DE2742835A1

DE2742835A1 - Antigenfraktionen von schistosoma mansoni-eiern, geeignet fuer die untersuchung von schistosomiasis

Info

Publication number: DE2742835A1
Application number: DE19772742835
Authority: DE
Inventors: Ronald P Pelley; Kennetz S Warren
Original assignee: MCCONNELL CLARK FOUND
Current assignee: MCCONNELL CLARK FOUND
Priority date: 1976-09-27
Filing date: 1977-09-23
Publication date: 1978-03-30
Also published as: FR2365580B1; EG13397A; CH633808A5; NL7710127A; BR7706417A; GB1543277A; US4158049A; FR2365580A1

Description

VON KREISLER SCHÖNWALD ^ MEYER EISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTING

PATENTANWÄLTE

Dr. linj. von Kicibler t 1973

Dr.-iriij. K. Schönwuld, Kolli

Dl. liKJ. TI). M(.-yur, KuIn

Di In.J. K. W UliolJ, Bad Sodun

Di. J. F. Fucb, KuIn

Dip! Chum. Ali k von Kieisltjr, Köln

Dipl. Ciii.'in. Ciiiuld KuIIlm, KuIn

Dipl. IfKj. G. StlliiKj, KuIn

5 KÖLN 1

tJlli.M/. ΙΙ,ΙΜ,.Ι)) AM HAUI'II;-.|INH( )

22. September 1977 AvK/Ax

Edna McConnell Clark Foundation

2 5o Park Avenue, New York N.Y., USA

Antigenfraktionen von Schistosoma mansoni-Eiern, geeignet für die Untersuchung von Schistosomiasis

Θ09813/0942

Telefon. (0221] 2J 45 41 - 4 Tuk-« :. j2JÜ7dopuJ T. I. ..ι ^-..,i, lJ„n,;,.:t. r.t KoIi.

Die Erfindung betrifft die Gewinnung einer oder mehrerer Antigenfraktionen aus Eiern von Schistosoma. Diese Fraktionen können für den Nachweis von Antikörpern, die gegen reife Eier von Schistosoma gerichtet sind, im Serum von Patienten verwendet werden und ermöglichen daher die Identifizierung von infizierten Patienten.

Millionen Menschen in der ganzen Welt leiden an Schistosomiasis -Infektionen. Das aktive Material Niridazol wird zur Behandlung der Infektion verwendet, seine Verwendung ist jedoch nicht ohne gewisse Gefahren und erfordert sorgfältige ärztliche Aufsicht. Es ist daher erwünscht, die Behandlung nur auf Personen zu beschranken, bei denen mit annehmbarer Sicherheit vorausgesetzt werden kann, daß sie infiziert sind.

Zu diesem Zweck wurden verschiedene Tests vorgeschlagen, von denen einige bei großen Bevölkerungen an Ort und Stelle für eine schnelle, billige, aber angenäherte Siebung anwendbar sind. Andere Tests sind verhältnismäßig kostspielig, aber von begrenzter Genauigkeit. Die Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, einen spezifischen, genauen und billigen Test für Schistosomiasis-Infektionen verfügbar, zu machen.

Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß man eine Radioimmuntestmethode an Seren von möglicherweise infizierten Patienten anwendet, wobei eine Fällung gebildet wird, deren Radioaktivitätshöhe ein Anhaltspunkt für das Ausmaß und/oder die Art der Infektion beim Patienten ist.

Das beim Immuntest verwendete radioaktiv markierte Material wird nach einem speziellen Verfahren aus Antigenen von Schistosoma-Eiern hergestellt. Die Anti-

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gene werden isoliert, fraktioniert und gereinigt. Ausgehend von reifen Eiern von Schistosoma mansoni vermögen die in dieser Weise erhaltenen radioaktiv markierten Fraktionen die Anwesenheit von reifen Eiern von Schistosoma im Blut eines Patienten zu entdecken, gleichgültig, ob es sich um Schistosoma mansoni, Schistosoma japonicum oder Schistosoma haematobium handelt. Eine der erfindungsgemäß hergestellten Fraktionen ist sogar spezifisch für Schistosoma mansoni in der Phase von reifen Eiern, so daß es möglich ist, sogar zwischen Patienten, die gegenwärtig mit Schistosoma mansoni infiziert sind,und Patienten, die nicht infiziert sind, jedoch gegen Schistosoma mansoni gerichtete Antikörper auf Grund einer früheren Infektion mit Schistosoma mansoni enthalten, zu unterscheiden. Die Fraktion kann ferner zwischen Patienten, die mit Schistosoma mansoni infiziert sind, und Patienten, die mit Schistosoma japonicum und/oder Schistosoma haematobium infiziert sind, unterscheiden.

Zur Herstellung der Fraktionen wird das Antigen von

Eiern von Schistosoma mansoni fraktioniert. Im einzelnen werden die Eier in Wasser gemahlen, wobei das lösliche Ei-Antigen (soluble egg antigen = SEA) in Lösung geht, die von den ungelösten Feststoffen abgetrennt wird. Die Lösung wird der Affinitätschromatographie und Elution unterworfen, wobei eine dritte Fraktion, die nachstehend als MSA₃ (mansoni soluble antigen-3.Fraktion) bezeichnet wird, am schwächsten festgehalten wird. Eine zweite Fraktion, die mit MSA_ bezeichnet wird, wird weniger schwach festgehalten und läuft bei der Elution ab, während eine erste Fraktion, mit MSA.. bezeichnet, stark festgehalten und als letzte Fraktion ausgewaschen wird. Diese MSA..-Fraktion ist die besonders erwünschte Fraktion.

Jede Fraktion kann beispielsweise durch Ionenaustausch-

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Chromatographie gereinigt und entsalzt werden. Ferner kann jede Fraktion in jeder Phase ihrer Gewinnung radioaktiv markiert werden, und die markierte Fraktion, insbesondere MSA^, kann in geringer Menge mit dem Serum eines Patienten gemischt werden, wobei eine Fällung abgeschieden wird. Die Intensität der Radioaktivität in der Fällung zeigt an, ob der betreffende Patient mit Schistosoma mansoni infiziert war, wobei zwischen alten und gegenwärtigen Infektionen und selbst zwischen Schistosoma mansoni und den verwandten Schistosoma japonicum und haematobium unterschieden wird.

