiojodierungswirksamkeit von etwa 20—50%. Beim Radiojodieren von CEA wird gereinigtes CEA verwendet. Die Reaktion wird zum Beispie! unier Verwendung von 200 μ! einer 100 μg »Chloramine-T« (Natriumsalz des p-Toluol-sulfo-chloramins) enthaltenden Reaktionslösung, von 0,25 — 0.4 mg gereinigtem CEA und von 4 mCi ¹²⁵Jod in Form von KJ oder NaJ durchgeführt. Die Reaktion verläuft bei Raumtemperatur in etwa einer Minute und wird durch Zugabe von Natrium-metabisulfit unterbrochen. Die Funktion des »Chloramine-T« besteht darin, das Jodid im Salz zu Jod zu oxidieren. Die Funktion des Natrium-metabisulfits besteht darin, das nicht umgesetzte ^I25Jod zum Jodid zu reduzieren. Man kann auch andere Reduktionsmittel, wie Kalium-metabisulfit, verwenden. Die verwendeten Oxidations- und Reduktionsmittel sollten nicht so stark sein, daß sie das CEA schädigen. Das Produkt kann vom nicht umgesetzten ¹²⁵Jod durch Chromatographie in einer Säule mit vernetzten! Dextrangel, zum Beispiel »Sephadex G-100«, abgetrennt werden, wobei das Gel eine annähernde Molekulargewichtsausschlußgrenze von 100 000, ein Wasserzurückhaltevermögen von 10,0± 1,0 g H₂OVg trockenes Gel, eine Teilchengröße von 40 —120 μ und ein Bettvolumen/ml/g trockenes Gel von 15-20 hat Man entfernt das Rohr mit der größten Radioaktivität im ersten Maximum. Das Produkt hat die folgenden Eigenschaften:

Es ist mit einem spezifischen Antikörper reaktionsfähig, hat das CEA-Elektrpphoresebild, ein Molekulargewicht von etwa 200 000 und eine spezifische Aktivität von etwa 1000-25 000 dpm/ng, vorzugsweise von etwa 10 000-20 000 dpm/ng, d h. etwa 5-10 n^Ci/ngCEA.

⁶S Es ist erforderlich, um bei der erfindungsgemäß angewandten Radioimmun-Technik einen Erfolg zu erreichen, das Blut des Patienten in einer Weise zu behandeln, die sicherstellt, daß das gesamte CEA unter

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Ausschluß der störenden Materialien in dem endgültig normalem Blutserum enthalten. Der zur Verdünnung

verwendete)! Serum vorliegt. Dies wird durch Behan- des normalen Blutserums verwendete Puffer kann ein dein des Blutserums der Patienten mit Perchlorsäure. beliebiger Puffer sein, jedoch wird ein Borat-Puffer mit

einem Glycoprotein-Lösungsmittel, das CEA löst, und einer lonenstärke von 0,1 und einem pH von 8,4

durch Klaren der erhaltenen Lösung erreicht. 5 bevorzugt.

0.2-m-Perchlorsäure wird bevorzugt angewandt, da Die erhaltenen Lösungen werden bei niedrigen

sie störende Substanzen entfernt. Die erhaltene, das Temperaturen, zum Beispiel etwa 4° C, eine ausreichen-

gegebenenfalls vorhandene gelöste CEA enthaltende de Zeit zur Vervollständigung der Reaktion inkubiert.

Lösung wird dann geklärt. Das bevorzugte Verfahren ist wobei gewöhnlich etwa 18 Stunden ausreichend sind. Im Zentrifugieren, Sammeln des Überstehenden und io Anschluß an die Inkubation wird jedem Röhrchen eine Dialysieren gegen Wasser. Dies nimmt gewöhnlich abgemessene Menge ^l25Jod zugegeben. Die Inkubation

24-48 Stunden in Anspruch. Der Dialyserückstand wird dann weitere zwei Stunden bei etwa 37°C

kann dann durch Lyophylisieren getrocknet werden. Bei fortgesetzt. Wenn die Inkubation beendet ist, wird ein

