**WARNUNG** Anfang DESC Feld konnte Ende CLMS uberlappen **.
PATENTANSPRÜCHE
1. Antikörper gegen ein tumorspezifisches Glykoprotein, das charakterisiert ist durch eine Löslichkeit in 0,6 M Perchlorsäure; einen pronase-resistenten Kern, enthaltend den Hauptanteil der Kohlenhydrate, wobei dieser Kohlenhydrat Anteil, der die Hauptmenge.der Sialinsäure enthält, über eine O-glykosidische Bindung von einem einzelnen N-Acetylgalactosaminyl-Rest an die Hydroxylgruppe von Serin oder Threonin mit der Polypeptidkomponente gebunden ist; durch eine sialinsäureabhängige Affinität für Weizenkeim-Agglutinin; eine Affinität für Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-25 und Eluierbarkeit mit Pyridin-Acetat-Puffer vom pH 5,2 und einer Konzentration von etwa 0,4 M; einen Einschluss auf Sephadex G-150 in 0,1 M Pyridin-Acetat-Puffer vom pH 5,2; eine Molekularmasse im Bereich von 50000 bis 70000; einen isoelektrischen Punkt von 4,2 bis 4,6;
und eine Aminosäurezusammensetzung, die als hauptsächlich vorliegende Aminosäuren Glutaminsäure, Prolin, Asparaginsäure, Threonin und Leucin umfasst.
2. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er nachweisbar markiert ist.
3. Mittel zur Durchführung eines Verfahrens zur Feststellung von Krebs beim Menschen, bei welchem menschliche Seren einer chemischen oder Radioimmuno-Bestimmungsanalyse zum Nachweis des tumorspezifischen Glykoproteins mit der in Anspruch 1 gegebenen Charakteristik unterworfen werden, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 2 enthält.
Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper gegen ein tumorspezifisches Glykoprotein.
Untersuchungen in einer Reihe von Laboratorien, einschliesslich denen der Erfinder, haben gezeigt, dass Tierzellen in Gewebekulturen unter Bedingungen gezüchtet werden können, die es ihnen ermöglichen, charakteristische Eigenschaften, die typisch für das Gewebe sind, aus dem sie stammen, beizubehalten. In anderen Worten bedeutet dies, dass z.B. Knorpelzellen in Gewebekulturen gezüchtet werden können und dabei typische Produkte der Knorpelmatrix produzieren. Hypophysenzellen würden Hypophysenhormone erzeugen usw. Zu den Produkten, denen im Labor der Erfinder besonderes Interesse gewidmet wurde, zählen eine Gruppe von komplexen Sacchariden, die normalerweise als Sekretionsprodukte der Zellen angesehen werden, indem sie in der extrazellulären Matrix, in der sich faserartige und zelluläre Elemente befinden, aufgefunden werden.
Diese Verbindungsklasse hat etwa 6 Vertreter mit gewissen gemeinsamen Merkmalen, insbesondere hinsichtlich ihres Molekulargewichtes und einer hohen negativen Ladung. Die zuletzt genannte Eigenschaft dient häufig dazu, diese spezielle Gruppe zu isolieren und zu identifizieren.
Es wurde dann eine Untersuchung durchgeführt, wobei ein direkter Vergleich zwischen einer normalen Zell-Linie und der gleichen Zell-Linie nach Infektion mit einem viralen Agens, das die Zelle tumorigen machte, gezogen werden konnte. Über diese Arbeit wurde in Proc. Nat. Acad. Sci., USA, Band 70, Nr. 1, Seiten 53-56, Januar 1973, berichtet.
Es wurde festgestellt, dass kein qualitativer Unterschied zwischen den Saccharidprodukten bestand, wohl aber ein quantitativer Unterschied durch die Virustransformation einsetzte, und zwar insbesondere was die Synthese eines der charakteristischen Saccharide betraf. Diese quantitative Veränderung ist bei Untersuchungen in Zellkultursystemen nützlich, könnte jedoch niemals bei Tierversuchen angewandt werden, da das spezielle Produkt normalerweise in den meisten Geweben des Körpers gefunden wird, nichtantigen ist und unter keinen Umständen als charakteristisch für eine Tumorzelle angesehen werden kann. Nichtsdestoweniger waren qualitative Unterschiede von Interesse, die jedoch ganz allgemeiner Art waren.
Es konnte die Folgerung gezogen werden, dass die Umwandlung einer Zell-Linie durch Virustransformation zumindest eine Veränderung bei der Synthese der komplexen Saccharide mit sich brachte.
Wie in Biochemistry (1974) Band 13, S. 1233, berichtet, wurde im Labor der Erfinder eine ähnliche Versuchsserie mit B16-Melanoma-Zellen von Mäusen und einer Kontrollpopulation von normalen Melanocyten, die aus der Iris von Mäusen erhalten wurden, durchgeführt. Die beobachteten Unterschiede zwischen den Melanom-Zellen und der Kontrollzüchtung waren etwas stärker ausgeprägt als bei den Versuchen mit den oben beschriebenen normalen und virustransformierten Paaren. Diese Unterschiede können kurz wie folgt zusammengefasst werden:
1. Beim Vergleich der Tumorzellen mit den normalen Zellen lag sowohl ein qualitativer als auch ein quantitativer Unterschied in der Produktion von komplexen Sacchariden vor.
2. Insbesondere wurde ein wesentliches Produkt der normalen Zellen, Hyaluronsäure, von der tumorigen Linie überhaupt nicht erzeugt.
3. Von der Tumorlinie wurde ein sulfatiertes Polysaccharid mit ungewöhnlich hohem Molekulargewicht produziert, welches bei den normalen Zellen nicht auftrat.
Bezüglich des sulfatierten Polysaccharides ist es wesentlich, darauf hinzuweisen, dass sich diese Verbindung von den normalen Komponenten des Gewebes einzig in ihrer Molekulargrösse und nicht in ihrer molekularen Architektur unterscheidet. Das heisst, die Struktur des Saccharides war mit den Strukturen identisch, die normalerweise in Geweben gefunden werden, lediglich ihr Molekulargewicht war etwas höher.
Es wird nochmals darauf hingewiesen, dass diese Versuche geeignet sind für Studien bei Zellkulturbedingungen; als eine diagnostische Methode sind sie jedoch weitgehend unbrauchbar, da die in Frage kommende Verbindung durch eine Vielzahl von Zellen in den Wirtstieren schnell metabolisiert wird.
Sobald eine solche Verbindung im Kreislauf aufträte, würde sie schnell wieder herausgefiltert und von Leberzellen, Zellen der Niere, Fibroblasten usw. abgebaut. Aus diesem Grunde bietet die Anwesenheit oder die Produktion dieses Saccharides durch die Tumorzellen keine Anwendungsmöglichkeit, und zwar sowohl aus den obengenannten Gründen als auch aufgrund der Tatsache, dass die Verbindung selbst nichtantigen ist.
In einer Veröffentlichung in Cancer Research, 36, 424431, Februar 1976 (E.A. Davidson), wurde über die Ergebnisse einer Untersuchung des komplexen Saccharides menschlicher Zellen berichtet, die in vieler Hinsicht ähnlich den bei Mäusen erhaltenen Ergebnissen sind. Die menschlichen Melanomzellen produzieren weniger Hyaluronsäure als die Kontrollmelanocyten und ein hochmolekulares sulfatiertes Polysaccharid, ähnlich dem, wie es in den Mauszellen produziert wird.
Weitere Untersuchungen mit Mäusen brachten die Anwesenheit eines ungewöhnlichen Glykoproteins zutage. Aus diesem Grunde war man bemüht, die Art des Glykoproteins in Mäusen näher kennenzulernen, und zwar insoweit, als dessen Eigenschaften, strukturelle Chemie und biologische Funktion bestimmt werden konnten. Viele der chemischen Eigenschaften des Moleküls werden in der Veröffentlichung von E.A.
Davidson in Biochemical and Biophysical Research Communications , Bd. 70, Nr. 1, Mai 1976, beschrieben. Die Anwesenheit eines ungewöhnlichen Glykoproteins in
menschlichen Melanomzellen oder dessen Produktion durch dieselben wird in dieser Veröffentlichung nicht angesprochen,
Die Erfindung ist durch die Merkmale in den unabhängigen Ansprüchen gekennzeichnet.
Das Glykoprotein wird von Normalzellen nicht produziert. Das Glykoprotein, das von bösartigen Tumorzellen produziert wird, während es von gesunden oder normalen Zellen nicht produziert wird, also ein tumorspezifisches Glykoprotein (im folgenden manchmal als TSGP bezeichnet), ist im Tumor anwesend, wird von den Tumorzellen produziert, abgesondert und erscheint im Kreislauf des Wirts, bei Tieren sowie bei Menschen, und zwar etwa zu der Zeit, als eine fühlbare Tumormasse nachgewiesen werden kann. Das TSGP kann auch in einem beliebigen früheren Stadium auftreten.
Das TSGP wird von den Tumorzellen gebildet, ohne Rücksicht, um welchen Tumor es sich dabei handelt, und erscheint im Kreislaufsystem von Menschen, die an Lungen-, Brust-, Dickdarm-, Uterus- und Magenkarzinomen, Melanomen und ähnlichem leiden. Leukämien und andere Blutkrankheiten stellen einen Defekt in der Reifekontrolle dar, wodurch eine abnorme Zahl von Zellen auftritt, wie man sie normalerweise in den metabolen Bildungsschritten findet.
Aus diesem Grunde wird bei vielen oder den meisten dieser Blutkrankheiten kein TSGP produziert, da die Zellen selbst nicht tumorigen sind. Ausserdem ist es gut möglich, Leukämien durch mikroskopische Untersuchung einer Blutprobe nachzuweisen, so dass Leukämien vom diagnostischen Standpunkt kein Problem darstellen.
Das spezifische Glykoprotein, das von einem Wirtstier mit einer bösartigen Tumorerkrankung produziert wird, kann sich je nach Charakter und Art des Tumors sowie auch hinsichtlich des betroffenen Wirts unterscheiden, jedoch ungeachtet, um welchen Tumortyp es sich handelt, wird ein Produkt der Art und Klasse von Tumor-Glykoproteinen (TSGP) isoliert.
Es wird darauf hingewiesen, dass die Wachstumscharakteristiken und andere Eigenschaften von Tumoren mit unterschiedlichem zellulärem Ursprung (und von verschiedenen Personen) nicht gleich sein werden. Jedoch scheint es, dass der hier beschriebene Glykoprotein-Typ charakteristischerweise von einer grossen Anzahl von Tumoren produziert wird. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften von TSGP eines beliebigen Tumortyps sind einander genügend ähnlich, um durchwegs die Anwendung von Standard-Isolationsmethoden zu erlauben.
