DE2102245A1 - Verfahren zur Herstellung von Antisera - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von AntiseraInfo
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Description
DR.-ING. VON KREiSLER DR.-1 NG. SCHÖNWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL-CHEM. ALEK VON KREISLER
DIPL.-CHHM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH
KÖLN 1, DEICHMANNHAUS
Köln, den 16.1.1971 Kl/Ax/Hz
Agence Nationale de Valorisation de la Recherohe (ANVAR"),
Tour Aurore, Paris - Defense 92 Courbevoie (Frankreich).
Verfahren zur Herstellung von Antisera
Die Erfindung betrifft die Herstellung von xenogenen Antisera,
die es ermöglichen, einen 'bestimmten Spender zu erkennen.
Antikörper, die bei Individuen einer Art durch Immunisierung mit Hilfe von Zellen auftreten, die von einem anderen
Individium der gleichen Art stammen, können bekanntlich dazu dienen, die Antigenspezifitäten zu erkennen, die den ™
einzigartigen Charakter eines Individiums definieren. Auf diesem Gebiet wurden zahlreiche Arbeiten durchgeführt, die
sich.mit der Herstellung von Antisera für die Bestimmung der Gewebegruppen beim Menschen befassen, z.B. für die
Transplantation von Organen, und diese Antisera werden zur Zeit von Kranken, an denen mehrere Transfusionen durchgeführt
worden sind, von mohrgebärenden Frauen und in jüngster Zeit durch vorsätzlichelmmunisierung von freiwilligen
•Personen mit menschlichen Zellen eines ausgewählten Typs .erhalten. Die erhaltenen Sera sind schwach, und
die erforderlichen Spezifitäten sind schwierig zu entdecken.
Die Immunisierung von freiv/illigen Personen mit Hilfe von Zellen ist ein Verfahren, das nicht frei von Gefahren ist. ''
109833/1956 -
Die Arbeiten, die sich mit der Herstellung von xenogenen Antisera bei verschiedenen Arten befassen, z.B. des Antimaus-Serums
des Kaninchens und des Antihumanserums der Ratte (xenogene Antisera), ermöglichten es nicht, die Individuen
der Spenderart zu erkennen, da die zur Immunisierung dienenden Zellen überwiegend durch die Artcharakteristiken
gekennzeichnet sind.
Allgemein hat das bekannte Verfahren der heterologen Immunisierung
mit ganzen Zellen zur Erzeugung von spezifischen Antikörpern nicht zu befriedigenden Ergebnissen geführt. Die
auf diese Weise gebildeten Antikörper erkennen zwar die Artantigene, aber sie können nicht die individuellen Spezifitäten
innerhalb der Art erkennen. Es war somit nur durch Isoimmunisierung möglich, Sera für die Identifizierung der
Gewebegruppe beim Menschen oder bei der Maus herzustellen. Dies hat die bekannten Nachteile bezüglich der Immunisierung
des Menschen: Schwierigkeit der Wahl von Freiwilligen, Gefahr der Immunisierung durch Leukozyten beim Menschen,
Zufallsergebnisse usw.
Es wurde nun gefunden, daß es unter Verwendung eines gereinigten Produkts von Zellen, die von einem Spendertier
stammen, möglich ist, ein Tier einer anderen Art zu immunisieren und Antisera herzustellen, die es ermöglichen, den
besonderen Spender zu erkennen. Insbesondere wurde gefunden, daß genügend gereinigte, aus Zellmembranen verschiedener
Gewebe erhaltene Antigene von Säugetieren verwendet werden können, um andere Arten zwecks Herstellung von Antisera, die
den Zelltyp oder das als Spender dienende Individuum erkennen, zu immunisieren.