Anwendung dieses Verfahrens wird ein gereinigter Ausfällmittel, das den Antikörper und den Antigen-An- Serumextrakt erhalten, der mehr als elwa 95% des 15 likörper-Komplex, jedoch nicht das Antigen, ausfällt,

ursprünglich vorhandenen CEA enthält. der Lösung zugefügt, um den Antikörper, der das CEA

Bc: diesem Verfahren isi es wesentlich, daß der gebunden hat, mit auszufällen. Vorzugsweise wird eine Scrumcxira'rc; wie beschrieben behandelt wird, da die gesäüigic AriimuiiiürnSüuäi-Lusuiig verwendet. Perchlorsäure, welche CEA löst, in der Anfangsstufe Unter den oben beschriebenen Bedingungen ver-

zuvor vorhandene CEA-Ami-CEA-Komplexe im Serum 20 bleibt freies CEA in Lösung. Der ^l25Jod-Gehalt des

des Patienten zerstört, wodurch die Gewinnung des im Präzipitats oder des Überstehenden wird dann aus den

wesentlichen gesamten ursprünglich vorhandenen CEA Ablesungen auf einem geeigneten Instrument bestimmt,

gewährleistet wird. Danach bestimmt man die CEA-Menge im Serum mit

Für das Radioimmunverfahren sind CEA-spezifischc Bezug auf einen Standard. Antikörper erforderlich. Diese werden durch Immuni- 15 Die auf die gepulverten Perchlorsäureextrakte des

sieren von Tieren mit gereinigter CEA in üblicher Weise Serums angewendete Prüfung, die in der gleichen Weise

erhalten. wie Standard-CEA behandelt worden sind, liefert eine

Man fügt dem CEA in eiicr Salzlösung ein Bestimmung der CEA-Menge im Blut des Patienten. Emulgiermittel zu. zum Beispiel Freunds Adjuvans Diese zeigt ihrerseits die An- oder Abwesenheit von

(vollständig). Die Emulsion kann bei Tieren in den 30 Krebs des Verdauungssystems beim Patienten an.

Fußballen intramuskulär und/oder subkutan injiziert Die nachstehenden speziellen Beispiele sollen die

werden. Geeignete Tiere sind Geflügel, Kaninchen, Erfindung noch weiter erläutern.
Pferde, Ziegen. Schafe und ähnl-che. Die Regel bei

Kaninchen ist zum Beispiel, wöchentlich zwei bis fünf Beispiel 1 Injektionen zu machen. Nach der letzten Injektion wird 35 ... . „„. _ , .

vom Tier Blut entnommen. Das Serum aus diesem Blut Isolierung der CEA-Fraktion

ist nichtabsorbiertes Anti-CEA-Antiserum. Es wird Tumorgewebe vom Adenokarzinom des

Bei einem Verfahren werden 400 μg CEA in 1 ml Colon herausgeschnitten ur.d soviel wie möglich Salzlösung (03%) verwendet. Die Injektion erfolgt. normales Gewebe abgeschnitten. Das restliche Tumorintramuskulär unter Verwendung eines etwa viermali- 40 gewebe wird durch einen Fleischwolf getrieben und in gen Volumens, das in den Fußballen injiziert wird. lOOO-g-Mengen bei —20⁰C gelagert. 1000g des

Der in dem Antiserum vorhandene Antikörper ist zerkleinerten Gewebes wird in destilliertem Wassv auf

nach Absorption an normalen Gewebebestandteilen in ein Gesamtvolumen von 4000 ml suspendiert und bei

seiner Aktivität gegen CEA spezifisch. 15 000 Umdrehungen pro Minute eine Stunde in einem

Das angewandte Radioimmunverfahren beruht auf 45 wassergekühlten Homogenisator homogenisiert,

der Technik der Copräzipitation-lnhibition. Dabei wird Unter ständigem Rühren fügt man ein gleiches

eine Titrationskurve und dann eine Standardinhibitions- Volumen 2 n-Perchlorsäure bei 4°C langsam zu. Dieses

kurve erhalten. Die Standardinhibiiionskurve wird als Suspension rührt man 30 Minuten bei Raumtemperatur

ein Kontrollstandard verwendet. Dann werden die und zentrifugiert dann 30 Minuten bei 4°C mit

radioaktiven Materialien aus der Lösung copräzipitiert 50 6000 Upm in einer gekühlten Zentrifuge (6 χ 250 ml,

