CH658317A5

CH658317A5 - Verfahren zur feststellung von krebs beim menschen.

Info

Publication number: CH658317A5
Application number: CH5595/84A
Authority: CH
Inventors: Eugene A Davidson; Sally Delong Bolmer
Original assignee: Research Corp
Priority date: 1977-02-18
Filing date: 1978-02-16
Publication date: 1986-10-31
Also published as: FR2381058B1; DE2806146C2; IT1102384B; JPS6218869B2; CH648330A5; IT7848072A0; DE2806146A1; JPS6129464B2; US4146603A; JPS60155975A; GB1591561A; JPS53127822A; CA1087979A; FR2381058A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Feststellung von Krebs beim Menschen.

Untersuchungen in einer Reihe von Laboratorien, einschliesslich denen der Erfinder, haben gezeigt, dass Tierzellen in Gewebekulturen unter Bedingungen gezüchtet werden können, die es ihnen ermöglichen, charakteristische Eigenschaften, die typisch für das Gewebe sind, aus dem sie stammen, beizubehalten. In anderen Worten bedeutet dies, dass z.B. Knorpelzellen in Gewebekulturen gezüchtet werden können und dabei typische Produkte der Knorpelmatrix produzieren, Hypophysenzellen würden Hypophysenhormone erzeugen usw. Zu den Produkten, denen im Labor der Erfinder besonderes Interesse gewidmet wurde, zählen eine Gruppe von komplexen Sacchariden, die normalerweise als Sekretionsprodukte der Zellen angesehen werden, indem sie in der extra-zellulären Matrix, in der sich faserartige und zelluläre Elemente befinden, aufgefunden werden. Diese Verbindungsklasse hat etwa 6 Vertreter mit gewissen gemeinsamen Merkmalen, insbesondere hinsichtlich ihres Molekulargewichtes und einer hohen negativen Ladung. Die zuletzt genannte Eigenschaft dient häufig dazu, diese spezielle Gruppe zu isolieren und zu identifizieren.

Es wurde dann eine Untersuchung durchgeführt, wobei ein direkter Vergleich zwischen einer normalen Zell-Linie und der gleichen Zell-Linie nach Infektion mit einem viralen Agens, das die Zelle tumorigen machte, gezogen werden konnte. Über diese Arbeit wurde in Proc. Nat. Acad. Sei., USA, Band 70, No. 1, Seiten 53-56, Januar 1973, berichtet.

Es wurde festgestellt, dass kein qualitiativer Unterschied zwischen den Saccharidprodukten bestand, wohl aber ein quantitativer Unterschied durch die Virustransformation einsetzte, und zwar insbesondere was die Synthese eines der charakteristischen Saccharide betraf. Diese quantitative Veränderung ist bei Untersuchungen in Zellkultursystemen nützlich, könnte jedoch niemals bei Tierversuchen angewandt werden, da das spezielle Produkt normalerweise in den meisten Geweben des Körpers gefunden wird, nicht-antigen ist und unter keinen Umständen als charakteristisch für eine Tumorzelle angesehen werden kann. Nichtsdestoweniger waren qualitative Unterschiede von Interesse, die jedoch ganz allgemeiner Art waren.

Es konnte die Folgerung gezogen werden, dass die Umwandlung einer Zell-Linie durch Virustransformation zumindest eine Veränderung bei der Synthese der komplexen Saccharide mit sich brachte.

Wie in Biochemistry (1974) Band 13, S. 1233, berichtet, wurde im Labor der Erfinder eine ähnliche Versuchsserie mit B16 Melanoma-Zellen von Mäusen und einer Kontroll-Population von normalen Melanocyten, die aus der Iris von Mäusen erhalten wurden, durchgeführt. Die beobachteten Unterschiede zwischen den Melanom-Zellen und der Kontrollzüchtung waren etwas stärker ausgeprägt, als bei den Versuchen mit den oben beschriebenen normalen und Virustransformierten Paaren. Diese Unterschiede können kurz wie folgt zusammengefasst werden :

1. Beim Vergleich der Tumorzellen mit den normalen Zellen lag sowohl ein qualitativer als auch ein quantitativer Unterschied in der Produktion von komplexen Sacchariden vor.

2. Insbesondere wurde ein wesentliches Produkt der normalen Zellen, Hyaluronsäure, von der tumorigenen Linie überhaupt nicht erzeugt.

3. Von der Tumorlinie wurde ein sulfatiertes Polysaccharid mit ungewöhnlich hohem Molekulargewicht produziert, welches bei den normalen Zellen nicht auftrat.

Bezüglich des sulfatierten Polysaccharides ist es wesentlich darauf hinzuweisen, dass sich diese Verbindung von den normalen Komponenten des Gewebes einzig in ihrer Molekular-grösse und nicht in ihrer molekularen Architektur unterscheidet. Das heisst, die Struktur des Saccharides war mit den Strukturen identisch, die normalerweise in Geweben

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gefunden werden, lediglich ihr Molekulargewicht war etwas höher. Es wird nochmals darauf hingewiesen, dass diese Versuche geeignet sind für Studien bei Zellkulturbedingungen ; als eine diagnostische Methode sind sie jedoch weitgehend unbrauchbar, da die in Frage kommende Verbindung durch eine Vielzahl von Zellen in den Wirtstieren schnell metaboli-siert wird. Sobald eine solche Verbindung im Kreislauf aufträte, würde sie schnell wieder herausgefiltert und von Leberzellen, Zellen der Niere, Fibroblasten etc. abgebaut. Aus diesem Grunde bietet die Anwesenheit oder die Produktion dieses Saccharides durch die Tumorzellen keine Anwendungsmöglichkeit, und zwar sowohl aus den obengenannten Gründen als auch aufgrund der Tatsache, dass die Verbindung selbst nicht-antigen ist.

In einer Veröffentlichung in Cancer Research, 36,

424-431, Februar 1976, (E.A. Davidson) wurde über die Ergebnisse einer Untersuchung des komplexen Saccharides menschlicher Zellen berichtet, die in vieler Hinsicht ähnlich den bei Mäusen erhaltenen Ergebnissen sind. Die menschlichen Melanomzellen produzieren weniger Hyaluronsäure als die Kontrollmelanocyten und ein hochmolekulares sulfa-tiertes Polysaccharid, ähnlich dem, wie es in den Mauszellen produziert wird.

Weitere Untersuchungen mit Mäusen brachten die Anwesenheit eines ungewöhnlichen Glykoproteins zutage. Aus diesem Grunde war man bemüht, die Art des Glykoproteins in Mäusen näher kennenzulernen, und zwar insoweit als dessen Eigenschaften, strukturelle Chemie und biologische Funktion bestimmt werden konnten. Viele der chemischen Eigenschaften des Moleküls werden in der Veröffentlichung von E.A. Davidson in «Biochemical and Biophysical Research Communications», Bd. 70, No. 1, Mai 1976, beschrieben. Die Anwesenheit eines ungewöhnlichen Glykoproteins in menschlichen Melanomzellen oder dessen Produktion durch dieselben wird in dieser Veröffentlichung nicht angesprochen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Feststellung von Krebs beim Menschen, indem man menschliche Seren einer chemischen oder Radioimmuno-Bestimmungs-analyse zum Nachweis eines Tumor-spezifischen Glykoproteins, das von menschlichen Krebszellen produziert wird, unterwirft. Das Glykoprotein wird von Normalzellen nicht produziert. Die Erfindung ist durch die Merkmale im Anspruch 1 charakterisiert. Das Glykoprotein, das von bösartigen Tumorzellen produziert wird, während es von gesunden oder normalen Zellen nicht produziert wird, also ein Tumor-spezifisches Glykoprotein (im folgenden manchmal als «TSGP» bezeichnet), ist im Tumor anwesend, wird von den Tumorzellen produziert, abgesondert und erscheint im Kreislauf des Wirts, bei Tieren sowie bei Menschen, und zwar etwa zu der Zeit, als eine fühlbare Tumor-masse nachgewiesen werden kann. Das TSGP kann auch in einem beliebigen früheren Stadium auftreten.