Gegenstand der Erfindung ist ferner die Herstellung von heterospezifischen Sera, mit denen die individuellen
menschlichen Spezifitäten erkannt werden können, unter Verwendung von gereinigten und löslich gemachten menschlichen
Antigenen mit Gewebe kompatibilität. Ein besonderer Vorteil der Erfindung liegt in der Herstellung von Antisera,
die bei einem nicht-menschlichen Säugetier durch Immuni-
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sierung des Empfängertieres mit einem genügend gereinigten
menschlichen Antigen gebildet werden. Mit solchen Antisera ist es möglich, die Zellen des jeweiligen menschlichen
Spenders zu identifizieren.
Gegenstand der Erfindung ist somit die Herstellung von Antisera nach einem Verfahren, bei dem man ein Empfängersäugetier
mit einem aus einem Säugetier stammenden gereinigten Transplantations-Alloantigen oder einem spezifischen
Tumorantigen, das von einem Spender einer anderen Säugetierart stammt, immunisiert und aus dem Empfänger das gebildete
Antiserum gewinnt.
Die hier erwähnten gereinigten Antigensubstanzen sind Substanzen,
die löslich gemacht worden sind (unter Hinterlassung eines unlöslichen Rückstandes mit einem großen Volumen
von Verunreinigungen) und anschließend durch Gelfiltrationssäulen (Sephadex G200) geleitet worden sind, um die Fraktion mit höherem Molekulargewicht zu entfernen, wobei ein
lösliches Produkt erhalten wird, das ein Molekulargewicht im Bereich von 30.000 bis 70,000 hat. Diese hochmolekulare
Fraktion ist immunogen für verschiedene Alloantigene, die als Verunreinigungen angesehen werden können, deren Anwesenheit
die Substanz für das Verfahren gemäß der Erfindung wertlos machen würde·.
Die beim Verfahren gemäß der Erfindung verwendete gereinigte antigene Substanz kann nach einer beliebigen Variante
der bekannten grundlegenden Reinigungsverfahren hergestellt werden, nämlich durch Herstellung eines rohen Membranextrakts,
Löslichmachung des Extrakts, Reinigung des Extrakts
und Abtrennung der Spezifitäten. Herstellungsverfahren dieser Art werden in der Literatur beschrieben, insbesondere
in den folgenden Veröffentlichungeni
1) D.A.L.Davies, Immunology, I1I, 115 (1966)
2) S.G.Nathanson und D.A.L.Davies, Froc.Nat.Acad.Sci.
Washington £6 W (1966)
3) D.A.L. Davies, A.J.Manstone, D.O.Viza, J.Colombani,
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J.Dausset, Transplantation,6, 571 (1968).
4. D.A.L.Davies, Transplantation, 5, 51 (1967)·
5. D.A.L.Davies, J.Colombani, D.C.Viza, J.Dausset,
Biochem, Biosphys. Res. Gommun. j£j5, 88 (1968).
6. D.A.L.Davies, Transplantation, 8, 51 (1969).
7. J.Colombani, N.Colombani, D.O.Viza, Degani-Bernard,
J.Dausset, D.A.L.Davies, Transplantation, 9, 228 (1970).
Ein System zur spezifischen Abtrennung von HL-A, seiner von anderen Tierarten stammenden Homologen oder von Antigenen,
die die speziellen Zelltypen definieren (einschließlich der Tumorzellen), kann kurz wie folgt beschrieben werden:
Milzlymphozyten, leukämische Zellen (von der Milz oder von
peripherem Blut) oder andere geeignete Zelltypen werden mit hypotonischer Kochsalzlösung eluiert (1), und das rohe
Lipoprotein wird aus diesem Waschwasser der Zellen zentrifugiert. Dieses Produkt wird durch Autolyse (unter Verwendung
von lysozymatisehen Kathepsinen, die in der rohen Ausgangssubstanz
vorhanden sind) (2) oder durch Verwendung anderer proteolytischer Enzyme (z.B. Picin, Bromelin oder
Papain) löslich gemacht (3 und 4). Die lösliche Substanz
wird durch Gelfiltration fraktioniert (4·), und die aus dieser Stufe stammende aktive Fraktion ist bereits genügend gereinigt,
um als immunogen für die Zwecke der Erfindung verwendet werden zu können. Eine Nachreinigung kann durch Chromatographie
an Ionenaustauschersäulen (5)» durch Elektrophorese und durch Elektrofokalisation vorgenommen werden. Die Chromatographie
an der Ionenaustauschersäule gewährleistet eine Trennung der Spezifitäten derart, daß ein Individuum beispielsweise
verschiedene HL-A-Antigene liefern kann (6 und 7)» die getrennt für die Immunisierung verwendet werden können.