Die Standardinhibitionskurve, die nach dem Farr- feststehender Winkelrotor). Das Überstehende wird Verfahren hergestellt wird, stellt ein Maß für die entfernt und in einen flachen, etwa 7,62 cm weiten Komplexbildung mit spezifischen Antikörpern dar. Die Dialysierschlauch gegeben, der zuvor 1 Stunde in Kurve gibt die CEA-Menge wieder, die pro Einheit des destilliertes Wasser getaucht worden ist, um ihn Serums vorhanden ist Die Dimension ist in Nanogramm 55 geschmeidiger zu machen. Die Dialyse wird 48 Stunden

pro Millimeter angegeben, die gegen einen bekannten gegen kaltes Leitungswasser und dann gegen ständige

Prozentsatz von radioaktiv markiertem CEA aufgetra- Wechsel von großen Mengen destillierten Wassers bei

gen wird. Die erhaltene Kurve wird zur graphischen 4° C während weiteren 48 Stunden durchgeführt Der

Darstellung der CEA-Menge im Serum eines Patienten dialysierte Rückstand wird in 5000 ml fassende Rundverwendet 60 kolben gegeben, und zwar jeweils 1500 ml pro Kolben,

Eine Standardinhibitionskurve erhält man durch in einem Methanol-Trockeneisbad Schalen-gefroren Zufügen von Standard-CEA zu einer Reihe von und dann auf einem Lyophylisiergerät mit einer Röhrchen, die gepulverten Perchlorsäureextrakt von Kapazität von 8 Litern iyophylisiert Unmittelbar vor

normalen menschlicher. Serum enthalten. Eine abge- der vollständigen Lyophyiisaüon (24—30 Stunden) messene Menge von Anti-CEA-Antiserum, die vorher 65 werden die Kolben herausgenommen, der teilweise

im Verhältnis 1:100 mit einem Borat-Puffer vom pH trockne rohe Extrakt aufgetaut und die erhaltene

etwa 8,4 verdünnt worden ist, wird der Reihe von Lösung ein einer gekühlten Zentrifuge (8 χ 3OmL

Röhrchen zugefügt, die einen Perchlorsäureextrakt von feststehender Winkelrotort 30 Minuten bei 14 000 Unm

13 14

bei 4°C zentrifugiert. Das Obersteherde wird entfernt läßt es sich während einer Stunde unter den

und dann nacheinander durch Membranfilter von 1,2 μ, Betriebsbedingungen von 400 V mit einer konstanten

0.45 μ und 0,22 μ Milliporen filtriert. Die geklärte Stromstärke von -20 mA bei 4°C ins Gleichgewicht

Lösung wird Schalen-gefroren und zur Trockne bringen. Dann entfernt man von der Mitte des Blocks Iyophylisiert 5 einen Streifen von 1 cm und vermengt ihn gut mit 60-mg

1,5 g des getrockneten rohen Extraktes löst man trockenem CEA aus Beispiel 1, das zuvor in einer

in 50 ml eines 0,05-m-NaH2PO«-Puffers {pH 4,5) in Mindestmenge von O,05m-Borat annähernd O₁SmI,

normaler Salzlösung. Der Phosphat-Salz-Puffer vom gelöst worden ist. Die erhaltene Aufschlämmung wird

pH 4,5 dient als Eluierungslösung bei allen nachfolgen- dann in den Mittelstreifen gegossen. Dann tupft man

den Säulenchromatographien. Die Probe wird dann io 1 —2 Tropfen Ferritin (6mal umkristallisiert) bei einer

durch eine Agarosegelsäule geleitet Die verwendete Konzentration von 100 mg/ml auf das Kathodenende

Säule mit den Abmessungen 100 cm χ 10 cm besaß eine des Blocks. 24 Stunden nach Versuchsbegimi bewegt Bettlänge von 89 cm. sich das Ferritin-Markierungsmittel 18 cm in anodischer Durch einen Umwälzkühler wird die Temperatur auf Richtung. Gleichzeitig wird der Block aus dem

4-5°C gehalten. Die Lösung wird mit einer Aufwärts-15 Elektrophoresegerät entnommen. Streifen von 2 cm

fließgeschwindigkeit von 150 ml/Stunde mittels einer zwischen der Aufbringungszone und dem Anodenende