Das Verfahren wird nachstehend ausführlicher erläutert. Die Eier von Schistosoma mansoni können aus einer beliebigen Quelle erhalten werden, jedoch sind Leber oder Darm von infizierten Mäusen oder anderen Laboratoriumstieren ein geeignetes Ausgangsmaterial. Die Organe werden zerhackt, um die Eier freizulegen, und können mit Trypsin digeriert werden, um vollständigere Extraktion zu ermöglichen. Die Eier werden in Wasser oder Kochsalz lösung mazeriert, um die darin enthaltenen löslichen Antigene freizulegen, worauf die Feststoffe beispielsweise durch Ultrazentrifugieren entfernt werden.

Der flüssige Überstand, der das gewünschte Antigen in Mischung mit anderen Antigenen, niedrigmolekularen Digestionsprodukten, Salzen und/oder Wasser enthält, kann gegen Kochsalzlösung dialysiert werden,.um das niedrigmolekulare Material zu entfernen. Dies kann beispielsweise geschehen, indem eine verschlossene schlauchförmige Membran, die die Flüssigkeit enthält, /in Kochsalzlösung getaucht und Vakuum an die Kochsalzlösung gelegt wird (Fig.l). Durch Dialyse und gleichzeitige Pervaporation kann somit die gewünschte Flüssigkeit von dialysierbarem Material befreit werden, während sie fünffach, zehnfach oder sogar zwanzigfach oder noch

35 stärker konzentriert wird.

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Es ist auch möglich, das dialysierbare Material zu entfernen, indem es durch eine Säule des Harzes "Sephadex G-25" geleitet wird.

Die konzentrierte Lösung wird dann der Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung eines geeigneten Adsorptionsmittels, z.B. des Polygalactans der Handelsbezeichnung "Sepharose", an das Concanavalin A gebunden ist, unterworfen. Das Mengenverhältnis ist in keiner Weise wichtig, jedoch erwies sich ein Volumenverhältnis des Adsorptionsmittels zur Lösung von etwa 3:1 bis 4:1 als besonders vorteilhaft. Die durch das Adsorptionsmittel laufende Flüssigkeit enthält eine hier als MSA- bezeichnete Fraktion, die offensichtlich die geringste Affinität zum Adsorptionsmittel hat.

Durch Elution des Adsorptionsmittels mit einer verdünnten Zuckerlösung, die beispielsweise etwa 1 bis 20 Gew.-% Glucose enthält, wird eine zweite Fraktion, MSAp, frei. Abschließend wird mit einem stärker konzentrierten Elutionsmittel, z.B. etwa Ibis 2 Gew.-%igem a-Methylglucosid oder a-Methylmannosid, eine dritte Fraktion, MSA,., frei, die die besonders erwünschte Fraktion gemäß der Erfindung ist.

Jede dieser Fraktionen kann einzeln gereinigt werden, um geringe Anteile anderer Fraktionen daraus zu entfernen.

Dies kann durch Gelfiltration beispielsweise unter Verwendung der Gruppe·von Gelen, die als "Biogel A" oder "Sephadex" im Handel und Glucane oder Galactane sind, erreicht werden. Jedes Gel enthält Löcher in einem bestimmten Größenbereich, in denen Moleküle einer bestimmten Größe festgehalten werden. Durch Wahl eines bestimmten Gels kann das gewünschte Material bevorzugt vom Gel festgehalten (zurückgehalten) oder nicht festgehalten werden, während die Verunreinigungen entgegengesetzt beeinflußt werden. Wenn das MSA. stark zurückgehalten wird, kann es beispielsweise mit einer Salzlösung,

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Gew. z.B. etwa 0,9- bis 4,5'%iger Natriumchloridlösung,

eluiert werden.

Ein weiteres bevorzugtes Reinigungsverfahren, das vor, nach oder an Stelle der Gelfiltration angewandt werden kann, ist die Ionenaustauschchromatographie, für die Diethylaminoethylcellulose (DEAE) ein repräsentatives Adsorptionsmittel ist. MSA.. wird von einem solchen Adsorptionsmittel verhältnismäßig stark festgehalten, während MSA- nur schwach und MSA„ kaum zurückgehalten wird. Die Elution zur Entfernung von MSA- kann mit verdünnter Salzlösung, z.B. etwa 0,02-molarer Natriumphosphatlösung oder Natriumchloridlösung bei pH 7 erfolgen.

Jede Fraktion kann einzeln in einer beliebigen Stufe oder auch vor der Abtrennung von den anderen Fraktionen radioaktiv markiert werden, jedoch erfolgt die Markierung zweckmäßig nach der Gelfiltration und/oder Ionenaustauschchromatographie der Einzelfraktionen. Als

125 radioaktives Atom eignet sich u.a. J, das nach der Chloramin-T-Methode angeheftet werden kann. Diese Methode wird ausführlich von Hunter in Kapitel 18 von "Handbook of Experimental Immunology¹¹ (1967), herausgegeben von Weir, Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, beschrieben. Anscheinend heftet sich das Jod an den Phenylring einer Thyrosinmolekularein heit. Auch andere gleichwertige Verfahren können ange-

125 wandt werden. Da nicht das gesamte J an das Antigen gebunden wird, erfolgt die Entsalzung zweckmäßig vor dem Gebrauch der Fraktion. Wenn beispielsweise die Markierung mit Jod vor der Gelfiltration und/oder Ionenaustauschchromatographie erfolgt, dient die Gelfiltration an "Sephadex G-25" unter Verwendung eines verdünnten Elutionsmittels, z.B. 0,01-molarem Natriumphosphat bei pH 7, dazu, die Salze festzuhalten, während die gereinigte Antigenfraktion MSA₁ eluiert wird. Wenn

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die Markierung nach der Ionenaustauschchromatographie erfolgt, eignet sich die Entsalzung an "Sephadex G-25" oder "G-200", wobei als Puffer eine etwa 0,14-molare Natriumchloridlösung, die etwa 1 mg/ml menschliches Serumalbumin enthält, verwendet wird.