Die vorstehende allgemeine Beschreibung und die aufgeführten Literaturstellen betreffen Verfahren zur Herstellung eines
gereinigten Antigens, das von Mäusegeweben stammt. Die verschiedenen
Arbeitsstufen gelten generell für die Herstellung einer ähnlichen Substanz aus menschlichem Gewebe (3, 5 und 7).
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Eine spezielle Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Reinigungsverfahrens wird wie folgt durchgeführt:
Die Milz von 100 Mäusen (oder das Äquivalent menschlicher Milzzelleii oder leukämischer Zellen, Feuchtgewicht 20 g)
wird zu einer Suspension von Zellen zerkleinert, indem das Gewebe durch ein Sieb gegeben wird. Die Zellen werden
etwa 30 Minuten in 200 ml 0,8%igem NaOl (40C) gründlich
gewaschen und 10 Minuten bei I5OO U/Minute zentrifugiert·
Die obenstehende Schicht wird aufbewahrt und das Sediment erneut in 200 ml zusätzlichem 0,8%igem NaOl suspendiert.
Diese Suspension wird 10 Minuten bei I500 Ü/Minute zentrifugiert.
Das Sediment wird entfernt und die obenstehende Schicht der zuerst erhaltenen Schicht zugesetzt. Diese
400 ml Waschwasser der Zellen werden 60 Minuten bei 30.000 U/Minute zentrifugiert. Die obenstehende Schicht wird verworfen.
Das Sediment wird erneut in Wasser in einer Menge von etwa bis 30 mg/ml (entsprechend I5 ml) suspendiert.
Diese Suspension kann bei 4-0C mit Tymol als Konservierungsmittel
aufbewahrt werden und wird als rohes Eluat bezeichnet.
Die Löslichmachung wird vorgenommen, indem ein "Tris"-Puffer
(Trinatriumphosphat) bis p„ 8 zugesetzt wird, wobei eine Endkonzentration von 0s05 Mol erhalten wird. Die Lösung
wird 2,5 Stunden bei 37°C bebrütet, 2 Stunden bei 5O.OOO U/
Minute zentrifugiert. Die obenstehende Schicht wird beiseite gestellt. Das Sediment wird erneut in 15 nil Trinatriumphosphatpuffer
von pH 8 bei 0,05 Mol suspendiert, worauf
Papain in einer Menge von etwa 1/150 (falls erforderlich
mehr) des Gewichts der löslich zu machenden Substanz zügesetzt wird (2,5 mg)· Diese Suspension wird 1 Stunde bei
37°C bebrütet. Die Reaktion wird abgebrochen, indem Natriumjodacetat
bis zu einer Endkonzentration von 0,05 Mol zugesetzt wird. Die Lösung wird anschließend 2 Stunden bei
5O.OOO U/Minute zentrifugiert. Das Sediment wird verworfen
und die obenstehende Schicht mit der oben genannten, bei hoher Geschwindigkeit zentrifugieren obenstehenden Schicht
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vereinigt. Diese vereinigten obenstehenden Schichten werden
in einen Rotationsverdampfer auf etwa 6 ml eingeengt und
anschließend auf eine Gelsäule ("Sephadex G2OO") (50x3 cm)
aufgegeben. 55 Fraktionen von je 10 ml werden aufgefangen.
