DE2029499A1 - Carcinoembryonales Antigen und Verfahren zu einer Gewinnung - Google Patents
Carcinoembryonales Antigen und Verfahren zu einer GewinnungInfo
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Description
DR. ING. A. VAN DER WERTH DR. FRAN Z LE DE RE R
21 HAMBURG 90 8 MÖNCHEN 80
MÜnehsn, 15» Juni 1970
h/B
F. Hoffmann-la Rooha & Co. Aictiengeselischaffc* Basel, Schweiz
Antigen und Verfahren zu seiner Ü-ewinnung
Der neopiastische Preseß beim Menseiien war und ist noch
stand intensiver Porscliungo Um ein besseres Verständnis der
Krankheit 2u erhalten* ist aansciiliches Krebsgewebe eingehend
untersucht worden, im dis Ursache, die Behandlung, die ¥erhütung
und Vorbeugung und/oder eine Krebsdiagnose 2su entdecken. Eine
Frühdiagnose des Krebses ist sehr wichtig9 da sie die Chancen
erhöht, eine vollständige Heilung der Krankheit zn
Beim Bemühen, bekannte diagnostische Mitt}«l zu verwenden,
um das Vorliegen von Krebstumoren au entdecken,'sind Versuche
unternommen worden, tumorspe2ifische Antigene beim menschliehen
Karzinom nachzuweisen* Diese Versuche sind bisher nicht erfolgreich gewesen, da es nicht möglich war8 normale öewebeantigene
aus abnormalen Krebsantigenen abzutrennen und nachzuweisen, daß die ICrebsantlgene spezifisch sindo
Bei den Versuchen, abnormale Kr©l>santigene zu isolieren und ihre
spezifische Wirksamkeit aufzuzeigen, wurden Versuche unternommon?
109851/1800
τ·. Ρ
die Bildung von tumorspezii'ischen Antikörpern zu verursachen und
ihr Vorhandensein in Seren zu zeigen, die von Sieren erhalten
worden sind, die mit menschlichen Krebspräparaten immunisiert
worden sind,, Wenn sie entsprechend reproduzierbar wären9 würde
der Beweis für das Vorhandensein von tumorspessifisehen Antikörpern in tierischen Antiseren zur Anwendung eines wertvollen diagnostischen Instruments führen o
Um die Existenz von tumorspezifisehen Antikörpern in tierischen
Antiseren als ein diagnostisches Mittel voll zu nutzen 9 muß
ein 'rest entwickelt werden, der das Vorhandensein des Tumoranti=*
gens im Blut des Patienten beweisto Früher vorgeschlagene Ver=*
fahren haben sich bei der Entdeckung eines Karzinoms das Verdauungssystems als nicht brauchbar oder als nicht wirksam erwiesene
Unter den menschlichen Karzinomen» die von den Forschern am gründlichsten untersucht worden sind, ist das Adenokarzinom des Colon
k-gin Vun den
und des Verdauungstrakts, da die^ am weitest verbreiteten Krebsgeschwüren
ist und für gewöhnlich einen chirurgischen Eingriff für eine definitive Diagnose erfordert, nachdem sine
grobe Symptomatik entwickelt worden ist»
Frühere Bemühungen, ein mit dem Colonkarzinom vergesellschaftetes
Antigen zu extrahieren^ sind nicht erfolgreich gewesen 9 da es
nicht möglich war, es vollständig von normalen Gewebeantigenen abzutrennen. Es ist tatsächlich nicht bewiesen worden9 daß sin
solches Antigen wirklich existiert«
Die Erfinder haben jedoch die Anwesenheit von Antigenen, die für
Adenokarzinome des Colon und des Verdauungssystems spezifisch sind, mittels immunologischer Toleranz·und Absorptionstechniken
bewiesen (Gold et alo in JDExptleMedo 12tt (1965)« Selten 459 bis
4-62) o Jedoch ist die praktische Isolierung des Antigens selbst
bis jetzt noch nicht erreicht worden*
Es ist nun gefunden worden, daß diese tumorspezifischen Antigene
nur bei Patienten vorhanden sind? die ein Adenokarzinom haban,
das im Verdauungssystemepithel entsteht, das sieh vom embryonalen
entodermalen Gewebe ableitet, do hu Ösophagusj Magena Duodenum*
Pancreas und Hektumo ........ ,
109851/1800 ,,, V
BAD ORiGiNAL
Es ist von den Erfindern früher auch nachgewiesen worden, daß das
tumorepezifische Antigen ebenfalls in den Verdauungsorganen von
Feten zwischen dem s?/eiten und sßchsten Schwangerschaftsmonat
vorhanden ist (Gold et al« in J,ExptloKedo 122 (1965), Seiten
467 bis 48?)ο Deshalb wurde dieses Antigen der Einfachheit halber
als carcinoeiabryonaleß Antigen (im folgenden kura ale GEA bezeichnet) des menschlichen Verdauungssystems bezeichnet»
1Es ist bisher nicht nur nicht möglich gewesen? das CEA zu isolieren und zu charakterisierenf sondern es war auch nicht mögliehs
sein Vorhandensein im Blut von I^ersonen aufzuzeigen, die ein
Adenokarzinom des Colon haben^ und zwar aus dem Grunde, v/eil sich
die im Hinblick auf das GEA gebildeten Antikörper mit dem CEA zu einem Komplex vereinigen, so daß deshalb das Antigen aus desi
Blut entfernt wird* Deshalb mußten Verfahren ausgearbeitet werden» den Antikörper-Antigen-Komplex ohne Veränderung der antigenentscheidenden
Regionen zu zerstöx-eno Wenn dies erreicht worden
istg war es weiterhin erforderlich, ein Markierungsmittel für- GEA
zu finden? so daß es entdeckt werden kann*
Nach vorliegender Erfindung hat man nun gefunden
(a) das CEA und Verfahren zu seiner Isolierung Reinigung und
Bestimmung seiner Identität und spezifischen Wirksamkeit9
(b) Verfahren zur Gewinnung spezifischer Antikörper für CEA5
(c) Verfahren zur Markierung von GEA und das neue markierte CEA,
(d) Verfahren 2ur Anwendung des markierten CEA, um das Vorhanden·=
sein des Adenokarzinoms su entdeckenf seinen Ursprung im Verdauungssystemeplthel
hat, das sich vom embryonalen entodermalen
Sewebe ableitet und
(e) Verfahren zur Behandlung von Serum, die CEA-Antl-CEA-Komplexeauf
zuspalt-enc
Das GEA wird isoliert und gereinigt durch Homogenisieren von
Adenokarzinomgewebe aus primären oder metastatischen Tumoren? die
ihren Ursprung im Verdauungssystem haben«
Um das mit dem homogenisierten Tumorge^ebe vergesellschaftete ·
Antigen zu isolieren, ist es erforderlich., alle anderen Substanzen
aus dem Homogenisat abzutrennen» Dies erreicht man durch «hemi=·
sehe und physikalische Extraktions- und Reinigungsverfahren?
1 0 98 B1/1800
w» Λ «s*
Wenn die Extrakt ions*= und Reinigungsverfahren beendet sind$ muß
die Identität der isolierten Fraktion als GEA bestätigt werden*,
Dies wird mittels verschiedener bekannter Techniken erreicht,
zum Beispiel doppelte Diffusion an Agargel, Xmniunoelektrophorese.4,
Hämagglutinations, passive kutane AnaphyXaxie und dergleichen
Um diese Techniken anzuwenden, muß bei den verwendeten Antikörpern
nachgewiesen v/erden, daß si© für CEA spezifisch sind« Antikörper...
die mit diesem Kriterium übereinstimmen 9 können durch immunologische Toleranz=· oder Absorptionstechniken gewonnen werden*
Bei der Absorpttonsteohnik wird das Antitumorantiserum an normalem
Gewebe absorbiert» um antinormale Komponenten des Antiserums zu
entfernen« Zurückbleibende Antikörperaktivität bei dem absor« bierten Antiserum9 das gegen das Tumormaterial gerichtet ist,
wird dann als tumorspezifisch bezeichnet„ Dieses Verfahren ist
nicht fehlerfrei* da die Möglichkeit besteht 9 daß tumorspezifi·=
sehe Antikörper entfernt oder durch normale G-ewebekomponenten
inaktiviert werden können» ähnlich den ·=· ,jedoch nicht mit ihnen
identischen ■= Tumorantigenen* die ursprünglich die Antikörper»
bildung anregtenο
Bei der immunologischen Toleranztechnik werden Tier© während des
Neugeborenenlebensabschnittes gegen normale Gewebe immunologisch widerstandsfähig (tolerant) gemacht« Die widerstandsfähigen
Tiere werden dann mit Tumorpräparate» der gleichen Spenderarten immunisierte Wo eine entsprechende Unterdrückung der immunen
Reaktion gegen normale Gewebebestandteile erreicht worden ists
ist die Entwicklung von für den Tumor anscheinend spezifischen
Antikörpern erreicht wordene Bei Studien von menschlichem. Krebs
eröffnet diese Technik eine mögliche Fehlinterpret^tion, da die
Quellendes normalen und des Tumormaterials verschiedene Spender
sindo Wenn jedoch Extrakt© von Geweben verwendet werdenf ist
dieses Problem nicht signifikant9 da all© Extrakte im wesent»
liehen ähnlich sind«
Es wurde nun gefunden, daß Tuaorgewebe vom Adenofearziaoa und
norjnales Colongewebe von dem gleieliea Individuum verwendet werden können, weil sich ein Golonkarsinom praktisch niemals sub- · ■
mukös mehr als 6 - 7 cm auf Jeder Seite eines sichtbaren Tumors -
109851/1800
im allgemeinen ausdehnte
adf no
Das Tumorgewebe des Colorlcarzinams und normales Colongewebe von
dem gleichen Individuum werden zwar getrennt, jedoch in paralleler Weise behandelt» Das Gewebe wird gemahlen, in eine» puffer
suspendiert und dann homogenisiert«. Das Homogenisat wird dann zur.Entfernung fester Teilchen behandelt. Ein Zentrifugieren
oder filtrieren durch allmählich kleiner werdende Filteröffnungen werden bevorzugte Dies erfolgt zu dem Zweck, alle Teilchen
von etwa 0,2-2 u oder größer zu entfernen, wobei alle Bakterien
gleichzeitig mit entfernt werden« Das Überstehende oder das Flltrat wird dadurch sterilisiert zur Sicherung gegen bakterielle Verseuchung» .
