DE2714751A1

DE2714751A1 - Herstellung von alpha-l-antikoerpern, reinigung von alpha-l-antigenen und reagenz fuer die bestimmung von alpha-l-antikoerpern und alpha-l-antigenen

Info

Publication number: DE2714751A1
Application number: DE19772714751
Authority: DE
Inventors: Emiko Kishi; Tomiaki Morimoto; Junichi Tohmatsu
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1976-04-05
Filing date: 1977-04-01
Publication date: 1977-10-06
Also published as: SE448032B; SE8205891L; FR2347688B1; DE2714751C2; FR2347688A1; GB1564063A; CH636449A5; US4132767A; SE8205891D0; SE446128B; SE7703918L

Description

HOFFMANN · EITLE & PARTNER

PATENTANWÄLTE ^ ' I DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) · Dl PL.-I N G. W. EITLE · D*. RER. NAT. K. HOFFMAN N ■ D I PL.· I N G. W. LE H N

DIPL.-ING. K. FOCHSLE - DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABEILASTRASSE 4 (STERN HAUS) ■ D-8000 MONCH EN 81 · TELEFON (089) 911087 ■ TELEX 05-29619 (PATH E)

29 195 o/wa

EISAI CO., LTD. TOKYO / JAPAN

Herstellung von Λ-L-Antikörpern, Reinigung von Ttz-L-Antigenen und Reagenz für die Bestimmung von .τΟ-L-Antikörpern und «x-L-Antigenen

Die Erfindung betrifft ein neues Antigen, das bei Lebererkrankungen von Bedeutung ist, und ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers daraus zur Verwendung des Nachweises von 0I/-L-Antigen und «o-L-Antikörpern.

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Die Erfindung betrifft auch ein Reagenz für die Bestimmung von ot/-L-Antigen und den «^-L-Antikörper, welches den ,τθ-L-Antikörper enthält.

Schliesslich betrifft die Erfindung ein Reagenz zur Bestimmung des .v-L-Antigens, das für dieBestimmung von oO -L-Antigen und oO-L-Antikörper verwendet werden kann.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Reinigung von o^-L-Antigen, welches ein neues Antigen, das bei Lebererkrankungen Bedeutung hat, darstellt.

Es ist bekannt gewesen, dass es HB-Antigene (HBs, HBc, e) und HA-Antigene gibt, die man bei ein Häpatitis leidenden Patienten findet und dass oC-Fetoprotein bei Patienten gefunden wird, die an primärem Leberkrebs und dergleichen leiden, und dass diese Antigene bei Lebererkrankungen vorkommen. Die Bestimmung dieser Antigene und der entsprechenden Antikörper werden für die Diagnose der Lebererkrankung und für die Untersuchung des Blutes bei Bluttransfusionen verwendet. Da jedoch bei der Untersuchung von Leberkrankheiten in vielen Fällen negative Ergebnisse hinsichtlich der genannten Antigene und Antikörper erzielt werden, reicht es bisher nicht aus, die Untersuchung nur auf die Entdeckung dieser Antigene und Antikörper zu erstrecken. Gemäss der vorliegenden Erfindung wurde ein neues ch-L-Antigen (genannt Arai-Antigen) und dessen Antikörper gefunden, wie sie bei Lebererkrankungen vorkommen und das neue oO-L-Antigen und dessen Antikörper wurden während der Untersuchung des Serums von an Lebererkrankungen leidenden Patienten gefunden. Das

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— % — S

Λ,-L-Antigen hat die folgenden Eigenschaften:

(1) Molekulargewicht etwa 1.000.000 /es wird mit der

fast gleichen Fraktion wie IgM (Molekulargewicht etwa 900.000 bis 1.000.000) durch Säulenchromatografie mit Biogel A-1,5 m (Handelsname für BIORED Laboratories) gefunden7

(2) Elektrophoretische Beweglichkeit: ß- o^-Globulin-

region (dies ist ein Zwischenwert, zwischen HBs Antigen und ,ArFetoprotein.

(3) Isoelektrischer Punkt: PI = 5,04 (die Aktivität des

rk/ -L-Antigens wurde im Bereich von 4,22 bis 5,88 durch Messen mit einer Ampholeinsäule gefunden)

(4) Auftriebsdichte: d = 1,08 g/ml in Lösung von Cäsium

chlorid und d = 1,03 g/ml in Lösung von Rohrzucker.

(5) Bildung eines Komplexes: Ein ausfallender Komplex bil

det sich mit Dextransulfat in Gegenwart von Magnesiumchlorid, wobei dieser Komplex lipoproteinähnliche Eigenschaften zeigt.

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(6) Färbung: Der oL-L-Antigen/Antikörper, der ausgefallen

ist in Agargel kann mit Sudanschwarz B angefärbt werden.

(7) ThermostabiIitat: Antigene Eigenschaften in dem Serum

werden be
erhalten.

werden bei 56°C 30 Minuten aufrecht-

(8) Form (als Antigen/Antikörper-Komplex): Sphärische Partikel mit etwa 300 A Durchmesser.

Es wurde die Häufigkeit untersucht, hinsichtlich des Nachweises von ot-L-Antigen und -Antikörpern im Serum von unter verschiedenen Lebererkrankungen leidenden Patienten, von HBs Antigen-positivem Trägerserum und dem Serum von gesunden Menschen, und es wurde untersucht das Verhältnis zwischen dem o6-L-Antigen und -Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung und den bekannten Antigenen und Antikörpern, wie sie bei Lebererkrankungen vorkommen, d.h. HBs-Antigensystemen, e-Antigensystemen und ot-Fetoprotein (nachfolgend

CL-Y¹P) . Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben. In dieser Tabelle wurde HBs-Antigen durch die lAHA-Methode untersucht; HBs-Antikörper wurden durch die PHA-Methode untersucht und die anderen wurden durch die MO-Methode untersucht.