Das TSGP wird von den Tumorzellen gebildet, ohne Rücksicht um welchen Tumor es sich dabei handelt, und erscheint im Kreislaufsystem von Menschen, die an Lungen-, Brust-, Dickdarm-, Uterus- und Magenkarzinomen, Melanomen und ähnlichen leiden. Leukämien und andere Blutkrankheiten stellen einen Defekt in der Reifekontrolle dar, wodurch eine abnorme Zahl von Zellen auftritt, wie man sie normalerweise in den metabolen Bildungsschritten findet. Aus diesem Grunde wird bei vielen oder den meisten dieser Blutkrankheiten kein TSGP produziert, da die Zellen selbst nicht tumorigen sind. Ausserdem ist es gut möglich, Leukämien durch mikroskopische Untersuchung einer Blutprobe nachzuweisen, so dass Leukämien vom diagnostischen Standpunkt kein Problem darstellen.

Das spezifische Glykoprotein, das von einem Wirtstier mit einer bösartigen Tumorerkrankung produziert wird, kann sich je nach Charakter und Art des Tumors sowie auch hinsichtlich des betroffenen Wirts unterscheiden, jedoch ungeachtet, um welchen Tumortyp es sich handelt, wird ein Pro-s dukt der Art und Klasse von Tumor-Glykoproteinen (TSGP) isoliert.

Es wird daraufhin gewiesen, dass die Wachstumscharakteristiken und andere Eigenschaften von Tumoren mit unterschiedlichem zellulären Ursprung (und von verschiedenen io Personen) nicht gleich sein werden. Jedoch scheint es, dass der hier beschriebene Glykoprotein-Typ charakteristischerweise von einer grossen Anzahl von Tumoren produziert wird. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften von TSGP eines beliebigen Tumortyps sind einander genügend 15 ähnlich, um durchwegs die Anwendung von Standard-Isola-tionsmethoden zu erlauben.

Die im nachfolgenden beschriebenen Merkmale hinsichtlich der Eigenschaften, chemischen Struktur und biologischen Funktion sind für TSGP charakteristisch und dienen 20 dazu, es von den normalerweise im Serum gefundenen Gly-koproteinen zu unterscheiden

(a) Löslichkeit in Perchlorsäure (0,6 M) bei 0°C oder in Trichloressigsäure (5%) bei 0°C.

(b) Sialinsäure- oder N-Acetylneuraminsäure- (im fol-25 genden manchmal als «NANA» bezeichnet) Gehalt mit 30

Gew.%, bezogen auf das Gesamtgewicht von Glucosamin, Galactosamin und Sialsäure (bzw. Sialinsäure genannt).

(c) Affinität für Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-25 (Pharmacia Co., Uppsala, Schweden) und Eluierung mit Pyridin-

30 acetatpuffer, pH 5,2, bei einer Konzentration von ungefähr 0,4 M.

(d) Einschluss an Sephadex G-150 (Pharmacia Co., Uppsala, Schweden) in 0,1 M Pyridinacetat, pH 5,2. Eluierung bei 1,5 >< dem Ausschlussvolumen, kalibriert mit Dextranblau.

35 (e) Affinität für ein konjugiertes Weizenkeim-Agglutinin, immobilisiert an einen Sepharoseträger, wie z.B. eine Wei-zenkeim-Sepharose-Säule in 0,5 M Natrium- oder Kaliumchlorid. Es können andere künstliche Träger für das Weizen-keim-Lektin verwendet werden. Eluierung von der Säule <30 erfolgt spezifisch mit N-Acetylglucosamin (0,1 M in Wasser ist optimal). Andere Lektine, die für TSGP eine Affinität besitzen, jedoch nicht derart spezifisch sind, umfassen limulus-polyphemus-(Krebs) Lektin und nach Entfernung von Sialsäureresten Ricinus-Communis-II-Lektin. 45 (f) Diese Affinität für das Weizenkeim-Agglutinin wird bei Behandlung mit Sialidase (gereinigt durch Affinitätschromatographie, um es von Protease freizumachen) von einer der verschiedenen Quellen verloren. Ein wesentliches Kriterium bei dieser Analyse ist es, dass es nicht notwendig ist, die so Sialsäure vom TSGP vollständig zu entfernen, um die Affinität für Weizenkeim-Agglutinin zu zerstören.

(g) Die Sialsäure in TSGP ist an Galactose gebunden und kann auch an N-Acetylgalactosamin gebunden sein.

*(h) Elektrophorese von TSGP in 6% Polyacrylamid-Gel in 55 Gegenwart von Natriumdodeclysulfat (0,1%) und Anfärben des Gels auf Protein und Kohlenhydrat zeigt, dass TSGP ein Molekulargewicht von etwa 50 000 bis 70 000, wahrscheinlich etwa 60 000 besitzt. Diese Zahl ist nicht genau anzugeben, da Glykoproteine im allgemeinen nach dieser 60 Methode anomale Molekulargewichtswerte ergeben. Das Glykoprotein tritt jedoch in ein 6%iges vernetztes Gel ein und wandert in demselben. Nach Einwirkung von Pronase reduziert sich das Molekulargewicht auf etwa 10 000 bis 15 000. Dies stellt einen Protease-resistenten Kern dar und 65 lässt die Annahme zu, dass die Sialsäurereste und die Saccha-ridsubstituenten auf dem Polypeptidlcern angeordnet sind bzw. sich um diesen herum zusammenballen.

(i) Durch isoelektrische Fokussierung in Gelen oder in

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Lösung wird TSGP deutlich von irgendwelchen kontaminierenden Serumkomponenten (wie a-l-saures Glykoprotein) abgetrennt. TSGP hat einen isoelektrischen Punkt von etwa 4,2 bis 4,6 und kann aufgrund geringfügiger Unterschiede im Sialsäuregehalt mehrere eng beisammenliegende Bande aufzeigen.

(j) TSGP enthält ebenfalls eine neutrale Hexose, hauptsächlich Galactose; es ist keine Glucose anwesend. Nachweis ist möglich durch Analyse auf neutrale Zucker [z.B. mittels der Methode von Dubois et al., Anal. Chem., 28,350 ( 1966)].

(k) TSGP kann als ein Produkt menschlicher Tumorzellen in vitro in monoschichtiger Kultur nachgewiesen werden.

(1) Der Hauptanteil an Kohlenhydrat von TSGP, der die Hauptmenge an Sialsäure enthält, ist mit der Polypeptidkom-ponente über eine O-glykosidische Bindung verknüpft, und zwar von einem einzelnen N-Acetylgalactosaminyl-Rest zur Hydroxylgruppe von Serin oder Threonin (als Partialsequenz kann angesehen werden: Galactosyl-N-Acetylgalactosamin, jeweils in den 3- und 6-Stellungen mit Sialsäureresten substituiert).

(m) Die gesamte Saccharid-Kette kann von dem Polypeptid durch Behandeln mit 0,01 N Natriumhydroxid, 16 Stunden bei 20°C, abgespalten werden. Die sich ergebende Saccharid-Kette kann auf einer G25-Sephadex-Säule ( 1,2 x 60 cm) abgetrennt werden und wird bei 1,15 x dem Ausschlussvolumen (kalibriert mit Dextranblau) eluiert.

(n) Die Aminosäurezusammensetzung der TSGP-Frak-tion nach Chromatographie auf DEAE-Sephadex A-25 ergibt Glutaminsäure, Prolin, Asparaginsäure, Threonin und Leucin als hauptsächliche Aminosäuren.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die charakteristischen Unterscheidungsmerkmale Tumor-spezifischer Glykoproteine, die aus den Blutseren von Krebs-infizierten Menschen isoliert werden können, folgende sind: Löslichkeit in 0,6 M Perchlorsäure, ein Pronase-resistenter Kern, der die Hauptmasse an Kohlenhydrat enthält, Affinität für Weizen-keim-Agglutinin, in Abhängigkeit von der Sialsäure, besondere elektrophoretische und chromatographische Mobilität, ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 50 000 bis 70 000 und ein isoelektrischer Punkt von etwa 4,2 bis 4,6. Besonders charakteristische Eigenschaften des Tumor-spezifischen Glykoproteins, die sich für diagnostische Zwecke eignen, um letzteres von anderen Glykoproteinen in den Seren normaler Patienten zu unterscheiden, bestehen darin, dass TSGP einen isoelektrischen Punkt von etwa 4,2 bis 4,6 und die Perchlor-säure-lösliche Fraktion einen Sialsäuregehalt von über etwa 0,065 mg/ml der ursprünglichen Serumprobe hat.