In geeignete Gruppen eingeteilte Versuchstier© werden dann mit den Extrakten immunisiert, und nach einem geeigneten Zeitintervall nimmt man von den Tieren ein Serum.» Das Vorliegen von
Antikörpern in den Prüfseren wird entweder durch die Ouchterlony-Technik einer doppelten Diffusion in Agargel, durch Immuno=
elektrophorese, durch Hämagglutinationsreaktionen oder durch
passive kutane Anaphylaxie bewiesen. Die bevorzugte praktische Methode ist wegen ihrer Einfachheit und reproduzierbaren Ergebnisse die Ouchterlony-Techniko
Wenn man die Anwesenheit von Antikörpern bewiesen hat, ist es
möglich, dft* Antigen! zu bestimmen, wenn tatsächlich eine be«
sondere Extraktionstechnik eine Fraktion isolieren läßt, die GEA enthalte '
Es wurde eine Extrakt ions- und .Reinigungstechnik gefunden, die
eine Fraktion ergibt, die stets eine fräzipitationelinie bei
der OuchterlonyrTechnik erzeugt, wenn sie gegen den Antikörper
geprüft wird, der für OEA spezifisch ist, oder wenn sie gegen nicht absorbierte Antiseren geprüft wird»
Wie oben angegeben worden ist, wird das OEA nach vorliegender Erfindung aus primärem oder metastatischem Adenokarzinomgewebe
isoliert und gereinigt, das seinen Ursprung im Verdauungssystemepithel
hat, das sich von embryonalen entodermalen Zellen able!»
Man kann das GEA nach vorliegenfer Erfindung auch aus em-10 9851 /1 80T)
bryonalen Verdauungsorganen von Feten im zweiten bis' siebenten Schwangerschaftsmonat isolieren und reinigen, Die nachstehende
Beschreibung ist auf die Extraktion von Krebsgewebe gerichtet, jedoch kann das Verfahren auch auf embryonales Gewebe angewendet werdenα
CSA enthaltendes Gewebe, das entweder embryonales Gewebe aus
Verdauungsorganen aus dem ersten und zweiten Trimester oder - Adenokarzinoragewebe von Tumoren ist, das seinen Ursprung
innerhalb des Verdauungssystemepithel hat, wie oben beschrieben worden ist, wird mit einem Glycoprotein-Lösungsmittel extrahiert, in dem das CEA löslich ist ο Dies ist erforderlich,, so
daß fällbare normale Proteine und störende antigenische Materialien
vom CEA-Material getrennt werden können« Geeignete
Glycoprotein«Lösungsmittel sind zum Beispiel Perchlorsäure,
Trichloressigsäure, Phosphorwolframsäure und dergleichen.,
Perchlorsäure wird jedoch wegen ihrer leichten Verfügbarkeit und Anwendbarkeit bevorzugto
Das zu prüfende Gewebe wird mit Wasser homogenisiert, um das Antigen iu «olublliftiertn« Dia Menge des verwendeten Wassers
sollte ausreichend sein, um das gesamte CEA zu lösen» Im all«
gerneten sind etwa 2 Liter Wasser pro Kilogramm Gewebe ausreichend» Man kann mehr Wasser verwenden, jedoch ist dies im allgemeinen nicht erforderlich»
Eine beliebige Temperatur unterhalb Haumtemperatur ist für die Zugabe des Glycoprotein-Lösungsmittels zum Gewebehomogenisat
geeignet., Vorzugsweise wendet man jedoch Raumtemperatur, zürn
Beispiel 20 - 250C, an. Die Temperatur des Glycoprotein~Lö~
sungsmittels, das dem Gewebehomogenisat zugefügt wird, kann ebenfalls variieren, jedoch wird Raumtemperatur bevorzugt. Im
allgemeton wird eine konzentrierte Säure als Glycoprotein-Lösungsmittel
verwendet, beispielsweise von einer Konzentration von 0,5 η bis eiwä;2 nf wobei 2 η-Säure bevorzugt wirdo Das
Lösungsmittel wird in etwa dem gleichen Volumen zum Homogeniset
zugefügt« Die Zeit, in der dies erreicht wird, beträgt gewöhnlich etwa 10 - 30 Minuten« Längare Zeiten können zum Verlust
der Antigenwirksamkeit fütoen»
109 8-61/1800
Man erhält ein Präzipitat» Dieses Präzipitat wird von dem Überstehenden abgetrennt, das das gelöste CBA enthalt«. Man kann beliebige
übliche !'rennungeverfahren anwenden, wie Zentrifugieren,
!filtrieren oder dergleichen»
Man bevorzugt das Zentrifugieren, weil es schneller durchführbar ist und weil dabei eine ausreichende Kraft entwickelt werden
kann; um im wesentlichen alle festen Teilchen zu entfernen., Im
allgemeinen sind zum\Erreichen dieser »Ifirkung etwa 3000 bis
etwa 8000 Umdrehungen pro Minute (TJpM) ausreichende Dieses Zentrifugieren wird vorzugsweise bei niedrigen Temperaturen, wie
etwa 4 - 100C, durchgeführtP da bei diesen iemperaturen die
Sedimentationszeit wesentlich herabgesetzt wird«
Perchlorsäure, balze, wie Natriumchlorid, und andere Substanzen
von niedrigem Molekulargewicht werden dann entfernt, um das system weiter au reinigen,. Obwohl es möglich sein kann9 dies
durch Ausfällen der verbleibenden Proteine zu erreichen, hat man gefunden, daß eine Dialyse durch eine semipermeable Membran
gegen Wasser am geeignetsten ist α Die Dialyse ist ein kritischer Teil des Verfahrens, da sie alle diffusionsfähige- lösliche Substanzen mit Ausnahme der Substanzen von höherem Molekulargewicht, die die CEA-Praktion einschließen, entfernte Die
Dialyse kann zuerst mit Leitungswasser etwa 24 - 48 Stunden
durchgeführt werden»' Dann kann die nachfolgende Dialyse mit kaltem destilliertem Wasser bei Temperaturen von etwa 4 * 1O°G
durchgeführt werden» Jedoch ist es möglich, lediglich destilliertes Wasser bei der Dialyse zu verwenden, vorausgesetzt, daß
die Temperatur niedrig bleibt und daß das Wasser häufig gewechselt wird» Das vollständige Dialyseverfahren nimmt etwa
48 - 96 Stunden in Anspruch«
Die trübe Lösung, die nach der Dialyse zurückbleibt, wird dann getrocknet« Man kann ein Sprühtrocknen anwenden, jedoch ist
die Lyophylisierung das bevorzugte Verfahren, Wasser zu entfernen«
Es sind beliebige Lyophylisierungsverfahren geeignete Das
bevorzugte Verfahren besteht darin, daß das Material zuerst Schalen-gefroren und dann lyophylisiert wird« Dies nimmt etwa
32 ■- 36 Stunden für das zu lyophylisierende Produkt bis zur voll·=
109851/1800
BAD OBiGlNAL
00 O "*
ständigen Trockne in Anspruch« Bei einer bevorzugten Ausfuhr
rungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Jedoch die Lyophylisierung
etwa 24 - 30 Stunden durchgeführt, so daß das Produkt nicht vollständig trocken ist«, Obwohl diese Verfahrensstufe fttfr di© «ohließlioftoIsolierung des reinen GEA nicht kritisch ist, wird sie bevorzugt, da si© Zeit sparto
Das teilweise lyophylisierte Material kann dann bei Raumtemperatur oder höherer Temperatur, wie etwa 370C9 aufgetaut wer.deno
Es kann auch durch Verdünnen mit einer sehr geringen Meng© Was=·
ser aufgetaut werden» Danach werden die zurückbleibenden Teilchen entfernt,, Bs ist auch gefunden worden, daß» wenn das Vo-=
lumen auf einem Minimum gehalten wird, die Klärung durch Filtrieren und/oder Zentrifugieren erreicht werden kann., AiLIe
Teilchen einer Größe, die nicht durch ein 0?22 u-Filter gehen
(d0ho einer U-röße der kleinsten Bakterien)? werden demnach totes?