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Tabelle

Diagnose

Beispiel
Nr.

Λζ-L

Zahl der
Beispiele

HBs

Ag(+)

e .H-FP

Ag(+) Ab(+) Ag(+)

Leberkrebs 3 9

Leberzirrhose 3 5

Chronische
Häpatitis 40

Akute

Häpatitis 40

Hbs Ag(+)
Blutspender 20

Gesunder .
Mensch

20

Ag(+) Ab(+) Ag,Ab(-)

29

23

37

32

19

20

15

16

19

3
2

15

19

0
0
0

0 0 3

0 0 2

1 0

0 1 8

0 0 0

0 0 4

0 0 0

0 2

1 0 0

1 1 4

0 0 2

0 0 0

12

0 0 0

CXi I

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'i

Wie in dieser Tabelle gezeigt wird, ist das .X, -L-Antigen stark positiv bei Leberkrebs und Leberzirrhose und die Existenz des ö~ -L-Antigens wird bei chronischer Häpatitis und akuter Häpatitis festgestellt. Dagegen kann das oL-L-Antigen nicht in den HBs-Antigen-positiven Blutspendern und beim gesunden Menschen festgestellt werden. Der d. -L-Antikörper zeigt eine hohe Positivität gegen Leberzirrhose und wird auch bei HBs-Antikörper-positiven Blutspendern festgestellt. Etwa 60 % des gegenüber ά. -L-Antigen-und <*. -L-Antikörper-positiven Serums wird von dem HBs-Antigen-Antikörper-System begleitet. Im Falle des Serums bei Leberkrebs kommen etwa 45 % des gegenüber ,Λ-L-Antigen-positiven Serums mit <*. -FP vor. Andererseits sind etwa 25 % des gegenüber <tL -L-Antigen-positiven Serums völlig unempfindlich gegenüber dem bekannten Antigen-Antikörper-System.

Infolgedessen kommt cK -L-Antigen und Λ-L-Antikörper sehr häufig bei Lebererkrankungen vor. Die Bestimmung von diesem J^-L-Antigen und oO-L-Antikörper ist geeignet für die Diagnose von Lebererkrankungen und für dieUntersuchung von Blut bei Bluttransfusionen.

Ein Ziel der Erfindung ist es, ein neues tfO-L-Antigen, das bei Lebererkrankungen vorkommt, aufzuzeigen, für die Bestimmung von (X-L-Antigen und ^O-L-Antikörper.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren für die Herstellung des o6-L-Antikörpers zur Verfügung zu stellen, bei dem man ein Tier, aber keinen Menschen, mit dem .X-L-Antigen oder dem .TL-L-Antigen-Antikörper-Komplex immunisiert

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und dann von diesem Tier das Antiserum sammelt.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Reagenz zu erzeugen aus einem oo-L-Antikörper, das für die Bestimmung von ^-L-Antigen und dem »*^L-Antikörper geeignet ist.

Schliesslich ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Reagenz aufzuzeigen, das aus dem <^-L-Antigen besteht und für die Bestimmung von oü-L-Antigen und oC-L-Antikörper geeignet ist.

Schliesslich ist es ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Reinigung des oo-L-Antigens zu zeigen.

Der X-L-Antikörper wird hergestellt durch Immunisierung eines Tieres mit dem ."k-L-Antigen oder dem ¹^-L-Antigen-Antikörper-Komplex, wobei man das Antiserum dann sammelt.

Das «-v-L-Antigen kann zur Bildung eines .^-L-Antigenpositiven Serums oder von Ascites durch eine Protein- oder Lipoproteintrennmethode verwendet werden. Bei einer solchen Trennmethode wird eine übliche Verfahrensweise angewendet, wie sie auf dem Gebiet der Immunologie bekannt ist. Solche Verfahren schliessen beispielsweise ein, Verfahren zur Bestimmung des Dichtegradienten durch Zentrifugieren, Aussalzen, Elektrophorese, Gelfiltration, Affinitätschromatografie, Feststellung des isoelektrischen Punktes, Ultrafiltration, Cohn¹s-Fraktion, die Dextransulfat-Ausfällmethode und ein Verfahren, bei dem man Antiserum zu

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Verunreinigungen gibt, die nicht das «^L-Antigen enthalten, um die Verunreinigungen zu entfernen, sowie weitere Methoden.

Der «Tt-L-Antigen-Antikörper-Komplex kann erhalten werden als Niederschlag, z.B. indem man eine Lösung des «*--L-Antigens mit einer Lösung des «^-L-Antikörpers vermischt. Als Tiere für die Immunisierung können beispielsweise Kaninchen, Meerschweinchen, Ziegen, Pferde, Kühe und dergleichen verwendet werden.

Beim Durchführen der Immunisierung arbeitet man vorzugsweise, um das Antiserum mit einer hohen Antikörperaktivität zu gewinnen, mit dem oL-L-Antigen oder dem oC-L-Antigen-Antikörper-Komplex, der emulgiert wurde unter Verwendung des Freund-Adjuvants, wobei man dieses Verfahren nicht nur einmals sondern mehrere Male durchführt.

Das erhaltene Antiserum kann durch die Immunoadsorptionsmethode gereinigt werden unter Verwendung des Serums von gesunden Menschen, Affinitätschromatografie und dergleichen.

Neben dem Verfahren, bei dem man <x,-L-Antikörper herstellt durch Immunisierung von Tieren, gibt es auch ein Verfahren, bei dem man den <A.-L-Antikörper durch das oc-L-Antikörperpositive menschliche Serum reinigt. Nach diesem Verfahren kann man jedoch nicht grössere Mengen an oC-L-Antikörper gewinnen.