Die gereinigten Fraktionen sind relativ spezifisch für die Anwesenheit von Schistosoma-Eiern im Serum und bilden eine Fällung. Die MSA^-Fraktion ist bei Anwendung der Ammoniumsulfatmethode zur Messung der Antigen- bindung, die von Minden und Farr in Kapitel 13 von "Handbook of Experimental Immunology" (loc.cit.) beschrieben wird, oder vergleichbarer Methoden besonders empfindlich. Eine geringe Menge der Antigenfraktion wird mit einer geringen Menge Blutserum eines zu unter suchenden Patienten gemischt. Nach Bebrütung wird durch Zugabe einer Salzlösung, z.B. gesättigter Natriumsulfatlösung oder vorzugsweise Ammoniumsulfatlösung, eine Fällung gebildet. Die relative Intensität der Radioaktivität in der Fällung ist ein Maß der relativen Menge des gegen Eier von Schistosoma mansoni in der Probe gerichteten Antikörpers. Auf Grund der Empfindlichkeit des Tests ist er bei der Diagnose des Vorliegens der Krankheit vergleichsweise genau.

Beim Radioimmuntest kann eine geringe Menge Kaninchenserum der Blutserumprobe zusammen mit der MSA^-Fraktion und Kochsalzlösung zugesetzt werden. Es dient als Träger und dazu, der Fällung, die sich bei Zugabe der Ammoniumsulfatlösung bildet, Masse zu verleihen, d.h. das größere Volumen der Fällung läßt sich leichter abtrennen und auf Intensität der Radioaktivität testen. Als grober Anhaltspunkt kann gesagt werden, daß, wenn 50% oder mehr der Radioaktivität des markierten MSA. in die Fällung gelangt, dies ein positives Anzeichen ist. Dieser Wert kann sich natürlich durch Verwendung unterschiedlicher Serummengen, Methoden o.dgl. verschieben.

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Die neue Methode ist im Vergleich zu anderen anerkannten Tests sowohl positiv als auch negativ zuverlässiger, verhältnismäßig leicht durchzuführen und erfordert nur ein geringes Serumvolumen.

Innerhalb der vorstehenden Erläuterungen ergeben sich ohne weiteres zulässige Variationen, besonders wenn erkannt wird, daß eine Fraktion mit solcher Spezifität nach irgendeiner Methode isoliert werden kann.

Die Abbildung zeigt ein Fließschema der Verfahrensstufen ausgehend von löslichen Antigenen von Eiern von Schistosoma mansoni bis zu den gereinigten Fraktionen.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter erläutert. In diesen Beispielen verstehen sich die Teile als Gewichtsteile, falls nicht anders angegeben.

15 Beispiel 1

a) Die Lebern und Därme von 200 Mäusen, die in bekannter Weise mit Schistosoma mansoni infiziert worden waren, werden entnommen und in genügend Kochsalzlösung gemahlen, um die Organe zu bedecken. Die Organlösung wird mit Trypsin digeriert, worauf die Eier abfiltriert und gewaschen werden. Die Eier werden in Kochsalzlösung gemahlen und die Feststoffe durch Zentrifugieren entfernt. Die restliche Flüssigkeit enthält lösliches Ei-Antigen (SEA) und Salze in Wasser gelöst.

b) Die Flüssigkeit, die in einer teilweise in Kochsalzlösung tauchenden schlauchförmigen Dialysemembran eingeschlossen ist, wird der Dialyse unterworfen, wodurch niedrigmolekulare organische Materialien in die Kochsalzlösung übergehen. Gleichzeitig bewirkt ein Vakuum

30 außerhalb der Membran oberhalb der Kochsalzlösung

Pervaporation von Wasser im Ausmaß einer 20fachen Verdampfung, wobei eine konzentrierte Lösung, die etwa

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4 mg SEA auf Trockenbasis enthält, erhalten wird.

c) Die Lösung wird in bekannter Weise der Affinitätschromatographie in einer Chromatographiesäule unterworfen, die als Adsorptionsmittel IO ml des Galactans "Sepharose" enthält, an das "Concanavalin A" gebunden ist. Nach der Adsorption wird eine Fraktion gewonnen, die ein Antigen enthält, das nicht am Adsorptionsmittel haftete. Dieses im wesentlichen nicht haftende Material wird als MSA- identifiziert. Tatsächlich haftete offensichtlich eine geringe Menge des gleichen Materials am Adsorptionsmittel. Dieses Material wird anschließend als Teil der Reinigung abgetrennt.

Dann werden durch die Säule 20 ml einer 10%igen Glucoselösung geleitet, wobei eine Eluatfraktion aufgefangen' wird, deren Hauptkomponente als MSA- identifiziert wird. Eine anschließende Elution mit 20 ml einer 2%igen Lösung von a-Methylglucosid (oder a-Methylmannosid) ergibt eine Eluatfraktion, die MSA₁ (etwa 1000 uq) als Hauptkomponente zusammen mit geringen Mengen MSA_ und

20 MSA., als Verunreinigungen enthält.

125 d) Die MSA^-Eluatfraktion wird dann mit J unter Verwendung von Chloramin T nach der Methode von Hunter (loc.cit.) markiert, wobei die Jodatome sich offensichtlich an Tyrosinringe heften. Die Lösung wird dann entsalzt, indem sie durch eine Säule von 20 cm Höhe und 0,5 cm durchmesser, die das Adsorptionsmittel "Sephadex G-25" enthält, geleitet wird, worauf die Säule mit 50 ml 0,01-molarer Natriumphosphatlösung bei pH 7,0 entsalzt wird.

e) Das Eluat wird durch Ionenaustauschchromatographie an einer Säule gereinigt, die 2 cm Diäthylaminoäthyl (DEAE)-Cellulose enthält und dann mit 5 ml 0,02-molarem Natriumchlorid (oder Natriumphosphat) bei pH 7 eluiert wird. Etwaiges MSA„, das im Ausgangsmaterial enthalten ist, geht zuerst durch die Säule, während das MSA- bei