Klären und Reinigen der Lösung entfernt.
Das bevorzugte Verfahren besteht darin? die Lösung bei einer
hohen Geschwindigkeit? dohe mit etwa 14 000 bis 30 000 UpI3
vorzugsweise etwa 14 0Ö0 UpMj bei Temperaturen unterhalb etwa
100C, do ho etwa 4 ■= 100C, etwa 15 ~ 45 Minuten lang zu aentrifugiereiio
Höhere Temperaturen sind anwendbar,, jedoch verzögern
sie die Sedimentationsgeschwindigkeit und sind daher nicht"
zweckmäßigo Nach dem Zentrifugieren ist es erforderlich^ die
überstehende Lösung weiter zn klären und zu sterilisieren,. ■
Dies kann man durch Filtrieren durch filter von sich allmählich
verringernder Porengröße erreichen9 um im wesentlichen verbleibende Feststoffe und Bakteriea au entferne»,. Die Poreagröße
der Filter kann von etwa 1,2 <= 0,20 ψ variiereno Bevorzugt
verwendet man Filter mit 1,2 γ, 0,45 ρ 0,22 ji in der angegebepen
Beihenfolgeo
Die Abtrennung eines Teils des erhaltenen lyophylisiert©n9 das
CEA unter Ausschluß anderer Substanzen enthaltenden Pulvers wird nach vorliegender Erfindung durch ChromatograpMe mit zwei
verschiedenen Gelsäulen und anschließende" Elektrophorese erreichte
1098S1/1800
Es wurde gefundens daß di© eluiert^n Fraktionen bus der Säulen-Chromatographie
j die· ein Molekulargewicht von etwa 200 000 und·
ein definiertes Maximum bei der spektrophotöaetrischen Absorbtionswellenlänge
von 280 mu besitsen,, das GM enthalten« Es
wurde weiter gefunden, daß, wenn die da© CEA ent halt .enden Irak«·
tionen einer Elektrophorese unterworfen werden» aie ein fiSaifife-tierietisoheä
": M.v - Wanderungsbild 9. das anodisch zur Auf-,
bringungszone an der Kathode ist» bei pH S,6- mit einem Borat»
puffer mit einer lonenstärke von.0,05 haben» fi*e~ JUhbm# der Tfen«
"derung. hängt von der angewendeten Stromstärke und Spannung» wie
auch vom pH- Wert 9 vom Puff er und von der'-Ionenstarfce- des Puffere
abc. Wenn beispielsweise 400 ¥ und. 2OmA angewendet werde.n, wan-■
dert das OEA etwa 10 - 14 om in anodischer Hiehtiing (-anodisch;}·
zur Aufbringungszone in der gleichen.Zeit,.wie'das als Markier
rungsmittel yerwezAtte Ferrit in (ein gefärbtes Protein), anodisch
18 cm wandert, wenn es-am kathodischen Ende aufgetaacJit -wird*1-Man
kann andere Markierungsmittel verwenden, jedoch müssen äaasi
die Elektrophorese be dingungen, geändert und die .fande3?img, de'e.
und „des Markierungsart teig auf-einander
Die SäulenöhromatQgraphie kann ia der Weise dttpeligefliiirt
daß man das lyophyIisiearte Mates-isl in LSsang äer anscMießendeia
Ohromatographie an swei verscMedenen.'6-elsäulen in beiiebig©^'
Heihenfolge unterwirft o ZwecfcraäSigerweise jedoeii ist eine Gel·=
säuleρ die erfindungsgemäß verwendet ward, ®in" Agaroee-Gelo
Agar'ose ist der-neutrale Anteil von Agar* -Das Öalmaterlal ist
von'der Firma-AB Phanaacia9 Uppsala (Schweden) 9-unter'dem'Waren-'
aeichen "Sepharose" handelsüblich erhältlicho Die Gele sind als
wäßrige Suspensionen in 0,02 ^»igem Natriumazld als Schutzmittel
erhältlich» Die Gel struktur let eine· Wasserstoff bindung -ms/
Das Grel wird in Perlform mit einer ausgewählten SeilehengrSie
und einem Prozentsatz Agarose hergestellte Die Konzentration
der Agarose im Gel bestimmt seinen Praktionierungsbereicho
Die 25ur erfindungsgöinäßan Verwendung zweckmäßigsten Gele besitzen
eine Seilchengröße von etwa 40 - 190 ρ und ent halten 4 Gew«>.«$
Agaroseo Diese als "Sepharose 4B" bezeichneten Materialien
haben einen Fraktionierungebereloh von 3x10^ bis 3x10 0 BeIm-
109851 /1-800
BADOBlGtNAL
2029493
Q^ wird raS©p.liar©s@ 4BW
sie Äi© AMs^ssmag 'el©r cl©@ GBl sntJaalie&d©» Fraktion
ß stattet
in L£ti3e ©BtMli* ©la &elfllt©raiat@3?ialp d&s oln
jo"'!'"'''läslieh©s ν©rastst©s De5Ci;raapoljmes.3g8l ist
b^^^ 1 unä &®in H®T3t®llnngsv®T£&h%®n sind in
teift-834 715 beseteiefeeifio Bas
da als
e^Mltlich istp besteht aus eine®
gh mätnuBkö'pt'BGhQn Metswerk voa
QiiaatstQia DeztraasiibstaEgQS^ die
I'^ "Z L^zVlQiii t'ozmsn« Di© Pähigfeait d©s j
isst de® feraetsimgsg^ad d©? D©sctransul3st®a«=
Dss <J©l®aterial ist
9 sieii la Hinblick
j I5O C""", ätsg^Ed EatQs?seii@id©nn Das fe@i der et
^ i7a„-70 löiaiag fe^^o^gagte ©θ! fe&'fe eia©
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mini"!1 . \-:d λ!ο da©-©^ste S©m1© HIt fiea Mc
;50 0Θ0 feeiits*fe9 iviFä ©in©
Jjc ViBi) "jor Smbw'&^M^QM mit iiöii©r©m od©s? nt
BAD ORiGIWAL
nung von balzen, dann durch Wiederlösen der gesammelten aktiven
Fraktion in einem wäßrigen Puffer bei einem pH-Wert, bei dem
das CEA elektrisch neutral ist» durch Leiten der Lösung durch die zweite Säule, dureh Sammeln der aktiven Fraktionen, durch
Dialysieren wie oben und durch Lyophylisieren durchgeführte Der
Grund, das CEA elektrisch zu machen (herzustellen), liegt darin,,
die Wechselwirkung des Antigens mit den Säulen und d£« nachfolgende
überlagerung der i'remdstoffe bei den aktiven Fraktionen
herabzusetzen. Obwohl beliebige wäßrige übliche Puffer geeignet
sind, wird die Verwendung einer mit Phosphat gepufferten Salz«-
lösung (o,9#) bevorzugte Der Vorteil der Anwendung niedriger Temperaturen» doh„ von etwa 4--10 C, liegt darin, daß man ein ,
verbessertes Auflöseveriaögen erreicht Die aus der zweiten Säule
gesammelten Fraktionen haben ein Molekulargewicht von 200 000
und ein Maximum bei 280 mjt im UV~Absorptionsmeßgerät0 Die aus
der ersten Säule gesammelten Fraktionen werden auf den gleichen Kriterien basierend ausgewählt, jedoch enthalten sie Materialien..
die ein etwas höheres oder etwas niedrigeres (bis herunter zu 70 000) Molekulargewicht als 200 000 hat* i„
Die aktiven Fraktionen aus der zweiten Säule werde» einer
trophorese unterworfen, um das CEA von Verunreinigungen weiter
zu befreien., Dies erreicht man durch Auflösen der aktiven^ zu=-
vor konzentrierten Fraktion in einem Puffer bei einem pH von etwa 8,2 - 9,2 und einer lonenstärke von etwa OsO125 - O?1O,
Obwohl beliebige wäßrige Puffer mit diesen Eigenschaften geelg=
net sindj verwendet man vorzugsweise einen Puffer, der die Beweglichkeit der aktiven. Fraktion steigert, doh«, einen Boratpuffer vom pH etwa 8,6 und einer lonenstärke von etwa 0,05 ο
Diese Eigenschaften lassen das CEA in der gleichen Weise wie das verwendete bevorzugte Markierungsmittel, d<,ha Ferritin,
wandernο
Die angewendete Stromstärke und Spannung bestimmen das Ausmaß
der Trennung der Moleküle in der Fraktion» Es wurde gefunden,
daß bei dem bevorzugten Verfahren, der islock elektrophorese 9 etwa
300 - 500 V, vorzugsweise 400 V, mit einer Stromstärke von etwa
20 mA zweckmäßig sind« Man kann andere Stromstärken und Span= ,
109851/1800
BAD
. - 12 -
nungen anwenden,, jedoch werden die oben genannten bevorzugt,··
Die aloekelektrophorese ist die bevorzugte Elektrophoreaemethode,
weil sie die Gewinnung der gewünschten Fraktion erleichterte" Jedoch 'kann man andere i'jrpen der Elektrophorese ebenfalls anwenden,,
Das bei der Blockelektrophorese verwendet© Material sollte das zu
prüfende Material tragen und elektrisch leitend seins wenn es mit
einem Puffer imprägniert wird« Typische geeignete Materialien
sind Papier und freie o Bei d©m bevorzugt en. Elektrophoreseverfah«=
ren wird ein vernetztes Dextrangels zwm Beispiel "Sephaöex G-25
fine" mit einer annähernden Molekulargewiohtsausschlußgrenae von,
5QOG«, einem Wasseraurückhaltevermägen von 295 f Q5,2 g H^O/g trok«
kenes GaIp eis.©!· teilchengröße von 20 -= 80 gi und einem BettTOla-
men/ml/g trockenes Gel von 5$, in dem Puffer angequollen und auf
einem niehtXeitfähigen Blocks zum Beispiel MLueit©M 9 angeordnete
Bei des bevorzugten Verfahren irird das C-al mit dam gleichen Puffer9
in dem auch die aktiv© Fraktion gelöst ψϊτά9 la dem- Block ange-*
ordnet usid "dann öle Papierkontakt® auf c.®m. GsI angebracht, Der
Block wi"ä?d clasn äe?;" dem gleichen Puffer in einem Elektrophorese«
jt^rät aste·? Arbeitsbedingungen ins Gleichgewicht gebrachte Nachdem die G-leiohgewiehtseinstellung durchgeführt worden ist,, wird
ein Streif en des ß-els ©atf ©rat und mit ö.er gepufferten 9 lyophyli»
siertes öEA--F2?aictic»E aus der aweiten Säul® varmisoiito Di© er-Iialtene
Aufschlämmung wird dann auf dea Block an die gleiche
Stelle g3g©ss©sig YQu'ueT der Streifen entfernt worden war?