Verwendet man den gemäss der Erfindung erhaltenen </w -L-Antikörper, so können oC-L-Antigene und <A^L-Antikörper

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nach üblichen Verfahren bestimmt werden, beispielsweise durch die Ouchterlony-Methode (MO), durch die einfache radiale Immunodiffusionsmethode (SRID), durch Immunoelektrophorese (IES, IEP), die Radioimmunobestimmungsmethode (RIA), die enzymverbundene Immunolösungsbestimmung (ELISA), die Ergänzungsfixierungsmethode (CF) , die umgekehrte passive Hämagglutinationsmethode (RPHA), die immune Haftungshämagglutinationsmethode (IAHA).

Das Bestimmungsreagenz, welches das ot-L-Antigen gemäss der Erfindung umfasst, kann verwendet werden für die übliche immunobiologische Verfahrensweise zur Bestimmung bei welcher man Antigen-Antikörper-Reaktion feststellt. Solche Bestimmungsmethoden schliessen ein eine Methode, bei welcher man das Antigen per se verwendet und eine Methode, bei welcher man das behandelte Antigen verwendet. Ein Reagenz für die Bestimmung, welche das oo-L-Antigen gemäss der Erfindung enthält, schliesst sowohl oC-L-Antigen per se und das behandelte <:*,-L-Antigen ein.

Das oC-L-Antigen wird per se angewendet, wenn die Bestimmung nach einer Methode wie der Ouchterlony-Methode (MO) durch Immunoelektrophorese (IES, IEP), Ergänzungsfixierungsmethode (CF) , Immunohämatologie (IAHA) und dergleichen durchgeführt wird.

Das behandlete «^-L-Antigen wird verwendet, wenn die Bestimmung nach einer Methode, wie der einfachen radialen Immunodiffusionsmethode (SRID), durch die Radioimmunobestimmungsmethode (RIA), durch die enzymverbunde Immuno-Lösungsmittelanordnung (ELISA) oder die passive Hämagglutinationsmethode (PHA) und dergleichen durchgeführt wird.

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42,

Im Falle der einfachen radialen Immunodiffusionsmethode (SRID) kann man das behandelte r«—L-Antigen verwenden, das hergestellt wurde, indem man das rt-L-Antigen zusammen mit einem Trägermedium auflöste und die Lösung in Form einer Platte verfestigte. Ein solches Trägermedium schliesst Agar, Agarose, Stärke, Polyacrylamidgel und dergleichen ein. Die Gelplatte kann von dem genannten Trägermedium und dem -X-L-Antigen nach üblichen Verfahren gewonnen werden. Beispielsweise wird ein Trägermedium unter Wärme in einerPufferlösung gelöst, ^-L-Antigen wird dazugegeben und das Ganze wird zusammen vermischt. Die erhaltene Lösung wird dann auf eine Glasplatte oder in ein Plastikgefäss gegossen und zur Verfestigung gekühlt. Um das zu untersuchende Serum aufzubringen, wird ein Loch in die erhaltene Gelplatte gebohrt.

Im Falle der passiven Hamagglutinationsmethode (PHA), verwendet man ein oC-L-Antigen das hergestellt wurde durch Binden des oL-L-Antigens an feine Teilchen. Als feine Teilchen können übliche Stoffe verwendet werden. Besonders bevorzugt werden als feine Teilchen Erythrocyten von Säugetieren und Vögeln. Man kann als Teilchen einer Grosse von etwa 1 bis 10,um im Durchmesser auch Polystyrollatex, Polyesterlatex, Polyvinylchlorid, Bentonit, Glaskugeln und dergleichen verwenden. Die üblichen Bindemittel können zum Binden des c<--L-Antigens an die feinen Teilchen verwendet werden. Zu solchen Mitteln gehören beispielsweise Glutaraldehyd, Formaldehyd, Tanninsäure, Bis-azotiertes Benzidin, Chromchlorid, Carbodiimid und dergleichen.

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-vf-43

Bei der Radioinununobestimmungsmethode (RIA) verwendet man das ^-L-Antigen, das durch ein Isotop gekennzeichnet ist. Die Kennzeichnung kann durchgeführt werden in üblicher Weise, z.B. nach der Chloramin-T-Methode unter Verwendung von J oder J.

Im Falle der enzymverbundenen Immunolösungsmittelmethode (ELISA) wird das vX-L-Antigen, gebunden an ein Enzym, verwendet. Als Enzym können verwendet werden Glukoseoxydase, Alkalyphosphatase, Peloxydase und dergleichen, Glutaraldehyd wird gewöhnlich als Bindemittel verwendet.

Das d.-L-Antigen und der ol-L-Ant ikör per können bestimmt werden nach üblichen Verfahren unter Verwendung der vorgenannten Reagenzien für die Bestimmung mittels des oC-L-Antigens. In allen Fällen wird das Reagenz für die Bestimmung, welches ,y_-L-Antigen enthält, für dieBestimmung des •Ti. -L-Antikörpers verwendet. Dieses Reagenz kann auch verwendet werden zur Bestimmung des -^-L-Antikörpers, indem man die inhibierte Reaktion anwendet, bei welcher bei jeder Methode der ,ü -L-Antikörper verwendet wird. Bei allen Methoden können im geeigneten Falle zusätzlich andere Reagenzien als Ergänzungsstoffe verwendet werden, wie Erythrocyten, Pufferlösungen, .?C-L-AntikÖrper und bergleichen, falls dies notwendig ist.

Die vorhergehende Beschreibung des Reagenzes für die Bestimmung mittels des X-L-Antigens kann in gleicher Weise auch dienen für das Reagenz zur Bestimmung, bei dem man den oi. -L-Ant ikör per verwendet, wobei der Ausdruck " «x.-L-Antikörper"einfach durch den Ausdruck " -X-L-Antigen"

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ausgetauscht wird. Das Verfahren zur Reinigung des „C-L-Antigens gemäss der Erfindung wird durchgeführt an einem Material, welches das .^-L-Antigen enthält und zwar mittels der Bestimmung des Dichtegradienten durch Zentrifugieren wobei man eine Fraktion sammelt mit einer Auftriebsdichte von weniger als 1,1 g/ml, vorzugsweise 1,03 bis 1,08 g/ml.