Eine Anzahl der verwendeten Produkte ist im Handel erhältlich. «Sephadex»-Produkte werden von Pharmacia Fine Chemicals A.B., Uppsala, Schweden, hergestellt und vertrieben. Es handelt sich um vernetzte Dextrane mit unterschiedlicher Porosität oder Substituenten. «Sepharose» ist ein in kugelförmigen Partikeln geformtes Agarose-Gel. «DEAE-Sephadex A25 oder A50» wird aus Sephadex G25 oder G50 durch chemische Substituierung von Diäthylami-noäthyl-Gruppen hergestellt. Letztere sind schwach basische Anionenaustauscher. Sie haben einen Kugeldurchmesser von 40 bis 120 Mikron und quellen zu einem Säulenvolumen von 89 (15-35) ml pro Gramm Trockengel. Sephadex G150 hat einen Kugeldurchmesser von 40 bis 120 Mikron, einen Fraktionierungsbereich von 5 bis 150 000 Molekulargewicht und ein Säulenvolumen (bed volume) von 20 bis 30 ml pro Gramm Trockengel. Sepharose 4B weist eine Agarose-Konzentration von 4% und einen Nasskugeldurchmesser von 40 bis 190 Mikron auf.

Es wird darauf hingewiesen, dass TSGP von carcino-embryonischem Antigen, wie in US-PS 3 663 684

beschrieben, u.a. unterschieden werden kann durch Ein-schluss von TSGP auf Sephadex G150 [wie oben unter (d) beschrieben], die Affinität von TSGP für ein konjugiertes Weizenkeim-Agglutinin, immobilisiert auf einem Sepharose-Träger [wie oben unter (e) beschrieben], sowie durch das Molekulargewicht [wie oben unter (h) beschrieben]. Carcino-embryonisches Antigen weist keine dieser Eigenschaften auf.

I. Frühdiagnose von Personen mit irgendeiner Art von bösartiger Erkrankung:

Es wurde festgestellt, dass die Anwesenheit von TSGP in menschlichen Seren eine direkte Indikation für das Vorliegen eines bösartigen Tumors (nicht eingeschlossen sind Bluterkrankungen) des untersuchten Patienten sein kann. Es wurde eine einfache, jedoch genaue Methode zum Nachweis der An- oder Abwesenheit von TSGP in menschlichen Seren entwickelt. Auf diese Weise entstand eine allgemein anwendbare diagnostische Nachweismethode, die v/eder angreifend noch zerstörend wirkt, und die als Teil einer routinemässig durchgeführten ärztlichen Untersuchung von Patienten in der risikoreichen Altersgruppe, d.h. Frauen über 40, Männer in bestimmten Berufen etc., angewandt werden kann. Ausgehend von einer einzigen Blutprobe kann die Methode als Teil einer Routineuntersuchung für Personen aller Altersgruppen angewandt werden.

Der ursprüngliche analytische Nachweis für TSGP basiert auf den folgenden Eigenschaften desselben:

1. Das Glykoprotein hat eine sehr hohe negative Ladung.

2. Die negative Ladung ist in der Hauptsache, wenn nicht ausschliesslich, auf die Anwesenheit von N-Acetylneuramin-säure zurückzuführen.

3. Die N-Acetylneuraminsäure war auf den Saccharid-Ketten angeordnet, die die Tendenz zeigen, sich zusammenzuballen und eine Kernstruktur auszubilden, die gegenüber Proteolyse resistent ist.

4. Das stark saure Gebilde war in einer geeigneten Konzentration von Perchlorsäure oderTrichloressigsäure oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel löslich.

5. Das Glykoprotein weist eine Affinität für Weizenkeim-Agglutinin, welches an Sepharose immobilisiert ist, auf.

6. Das Glykoprotein kann aufgrund seiner hohen negativen Ladung an einer Vielzahl von anionischen Austauschern fraktioniert werden, einschliesslich Diäthylamino-äthyl-Cellulose, Diäthylaminoäthyl-Sephadex, Ecteola-Cellu-lose, und starken und schwachen Anionenaustauschharzen, wie Dowex 1 oder Dowex 2.

7. Der hohe Kohlenhydratgehalt des Glykoproteins und seine Ladung erlauben eine Identifizierung durch Polyacrylamid- oder andere Gel-Elektrophorese-Methoden, sowie Anfärben entweder durch übliche Proteinfarbstoffe oder durch Farbstoffe für die Kohlenhydratkomponente unter Verwendung von Perjodsäure-Schiff-Reagens oder andere Reagenzien.

Kurz zusammengefasst basiert die diagnostische Nachweismethode auf den generalisierten und allgemeinen Strukturmerkmalen des Glykoproteins, d.h. den Pronase-beständigen Kern, die Affinität für Weizen-Agglutinin und die charakteristische elektrophoretische und chromatographische Mobilität.

Die allgemein anwendbare Methode zur Bestimmung der Anwesenheit von TSGP im menschlichen Blutserum umfasst die Beschaffung einer Serumprobe von einem menschlichen Patienten, Behandeln der Serumprobe mit einem TSGP-Lösungsmittel, wie Perchlorsäure, Trichloressigsäure oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel, Entfernung des gebildeten Niederschlages durch eine geeignete Methode zur

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Fest-Flüssig-Trennung, wie Dekantierung, Filtration oder Zentrifugation ; Neutralisierung der löslichen Fraktion mit einem alkalischen Material, wie Kaliumhydroxid, Analysieren des löslichen Anteiles auf den Gehalt an N-Acetylneu-raminsäure und Protein, und Vergleich der gefundenen Werte für N-Acetylneuraminsäure und Protein mit Grundlinien-Parametern, aufgestellt für Normal- und Krebsseren.

Die Analyse auf NANA kann durch eine der üblichen bekannten Methoden erfolgen, einschliesslich der Perjodat-Resorcinol-, Thiobarbitursäure oder der direkten Ehrlich Methode [G.W. Jourdian et al., J. Biol. Chem., 246,431 ( 1971 ); L. Warren, J. Biol. Chem., 234, 1971 ( 1959); und I. Werner et al., Acta Med. Soc. Uppsala, 57,230 (1952)].

Die Proteinbestimmungen können z.B. durch ein modifiziertes Coomasie-Blau-G-Verfahren oder durch die Methode nach Lowry oder durch Bestimmung der Absorption bei 280 nm erfolgen [O.H. Lowry et al., J. Biol. Chem., 193,265 ( 1951) und M.M. Bradford, Anal. Biochem., 72,248 (1976)].

Auf der Grundlage der zusammengestellten Daten von 370 menschlichen Serumproben wurden die folgenden Parameter zur Feststellung des Vorliegens von bösartigen Tumoren bei Menschen festgelegt (basierend auf der Analyse der Perchlorsäure-löslichen Fraktion, bezogen auf das Volumen der ursprünglichen Serumprobe):

( 1 ) Ein Sialsäuregehalt (NANA) von über etwa 0,065 mg/ml weist auf die Möglichkeit eines Tumors hin ; ein Sialsäuregehalt von über etwa 0,080 mg/ml indiziert einen wahrscheinlichen Tumor.

(2) Ein Proteingehalt von über etwa 0,35 mg/ml weist auf einen möglichen Tumor, ein Proteingehalt von über etwa 0,4 mg/ml auf das wahrscheinliche Vorliegen eines Tumors hin.

Es wurde eine Ausgangsuntersuchung mit 59 Proben durchgeführt, wobei die Perjodat-Resorcinol-Methode und die direkte Ehrlich-Methode für N-Acetylneuraminsäure-Spiegel und das Lowry-Verfahren für Protein-Spiegel angewandt wurden. Es wurde festgestellt, dass zwischen 30 Krebspatienten und 29 Normalkontrollen eine vollständige Unterscheidung im Gehalt der Sialsäure bestand. Das heisst, der höchste Normalspiegel war immer noch niedriger als der niedrigste Spiegel, der bei einem Patienten mit diagnostizierter bösartiger Erkrankung festgestellt wurde. Diese Ausgangsuntersuchung schloss eine Anzahl von Erkrankungen verschiedener Art, Lungen-, Brust-, Dickdarm-, Lymphom- und Melanom-Patienten ein, davon ausgehend, dass die Produktion eines Perchlorsäure-löslichen Glykoproteins eine allgemeine Eigenschaft einer Anzahl von Tumoren darstellt. Die statistische Analyse dieser Werte zeigte, dass die Zufallswahrscheinlichkeit dieser Ergebnisse geringer als 1 in 1000 ist.