weise in de? Mitte des BloekSo Das geeignete larkienin
s«m Beispiel Ferritia? ein llgea enthaltendes Prot©ia9 wird
dann as ICatiiQdsiiaade des Blocks aufgetupft« Hachdem di© Blektr®«»
ρ höre se sine ύο rbe stimmte Zeitdauer betrisfeesi worden iste in
dieses fajlle etwa 24 Stunden^ wiffd des3 die C£A~Aktivität enthaltend® Bereielio doh« 10 - 14 ©m anödiseh sur AEfteiagraiggson© 9
DIqpqt Bereich wird ηητ entfernt^ wenn sieh das Mar·=·
gifiittel ein© sixwov "bestimmt© Entfernung bewegt iiats Ia
diesem Falle ''8 gw. in anodischer Hiehtuag» Di© GEA-Ucti^ität
wisd imts? Saugen dursh ein verfügbares öP20 |ti-C©llul©SGaeetat-filtes·
fsj-n^ös't tAsd ¥orsugsw@is@ dureh Diaiys© gegea destilliertes
Wasser zur Entfernung des bei der Bluierung verwendeten Salzes
gewonnen,, Man erhält ein Material, da.s im wesentlichen reines
GEA ist« Dies Y/ird entweder durch die JPrecipitin-Inhibition
oder unmittelbar durch die Ouohterlony-'Prüfung gegen nieht-ab»
sorbiertes iuaor-Antiserum gezeigt* Eine einseine Präzipl tat ions·=
linie zeigt reine CEA-Aktivität ano
Bei einem anderen Gesichtspunkt vorllegsnder J|rfladung, wurde sin
Verfahren zur Bestimmung der Höhe des GBA 4n Körparflüssigkeitsn
von Personen mit Krebs oder Krebsvermtt ung gefunden« Xsiabesünde·=
re wurde eine Strahlenunempfindliehkeitsprüfungsteeimik gefunden^
die einfach durchzuführen ist und ©inen hohen
grad hat und spezifisch
Bei Strahlenunempfindlichkeitsprüfungen- ist es wiehtigp daS das
radioaktive Atom ausreichend reaktionsfähig mit"dem au kennzeieh«
nenden Molekül ist9 uia eine entsprechende Konzentration der fiadio·=
aktivität zur Bestimmung zu schaffen9 und- daß das radioaktive
Atom eine ausreichende 2erfallsaahl prc Seiteiahe.it aar Vertu»
gung stellen auß'p um eine'ausreichende" Empfindlichkeit für" genaue■
Bestimmungen zu schaffen«. Weiterhin darf im Falle der Strahlen·=*
. unempfindlichkeitsprü-fung' von Antigene» die Antigenwirksamkeitdureh
die Verbindung des .radioaktiven Atoms mit uem Antigen"
nicht schädlich beeinflußt werdeßo " - - - .-
8-eiiäß vorliegender Erfindung warde -gefunden, daß- sen erstes Male
die Existenz eines menseüiefaen Tumors- dadurch bestimmt wenden
kanEj,. -daß rnaa ein tumorspezifisches 'Antigen sirkiilieren läßta
Mittel» vorliegender Erfindung ist es mögligli& wenigstens
. etwa 1J1O ng-.-CEA pr© mi Serail zu entdQ©kQno . Bie Empfindlichkeit
der Prüfung wird nur durch die spezifische Aktivität des radio«=
aktiven Atoms begrenzt»' Diesis Begrenzung wifet
■ überwunden j da- praktisch das gesamte«, in einem feilifolumea des-Serums
vorhandene CSA dureh die exf indungsgsiaäßen. Isstrattioasverfahren
extrahiert warden kann,, wodurch es.aögli©a wird, die
spezifische Aktivität des radioaktiven_Atems su
Weiterhin kann dieOopräzipitations«Inhibition des
CEA vergrößert werden, um die" EmpfindXiehkeit der Prüfung zu
' erhöhen/ -.109851-/1800 .'-.
BAD
*·' 14 -
Das CEA kann durch radioaktive Atome markiert werden,, die mit
dessen chemisch reaktionsfähigen. Gruppen reagieren können und ·
nicht wesentlich die Antige !Wirksamkeit herabsetzen» Es wurde
gefunden., daß ^Jod besonders geelgaet ist»
Das GEA kam mittels in der Technik bekannter Verfahren -mit ge«
ringen Modifikationen bezüglich der Konzentration.und der Volumina mit radioaktivem J©d umgesetzt (radiojodi@3?t) "werdano Die
"Chloramine^f-Methode88 von Bunter und Gree&woo&j Biosheiio J0
(1964) j Seite 46^ unter Verwendung ύοζι ^Jod ist besonders
vorteilhaft» . - -
Dieses Verfahren ergibt ein© Badi©3©äierüngswi2?ksasakeit von etwa,
20 - 5O5&0 Beim liadiojodier-en fass GBA wird gereinigtes- CEA ver~
7/eadeto Die Beaktiosi wird sum Beispiel unter Verwesdung von
200 pi einer 100 pg "Ghloraiaine-S" (Natriumsala des ρ-ϊαΐαοΐ-siu,fo-=ehlo2*a!ains)
eatijaltsndesi H@sktioiislösungs fön O2 25 ■=■ O9 4 i&i
gereinigtesa CBA rand ^em 4 siGi ' ^Jod la Form toq KJ odes? HaJ
•;liir©iigsfülij?to Sie Eeaktion ¥©rläEft bei Saraatejiperatwr in etwa
■aiaös» Minute usd wird äw£&h 2ugals© ¥©a lEtriuia-metaMsulfit mn·=·
"i^rb-ifQsiisSo Mq Fi!akti©a aes "G-hloffsaine-f n "bestallt da^las das
'J^did. äs SaIs se Joö am osjidiareao Die FwÄtioa des
■12*5
das aiekfe sagesetste J©d
slEgiQ^QSo Mgs ksna s-M&h @Μά®τ& Hediaktiosismitt©l9
eiQiJS.SiisKlfats, ¥erws2ifieao Die f©nnread©t©n Oxidatio
»aiii asdiiktieasaätt©! sollten mlmis s© sta2?fe ssin^ daß eie das
125-eSo
Bas P^odulrfe kasm ü-qfi aiefefe BBgesetstea Jöd
3ä3?sBa^©|p?gipM© ia elaes· Saal© ait
lgpi©! s6Ssplia,d©5£ 6-100'% aögetresmt ^©^©Hg uobei -das
aiae aasaalis^aae lolQkialsE'geisiieiisssiisselilMigE'QSise vaa 100 000
;i3l,9 ads® fSlIoIiQHIgE1OgQ. ^©11 40 = 120 μ VM^.
I ':'3u9t^neB @©1 wmi 15 <=· 20 hg&P Mas eatferat das E©iir alt
.^öi^93 fia€i@slsi5iifitli!5 im ©rsten lasiisiaiio Dse - Produkt hat die
"i:j äo'ö Mt ©ia©a s©Qsifis<;lis-n Äiitilcörpois1 reaktionsfähig9. hat
200 Ό00
ss©s£fi£j©&© Afetivitä-fe vom Gtu® 1000 - 25
1 ο i a s 1 /11 ο ο .