Mittels dieses Verfahrens kann das ni. -L-Antigen von einem grossen Teil der unreinen Proteinkomponente und anderen Antigenen, wie sie bei Lebererkrankungen vorkommen, abgetrennt werden, weil das .Α,-L-Antigen eine sehr geringe Auftriebsdichte aufweist.

Als Material, welches jC-L-Antigen enthält, das erfindungsgemäss verwendet werden kann, kann jede Substanz dienen, welche das oC-L-Antigen enthält, beispielsweise .Χ,-L-Antigen-positives Serum und Ascites und dergleichen.

Als Mittel für die Zentrifugierung zur Bestimmung des Dichtegradienten können übliche Stoffe verwendet werden, wie Cäsiumchlorid, Cäsiumbromid, Kaliumbromid, Lithiumbromid, Lithiumchlorid, Natriumchlorid, Glyzerin, Rohzucker und dergleichen.

Um das Reinigungsverfahren gemäss der Erfindung durchzuführen, können, in Form von Kombinationen,andere Verfahren zum Trennen des Proteins oder der Lipoproteinfraktionen angewendet werden, beispielsweise die Aussalzmethode, die Elektrophorese, Gelfiltration, Affinitätschromatografie, Bestimmung

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V^s - AS

des isoelektrischen Punktes, Ultrafiltration, Cohns-Fraktion, Dextransulfatreinigung oder ein Verfahren, bei dem man die Antikörper den Verunreinigungen zusetzt (ausgenommen solchen, die oO-L-Antigen enthalten) um die Verunreinigungen zu entfernen und dergleichen und wobei man ein reines oC-L-Antigen erhält.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist ausgezeichnet geeignet für die Reinigung von zunächst dem oC -L-Antigen aus dem Rohmaterial wie einem Serum, Ascites und dergleichen. Das Verfahren kann auch für die weitere Reinigung des co-L-Antigens, welches vorher nach anderen Reinigungsverfahren gereinigt worden war, verwendet werden. Die Beispiele und Versuche, die anschliessend beschrieben werden, dienen der Beschreibung der Erfindung und sollen in keiner Weise die Erfindung beschränken.

Beispiel 1

100 ml eines oC-L-Antigen-positiven Serums wurden 20 Minuten mit 10.000 üpm zentrifugiert und das Überstehende wurde gewonnen. Pulverförmiges Cäsiumchlorid wurde zu dem überstehenden in einem Verhältnis von 0,3 g/ml gegeben, wobei sich das Ganze löste. Die erhaltene Lösung wurde einer Zentrifugierung unter Ausbildung eines Dichtegradienten 40 Stunden mit 40.000 üpm unterworfen. Die äusserste Fraktion mit einer Auftriebsdichte von weniger als 1,1 g/ml wurde gesammelt und über Nacht mit destilliertem Wasser bzw. einer Kochsalzlösung dialysiert. Die erhaltene

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Lösung wurde etwa 5 mal unter Verwendung eines Amicon Diaflow-XM-50 (Warenzeichen der Amicon Corporation) konzentriert, wobei man eine <*--L-Antigenlösung erhielt. Die erhaltene d. -L-Antigenlösung bildet einen Komplex mit dem .χ,-L-Antikörper und man stellt keine anderen Antigene, wie sie bei Lebererkrankungen vorkommen, wie HBs-Antigen, e-Antigen, das .A.-FP und dergleichen, bei der MO-Methode fest. Die spezifische Aktivität des <*C -L-Antigens wurde auf etwa das 30-fache erhöht. Dieses öC -L-Antigen ist als Reagenz für den Nachweis geeignet.

Beispiel 2

Unter Verwendung von 1OO ml des oL-L-Antigen-positiven Ascites wurde die d*.-L-Antigenlösung nach der gleichen Verfahrensweise, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten. Der Dichtegradient im Bereich von 1,05 bis 1,2 g/ml war vorher in einem Zelluloserohr gebildet worden, unter Verwendung einer Lösung, in welcher Cäsiumchlorid in O,O1 m Trishydrochlorsäure-Pufferlösung aufgelöst war. Die d. -L-Antigen-Lösung wurde auf die obere Schicht der Röhre unter Ausbildung von verschiedenen Schichten gegeben. Das Ganze wurde dann einer Dichtheitsgradienten-Zentrifugierung 24 Stunden mit 4O.OOO üpm unterworfen. Die .-jt-L-Antigenpositive Fraktion wurde gesammelt und mit destilliertem Wasser und dann mit Trischlorwasserstoffpuf f er lösung über Nacht dialysiert. Die erhaltene Lösung wurde auf etwa 1/5 ihrer Konzentration konzentriert, unter Verwendung von Amicon Diaflow-XM-50. Das erhaltene Λ,-L-Antigen bildete

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einen Komplex mit dem ,i-L-Antikörper und man stellte keine anderen Antigene, wie sie bei Lebererkrankungen vorkommen, fest, wie Hbs-Antigen, e-Antigen, .oL -FP und dergleichen, unter Zufhilfenahme der MO-Methode. Die spezifische Aktivität des ·** —L-Antigens wurde um etwa das 1OO—fach erhöht. Dieses .^C-L—Antigen ist ein brauchbares Reagenz für den Nachweis.