Unter Auswertung der in der vorangehend beschriebenen Untersuchung erhaltenen Spiegel als parametrische Kriterien, wurde eine viel grössere Untersuchung mit etwa 311 Patienten durchgeführt, die sowohl an bösartigen Erkrankungen und einer Reihe von nicht-malignen Beschwerden litten sowie einer Anzahl von normalen Kontrollpersonen. Lediglich basierend auf die Gehalte an Protein und Sialsäure (N-Acetyl-neuraminsäure) wurde eine über 95%ige Unterscheidung zwischen Normalpersonen und nicht-bösartig erkrankten Personen einerseits und Patienten mit Tumor andererseits erhalten. Ausserdem bestand kein signifikanter Unterschied zwischen normal- und nicht-bösartig erkrankten Personen oder zwischen Männern und Frauen. Es wurde eine Reihe anderer statistischer Tests durchgeführt, wobei die Daten von dieser Gruppe stammen. Es sei hier nur angeführt, dass die Zufallswahrscheinlichkeit zur Unterscheidung zwischen der Krebsgruppe und der anderen Gruppe geringer ist als 1 in 1000. Es besteht auch eine deutliche Korrelation mit dem Fortschritt der Erkrankung. So haben Personen mit ausgestreuter, verbreiteter metastatischer Erkrankung höhere Spiegel an zirkulierendem TSGP als solche mit lokalisierter Erkrankung; Personen, die sich in Remission s befinden bzw. Personen nach einer chirurgischen und/oder chemotherapeutischen oder Strahlungsbehandlung tendieren dazu, niedrigere Spiegel an zirkulierendem Glykoprotein zu haben.

Diese Ergebnisse führten zu einer Reihe von weiteren i« Untersuchungen. Zuerst wurde das Augenmerk auf die wenigen falschen positiven Bestimmungen, die sich in dieser Gruppe zeigten, gerichtet. Es zeigte sich, dass mehrere derselben von asthmatischen Patienten herrührten und können in der Tat auf einen Faktor, der mit dieser Krankheit assozi-is iert ist, bezogen werden.

Dementsprechend wurde eine weitere Untersuchung mit den falschen Positiven, mit Normalproben und verschiedenen Patienten mit diagnostiziertem Krebs durchgeführt, um festzustellen, ob die gefundenen qualitativen Unter-20 schiede im Zellkultursystem auch in der Serumprobe wiederholt werden konnten. Statt nur einfach die Spiegel an N-Acetyl-neuraminsäure in der Perchlorsäure-löslichen Fraktion zu berücksichtigen, wurde das Perchlorsäure-lösliche Material einer Gel-Elektrophorese unterzogen (wie 25 insbes. im nachfolgenden Beispiel 2 beschrieben) zum Nachweis des charakteristischen Tumor-Glykoproteins (TSGP). Das Tumor-spezifische Glykoprotein hat einen isoelektrischen Punkt von etwa 4,2 bis 4,6 und ein Molekulargewicht von etwa 50 000 bis 70 000, allgemein etwa 60 000.

so Nach Durchführung dieser zweiten Untersuchung reduzierte sich die Anzahl an falschen Positiven auf Null;

lediglich Patienten mit diagnostiziertem Tumor zeigten eine charakteristische Glykoprotein-Bande auf der Gel-Elektrophorese. Obwohl einige wenige der Personen mit Erkran-35 kungen (insbes. Leukämien) N-Acetyl-neuraminsäure-Spiegel aufwiesen, die nicht in die anormalen Gruppe fielen, traten keine Normalen oder nicht-bösartig erkrankten Normalen in der positiven Gruppe nach der zweiten Untersuchung auf. Darüber hinaus konnte die Anwesenheit des 40 charakteristischen Glykoproteins bei solchen Personen mit bösartiger Erkrankung gezeigt werden, die niedrigere Spiegel an N-Acetyl-neuraminsäure aufwiesen.

Zusammengefasst zeigt die entwickelte Nachweismethode folgendes:

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1. Es besteht ein ungewöhnlich hoher Wahrscheinlichkeitsgrad in der Voraussage des Vorliegens eines Tumors sowie des Erkrankungsstadiums, basierend lediglich auf der Messung der N-Acetyl-neuraminsäure- und Protein-Spiegel so in der Perchlorsäure-löslichen Fraktion des Serums.

2. Die sehr kleine Anzahl von falschen Positiven kann vollständig durch eine zweite Untersuchung, die eine Gel-Elektrophorese und Untersuchung der Gele auf das Vorliegen des charakteristischen Tumor-spezifischen Glykopro-

55 teins umfasst, eliminiert werden.

3. Der Voraussagewert dieser Methode ist mindestens ebenso gut oder besser als irgendeine der gegenwärtigen oder früher beschriebenen Methoden, einschliesslich dem carci-noembryonischen Antigen, wie es in der US-PS 3 683 684

60 beschrieben wird.

4. Obwohl TSGP nicht für sämtliche Tumore oder in der Tat sogar z.B. für sämtliche Lungencarcinome identisch sein mag, besitzt es doch eine ausreichende Identität aufgrund struktureller Charakteristiken, um eine verallgemeinerte es diagnostische Nachweismethode zu erlauben. Wichtig ist die Feststellung, dass zwei verschiedene Personen mit der gleichen anatomischen Diagnose dennoch Tumore mit unterschiedlichen Charakteristiken in bezug auf Metastasege

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schwindigkeit, Wachstumsgeschwindigkeit sowie charakteristischer Produkte aufweisen können. Es besteht die Möglichkeit, dass jeder Tumor eine unterschiedliche biologische Einheit und eine unterschiedliche Krankheit darstellt, und dass keine zwei identisch sind, wenn man charakteristische Zellprodukte in Betracht zieht. Aus diesem Grunde besteht eine dringende Notwendigkeit für eine verallgemeinerte Identifikationsmethode und eine allgemein anwendbare therapeutische Strategie, bevor ein vernünftiger Fortschritt in bezug auf Früherkennung oder therapeutische Behandlung mit weitem Anwendungsbereich erwartet werden kann.

Die Tatsache, dass ein Tumor-spezifisches Glykoprotein in menschlichen Seren anwesend ist, welches ein Produkt des Tumorwachstums darstellt, stellt ein allgemeines diagnostisches Mittel dar.

Beispiel 1

Reinigung und Isolierung des Tumor-spezifischen Glykoproteins

Serumproben von Patienten mit diagnostizierten festen Tumoren (Lungen-, Magen- und Brustkarzinom und Melanom wurden verwendet, die jeweils eine ähnliche chromatographische und elektrophoretische Mobilität zeigten) wurden wie folgt behandelt:

70 Mikroliter einer 60%igen Perchlorsäure wurden pro ml Serum zugegeben und die Lösung gemischt. Zu dieser Lösung werden 0,93 ml 0,6 M Perchlorsäure pro ml Serum zugegeben. Diese Lösung wird gut gemischt und eine Stunde (45 bis 90 Min. sind ausreichend) bei 0°C stehengelassen. Das Gemisch wird dann bei 8000 g 10 Min. lang (6 bis 12 Min.) zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit durch Dekantieren vom Niederschlag getrennt.

Die erhaltene überstehende Lösung wird mit 1,2 M Kaliumhydroxid auf pH 6 bis 7 eingestellt und 10 Min. bei 0°C stehengelassen. Das Kaliumperchlorat wird wie oben durch Zentrifugation (Filtration ist ausreichend) abgetrennt und die überstehende Flüssigkeit 24 Stunden lang ( 16 bis 36 Stunden sind ausreichend) gegen 10~3 M Pyridinacetat, pH 5,2, dialysiert.

Eine DEAE-Sephadex-A-25-Säule (1,5x40 cm) wird entsprechend den Anweisungen des Herstellers bereitet und mit 0,1 M Pyridinacetat, pH 5,2, äquilibriert.

Die Probe des dialysierten Perchlorsäure-Überstandes wird (vorzugsweise) durch Lyophilisation oder Ultrafiltration auf etwa das Zehnfache konzentriert. Ein Aliquot mit bis zu 5 mg Sialsäure und bis zu 30 mg Protein wird auf die Säule aufgebracht und diese daraufhin mit einem linearen Gradienten aus 0,01 M bis 1,0 M Pyridinacetat, pH 5,2, (das gesamte Gradientenvolumen beträgt 600 ml) eluiert.

Bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 ml pro Stunde werden Fraktionen gesammelt (5 bis 6 ml Fraktionen). Diese Fraktionen werden dann auf ihren Protein- und Sialsäuregehalt nach Lowry et al. und mittels der Perjodat-Resorzinol-Methode analysiert. Die Sialsäure-positiven Fraktionen, die den Hauptanteil dieser Säure enthalten, und bei einer Gradientkonzentration von etwa 0,4 M eluiert werden, werden vereinigt, bei 0°C 24 Stunden lang gegen destilliertes Wasser dialysiert und durch Lyophilisation konzentriert. Diese Fraktion enthält das Tumor-spezifische Glykoprotein und kann etwas a-1-saures Glykoprotein, eine normale Serumkomponente, enthalten.

Eine weitere Reinigung des Tumor-spezifischen Glykoproteins kann durch isoelektrische Fokussierung oder Chromatographie über DEAE-Sephadex A-50 erreicht werden.

Die nach der oben beschriebenen Chromatographie erhaltene Fraktion, die dië Sialsäure enthält, wird auf eine 1,2x50 cm Säule aus DEAE-Sephadex A-50 aufgebracht und die Säule mit einem linearen Pyridin-Acetat-Gradienten (0,01 M bis 0,5 M, pH 5,2,400 ml) eluiert. Es werden zwei

Sialsäure-positive Fraktionen erhalten, die jeweils bei den Gradientenkonzentrationen 0,42 und 0,46 M eluiert werden. Die zweite Fraktion enthält das Tumor-Glykoprotein und ist im wesentlichen frei von anderen Verunreinigungen. Diese Fraktion wird durch 24 Stunden lange Dialyse gegen destilliertes Wasser bei 0°C entsalzt und durch Lyophilisation konzentriert.

Alternativ wird die Fraktion mit dem Tumor-spezifischen Glykoprotein, wie sie von der DEAE-Sephadex-A-25-Säule erhalten wird, einer Gel-isoelektrischen Fokussierung in einem pH 3,5 bis 7,0 Ampholin-Gradienten mit Hilfe eines LKB-Multiphorgerätes von LKB Instruments, Inc., unterworfen. Kontaminierende saure Glykoproteine weisen isoelektrische Punkte von 3,5 bis 3,8 auf und werden deutlich von dem Tumor-spezifischen Glykoprotein getrennt, das einen isoelektrischen Punkt bei 4,4 (4,2 bis 4,6) besitzt. Nach demselben Prinzip kann präparativ gearbeitet werden, indem eine 110 ml Ampholin-Säule (LKB) und der oben beschriebene pH-Gradient verwendet wird. Der Bereich zwischen pH 4,2 und 4,6 wird gesammelt, gegen destilliertes Wasser dialysiert und durch Lyophilisation konzentriert. Das Produkt kann in 0,01 M Natrium- oder Kaliumchlorid, das 0,005 M Phosphatpuffer, pH 6,5 enthält, gelöst werden.

Eine letzte Reinigung sowie eine Prüfung auf Verunreinigungen kann durch Affinitätschromatographie des Glykoproteins auf einer Weizenkeim-Agglutinin-Sepharosesäule erreicht werden.

Die Glykoproteinlösung (in Natriumchlorid/Phosphat 0,01 M/0,005 M pH 6,5) wird auf eine 1 x 10 cm Säule mit Sepharose 4 B, das mit Weizenkeim-Agglutinin konjugiert ist, und die mit der gleichen Lösung äquilibriert wurde, gegeben. Die Säule wird mit 3 bis 5 Volumen des äquilibrie-renden Puffers gewaschen (von dem Tumor-Glykoprotein sollte dabei nichts von der Säule eluiert werden). Das Tumor-Glykoprotein kann mit einem scharfen, symmetrischen Peak mit 0,01 M N-Acetylglucosamin eluiert werden. Der Zucker wird durch Dialyse gegen destilliertes Wasser entfernt und das Glykoprotein durch Lyophilisation konzentriert.

Beispiel 2

Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese

Lösung A wird durch Vermischen von 0,24 g Acrylamid (erhältlich von Eastman Organic DPI und zweimal in Aceton umkristallisiert) mit 0,73 g N,N'-Methylenbisacrylamid und 100 ml Wasser hergestellt. Lösung B bereitet man durch Auflösen von 150 mg Kalium- oder Ammoniumpersulfat in 100 ml Wasser. Lösung C enthält 7,7 g NaHiPCh-H20,38,6 g Na2HP04*7H20,4gNatriumdodecylsulfatund 1,15 ml N,N,N',N'-Tetramethyläthylendiamin (Eastman DPI) pro Liter. Das Gel wird hergestellt durch Mischen von einem Teil der Lösung A mit zwei Teilen der Lösung B und einem Teil der Lösung C. Das Gemisch wird sofort in ein 5x75 mm Gel-Röhrchen mit einer Höhe von 55 mm gegeben. Das Gel wird 10 mm mit H2O überschichtet und das auf diese Weise hergestellte Röhrchen eine Stunde lang bei 25°C stehengelassen. Das Röhrchen wird daraufhin in ein Reservoir eingegeben. Eine Probe, 10 bis 25jil, die 5 bis 20 [ig Glykoprotein enthält, wird auf das obere Ende der Geloberfläche überschichtet und ein Elektrophoreselauf bei 70 V zwei Stunden lang durchgeführt. Das Gel wird herausgenommen und mit 10%igerTrichloressigsäure 3 Min. lang fixiert und dann mit 0,3%igem Coomassie Brilliantblau R in 10% Essigsäure/45% Methanol/45% H2O zwei Stunden lang bei 40°C gefärbt. Das Material wird daraufhin mit 7% Essigsäure/30% Methanol/63% Wasser fünfmal zwei Stunden lang bei 40°C (oder bei 25°C entsprechend länger) entfärbt. Die Färbemethode für Glykoprotein entspricht der von Zacharius et al., Anal. Biochem., 30,148 ( 1969), beschriebenen.

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Beispiel 3

Bestimmung von Sialsäure- (NANA) und Protein-Spiegel in den Perchlorsäure-löslichen Glykoproteinfraktionen von Krebs- bzw. normalen Patienten

Es wurden Serumproben gesammelt von 30 Krebspatienten (einschliesslich Brust-, Lungen-, Dickdarm-, Lymphom- und Melanomkrebs) sowie von 29 normalen, als Kontrolle dienenden Personen. Die Serumprobe jedes Patienten sowie die Kontrollproben wurden mit Perchlorsäure gemischt, die lösliche Fraktion nach Entfernung des Niederschlages gewonnen, und diese lösliche Fraktion neutralisiert, wie es im vorangehenden Beispiel 1 beschrieben wird. Die neutralisierte Perchlorsäure-lösliche Fraktion wird auf Protein nach der Methode von Lowry et al. und auf Sialsäure nach dem direkten Ehrlich-Verfahren analysiert.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 1 bis 4 aufgeführt.

Fig. 1 zeigt die in der Perchlorsäure-löslichen Fraktion gefundene Proteinmenge (mg/ml) sowohl der normalen als auch der Krebsproben. Der durchschnittliche Proteingehalt für Normalpersonen beträgt 0,35 mg/ml und der durchschnittliche Proteingehalt für Krebspatienten 0,79 mg/ml. Der Unterschied ist signifikant mit einem Wert von weniger als 0,001 (weniger als 1 Chance in 1000, dass es sich dabei um einen Zufall handelt).

Fig. 2 zeigt die Menge (mg/ml) an gefundener Sialsäure (NANA) in der Perchlorsäure-löslichen Fraktion der Proben von den Normalpersonen sowie den Krebspatienten. Der durchschnittliche Sialsäuregehalt für Normalpersonen betrug 0,034 gegenüber dem Durchschnittswert für Krebspatienten mit 0,162 (a<0,001 ).

Fig. 3 zeigt wiederum die Daten von Fig. 2, indem sie den Bereich des Sialsäuregehaltes sowohl bei Normalpersonen als auch bei Krebspatienten und einen Vergleich derselben wiedergibt.

Fig. 4 zeigt den Bereich des Sialsäuregehaltes von Normalpersonen und Personen mit Brustkrebs.