2029A99
- .15 -'
vorzugsweise von etwa 10 000 ~ 20 000 dpm/ng, d.h» etwa
.5 - 10 mjiCi/ng- GBAn
Bei der Durchführung vorliegender Erfindung unter Verwendung
von radio kodiertem CEA wird die Anwesenheit wn QEA im menschlichen Serum unter Anwendung von StrahlenuneaipfindlichkaitS"
prüfverfahren entdeckt, die auf einer Modifikation der Technik
der Coprässipitation-Inhlbition basieren (vgl*, Farr in Jc Infect
ms» W$ (I95ß)f Seite 239) ο
Es ist erforderllahs» um bei der obe*n genannten Technik einen
Erfolg zu erreichen, das Blut des !Patienten in einer Weise zu
behandeln, die sicherstellt 9 daß das gesamte GEA unter Ausschluß der störenden Materialien in dem endgültig verwendeten
Serum vorliegt,, Dies kann durch Behandeln des Blutserums der
Patienten Bit einem Q-lycoprotein-Lösungsmittels das GEA löst,
und durch Klären der erhaltenen Lösung erreicht werden,,
Das Grlycoprotein-Lösungsmittelf das,-wie gefunden wurde*-für ·
dieses Verfahren geeignet ist, ist Perchlorsäure0 Man iiat ge«
funden, daß 0,2 m-Perehlorsäure bevorzugt ist, da sie störendο
Substanzen entfernt<= " Die erhaltene» das gegebenenfalls Torten«=
ft £?β3_ Q R "I* A
deneTöEA enthaltende Lösung wird dann geklärt. Das .bevorzugte
Verfahren ist 2entrifugierens Sammeln des Überstehenden und
Dialysieren' gegen Wasser<>
Dies nimmt gewöhnlieh 24 ·= 48 Stunden
in Ansprüche Der MaIyserückstand kann dann durch Lyophylisieren
getrocknet werden« Bei Anwendung dieses Verfahrens wird ein gereinigter Serumextrekt erhalten, der mehr als etwa
95% des ursprünglich vorhandenen CEA enthält«,
Bei diesem Verfahren-ist es wesentlich^ daß der Serumextsrafct
wie beschrieben behandelt wird, da das G-lycoprotein^Lösiitigs==
mittel,· welches CEA löst9 in der Anfangsstufe suvor vorhandene
GEA-Anti-CEA-Kompieie im Serum des PatSsnten 2serstörtf
die G-ewinnimg des im wesentlichen gesamten ursprünglich
handenen CIA.gewährleistet wird« "
Um ferner die Straiü.enuneiapfindlichkeitsprüfung wirksam g»
leiten^ muß eine Zufuhr von GSA-spezifieciien Antikörpes« gs-■■währleistet'
se in ο -Dies wird cMroh Issaunisiercn von Sieben mit
10 9 8 51/18 0 0
gereinigter OEA in üblicher V/eise erreicht„
Man fügt dem CEA in einer üalsälösung ein Emulgiermittel au, zum
Beispiel Freund's Adjuvans (vollständig)« Die Emulsion kann bei
fieren in den Fußbällen intramuskulär und/oder subkutan injiziert
werden., Geeignete Tiere sind Geflügel, Kanineheny Pferde, aie~
gen, Schafe und ähnlicheβ Di© Regel bei Kaninchen ist sum Beispiel? wöchentlich awei bis fünf Injektionen zu machen«. Nach
der letzten Injektion wird vom Tier Blut entnommen« Das Serum
aus diesem Ulut ist niehtabsorbiertes Anti-OEA-Antiöerum0
üei einem Verfahren werden 400 jjjg GEA in 1 ml Salzlösung (Q>9?0
verwendet» Die Injektion erfolgt intramuskulär unter Verwendung eines etwa viermäSJnen Volumens, das in den Fußbällen injiziert
wird»
Der in dem Antiserum vorhandene Antikörper ist nach Absorption
an normalen Gewebebestandtellen in seiner Aktivität gegen GEA
unter Ausschluß von anderen Antigenen spezifische
Bei der Durchführung der Strahlenunempfindlichkeitsprüfung des
GEA werden Verfahren angewendet 9 die auf der TecJmik der Copräzipitation-Xnhibition
beruhen«
Bei diesem Verfahren wird eine Sitrationskurve und dann ein©
Standardinhibitionskurve erhalten« Die Standardinhibitions-kurve
wird als ©in Kontrollstandard verwendete Dann werden die
radioaktiven Materialien aus der Lösung eopräzipltierto
Die ötandardinhibitionskurves die durch das Farbverfahren hergestellt wirdg stellt ein Maß ftr die Komplexbildung mit spezifischen Antikörpern <iaro Die Kurve gibt die GEA°Ieng© wleder9
die pro Einheit des Serums vorhanden ist» Die Dimension ist in
Nanogramm pro Milliliter angegeben^ die gegen einen bekannte»
Prozentsatz von radioaktiv markiertem GEA aufgetragen wirdo Die erhalten© Kur^e wird zur graphiachen Darstellung dar CSA-Menge
im Serum eines Patienten verwendete
Eine Standardinnibitionskurve erhält man durelx Zufügen voa .
Standard-GEA au einer H^ihe von Höhrchen® die gepulverten Per-
109851/1800
* 17 ~
Chlorsäureextrakt von normalem menschlichen Serum enthaltene
Eine abgemessene Menge von Anti-OEA-Antiserum, die vorher im
Verhältnis 1s 100 mit einem Borat-Puffer vom pH etwa 8?4- verdünnt worden ists wird der Beihe von .Röhrchen zugefügt, die
einen Perchlorsäure extrakt von normalem Blutserum enthalten.,
Der zur Verdünnung des normalen Blutserums verwendete Puffer
kann ein beliebiger Puffer-sein., jedoch wird ein Borat-Puffer
mit einer lonenstärke von 091 und eines* pH von 8,4 bevorzugt ο
Di© erhaltenen Lösungen ?/erden bei niedrigen !Temperaturen, zum
Beispiel etwa 4-0G9 eine ausreichende Üeit zur Vervollständigung
der Healction inkubiert? wobei gewöhnlich etwa 18 Stunden ausreichend sind» Im Anschluß an die Inkubation wird ,jedem Röhr·=
chen eine abgemessene Menge Jod zugegeben«, Die Inkubation
wird dann weitere zwei Stunden bei etwa 570C fortgesetzt, Wenn
die Inkubation beendet ist, wird ein Ausfällmittel r das den
Antikörper und den Antigen-'Antikörper-KompleXp jedoch nicht
das Antigen, ausfällt$ der Lösung zugefügt t um den Antikörper?
der das CEA gebunden hats mit auszufällen '-Vorzugsweise* wird
eine gesättigte Ammoniumsulfat-Lösung verwendete
Unter den oben beschriebenen Bedingungen verbleibt freies GEA
in Lösung* Der ^Jod-Gehalt des Präzipitats oder des liberate^
henden wird dann aus den Ablesungen auf einem geeigneten Instrument
bestimmtο Danach bestimmt man die GEA-Henge im Serum
mit Bezug auf einen Standard» . , /
Die auf die gepulverten Perchlorsäureextrakte des Serums angewendete Prüfung, diäi* in der gleichen Weise wie -Standard«-
OEA behandelt worden ist, liefert eine Bestimmung der GEA-Menge
im Blut des Patienten,, Diese zeigt ihrerseits die
An- oder Abwesenheit von Krebs des Verdauungssystems beim Pa=>
• tienten am
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung»
Isolierung der QBA--'ffraktion._0_
Es wird iumorgewabe vom Adenokarzinom des Colon herausgeschnit-
10 9851/1800 ·
• BAD ORIQINAU
~ 18 ~ . ■ '
ten und soviel wie möglich normales Gewebe abgeschnitten. Das
restliche iumorgewebe wird durcsh einen Fleischwolf getrieben
und in 1000 g-Hengen bei -200C gelagert, 1000 g des zerkleinerten Gewebes wird in destillierten Wasser auf ein Gesamtvolumen YQYi- 4000 ml suspendiert und bei, 15 000 Umdrehungen pro
Minute ©ine Stund© in einem wassergekühlten Homogen!satar homogenisiert O
Unter ständigem ßühren fügt man ein gleiches Volumen 2 n-lfeY·=·
ohlorsäure bei 4°C langsam zu. Diese Suspension rührt man
30 Minuten bei Baumtemperatur und zentrifugiert dann 30 Minuten
bei 4°ö mit 6Οθφρ1ί in-einer gekühlten Zentrifuge (6 π 250 ml,
feststehender Winkelrotor)o Bas Überstehende wird entfernt
und in einen flachen, etwa 7j62 em weiten Dialysierschlaueh·
gegebesij, der zuvor 1 Stunde in destilliertes Wasser getaucht
worden ist, usa ihn geschmeidiger zu maß hen ο Die Dialyse wird
48 Stunden gegen kaltes Leitungswasser und dann gegen ständige Wechsel von großen Mengen destillierten Wassers bei 4°ö während
weiteren 48 Stunden durchgeführtο Der dialysierte Rückstand