Peristaltikpumpe mit konstanter Strömungsleistung werden mit 2m-NaCI eluiert, die durch eine 0,20 μ

gepumpt Man sammelt 25-ml-rraktionen in einem ungebundene Gittermembran geleitet worden war. Die

Fraktionssammler. Die Fraktionen werden laufend bei Aktivität wird bei 10—14 cm in anodischer Richtung zur

280 πιμ in einem UV-Absorptionsmeßgerät überprüft.» Aufbringungszone lokalisiert, wobei eine schwächere

Die aktive Fraktion wird nach der Eluierung von Aktivität bei 8—10 cm in modischer Richtung zur

4750 ml aufgefangen. Der Versuch dauert annähernd Aufbringungszone gefunden wurde.

47 Stunden. Jeder aktive Streifen wird eluiert und in einem

Das Gesamtvolumen der aktiven Fraktion beträgt eingeweichten 30-mm-Dialysterschlauch gegen zahlrei-

750 ml. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, 48 25 ehe Wechsel großer Volumina destillierten Wassers

Stunden bei 4°C gegen zahlreiche Wechsel großer 48 Stunden bei 4°C dialysiert. Das Dialysat wird Volumina destillierten Wassers dialysiert, Schalen-ge- Schalen-gefroren und zur Trockne Iyophylisiert. Das

froren und lyophylisierL getrocknete, gereinigte CEA wird unter vermindertem

200 mg des getrockneten Materials aus der Agarose- Druck über Calciumchlorid bei 4^eC gelagert. Das gelsäule werden dann in 10 ml des Standard-Puffers 30 Produkt hat die folgenden charakterisierenden Eigengelöst und durch eine Dextrangelsäure geschickt Die schäften:

verwendete Säule besaß die Abmessungen 100 cm χ Es bildet eine einzige Präzipitationslinie mit nichtab-

10 cm mit einer Bettlänge von 90 cm. Durch einen sortiertem Antiserum bei Geldiffusionsprüfungen, ist in

Umwälzkühler wird die Temperatur auf 4^eC gehalten. Perchlorsäure löslich, wandert bei der Blockelektropho-' Die Lösung wird mit einer Aufwärtsfließgeschwindig- 35 rese anodisch 10-14 cm, wobei gleichzeitig ein

keit von 40 ml/Stunde mittels einer Peristaltikpumpe Ferritin-Markierungsmittel anodisch 18 cm wandert,

mit konstanter Strömungsleistung gepumpt 10-ml- wenn ein Borat-Puffer vom pH 8,6 und einer

Fraktionen werden laufend bei 280 πιμ in einem lonenstärke von 0,05 und 400 V und 20 mA die

UV-Absorptionsmeßgerät überprüft. Die aktive Frak- Bedingungen der Blockelektrophorese sind, es hat tion wird nach der Eluierung von 820 ml aufgefangen. 40 weiterhin ein Molekulargewicht von 200 000 und es

Die Dauer dieses Versuchs beträgt 30 Stunden und zeigt ein Spektrophotometerabsorplionsmaximum bei

das Gesamtvolumen der aktiven Fraktion 190 ml. Die einer Wellenlänge von 280 πιμ.
aktiven Fraktionen werden vereinigt, 48 Stunden bei

4°C gegen zahlreiche Wechsel großer Volumina Beispiel 3

f '"'³^ ^™'**™™ ^U"^{d 45} Herstellung des Anti-CEA-Antiserums

12 ausgewachsene, männliche, weiße Neu-Seeland-Beispiel 2 Kaninchen mit einem Gewicht von 2,0kg werden in

ReinigungderisoliertesCEAenthaHenden ,^^^jf^^Ä Fraktion durch Blockelektrophorese " ionisiert: normaler Colongewebeextrakt. Tumorge- Das Blockelektrophoresemedium war ein vernetztes webeextrakt des gleichen Individuums, von dem der Dextrangel mit einer annähernden Molekulargewichts- normale Gewebeextrakt erhalten worden war, ange-

ausschlußgrenze von 5000 und einer Teilchengröße von sammelles menschliches Plasma. Der Tumorgewebeex-