Die Fraktionen werden unter Berücksichtigung des Verlaufs der optischen Dichte und der Ergebnisse zusammengegeben,
die bei der Prüfung der Antigenspezifität, d.h. bei der
Prüfung der Fraktionen auf ihre Fähigkeit, die Anwesenheit eines spezifischen Antigens durch Verwendung entsprechender
Antisera zu erkennen, erhalten werden. Unter den vorstehend genannten Bedingungen sind es im allgemeinen die Reagenzgläser
18 bis 30, die die Aktivität, d.h. die Antigene H-2 und HIi-A enthalten. Der Inhalt dieser Reagenzgläser wird
vereinigt, unter vermindertem Druck eingeengt, dialysiert und lyophilisiert. Die gesamte Behandlung wird in der Kälte
vorgenommen. Die Ausbeute bei einem solchen Herstellungsversuch beträgt etwa 5
Durch Analyse der Produkte konnten Glykoproteine idenzifiziert werden. Da jedoch auf Grund der sehr geringen Ausbeute
ein Homogenitätsbeweis fehlte, war es nicht möglich, eine Maßanalyse durchzuführen. Die Ermittlung des Molekulargewichts,
berechnet nach den Methoden der Sedimentationsgeschwindigkeit und Ultrazentrifugierung bei Gleichgewicht,
ergab eine Zahl von 54.000 (Summerell & Davis, Trans.Proc,
2» 479 (1969)» und Summerei & Davis, Biochem.Biophys.Acta.
207 92 (1970)) für drei untersuchte H-2-Spezifitäten der
Maus· Die Ergebnisse der Gelfiltration zeigen, daß das Molekulargewicht der menschlichen HL-A-Antigene sehr dicht
bei dieser Zahl liegt. Die Moleküle sind in dem zur Reinigung und Löslichmachung verwendeten Wasser löslich.
Diese Verfahrensweise wurde für HL-A-Transplantationsantigene
des Menschen, für die H-2-Transplantationsantigene der
Maus, für ihre Homologen des Hundes und des Schweins und für die spezifischen Antigene der Leukämie des Menschen und
der Maus angewandt..
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Modifikationen dieses grundlegenden Reinigungsverfahrens
können auf andere Antigene, die' an die Zellmembranen gebunden sind, angewandt werden. Nicht-HL-A-Alloantigene oder
Nicht-H-2-Alloantigene, die ebenfalls für die Herstellung
von xenogenen Antisera verwendet werden können, wurden nach verschiedenen Verfahren hergestellt·
Die Methode der Immunisierung des Empfängertieres ist in keinem Fall kritisch. Die gereinigte Substanz wird gewöhnlich
dem Empfängertier in Form einer Lösung oder einer Suspension in einem ungiftigen, physiologisch unbedenklichen
flüssigen Träger verabreicht. Es erwies sich als vorteil- ^ haft, eine Lösung oder eine Suspension der gereinigten
Substanz im Verhältnis von 1 mg gereinigte Substanz pro 3 ml Flüssigkeit herzustellen. In zahlreichen Fällen ist es
vorteilhaft, außerdem ein Adjuvans, z.B. ein Ad^uvans nach
Freund, zu verwenden. Die während der Immunisierung verabreichte Dosis ist nicht kritisch.
Die Gewinnung des Serums aus dem immunisierten Tier erfolgt nach üblichen Verfahren, d.h. durch Abtrennung des Bluts,
Koagulierung, Zentrifugierung und Gewinnung des Serums.