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der Elution gewonnen wird. Durch weitere Elution mit 10 ml 0,1-molarer Natriumchloridlösung wird ein Eluat erhalten, das 100 ug MSA. in hochreiner Form enthält, das jedoch an einer Säule des Adsorptionsmittels "Sephadex G-200" durch Elution mit Natriumphosphat, wie im Abschnitt (d) beschrieben, noch etwas weiter gereinigt werden kann.

f) Die Radioimmuntests werden nach einer Modifikation der Methode von Minden und Farr (Handbook of Experimental Immunology", Kapitel 13, loc.cit.) durchgeführt. Die Durchführung dieses Tests erfolgt bei einer von zwei Empfindlichkeitsstufen. Bei einem Vortest oder Suchtest, durch den festgestellt werden soll, ob ein Patient von Schistosomiasis befallen ist oder nicht,

12S werden 5 ^uI Serum mit 5 bis 10 mg ³J-MSA₁ in 0,5 ml

Puffer (mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung-10% normales Kaninchenserum) bebrütet. Bei einer zweiten Version dieses Tests, die dazu dient, die Antikörpermenge im Serum von infizierten Patienten quantitativ zu bestimmen, werden 0,5 ul Serum mit Antigen bebrütet. Nach Bebrütung bei 37°C für 15 Minuten und anschliessender Bebrütung bei 4°C für 15 Minuten wird 0,5 ml kalte gesättigte Ammoniumsulfatlösung zugesetzt, worauf das Gemisch wenigstens 2 Stunden bei 4°C gehalten wird. Die Fällung, die den Antikörper mit daran gebundenem

¹^J-MSA₁ enthält, wird durch Zentrifugieren bei 2000 g

für 15 Minuten pelletisiert. Der Überstand mit dem

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nicht gebundenen J-MSA,. wird abgegossen, und die Radioaktivität im Pellet und im Überstand wird quantitativ gemessen. Die prozentuale Antigenbindung ist durch die folgende Formel gegeben:

% Antigenbindung - ^{x 1OC} ^y * ZPM über Hintergrund im Pellet +

ZPM über Hintergrund im Überstand ·ΖΡΜ - Zählimpulse/Minute

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Beispiel 1 veranschaulicht die Jodmarkierung in einer bestimmten Stufe, jedoch kann sie auch in anderen Stufen der Reinigung vorgenommen werden. Dies wird durch das folgende Beispiel veranschaulicht.

5 Beispiel 2

a) Der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wird bis zur Stufe (c) einschließlich wiederholt.

b) Das Material wird durch Behandlung mit dem Adsorptionsmittel "Sephadex G-200", an dem MSA. nur leicht festgehalten wird, gereinigt. Die Elution erfolgt mit 0,7%iger Natriumchloridlösung.

c) Als Alternative zu (b) wird das Produkt von (a) mit dem Adsorptionsmittel "Biogel A 1,5" gereinigt. Dieses Material hält das MSA. stark zurück.

d) Das Produkt von (b) oder (c) wird auf die in Beispiel 1 (e) beschriebene Weise weiter gereinigt und auf die in Beispiel 1 (d) beschriebene Weise unter Ver-

125 wendung von Chloramin T mit Jod markiert. Das mit J markierte MSA. wird dann am Adsorptionsmittel "Sephadex G-25" oder "G-200" unter Verwendung von 0,14-molarem NaCl-Puffer, der 1 mg/ml menschliches Serumalbumin enthält, entsalzt.

125 MSA. mit oder ohne Markierung durch J ist ein Glykoprotein, das in der Größe zwischen IgG und Albumin

125

liegt. Die Analyse von gereinigtem J-MSA."durch Gelfiltration ergibt ein Molekulargewicht von 138.000 j+5OOO, Sein Verhalten (R.F.0,33) bei der Standard-Elektrophorese an 7,5% Polyacrylamidgel nach Ornstein und Davis (PAGE) stimmt mit diesem Molekulargewicht überein. Bei dieser Methode wird teilweise der Stokes'sehe Radius (größter Durchmesser) eines Moleküls gemessen. Die Sedimentationsgeschwindigkeit bestimmt das Molekulargewicht durch Diffusion durch eine Lösung (gemittelte Quer schnittsfläche). Mit Hilfe dieser Methode wird durch

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Ultrazentrifugieren von J-MSA₁ durch Saccharosegradienten seine Größe mit 90 bis lOO.OOO Dalton ermittelt. Das aus dem Stokesschen Radius bestimmte Molekulargewicht ist im allgemeinen größer als das wahre

Molekulargewicht bei Glykoproteinen, die eine wesent-

125 ' liehe Menge Kohlenhydrat enthalten. Wenn man J-MSA₁

in Gegenwart von SDS und 2-Mercaptoäthanol (2-ME) sieden läßt und der Elektrophorese an 10%igen Acrylamidgelen unterwirft, die 1% SDS enthalten (Tabelle 1, , 10% SDS-2ME), hat es ein Molekulargewicht von 5o.OOO. Wenn die Bestimmung des Molekulargewichts der intakten Untereinheit durch Sedimentationsgeschwindigkeit richtig ist, kann MSA. ein Dimeres sein, das aus zwei isoelektrischen Polypeptidketten von je 50.000 Dalton , 15 besteht.

MSA₁ hat die chemischen Eigenschaften eines klassischen Glykoproteins. Bei der Elektrophorese an Polyacrylamidgel (PAGE) wird nicht markiertes MSA₁ (R.F.0,33) mit Coomassieblau (Protein) und PAS (Kohlenhydrat), 20 aber nicht mit Sudanschwarz (Lipid) gefärbt (Tabelle I). Bei der Ultrazentrifugierung in CsCl ergibt J-MSA₁ einen einzelnen homogenen Peak mit einer Dichte (buoyant density) von 1,43 _+ 0,01 g/cm ( Mittel _+ sem, j doppelte Bestimmungen an drei Präparaten). Dies liegt innerhalb des erwarteten Bereichs für ein Glykoprotein j mit wesentlichem Kohlenhydratgehalt. MSA₁ (markiert j oder unmarkiert) bindet sich stark an Con A. Die Elution erfolgt bei 0,1-molarer Zuckerkonzentration mit a-Methyl-Mannosidgradienten. Dies läßt darauf schließen, daß der Kohlenhydratteil von MSA₁ eine hohe Dichte von endständigen Zuckerresten mit a-l^-Glucopyranosidbindungen hat. Die meisten Glykoproteine haben eine negative Ladung. Gereinigtes J-MSA₁ hat einen isoelektrischen Punkt zwischen 3,5 und 4,5, ein Zeichen für eine solche negative Ladung. In Übereinstimmung mit

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einer negativen Ladung bindet sich MSA.. (markiert und unmarkiert) leicht an die positiv geladenen Diäthylaminoäthylgruppen in DEAE.