Beispiel 4

I. Bestimmung des Sialsäure-(NANA) und Proteinspiegels in Perchlorsäure-löslichen Glykoproteinfraktionen von Krebs- und Normalpatienten

Es wurde eine zweite Serie mit 311 Individuen unter Anwendung eines unsichtbaren, kontrollierten Codesystems durchgeführt. Die Personengruppe schloss solche mit festen und Bluttumoren (Leukämie) ein. Die Gruppe der Krebspatienten umfasste die folgenden Krebstypen : Lymphom-, Brust-, Darm-, Melanom-, Sarkom-, Testikulär-, Rhabdomyosarkom-, Lungen-, Nieren- und Cervikalkrebs. Eine Anzahl der untersuchten Personen litt an einen grossen Bereich umfassenden, nicht-bösartigen Krankheiten oder Zuständen, einschliesslich : Schwangerschaft, Geschwüre, Asthma, Infektionskrankheiten, Trauma, Herzbeschwerden. Andere der Individuen stellten gesunde Normalpersonen dar. Die Serumproben von sämtlichen der 311 Personen wurden, wie im Beispiel 3 beschrieben, behandelt und analysiert.

Basierend auf den in Beispiel 3 erhaltenen Daten, wurden Bereiche für Normalspiegel an Sialsäure und Protein in der Perchlorsäure-löslichen Fraktion ermittelt. Es wurden Bereiche aufgestellt für «möglichen Tumor» : Sialsäure über 0,065 mg/ml und Protein über 0,35 mg/ml. Proben, die über diesem Bereich liegen, wurden als möglicher Tumor diagnostiziert. Proben mit einem Sialsäuregehalt von über 0,080 mg/ml und einem Proteinspiegel über 0,4 mg/ml wurden als sehr wahrscheinlicherTumor diagnostiziert.

Die Ergebnisse der Diagnosen, die sich auf den Sialsäure-und Proteingehalt beziehen, sind folgende:

Prozent korrekt diagnostizierte maligne Krankheit: 83%, mit einer 95%igen Genauigkeit, basierend auf den oben angegebenen sehr wahrscheinlichen Gehalten. Es wird daraufhin gewiesen, dass eine Reihe von Patienten mit Krebs eine Chemotherapie oder Bestrahlungsbehandlung erhielten. Die Gesamtzahl in dieser Gruppe war zu niedrig, um sicherzu-5 stellen, dass eine der letztgenannten einen direkten Effekt auf die NANA-Gehalte im Serum oder die Anwesenheit von TSGP hatten. Der Prozentsatz an «falschen» Positiven betrug 12%.

Die falsche positive Gruppe wurde des weiteren unter-lo sucht, indem die Serumproben der Patienten einer Polyacryl-amid-Gel-Elektrophorese, wie in Beispiel 2 beschrieben, unterworfen wurden.

Das Tumor-spezifische Glykoprotein wurde in keinem dieser untersuchten Proben gefunden, einschliesslich den 15 asthmatisch nicht-malignen Kranken.

II. Radioimmuno-Bestimmung zum Nachweis des Tumorspezifischen Glykoproteins.

Unter Verwendung ausreichender Mengen an Material, 20 das von menschlichen Patienten mit breitem Erkrankungsbereich und hohen Glykoproteingehalten erhalten wurde, kann das Tumor-spezifische Glykoprotein durch Kombination einer Reihe von Methoden gereinigt werden, einschliesslich Affinitätschromatographie, lonenaustauschchromatogra-25 phie, isoelektrische Fokussierung und andere, und ein Antikörper zu diesem Glykoprotein entwickelt werden unter Anwendung einer Reihe von immunologischen Methoden. Anfangs werden Kaninchen, Meerschweinchen oder Hamster als Wirtstiere für die Entwicklung eines Antikörpers 30 erster Stufe verwendet. Obwohl dies geeignet ist, mag es wünschenswert oder vorzuziehen sein, das Tumor-spezifische Glykoprotein durch Modifikation der Sialsäure, z.B. durch Reaktion mit Aminen oder Hydraziden nach der Perjodatbe-handlung oder durch partielle Entfernung oder Hydrolyse 35 der Sialsäure (unter Verwendung von Sialidase aus einer Anzahl von Quellen - vibrio choiera, hemophilus influenzae, Clostridium species, diploccocus pneumoniae u.a.) zu modifizieren, um darüber hinaus Kohlenhydrat-Gruppierungen freizulegen, die immunologisch reaktionsfä-40 higer sein können.

Nachdem der Antikörper zu dem Tumor-spezifischen Glykoprotein in einem geeigneten Wirtstier erhalten worden ist, werden Antikörper zu diesem durch Injektion der Globulin-fraktion des Wirts in eine Ziege hergestellt. Auf diese Weise 45 wird z.B. Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper erhalten, der mit Radiojod oder durch andere geeignete Methoden radioaktiv markiert wird. Alternativ kann TSGP radioaktiv mit 125I oder3H nach R.O. Hynes, Proc. Nati. Acad. Sei., USA, 70, 3170 (1973) oder Liao et al., J. Biol. Chem. 248,8247 (1973) so markiert werden. Auf diese Weise erhält man einen radioimmunologischen Nachweis zur Bestimmung geringerer Mengen an Glykoprotein mit Hilfe von hochspezifischen immunologischen Methoden. Auf diese Weise erhält man einen Empfindlichkeitsspiegel, der 100 bis 10 OOOmal tiefer 55 liegt als die Empfindlichkeit, die mit den rein-chemischen Verfahren, wie sie oben beschrieben werden, erreicht wird.

Da man davon ausgehen kann, dass das Tumor-Glykoprotein sogar von sehr wenig Tumorzellen, wenn diese in einer Kultur gezüchtet werden, produziert wird, ist die Annahme so berechtigt, dass sehr kleine Tumorherde dieses Glykoprotein, das dann im Kreislauf der Individuen erscheint, produzieren und absondern. Eine hochempfindliche Nachweismethode, wie z.B. die Radioimmunobestimmung, macht es möglich, die Anwesenheit dieser Komponente anzuzeigen, 65 noch vor dem Auftreten irgendwelcher manifestierter Symptome, wie Schmerzen, Unbehagen, Gewebeknoten etc. Ein positiver Test mit Hilfe dieser Methode würde dem untersuchenden Arzt die Notwendigkeit für weitere und sorgfälti-

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gere diagnostische Untersuchungen des Patienten anzeigen, um die Art, den Typ und die Lage des Tumors sicherzustellen. Dies erlaubt eine frühe Behandlung, noch bevor das Tumorvvachstum und Metastasen auftreten. Es besteht kein Zweifel, dass die frühzeitige Diagnose und Behandlung von Krebs noch immer das effektivste Mittel im Kampf gegen die hohe Sterblichkeitsrate, die mit dieser Krankheit assoziiert ist, darstellt.

Beispiel 5

Antikörperproduktion

Das gereinigte Tumor-spezifische Glykoprotein, z.B. gemäss Beispiel 1 (0,5 mg in 1 ml 0,15 M NaCl) wird mit einem geeigneten Agens (Freunds-Adjuvanz) vermischt und in ein geeignetes Tier injiziert. Die Injektion kann erfolgen : subkutan, intramuskulär (grössere Volumen, 3 bis 4 x) in die Fussohle oder durch entsprechende Kombination. Auf diese Weise können Kaninchen, Meerschweinchen, Pferde und Ziegen behandelt werden. Bei Kaninchen würde sich die Injektion in wöchentlichen Abständen über eine Periode von 6 Wochen wiederholen, worauf von dem Kaninchen Blut abgenommen und das Serum hergestellt wird. Dieses Serum ist ein nicht-absorbiertes TSGP- (Tumor-spezifisches Glykoprotein) Serum. Dies kann dann mit Hilfe eines normalen Serums absorbiert und ein sich bildender Niederschlag abgetrennt werden. Der Überstand wird den Antikörper, spezifisch für TSGP, enthalten.

Beispiel 6

Modifikation von funktionellen Gruppen am TSGP

Es wird eine selektive strukturelle Modifizierung des Tumor-spezifischen Glykoproteins durchgeführt, um seine immunologischen Eigenschaften zu verstärken und um einen Mechanismus zu schaffen für das Binden von spezifischen funktionellen Gruppen. Die TSGP-Probe wird in einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,1 M Acetatpuffer, pH 5,0 (Natrium oder Kalium) hergestellt. Diese Lösung wird mit einem äquivalenten Volumen einer Lösung vermischt, die 2 bis 4 uMol Natriummetaperjodat im gleichen Puffer enthält. Das Gemisch lässt man 30 Min. lang bei 0°C stehen und zerstört das restliche Perjodat durch Zugabe von 5 uMol Natriumarsenit. Das modifizierte TSGP kann nun mit einem der verschiedenen Amine oder Hydrazide, wie von K. Itaya et al., Biochem. Biophys., Res. Comm. 64,1028 (1975) beschrieben, umgesetzt werden. Dieses Verfahren ändert spezifisch die Sialsäuregruppierungen auf dem Molekül und erlaubt ihre Umwandlung zu einer immunologisch stärker responsiven Gruppierung.

