CH615439A5 - - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines menschlichen carcinoembryonalen Antigens (im folgenden auch CEA genannt).
Das CEA kann erfindungsgemäss aus Adenokarzinomge-webe aus primären oder metastatischen Tumoren des Verdauungssystemepithels, das sich von embryonalem, endodermalem Gewebe ableitet, isoliert werden. Die Isolierung des Antigens aus dem Homogenat von allen Begleitsubstanzen kann durch bekannte chemische und physikalische Extraktions- und Reinigungsverfahren erreicht werden. Der Nachweis der Identität der schliesslich isolierten Fraktion als CEA kann mittels verschiedener bekannter Techniken erbracht werden, zum Beispiel durch zweidimensionale Agargeldiffusion, durch Immunoelektrophorese, Hämagglutination, passive kutane Anaphylaxie und dergleichen.
Um diese Techniken anwenden zu können, muss die Spezifität der verwendeten Antikörper für CEA nachgewiesen werden.
Antikörper, die dieses Kriterium erfüllen, können durch immunologische Toleranz- oder Absorptionstechniken gewonnen werden.
Bei der Absorptionstechnik wird das Antitumorantiserum von normalem Gewebe absorbiert, um antinormale Komponenten des Antiserums zu entfernen. Zurückbleibende Antikörperaktivität des absorbierten Antiserums, die gegen das Tumormaterial gerichtet ist, wird dann als tumorspezifisch bezeichnet. Dieses Verfahren ist nicht fehlerfrei, da die Möglichkeit besteht, dass tumorspezifische Antikörper entfernt oder durch normale Gewebekomponenten inaktiviert werden können, die ähnlich, jedoch nicht identisch sind mit den Tumorantigenen, die ursprünglich die Antikörperbildung anregten.
Bei der immunologischen Toleranztechnik werden Tiere während des Neugeborenenlebensabschnittes gegen normale Gewebe immunologisch tolerant gemacht. Die toleranten Tiere werden dann mit Tumorpräparaten der gleichen Spenderarten immunisiert. Wo eine angemessene Unterdrückung der Immunreaktion gegen normale Gewebebestandteile beobachtet werden konnte, ist die Entwicklung von für den Tumor anscheinend spezifischen Antikörpern erreicht worden. Beim Studium des menschlichen Krebses eröffnet diese Technik eine mögliche Fehlinterpretation, da das normale und das Tumorgewebe von verschiedenen Spendern stammen. Wenn jedoch Gewebeextrakte verwendet werden, ist dieses Problem nicht signifikant, da alle Extrakte im wesentlichen ähnlich sind.
Es wurde nun gefunden, dass Tumorgewebe von Adenokarzinom und normales Colongewebe des gleichen Individuums verwendet werden kann, weil sich ein Colonkarzinom im allgemeinen praktisch niemals submukös mehr als 6-7 cm auf jeder Seite eines sichtbaren Tumors ausdehnt.
Das Tumorgewebe des Colonadenokarzinoms und normales Colongewebe des gleichen Individuums werden zwar getrennt, jedoch in gleicher Weise behandelt. Das Gewebe wird gemahlen, in einem Puffer suspendiert und dann homogenisiert. Aus dem Homogenat werden dann feste Teilchen, die grösser als 0,22 [i, sind und worunter alle Bakterien fallen, entfernt. Dies geschieht vorzugsweise durch Zentrifugieren oder Filtrieren durch allmählich kleiner werdende Filteröffnungen.
In geeignete Gruppen eingeteilte Versuchstiere werden dann mit den Extrakten immunisiert. Nach einem geeigneten Zeitintervall entnimmt man den Tieren ein Serum. Das Vorliegen von Antikörpern in den Seren kann entweder durch die Ouchterlony-Technik der zweidimensionalen Agargeldiffusion durch Immunoelektrophorese, durch Hämagglutinationsreak-tionen oder durch passive kutane Anaphylaxie bewiesen werden. Bevorzugt in der Praxis ist wegen ihrer Einfachheit und ihrer reproduzierbaren Ergebnisse die Ouchterlony-Technik.