MSA- ist ein homogenes, verhältnismäßig leicht zu reinigendes Protein. Die Anfärbung ergibt, daß es wenig nachweisbares Kohlenhydrat enthält. Im Einklang hiermit ist das Verhalten von MSA^ an Concanavalin A-Sepharose. Die Molekulargewichtsbestimmungen durch Gelfiltration und durch Elektrophorese an Polyacrylamidgel stimmen gut überein.

p ist ein heterogenes Lipoglykoprotein, das möglicherweise aus der Miracidalzellmembran stammt. Eine überwiegende Spezies wird fast immer aus SEA, R.F. 0,22, isoliert. Diese Spezies hat eine mäßige Stabilitat und kann bis zur Homogenität gereinigt werden, wie sowohl durch SDS als auch Ornstein-Davis-Eiektrophorese an Polyacrylamidgel festgestellt. Die beiden anderen Spezies werden gelegentlich beobachtet, nämlich eine mit R.F. 0,08, die verhältnismäßig stabil ist, jedoch nur in geringen Konzentrationen gefunden wurde, und eine andere (0,18), die sich als instabil erweist. Ein noch sehr vorläufiger Beweis läßt darauf schließen, daß gewisse antigene Eigenschaften von MSA„ auf eine MSA.-artige Aktivität zurückzuführen sind.

Die vorstehend dargelegten Eigenschaften sind nachstehend in Tabelle I zusammengestellt.

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Tabelle 1
Eiochemische Eiaenschaften von gereinigten seroloaischen Voll-Antigenen

PAGE

KSA.

MSA.

FSA 2

Vorwiegende Gelegentlich Spezies beobachtete Spezies

R.F.

Färbung

α, Protein (Coomassieblau)
ο Kohlenhydrat (PAS)
to Lipid (Sudanschwarz)
oo
—* Concanaval in-A-Bindung

cd CsCl-"buoyant" Dichte

Molekulargewicht

Gelfiltration³
Sedimentationsgeschwindigkeit
PAGE⁵ (R.F.)

0,34 +_ 0,01

0,48 +_ 0,01 0,22 +. 0,01 0,08 0,18

stark adsorbiert lose adsorbiert

oder nicht adsorbiert

1,43 +_ 0,01 g/ml 1,54 g/ml⁽²⁾ (homogen)

138.000.+ 5000

90.000-100.000 50.000 (0,50)

80.000.+ 5000

40.000 69.000 (0,33) lose adsorbiert

heterogen nicht bestimmt ' (1,51-1,37) ^

450.000+_8000 nicht bestimmt

>200.000 nicht bestimmt >200.000 nicht bestimmt

Ladung (isoelektr. Punkt) - (pH 3,5-4,5)

Fußnoten zu Tabelle 1

Diskontinuierliche Elektrophorese an Polyacrylamidgel unter Verwendung von 7,5% Gel nach der Methode von Ornstein und Davis, pH 9,5.

Dieser Wert kann infolge Komplexbindung von MSA₃ mit Cs -Ionen anomal sein. Die Eigenschaften dieses Antigens scheinen durch Einwirkung dieses Salzes verändert zu sein.

³⁾"Sephadex G-200" wurde für MSA₁, G-IOO und G-200 für

^MSA3 ^unc* ^Ei°9^el ^A 1»5 für die vorwiegenden Spezies 4),

von MSA» verwendet.

Ultrazentrifugierung in Saccharosegradient; 5 bis 20%ig für MSA₁ und MSA₃, 5 bis 20%ig und

20 bis 40%ig für MSA₃.

10% Acrylamidgele, die SDS enthalten; nach Sieden für 15 Minuten in SDS und 2-MercaptoMthanol durchgeführt,

Scheint zu Peptiden abgebaut zu werden.

Es ist zu beachten, daß dieser Wert mit gereinigtem,

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mit J markiertem Material erhalten wird, und daß die Ladung eines Moleküls durch die Isolierungs- und Radiomarkierungsmethoden verändert werden kann.

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i 125 '

' Wie bereits erwähnt, ist J-MSA₁ sowohl stufenspezi-

■ fisch als auch artspezifisch. Untersuchungen der Anti- ■ genkonkurrenz haben ergeben, daß MSA₁ vollständig stufenspezifisch ist, da seine Bindung an das Serum der

■ 5 chronischen Infektion durch S.mansoni (S.mansoni chronic' j infection serum - CIS)) weder mit dem Antigen von

; Zerkarien noch mit dem Antigen von geschlechtsreifen !

I {

I Würmern gehemmt werden kann. MSA^ und MSA- sind spezi- ' I fisch für das Antigen von geschlechtsreifen Würmern, aber ! 10 ihre Bindung an CIS wird durch Zerkarien-Antigen leicht
; I

i gehemmt. Unreife Eier im Vergleich zu reifen Eiern enthalten nur unbeachtliche Mengen von MSA₁, während MSA₂ ι und MSA₃ in großen Mengen vorhanden sind. Flüssigkeit von Eiern, die in Quellwasser ausgebrütet worden sind j 15 (Hatch Fluid ■ HF » Ausbrütflüssigkeit), enthalten er-, hebliche Mengen von MSA₁ sowie MSAp und MSA-. Hinsicht- ! ! lieh der Art-Spezifität geht MSA. im wesentlichen keine ■ ι ^L i

Kreuzreaktion mit rohen löslicheh Ei-Antigenen (SEA)

: von S. japonicum und S.haematobium ein, während MSA₂ und ; 20 ^MSA3 teilweise Kreuzreaktionsfähigkeit aufweisen. Anti- j

I körper-Verdünnungsuntersuchungen mit Seren von Tieren ; und Menschen, die mit Spezies von heterologen Schisto- j somen (S.japonicum und S.haematobium) infiziert waren, j bestätigen indirekt den hohen Grad der Artspezifität ]

25 von MSA^.