Die im nachfolgenden beschriebenen Merkmale hinsichtlich der Eigenschaften, chemischen Struktur und biologischen Funktion sind für TSGP charakteristisch und dienen dazu, es von den normalerweise im Serum gefundenen Glykoproteinen zu unterscheiden.
a) Löslichkeit in Perchlorsäure (0,6 M) bei 0 "C oder in Trichloressigsäure (5%) bei 0 "C.
b) Sialinsäure- oder N-Acetylneuraminsäure-Gehalt (im folgenden manchmal als NANA bezeichnet) mit 30 Gew. %, bezogen auf das Gesamtgewicht von Glucosamin, Galactosamin und Sialsäure (bzw. Sialinsäure genannt).
c) Affinität für Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-25 (Pharmacia Co., Uppsala, Schweden) und Eluierung mit Pyridinacetatpuffer, pH 5,2, bei einer Konzentration von ungefähr 0,4M.
d) Einschluss an Sephadex G-150 (Pharmacia Co., Uppsala, Schweden) in 0,1 M Pyridinacetat, pH 5,2. Eluierung bei 1,5 x dem Ausschlussvolumen, kalibriert mit Dextranblau.
e) Affinität für ein konjugiertes Weizenkeim-Agglutinin, immobilisiert an einen Sepharoseträger, wie z. B. eine Weizenkeim-Sepharose-Säule in 0,05 M Natrium- oder Kaliumchlorid. Es können andere künstliche Träger für das Weizenkeim Lektin verwendet werden. Eluierung von der Säule erfolgt spezifisch mit N-Acetylglucosamin (0,1 M in Wasser ist optimal). Andere Lektine, die für TSGP eine Affinität besitzen, jedoch nicht derart spezifisch sind, umfassen limulus-polyphemus-(Krebs)Lektin und nach Entfernung von Sialsäureresten Ricinus-Communis-II-Lektin.
f) Diese Affinität für das Weizenkeim-Agglutinin wird bei Behandlung mit Sialidase (gereinigt durch Affinitätschromatographie, um es von Protease freizumachen) von einer der verschiedenen Quellen verloren. Ein wesentliches Kriterium bei dieser Analyse ist es, dass es nicht notwendig ist, die Sialsäure vom TSGP vollständig zu entfernen, um die Affinität für Weizenkeim-Agglutinin zu zerstören.
g) Die Sialsäure in TSGP ist an Galactose gebunden und kann auch an N-Acetylgalactosamin gebunden sein.
h) Elektrophorese von TSGP in 6% Polyacrylamid-Gel in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (0,1%) und Anfärben des Gels auf Protein und Kohlenhydrat zeigt, dass TSGP ein Molekulargewicht von etwa 50000 bis 70000, wahrscheinlich etwa 60000 besitzt. Diese Zahl ist nicht genau anzugeben, da Glykoproteine im allgemeinen nach dieser Methode anomale Molekulargewichte ergeben. Das Glykoprotein tritt jedoch in ein obiges vernetztes Gel ein und wandert in demselben.
Nach Einwirkung von Pronase reduziert sich das Molekulargewicht auf etwa 10000 bis 15000. Dies stellt einen Proteaseresistenten Kern dar und lässt die Annahme zu, dass die Sialsäurereste und die Saccharidsubstituenten auf dem Polypeptidkern angeordnet sind bzw. sich um diesen herum zusammenballen.
i) Durch isoelektrische Fokussierung in Gelen oder in Lösung wird TSGP deutlich von irgendwelchen kontaminierenden Serumkomponenten (wie a-l-säures Glykoprotein) abgetrennt. TSGP hat einen isoelektrischen Punkt von etwa 4,2 bis 4,6 und kann aufgrund geringfügiger Unterschiede im Sialsäuregehalt mehrere eng beisammenliegende Bande aufzeigen.
j) TSGP enthält ebenfalls eine neutrale Hexose, hauptsächlich Galactose; es ist keine Glucose anwesend. Nachweis ist möglich durch Analyse auf neutrale Zucker (z. B. mittels der Methode von Dubois et al., Anal. Chem.. 28, 350 [19661).
k) TSGP kann als ein Produkt menschlicher Tumorzellen in vitro in monoschichtiger Kultur nachgewiesen werden.
1) Der Hauptanteil an Kohlenhydrat von TSGP, der die Hauptmenge an Sialsäure enthält, ist mit der Polypeptidkomponente über eine O-glykosidische Bindung verknüpft, und zwar von einem einzelnen N-Acetylgalactosaminyl-Rest zur Hydroxylgruppe von Serin oder Threonin (als Partialsequenz kann angesehen werden: Galactosyl-N-Acetylgalactosamin, jeweils in den 3- und 6-Stellungen mit Sialsäureresten substituiert).
m) Die gesamte Saccharid-Kette kann von dem Polypeptid durch Behandeln mit 0,01 N Natriumhydroxid, 16 Stunden bei 20 "C, abgespalten werden. Die sich ergebende Saccharid-Kette kann auf einer G25-Sephadex-Säule (1,2 > < x 60 cm) abgetrennt werden und wird bei 1,15 x dem Ausschlussvolumen (kalibriert mit Dextranblau) eluiert.
b) Die Aminosäurezusammensetzung der TSGP-Fraktion nach Chromatographie auf DEAE-Sephadex A-25 ergibt Glutaminsäure, Prolin, Asparaginsäure, Threonin und Leucin als hauptsächliche Aminosäuren.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die charakteristischen Unterscheidungsmerkmale tumorspezifischer Glykoproteine, die aus den Blutseren von krebsinfizierten Menschen isoliert werden können, folgende sind: Löslichkeit in 0,6 M Perchlorsäure, ein Pronase-resistenter Kern, der die Hauptmasse an Kohlenhydrat enthält, Affinität für Weizenkeim-Agglutinin, in Abhängigkeit von der Sialsäure, besondere elektrophoretische und chromatographische Mobilität, ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 50000 bis 70000 und ein isoelektrischer Punkt von etwa 4,2 bis 4,6.
Besonders charakteristische Eigenschaften des tumorspezifischen Glykoproteins, die sich für diagnostische Zwecke eignen, um letzteres von anderen Glykoproteinen in den Seren normaler Patienten zu unterscheiden, bestehen darin, dass TSGP einen isoelektrischen Punkt von etwa 4,2 bis 4,6 und die perchlorsäurelösliche Fraktion einen Sialsäuregehalt von über etwa 0,065 mg/ml der ursprünglichen Serumprobe hat.
Eine Anzahl der verwendeten Produkte ist im Handel erhältlich. Sephadex -Produkte werden von Pharmacia Fine Chemicals A.B., Uppsala, Schweden, hergestellt und vertrieben. Es handelt sich um vernetzte Dextrane mit unterschiedlicher Porosität oder Substituenten. Sepharose ist ein in kugelförmigen Partikeln geformtes Agarose-Gel. DEAE Sephadex A25 oder A50 wird aus Sephadex G25 oder G50 durch chemische Substituierung von Diäthylaminoäthyl Gruppen hergestellt. Letztere sind schwach basische Anionenaustauscher. Sie haben einen Kugeldurchmesser von 40 bis 120 Mikron und quellen zu einem Säulenvolumen von 89 (15-35) ml pro Gramm Trockengel. Sephadex G150 hat einen Kugeldurchmesser von 40 bis 120 Mikron, einen Fraktionierungsbereich von 5 bis 150000 Molekulargewicht und ein Säulenvolumen (bed volume) von 20 bis 30 ml pro Gramm Trockengel.
Sepharose 4B weist eine Agarose-Konzentration von 4% und einen Nasskugeldurchmesser von 40 bis 190 Mikron auf.
Es wird darauf hingewiesen, dass TSGP von carcinoembryonischem Antigen, wie in US-PS 3 663 684 beschrieben, u.a. unterschieden werden kann durch Einschluss von TSGP auf Sephadex G150 [wie oben unter d) beschrieben], die Affinität von TSGP für ein konjugiertes Weizenkeim-Agglutinin, immobilisiert auf einem Sepharose-Träger [wie oben unter e) beschrieben], sowie durch das Molekulargewicht [wie oben unter h) beschrieben]. Carcinoembryonisches Antigen weist keine dieser Eigenschaften auf.
I. Frühdiagnose von Personen mit irgendeiner Art von bösartiger Erkrankung:
Es wurde festgestellt, dass die Anwesenheit von TSGP in menschlichen Seren eine direkte Indikation für das Vorliegen eines bösartigen Tumors (nicht eingeschlossen sind Bluterkrankungen) des untersuchten Patienten sein kann. Es wurde eine einfache, jedoch genaue Methode zum Nachweis der An- oder Abwesenheit von TSGP in menschlichen Seren entwickelt. Auf diese Weise entstand eine allgemein anwendbare diagnostische Nachweismethode, die weder angreifend noch zerstörend wirkt und die als Teil einer routinemässig durchgeführten ärztlichen Untersuchung von Patienten in der risikoreichen Altersgruppe, d.h. Frauen über 40, Männer in bestimmten Berufen usw., angewandt werden kann.
Ausgehend von einer einzigen Blutprobe kann die Methode als Teil einer Routineuntersuchung für Personen aller Altersgruppen angewandt werden.
Der ursprüngliche analytische Nachweis für TSGP basiert auf den folgenden Eigenschaften desselben:
1. Das Glykoprotein hat eine sehr hohe negative Ladung.
2. Die negative Ladung ist in der Hauptsache, wenn nicht ausschliesslich, auf die Anwesenheit von N-Acetylneuraminsäure zurückzuführen.
3. Die N-Acetylneuraminsäure war auf den Saccharid Ketten angeordnet, die die Tendenz zeigen, sich zusammenzuballen und eine Kernstruktur auszubilden, die gegenüber Proteolyse resistent ist.
4. Das stark saure Gebilde war in einer geeigneten Konzentration von Perchlorsäure oder Trichloressigsäure oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel löslich.
5. Das Glykoprotein weist eine Affinität für Weizenkeim Agglutinin, welches an Sepharose immobilisiert ist, auf.
6. Das Glykoprotein kann aufgrund seiner hohen negativen Ladung an einer Vielzahl von anionischen Austauschern fraktioniert werden, einschliesslich Diäthylaminoäthyl-Cellulose, Diäthylaminoäthyl-Sephadex, Ecteola-Cellulose und starken und schwachen Anionenaustauschharzen wie Dowex 1 oder Dowex 2.
7. Der hohe Kohlenhydratgehalt des Glykoproteins und seine Ladung erlauben eine Identifizierung durch Polyacrylamid- oder andere Gel-Elektrophorese-Methoden sowie Anfärben entweder durch übliche Proteinfarbstoffe oder durch Farbstoffe für die Kohlenhydratkomponente unter Verwendung von Perjodsäure-Schiff-Reagens oder andere Reagenzien.
Kurz zusammengefasst basiert die diagnostische Nachweismethode auf den generalisierten und allgemeinen Strukturmerkmalen des Glykoproteins, d.h. den Pronase-beständigen Kern, die Affinität für Weizen-Agglutinin und die charakteristische elektrophoretische und chromatographische Mobilität.