Ist die Anwesenheit von Antikörpern bewiesen, dann ist es möglich, zu untersuchen, ob es tatsächlich eine besondere
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Extraktionstechnik gibt, mit der eine CEA-Fraktion isoliert werden kann.
Es wurde nun eine Extraktions- und Reinigungsmethode gefunden, die eine Fraktion liefert, die bei Anwendung der Ouchterlony-Technik stets eine Präzipitationslinie erzeugt, wenn gegen den für CEA spezifischen Antikörper oder gegen nicht absorbierte Antiseren geprüft wird.
Wie oben angegeben, wird das CEA erfindungsgemäss aus primären oder metastatischem Adenokarzinomgewebe des Verdauungssystemepithels, das sich von embryonalem ento-dermalem Gewebe ableitet, isoliert und gereinigt. Erfindungsgemäss kann man das CEA auch aus embryonalen Verdauungsorganen von Föten im zweiten bis siebenten Schwangerschaf tsmonat isolieren und reinigen. Die nachstehende Beschreibung ist auf die Extraktion von Krebsgewebe gerichtet, jedoch kann das Verfahren auch auf embryonales Gewebe angewendet werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von CEA ist durch die folgenden Verfahrensstufen charakterisiert:
a) Homogenisieren eines Adenokarzinomgewebes von Tumoren des Verdauungssystemepithels,
b) Behandlung des Homogenats mit einem Glycoprotein-Lösungsmittel,
c) Abtrennunf des Niederschlages und Klären der erhaltenen Lösung,
d) Dialyse der geklärten Lösung,
e) Konzentrieren des Dialysats,
f) Klären der erhaltenen Lösung,
g) Trocknen der geklärten Lösung,
h) Chromatographie des erhaltenen Materials an zwei verschiedenen Gelsäulen, von denen die erste ein Agarosegel mit etwa 4 Gew.% Agrose und einer Teilchengrösse von 40-190u. und die zweite ein hydrophiles wasserunlösliches quervernetz-tes Dextrangel darstellt,
i) Sammeln und Konzentrieren der Fraktionen des Eluats mit einem Absorptionsmaximum bei 280 nm und einem Molekulargewicht von etwa 200 000,
j) präparative Elektrophorese der gesammelten Eluate und k) Sammeln derjenigen Fraktionen, die bei der Elektrophorese von der Startzone etwa 10-14 cm in anodischer Richtung gewandert sind, wenn gleichzeitig Ferritin vom Kathodenende 18 cm in anodischer Richtung wandert.
Das CEA enthaltende Gewebe wird zweckmässig mit einer für die Solubilisierung des gesamten vorhandenen CEA ausreichenden Menge Wasser homogenisiert. Im allgemeinen ist eine grössere Menge als etwa 2 Liter Wasser pro Kilogramm Gewebe nicht erforderlich.
Das Homogenat wird mit einem Glycoprotein-Lösungsmit-tel und damit CEA-lösenden Mittel, behandelt. Dies ist erforderlich, damit präzipitierbare normale Proteine und störende antigenische Materialien vom CEA-Material abgetrennt werden können. Hierfür geeignete Glycoprotein-Lösungsmittel sind zum Beispiel Perchlorsäure, Trichloressigsäure, Phosphorwolframsäure und dergleichen, wobei Perchlorsäure bevorzugt wird.
Jede Temperatur von Raumtemperatur und darunter ist für die Zugabe des Glycoprotein-Lösungsmittel zum Gewebeho-mogenat geeignet. Vorzugsweise arbeitet man bei Raumtemperatur, d. h. bei 20-25°C. Die Temperatur des Glycoprotein-Lösungsmittels, das dem Gewebehomogenat zugefügt wird, kann ebenfalls variieren; auch hier wird Raumtemperatur bevorzugt. Im allgemeinen wird eine konzentrierte 0,5-2 N, insbesondere 2 N Säure bevorzugt. Dem Homogenat wird zweckmässig innerhalb von 10-30 Minuten etwa die gleiche Volumenmenge Lösungsmittel zugefügt. Ein langsamerer Zusatz kann zum Verlust der Antigenwirksamkeit führen.