Das Produkt gemäß tfer Erfindung hat eine besondere Bedeutung
für die Identifizierung von Geweben für die Transplantation. d
Die Identifizierung von Gewebe ist eine Methode zur Bewertung der Unverträglichkeit (bei der Organtransplantation)
zwischen den möglichen Spendern und den Empfängern. Als Reagenzien werden menschliche Alloantisera verwendet, die
verschiedene Alloantigene von Leukozyten, im wesentlichen diejenigen der Reihe "HL-A",Merkennen"· Die HL-A-Antigene
sind die wichtigsten Faktoren, die bei der Abstoßung von Implantaten eine Rolle spielen. Ein gut ausgewähltes Spender-Empfänger-Paar
muß minimale Unterschiede in seiner HL-A-Zusammensetzung
haben. Wenn Unterschiede zwischen den beiden Individuen auftreten, d.h. wenn die Reaktion der Antisera
Unverträglichkeiten ergibt, wird den Individuen nicht der Vorzug für den Austausch von Organen gegeben.
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Das Produkt gemäß der Erfindung kann auch zur Identifizierung und Klassifizierung der leukämischen Antigene und
anderer Tumor-Antigene verwendet werden. Es eignet sich auch in der Therapie von Tumoren,
Es wird angenommen, daß die Erfindung auch die Charakterisierung der Spezifitäten von Tumorzellen ermöglicht. Zur
Zeit ist man der Ansicht, daß alle Tumorzellen ein Antigen aufweisen, das sie von ihren Wirtszellen differenziert,
und in dieser Hinsicht sind die Leukämiezellen am eingehendsten untersucht worden.
Bei einem großen Teil der durchgeführten Versuchsarbeiten wurde die gereinigte oder teilweise gereinigte HL-A-Substanz
verwendet.
Die Erfindung wird nachstehend durch Beispiele der Verwendung einer solchen Substanz für die Herstellung eines xenogenen
Antiserums veranschaulicht.
1) Anti-HL-A-Serum der Ratte
Ein lösliches Präparat wurde aus menschlicher Milz (HS 15) hergestellt. Das Gewebe wurde mit einem Metallsieb zerkleinert.
Die Zellen wurden in einer 0,8%igen NaCl-Lösung suspendiert
und in der oben beschriebenen Weise behandelt, wobei eine gereinigte Substanz erhalten wurde, die durch Inhibierung
der Zytotoxizität identifiziert wurde. Mit dieser Substanz wurden zwei Batten immunisiert (2 Injektionen von
2,5 mg Antigen in einem Abstand von 1 Woche in die Pfote mit
vollständigem Freund-Adjuvans). Das Serum, das 8 Tage nach
der zweiten Immunisierung entnommen wurde, wurde auf Zytotoxizität auf die Lymphozyten von 13 identifizierten Individuen
geprüft. j
Diese Methode schließt die Ermittlung des Prozentsatzes der Zerstörung von bestimmten lymphozytären Zellen einer bekannten
HL-A-Gruppe mit verschiedenen lymphozytotoxischen Antisera von Gewebe nach den Methoden ein, die in "Histocompatibility
Testing", 196? (Eds.Curtoni E.S. und Mitarbeiter (Munksgaard)
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beschrieben sind. Die Anpassung dieser Methode an eine Messung der Aktivität des Antigens nach Inhibitionsmethoden
wird in der oben genannten Literaturstelle (3) beschrieben.
Das Serum wurde in seiner ursprünglichen Form und auch nach Absorption verwendet. Die Absorption wurde vorgenom-
men, indem 1 ml Serum mit 10 Lymphozyten von peripherem
Blut von identifizierten Spendern eine Stunde bei 37°C bebrütet wurde. Das Serum wurde durch Zentrifugieren
bei 500 G für 10 Minuten gewonnen.
Das nicht absorbierte Serum ergab 10 negative und 3 positive Reaktionen. Nach Absorption mit den Lymphozyten eines
der drei Individuen, die reagiert hatten, war das Serum inaktiv gegenüber den für die Absorption verwendeten
Lymphozyten, jedoch reagierte es noch mit den beiden anderen Individuen.