20-80 μ. Es wurde zwei Stunden bei 8O⁰C in Wasser 55 trakt stammt von Tumorproben, die diagnostiziert und

gequollen und durch Dekantieren mit Borat vom pH 8,6 bestätigt worden waren, daß sie ein Adenokarzinom des

und einer lonenstärke von 0,05 gewaschen und dann Colon sind. Die normalen Gewebeextrakte und die

durch eine gesinterte Glasplatte saugend nitriert Tumorgewebeextrakte werden nach dem in Beispiel 1

Man gießt eine dicke Gelaufschlämmung auf einen beschriebenen Verfahren gebildet. Das vereinigte Acrylglas-Blockträger mit den Ausmaßen 61 cm χ 6o menschliche Plasma wurde von 30 normalen Spendern

7,5 cm χ 1 cm und läßt sie sich gleichmäßig Ober die erhalten, die alle Hauptblutgruppen repräsentieren.

Platte bis zu einer Tiefe von 1 cm verteilen. Die Die Injektionen, die 4 Wochen lang zweimal wö- Oberflfiche wird dann mit einem Wattebausch abge- chentlich gegeben wurden, enthielten 3 mg Protein in

wischt, bis sie fest aber nicht vollständig trocken ist. 0,6 ml Gewebeextrakt oder Plasma, die in dem gleichen

Der Block wird dann mit 3-mm-Chromatographiepa- 65 Volumen Freunds Adjuvans (vollständig) emulgiert pierkontakten versehen, die alle in der gleichen waren. Injektionen von 0,1-0,2 ml wurden in einen Fließrichtung des Papiers ausgerichtet sind. Den Block Fußballen und der Rest intramuskulär in die Flankengeordnet man dann in dem Elektrophoresegerät an und gend gegeben. 12 Tage nach den letzten Injektionen

15 16

wurde den Tieren Blut aus ihren äußeren Ohrvenen hergestellt worden war, und das ¹²⁵J-CEA verwendet,

entnommen, und die von jeder Gruppe erhaltenen das nach dem Verfahren des Beispiels 4 hergestellt

Seren zu Prüfzwecken gesondert gesammelt worden war.

Die Seren von jeder Gruppe wurden an normalem , ,„ _ „ . _. , .. ..... ,

Gewebe absorbiert und das erhaltene Präzipitat 5 (a) Herstellung einer Standard,nhibitionskunve

abgetrennt. Die überstehenden Lösungen wurden dann Man fügt 5 ml Standard-CEA einer Reihe von

der Ouchterlony-Technik einer doppelten Diffusion in Röhrchen zu, von denen jedes den gepulverten Extrakt

Agargel unterworfen. Diese wurde in 1% Agar-in-Salz- von 5 ml normalem menschlichen Serum enthält, das lösung mit Merthiolat durchgeführt, das als Schutzstoff nach dem Verfahren des Beispiels 5 hergestellt worden

zu einer Endkonzentration von '/io ooo zugefügt wurde. io war. Dann gibt man 500 μΐ verdünntes Anti-CEA-Anti-

Die Proben wurden in den Gelplatten geschnitten, so serum in jedes Röhrchen. Die erhaltenen Lösungen

daß die zentralen und peripheren Vertiefungen 1 cm werden dann 18 Stunden bei 4°C inkubiert und danach

voneinander angeordnet waren. Jede Vertiefung wurde jedes Röhrchen mit 500 μΐ ^l25Jod-CEA versetzt Die

mit 0,15 ml des zu untersuchenden Materials gefüllt Die Inkubation wird dann weitere 2 Stunden bei 37°C

verwendete Antigenkonzentration betrug 10 mg Eiweiß 15 fortgesetzt Dann fügt man jedem Röhrchen 1 ml einer

pro ml. Die Anfangsinkubation der Platten wurde in auf 4° C gekühlten gesättigten wäßrigen Ammoniumsul-

einer feuchten Umgebung 24 Stunden bei 37° C fatlösung hinzu. Bei den erhaltenen zu 50% gesättigten

durchgeführt um die Diffusion des Materials aus den Ammoniumsulfatlösungen erleidet das an den Antikör-

Zwischenräumen (Vertiefungen) heraus zu unterstützen. per gebundene CEA eine Copräzipitation, während das