Die allgemein anwendbare Methode zur Bestimmung der Anwesenheit von TSGP im menschlichen Blutserum umfasst die Beschaffung einer Serumprobe von einem menschlichen Patienten, Behandeln der Serumprobe mit einem TSGP Lösungsmittel wie Perchlorsäure, Trichloressigsäure oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel; Entfernung des gebildeten Niederschlages durch eine geeignete Methode zur Fest-Flüssig-Trennung wie Dekantierung, Filtration oder Zentrifugation; Neutralisierung der löslichen Fraktion mit einem alkalischen Material wie Kaliumhydroxid; Analysieren des löslichen Anteiles auf den Gehalt an N-Acetylneuraminsäure und Protein und Vergleich der gefundenen Werte für N-Acetylneuraminsäure und Protein mit Grundlinienparametern, aufgestellt für Normal- und Krebsseren.
Die Analyse auf NANA kann durch eine der üblichen bekannten Methoden erfolgen, einschliesslich der Perjodat Resorcinol-, Thiobarbitursäure oder der direkten Ehrlich Methode (G.W. Jourdian et al., J. Biol. Chem., 246, 431 (1971); L. Warren, J. Biol. Chem., 234, 1971(1959) und I.
Werner et al., Acta Med. Soc., Uppsala, 57, 230 (1952).
Die Proteinbestimmungen können z. B. durch ein modifiziertes Coomasie-Blau-G-Verfahren oder durch die Methode nach Lowry oder durch Bestimmung der Absorption bei 280 nm erfolgen [OH. Lowry et al., J. Biol. Chem., 193, 265 (1951) und M.M. Bradford, Anal. Biochem., 72, 248 (1976)].
Auf der Grundlage der zusammengestellten Daten von 370 menschlichen Serumproben wurden die folgenden Parameter zur Feststellung des Vorliegens von bösartigen Tumoren bei Menschen festgelegt (basierend auf der Analyse der Perchlorsäure-löslichen Fraktion, bezogen auf das Volumen der ursprünglichen Serumprobe):
1) Ein Sialsäuregehalt (NANA) von über etwa 0,065 mg/ ml weist auf die Möglichkeit eines Tumors hin; ein Sialsäuregehalt von über etwa 0,080 mg/ml indiziert einen wahrscheinlichen Tumor.
2) Ein Proteingehalt von über etwa 0,35 mg/ml weist auf einen möglichen Tumor, ein Proteingehalt von über etwa 0,4 mg/ml auf das wahrscheinliche Vorliegen eines Tumors hin.
Es wurde eine Ausgangsuntersuchung mit 59 Proben durchgeführt, wobei die Perjodat-Resorcinol-Methode und die direkte Ehrlich-Methode für N-Acetylneuraminsäure Spiegel und das Lowry-Verfahren für Proteinspiegel angewandt wurden. Es wurde festgestellt, dass zwischen 30 Krebspatienten und 29 Normalkontrollen eine vollständige Unterscheidung im Gehalt der Sialsäure bestand. Das heisst, der höchste Normalspiegel war immer noch niedriger als der niedrigste Spiegel, der bei einem Patienten mit diagnostizierter bösartiger Erkrankung festgestellt wurde. Diese Ausgangs untersuchung schloss eine Anzahl von Erkrankungen verschiedener Art, Lungen-, Brust-, Dickdarm-, Lymphom- und Melanom-Patienten ein, davon ausgehend, dass die Produktion eines Perchlorsäure-löslichen Glykoproteins eine allgemeine Eigenschaft einer Anzahl von Tumoren darstellt.
Die statistische Analyse dieser Werte zeigte, dass die Zufallswahrscheinlichkeit dieser Ergebnisse geringer als 1 in 1000 ist.
Unter Auswertung der in der vorangehend beschriebenen Untersuchung erhaltenen Spiegel als parametrische Kriterien wurde eine viel grössere Untersuchung mit etwa 311 Patienten durchgeführt, die sowohl an bösartigen Erkrankungen und einer Reihe von nichtmalignen Beschwerden litten sowie einer Anzahl von normalen Kontrollpersonen. Lediglich basierend auf die Gehalte an Protein und Sialsäure (N-Acetyl-neuraminsäure) wurde eine über 95%ige Unterscheidung zwischen Normalpersonen und nicht bösartig erkrankten Personen einerseits und Patienten mit Tumor andererseits erhalten. Ausserdem bestand kein signifikanter Unterschied zwischen normal- und nicht bösartig erkrankten Personen oder zwischen Männern und Frauen. Es wurde eine Reihe anderer statistischer Tests durchgeführt, wobei die Daten von dieser Gruppe stammen.
Es sei hier nur angeführt, dass die Zufallswahscheinlichkeit zur Unterscheidung zwischen der Krebsgruppe und der anderen Gruppe geringer ist als 1 in 1000. Es besteht auch eine deutliche Korrelation mit dem Fortschritt der Erkrankung. So haben Personen mit ausgestreuter, verbreiteter metastatischer Erkrankung höhere Spiegel an zirkulierendem TSGP als solche mit lokalisierter Erkrankung; Personen, die sich in Remission befinden bzw. Personen nach einer chirurgischen und/oder chemotherapeutischen oder Strahlungsbehandlung tendieren dazu, niedrigere Spiegel an zirkulierendem Glykoprotein zu haben.
Diese Ergebnisse führten zu einer Reihe von weiteren Untersuchungen. Zuerst wurde das Augenmerk auf die wenigen falschen positiven Bestimmungen, die sich in dieser Gruppe zeigten, gerichtet. Es zeigte sich, dass mehrere derselben von asthmatischen Patienten herrührten und in der Tat auf einen Faktor, der mit dieser Krankheit assoziiert ist, bezogen werden können.
Dementsprechend wurde eine weitere Untersuchung mit den falschen Positiven, mit Normalproben und verschiedenen Patienten mit diagnostiziertem Krebs durchgeführt, um festzustellen, ob die gefundenen qualitativen Unterschiede im Zellkultursystem auch in der Serumprobe wiederholt werden konnten. Statt nur einfach die Spiegel an N-Acetyl-neuraminsäure in der Perchlorsäure-löslichen Fraktion zu berücksichtigen, wurde das Perchlorsäure-lösliche Material einer Gel Elektrophorese unterzogen (wie insbesondere im nachfolgenden Beispiel 2 beschrieben), zum Nachweis des charakteristischen Tumor-Glykoproteins (TSGP). Das tumorspezifische Glykoprotein hat einen isoelektrischen Punkt von etwa 4,2 bis 4,6 und ein Molekulargewicht von etwa 50000 bis 70000, allgemein etwa 60000.
Nach Durchführung dieser zweiten Untersuchung reduzierte sich die Anzahl an falschen Positiven auf Null; lediglich Patienten mit diagnostiziertem Tumor zeigten eine charakteristische Glykoprotein-Bande auf der Gel-Elektrophorese. Obwohl einige wenige der Personen mit Erkrankungen (insbesondere Leukämien) N-Acetylneuraminsäure-Spiegel aufwiesen, die nicht in die anormale Gruppe fielen, traten keine Normalen oder nicht bösartig erkrankten Normalen in der positiven Gruppe nach der zweiten Untersuchung auf.
Darüber hinaus konnte die Anwesenheit des charakteristischen Glykoproteins bei solchen Personen mit bösartiger Erkrankung gezeigt werden, die niedrigere Spiegel an N-Acetylneuraminsäure aufwiesen.
Zusammengefasst zeigt die entwickelte Nachweismethode folgendes:
1. Es besteht ein ungewöhnlich hoher Wahrscheinlichkeitsgrad in der Voraussage des Vorliegens eines Tumors sowie des Erkrankungsstadiums, basierend lediglich auf der Messung der N-Acetyl-neuraminsäure- und Proteinspiegel in der perchlorsäurelöslichen Fraktion des Serums.
2. Die sehr kleine Anzahl von falschen Positiven kann vollständig durch eine zweite Untersuchung, die eine Gel Elektrophorese und Untersuchung der Gele auf das Vorliegen des charakteristischen tumorspezifischen Glykoproteins umfasst, eliminiert werden.
3. Der Voraussagewert dieser Methode ist mindestens ebenso gut oder besser als irgendeine der gegenwärtigen oder früher beschriebenen Methoden, einschliesslich dem carcinoembryonischen Antigen, wie es in der US-PS 3 683 684 beschrieben wird.
4. Obwohl TSGP nicht für sämtliche Tumore oder in der Tat sogar z. B. für sämtliche Lungencarcinome identisch sein mag, besitzt es doch eine ausreichende Identität aufgrund struktureller Charakteristiken, um eine verallgemeinerte diagnostische Nachweismethode zu erlauben. Wichtig ist die Feststellung, dass zwei verschiedene Personen mit der gleichen anatomischen Diagnose dennoch Tumore mit unterschiedlichen Charakteristiken in bezug auf Metastasegeschwindigkeit, Wachstumsgeschwindigkeit sowie charakteristischer Produkte aufweisen können. Es besteht die Möglichkeit, dass jeder Tumor eine unterschiedliche biologische Einheit und eine unterschiedliche Krankheit darstellt und dass keine zwei identisch sind, wenn man charakteristische Zellprodukte in Betracht zieht.
Aus diesem Grunde besteht eine dringende Notwendigkeit für eine verallgemeinerte Identifikationsmethode und eine allgemein anwendbare therapeutische Strategie, bevor ein vernünftiger Fortschritt in bezug auf Früherkennung oder therapeutische Behandlung mit weitem Anwendungsbereich erwartet werden kann.
Die Tatsache, dass ein tumorspezifisches Glykoprotein in menschlichen Seren anwesend ist, welches ein Produkt des Tumorwachstums darstellt, stellt ein allgemeines diagnostisches Mittel dar.
Beispiel 1: Reinigung und Isolierung des tumorspezifischen Glykoproteins
Serumproben von Patienten mit diagnostizierten festen Tumoren (Lungen-, Magen- und Brustkarzinom und Melanom wurden verwendet, die jeweils eine ähnliche chromatographische und elektrophoretische Mobilität zeigten) wurden wie folgt behandelt:
70 Mikroliter einer 60%gen Perchlorsäure wurden pro ml Serum zugegeben und die Lösung gemischt. Zu dieser Lösung werden 0,93 ml 0,6 M Perchlorsäure pro ml Serum zugegeben.
Diese Lösung wird gut gemischt und eine Stunde (45 bis 90 Min. sind ausreichend) bei 0 C stehengelassen. Das Gemisch wird dann bei 8000 g 10 Min. lang (6 bis 12 Min.) zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit durch Dekantieren vom Niederschlag getrennt.
Die erhaltene überstehende Lösung wird mit 1,2 M Kaliumhydroxid auf pH 6 bis 7 eingestellt und 10 Min. bei 0 "C stehengelassen. Das Kaliumperchlorat wird wie oben durch Zentrifugation (Filtration ist ausreichend) abgetrennt und die überstehende Flüssigkeit 24 Stunden lang (16 bis 36 Stunden sind ausreichend) gegen 10-3 M Pyridinacetat, pH 5,2, dialysiert.