Man erhält ein Präzipitat, das vom Überstand, der das gelöste CEA enthält, nach einem der üblichen Verfahren wie z. B. Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt werden kann. Zur Abtrennung wird Zentrifugieren bevorzugt, i.a. bei etwa 3000-8000 U/min. Es wird vorzugsweise bei niedrigen Temperaturen, etwa 4-10°C, zentrifugiert.
Zur weiteren Reinigung, d. h. zur Entfernung niedermolekularer Substanzen, wie Perchlorsäure oder Salzen, wie Natriumchlorid, hat sich die Dialyse gegen Wasser als am geeignetsten erwiesen. Die Dialyse ist ein kritischer Teil des Verfahrens, da durch sie alle diffusionsfähigen löslichen Substanzen mit Ausnahme der Substanzen von höherem Molekulargewicht, wozu auch die CEA-Fraktion gehört, entfernt werden. Sie kann zuerst mit Leitungswasser während etwa 24-48 Stunden und dann mit kaltem destilliertem Wasser bei Temperaturen von etwa 4-10°C durchgeführt werden. Jedoch ist es auch möglich, nur destilliertes Wasser zu verwenden. Das Dialyseverfahren nimmt insgesamt etwa 48-96 Stunden in Anspruch.
Die trübe Lösung, die nach der Dialyse zurückbleibt, wird konzentriert. Die Methode der Wahl ist die Gefriertrocknung, obgleich auch andere Verfahren in Frage kommen wie z. B. Sprühtrocknung. Das bevorzugte Verfahren besteht darin, dass das Material zuerst in Schalen gefroren und dann lyophylisiert wird, was insgesamt etwa 32-36 Stunden in Anspruch nimmt. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäs-sen Verfahrens wird jedoch, um Zeit zu sparen, die Lyophyli-sierung nach etwa 24-30 Stunden abgebrochen, so dass das Produkt noch nicht vollständig trocken ist.
Das nicht ganz bis zur Trockne lyophylisierte Material kann dann bei Raumtemperatur oder höherer Temperatur, wie etwa 37°C, aufgetaut werden. Es kann auch durch Verdünnen mit einer sehr geringen Menge Wasser aufgetaut werden. Danach können die zurückbleibenden Teilchen entfernt werden. Wird das Volumen auf einem Minimum gehalten, dann kann die Klärung durch Filtration und/oder Zentrifugieren erreicht werden. Alle Teilchen, die ein 0,22 (x-Filter nicht passieren können (d. h. bis zur Grösse der kleinsten Bakterien), werden so aus der Lösung entfernt.
Das bevorzugte Verfahren ist das des 15-45minütigen Zentrifugierens mit hoher Geschwindigkeit, d. h. mit etwa 14 000 bis 30 000, vorzugsweise mit etwa 14 000 U/min, bei Temperaturen bis zu etwa 10°C, vorzugsweise von 4-10°C. Höhere Temperaturen sind anwendbar, jedoch nicht zweckmässig, da sie die Sedimentation verzögern. Nach dem Sedi-mentieren ist es erforderlich, die überstehende Lösung weiter zu klären und zu sterilisieren. Dies kann man durch Filtrieren durch Filter erreichen, deren Porengrösse zwischen 1,2 und 0,20 variiert. Bevorzugt verwendet man Filter mit einer Porengrösse von 1,2 [x, 0,45 u, 0,22 u in der angegebenen Reihenfolge.
Das Filtrat wird getrocknet, vorzugsweise gefriergetrocknet. Die Abtrennung des CEA von anderen Substanzen des erhaltenen gefriergetrockneten Pulvers wird erfindungsgemäss durch subséquente Chromatographie an zwei verschiedenen Gelsäulen und anschliessende Elektrophorese erreicht.