Die Artspezifität beim Menschen wurde wie folgt bestätigt:

Beispiel 3 Seren wurden von Patienten in St.Lucla auf den Westindi-

30 sehen Inseln und Machakos in Kenia entnommen. Die Patienten auf der Insel St.Lucia pflegen sich leicht mit Schistosomiasis zu infizieren und wurden vorher immunologisch, parasitologisch und pathologisch untersucht. Vergleichsseren wurden von Patienten auf der Nachbar-

35 insel St.Vincent, 30 Meilen entfernt, wo Schistosomiasis

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nie beobachtet wurde, entnommen. Diese Patienten von ' der Insel St. Vincent waren jedoch gleichmäßig mit Eingeweidewürmern, die nicht zu Schistosoma gehören, infiziert. Diese Seren stellen somit eine geeignete Kontrolle dar, mit der bestimmt werden kann, ob der ι MSA.,-Radioimmuntest spezifisch für Schistosomiasis unter den Eingeweidewürmern war. Beispielsweise waren von den j Jugendlichen auf St.Vincent 71% mit wenigstens einem der¹ folgenden Parasiten infiziert: Ascaris lumbricoides, ; Trichuris trichiuria oder Hakenwurm. Alle in diesem Beispiel analysierten 227 Seren von St.Lucia/St.Vincent waren vorher in einer früheren Untersuchung durch das Zentrum für Krankheitsbekämpfung in Atlanta, Georgia, unter Anwendung von vier serologischen Tests auf Schisto-

15 somiasis untersucht worden.

Die zweite untersuchte größere Bevölkerung in Kenia zeigte nur einen geringen Befall mit Infektionen durch Eingeweidewürmer (Ascaris 1,4%, Trichuris 0,2%, Haken- ] wurm 8,9%). Infektionen mit S.haematobium sind selten (5%).

Abschließend wurden zwei weitere mit Schistosoma infizierte Bevölkerungen auf Anwesenheit von kreuzreaktiven , Antikörpern untersucht. 20 Serumproben wurden von Patienten in den Philippinen entnommen, die mit S.japonicum infiziert waren. Von diesen 20 Seren wurden 15 ! von Patienten ohne Krankheit (außer Hepatosplenomegalie) ausgewählt, die im Alter ungefähr zu 15 erwachsenen Patienten von St.Lucia und 15 erwachsenen Patienten von St.Vincent passten. Seren wurden auch von Kindern in Kenia entnommen, die mit S.haematobium infiziert waren.

Der in Beispiel Kf) beschriebene serologische Test mit 5 jul wurde dann mit dem Serum von 49 infizierten Erwachsenen von St.Lucia und 20 nicht infizierten Erwachsenen von St.Vincent durchgeführt, um festzustellen, ob eine Bindung von,mehr als 50%_ÄMSA„ tatsächlich ein

empfindlicher Test für Schistosoma-Infektionen war.

Alle Seren der mit Schistosoma infizierten Patienten ι von St.Lucia mit Ausnahme von einem (98%) waren posi-

125 tiv und banden signifikante Mengen von J-MSA^. Dies ist ein Beweis für die ausgezeichnete Empfindlichkeit des MSA^-Radioimmuntests. Seren der Patienten von St.Vincent banden nie mehr MSA.. als die im Puffer vorhandenen 50 ul des normalen Kaninchenserums (St.Vincent-Seren - Antigenbindung von 20 Seren 36,16 _+_ Standardabweichung; Puffer enthaltendes normales Kaninchenserum - 32% Antigenbindung). Es besteht keine signifikante Überschneidung zwischen den infizierten Gruppen (St.Lucia) und den nicht infizierten Gruppen (St.Vincent). Da Eingeweideparasiten, beispielsweise die Würmer Trichuris, Ascaris und der Hakenwurm, auf St.Vincent ^! endemisch sind, wird der MSA^-Radioimmuntest offensichtlich nicht durch Infektionen mit anderen Würmern beeinflußt.

Anschließend wurde der MSA.-Radioimmuntest bewertet, um festzustellen, ob er in der Lage ist, zwischen Populationen, die mit den drei Hauptarten von Schistosoma ' (S.mansoni, japonicum und haematobium) infiziert sind, zu differenzieren. Serum von philippinischen Patienten, > die mit S.japonicum infiziert waren, enthielt bedeutende Mengen Antikörper gegen S.mansoni MSA,. (18/20 parasiten-! positive Patienten waren auch bei dem mit 5 ul Serum durchgeführten MSA.-Radioimmuntest positiv). Daher wurden 0,5 ul getestet, um die Konzentrationen von Anti-S-mansoni-MSA^-Antikörper guantitativ zu bestimmen.

15 Seren wurden von erwachsenen Patienten (Durchschnittsalter 38,4 Jahre) ausgewählt, die mit S.Japonicum infiziert, jedoch frei von ernsten Krankheiten (Ascites, Varizen der Speiseröhre oder zerebrale Manifestationen) waren und daher als leicht infiziert angesehen wurden.

35 Seren wurden auch von 15 erwachsenen Patienten mit

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leichten Infektionen durch S.mansoni auf St.Lucia und 15 Erwachsenen von St.Vincent, die frei von Infektionen durch Schistosoma waren, entnommen. Kontrollseren (St.Vincent) banden nicht spezifisch signifikante Mengen von J-MSA₁ (mittlere Eindung 33% gegen Grundlinie, 32% Bindung in Puffer allein). Seren von mit S.japoni- ι cum infizierten Philippinos banden spezifisch kleine ' (38%), jedoch signifikante Antigenmengen (p kleiner als ! 0,001 gegenüber Kontrollseren von St.Vincent). 0,5 ul ; Serum von leicht infizierten Patienten von St.Lucia (S.mansoni) banden weit mehr Antigen (Durchschnitt 58%)·» Von diesen Seren banden sieben selbst bei 0,5 ul das gesamte verfügbare MSA^-Antigen, während der Rest der Seren, wie bei einem quantitativen Test zu erwarten, bedeutende, aber verstreute Antigenbindungsfähigkeiten hatten. Es bestand eine gewisse Überschneidung zwischen '

; den Anti-S.mansoni-MSA₁-Konzentrationen von mit S.japonicum und S.mansoni infizierten Patienten, jedoch bestand eine äußerst signifikante Differenz (p kleiner als;

ι 20 0,001) zwischen den beiden Populationen. Der mit 0,5 ul j durchgeführte quantitative MSA^-Radioimmuntest ermög- i licht somit die Unterscheidung zwischen Populationen, j

; die mit diesen beiden Schistosoma-Arten infiziert sind.