Das derivatisierteTSGP kann dann, wie oben beschrieben, für die Antikörper-Herstellung verwendet werden.

Beispiel 7

I. Hydrolyse von Sialsäuregruppierungen am TSGP

Im Handel erhältliche Sialidase aus Vibrio cholerae oder Clostridium perfingens wird mittels Affinitätschromatographie [s. P. Cuatrecasas, Biochem. Biophys. Res. Comm., 38, 947 (1970)1 gereinigt. Das TSGP wird in einer Konzentration von 1 bis 2 mg/ml in pH 5,0 Acetatpuffer (Kalium), der 2 mM Calciumacetat enthält, hergestellt. Diese Lösung wird mit einer Lösung vermischt, die 50 Millieinheiten gereinigter Sialidase im gleichen Puffer enthält. Das Gemisch wird 18 Stunden ( 12 bis 24 Stunden) bei 37°C inkubiert. Das modifizierte TSGP wird von der frei gewordenen Sialsäure durch Chromatographie auf einer vernetzten Dextrangelsäule (1 x60 cm) in pH 5,0 Acetatpuffer (z.B. Sephadex G-50, das eine Ausschlussgrenze des Molekulargewichtes von etwa 50 000 und eineTeilchengrösse von 30 bis 100 Mikron besitzt) abgetrennt. Das modifizierte TSGP erscheint im Ausschlussvolumen (erster Proteinpeak). Nach Dialyse gegen destilliertes Wasser (24 Stunden) und Konzentrierung durch Lyophilisation kann das Material direkt für die Antikörper-Produktion, wie oben beschrieben, verwendet werden.

II. Radioimmuno-Bestimmung:

Verschiedene Arten von Radioimmuno-Bestimmungsmethoden können zum Nachweis von TSGP im Serum angewandt werden. Typische Beispiele stellen die Methoden der direkten Kompetition, der Verbindung und der Doppel-Antikörper-Bindung dar und werden nachfolgend beschrieben.

Bei der Methode der direkten Kompetition verwendet man TSGP, radioaktiv markiertes TSGP (3H oder l25I-Material) und TSGP-Antikörper (z.B. von Kaninchen). Man stellt eine Standard-Titrationskurve auf, indem eine Reihe von bekannten TSGP-Konzentrationen in eine Anzahl von Reagenzgläser gegeben wird, die Aliquot des Perchlorsäure-Überstandes von normalem Serum enthalten, wobei dieses äquivalent dem zu analysierenden Serumvolumen ist (typischerweise 1 bis 5 ml). Dieses Gemisch wird in 0,1 M Natriumkaliumphosphatpuffer, pH 7,2, hergestellt. Daraufhin wird ein Aliquot eines TSGP-Antiserums in jedes Reagenzglas gegeben, und zwar in ausreichender Menge, um mit dem gesamten vorliegenden TSGP im Reagenzglas mit der höchsten Konzentration zu reagieren. Dieses Gemisch wird 16 Stunden lang bei 4°C stehengelassen, worauf eine bestimmte Menge (5 x 103-2 x 104 Counts pro Minute) an radiomarkiertem TSGP zugegeben wird. Nach Inkubation für zwei Stunden bei 37°C werden der Antikörper und der Antigen-Antikörper-Komplex durch Zugabe eines geeigneten Agens wie gesättigtes Ammoniumsulfat oder Ziegenanti-Kanin-chenanti-Serum (s. unten) präzipitiert. Freies TSGP bleibt in Lösung und die Menge an radiomarkiertem TSGP in der löslichen Fraktion kann durch Bestimmung der radioaktiven Counts in einem Flüssig-Scintillationspektrometer (3H) oder einem gamma-Scintillationszähler (l25I) bestimmt werden. Mit Hilfe dieser Daten lässt sich eine Standard-Titrations-kurve aufstellen, aus der die TSGP-Konzentration einer unbekannten Serumprobe, die demselben Verfahren unterworfen wurde, abgeleitet werden kann.

Die radioimmunologische Methode der Vorbindung geht davon aus, dass der TSGP-Antikörper an einen unlöslichen Matrixträger, wie Speharose 4B, gekoppelt wird, wodurch ein wiederverwendbarer gebundener Partikel-Antikörper gebildet wird (AB-Sepharose). Diese Präparation wird dann mit bekannten Mengen an TSGP und radiomarkiertem TSGP wie oben beschrieben inkubiert und eine Standard-Titrationskurve aufgestellt. DerTSGP-Antikörper-Sepha-rose-Komplex kann durch Filtration und Waschen mit 0,15 M NaCl, um mechanisch eingeschlossenes Material zu entfernen, wiedergewonnen werden. Das Eluieren des gebundenen TSGP kann (mit 10_3M KOH oder einem geeigneten Puffer) ohne Zerstörung der AB-Sepharose (wodurch sich diese wieder verwenden lässt) erreicht werden. Die Radioaktivität der eluierten TSGP-Fraktion wird bestimmt und aufgrund dieser Daten eine Standard-Titrationskurve wie oben aufgestellt. Zur Durchführung der radioimmunologischen Bestimmung wird die auf TSGP zu untersuchende Testprobe dann mit dem markierten Antigen und dem Antikörper inkubiert und die Radioaktivität der eluierten Fraktion, wie oben beschrieben, bestimmt.

Anstelle von Sepharose als Träger, kann der Antikörper an Kunststoffoberflächen, wie Scheiben oder Reagenzgläser in der von Catt, Science, 158, (1967) S. 1570 oder US-PS 3 646 346 beschriebenen Weise gebunden werden, wobei die in den genannten Druckschriften beschriebenen Verfahren angewandt werden können.

Bei der Doppel-Antikörper-Methode ist es erforderlich,

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dass ein Antikörper zum TSGP-Antikörper (z.B. Ziegenanti-Kaninchen) hergestellt wird. Dies dient dazu, um denTSGP-TSGP-Antikörper-IComplex zu präzipitieren, wobei Spiegel von TSGP-Antikörper verwendet werden, die weit unter den oben beschriebenen liegen. Die Standardkurven werden auf ähnliche Weise (direkte Kompetition) hergestellt, mit der Ausnahme, dass ein Zehntel bis ein Hundertstel der Mengen an TSGP-Antikörper eingesetzt werden. Die Fällung des TSGP-Antikörper-Komplexes wird durch Zugabe eines zweiten (Ziegen)Antikörpers und Inkubation für zwei Stunden bei 4°C durchgeführt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugation abgetrennt, mit Salzlösung gewaschen und dessen Radioaktivität bestimmt.

Anstelle der Radiomarkierung von TSGP kann der TSGP-Antikörper markiert werden und die in einer Versuchsprobe vorliegende Menge an TSGP durch Inkubation und Bestimmung der Radioaktivität der gebundenen und nicht-gebundenen Fraktionen bestimmt werden. Der markierte Antikörper kann auf eine feste Oberfläche oder auf geeignete Trägerteilchen aufgebracht werden, und dient als Reagenz, das mit TSGP-enthaltenden Testproben in Kontakt gebracht wird.

Die vorangehend beschriebenen Verfahren dienen dazu, um mittels radioimmunologischer Bestimmung sehr geringe Mengen von TSGP mit hoher Spezifität nachzuweisen. Dementsprechend kann eine frühzeitige Identifizierung der Anwesenheit von malignen Herden möglich gemacht werden, die auf routinemässig durchgeführte raidoimmuno-logische Bestimmungs-Analysen von Serumproben basiert. Das Auftreten von TSGP sollte als ein Signal für die Möglichkeit eines sich bildenden Tumors und der Notwendigkeit für weitere diagnostische Untersuchungen dienen.