Eine DEAE-Sephadex-A-25-Säule (1,5 x 40 cm) wird entsprechend den Anweisungen des Herstellers bereitet und mit 0,1 M Pyridinacetat, pH 5,2, äquilibriert.
Die Probe des dialysierten Perchlorsäure-Überstandes wird (vorzugsweise) durch Lyophilisation oder Ultrafiltration auf etwa das Zehnfache konzentriert. Ein Aliquot mit bis zu 5 mg Sialsäure und bis zu 30 mg Protein wird auf die Säule aufgebracht und diese daraufhin mit einem linearen Gradienten aus 0,01 M bis 1,0 M Pyridinacetat, pH 5,2 (das gesamte Gradientenvolumen beträgt 600 ml), eluiert.
Bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 ml pro Stunde werden Fraktionen gesammelt (5 bis 6 ml Fraktionen).
Diese Fraktionen werden dann auf ihren Protein- und Sialsäuregehalt nach Lowry et al. und mittels der Perjodat-Resorzinol-Methode analysiert. Die Sialsäure-positiven Fraktionen, die den Hauptteil dieser Säure enthalten und bei einer Gradientkonzentration von etwa 0,4 M eluiert werden, werden vereinigt, bei 0 "C 24 Stunden lang gegen destilliertes Wasser dialysiert und durch Lyophilisation konzentriert. Diese Fraktion enthält das tumorspezifische Glykoprotein upd kann etwas a-1-saures Glykoprotein, eine normale Serumkomponente, enthalten.
Eine weitere Reinigung des tumorspezifischen Glykoproteins kann durch isoelektrische Fokussierung oder Chromatographie über DEAE-Sephadex A-50 erreicht werden.
Die nach der oben beschriebenen Chromatographie erhaltene Fraktion, die die Sialsäure enthält, wird auf eine 1,2 x 50cm-Säure aus DEAE-Sephadex A-50 aufgebracht und die Säule mit einem linearen Pyridin-Acetat-Gradienten (0,01 bis 0,5 M, pH 5,2, 400 ml) eluiert. Es werden zwei Sialsäure-positive Fraktionen erhalten, die jeweils bei den Gradientenkonzentrationen 0,42 und 0,46 M eluiert werden. Die zweite Fraktion enthält das Tumor-Glykoprotein und ist im wesentlichen frei von anderen Verunreinigungen. Diese Fraktion wird durch 24 Stunden lange Dialyse gegen destilliertes Wasser bei 0 "C entsalzt und durch Lyophilisation konzentriert.
Alternativ wird die Fraktion mit dem tumorspezifischen Glykoprotein, wie sie von der DEAE-Sephadex-A-25-Säule erhalten wird, einer Gel-isoelektrischen Fokussierung in einem pH-3,5- bis 7,0-Ampholin-Gradienten mit Hilfe eines LKB-Multiphorgerätes von LKB Instruments, Inc., unterworfen. Kontaminierende saure Glykoproteine weisen isoelektrische Punkte von 3,5 bis 3,8 auf und werden deutlich von dem tumorspezifischen Glykoprotein getrennt, das einen isoelektrischen Punkt bei 4,4 (4,2 bis 4,6) besitzt. Nach demselben Prinzip kann präparativ gearbeitet werden, indem eine 110ml-Ampholin-Säule (LKB) und der oben beschriebene pH Gradient verwendet werden. Der Bereich zwischen pH 4,2 und 4,6 wird gesammelt, gegen destilliertes Wasser dialysiert und durch Lyophilisation konzentriert.
Das Produkt kann in 0,01 M Natrium- oder Kaliumchlorid, das 0,005 M Phosphatpuffer, pH 6,5 enthält, gelöst werden.
Eine letzte Reinigung sowie eine Prüfung auf Verunreinigungen kann durch Affinitätschromatographie des Glykoproteins auf einer Weizenkeim-Agglutinin-Sepharosesäule erreicht werden.
Die Glykoproteinlösung (in Natriumchlorid/Phosphat, 0,01 M/0,005 M, pH 6,5) wird auf eine 1 x 10-cm-Säule mit Sepharose 4 B, das mit Weizenkeim-Agglutinin konjugiert ist, und die mit der gleichen Lösung äquilibriert wurde, gegeben.
Die Säule wird mit 3 bis 5 Volumen des äquilibrierenden Puffers gewaschen (von dem Tumor-Glykoprotein sollte dabei nichts von der Säule eluiert werden). Das Tumor-Glykoprotein kann mit einem scharfen symmetrischen Peak mit 0,01 M N-Acetylglucosamin eluiert werden. Der Zucker wird durch Dialyse gegen destilliertes Wasser entfernt und das Glykoprotein durch Lyophilisation konzentriert.
Beispiel 2: Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
Lösung A wird durch Vermischen von 0,24 g Acrylamid (erhältlich von Eastman Organic DPI und zweimal in Aceton umkristallisiert) mit 0,73 g N,N'-Methylenbisacrylamid und 100 ml Wasser hergestellt. Lösung B bereitet man durch Auflösen von 150 mg Kalium- oder Ammoniumpersulfat in 100 ml Wasser. Lösung C enthält 7,7 g NaH2PO4- H20, 38,6 g Na2HPO4 - 7H20, 4 g Natriumdodecylsulfat und 1,15 ml N,N,N',N'-Tetramethyläthylendiamin (Eastman DPI) pro Liter. Das Gel wird hergestellt durch Mischen von einem Teil der Lösung A mit zwei Teilen der Lösung B und einem Teil der Lösung C. Das Gemisch wird sofort in ein 5 x 75-mm Gel-Röhrchen mit einer Höhe von 55 mm gegeben.
Das Gel wird 10 mm mit H20 überschichtet und das auf diese Weise hergestellte Röhrchen eine Stunde lang bei 25 "C stehengelassen. Das Röhrchen wird daraufhin in ein Reservoir eingegeben. Eine Probe, 10 bis 25 1ll, die 5 bis 20 llg Glykoprotein enthält, wird auf das obere Ende der Geloberfläche überschichtet und ein Elektrophoreselauf bei 70 V zwei Stunden lang durchgeführt. Das Gel wird herausgenommen und mit 10%der Trichloressigsäure 3 Min. lang fixiert und dann mit 0,3%igem Coomassie Brillantblau R in 10% Essigsäure/45% Methanol/45% H20 zwei Stunden lang bei 40 "C gefärbt.
Das Material wird daraufhin mit 7% Essigsäure/30% Methanol/ 63% Wasser fünfmal zwei Stunden lang bei 40 "C (oder bei 25 "C entsprechend länger) entfärbt. Die Färbemethode für Glykoprotein entspricht der von Zacharius et al., Anal. Biochem., 30, 148 (1969), beschriebenen.
Beispiel 3: Radioimmuno-Bestimmung zum Nachweis des tumorspezifischen Glykoproteins
Unter Verwendung ausreichender Mengen an Material, das von menschlichen Patienten mit breitem Erkrankungsbereich und hohen Glykoproteingehalten erhalten wurde, kann das tumorspezifische Glykoprotein durch Kombination einer Reihe von Methoden gereinigt werden, einschliesslich Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, isoelektrische Fokussierung und andere, und ein Antikörper zu diesem Glykoprotein entwickelt werden unter Anwendung einer Reihe von immunologischen Methoden. Anfangs werden Kaninchen, Meerschweinchen oder Hamster als Wirtstiere für die Entwicklung eines Antikörpers erster Stufe verwendet. Obwohl dies geeignet ist, mag es wünschenswert oder vorzuziehen sein, das tumorspezifische Glykoprotein durch Modifikation der Sialsäure, z.
B. durch Reaktion mit Aminen oder Hydraziden nach der Perjodatbehandlung oder durch partielle Entfernung oder Hydrolyse der Sialsäure [unter Verwendung von Sialidase aus einer Anzahl von Quellen (vibrio cholera, hemophilus influenzae, clostridium species, diploccocus pneumoniae u.a.)] zu modifizieren, um darüber hinaus Kohlenhydratgruppierungen freizulegen, die immunologisch reaktionsfähiger sein können.
Nachdem der Antikörper zu dem tumorspezifischen Glykoprotein in einem geeigneten Wirtstier erhalten worden ist, werden Antikörper zu diesem durch Injektion der Globulinfraktion des Wirts in eine Ziege hergestellt. Auf diese Weise wird z. B. Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper erhalten, der mit Radiojod oder durch andere geeignete Methoden radioaktiv markiert wird. Alternativ kann TSGP radioaktiv mit 125I oder 3H nach R.O. Hynes, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 70, 3170 (1973) oder Liao et al., J. Biol. Chem. 248, 8247 (1973) markiert werden. Auf diese Weise erhält man einen radioimmunologischen Nachweis zur Bestimmung geringerer Mengen an Glykoprotein mit Hilfe von hochspezifischen immunologischen Methoden.
Auf diese Weise erhält man einen Empfindlichkeitsspiegel, der 100- bis 10000mal tiefer liegt als die Empfindlichkeit, die mit den rein chemischen Verfahren erreicht wird.
Da man davon ausgehen kann, dass das Tumor-Glykoprotein sogar von sehr wenig Tumorzellen, wenn diese in einer Kultur gezüchtet werden, produziert wird, ist die Annahme berechtigt, dass sehr kleine Tumorherde dieses Glykoprotein, das dann im Kreislauf der Individuen erscheint, produzieren und absondern. Eine hochempfindliche Nachweismethode, wie z. B. die Radioimmunobestimmung, macht es möglich, die Anwesenheit dieser Komponente anzuzeigen, noch vor dem Auftreten irgendwelcher manifestierter Symptome wie Schmerzen, Unbehagen, Gewebeknoten usw. Ein positiver Test mit Hilfe dieser Methode würde dem untersuchenden Arzt die Notwendigkeit für weitere und sorgfältigere diagnostische Untersuchungen des Patienten anzeigen, um die Art, den Typ und die Lage des Tumors sicherzustellen. Dies erlaubt eine frühe Behandlung, noch bevor das Tumorwachstum und Metastasen auftreten.
Es besteht kein Zweifel, dass die frühzeitige Diagnose und Behandlung von Krebs noch immer das effektivste Mittel im Kampf gegen die hohe Sterblichkeitsrate, die mit dieser Krankheit assoziiert ist, darstellt.