Man ließ die Proben sich in der gleichen feuchten 20 freie CEA in Lösung verbleibt Nach einem Waschen

Atmosphäre 7 Tage bei 25°C entwickeln. Die Proben mit 3,0 ml einer zu 50% gesättigten wäßrigen Ammoni-

aus den Seren von den Tieren, die mit dem umsulfatlösung bei 4° C wird der ¹²⁵Jod-CEA-Gehalt des

Tumorgewebeextrakt immunisiert worden waren, zeig- Präzipitates in einem mit zwei Kanäien versehenen,

ten eine einzige Linie, die angibt daß das Serum für den automatisierten Gammastrahlungs-Szintillationszähler

Tumor spezifische Antikörper enthält. Keine Proben 25 analysiert. Die erhaltene Standardinhibitionskurve ist in

wurden aus den Seren von Tieren entwickelt, die mit der Zeichnung dargestellt

normalem Gewebe oder normalem menschlichem „.„,.. _r . „

Plasma immunisiert worden waren. (^b) Radio.mmunprüfung des Serums

Die gepulverten Extrakte von Serum, das von jedem

B ei s ρ i e I 4 ' 30 der 200 Menschen erhalten worden war, werden in der

Umsetzung von CEA mit '»Jod gleichen Weise behandelt mit der Ausnahme, daß kein

Standard-CEA zu einer der Proben zugefugt wird.

Cs vvird eine 500^I-Reakiionsmischung gebildet, die Die Ergebnisse der Radioimmunprüfung zeigen, daß

100 μg »Chloramine-T«, 250 pg CEA aus Beispiel 2 und CEA nicht festgestellt werden konnte in einem Serum, 4 mCi'^l25|od in Form von KJ enthält. Man läßt die 35 das von normalen (gesunden) Menschen, Schwangeren, Reaktion 1 Minute bei Raumtemperatur ablaufen und Patienten mit Krebserkrankungen von nicht zum unterbricht sie durch Zugabe von 240 μg Natrium-meta- Verdauungssystem gehörenden Organen, Patienten mit bisulfit Das erhaltene Produkt ¹²⁵J-CEA wird vom nichtmalignen Krankheiten der Verdauungsorgane und restlichen nichtreagierten ¹²⁵Jod durch Chromatogra- Patienten mit nichtenterischen, nichtneoplastischen phie an einer Dextrangelsäule abgetrennt. Das Produkt 40 Zuständen erhalten worden war.
hat eine spezifische Aktivität von etwa 5 ιτιμ Ci/ng. Bei 36 Patienten mit einem Adenokarzinom entweder

des Colon oder des Rektum, die zu der Zeit untersucht Beispiel 5 worden waren, als bekannt wurde, daß im Körper

u . 11. „πι , κ 1- ■ Tumorgewebe vorhanden sei, wurde bei allen außer

Herstellung von Blutproben fur eine _Α$ ^_&m |_{emm funden daß $je erkennbare M von}

Radio.mmunprufung zirkulierendem CEA aufweisen. Das einzige erkannte

Man fügt 5 ml einer 2,0 m-Perchlorsäure zu je 5 ml falsche negative Resultat, das bis heute registriert

Serum, das von Blutproben von 200 Menschen erhalten wurde, fand man bei einem Patienten, mit einem

worden war. Das Gemisch wird 20 Minuten bei lokalisierten, aggressiven polyähnlichen Adenokarzi-

Raumtemperatur gerührt. Der erhaltene Niederschlag 50 nom des Querdarmr, das das CEA am Eindringen in das

wird durch Zentrifugieren in einem Rotor mit festem zirkulatorische System hindert. Bei einer Operation

Winkel bei 9000 g während 10 Minuten bei 4⁰C entfernt. fand man, daß dieser Patient eine Darmverschlingung

Das erhaltene Sediment wird verworfen und das des Dickdarms mit einer zirkulatorischen Schädigung

Überstehende 24 Stunden gegen kaltes Leitungswasser hatte.

und dann zusätzliche 24 Stunden gegen wiederholte 55 Der niedrigste positive Wert wurde bei einem Serum