Das Serum zeigte ein sehr starkes Agglutinationsvermögen der Leukozyten. Dies zeigt, daß der Agglutinationstest auch
erfolgreich für die Eingruppierung von Gewebe mit Hilfe
von xenogenen Antisera verwendet werden kann.
2) Anti-HL-A-Serum des Kaninchens
Ein Kaninchen wurde mit dem Präparat HS 15 (S.Beispiel 1)
immunisiert. Die Immunisierung erfolgte nach der gleichen Methode wie bei den Ratten. Drei Injektionen von je 3 mg
Antigen wurden in Abständen von 10 Tagen vorgenommen. Das Serum wurde vor und nach der Absorption durch rote
menschliche Blutkörperchen der Gruppe A (HL-A 2 negativ) kontrolliert.
Das Serum reagierte mit den Leukozyten von verschiedenen Spendern vor und nach der Absorption. Sein Titer war jedoch
nach der Absorption leicht erniedrigt. Auch hier wurde festgestellt, daß das Serum des Kaninchens ein sehr hohes
Agglutinationsvermögen hatte.
Bei Kontrolle durch die Zytotoxizität gegenüber Lymphozyten von fünf verschiedenen Individuen lieferte das Serum vier
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- ίο -
positive Ergebnisse und ein schwach positives Ergebnis.
Nach Absorption mit den Lymphozyten eines Spenders reagiert das Serum nicht mit den Lymphozyten des für die Absorption
verwendeten Spenders, jedoch reagiert es noch mit den Lymphozyten anderer Spender.
3) Anti-HL-A-Serum des Kaninchens
Drei Kaninchen wurden mit einem Präparat immunisiert, das von einem Gewebe einer identifizierten menschlichen Milz
stammte (Präparat HSI, hergestellt auf die für HS 15 beschriebene V/eise). Das Serum wurde durch die Zytotoxizität
bewertet.
a) Vor der Immunisierung brachte es negative Ergebnisse.
b) Nach der ersten Immunisierung zeigte es eine vollständig negative Reaktion und zwei sehr schwach positive Reaktionen.
c) Nach der zweiten Immunisierung wurden 7 negative oder sehr schwache Reaktionen (+ oder -), 3 leicht positive
Reaktionen (+) und 3 stark positive Reaktionen (++) an 13 Testindividuen beobachtet, die vorher identifiziert
worden waren. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt.
Identifizierte Erste Immunisierung Zweite Immunisierung Individuen der Kaninchen
5Q1 502 503 501 502. 503
KH - + + ♦
GK - - - - Z I
HW - -
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VH / -
JT -
AJ -
Das Kaninchenserum zeigt demzufolge verschiedene Reaktionen gegenüber Individuen des unterschiedlichen menschlichen
Typs HL-A.
Nach der Absorption des Serums durch das zur Immunisierung verwendete ursprüngliche Präparat war das Serum völlig inaktiv
geworden. Nach Absorption durch zwei verschiedene Präparate des bekannten Typs HL-A, die nur einige der Anti- "
gene des ursprünglichen Präparats gemeinsam hatten, hatte die Häufigkeit der Reaktion des Serums mit den verschiedenen
Spendern abgenommen.
A-) Antileukämisches Serum des Kaninchens, hergestellt
durch Imnunisierung mit Extrakten von leukämischen Zellen des Menschen
Kaninchen, die mit den in der oben beschriebenen Weise hergestellten,
aber aus leukämischen Zellen des Menschen erhaltenen Präparaten immunisiert worden waren, reagierten mit
den Extrakten von normaler Milz zahlreicher Menschen. Dies wurde durch Doppeldiffusion in Agar bestimmt. Nach Absorption
zur Unterdrückung jeder Reaktionsfähigkeit der Bestandteile λ
des normalen Serums mit den zur Herstellung des löslichen Extrakts verwendeten Reagenzien, z.B. Papain, zeigten die
von nicht leukämischen Zellen extrahierten löslichen Produkte
kreuzweise Reaktionsfähigkeit bei der Spezifität AL-A mit dem leukämischen Extrakt. Es verblieben nur zwei Diffusionsgeraden
mit Extrakten von Zellen, die vom ursprünglichen leukämischen Spender stammten. Diese Geraden wiesen
das Vorhandensein von spezifischen leukämischen Antigenen auf.