wird in 5000 ml fassende Hundkolben gegeben, und zwar1 jeweils
1500 ml pro Kolben? in einem Methanol=Trockeneis=Bad Schalen»
gefroren., und dann auf einem Lyophylisiergerät mit einer Kapazität von 8 Litern lyophylisierto Unmittelbar vor der vollständigen Lyophylisation (24 - 30 Stunden) werden die Kolben
herausgenommen-, der teilweise trockne rohe Extrakt aufgetaut
und die erhalten© Lösung in einer gekühlten Zentrifuge (8 χ
50 ml, feststehender Winkelrotor) 30 Minuten bei 14-000 UpM
bei 40G zentrifugiert» Das Übersteheade wird entfernt und
dann nacheinander durch Membranfilter von 1,2 U9 O945 U und
0,22 u MÜliporen filtriert» Die geklärte Lösung, wird Schalen«=·
gefroren -und zur Trockne lyophylisierto
1,5 g des getrockneten rohen Extraktes löst man in 50 ml eines
0,05 m-HaiyPO .-Puffers (pH 4,5) in. normaler Salzlösung, Der
Phosphat-Salz-Puffer vom pH 495 dient als Eluierungslösung
bei allan nachfolgenden Säulenohromatographieno Die Probe wird
dann duroh aine "Sepharoae 4·=ΒΜ«Säule geleitet» Die verwendet®
ist eine■ "PhamiauJLa K 100/100" (100 em χ" 10 em) mit eines·
109851/18.00
~ 19 *
Bettlänge von 89 orn» Durch einen Umwälzkühler wird die Tempe
ratur auf 4 ■=· 50G gehaltene Die Lösung wird mit einer Auf«
wärtsfließgeschwindigkeit von 150 ml/Stunde mittels einer
konstanten Strömungspunipe (liKß "Varioperpex 1200" Peristaltic
Pump) gepumpt., Man sammelt 2$ mX-Fraktionen in einem
Fraktionssammler (LKB "Ultrorac TOOO")„ Die Fraktionen wer«
den laufend bei 280 mu in einem IJY-Absorptionsmeßgerät über»
prüfte Die aktive fraktion wird naöh der Eluierung von
4750 ml aufgefangene Der Versuch dauert annähernd 47 Stundeno
Das Gesamtvolumen der aktiven Fraktion beträgt 750 mlc Die
aktiven Fraktionen werden vereinigt, 48 Stunden bei 40C- gegen,
zahlreiche Wechsel großer Volumina destillierten Wassers dialysiertj Schalen- gefroren und lyophylisierta
200 mg des getrockneten Materials aus der "Sepharose 4-B"=
Säule werden dann in 10 ml des btandard«Puffers gelöst und
durch eine "Sephadex £·-2GQ"-Säule geschickt» Die verwendete
Säule ist eine "Pharmacia K 50/100" (100 cm χ 10 cm) mit
einer Bettlänge von 90 esa., Durch einen umwälzkühler wird die Temperatur auf 40C gehalten«- Die Lösung wird mit einer
Äufwärtsfließgeschwindigkeit von 40 ml/Stunae mittels einer
konstanten Stromungspurape (LKB "Perpex 10200" Peristaltic
Pump) gepumpte 10 ml-Fraktionen werden laufend bei 280 m|i
in einem UV-Absorptionsmeßgerät überprüft0 Die aktive Fraktion wird nach der Eluierung von 820 ml aufgefangene
Die Dauer dieses Versuchs beträgt 350 Stunden und das Gesamt-=
volumen der aktiven Fraktion 190 ml» Die aktiven Fraktionen
werden vereinigt, 48 Stunden bei 40C ßegen zahlreiche Wechsel
großer Volumina destillierten Wassers dialysiert» SehaXen«ge«
froren ■ und lyophylisiert»
Beispiel 2ο
Reinigung der isoliertes QM enthaltenden Fraktion durch
Blockelektrophore se»
Das Blockelektrophoresemedium "Sephadex G-=-25.Fine" wird zwei
Stunden bei 800C in Wasser gequollen und durch Dekantieren
mit Borat vom pH 8,6 und einer Ionenstärke von 0,05
10 9851/1800
sehen und dann durch eine gesinterte Glasplatte saugend ΐίϊ-trierto
Man gießt eine dicke ^!aufschlämmung auf einen "Lueitö*-
Blockträger mit den Ausmaßen 61 cm χ 7»5 cm. χ 1 cm und läßt
sie sich gleichmäßig über die Platte bis au einer $iefe von
ί on verteilen. Die Oberfläche wird dann mit einem Wattebausch abgewischt, bis sie fest aber nicht vollständig trocken ist c
Der Block wird dann mit 3 mm-Chromategrphiepapierkontakten
(Whatman) versehen, die alle in der gleichen Pließrichtung
des Papiers ausgerichtet sindο Den Block ordnet man dann
in dem Elektrophoresegerät an und läßt es sich während einer Stunde unter den Betriebsbedingungen von 400 Y mit einer konstanten Stromstärke von«»2Q mA bei 40C ins Gleichgewicht bringeno
Dann entfernt man von der Mitte des Blocks einen Streifen von 1 cm vmd vermengt ihn gut mit 60 mg trockenem CEA aus
Beispiel 1, das zuvor in einer Mindestmenge von 0905 m»Boratg
annähernd 0,5 ml, gelöst worden ist» Die erhaltene Aufschlämmung wird dann in den Mittelstreifen gegossen» Dann
tupft man 1-2 Tropfen Ferritin (β-mal umkristallisieriJ)
bei einer Konzentration von 100 mg/ml auf das Kathodenend®
des Blocksο 24 Stunden nach ¥©rsuehsbeginn bewegt sich das
Ferritin-Markierungsmitt©! 18 cja in axtodischer HiehtungO
Gleichzeitig wird der Block aus dem Elelctrophoresegerät entnommen» Streifen von 2 em zwischen der Aufbringungszone und
dem Anodenende werden mit 2 m-NsCi eluiertj, die durch eine.
0,20 ρ ungebundene Gittermembran ("ffaleene") geleitet wordenwarο
Die Aktivität wird bei 10 - 14 cm in anodischer Sieht«
tung zur Aufbringungszoxi® lokalisiert, wobei eine schwächere
Aktivität bei 8 ■=· 10 ca in anodischer Richtung zur Aufbrin».
gungssone gefunden wurde«
Jeder aktive Streifen wird eluiert und in einem eingeweichten
/i^*;- -Dialjrsiersehlauoh gegen zahlreich© Wechsel großer Volumina destillierten Wassers 48 Stunden bei 40C dialygierto
'Das Dialysat wird öchalen--|5!t^Äiii und zur Trockne lyo*·
phylisierto Das getrocknate9 gereinigte CSA wird unter
109851/1800
BAD ORIGINAL
mindert em Druck über Calciumchlorid bei 40G gelagert. Das
Produkt hat die folgenden efc^afcteffiaierendsn Eigenschaftens
Es bildet eine einzige Präzipitationslinie mit nichtabßorbier~
tem Antiserum bei Geldifiusionsprü£ungen? ist in. Perchlorsäure löslich? wandert bei.der Blockelektrophorese anodisch
10 - 14 cm,, wobei gleichzeitig ein Ferritin-Markierungsmittel
anodisch 18 cm wandert, wenn ein Borat-Puffer vom pH 8,6 und
einer Ionenstärke von 0,05 und 400 V und 20 mA die Bedingungen
der üloekelektrophorese sind, es hat weiterhin ein Molekulargewicht von 200,000 und es zeigt ein SpektrophotometerabsQrptionsmaxiiaum
bei einer Wellenlänge von 280 mno ·
Beispiel 3. ■ * . '
Herstellung des Anti-üBA^AntiserumSo
12 ausgewachsenes männlicheρ weiße Neu~Seeland~Kaninchen mit
einem Gewicht von 2,0 kg werden in 3 Gruppen zu je 4 Tieren
eingeteiltο Die verschiedenen Gruppen werden mit den folgenden Materialien immunisiert! normaler üolongewebeextrakt, Tu=
morgewebeextrakt des gleichen Individuums, von dem der normale
Gewebeextrakt erhalten worden war, angesammeltes menschliches
Plasma«, Der Tumorgewebeextrakt stammt von Tumorproben, die
diagnostiziert und bestätigt worden waren, daß sie ein Adeno»
karzinom des Colon sindo Die normalen Gewebeextrakte und die
Tumorgewebeextrakte werden nach dem in Beispiel 1 beschriebe» nen Verfahren gebildet» Das vereinigte, menschliche Plasma
wurde von 50 normalen Spendern erhalten, die alle Hauptblutgruppen
repräsentieren»
Die Injektionen, die 4 Wochen lang zweimal wächjtlich gegeben
wurden, enthielten 3 mg Protein in 0,6 ml Gewebe extrakt^;,
.eider. Plasma , 41%·' in dem gleichen Volumen Freund's Adjuvans
(vollständig) emulgiert. warwi. Injektionen von 0,1 - 0,2 ml
wurden in einen Fußballen und der Rest intramuskulär in die
Flankengegend gegeben» 12 Tage nach den letzten Injektionen
wurde den Tieren Blut, aus ihren äußeren Ohrvenen entnommen,
und die von jeder Gruppe erhaltenen Seren zu Prüf zwecken ge-?