Beispiel 4:
Antikörperproduktion
Das gereinigte tumorspezifische Glykoprotein, z. B.
gemäss Beispiel 1 (0,5 mg in 1 ml 0,15 M Nah1) wird mit einem geeigneten Agens (Freunds-Adjuvanz) vermischt und in ein geeignetes Tier injiziert. Die Injektion kann erfolgen: subkutan, intramuskular (grössere Volumen, 3 bis 4 X) in die Fusssohle oder durch entsprechende Kombination. Auf diese Weise können Kaninchen, Meerschweinchen, Pferde und Ziegen behandelt werden. Bei Kaninchen würde sich die Injektion in wöchentlichen Abständen über eine Periode von 6 Wochen wiederholen, worauf von dem Kaninchen Blut abgenommen und das Serum hergestellt wird. Dieses Serum ist ein nichtabsorbiertes TSGP-(tumorspezifisches Glykoprotein)Serum. Dies kann dann mit Hilfe eines normalen Serums absorbiert und ein sich bildender Niederschlag abgetrennt werden. Der Überstand wird den Antikörper, spezifisch für TSGP, enthalten.
Beispiel 5: Modifikation von funktionellen Gruppen am TSGP
Es wird eine selektive strukturelle Modifizierung des tumorspezifischen Glykoproteins durchgeführt, um seine immunologischen Eigenschaften zu verstärken und um einen Mechanismus zu schaffen für das Binden von spezifischen funktionellen Gruppen. Die TSGP-Probe wird in einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,1 M Acetatpuffer, pH 5,0 (Natrium oder Kalium), hergestellt. Diese Lösung wird mit einem äquivalenten Volumen einer Lösung vermischt, die 2 bis 4 IlMol Natriummetaperjodat im gleichen Puffer enthält.
Das Gemisch lässt man 30 Min. lang bei 0 "C stehen und zerstört das restliche Perjodat durch Zugabe von 5 FuMol Natriumarsenit. Das modifizierte TSGP kann nun mit einem der verschiedenen Amine oder Hydrazide, wie von K. Itaya et al., Biochem. Biophys., Res. Comm. 64, 1028 (1975) beschrieben, umgesetzt werden. Dieses Verfahren ändert spezifisch die Sialsäuregruppierungen auf dem Molekül und erlaubt ihre Umwandlung zu einer immunologisch stärker responsiven Gruppierung.
Das derivatisierte TSGP kann dann, wie oben beschrieben, für die Antikörper-Herstellung verwendet werden.
Beispiel 6: I. Hydrolyse von Sialsäuregruppierungen am TSGP
Im Handel erhältliche Sialidase aus Vibrio cholerae oder Clostridium perfingens wird mittels Affinitätschromatographie (s. P. Cuatrecasas, Biochem. Biophys. Res. Comm., 38, 947 [1970]) gereinigt. Das TSGP wird in einer Konzentration von 1 bis 2 mg/ml in pH-5,0-Acetatpuffer (Kalium), der 2 mM Calciumacetat enthält, hergestellt. Diese Lösung wird mit einer Lösung vermischt, die 50 Millieinheiten gereinigter Sialidase im gleichen Puffer enthält. Das Gemisch wird 18 Stunden (12 bis 24 Stunden) bei 37 "C inkubiert. Das modifizierte TSGP wird von der frei gewordenen Sialsäure durch Chromatographie auf einer vernetzten Dextrangelsäure (1 x 60 cm) in pH-5,0-Acetatpuffer (z. B.
Sephadex G-50, das eine Anschlussgrenze des Molekulargewichtes von etwa 50000 und eine Teilchengrösse von 30 bis 100 Mikron besitzt) abgetrennt. Das modifizierte TSGP erscheint im Ausschlussvolumen (erster Proteinpeak). Nach Dialyse gegen destilliertes Wasser (24 Stunden) und Konzentrierung durch Lyophilisation kann das Material direkt für die Antikörperproduktion, wie oben beschrieben, verwendet werden.
II. Radioimmuno-Bestimmung:
Verschiedene Arten von Radioimmuno-Bestimmungsmethoden können zum Nachweis von TSGP im Serum ange wandt werden. Typische Beispiele stellen die Methoden der direkten Kompetition, der Vorbindung und der Doppel-Anti körper-Bindung dar und werden nachfolgend beschrieben.
Bei der Methode der direkten Kompetition verwendet man TSGP, radioaktiv markiertes TSGP (3H oder '251-Mate- rial) und TSGP-Antikörper (z. B. von Kaninchen). Man stellt eine Standard-Titrationskurve auf, indem eine Reihe von bekannten TSGP-Konzentrationen in eine Anzahl von Reagenzgläser gegeben wird, die Aliquot des Perchlorsäure-Über standes von normalem Serum enthalten, wobei dieses äquiva lent dem zu analysierenden Serumvolumen ist (typischerweise
1 bis 5 ml). Dieses Gemisch wird in 0,1 M Natriumkalium phosphatpuffer, pH 7,2, hergestellt. Daraufhin wird ein Ali quot eines TSGP-Antiserums in jedes Reagenzglas gegeben, und zwar in ausreichender Menge, um mit dem gesamten vor liegenden TSGP im Reagenzglas mit der höchsten Konzentration zu reagieren.
Dieses Gemisch wird 16 Stunden lang bei 4 "C stehengelassen, worauf eine bestimmte Menge (5 x 10- 2 x 104 Counts pro Minute) an radiomarkiertem
TSGP zugegeben wird. Nach Inkubation für zwei Stunden bei
37 "C werden der Antikörper und der Antigen-Antikörper
Komplex durch Zugabe eines geeigneten Agens, wie gesättig tes Ammoniumsulfat oder Ziegenanti-Kaninchenanti-Serum (s. unten), präzipitiert. Freies TSGP bleibt in Lösung, und die
Menge an radiomarkiertem TSGP in der löslichen Fraktion kann durch Bestimmung der radioaktiven Counts in einem
Flüssig-Scintillationsspektrometer (3H) oder einem gamma
Scintillationszähler (1251) bestimmt werden.
Mit Hilfe dieser
Daten lässt sich eine Standard-Titrationskurve aufstellen, aus der die TSGP-Konzentration einer unbekannten Serumprobe, die demselben Verfahren unterworfen wurde, abgeleitet wer den kann.
Die radioimmunologische Methode der Vorbindung geht davon aus, dass der TSGP-Antikörper an einen unlöslichen
Matrixträger, wie Sepharose 4B, gekoppelt wrid, wodurch ein wiederverwendbarer gebundener Partikel-Antikörper gebildet wird (AB-Sepharose). Diese Präparation wird dann mit bekannten Mengen an TSGP und radiomarkiertem TSGP wie oben beschrieben inkubiert und eine Standard-Titrations kurve aufgestellt. Der TSGP-Antikörper-Sepharose-Komplex kann durch Filtration und Waschen mit 0,15 M NaCL, um mechanisch eingeschlossenes Material zu entfernen, wieder gewonnen werden. Das Eluieren des gebundenen TSGP kann (mit 10-3M KOH oder einem geeigneten Puffer) ohne Zerstö rung der AB-Sepharose (wodurch sich diese wiederverwen den lässt) erreicht werden.
Die Radioaktivität der eluierten
TSGP-Fraktion wird bestimmt und aufgrund dieser Daten eine Standard-Titrationskurve wie oben aufgestellt. Zur
Durchführung der radioimmunologischen Bestimmung wird die auf TSGP zu untersuchende Testprobe dann mit dem markierten Antigen und dem Antikörper inkubiert und die Radioaktivität der eluierten Fraktion wie oben beschrieben bestimmt.
Anstelle von Sepharose als Träger kann der Antikörper an Kunststoffoberflächen, wie Scheiben oder Reagenzgläser, in der von Catt, Science, 158 (1967), S. 1570 oder US-PS 3 646 346 beschriebenen Weise gebunden werden, wobei die in den genannten Druckschriften beschriebenen Verfahren angewandt werden können.
Bei der Doppel-Antikörper-Methode ist es erforderlich, dass ein Antikörper zum TSGP-Antikörper (z.B. Ziegenanti Kaninchen) hergestellt wird. Dies dient dazu, um den TSGP TSGP-Antikörper-Komplex zu präzipitieren, wobei Spiegel von TSGP-Antikörper verwendet werden, die weit unter den oben beschriebenen liegen. Die Standardkurven werden auf ähnliche Weise (direkte Kompetition) hergestellt, mit der Ausnahme, dass ein Zehntel bis ein Hundertstel der Mengen an TSGP-Antikörper eingesetzt werden. Die Fällung des TSGP-Antikörper-Komplexes wird durch Zugabe eines zweiten (Ziegen-)Antikörpers und Inkubation für zwei Stunden bei 4 "C durchgeführt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugation abgetrennt, mit Salzlösung gewaschen und dessen Radioaktivität bestimmt.
Anstelle der Radiomarkierung von TSGP kann der TSGP Antikörper markiert werden und die in einer Versuchsprobe vorliegende Menge an TSGP durch Inkubation und Bestimmung der Radioaktivität der gebundenen und nichtgebundenen Fraktionen bestimmt werden. Der markierte Antikörper kann auf eine feste Oberfläche oder auf geeignete Trägerteilchen aufgebracht werden und dient als Reagenz, das mit TSGP enthaltenden Testproben in Kontakt gebracht wird.
Die vorangehend beschriebenen Verfahren dienen dazu, um mittels radioimmunologischer Bestimmung sehr geringe Mengen von TSGP mit hoher Spezifität nachzuweisen. Dementsprechend kann eine frühzeitige Identifizierung der Anwesenheit von malignen Herden möglich gemacht werden, die auf routinemässig durchgeführte radioimmunologische Bestimmungsanalysen von Serumproben basiert. Das Auftreten von TSGP sollte als ein Signal für die Möglichkeit eines sich bildenden Tumors und der Notwendigkeit für weitere diagnostische Untersuchungen dienen.
** WARNING ** beginning of DESC field could overlap end of CLMS **.
PATENT CLAIMS
1. Antibodies against a tumor-specific glycoprotein, which is characterized by a solubility in 0.6 M perchloric acid; a pronase-resistant core containing the majority of the carbohydrates, this carbohydrate portion containing the majority of the sialic acid being bound to the hydroxyl group of serine or threonine with the polypeptide component via an O-glycosidic bond from a single N-acetylgalactosaminyl residue is; by a sialic acid dependent affinity for wheat germ agglutinin; an affinity for diethylaminoethyl Sephadex A-25 and elution with pyridine acetate buffer of pH 5.2 and a concentration of about 0.4 M; inclusion on Sephadex G-150 in 0.1 M pyridine acetate buffer, pH 5.2; a molecular mass in the range of 50,000 to 70,000; an isoelectric point of 4.2 to 4.6;
and an amino acid composition comprising, as the main amino acids, glutamic acid, proline, aspartic acid, threonine and leucine.
2. Antibody according to claim 1, characterized in that it is detectably marked.
3. Means for carrying out a method for the detection of cancer in humans, in which human sera are subjected to a chemical or radioimmuno-determination analysis for the detection of the tumor-specific glycoprotein with the characteristic given in claim 1, characterized in that it is an antibody according to one of the claims 1 to 2 contains.
The present invention relates to antibodies against a tumor-specific glycoprotein.