Es wurde gefunden, dass die eluierten Fraktionen der Säulenchromatographie, die ein Molekulargewicht von etwa 200 000 und ein definiertes Absorptionsmaximum bei 280 nm besitzen, das CEA enthalten. Es wurde weiter gefunden, dass, wenn die das CEA enthaltenden Fraktionen bei pH 8,6 in einem Boratpuffer mit einer Ionenstärke von 0,05 einer Elektrophorese unterworfen werden, man ein charakteristisches Wanderungsbild erhält. Die Länge des zurückgelegten Weges hängt von der Stromstärke, der Spannung, vom Puffer, von dessen pH-Wert und dessen Ionenstärke ab. Bei einer Spannung von 400 V und einer Stromstärke von 20 mA wandert das CEA etwa 10-14 cm in anodischer Richtung während Ferritin (ein gefärbtes Protein) als Vergleichssubstanz in der gleichen
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Zeit 18 cm vom Kathodenende in anodischer Richtung wandert.
Die anschliessende Säulenchromatographie kann in der Weise durchgeführt werden, dass man das gelöste lyophilisierte Material an zwei verschiedenen Gelsäulen in beliebiger Reihenfolge chromatographiert. Zweckmässigerweise verwendet man eine Gelsäule aus Agarose-Gel, dem neutralen Anteil von Agar. Es wurde Gelmaterial der Firma AB Pharmacia, Uppsala (Schweden), das unter dem Warenzeichen «Sepha-rose» im Handel erhältlich ist, verwendet. Die Gele sind als wässrige Suspensionen in 0,02%igem Natriumazid als Schutzmittel erhältlich. Die Konzentration der Agarose im Gel bestimmt seinen Fraktionierungsbereich. Die zur erfindungsge-mässen Verwendung zweckmässigsten Gele besitzen eine Teilchengrösse von etwa 40-190 |.t und enthalten 4 Gew.% Agarose. Dieses als «Sepharose 4B» bezeichnete Material hat einen Fraktionierungsbereich von 3 X105 - 3 X106. Mit «Sepharose 4B» gelingt eine Anreicherung von CEA, da andere Verbindungen mit höherem oder niedrigerem Molekulargewicht wie auch kolloidale Teilchen abgetrennt werden.
Die andere Säule enthält zweckmässig ein hydrophiles, wasserunlösliches vernetztes Dextrangel. Ein solches Material wird von der Firma AB Pharmacia, Uppsala (Schweden), unter dem Namen «Sephadex» in den Handel gebracht. Die Fähigkeit des Gelmaterials, Wasser aufzunehmen, ist dem Vernetzungsgrad der Dextransubstanzen im Gelmaterial umgekehrt proportional. Das Gelmaterial ist in einer Vielzahl von Graden erhältlich, die sich im Hinblick auf den Porositätsgrad unterscheiden. Das bei der erfindungsgemässen Verwendung bevorzugte Gel hat eine annähernde Ausschlussgrenze von 200 000, ein Wasserretentionsvermögen von 20 ± 2,0 g H2Ü/g Trockensubstanz, eine Teilchengrösse von 40-120[i und ein Bettvolumen von 30-40 ml/g Trockensubstanz. Dieses Gel trägt die Bezeichnung «Sephadex G-200».
«Sephadex G-200» wird zweckmässig zur weiteren Reinigung der das CEA enthaltenden Fraktion verwendet. Die Sephadex G-200-Säule hat ein grösseres Auftrennungsvermögen für den Molekulargewichtsbereich von 150 000 bis 250 000 als die erstegenannte und sollte nur verwendet werden, nachdem die kolloidalen Teilchen durch die erste Säule entfernt worden sind, da diese Teilchen die Sephadex-Säule sonst verstopfen und sie unwirksam machen würden.
Die Säulenchromatographie wird beispielsweise folgender-massen durchgeführt: das lyophylisierte Material wird in einem wässrigen Puffer beim pH-Wert des isoelektrischen Punktes des CEA, d. h. bei pH 4,5 gelöst. Die Lösung wird auf die erste Säule aufgegeben. Die gesammelten aktiven Fraktionen des Eluats werden wie oben beschrieben, dialysiert, lyophilisiert, wiederum in einem wässrigen Puffer vom pH 4,5 gelöst und auf die zweite Säule gegeben. Die aktiven Fraktionen (Absorptionsmaximum bei 280 nm) werden nochmals dialysiert und lyophylisiert. Obwohl alle üblichen wässrigen Puffer geeignet sind, wird die Verwendung eines 0,9%igen Phosphatpuffers bevorzugt. Der Vorteil der Anwendung niedriger Temperaturen, d. h. von etwa 4-10°C, liegt darin, dass man ein verbessertes Auflösevermögen erreicht. Die aus der zweiten Säule gesammelten Fraktionen haben ein Molekulargewicht von 200 000 und ein Absorptionsmaximum bei 280 nm.