Bei den bisherigen Methoden, bei denen die spezifischen Antigene der Leukämie unter Verwendung xenogener Sera, die
aus ganzen Zellen oder rohen homogenisierten Produkten stammen, identifiziert werden, haben die Sera den Nachteil,
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daß sie eine Vielzahl verschiedener ungeeigneter Antikörper enthalten. Die Zahl dieser ungeeigneten Antikörper kann
durch Verwendung einer gereinigten Substanz stark verringert werden·
Die oben genannten Ergebnisse lassen die Spezifität der in den erfindungsgemäß hergestellten Sera vorhandenen Antikörper
erkennen.
Die Versuche, bei denen Sera, die gegenüber Lymphozyten
eines Spenders zytotoxisch sind, mit diesen gleichen Lymphozyten absorbiert wurden, zeigen, daß diese Absorption
die Sera negativ für Lymphozyten macht, die zur Absorption dienten, daß sie jedoch ihre Aktivität gegenüber anderen
Lymphozyten, die anderen Individuen gehören, nicht verringert. Ebenso wurden lymphozytotoxische Sera, die nach Immunisierung
mit einem löslichen Extrakt erhalten wurden, entweder durch den gleichen Extrakt oder durch andere Extrakte
neutralisiert. Allein die mit dem ursprünglichen Extrakt neutralisierten Sera haben ihre Aktivität vollständig verloren.
Die anderen Extrakte bewirkten lediglich eine Verringerung der Häufigkeit der Reaktionsfähigkeit der Sera
mit den verschiedenen Individuen der untersuchten Gruppe.
Die Erfindung zeigt somit, daß die Histokompatibilitätsantigene,
wenn sie genügend gereinigt und löslich gemacht worden sind, zur Herstellung von Antisera verwendet werden
können, die über die Grenzen oder Schranken der Art hinaus spezifisch sind.
Im Rahmen der Erfindung sind zahlreiche Varianten möglich. Beispielsweise ist, wie vorstehend beschrieben wurde, eine
besonders interessante Anwendung die Herstellung von Antisera für die Gewebeidentifizierung beim Menschen oder beim
Tier (insbesondere bei der Maus) durch Immunisierung anderer Tierarten mit einer besseren Ausbeute und unter Vermeidung
aller Schwierigkeiten, die den Immunisierungen des Menschen innewohnen. Es ist offensichtlich, daß spezifische
Antisera von verschiedenen Tierarten (Kaninchen, Ratte,
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Meerschweinchen, Pferd usw.) gewonnen werden können, und
daß das zur Immunisierung dienende Antigen auch zu beliebigen Tierarten (Mensch, Maus usw.) gehören kann.
Es ist ferner zu bemerken, daß in der vorstehenden Beschreibung
die Sera durch ihre zytotoxische Aktivität charakterisiert
wurden. Man ist jedoch nicht auf diese Methode beschränkt. Es können andere Methoden angewandt werden, die
die Wertbemessung von Sera ermöglichen, z.B. die bekannten Methoden der Fixierung der Bindung, Agglunitation und
Immunadhärenz.
Eine weitere wichtige Anwendung der Erfindung ist die Herstellung von spezifischen Antisera gegen leukämische Antigene
und Tumor-Antigene durch Heteroimmunisierung. Neuere Arbeiten beweisen, daß die menschlichen leukämischen Zellen
Neoantigene aufweisen, die vom Organismus nicht als
"self" anerkannt werden. Mehrere Arbeiten lassen den Schluß zu, daß eine Situation vorliegt, die derjenigen bei den
festen Tumoren analog ist.