■ sondert gesammelt,
1098 61/1800 ^ oRlGlNAt
lüe Seren von jeder Gruppe wurden an normalem Gewebe absorbiert
und das erhaltene träaipitat abgetrennt„ Die überstehenden
Lösungen wurden dann der Ouchterlony-Technik einer doppelten Diffusion in Agargel unterworfen-* Diese wurde in 1$ Agar-in-Salzlösung
mit Merthiolat durchgeführt, das als öchutzstoff zu einer Endkonaentration von 1/10 000 angefügt wurdeο Die
den oo
Proben wurden in Afelplatten gesßhnitten, so daß die zentralen
und peripheren Vertiefungen 1 cm von einander angeordnet waren,,
Jede Vertiefung wurde mit 0*15 ml des zu untersuchenden Mate»
rials gefüllte Die verwendete .".;Antigenkonzentration betrug
10 mg Eiweiß pro ml„ Die A&fangslnkubation der Platten wurde
in einer feuchten Umgebung 24 Stunden bei 370G durchgeführt,
um die Diffusion des Materials aus den Zwischenräumen (Vertiefungen) heraus zu unterstützen» Man ließ die Proben sich
in der gleichen feuchten Atmosphäre 7 Tag© bei 250G entwickeln,,
Die Proben aus den Seren von den Tieren 9 die mit dem SJumorgewebeextrakt
immunisiert worden waren; zeigten eine einsige
Linie, die angibt, daß das Serum für den Tumor spezifische
Antikörper enthält,, Keine Proben wurden aus den Seren von
Tieren entwickelt, die mit normalem G-ewebs oder normalem
menschlichem Plasma immunisiert worden waren*
125
Umsetzung von GBA mit ,Jod».
Es wird eine 500 iil-Heaktionsmisohung gebildet, die 100 ug
"Chloramine-T", 250 jig CEA aus Beispiel 2 und 4 mCi IOJod
in Porm von KJ enthält» lan läßt die Eeaktion 1 Minute bei
Raumtemperatur ablaufen und unterbricht sie durch Zugab® von
240 ug Natrium-metabisulfito Das erhaltene Produkt "13J=
125 wird vonv restlichen nichtreagierten Jod dursh Chromato
graphie an einer "Sephadex G^IOO^-Säule abgetrennt,, Das Pro«
dukt hat eine spezifische Aktivität von. etwa 5 muCi/wg«.
Beispiel
5
ο
Herstellung von .Blutproben für eine Stral^anunemgfindlioh"
keitsprüfun^o
Man fügt 5 ml einer 2,0 m-Perehlorsäure zu je 5 ml Serum, das
von ,Blutproben von 200 Menschen erhalten worden waro Das Ge=
109851/1800
*, 23 -
misch· wird 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt„ Der erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugieren in einem feststehenden
Winkelrotor (fixed-angle rotor) bei 9000 g während 10 Minuten bei .40G entfernt» Das erhaltene Sediment wird
verworfen und das über stehende 24 Stunden gegen kaltes Leitungswasser und dann zusätzliche 24 Stunden gegen wiederholte
Wechsel destillierten Wassers bei 4-0G dialysiert« Der dia«
lysierte Hückstand wird dann zu einem trocknen Pulver lyo~
phylisierto ..*■'■
Beispiel 6„ ■
StrahlenunempfindJL^
Während dieses Verfahrens wird normales menschliches öerum
mit uorat-Puffer (lonenstärke 0,1, pH β,4·) auf 1s100 ver»
dünnt, und es werden diese Zubereitungen als Verdünnungsmittel für das Anti~CEA»Antiserum, das aus Ziegen nach dem Verfahren
des Beispiels 3 hergestellt worden war, und das
^J-GEA verwendet, das nach dem Verfahren des Beispiels 4
hergestellt worden war ο
Herstellung einer StandardinhibitionskurTeo
Man fügt 5 ml Standard-GEA einer Reihe von Eöhröhen zu, you
denen jedes den gepulverten Extrakt von 5 ml normalem menschlichen Serum enthält, das nach dem Verfahren des Beispiels 5
hergestellt worden war«, Dann gibt man 500 j*l verdünntes
Anti-CEA-Antiserum in jedes fiöhrchen* Die erhaltenen Lösungen werden dann 18 Stunden bei 4°ö inkubiert und danach je·»
des Böhrchen mit 500 |*1 ^Jod-OBA versetzt,, Di© Inkubation
wird dann weiter« 2 Stunden bei 370C fortgesetzt«, 33ann fügt
man jedem Köhrchea 1 ml einer auf 4-0G gekühlten gesättigten
raserxgim
'Ammoiiiumsulfatlöswng hinzuo isei den erhaltenen au 50^ gesättigten
Ammoniumsulfatlösungen erleidet das an den Antikörper gebundene GEA eine Copräsipitation, während das frei©
GEA in Lösung verbleibt« Nach einem Waschen mit 5?0 ml einerau
5O^ gβsäΐtigtenΔmmolΓlumsulfatlÖsung bei 40G wird der
12^
gg
12^Jod~»CEA-Gehalt des Präsipitats in einem "Kuclear-Ohicago
Dual Channel Automated Scintillation &amma~BayM»Analysiergerät
analysiert o,. Die erhaltene Standardinhibitionskurve
ist in der Zeichnung dargestellt«
109861/1800
60-
an Antikörper gebundenes 125JOd-GEA li
in Prozent
20-
■*■«.
5 10 20 40 SO 160
Standard-CEA (ng/ml)
10 9 8 5 1/18 0
Sr
(b) Strahlenunei^ffin;d^ Serumgo
• Die gepulverten Extrakte von Serup?.das von federn der 200
Menschen erhalten worden warf werden Ιιφϊer gleichen Weise
behandelt?, mit der Ausnahmes daß kein Standard-CIA zu
einer der Proben zugefügt wird»
Die Ergebnisse der StrahleminempfindlleMceit sprüf ung aeigen9
daß GEA nicht festgestellt werden konnte in einem Serum» das
von normalen (gesunden) Menschen^ Schwangeren, Patienten mit
Krebserkrankungen von nicht sum Verdauungssystem gehörenden
Organenj Patienten mit niaht-malignen Krankheiten der ?er^
dauungsorgane und Patienten mit nicht»entorische-n^ nicht»
neoplastisehen Zuständen erhalten worden warο
Bei 56 Patienten mit einem Adenoka'rzinom entweder des Colon
oder des Rektuja, diesa der Zeit . untersucht worden waren,
als "-· bekannt wurde? da£B im Körper/vornraden sei?
wurde bei allen außer einem Serum gefunden^ daß sie erkennbare Mengen von zirkulierender GBA aufweiseno Das einsige
erkannte falsche negative JResultat, das bis'heute-registriert"
wurde, fand man bei einem Patienten mit einem lokalisierten 9
aggressiven polypäfenlichen Adenolcarzinom des Querdarms9 das
das GEA am Eindringen in das zirkulatorisehs System hindert o
Bei einer Operation fand man, daß dieser Patient eine Darmverschlingung des Dickdarms mit einer zirkulatorischen Schädigung hatteα
Der niedrigste positive Wert wurde bei einem Serum eines Pa-=
tienten mit einem malignen Dickdarmtumor mit einem Wert von
3 ng/ml registriert» Man erhielt keine falschen positiven
Ergebnisse? Patienten, die eine Colon« oder Rektumkarainoia=
operation durchgemacht hatten und die keinen Befund eines restlichen oder wiederkehrenden Tumorwachstums zeigten,
hatten kein erkennbares zirkulierendes GBAo In sieben Fällen
in denen sowohl vor als auch nach der Operation. Blutproben entnommen worden waren, blieben die postoperativen Werte des
Serum-OEA nur bei einem einzigen Patienten mit einem Metastasenbefund bei der Operation erhöhto
109851/1800 ■
Claims (1)
- Patentanspruch®1) Oaroinoeabryoaalos Aatigeaj, g©keans@i@teet durch dl® BiI= dung öinar einzigen Präzipitatlonslinio mit seia®» spasifiechen Antikörper in unabaorbierten Antisera® bai G@ldiffu~ sionsprüfungen? durch eine Löslichkeit in Perchlorsäure, duroii Wandern von 10·« 14 es in ©«©diseter fiiclitwig bei Blockelektrophoreses wofeei gl®i@hs©itig ®tn Ferritin nmgsmittel 13 ca in aaodiseslier RieiittäEg wsiioer^^ unt@r Wendung, von 400 ¥ und @twa 20 aA mit ©ia®a Borat«? uff er vom pH 8j,6 und einer Iononstärke von Oj,05© dureh ein Molekular» gewicht von etwa 200 000 und öurea ©in AbBorptionemaximua bai ©iaer !©liaaläiag® von' 2802) Antigen n&oh Ansprueij 1? dadur@ii gekensseleteet 9 daß as ait radioaktivem Jod usagosetat ist, die gleietoa Eigensehaf·= ton wie GEA und ®ine spasifiacto Aktivität voa ©twa 5 - 10 BijtCi/ng CEA hat ο3) Antikörper» dadursli gekennzeisfinet, daß sie spezifischfür menschliches GM nae.fe AEaprueä 1 sind«4) Verfahren zur ö-ewinnung ©in©s Bs®nschliah@B nalan Antigene nach Anspruch 1$ g©köan2!