Abschließend wurde ein Versuch mit den 0,5 ul Serum j '

t 25 durchgeführten MSA.-Radioimmuntest gemacht, um

zwischen Populationen,. die mit S.mansoni und S.haematobium infiziert sind, zu differenzieren. Diese beiden ! Schistosoma-Arten sind eng verwandt, und selbst mit den ausgeklügeltsten serologischen Tests bestehenSchwierigkeiten, Infektionen mit S.haematobium von solchen mit S.mansoni zu unterscheiden. Eine Gruppe von Jugendlichen und Kindern wurde ausgewählt, die mäßig stark mit S.haematobium infiziert waren. Ferner wurde eine Gruppe von Patienten, die mäßig stark mit S.mansoni infiziert waren und altersmäßig mit der ersten Gruppe überein-

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stimmte, ausgewählt. 93% der mit S.haematobium infizierten Patienten waren positiv bei dem mit 5 jul Serum durch- j geführten MSA₁-Radioimmuntest. Wenn ihre Seren jedoch \ ι dem mit 0,5 ul durchgeführten quantitativen Test unter- ' worfen wurden, bestand fast keine Überschneidung der '

Häufigkeitsverteilung ihrer Antigenbindungswerte im !

Vergleich zu der mit S.mansoni infizierten Population. Patienten, die mit S.haematobium infiziert sind, bilden zwar Antikörper, die mit S.mansoni-MSA^ reagieren, jedoch bilden sie weit weniger dieses Antikörpers als ^! Patienten mit vergleichbaren Infektionen durch S.mansoni·

j In Tabelle II sind die Ergebnisse des Radioimmuntests

(

(RIT) bei den Patienten von St.Lucia/St.Vincent unter i Verwendung von MSA^ «it den Ergebnissen von vier anderen:

Tests, die im vorstehend genannten Zentrum für Krank- j heitsbekämpfung durchgeführt wurden, verglichen. Die

anderen Tests sind weit teurer, erfordern weit mehr '

Material und sind nicht so zuverlässig. _;

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Test

Komplementbindung

Cholesterin-Lecithin-

Kinder

St.Lucia St.Vincent

Tabelle II

Jugendliche Erwachsene Reine Bewer-

33%

St.Lucia St.Vincent St.Lucia St.Vincent i^u"?^: .,

% diagnostl-

ziert

9%

58%

6%

62%

33%

ο co	Ausflockung	19%	ESA)	44%	6%	57%	8%	47%	0%
	Sensitive
	Immunfluores			64%
■^.	zenz	61%		6%	76%	12%	82%	0%
<=>	(0,1% BS 0,1%
co
(O	Spezifische
	Immun
ί	fluoreszenz
	(1% ESA)	0%	72%	2%	76%	0%
	MSA₁-RSdIo-
i	immuntest	0%	83%	0%	98%	0%

% falsch 54%/12%

48%/6%

74%/8%

Zahl der Patienten 36

32

40

49

20

227

-ti

Früheres Verfahren zur Antigen-Reinigung

Antlgen-Herstellung einmal wöchentlich

Antigen-Reinigung einmal monatlich

Tag 1

D E

Tag 2 nicht-adsorbierend

SEA-Proteine (MSA₃) Tag 3

Tag 4 D Tag 5

D, A

Tag 6, 7 A χ 10⁶ Eier von S.Mansoni (50 Mäuse)

Mahlen in großer Ten-Broeck-Mühle in 10 ml 0,15-molarem NaCl

I Ultrazentrifugieren - 2 Stunden i Gefrieren Nr. 1

j nach Auftauen: Zentrifugieren

Rohes SEA (10 ml), Aufbewahren 1 Woche

bis 3 Monate

Rohes SEA (40 ml) Nr. 2

Konzentrieren - Dialyse 0,15-molares NaCl - Con A-Puffer

Entsalztes SEA (2-3 ml)

Affinitätschromatographie an Concanavalin A-Sepharose 4B (Säule von 0,5x15 cm - 0,15-molares NaCl-Con-A-Puffer)

Mit Glucose- * mit Methyl-<j6~mannose qradient eluiert eluiert

SEA-Glykoproteine (MSA₃+MSA₂) (MSA₁)

SEA-Glykoproteine

Konzentrieren-Dialyse-0,01-molares Phosphat, pH 6,9.

Ionenaustauschchromatographie an DEAE-Cellulose

Konzentrieren in MINICON Nr. 3

Radiaktive Markierung mit ¹²⁵J Entsalzen an G-2OO oder Biogel Al_r5

Nr. 4

Gereinigtes, mit ¹²⁵J markiertes MSA₁, MSA, und MSA,

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Flg. 2 Neues Verfahren zur Antigen-Relnigung

Tag 1

2x10 Eier von S. mansoni (50 Mäuse) ψ Mahlen in kleiner Ten-Broeck-Mühle in 5 ml j 0,5-molares NaCl - Concanavalin A-Puffer

I Ultrazentrifugieren - 2 Stunden Rohes SEA (5 ml)

Entsalzen an Sephadex G-25 (SSuIe von

2 χ 29 cm, O,5-molares NaCl-Concanavalin-A-

Puffer

Rohes entsalztes SEA (12 ml)

nicht-absorbierend (16 ml)

ÄffinitStschromatographie an Concanavalin A-

Sepharose (Sfiule von 1,6 χ 21 cm, 0,5-molares NaCl-Concanavalin-A-Puffer

Elution mit Methvl-ut-mannose (12-16 ml)

SEA-Proteine SEA-Glycoproteine (MSA₁, MSA₂ und MSA₃) (MSA₃)

Konzentrierung und Dialyse

125.