Beispiel 3

Die gemäss Beispiel 1 hergestellte ^i -L-Antigen-Lösung wurde nach Zugabe von Freund-Adjuvants im Verhältnis von 1:1 emulgiert. 1 ml der Emulsion wurde an getrennten Stellen in den Rücken eines Kaninchens injiziert und zwar subkutan als auch intrakutan und auch in die Fussohle, so dass das Kaninchen eine Immunität entwickelte. Eine Woche nach der ersten Immunisierung wurde eine zweite Immunisierung durchgeführt, die in gleicher Weise vorgenommen wurde undzwar auch mit der gleichen Menge der Emulsion wie bei der ersten Immunisierung. Einen Monat nach der ersten Immunisierung wurde eine dritte Immunisierung durchgeführt und zwar zusätzlich mit doppelten Mengen der Emulsion im Vergleich zu der ersten Immunisierung. Eine Woche nach der letzten Immunisierung wurde mehrere Male Blut abgenommen und das Serum wurde vom Blut getrennt. Zu diesem Serum wurden äquivalente Mengen eines Serums eines gesunden Menschen gegeben. Man Hess die Mischung 1 Stunde bei 37°C und dann über Nacht bei 4°C stehen. Das Gemisch der Seren wurde mit 10.0OO üpm pro Minute während

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At

10 Minuten zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde gewonnen. Das erhaltene Antiserum, enthaltend den Λ- -L-Antikörper, reagiert lediglich mit ^C-L-Antigen aber nicht mit anderen Antigenen, wie sie bei Lebererkrankungen vorkommen, wie HBs-Antigen, e-Antigen_f .*- -FP und dergleichen, sowie dem Serum vom gesunden Menschen.

Das Antiserum, enthaltend diesen .*.-L-Antikörper kann als Bestimmungsreagenz gemäss der Erfindung verwendet werden.

Beispiel 4

Freund-Adjuvants wurde zu einer Lösung des nach Beispiel 2 erhaltenen «C-L-Antigens im Verhältnis von 1:1 gegeben und das Ganze wurde emulgiert. Eine Menge von 0,5 ml der Emulsion wurde an verschiedenen Stellen in den Rücken eines Meerschweinchens injiziert und zwar subkutan und intrakutan und auch in die Fussohle, so dass das Meerschweinchen eine Immunität entwickelte. In gleicher Weise wie in Beispiel 3 beschrieben wurde ein Antiserum, welches den cL-L-Antikörper enthielt, gewonnen. Das erhaltene Antiserum reagiert sehr stark lediglich mit oC-L-Antigen aber zeigt praktisch keine Reaktion mit den anderen Antigenen wie sie bei Lebererkrankungen vorkommen, wie beispielsweise HBs-Antigen, e-Antigen, «X, -FP und dergleichen, sowie dem Serum eines gesunden Menschen.

Das Antiserum, welches den ^-L-Antikörper enthält, kann

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als Reagenz für dieBeStimmung gemäss der Erfindung verwendet werden.

Beispiel 5

Zu 25 ml der gemäss Beispiel 1 erhaltenen <ü -L-Antigen-Lösung werden allmählich 5O ml des gemäss Beispiel 3 gewonnenen Antiserums, welches einen .->(,-L-Antikörper enthielt, gegeben. Das Ganze wird unter Rühren vermischt. Man lässt die Mischung 1 Stunde bei 37°C und dann über Nacht bei 4°C stehen. Die Mischung wird dann 2O Minuten mit 10.0OO Upm zentrifugiert. Der oC-L-Antigen-Antikörper-Komplex wurde als Niederschlag gewonnen. Zu diesem Niederschlag wurden 0,01 η Trisaminomethan/Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung gegeben und die Mischung wurde zentrifugiert um die Verunreinigungen durch Waschen zu entfernen.

Der oL -L-Antigen-Antikörper-Komplex wurde in 5 ml Salzlösung suspendiert und die Suspension wurde durch Zugabe von Freund-Adjuvants emulgiert. Anschliessend wurde die gleiche Verfahrensweise wie in Beispiel 3 durchgeführt und man erhielt ein Antiserum, welches den o^-L-Antikörper enthielt. Das erhaltene Antiserum reagiert im wesentlichen nur mit «jC-L-Antigenen aber nicht mit Antigenen, wie sie bei Lebererkrankungen vorkommen, nämlich mit HBs-Antigen, e-Antigen, Λ* -FP und dergleichen oder dem Serum von gesunden Menschen.

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- 1J^-

Beispiel 6

Zu dem Antiserum, enthaltend ^L-L-Antikörper, das gemäss Beispiel 3 gewonnen wurde, wurde eine äquivalente Menge von 0,05 m einer Phosphat-Kochsalz-Pufferlösung (pH 7,5) gegeben. Zu dieser Lösung wurde eine äquivalente Menge einer wässrigen gesättigten Ammoniumsulfatlösung (pH 6,8) gegeben. Das Ganze wurde unter Rühren gemischt. Nach einer Stunde wurde die Lösung zentrifugiert mit 5.000 Upm während 30 Minuten. Die erhaltenen Niederschläge wurden in der Phosphat-Kochsalz-Pufferlösung gelöst, wobei man eine Lösung erhielt mit dem gleichen Volumen des ursprünglichen Antiserums. Ein Viertel Volumenteil der wässrigen gesättigten Ammoniumsulfatlösung (pH 6,8) wurde zu der Lösung gegeben. Nach einer Stunde wurde die Lösung mit 5.000 Upm während 30 Minuten zentrifugiert. Ein weiteres Viertel (Volumenteil) der wässrigen gesättigten Ammoniumsulfatlösung wurde zu der entstandenen überstehenden Lösung gegeben, wodurch man eine 33 %-ige Ammoniumsulfatlösung erhielt. Nach 1 Stunde wurde diese Lösung mit 5.000 Upm während 30 Minuten zentrifugiert und die Niederschläge wurden gesammelt. Die Niederschläge wurden in 0,01 m Tris-aminomethan/Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 8,0) gelöst, wobei man eine Lösung erhielt mit einer Proteinkonzentration von 80 mg/ml. Diese Lösung wurde einer Gelfiltration mit Sephadex G 50 (Handelsname Pharmacia AB) unterworfen unter Verwendung der genannten Pufferlösung, um die Entsalzung und das Puffern durchzuführen. Die erhaltene Lösung wurde konzentriert und auf eine Proteinkonzentration von 70 mg/ml gebracht unter Verwendung von Amicon Diaflow-XM-50. Aktivierte DEAE-Zellulose