Studies in a number of laboratories, including those of the inventors, have shown that animal cells can be grown in tissue cultures under conditions that allow them to maintain characteristic properties typical of the tissue from which they originate. In other words, this means that e.g. Cartilage cells can be grown in tissue cultures and thereby produce typical products of the cartilage matrix. Pituitary cells would produce pituitary hormones, etc. Among the products of particular interest in the inventor's laboratory include a group of complex saccharides, which are normally considered to be secretion products of cells, in the extracellular matrix, which contains fibrous and cellular elements be found.
This class of compounds has about 6 representatives with certain common characteristics, in particular with regard to their molecular weight and a high negative charge. The latter property is often used to isolate and identify this particular group.
An investigation was then carried out and a direct comparison could be made between a normal cell line and the same cell line after infection with a viral agent that made the cell tumorigenic. This work was discussed in Proc. Nat. Acad. Sci., USA, Vol. 70, No. 1, pages 53-56, January 1973.
It was found that there was no qualitative difference between the saccharide products, but there was a quantitative difference due to the virus transformation, in particular with regard to the synthesis of one of the characteristic saccharides. This quantitative change is useful in studies in cell culture systems, but could never be used in animal studies because the specific product is normally found in most tissues of the body, is non-antigenic and can under no circumstances be considered to be characteristic of a tumor cell. Nevertheless, qualitative differences were of interest, but were of a general nature.
It could be concluded that the conversion of a cell line by virus transformation brought about at least a change in the synthesis of the complex saccharides.
As reported in Biochemistry (1974) Volume 13, p. 1233, a similar series of experiments were carried out in the inventors' laboratory with B16 melanoma cells from mice and a control population of normal melanocytes obtained from the iris of mice. The observed differences between the melanoma cells and the control cultivation were somewhat more pronounced than in the experiments with the normal and virus-transformed pairs described above. These differences can be briefly summarized as follows:
1. When comparing the tumor cells with the normal cells, there was both a qualitative and a quantitative difference in the production of complex saccharides.
2. In particular, an essential product of normal cells, hyaluronic acid, was not produced at all by the tumorous line.
3. A sulfated polysaccharide with an unusually high molecular weight was produced from the tumor line, which did not occur in normal cells.
With regard to the sulfated polysaccharide, it is important to point out that this compound differs from the normal components of the tissue only in its molecular size and not in its molecular architecture. This means that the structure of the saccharide was identical to the structures normally found in tissues, only their molecular weight was slightly higher.
It is again pointed out that these experiments are suitable for studies under cell culture conditions; however, they are largely unusable as a diagnostic method, since the compound in question is rapidly metabolized by a large number of cells in the host animals.
As soon as such a connection appeared in the circulation, it would quickly be filtered out and broken down by liver cells, kidney cells, fibroblasts, etc. For this reason, the presence or production of this saccharide by the tumor cells has no application, both for the reasons mentioned above and due to the fact that the compound itself is not antigenic.
A publication in Cancer Research, 36, 424431, February 1976 (E.A. Davidson) reported the results of an examination of the complex saccharide of human cells, which in many respects are similar to the results obtained in mice. Human melanoma cells produce less hyaluronic acid than control melanocytes and a high molecular weight sulfated polysaccharide, similar to what is produced in mouse cells.
Further studies with mice revealed the presence of an unusual glycoprotein. For this reason, efforts were made to get to know the type of glycoprotein in mice to the extent that its properties, structural chemistry and biological function could be determined. Many of the chemical properties of the molecule are described in the publication by E.A.
Davidson in Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 70, No. 1, May 1976. The presence of an unusual glycoprotein in
human melanoma cells or their production by them is not addressed in this publication,
The invention is characterized by the features in the independent claims.
The glycoprotein is not produced by normal cells. The glycoprotein, which is produced by malignant tumor cells while it is not produced by healthy or normal cells, i.e. a tumor-specific glycoprotein (hereinafter sometimes referred to as TSGP), is present in the tumor, is produced by the tumor cells, secreted and appears in the circulation of the host, in animals and in humans, at about the time when a palpable tumor mass can be detected. The TSGP can also occur at any earlier stage.
The TSGP is formed by the tumor cells, regardless of which tumor it is, and appears in the circulatory system of people suffering from lung, breast, colon, uterine and gastric carcinoma, melanoma and the like. Leukaemias and other blood disorders are a defect in maturity control, which causes an abnormal number of cells to be found, as is normally found in the metabolic stages of formation.
For this reason, TSGP is not produced in many or most of these blood disorders because the cells themselves are not tumorigenic. It is also possible to detect leukemia by microscopic examination of a blood sample, so that leukemia is not a problem from a diagnostic point of view.
The specific glycoprotein produced by a host animal with a malignant tumor disease may vary depending on the character and type of the tumor, as well as the host concerned, but regardless of what type of tumor it is, it becomes a product of the type and class of Tumor glycoproteins (TSGP) isolated.
It is noted that the growth characteristics and other characteristics of tumors with different cellular origins (and different people) will not be the same. However, it appears that the type of glycoprotein described here is characteristically produced by a large number of tumors. The chemical and physical properties of TSGP of any tumor type are sufficiently similar to allow the use of standard isolation methods throughout.
The characteristics, chemical structure and biological function described below are characteristic of TSGP and serve to distinguish it from the glycoproteins normally found in serum.
a) Solubility in perchloric acid (0.6 M) at 0 "C or in trichloroacetic acid (5%) at 0" C.
b) Sialic acid or N-acetylneuraminic acid content (hereinafter sometimes referred to as NANA) with 30% by weight, based on the total weight of glucosamine, galactosamine and sialic acid (or called sialic acid).
c) Affinity for diethylaminoethyl Sephadex A-25 (Pharmacia Co., Uppsala, Sweden) and elution with pyridine acetate buffer, pH 5.2, at a concentration of approximately 0.4M.
d) Inclusion on Sephadex G-150 (Pharmacia Co., Uppsala, Sweden) in 0.1 M pyridine acetate, pH 5.2. Elution at 1.5 x the exclusion volume, calibrated with dextran blue.
e) affinity for a conjugated wheat germ agglutinin immobilized on a Sepharose carrier, such as. B. a wheat germ Sepharose column in 0.05 M sodium or potassium chloride. Other artificial carriers for the wheat germ lectin can be used. Elution from the column is carried out specifically with N-acetylglucosamine (0.1 M in water is optimal). Other lectins that have an affinity for TSGP, but are not so specific, include limulus polyphemus (cancer) lectin and after removal of sialic acid residues, Ricinus-Communis-II lectin.
f) This affinity for the wheat germ agglutinin is lost from one of the various sources when treated with sialidase (purified by affinity chromatography to free it from protease). An important criterion in this analysis is that it is not necessary to completely remove the sialic acid from the TSGP in order to destroy the affinity for wheat germ agglutinin.
g) The sialic acid in TSGP is bound to galactose and can also be bound to N-acetylgalactosamine.
h) Electrophoresis of TSGP in 6% polyacrylamide gel in the presence of sodium dodecyl sulfate (0.1%) and staining of the gel for protein and carbohydrate shows that TSGP has a molecular weight of about 50,000 to 70,000, probably about 60,000. This number is not to be specified exactly, since glycoproteins generally give abnormal molecular weights using this method. However, the glycoprotein enters and migrates in the above cross-linked gel.
After exposure to pronase, the molecular weight is reduced to approximately 10,000 to 15,000. This represents a protease-resistant core and allows the assumption that the sialic acid residues and the saccharide substituents are arranged on the polypeptide core or aggregate around it.
i) TSGP is clearly separated from any contaminating serum components (such as a-l-acidic glycoprotein) by isoelectric focusing in gels or in solution. TSGP has an isoelectric point of around 4.2 to 4.6 and can show several closely related bands due to slight differences in the sialic acid content.
j) TSGP also contains neutral hexose, mainly galactose; there is no glucose present. Detection is possible by analysis for neutral sugars (eg using the method of Dubois et al., Anal. Chem. 28, 350 [19661).
k) TSGP can be detected as a product of human tumor cells in vitro in monolayer culture.
1) The majority of the carbohydrate of TSGP, which contains the majority of sialic acid, is linked to the polypeptide component via an O-glycosidic bond, from a single N-acetylgalactosaminyl residue to the hydroxyl group of serine or threonine (partial sequence can be considered : Galactosyl-N-acetylgalactosamine, substituted in the 3- and 6-positions with sialic acid residues).
m) The entire saccharide chain can be cleaved from the polypeptide by treatment with 0.01 N sodium hydroxide, 16 hours at 20 ° C. The resulting saccharide chain can be removed on a G25 Sephadex column (1,2> <x 60 cm) and is eluted at 1.15 x the exclusion volume (calibrated with dextran blue).
b) The amino acid composition of the TSGP fraction after chromatography on DEAE-Sephadex A-25 gives glutamic acid, proline, aspartic acid, threonine and leucine as the main amino acids.
In summary, it can be said that the distinguishing features of tumor-specific glycoproteins that can be isolated from the blood sera of cancer-infected people are as follows: solubility in 0.6 M perchloric acid, a pronase-resistant core that contains the main mass of carbohydrate, affinity for wheat germ Agglutinin, depending on the sialic acid, special electrophoretic and chromatographic mobility, a molecular weight in the range from about 50,000 to 70,000 and an isoelectric point from about 4.2 to 4.6.
Particularly characteristic properties of the tumor-specific glycoprotein, which are suitable for diagnostic purposes in order to distinguish the latter from other glycoproteins in the sera of normal patients, are that TSGP has an isoelectric point of about 4.2 to 4.6 and the perchloric acid-soluble fraction has a sialic acid content above about 0.065 mg / ml of the original serum sample.
A number of the products used are commercially available. Sephadex products are manufactured by Pharmacia Fine Chemicals A. B. , Uppsala, Sweden, manufactured and distributed. They are cross-linked dextrans with different porosity or substituents. Sepharose is an agarose gel formed in spherical particles. DEAE Sephadex A25 or A50 is made from Sephadex G25 or G50 by chemical substitution of diethylaminoethyl groups. The latter are weakly basic anion exchangers. They have a ball diameter of 40 to 120 microns and swell to a column volume of 89 (15-35) ml per gram of dry gel. Sephadex G150 has a ball diameter of 40 to 120 microns, a fractionation range of 5 to 150,000 molecular weight and a column volume (bed volume) of 20 to 30 ml per gram of dry gel.
Sepharose 4B has an agarose concentration of 4% and a wet ball diameter of 40 to 190 microns.
It is noted that TSGP of carcinoembryonic antigen as described in U.S. Patent 3,663,684, et al. a. A distinction can be made between inclusion of TSGP on Sephadex G150 [as described above under d)], the affinity of TSGP for a conjugated wheat germ agglutinin immobilized on a Sepharose carrier [as described above under e)] and the molecular weight [ as described above under h)]. Carcinoembryonic antigen has none of these properties.