Wechsel destillierten Wassers bei 4° C dialysiert. Der eines Patienten mit einem malignen Dickdarmtumor mit

dialysierte Rückstand wird dann zu einem trocknen einem Wert von 3 ng/ml registriert. Man erhielt keine

Pulver lyophylisiert. falschen positiven Ergebnisse. Patienten, die eine Colon-

oder Rektumkarzinomoperation durchgemacht hatten Beispiele 60 und die keinen Befund eines restlichen oder wiederkeh-

D.««™„nrii(„n.j.,rci renden Tumorwachstums zeigten, hatten kein erkenn-

Rad.o.mmunprüfungdesCEA _{barej zirku}|_{iercndcs CEA} ,*_sieben F_{ällen in denen}

Während dieses Verfahrens wird normales menschli- sowohl vor als auch nach der Operation Blutproben ches Serum mit Borat-Puffer (lonenstärke 0,1, pH 8,4) entnommen worden waren, blieben die postoperativen auf 1 :100 verdünnt, und es werden diese Zubereitungen 65 Werte des Serum-CEA nur bei einem einzigen Patienten als Verdünnungsmittel für das Anti-CEA-Antiserum, das mit einem Metastasenbefund bei der Operation erhöht, aus Ziegen nach dem Verfahren des Beispiels 3

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch: Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von carcinoembryonalen Antigenen im Blut, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensstufen:

a) Zusatz einer abgemessenen Menge von Anti-CEA-Anliserum zu einer Probe von mit Perchlorsäure extrahiertem Blutserum,^

b) Inkubieren des Gemisches,

c) Zufügen einer abgemessenen Menge von radioaktiv markiertem CEA zum inkubierten Gemisch,

d) Inkubieren des Gemisches,

e) Zusatz eines Proteinfällungsmittels zum inkubierten Gemisch, wobei alle CEA-Anii-CEA-Komplexe copräzipitiert werden, und

f) Messen der Radioaktiviiäi des Copräzipiiates oder d«is Oberstandes.

wobeizurHerstellungdesradioaktivmarkiertenCEA reines CEA verwendet wird, das ein Molekulargewicht von etwa 200 000 und ein Absorptionsmaximum bei 280 nm aufweist, das mit seinem spezifischen Antikörper in nicht absorbiertem Antiserum beim Geldiffusionstest eine einzige Präzipilatipnslinie bildet und das wie folgt erhältlich ist: g) Homogenisieren eines Adenokarzinomgewe-

bes auf Verdauungssystemepitheltumoren, h) Behandlung des Homogenisates mit einem

Glycopnv.ein-Lösungsmitiel, i) Abtrennung des Niederschlages und Klären der

erhaltenen Lösung,
j) Dialyse der geklärten Lösung, k) Konzentrieren des Dialysaii, I) Klären der erhaltenen Lösung, m) Trocknen der geklärten Lösung, n) Chromatographie des erhaltenen Materials an zwei verschiedenen Gelsäulen, von denen die erste ein Agarosegel mit etwa 4 Gew.-% Agarose und einer Teilchengröße von 40—190μ und die zweite ein hydrophilss wasserunlösliches quervernetztes Dextrangel darstellt,

o) Sammeln und Konzentrieren der Fraktionen des Eluats mit einem Absorptionsmaximum bei 280 nm und einem Molekulargewicht von etwa 200 000.

p) präparative Elektrophorese der gesammelten Eluate durch eine Blockelektrophorese, durchgeführt bei 300-500 V und etwa 2OmA mit Ferritin als Standard, Lösung des Aktivmaterials in einem Boratpuffer vom pH 8,2-9,2 und einer lonenslärke von 0,0125-0,10, und Verwendung eines wasserunlöslichen, hydrophilen, quervernetzten Dextrangels mit einer AusschluDgrenze von 5000, einer Wasseraufnahmekapazitäl von 2,5 ± 0,2 g/g Trockensubstanz und einer Korngröße von 20-80 μ als elektrophoreiisches Tragermaterial, und
r) Sammeln derjenigen Fraktionen, die bei der Elektrophorese von der Starlzone etwa 10—14 cm in anodischer Richtung gewandert sind, wenn gleichzeitig Ferritin vom Kathodenende 18 cm in anodischef Richtung wandert.