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wurde in eine Säule von 40 cm Länge und 2,6 cm Durchmesser gepackt unter Verwendung von Trisaminomethan/Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung. Die konzentrierte Lösung wurde auf die Säule gegeben, um den H. -L-Antikörper auf der aktivierten DEAE-Zellulose zu absorbieren. Das absorbierte .-C -L-Antigen wurde mit 0,1 m Natr iumchlor id/Trisaminomethan/ Hydrochlorsäure-Pufferlösung (pH 8,0), die hergestellt worden war durch Zugabe von Natriumchlorid zu der Trisaminomethan/ Chlorwasserstoff säure-Puf f erlösung, eluiert. Die <?<--L-Antikörper-positive Fraktion wurde isoliert und gesammelt. Diese Fraktion wurde dann konzentriert, auf eine Proteinkonzentration von 70 mg/ml unter Verwendung von Amicon Diaflow-XM-50. Der erhaltene /<-L-Antikörper kann als Bestimmungsreagenz verwendet werden.

Beispiel 7

Der gemäss Beispiel 6 erhaltene ■<-L-Antikörper wurde in 0,1 m Barbital-Pufferlösung (pH 9,0) gelöst, um die Konzentration des Proteins auf 10 mg/ml einzustellen. Zu dieser Lösung wurde die äquivalente Menge von Bromcyanidaktiviertem Sepharose-4B-Gel (Handelsname, Pharmacia AB) gegeben und die Mischung wurde 24 Stunden bei 4 C reagieren gelassen. Das nicht umgesetzte Protein wurde durch Waschen mit 0,05 m Phosphat/Kochsalz-Pufferlösung (pH 7,5) entfernt. Die erhaltene Lösung wurde in eine Säule von 20 cm Länge und 1,5 cm Durchmesser gefüllt. Die .TC-L-Antigen-Lösung gemäss Beispiel 2 wurde auf diese Säule gegeben.

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Nach der Entfernung von nicht umgesetzter Substanz durch Waschen mit der Phosphat/Kochsalz-Pufferlösung wurde 3,5m einer Natriumjodid-Lösung auf die Säule gegeben, um das cL -L-Antigen aufzulösen und zu eluieren. Die gesammelte (λ. -L-Antigen-Lösung wurde mit destilliertem Wasser zur Entfernung des Natriumjodids dialysiert und die Lösung wurde dann unter Verwendung von Amicon Diaflow-XM-50 konzentriert. Das erhaltene oi.-L-Antigen kann als Nachweisreagenz verwendet werden.

Beispiel 8

Die in Beispiel 1 hergestellte .jL-L-Antigen-Lösung wurde in 0,1 m Barbital-Pufferlösung (pH 9,0) gelöst um die Konzentration des Proteins auf 10 mg/ml zu bringen. Diese Lösung wurde zu einer äquivalenten Menge eines Bromcyanidaktivierten Sepharose-4B-Gel gegeben und die Mischung wurde 24 Stunden bei 4 C reagieren gelassen. Nicht umgesetztes Protein wurde durch Waschen mit 0,05 m Phosphat/ Kochsalz-Pufferlösung (pH 7,5) entfernt. Anschliessend wurde das erhaltene Produkt auf eine Säule von 1,5 cm Durchmesser und 20 cm Länge gegeben. Auf die Säule wurde dann das Antiserum, enthaltend den ^-L-Antikörper, hergestellt gemäss Beispiel 3, gegeben. Nach Entfernen der nicht umgesetzten Substanzen durch Waschen mit einer Phosphat/Kochsalz-Pufferlösung wurde eine 3,5m Natriumjodidlösung auf die Säule gegeben, um das <?C-L-Antigen aufzulösung und zu eluieren. Die erhaltene ^C-L-Antigen-Lösung wurde gesammelt und mit destilliertem Wasser dialysiert zur Entfernung des

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Natriumjodids und anschliessend wurde die Lösung mittels eines AMicon Diaflow-XM-50 konzentriert. Das erhaltene A/-L-Antigen kann als Nachweisreagenz verwendet werden.

Beispiel 9

Das Blut eines Schafes wurde in einem Zentrifugierröhrchen gesammelt und dann 5 Mal mit 2.CX)O Upm während 10 Minuten unter Verwendung einer Kochsalzlösung um die Erythrocyten zu waschen, zentrifugiert. Zu diesen Erythrocyten wurde eine Lösung eines 0,15 m Phosphat/Kochsalz-Puffers (pH 7,5) gegeben, um die Konzentration der Erythrocyten-Lösung auf 5 % zu bringen. Zu der Lösung, in welcher die Erythrocyten schwammen, wurde 1/5 Volumen einer GIutaraldehyd-Lösung gegeben, die auf eine Konzentration von 2,5 % eingestellt wurde mittels der Phosphat/Kochsalz-Pufferlösung und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur etwa 5 Stunden unter Rühren zur Fixierung der Erythrocyten durchgeführt. Durch Zentrifugieren dieser Suspension erhielt man die fixierten Erythrocyten, die dann mehrere Male mittels einer Kochsalz-Lösung durch Zentrifugieren gewaschen wurden. Nach Einstellen dieser fixierten Erythrocyten auf eine 5 %-ige Suspension mittels der Phosphat-Pufferlösung wurde zu der Suspension die äquivalente Menge an Tanninsäure-Lösung zugegeben, die auf 3 mg/dl eingestellt war mittels der Phosphat/Kochsalz-Pufferlösung und man rührte weitere 15 Minuten. Durch Zentrifugieren dieser Suspension erhielt man die Erythrocyten, die dann mit Tanninsäure behandelt wurden. Die erhaltenen Erythrocyten wurden mehrere Male unter