III. Individual-Therapie durch Isolierung von TSGP und Antikörper-Herstellung:

Die Plasmapherese-Methode erlaubt es, bis zu 500 ml Serum von einem einzelnen Patienten zu erhalten. Auf diese Weise sollte es möglich sein, ausreichende Mengen an TSGP von dem einzelnen Patienten zu isolieren, die die Produktion von Antikörpern gestatten. Diese Antikörper richten sich gegen das TSGP und die Oberfläche der Tumorzellen. (Es konnte gezeigt werden, dass TSGP auf der Oberfläche von Tumorzellen, die im Labor in Kulturen gezüchtet wurden, nachweisbar ist.) Die Wechselwirkung dieses Antikörpers mit den Tumorzellen kann, durch das normale Immunsystem des Wirts, mittels Sensibilisierung der Zellen zu deren Lyse führen. Die komplementäre oder durch die Zelle verursachte Lyse von Target-Zellen wird häufig in Gegenwart von Agenzien, die mit der Zelloberfläche in Wechselwirkung treten, verstärkt. Die ungezielte Ausfällung des Antikörpers mit zirkulierendem oder löslichem TSGP kann durch Verwendung von monovalenten Fab-Antikörper-Fragmenten verhindert werden.

IV. Verwendung von TSGP zur Erleichterung der Chemotherapie:

Vorausgesetzt, dass Antikörper gegen TSGP, das von einer einzelnen Person isoliert wurde, produziert werden können,

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und dass diese Antikörper-Moleküle gegen die Oberfläche der Tumorzellen gerichtet werden, sollte es möglich sein, dieses Vehikel als spezifisches Trägeragens für funktionelle chemische Gruppen, die auf die Tumorzelle toxisch oder s lethal wirken, zu verwenden. Das allgemeine Muster einer derartigen therapeutischen Anwendung hängt von der Modifikation des TSGP-Antikörpers und der Einführung eines geeigneten Derivates am neuen Zentrum ab. Typischerweise werden Antikörper gegen TSGP aus dem Serum von Wirt-

10 stieren (z.B. Kaninchen) isoliert und gereinigt. Dies erfolgt durch eine Vielzahl von Standardverfahren, einschliesslich Differentialpräzipitation der ß- und y-Globulin-Fraktion, Gel-Ausschluss-Chromatographie auf Sephadex G-150, elektrophoretische Auflösung und schliesslich durch Affinitäts-

ls Chromatographie auf einer TSGP-Sepharose-Säule. Der letzte Schritt verwendet den spezifischen Liganden (TSGP), immobilisiert durch Kopplung an einen inerten Träger (Cuatre-casas et al., wie oben zitiert) und sichert die Abtrennung aus der Hauptmasse der Globulinfraktion.

20 Alle Immunoglobuline sind selbst Glykoproteine ; sie enthalten alle Galactose und die meisten haben mindestens einen Sialsäure-Substituenten. Diese Stellen sind geeignet für das Anbringen anderer funktioneller Gruppen. Typischerweise wird das isolierte Immunoglobulin entweder mit Natri-25 ummetaperjodat (wie vorangehend beschrieben) oder Galac-toseoxidase [s. Gahmberg et al., J. Biol. Chem. 2458,4311 (1973)] behandelt. Dabei ergibt sich, dass die Kohlenhydrat-komponente des Immunoglobulins modifiziert wird und nun eine funktionelle Aldehyd-Gruppierung enthält, die mit 30 einer Vielzahl von Agenzien umgesetzt werden kann.

Zu den Chemikalien, die mit diesem Verfahren mit dem Antikörper gekoppelt werden können, gehören Hydrazide und Stickstoff-Senföle. Die allgemeine Toxizität dieser Agenzien wird auffallenderweise reduziert, da das Zell-orientierte 35 Trägermolekül (TSGP-Antikörper) deren Introduktion in den Herd bei einem geringen Anteil der Konzentration erlaubt, die normalerweise angewendet wird.

V. Bestimmung des TSGP-Spiegels im Serum von 40 Patienten und dessen Verwendung als Index für die therapeutische Behandlungsweise:

Da das TSGP in direktem Zusammenhang mit dem Vorliegen von Krebs steht, kann der Fortschritt eines beliebigen Patienten, der eine Behandlung (z.B. Chemotherapie, Chir-45 urgie) erfährt, zum Teil durch die Bestimmung der TSGP-Spiegel vor und nach der Therapie ermittelt werden. Typischerweise werden TSGP-Spiegel im Serum für eine beliebige Person aufgestellt und kontrolliert. Im allgemeinen werden Patienten, denen chirurgisch ein Tumor entfernt wurde, in so drei- bis sechsmonatlichen Intervallen nachuntersucht. Die Diagnose zum Wiederauftreten der Krankheit oder der Wirksamkeit einer Drogenbehandlung erfolgt im allgemeinen durch das Nicht-Auftreten von Symptomen. Eine Routineuntersuchung der TSGP-Spiegel als Teil des allge-55 meinen Untersuchungsprotokolls würde erlauben, dass das Wiederauftreten eines Tumors wesentlich früher festgestellt werden kann, sowie die Bestimmung der Wirksamkeit einer spezifischen Behandlungsweise ermöglichen.

B

3 Blatt Zeichnungen

Claims

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1. Verfahren zur Feststellung von Krebs beim Menschen, dadurch gekennzeichnet, dass man menschliche Seren einer chemischen oder Radioimmuno-Bestimmungsanalyse zum Nachweis eines Tumor-spezifischen Glykoproteins unterwirft, das charakterisiert ist durch eine Löslichkeit in 0,6 M Perchlorsäure; einen pronase-resistenten Kern, enthaltend den Hauptanteil der Kohlenhydrate, wobei dieser Kohlenhy-drat-Anteil, der die Hauptmenge der Sialinsäure enthält,

über eine O-glykosidische Bindung von einem einzelnen N-Acetylgalactosaminyl-Rest an die Hydroxylgruppe von Serin oderThreonin mit der Polypeptidkomponente gebunden ist; durch eine sialinsäureabhängige Affinität für Weizenkeim-Agglutinin; eine Affinität für Diäthylamino-äthyl-Sephadex A-25 und Eluierbarkeit mit Pyridin-Acetat-Puffer vom pH 5,2 und einer Konzentration von etwa 0,4 M ; einen Einschluss auf Sephadex G-l 50 in 0,1 M Pyridin-Acetat-Puffer vom pH 5,2; eine Molekularmasse im Bereich von 50 000 bis 70 000; einen isoelektrischen Punkt von 4,2 bis 4,6, und eine Aminosäurezusammensetzung, die als hauptsächlich vorliegende Aminosäuren Glutaminsäure, Prolin, Asparaginsäure, Threonin und Leucin umfasst.

2. Verfahren nach Anspruch 1 zur chemischen Bestimmung, dadurch gekennzeichnet, dass man

(a) aus dem Blutserum einer krebsverdächtigen Person eine in Perchlorsäure oder Trichloressigsäure lösliche Fraktion isoliert;

(b) eine Fällung entfernt;

(c) die lösliche Fraktion mit einer alkalischen Substanz neutralisiert;

(d) den löslichen Anteil auf N-Acetylneuraminsäure analysiert, und

(e) die erhaltenen Ergebnisse mit einem Standard vergleicht.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1 zur Radioimmuno-Bestimmungsanalyse, dadurch gekennzeichnet, dass man

(a) aus dem Blutserum einer krebskranken Person eine in Perchlorsäure lösliche Fraktion isoliert;

(b) daraus ein tumorspezifisches Glykoprotein gewinnt;

(c) dieses Glykoprotein als ein Antigen zwecks Erzeugung eines Antikörpers in einem Wirtstier einsetzt;

(d) den Antikörper oder/und das tumorspezifische Glykoprotein radioaktiv markiert, und

(e) die markierte Substanz mit einer in Perchlorsäure löslichen Fraktion aus dem Blutserum eines Patienten zusammenbringt, wodurch sich ein Komplex aus dem Glykopro-teinantigen und dem Antikörper bildet;

(f) den Komplex abtrennt, und

(g) die Radioaktivität des Komplexes zur Bestimmung der Anwesenheit und Menge von tumorspezifischem Glykoprotein im Serum des Patienten misst.

4. Radioaktiv markiertes tumorspezifisches Glykoprotein mit der im Anspruch 1 gegebenen Charakteristik als Mittel zur Ausführung des Verfahrens gemäss Anspruch 1.

5. Radioaktiv markierter Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass er gegen ein tumorspezifisches Glykoprotein mit der im Anspruch 1 gegebenen Charakteristik gerichtet ist als Mittel zur Ausführung des Verfahrens gemäss Anspruch 1.