©ielisn@t dureh die folgenden 7erfahrens8tuf@nfCa) Homogenisieren eines AaQnok®^zlnQm^@v®b®Q von iumorsn, dt» im 7erdaimng08yst@m@pitlä@l @ntst9h®!n9da3 eich von einem embryonalen entodermalen d@w«be ableitet9(b) Behandeln des Hosiogenieate mit einem O-lyeoprotein-Löeungs« mittel,(c) Abtrennen des Nisd@raeiil&gs und Hären d©r· erhaltenen La sung,(d) Dialyeieren der geklärten Löswagp(e) Konzentrieren des BimlyeatSp'(f) Klären der erhaltenen Lösung»(g) Trocknen der geklärten Idsimgs ■(h) Unterwerfen des erhaltenen Materials einer siiaöklisß©ndsn Ohromatographie an sswei verac^hi©denen &elsäul®n9 von denen1Q98S1/18QQBAD ORIGINALdie erste ein Agar ο segel mit etwa 4 &ewo-?6 Agaroee und einer Teilchengröße von 4-0 - 190 u und die zweite ein hydrophiles wasserunlösliches vernetztee Dextranpolynerisatgel äSiiPiteilti (i) Sammeln und Konzentrieren der Eluate9 die ein spektro» photometrischea Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 280 inji und ein Molekulargewicht τοη etwa 200 000 haben, Q) Unterwerfen der gesammelten Eluate einer Elektrophorese, (k) Sammeln der Fraktionen» die von der Aufbringungezone in anodischer Richtung etwa 10 -14 om wandern, wobei gleichzeitig ein Ferritln*»Uarkierungsmittel von Kathodenende in anodisch©? Richtung 18 cm wanderte5) Verfahren nach Anspruch! ι dadurch gekennzeichnet, daß In Stufe (b) als Glycoprotein^Lösungsaittel !Perchlorsäure nit einer Konzentration von 0,5 bis etwa 2 normal vexwendet wird-6) Verfahren naoh Anspruch 4e dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (c) der Niederschlag abgetrennt tind die erhaltene Lösung durch Zentrifugieren geklärt7) Verfahren nach Anspruch 4? dadurch gekennzeichnet.» in Stufe (d) die Lösung gegen Wasser dialysiert wird«,8) Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet P daß in Stufe (e) das Dialyaat durch etwa 24 - 30 stundigeβ par« tielles Lyophylieieren konzentriert wirdo9) Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß in Stuf« (f) die Lösung mittels eines Hocngeschwindlgkeits» zentrifugieren mit etwa 12 000 bis 16 000 Umdrehungen pro Minute und anschließendem Filtrieren mit Filtere mit sich verringernden Porengrööen von etwa 1»2 ji biß zu etwa 0,20 ti geklärt wird»10) Verfahren nach Anspruch 4« dadurch gekennzeichnet s daß in Stufe (g) die geklärte Lösung vor einem Trocknen durch Lyophyli sieren Sc hai en-gefroren wird*11) Verfahren nach Anspruch 4» dadurch gekennzeichnet, daß10 9851/1800in Stufe (h) das Material zuerst in einem wäßrigen Puffer von pH etwa 4»5 gelöst wird, dann durch die Agarosegelsäule läuft, a&n die das CEA enthaltende Fraktion von Materialien mit höherem oder niedrigerem Molekulargewicht und toe kolloidalen Seilchen abtrennt 9 die EIuatβ ait einem spektro« photoaetrischen Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 260 au und einem Molekulargewicht von etwa 200 000 sammelt, dlalysiart und lyopJylieiert, das Lyophylisat in einen wäßrigen Puffer voa pH etwa .4*5 löet «*»& ®s durch eine zweite Säule mit vernetztem Derfcrange! laufen IaUt9 die ein höheres .££·.:. ^/vermögen al β die erste Säule besitzt 9 und schließlich das GSA von Materialion mit höherem und nie.drl<» gerea Molekulargewicht abtrennt o12) Verfahren nach Anspruch 4:. dadurch gekennseiehnetp daß in Stufe (j) als Elektrophorese di® Blockelektrophoreee an» gewendet wird» wobei die aktive Fraktion in einem.Borat-Puffer vom pH etwa 892 bis 9,2 und ,mit einer lonenetärke von etwa 0,0125 bis 0,10 gelöst wird und wobei eine Spannung von etwa 300 «° 500 Y9 eine Stromstärk® von etwa 20 mA und als Markierungsmittel Ferritin angewendet wird«13) Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach An» spruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man CEA mit ■ Jod umsetzt»14) Verfahren au» NaeJhrelJSftn der Anwesenheit voa carcinoembryonalem Antigen nach Anspruch 1, im Blut* dadurch gekennzeichnet, daß man die folgenden Terfaärensstufen durchfuhrt^(a) Zufügen einer abgemessenen Menge von Anti<=-ÖEA»Antiserum -zu einer Probe von mit Psrslilorsäuare extrahiertem Blutseramv(b) Inkubieren des G-emisciieSp(c) Zufügen einer abgemessenen Meng© von radioaktiv mar« kiertem CEA zu dem inkt&blorten QOiiscli®(d) Inkubieren des (k®rnlschi&@v(e) Zufügen eines ProteinfällöagsmitteXs zm Gemisch, wobei all© CEA=Ant3L-GEAwerden und109851/1800bad- 38--(f) Messen des radioaktiven Gehalts des überstehenden oder des Ausgefälltenο .15) Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Stufe (a) das Anti-CEA--Antiserum mit normalem Blutserum auf eine Verdünnung von 1:100 in einem Puffer vom pH etwa 816) Verfahren nach Anspruch 14» dadurch gekennzeichnet; daß in Stufβ (c) das CBA mit 125Jod Markiert wirdο17) Verfahren nach Anspruch 14» dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (β) das nicht umgesetzte GEA in. Lösung verbleibt und18) Verfahren nach Anspruch 14,. dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (f) der radioaktive Gehalt des CEA im Blut durch Vergleich mit,einer Standardkurve bestimmt wird«».19) Verfahren zur Gewinnung von menschlichem earüinoembryo^ nalem Antigen.nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,- daß man mittel« aufeinanderfolgender Chromatographie an einer ersten und einer zweiten Gel säule Fraktionen von Menoliarzi« nomgewebe von Tumoren sammelt, die im Verdauungssyetemctpithel entstehen, das sich von embryonalem.entodermalen @ew®be ab« leitet, wobei diese Fraktionen ein spektrophotometrisoliee Abaorptionemaximua bei einer Wellenlänge von 280 m$i und Molekulargewicht von etwa 200 000 haben und wobei dl® Gel säule ein Agaro segel mit etwa 4 öewo°=$* Agarose und. eiaor Teilchengröße von 40 - 19Ou und einem Fraktionierungsbereieh von 3 χ 105 bis 3 x 106 enthält und wobei die svelte'-Gteleäiil· ein hydrophiles, wasserunlösliches vemetsstes DexJiraiigel mit einer Molekulargevichtsausschlußgrenss© von etwa .200 000 be«' sitzto2Oo Verfahren nach Anspruch 19» dadurch gekennzeichnet, daß al* erste . Gelsäule die das CEA enthaltende Fraktion tob Materialien mit niedrigerem und höherem Molekulargewicht und109851/1800BAD3Dkolloidalen Teilchen abtrennt und ; öio zweite s-ββΐsäule die das GEA enthaltende Fraktion von Materialien alt höherem und niedrigerem Holekttlargawieht abtrennt, das -von dar ersteft Säule nioht aögetrassnä worden21) Verfahren naeh Aasprueh 4» dadureh gekennseiehn©tp daß man mittels Elektrophorese Fraktionen von Ad@nokarzinoiBgewe.be von iuaoren sammelt, die im V-erdauungssystemepithel ent ate hen s das sich von "embryonalem ent©ci©Hssl©a &ewe"b© ableitet, wobei diese Fraktionen toe der AtiftaingiaagBson© Ia snodäseher Hich** tung etwa 10 » 14 ca wandernf wolbel ^©icteeitig ©la Ferritia= Markierungsmittel vom- latiiodeneaöe ia aaöiisclieS' Hiehtung" 18 ca wandert 9 wenn eia Borst-PMffer ψθμ pH 8^6 und von Xonenetärk© von O9OS5, ein© Spasiistmg von 400 ¥ stärke von etwa 20 a& fsrwend®t we?d©ao22) VerfateoB nach Aospraeli 21 9als Slektrophoreseiaedliiiia ein wass
venaetstee DestraapolyiaQrisatjg©! ©if ©ia©2?92 gmögen ·ψο& 2„5 * 092größe vo» 20 « 30 si VQ^w@ni.et wMo23} ferfatwea sair bryonalea Intlgwebeeztraki; ein HemmVerfahrenein homogenisiert©®Gewebe ableitet $ ait ia dem das5?©t@iH-3D!§si3SSgaa Äsatlgea ldsllela let25)als Löaungsmittnach,10^351/1800"etwa 2-noreal verwendet wird«26) Verfahren nach den Ansprüchen 4 ~ 12, dadurch gekennzeichnet, daß nan das Dialysat eines geklärten Perchlorsäure» extraktes teilweise lyophylislert»27) Verfahren zur Gewinnung von für menschliches eareino« embryonalee Antigen spezifischen Antikörpern nach Anspruch 3t dadurch gekennzeichnet, daß man ein warmblütiges Tier mit im wesentlichem meinem menschlich«» caroinoembryonalen Antigen ijaunisiert und dann das bei diesem Tier gebildete Anti-CEA Antiserum sammelt.109851/1800BAD
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