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- 2-2 -

a·»

Verwendung einer Kochsalzlösung zentrifugiert. Zu den erhaltenen, mit Tanninsäure behandelten Erythrocyten wurde eine Phosphat-Pufferlösung gegeben, wobei man eine Suspension erhielt, die die Erythrocyten in Mengen von 5 % enthielt. Zu dieser, die Erythrocyten enthaltenden Suspension, wurde die Lösung gegeben, welche den ./.-L-Antikörper gemäss Beispiel 6 enthielt, und welche auf eine Proteinkonzentration von 1 mg/ml mittels der Phosphat/Kochsalz-Pufferlösung eingestellt worden war, und das Ganze wurde vermischt. Die erhaltene Suspension wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur sensibilisiert. Nach dem Zentrifugieren wurden die erhaltenen sensibilisierten Erythrocyten mehrere Male unter Verwendung von Kochsalz-Lösung durch Zentrifugieren gewaschen. Zu den erhaltenen sensibilisierten Erythrocyten wurde die Phosphat/Kochsalz-Pufferlösung gegeben, wobei man eine 7,5 %-ige Suspension erhielt. Nachdem man eine genaue Menge Tymelosal als Antiseptikum zugefügt hatte, wurde die Lösung bei 4°C aufbewahrt. Die Ji-L-Antikörpersensibilisierten Erythrocyten des Schafes können als Reagenz für den Nachweis bei der RPHA-Methode verwendet werden.

Beispiel 10

Die gleiche Verfahrensweise, die in Beispiel 9 beschrieben wurde, wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass die Suspension, die die Erythrocyten enthielt, mit einer äquivalenten Menge einer Lösung vermischt wurde, die erhalten worden war, indem man das in Beispiel 2 erhaltene ^-L-Antigen auf eine Proteinkonzentration von 100 ,ug/ml unter Verwendung

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einer Phosphat/Kochsalz-Pufferlösung einstellte, worauf dann die Erythrocyten sensibilisiert wurden. Die .X.-L-Antigen-sensibilisierten Erythrocyten des Schafes können als Reagenz für den Nachweis bei der PHA-Methode verwendet werden.

Beispiel 11

Das gemäss Beispiel 7 gewonnene X-L-Antigen wurde in einer O,O4 m Phosphat-Pufferlösung (pH 7,4) gelöst und die erhaltene Lösung wurde auf eine Proteinkonzentration von 1 mg/ml eingestellt. 10 ,ul der Lösung wurden 50 ,ul

125 '

1 mc Na J zugegeben. 10,ul einer Lösung, in welcher Chloramin T in einer Phosphat-Pufferlösung im Verhältnis von 1,5 mg/ml gelöst worden waren, wurden zu der vorgenannten Lösung gegeben und die erhaltene Lösung wurde 30 Sekunden gerührt. Nach Zugabe von 100,ul der Phosphat-Pufferlösung, in welcher Metanatriumbisulfit gelöst worden war, im Verhältnis von 2 mg/ml, wurde die Umsetzung abgebrochen. Zu der Reaktionslösung wurden 100 ,ul einer Phosphat-Pufferlösung gegeben, in welcher Kaliumjodid im Verhältnis von 10 mg/ml gelöst worden war. Unmittelbar darauf wurde die erhaltene Lösung einer Gelfiltration unterworfen unter Verwendung von Sephadex G-50, um das J-markierte .%-L-Antigen und das J zu trennen. Die

1 25 spezifische Radioaktivität des erhaltenen J-markierten

.Λ,-L-Antigens betrug 80,uc/,ug.

125
Das J-markierte oC-L-Antigen kann als Reagenz für die

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- ζ* -üb

Bestimmungbei der RIA-Methode verwendet werden. Der Nachweisbereich des .x-L-Antigens liegt im Bereich von 10 ng bis 600 ng/ml und der Nachweisbereich des ,χ,-L-Antikörpers im Bereich von 30 ng bis 10OO ng/ml.

Beispiel 12

Der nach Beispiel 8 erhaltene .% -L-Antikörper wurde in 0,04 m Phosphat-Pufferlösung (pH 7,4) gelöst und die erhaltene Lösung wurde auf eine Proteinkonzentration von 1 mg/ml einge-

125 stellt. Zu 10 ,ul dieser Lösung wurden 50 .ul 1 mc Na J gegeben. Zu dieser Lösung wurden 1O.ul einer Lösung gegeben, in welcher Chloramin T in der Phosphatpufferlösung im Verhältnis von 1,5 mg/ml gelöst worden war und die erhaltene Lösung wurde 30 Sekunden gerührt. Zu der erhaltenen Lösung wurden 10 ,ul der Phosphat-Pufferlösung, in welcher Metanatriumbisulfit im Verhältnis von 2 mg/ml gelöst worden war, gegeben, so dass die Reaktion abbrach. Zu der Reaktionslösung wurde eine Phosphat-Pufferlösung gegeben, in welcher Kaliumjodid im Verhältnis von 10 mg/ml gelöst worden war. Die erhaltene Lösung wurde einer Gelfiltration unter Ver-

1 25 wendung von Sephadex G-50 unterworfen, um den J-markierten

1 25
Φ -L-Antikörper und das J zu trennen. Die spezifische

1 25

Radioaktivität des erhaltenen J-markierten X-L-Antikörpers

betrug 70,uc/ ,ug.

125
Dieser J-markierte cL -L-Antikörper kann als Reagenz für

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den Nachweis bei der RIA-Methode verwendet werden. Das Reagenz zeigte einen Nachweisbereich des .χ,-L-Antigens im Bereich von 10 ng bis 600 ng/ml und einen Nachweisbereich für den ^-L-Antikörper im Bereich von 30 ng bis 1.000 ng/ml.