Markierung mit radioaktivem Jod

Entsalzen an Sephadex G-25

Mit J markiertes MSA₁, MSA₂ mit geringer Verunreinigung durch MSA₃

Ionenaustauschchromatographie an DEAE-Cellulose

125
Gereinigtes, mit J markiertes MSA

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Claims

Patentansprüche

1. Lösliche und für das Entwicklungsstadium des reifen Eies von Schistosoma spezifische Fraktion von Schistosoma-Ei -An ti gen.

2. Fraktion von Schistosoma-mansoni-Ei-Antigen nach Anspruch 1, die spezifisch für reife Eier von Schistosoma mansoni ist und die folgenden ungefähren Eigenschaften hat:

Elektrophorese an Polyacrylamidgel mit

7,55t Gel nach Ornstein und Davis,(PAGE) R.F.0,34 _+ 0,01

Farbreaktion: Protein (Coomassieblau) + Kohlenhydrat (PAS) +

Lipid (Sudanschwarz) —

Concanavalin-A-Binduna stark adsorbiert

CsCl-"buoyant" Dichte 1,43+0,01 g/cm³

(homogen)

Molekulargewicht:

Gelfiltration 148.000^5000

Sedimentationsgeschwindigkeit 90.000-100.000

PAGE (R.F.) 50.000 (0,50)

Ladung (isoelektrischer Punkt) - pH 3,5 - 4,5

3. Fraktion nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie radioaktiv markiert ist.

4. Fraktion nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet,

125
daß sie mit J radioaktiv markiert ist.

5. Fraktion von Schistosoma-mansoni-Ei-Antigen, gekennzeichnet durch die folgenden ungefähren Eigenschaften:

Elektrophorese an Polyacrylamidgel mit

7,5% Gel nach Ornstein und Davis, R.F. 0,48 +_ 0,01

Farbreaktion: Protein (Coomassieblau) + Kohlenhydrat (PAS) _

Lipid (Sudanschwarz) -

Concanavalin-A-Bindung: lose oder nicht

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ORIGINAL INSPECTED

CsCl-"buoyant" Dichte 1,53 g/ml²

Molekulargewicht:

Gelfiltration 80.000 +_ 5000 Sedimentationsgeschwindigkeit 40.000

PAGE (R.F.) 69.000 (0,33)

6. Fraktion von Schistosoma-mansoni-Ei-Antigen, gekennzeichnet durch die folgenden ungefähren Eigenschaften:

Elektrophorese an Vorwiegende Gelegentlich be-Polyacrylämidgel mit Spezies obachtete Spezies 7,5% Gel nach Ornstein
und Davis:

Farbreaktion ο 22 + o,o1 o,o8 o,18

Protein (Coomassieblau) ₊ + +

Kohlenhydrat (PAS) + + +

Lipid + + +

Concanavalin-A-Bindung lose adsorbiert

CsCl-"buoyant" Dichte heterogen nicht bestimmt

(1,51-1,37)

Molekulargewicht

Gelfiltration 450.000+8000 nicht bestimmt

Sedimentationsgeschwindigkeit >200.000 nicht bestimmt

PAGE (R.F.) >200.000 nicht bestimmt

7. Verfahren zur Fraktionierung von Schistosoma-mansoni-Ei-Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß man Eier von Schistosoma mansoni mahlt und hierdurch eine Lösung der Eier bildet, die Lösung der Affinitätschromatographie unterwirft und eluiert und hierbei eine dritte Fraktion, die am schwächsten festgehalten wird, eine zweite Fraktion, die weniger schwach festgehalten wird, und eine erste Fraktion, die stark festgehalten wird, bildet und wenigstens die erste Fraktion reinigt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Affinitätschromatographie an einem Galactan vornimmt, die Elution der ersten Fraktion mit u-Methylmannosid und/oder a-Methylglucosid durchführt und die

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erste Fraktion radioaktiv markiert.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß

125
man die erste Fraktion mit J radioaktiv markiert.

10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reinigung wenigstens der ersten Fraktion durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung eines salzhaltigen Elutionsmittels durchführt, wobei eine etwa vorhandene dritte Fraktion am schwächsten festgehalten, eine etwa vorhandene zv/eite Materialfraktion weniger schwach festgehalten und die erste Fraktion

am stärksten festgehalten wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reinigung wenigstens der ersten Fraktion durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung eines salzhaltigen Elutionsmittels durchführt, wobei eine etwa vorhandene dritte Fraktion am schwächsten festgehalten, eine etwa vorhandene zweite Fraktion weniger schwach und aie erste Fraktion am stärksten festgehalten wird, und die erste Fraktion in irgendeiner Stufe nach der radioaktiven Markierung entsalzt und hierdurch wenigstens einen Teil von Salzen, die während der radioaktiven Markierung eingeführt worden sind, entfernt.

12. Verwendung der nach dem Verfahren gemäß Anspruch 8 hergestellten, radioaktiv markierten Fraktion für die Bestimmung von Antikörpern gegen reife Eier von Schistosoma im Serum von Patienten, wobei man- das Serum mit der radioaktiv markierten Fraktion mischt, eine etwa gebildete Fällung abtrennt und die Radioaktivität der Fällung mißt, wobei die Intensität der Radioaktivität ein Maß für die Menge der Antikörper gegen reife Eier von Schistosoma im Serum ist.

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"⁴~ 27A2835

13. Verwendung einer radioaktiv markierten Fraktion nach Anspruch 3 für die Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern gegen reife Eier von Schistosoma mansoni im Serum von Patienten, wobei man das Serum mit der radioaktiv markierten Fraktion mischt, eine etwa gebildete Fällung abtrennt und die Radioaktivität der Fällung mißt, wobei die Intensität der Radioaktivität ein Maß für die Menge der Antikörper gegen reife Eier von Schistosoma mansoni im Serum ist.

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