Die Erfindung ist somit auf leukämische Antigene oder Antigene von festen Tumoren beim Menschen anwendbar, nachdem
sie isoliert und gereinigt worden sind. Die Erfindung ermöglicht die Herstellung von spezifischen antileukämischen
Antisera sowie von spezifischen Antisera gegen Tumorzellen durch Immunisierung von Tieren. Der Anwendungsbereich der
Erfindung ist somit sehr weit.
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Claims (1)
- Patentansprüche £Verfahren zur Herstellung von Antisera, dadurch gekennzeichnet, daß man als Empfänger ein Säugetier mit einem Transplantationsalloantigen eines Säugetiers oder einem spezifischen Tumorantigen, das löslich gemacht, von hochmolekularen Verunreinigungen abgetrennt worden ist und ein Molekulargewicht zwischen 30.000 und 70.000 hat, immunisiert und das hierbei gebildete Antiserum gewinnt.Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Transplantations-Alloantigene von Säugetieren oder die spezifischen Tumorantigene aus einem menschlichen Gewebe erhalten worden sind, das an Lymphozyten oder Zellen des Typs, der als Quelle des gewünschten Antigens geeignet ist, reich ist, wobei das Antigen löslich gemacht und einer Gelfiltration unterworfen worden ist, um ein gereinigtes Produkt zu erhalten, das ein Molekulargewicht von etwa 54.000 - 5000 hat.Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das gereinigte Transplantations-Alloantigen des Säugetiers oder das spezifische Tumor-Antigen erhalten worden ist durch Verkleinerung des an lymphozytären Zellen reichen Spendergewebes, durch Suspendierung des Zellprodukts in einem geeigneten flüssigen Träger, Abtrennung der obenstehenden Flüssigkeit vom suspendierten Peststoff durch einmalige oder mehrmalige Zentrifugierung, anschließende Trennung des Peststoffs und der obenstehenden Flüssigkeit durch ültrazentrifugierung, Löslichmachung der festen Substanz und, falls erforderlich, Einengung der erhaltenen Lösung und Abtrennung der hochmolekularen Verunreinigungen durch Fraktionierung in einer Gelfiltrationsapparatur.Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß die Löslichmachune erfolgt, indem das bei der Ultrazentrifuge erung erhaltene Sediment mit Papain oder einem anderen wirksamen Enzym bebrütet wird.109833/19565. Verfahren nach Anspruch 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen aus Lymphozyten des peripheren Bluts oder aus Zellen einer Gewebekultur erhalten worden ist.6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5* dadurch gekennzeichnet, daß man die gereinigte Substanz dem Empfängertier in Form einer Lösung oder einer Suspension in einem ungiftigen, physiologisch unbedenklichen flüssigen Träger verabreicht, der gegebenenfalls ein Adjuvans enthält.7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das Serum des immunisierten Tiers durch Entnahme des Bluts, Koagulierung des Bluts, Zentrifugierung und Isolierung des flüssigen Serums gewinnt.öle .*Mittel zur Bestimmung und Einstufung von Gewebe sehen oder beim Tier.bjjrfW9. Verwendung der Antisera nach Ansprüchen---'! bis 7 bei der Organtransplantation zur Bestimmung>erer Verträglichkeit von vorgesehenen Spendern und ein^m Empfänger.10. Verwendung der Antisera^rfach Ansprüchen 1 bis 7 als spe- ^zifische, dem Menscheja^nach der Methode der passiven Immuntherapie zuv^rabreichende Mittel gegen leukämische Antigene und TJdmorantigene.11. Verwejaflung der Antisera nach Ansprüchen 1 bis 7 als spezifische, diagnostischen Zwecken dienende Mittel für die »Feststellung von leukämischen.Antigenen und Krebsantige-I,109833/1956
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