Die aktiven konzentrierten Fraktionen des Eluats der zweiten Säule werden schliesslich einer Elektrophorese beispielsweise in einem Puffer vom pH etwa 8,2-9,2 und einer Ionenstärke von etwa 0,0125-0,10, vorzugsweise in einem Boratpuffer vom pH etwa 8,6 und einer Ionenstärke von etwa 0,05 unterworfen.
Die Blockelektrophorese ist die bevorzugte Elektrophoresemethode, jedoch kann man andere Typen der Elektrophorese ebenfalls anwenden. Zweckmässig arbeitet man bei etwa 300-500 V, vorzugsweise bei 400 V mit etwa 20 mA. Bei dem bevorzugten Elektrophoreseverfahren wird geeigneterweise ein vernetztes Dextrangel, zum Beispiel «Sephadex G-25,
fein» verwendet, mit einer Anschlussgrenze von etwa 5000, einem Wasserretentionsvermögen von 2,5 ± 0,2 g H;OZg Trockensubstanz, einer Teilchengrösse von 20-80 u und einem Bettvolumen von 5 ml/g Trockensubstanz. Das Gel wird in dem Puffer angequollen und auf einem nichtleitfähigen Block, zum Beispiel «Lucite», angeordnet. Als geeigneter Standard kann zum Beispiel Ferritin verwendet werden, das am Kathodenende des Blocks aufgebracht wird. Nach etwa 24stündiger Elektrophorese wird der die CEA-Aktivität enthaltende Bereich entfernt. Unter den genannten speziellen Betriebsbedingungen ist das die Zone, die in anodischer Richtung 10-
14 cm vom Start entfernt ist. Das Ferritin ist in diesem Fall 18 cm in anodischer Richtung gewandert. Die CEA-Aktivität wird eluiert und das Material vorzugsweise durch Dialyse gegen destilliertes Wasser gereinigt. Man erhält ein Material, das im wesentlichen reines CEA ist. Dies wird entweder durch die Hemmung der Präzipitation oder unmittelbar durch die Ouchterlony-Prüfung gegen nicht-absorbiertes Tumor-Antise-rum gezeigt. Eine einzige Präzipitationslinie zeigt reines CEA an.
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Beispiel a) Isolierung der CEA-Fraktion
Es wird Tumorgewebe vom Adenokarzinom des Colons herausgeschnitten und möglichst viel normales Gewebe entfernt. Das restliche Tumorgewebe wird durch einen Fleischwolf gedreht und in 1000 g-Mengen bei — 20°C gelagert. 1000 g des zerkleinerten Gewebes werden mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 4000 ml suspendiert und eine Stunde in einem wassergekühlten Homogenisator bei
15 000 U/min zerkleinert. Unter ständigem Rühren fügt man bei 4°C langsam ein gleiches Volumen 2N Perchlorsäure zu, rührt das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur und zen-trifugiert dann 30 Minuten bei 4°C mit 6000 U/min in einer gekühlten Zentrifuge. Das Überstehende wird entfernt und in einen flachen, etwa 7,6 cm weiten Dialysierschlauch gegeben, der zuvor 1 Stunde in destilliertes Wasser getaucht wurde, um ihn geschmeidiger zu machen. Es wird 48 Stunden gegen kaltes Leitungswasser und weitere 48 Stunden gegen destilliertes Wasser bei 4°C dialysiert. Der dialysierte Rückstand wird nicht ganz bis zur Trockne lyophylisiert, aufgetaut und die erhaltene Lösung in einer gekühlten Zentrifuge bei 4°C 30 Minuten mit 14 000 U/min zentrifugiert. Das Überstehende wird entfernt und nacheinander durch Membranfilter von 1.2, 0,45 und 0,22 u. Porengrösse filtriert. Die geklärte Lösung wird in Schalen gefroren und zur Trockne lyophylisiert.