I. Early diagnosis of people with any type of malignancy:
It has been found that the presence of TSGP in human sera can be a direct indication of the presence of a malignant tumor (not including blood disorders) of the patient examined. A simple but accurate method has been developed to detect the presence or absence of TSGP in human sera. In this way, a generally applicable diagnostic detection method emerged, which is neither aggressive nor destructive, and which is part of a routine medical examination of patients in the high-risk age group, i.e. H. Women over 40, men in certain professions, etc. , can be applied.
Starting from a single blood sample, the method can be used as part of a routine test for people of all ages.
The original analytical evidence for TSGP is based on the following properties:
1. The glycoprotein has a very high negative charge.
2nd The negative charge is mainly, if not exclusively, due to the presence of N-acetylneuraminic acid.
3rd The N-acetylneuraminic acid was placed on the saccharide chains, which tend to aggregate and form a core structure that is resistant to proteolysis.
4th The strongly acidic structure was soluble in a suitable concentration of perchloric acid or trichloroacetic acid or another suitable solvent.
5. The glycoprotein has an affinity for wheat germ agglutinin, which is immobilized on Sepharose.
6. Because of its high negative charge, the glycoprotein can be fractionated on a variety of anionic exchangers, including diethylaminoethyl cellulose, diethylaminoethyl sephadex, ecteola cellulose, and strong and weak anion exchange resins such as Dowex 1 or Dowex 2.
7. The high carbohydrate content of the glycoprotein and its charge allow identification by polyacrylamide or other gel electrophoresis methods and staining either by conventional protein dyes or by dyes for the carbohydrate component using periodic acid Schiff reagent or other reagents.
Briefly summarized, the diagnostic detection method is based on the generalized and general structural features of the glycoprotein, i.e. H. the pronase-resistant core, the affinity for wheat agglutinin and the characteristic electrophoretic and chromatographic mobility.
The generally applicable method for determining the presence of TSGP in human blood serum involves obtaining a serum sample from a human patient, treating the serum sample with a TSGP solvent such as perchloric acid, trichloroacetic acid or another suitable solvent; Removal of the precipitate formed by a suitable method for solid-liquid separation such as decanting, filtration or centrifugation; Neutralizing the soluble fraction with an alkaline material such as potassium hydroxide; Analyze the soluble fraction for the content of N-acetylneuraminic acid and protein and compare the found values for N-acetylneuraminic acid and protein with baseline parameters, established for normal and cancer sera.
The analysis for NANA can be carried out by one of the usual known methods, including the periodate resorcinol-, thiobarbituric acid or the direct Ehrlich method (G. W. Jourdian et al. , J. Biol. Chem. , 246, 431 (1971); L. Warren, J. Biol. Chem. , 234, 1971 (1959) and I.
Werner et al. , Acta Med. Soc. , Uppsala, 57, 230 (1952).
The protein determinations can e.g. B. by a modified Coomasie blue G method or by the Lowry method or by determining the absorption at 280 nm [OH. Lowry et al. , J. Biol. Chem. , 193, 265 (1951) and M. M. Bradford, Anal. Biochem. , 72, 248 (1976)].
Based on the compiled data from 370 human serum samples, the following parameters were determined to determine the presence of malignant tumors in humans (based on the analysis of the perchloric acid-soluble fraction based on the volume of the original serum sample):
1) A sialic acid content (NANA) above about 0.065 mg / ml indicates the possibility of a tumor; a sialic acid level above about 0.080 mg / ml indicates a likely tumor.
2) A protein content of more than about 0.35 mg / ml indicates a possible tumor, a protein content of more than about 0.4 mg / ml indicates the likely presence of a tumor.
A baseline study of 59 samples was performed using the periodate resorcinol method and the direct Ehrlich method for N-acetylneuraminic acid levels and the Lowry method for protein levels. It was found that between 30 cancer patients and 29 normal controls there was a complete distinction in the sialic acid content. That is, the highest normal level was still lower than the lowest level found in a patient diagnosed with malignancy. This baseline study included a number of diseases of various types, lung, breast, colon, lymphoma and melanoma patients, assuming that the production of a perchloric acid-soluble glycoprotein is a common property of a number of tumors.
Statistical analysis of these values showed that the random probability of these results is less than 1 in 1000.
By evaluating the levels obtained in the previously described study as parametric criteria, a much larger study was carried out with approximately 311 patients who suffered from malignant diseases and a number of non-malignant complaints as well as a number of normal control persons. Only based on the levels of protein and sialic acid (N-acetyl-neuraminic acid) was a 95% distinction between normal people and non-malignant people on the one hand and patients with tumor on the other hand obtained. In addition, there was no significant difference between normal and non-malignant people or between men and women. A number of other statistical tests have been carried out, the data coming from this group.
It should only be mentioned here that the chance of differentiation between the cancer group and the other group is less than 1 in 1000. There is also a clear correlation with the progress of the disease. For example, people with spread, widespread metastatic disease have higher levels of circulating TSGP than those with localized disease; People who are in remission or Individuals after surgical and / or chemotherapy or radiation treatment tend to have lower levels of circulating glycoprotein.
These results led to a number of further studies. First, attention was drawn to the few false positives that emerged in this group. It has been shown that several of them originated from asthmatic patients and can indeed be related to a factor associated with this disease.
Accordingly, a further investigation was carried out with the false positives, with normal samples and different patients with diagnosed cancer to determine whether the qualitative differences found in the cell culture system could also be repeated in the serum sample. Instead of simply considering the levels of N-acetyl-neuraminic acid in the perchloric acid-soluble fraction, the perchloric acid-soluble material was subjected to gel electrophoresis (as described in particular in Example 2 below) to detect the characteristic tumor glycoprotein (TSGP) . The tumor specific glycoprotein has an isoelectric point of about 4.2 to 4.6 and a molecular weight of about 50,000 to 70,000, generally about 60,000.
After performing this second test, the number of false positives decreased to zero; only patients with a diagnosed tumor showed a characteristic glycoprotein band on gel electrophoresis. Although a few of the people with diseases (especially leukaemias) had N-acetylneuraminic acid levels that were not in the abnormal group, there were no normal or non-malignant norms in the positive group after the second examination.
In addition, the presence of the characteristic glycoprotein could be shown in those with malignant disease who had lower levels of N-acetylneuraminic acid.
In summary, the developed detection method shows the following:
1. There is an unusually high degree of probability in predicting the presence of a tumor and the stage of the disease, based only on the measurement of the N-acetyl-neuraminic acid and protein levels in the perchloric acid-soluble fraction of the serum.
2nd The very small number of false positives can be completely eliminated by a second examination, which involves gel electrophoresis and examination of the gels for the presence of the characteristic tumor-specific glycoprotein.
3rd The predictive value of this method is at least as good or better than any of the methods currently or previously described, including the carcinoembryonic antigen, as described in U.S. Patent 3,683,684.
4th Although TSGP does not cover all tumors, or in fact, e.g. B. may be identical for all lung carcinomas, but it has sufficient identity based on structural characteristics to allow a generalized diagnostic method of detection. It is important to note that two different people with the same anatomical diagnosis can nevertheless have tumors with different characteristics in terms of metastasis rate, growth rate and characteristic products. There is a possibility that each tumor represents a different biological entity and a different disease, and that no two are identical if one takes into account characteristic cell products.
For this reason, there is an urgent need for a generalized method of identification and a generally applicable therapeutic strategy before reasonable progress in early detection or therapeutic treatment with a wide range of applications can be expected.
The fact that a tumor-specific glycoprotein is present in human sera, which is a product of tumor growth, is a common diagnostic tool.
Example 1: Purification and isolation of the tumor-specific glycoprotein
Serum samples from patients diagnosed with solid tumors (lung, gastric and breast carcinoma and melanoma were used, each showing similar chromatographic and electrophoretic mobility) were treated as follows:
70 microliters of a 60% perchloric acid gene were added per ml of serum and the solution was mixed. 0.93 ml of 0.6 M perchloric acid per ml of serum are added to this solution.
This solution is mixed well and one hour (45 to 90 min. are sufficient) left at 0 C. The mixture is then at 8000 g for 10 min. long (6 to 12 min. ) centrifuged and the supernatant liquid separated from the precipitate by decanting.
The supernatant solution obtained is adjusted to pH 6 to 7 with 1.2 M potassium hydroxide and 10 min. left at 0 "C. The potassium perchlorate is separated as above by centrifugation (filtration is sufficient) and the supernatant liquid is dialyzed against 10-3 M pyridine acetate, pH 5.2 for 24 hours (16 to 36 hours are sufficient).
A DEAE Sephadex A 25 column (1.5 x 40 cm) is prepared according to the manufacturer's instructions and equilibrated with 0.1 M pyridine acetate, pH 5.2.
The sample of the dialyzed perchloric acid supernatant is (preferably) concentrated to about ten times by lyophilization or ultrafiltration. An aliquot with up to 5 mg of sialic acid and up to 30 mg of protein is applied to the column and this is then applied with a linear gradient of 0.01 M to 1.0 M pyridine acetate, pH 5.2 (the total gradient volume is 600 ml) , eluted.
Fractions are collected at a flow rate of 30 ml per hour (5 to 6 ml fractions).
These fractions are then analyzed for their protein and sialic acid content according to Lowry et al. and analyzed using the periodate-resorzinol method. The sialic acid-positive fractions, which contain the majority of this acid and are eluted at a gradient concentration of approximately 0.4 M, are combined, dialyzed against distilled water at 0 ° C. for 24 hours and concentrated by lyophilization. This fraction contains the tumor specific glycoprotein upd may contain some a-1 acid glycoprotein, a normal serum component.
Further purification of the tumor-specific glycoprotein can be achieved by isoelectric focusing or chromatography using DEAE-Sephadex A-50.
The fraction obtained after the chromatography described above, which contains the sialic acid, is applied to a 1.2 x 50 cm acid from DEAE-Sephadex A-50 and the column with a linear pyridine acetate gradient (0.01 to 0, 5 M, pH 5.2, 400 ml). Two sialic acid-positive fractions are obtained, which are eluted at the gradient concentrations 0.42 and 0.46 M, respectively. The second fraction contains the tumor glycoprotein and is essentially free of other contaminants. This fraction is desalted by dialysis against distilled water at 0 ° C. for 24 hours and concentrated by lyophilization.
Alternatively, the fraction with the tumor-specific glycoprotein, as obtained from the DEAE-Sephadex A-25 column, is gel isoelectric focused in a pH 3.5 to 7.0 ampholine gradient using an LKB -Multiphor device from LKB Instruments, Inc. , subjected. Contaminating acidic glycoproteins have isoelectric points from 3.5 to 3.8 and are clearly separated from the tumor-specific glycoprotein, which has an isoelectric point at 4.4 (4.2 to 4.6). Preparative work can be carried out according to the same principle, using a 110 ml ampholine column (LKB) and the pH gradient described above. The range between pH 4.2 and 4.6 is collected, dialyzed against distilled water and concentrated by lyophilization.