Beispiel 13

Agarose wurde in der Wärme in 0,01 m Tris-aminomethan/Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung mit einem pH von 7,5 (welche 0,15 m Natriumchlorid und 0,1 % Natriumnitrid enthielt) gelöst bis zu einem Gehalt von 1,2% Agaraose. 80 ml der Agarose-Lösung wurden auf etwa 56°C gekühlt und zu der Lösung wurden unter Rühren 20 ml der ^i, -L-Antikörper-Lösung gemäss Beispiel 3 gegeben. Die Lösung wurde in Plastikgefässe gegossen und dort abkühlen gelassen, wobei man Agarosegelplatten von 1 mm Dicke erhielt, welche den <7L-L-Antikörper enthielten. In diese Platten wurden Löcher für die Proben von 3 mm Durchmesser in regelmässigen Abständen gemacht. Das erhaltene Produkt kann als Nachweisreagenz bei der RID-Methode verwendet werden.

Beispiel 14

Die in Beispiel 13 beschriebene Verfahrensweise wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass das oC-L-Antigen gemäss Beispiel 2 anstelle der «A-L-Antikörper-Lösung verwendet wurde. Man erhielt so Agarosegelplatten, welche das oC-L-Antigen

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in einer Dicke von 1 mm enthielten.

Das erhaltene Produkt kann als Reagenz bei dem Nachweis in der SRID-Methode verwendet werden.

Versuch 1

Versuche wurden durchgeführt für den Nachweis des <£ -L-Antigens aus dem Serum bei verschiedenen Lebererkrankungen, HBs-Antigen-postiven Blutspendern und bei gesunden Menschen. Dieser Nachweis wurde durchgeführt nach der MO-Methode unter Verwendung des Λ-L-Antikörpers, der gemäss Beispiel 3 erhalten worden war, und mittels der SRID-Methode unter Verwendung des Bestimmungsreagenzes, das gemäss Beispiel 13 gewonnen worden war.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle festgehalten.

Zahl der Beispiele, bei denen iC-L-Antigen gefunden wurde

Diagnose	Zahl der Bei spiele an Er krankungen	MO-Methode	SRID-Methode
Leber krebs	39	9	24
Leber- z irrhose	35	6	10
Chronische Häpatitis	40	3	3
Akute Häpatitis	40	4	10

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Fortsetzung der Tabelle

HBs Antigenpositive Blutspender

Gesunder
Mensch

20 20

Versuch 2

Es wurden Versuche durchgeführt für die Bestimmung von .·*, -L-Antikörpern aus dem Serum von verschiedenen lebererkrankten oder von gesunden Menschen mittels der SRID-Methode unter Verwendung des gemäss Beispiel 14 erhaltenen Nachweisreagenzes und mittels der MO-Methode unter Verwendung des gemäss Beispiel 1 erhaltenen Nachweisreagenzes. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.

Zahl der Beispiele, bei denen tfC-L-Antigen gefunden wurde

Diganose	Zahl der Bei spiele an Er krankungen	MO-Methode	SRID-Methode
Leberkrebs	39	1	2
Leberζ irrhose	35	6	7
Chronische Hä- patitis	40	0	2
Akute Häpatitis	40	4	6
Gesunder Mensch	40	1	3

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Versuch 3

Es wurden Versuche durchgeführt für die Bestimmung des Jo -L-Antigens aus dem Serum von verschiedenen Lebererkrankungen oder gesunden Menschen unter Verwendung der SRID-Methode mit dem Nachweisreagenz gemäss Beispiel und mittels der IES-Methode unter Verwendung des Nachweisreagenzes, das gemäss Beispiel 3 erhalten worden war.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zu sehen.

Zahl der Beispiele, bei denen c^-L-Antigen gefunden wurde

Diagnose	Zahl der Bei spiele der Er krankungen	SRID-Methode	IES-Methode
Leberkrebs	40	21	19
Leberzirrhose	52	15	14
Chronische Häpatitis	78	15	15
Akute Häpatitis	44	17	13
Gesunder Mensch	50	0	0

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Claims

PATENTANSPRÜCHE

1. Herstellung eines .-C-L-Antikörpers, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Tier mit einem Λ,-L-Antigen oder .-v -L-Antigen/ ^C-L-Antikörper-Komplex immunisiert und ein Antiserum aus dem Tier gewinnt.

2. Reagenz aus einem -"^-L-Antikörper für die Bestimmung von .\,-L-Antigen und .χ-L-Antikörper.

3. Bestimmungsreagenz gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass der -Λ,-L-Antikörper zusammen mit einem Trägermedium gelöst ist und die erhaltene Lösung in Form einer Platte verfestigt wurde.

4. Bestimmungsreagenz nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass der .^c -L-Antikörper mit feinen Teilchen kombiniert ist.

5. Bestimmungsreagenz gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass der .^C-L-Antikörper mit einem Isotop markiert ist.

6. Reagenz aus einem .-C-L-Antigen zur Bestimmung von

•-ν -L-Antikörpern und -x-L-Antigen.

7. Bestimmungsreagenz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , dass das oC-L-Antigen

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ORIGINAL INSPECTED

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mit einem Trägermedium gelöst ist und die erhaltene Lösung in Form von Platten verfestigt ist.

8. Bestimmungsreagenz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das oo-L-Antigen an feine Teilchen gebunden ist.

9. Bestimmungsreagenz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das oü-L-Antigen mit einem Isotop markiert ist.

10. Verfahren zum Reinigen eines .-C-L-Antigens dadurch gekennzeichnet , dass man eine Lösung, welche das .-^-L-Antigen enthält, einer dichtegradienten-Zentrifugierung unterwirft und eine Fraktion sammelt, mit einer Auftriebsdichte von weniger als 1,1 g/ml.

11. Verfahren zum Reinigen gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , dass Cäsiumchlorid als Mittel verwendet wird bei der Durchführung der Dichtegradienten-Zentrifugierung.

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