1,5 g des getrockneten rohen Extraktes löst man in 50 ml eines 0,05 m NaHzPO-t-Puffers (pH 4,5) in normaler Salzlösung. Der Phosphat-Salz-Puffer vom pH 4,5 dient bei allen nachfolgenden Säulenchromatographien als Elutionsmittel. Die Probe wird dann über eine Säule (Pharmacia K 100/100 (100 cm X 10 cm) mit einer Bettlänge von 90 cm) mit Sepharose 4B gegeben. Die Temperatur wird auf 4-5°C gehalten. Die Durchflussgeschwindigkeit beträgt 150 ml/Stunde. Man sammelt 25 ml-Fraktionen, deren Absorption bei 280 nm gemessen wird. Die aktiven Fraktionen erscheinen nach 4750 ml im Eluat. Die aktiven Fraktionen (750 ml) werden vereinigt, 48 Stunden bei 4°C gegen destilliertes Wasser dialysiert, in Schalen gefroren und lyophylisiert.
200 mg des erhaltenen getrockneten Materials werden dann in 10 ml des Standard-Puffers gelöst und an Sephadex G-200 chromatographiert. (Säule Pharmacia K 50/100 ( 100 cm X10 cm) mit einer Bettlänge von 90 cm). Die Temperatur wird auf 4°C gehalten. Bei einer Durchflussgeschwindigs
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keit von 40 ml/Stunde werden 10 ml-Fraktionen gesammelt und bei 280 nm in einem Spektrophotometer gemessen. Die aktiven Fraktionen (190 ml) erscheinen nach 820 ml im Eluat, werden vereinigt, 48 Stunden bei 4°C gegen destilliertes Wasser dailysiert, in Schalen gefroren und lyophylisiert. s b) Reinigung des isolierten CEA-durch Blockelektrophorese Das Blockelektrophoresematerial Sephadex G-25, fein, wird io zwei Stunden bei 80°C in Wasser gequollen, mit Borat-Puffer (pH 8,6; Ionenstärke 0,05) gewaschen und dann durch eine gesinterte Glasplatte unter Anwendung von Unterdruck filtriert.
Man verteilt eine Gelaufschlämmung gleichmässig auf einem 15 Lucite Blockträger (Masse 61X 7,5 X1 cm) und behandelt die Oberfläche mit einem Wattebausch, bis sie fest aber nicht vollständig trocken ist. Der Block wird dann mit Chromatographiepapierkontakten (3 mm), die alle in Fliessrichtung des Papiers ausgerichtet sind, versehen und eine Stunde unter den 20 Betriebsbedingungen (400 V und etwa 20 mA) bei 4°C äquilibriert. Dann entfernt man von der Mitte des Blocks einen Streifen von 1 cm, vermengt das Material gut mit 60 mg trok-kenem CEA aus Abschnitt a), das zuvor mit einer möglichst geringen Menge (etwa 0,5 ml) von 0,05 m Boratlösung gelöst 25
wurde. Der erhaltene Brei wird in den Mittelstreifen zurückgegossen. Dann tupft man 1—2 Tropfen einer Ferritinlösung (6X umkristallisiert; Konzentration 100 mg/ml) auf das Kathodenende des Blocks und beginnt die Elektrophorese. Nach 24 Stunden hat sich der Ferritin-Standard etwa 18 cm in anodische Richtung bewegt. Nach beendeter Elektrophorese werden aus dem Block Streifen von 2 cm zwischen der Startzone und dem Anodenende geschnitten. Die Hauptaktivität wird in einer Entfernung von 10-14 cm von der Startzone in anodischer Richtung lokalisiert; eine schwächere Aktivität lässt sich in einer Entfernung von 8-10 cm nachweisen.