The product can be dissolved in 0.01 M sodium or potassium chloride containing 0.005 M phosphate buffer, pH 6.5.
Final purification and contamination testing can be accomplished by affinity chromatography of the glycoprotein on a wheat germ agglutinin-Sepharose column.
The glycoprotein solution (in sodium chloride / phosphate, 0.01 M / 0.005 M, pH 6.5) is placed on a 1 x 10 cm column of Sepharose 4 B conjugated with wheat germ agglutinin and with the same solution was equilibrated.
The column is washed with 3 to 5 volumes of the equilibrating buffer (none of the tumor glycoprotein should be eluted from the column). The tumor glycoprotein can be eluted with a sharp symmetrical peak with 0.01 M N-acetylglucosamine. The sugar is removed by dialysis against distilled water and the glycoprotein is concentrated by lyophilization.
Example 2: Polyacrylamide gel electrophoresis
Solution A is prepared by mixing 0.24 g of acrylamide (available from Eastman Organic DPI and recrystallized twice in acetone) with 0.73 g of N, N'-methylenebisacrylamide and 100 ml of water. Solution B is prepared by dissolving 150 mg of potassium or ammonium persulfate in 100 ml of water. Solution C contains 7.7 g NaH2PO4-H20, 38.6 g Na2HPO4-7H20, 4 g sodium dodecyl sulfate and 1.15 ml N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine (Eastman DPI) per liter. The gel is prepared by mixing part of solution A with two parts of solution B and part of solution C. The mixture is immediately placed in a 5 x 75 mm gel tube with a height of 55 mm.
The gel is overlaid 10 mm with H20 and the tube prepared in this way is left to stand at 25 ° C. for one hour. The tube is then placed in a reservoir. A sample, 10 to 25 µl, containing 5 to 20 µg glycoprotein is overlaid on the top of the gel surface and electrophoresed at 70 V for two hours. The gel is removed and 3% with 10% of the trichloroacetic acid. fixed and then stained with 0.3% Coomassie Brillantblau R in 10% acetic acid / 45% methanol / 45% H20 at 40 "C for two hours.
The material is then decolorized with 7% acetic acid / 30% methanol / 63% water five times for two hours at 40 "C (or correspondingly longer at 25" C). The staining method for glycoprotein corresponds to that of Zacharius et al. , Anal. Biochem. , 30, 148 (1969).
Example 3: Radioimmuno-determination for the detection of the tumor-specific glycoprotein
Using sufficient amounts of material obtained from human patients with a broad disease range and high glycoprotein levels, the tumor-specific glycoprotein can be purified by combining a number of methods, including affinity chromatography, ion exchange chromatography, isoelectric focusing and others, and an antibody to this glycoprotein will be developed are made using a number of immunological methods. Initially rabbits, guinea pigs or hamsters are used as host animals for the development of a first stage antibody. Although suitable, it may be desirable or preferable to modify the tumor specific glycoprotein by modifying the sialic acid, e.g.
B. by reaction with amines or hydrazides after periodate treatment or by partial removal or hydrolysis of sialic acid [using sialidase from a number of sources (vibrio cholera, hemophilus influenzae, clostridium species, diploccocus pneumoniae and the like. a. )] to modify to also expose carbohydrate groups that may be more immunologically reactive.
After the antibody to the tumor-specific glycoprotein is obtained in a suitable host animal, antibodies are made to it by injecting the host's globulin fraction into a goat. In this way, e.g. B. Goat anti-rabbit antibody obtained which is radioactively labeled with radio iodine or by other suitable methods. Alternatively, TSGP can be radioactive with 125I or 3H according to R. O. Hynes, Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 70, 3170 (1973) or Liao et al. , J. Biol. Chem. 248, 8247 (1973). In this way, radioimmunological detection is obtained for the determination of smaller amounts of glycoprotein with the help of highly specific immunological methods.
In this way, a sensitivity level is obtained which is 100 to 10,000 times lower than the sensitivity achieved with the purely chemical processes.
Since it can be assumed that the tumor glycoprotein is produced by very few tumor cells when they are grown in a culture, it is reasonable to assume that very small tumor foci produce this glycoprotein, which then appears in the circulation of the individual and secrete. A highly sensitive detection method, such as. B. the radioimmuno determination, makes it possible to indicate the presence of this component even before any manifested symptoms such as pain, discomfort, tissue nodules, etc. appear A positive test using this method would indicate to the examining physician the need for further and more careful diagnostic examinations of the patient to ensure the type, type and location of the tumor. This allows early treatment before tumor growth and metastases occur.
There is no doubt that early diagnosis and treatment of cancer is still the most effective way to fight the high mortality rate associated with this disease.
Example 4:
Antibody production
The purified tumor-specific glycoprotein, e.g. B.
according to Example 1 (0.5 mg in 1 ml 0.15 M Nah1) is mixed with a suitable agent (Freund's adjuvant) and injected into a suitable animal. The injection can take place: subcutaneously, intramuscularly (larger volume, 3 to 4 times) into the sole of the foot or by an appropriate combination. This way rabbits, guinea pigs, horses and goats can be treated. In rabbits, the injection would be repeated at weekly intervals over a 6 week period, after which blood was drawn from the rabbit and serum was made. This serum is a non-absorbed TSGP (tumor-specific glycoprotein) serum. This can then be absorbed using a normal serum and a precipitate that forms can be separated off. The supernatant will contain the antibody specific for TSGP.
Example 5: Modification of functional groups at the TSGP
A selective structural modification of the tumor-specific glycoprotein is carried out in order to increase its immunological properties and to create a mechanism for the binding of specific functional groups. The TSGP sample is prepared at a concentration of 1 mg / ml in 0.1 M acetate buffer, pH 5.0 (sodium or potassium). This solution is mixed with an equivalent volume of a solution containing 2 to 4 IlMol sodium metaperiodate in the same buffer.
The mixture is left for 30 min. long at 0 "C and destroys the remaining periodate by adding 5 FuMol sodium arsenite. The modified TSGP can now be treated with one of the various amines or hydrazides as described by K. Itaya et al. , Biochem. Biophys. , Res. Comm. 64, 1028 (1975). This procedure specifically changes the sialic acid groups on the molecule and allows them to be converted into an immunologically more responsive group.
The derivatized TSGP can then be used for antibody production as described above.
Example 6: I. Hydrolysis of sialic acid groups at the TSGP
Commercially available sialidase from Vibrio cholerae or Clostridium perfingens is analyzed using affinity chromatography (see P. Cuatrecasas, Biochem. Biophys. Res. Comm. , 38, 947 [1970]). The TSGP is prepared at a concentration of 1 to 2 mg / ml in pH 5.0 acetate buffer (potassium) containing 2 mM calcium acetate. This solution is mixed with a solution containing 50 milliunits of purified sialidase in the same buffer. The mixture is incubated for 18 hours (12 to 24 hours) at 37 ° C. The modified TSGP is released from the released sialic acid by chromatography on a cross-linked dextrangelic acid (1 x 60 cm) in pH 5.0 acetate buffer (e.g. B.
Sephadex G-50, which has a molecular weight cutoff of about 50,000 and a particle size of 30 to 100 microns). The modified TSGP appears in the exclusion volume (first protein peak). After dialysis against distilled water (24 hours) and concentration by lyophilization, the material can be used directly for antibody production as described above.
II. Radioimmuno determination:
Different types of radioimmunoassay methods can be used to detect TSGP in serum. Typical examples are the methods of direct competition, prebinding and double-antibody binding and are described below.
The direct competition method uses TSGP, radioactively labeled TSGP (3H or '251 material) and TSGP antibodies (e.g. B. of rabbits). A standard titration curve is established by adding a series of known TSGP concentrations to a number of test tubes containing aliquot of the perchloric acid supernatant from normal serum, which is equivalent to the serum volume to be analyzed (typically
1 to 5 ml). This mixture is prepared in 0.1 M sodium potassium phosphate buffer, pH 7.2. An aliquot of a TSGP antiserum is then added to each test tube, in sufficient quantity to react with the entire TSGP present in the test tube with the highest concentration.
This mixture is left at 4 "C for 16 hours, after which a certain amount (5 x 10 x 2 x 104 counts per minute) of radiolabeled
TSGP is added. After incubation for two hours
37 "C become the antibody and the antigen antibody
Complex by adding a suitable agent, such as saturated ammonium sulfate or goat anti-rabbit anti-serum (see. below), precipitated. Free TSGP remains in solution, and that
The amount of radiolabeled TSGP in the soluble fraction can be determined by determining the radioactive counts in a
Liquid scintillation spectrometer (3H) or a gamma
Scintillation counter (1251) can be determined.
With the help of this
A standard titration curve can be established from which the TSGP concentration of an unknown serum sample subjected to the same procedure can be derived.
The radioimmunological method of prebinding assumes that the TSGP antibody is insoluble
Matrix carriers, such as Sepharose 4B, are coupled to form a reusable bound particle antibody (AB-Sepharose). This preparation is then incubated with known amounts of TSGP and radiolabeled TSGP as described above and a standard titration curve is established. The TSGP-antibody-Sepharose complex can be recovered by filtration and washing with 0.15 M NaCL to remove mechanically entrapped material. Elution of the bound TSGP can be achieved (with 10-3M KOH or a suitable buffer) without destroying the AB-Sepharose (which can be reused).
The radioactivity of the eluted
TSGP fraction is determined and based on this data a standard titration curve is drawn up as above. To
Carrying out the radioimmunological determination, the test sample to be examined for TSGP is then incubated with the labeled antigen and the antibody and the radioactivity of the eluted fraction is determined as described above.
Instead of Sepharose as a carrier, the antibody can be used on plastic surfaces, such as disks or test tubes, in the von Catt, Science, 158 (1967), S. 1570 or US Pat. No. 3,646,346 can be bound using the methods described in the cited documents.
The double antibody method requires that an antibody to the TSGP antibody (e.g. B. Ziegenanti rabbit) is produced. This serves to precipitate the TSGP-TSGP-antibody complex using levels of TSGP-antibody that are far below those described above. The standard curves are prepared in a similar manner (direct competition), except that one-tenth to one-hundredth of the amounts of TSGP antibody are used. The precipitation of the TSGP-antibody complex is carried out by adding a second (goat) antibody and incubating for two hours at 4 "C. The precipitate is separated off by centrifugation, washed with brine and its radioactivity determined.
Instead of radiolabeling TSGP, the TSGP antibody can be labeled and the amount of TSGP present in a test sample can be determined by incubation and determination of the radioactivity of the bound and unbound fractions. The labeled antibody can be applied to a solid surface or to suitable carrier particles and serves as a reagent which is brought into contact with test samples containing TSGP.
The methods described above are used to detect very small amounts of TSGP with high specificity by radioimmunological determination. Accordingly, early identification of the presence of malignant foci can be made possible, which is based on routine radio-immunological analysis of serum samples. The appearance of TSGP should serve as a signal for the possibility of a tumor developing and the need for further diagnostic tests.