Jeder aktive Streifen wird mit 2 m NaCl-Lösung, die vorher eine 0,20 11 Membran passieren musste, eluiert und das Eluat 48 Stunden bei 4°C mit destilliertem Wasser dialysiert. Das Dialysat wird in Schalen eingefroren und gefriergetrocknet. Das getrocknete, gereinigte CEA wird unter vermindertem Druck über Calciumchlorid bei 4°C gelagert. Das Produkt hat die folgenden charakteristischen Eigenschaften:
Es bildet eine einzige Präzipitationslinie mit nicht-absor-biertem Antiserum bei Geldiffusionsprüfungen; ist in Perchlorsäure löslich; wandert bei der Blockelektrophorese anodisch 10-14 cm, wobei gleichzeitig ein Ferritin Standard anodisch 18 cm wandert (Borat-Puffer von pH 8,6 und einer Ionenstärke von 0,05, Spannung 400 V, Stromstärke 20 mA); Molekulargewicht 200 000; Absorptionsmaximum bei 280 nm.
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Claims (10)
1. Verfahren zur Herstellung eines menschlichen carcinoem-bryonalen Antigens (CEA), gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensstufen:
a) Homogenisieren eines Adenokarzinomgewebes aus Ver-dauungssystemepitheltumoren,
b) Behandlung des Homogenisats mit einem Glycoprotein-Lösungsmittel,
c) Abtrennung des Niederschlages und Klären der erhaltenen Lösung,
d) Dialyse der geklärten Lösung,
e) Konzentrieren des Dialysats,
f) Klären der erhaltenen Lösung,
g) Trocknen der geklärten Lösung,
h) Chromatographie des erhaltenen Materials an zwei verschiedenen Gelsäuren, von denen die erste ein Agarosegel mit etwa 4 Gew.% Agarose und einer Teilchengrösse von 40-190 n und die zweite ein hydrophiles wasserunlösliches quer-vernetztes Dextrangel darstellt,
i) Sammeln und Konzentrieren der Fraktionen des Eluats mit einem Absorptionsmaximum bei 280 nm und einem Molekulargewicht von etwa 200 000,
j) präparative Elektrophorese der gesammelten Eluate und k) Sammeln derjenigen Fraktionen, die bei der Elektrophorese von der Startzone etwa 10-14 cm in anodischer Richtung gewandert sind, wenn gleichzeitig Ferritin vom Kathodenende 18 cm in anodischer Richtung wandert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass in Stufe b) 0,5-2N Perchlorsäure verwendet wird.
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PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
dass 2 N Perchlorsäure verwendet wird.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass in Stufe c) die Abtrennung des Niederschlages und die Klärung der erhaltenen Lösung durch Zentrifugieren erfolgt.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass in Stufe d) gegen Wasser dialysiert wird.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass in Stufe e) die Konzentrierung durch 24 bis 30stündiges Lyophylisieren bis nicht ganz zur Trockne erfolgt.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass in Stufe f) die Lösung durch Ultrazentrifugieren mit 12000-16000 U/min und anschliessende Filtration durch Filter mit sukzessive von 1,2 n auf 0,20 li abnehmender Porengrösse geklärt wird.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass in Stufe g) die geklärte Lösung in Schalen gefroren und lyophylisiert wird.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass man in Stufe h) das erhaltene Material zwecks Chromatographie an der Agarosegelsäule in einem wässrigen Puffer von pH 4.5 löst, die Fraktionen des Eluates mit einem Absorptionsmaximum bei 280 nm und einem Molekulargewicht von etwa 200 000 sammelt, dialysiert, lyophylisiert und zwecks Abtrennung von noch vorhandenem Material mit höherem oder niedrigerem Molekulargewicht als CEA an der Dextrangelsäule, die ein höheres Trennvermögen besitzt als die Agarosesäule, in einem wässrigen Puffer vom pH 4,5 löst.
10. Verfahren nach den Ansprüchen 1-9. dadurch gekennzeichnet, dass man in Stufe j) eine Blockelektrophorese bei 300-500 V und etwa 20 mA durchführt, Ferritin als Standard verwendet und das aktive Material in einem Boratpuffer vom pH 8,2-9,2 und eine Ionenstärke von 0,0125-0,10 löst.
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