DE2102245A1 - Verfahren zur Herstellung von Antisera - Google Patents

Description

PATENTANWÄLTE Z I 02245

DR.-ING. VON KREiSLER DR.-1 NG. SCHÖNWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL.-CHHM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH

KÖLN 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den 16.1.1971 Kl/Ax/Hz

Agence Nationale de Valorisation de la Recherohe (ANVAR"), Tour Aurore, Paris - Defense 92 Courbevoie (Frankreich).

Verfahren zur Herstellung von Antisera

Die Erfindung betrifft die Herstellung von xenogenen Antisera, die es ermöglichen, einen 'bestimmten Spender zu erkennen.

Antikörper, die bei Individuen einer Art durch Immunisierung mit Hilfe von Zellen auftreten, die von einem anderen Individium der gleichen Art stammen, können bekanntlich dazu dienen, die Antigenspezifitäten zu erkennen, die den ™ einzigartigen Charakter eines Individiums definieren. Auf diesem Gebiet wurden zahlreiche Arbeiten durchgeführt, die sich.mit der Herstellung von Antisera für die Bestimmung der Gewebegruppen beim Menschen befassen, z.B. für die Transplantation von Organen, und diese Antisera werden zur Zeit von Kranken, an denen mehrere Transfusionen durchgeführt worden sind, von mohrgebärenden Frauen und in jüngster Zeit durch vorsätzlichelmmunisierung von freiwilligen

•Personen mit menschlichen Zellen eines ausgewählten Typs .erhalten. Die erhaltenen Sera sind schwach, und die erforderlichen Spezifitäten sind schwierig zu entdecken.

Die Immunisierung von freiv/illigen Personen mit Hilfe von Zellen ist ein Verfahren, das nicht frei von Gefahren ist. ''

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Die Arbeiten, die sich mit der Herstellung von xenogenen Antisera bei verschiedenen Arten befassen, z.B. des Antimaus-Serums des Kaninchens und des Antihumanserums der Ratte (xenogene Antisera), ermöglichten es nicht, die Individuen der Spenderart zu erkennen, da die zur Immunisierung dienenden Zellen überwiegend durch die Artcharakteristiken gekennzeichnet sind.

Allgemein hat das bekannte Verfahren der heterologen Immunisierung mit ganzen Zellen zur Erzeugung von spezifischen Antikörpern nicht zu befriedigenden Ergebnissen geführt. Die auf diese Weise gebildeten Antikörper erkennen zwar die Artantigene, aber sie können nicht die individuellen Spezifitäten innerhalb der Art erkennen. Es war somit nur durch Isoimmunisierung möglich, Sera für die Identifizierung der Gewebegruppe beim Menschen oder bei der Maus herzustellen. Dies hat die bekannten Nachteile bezüglich der Immunisierung des Menschen: Schwierigkeit der Wahl von Freiwilligen, Gefahr der Immunisierung durch Leukozyten beim Menschen, Zufallsergebnisse usw.

Es wurde nun gefunden, daß es unter Verwendung eines gereinigten Produkts von Zellen, die von einem Spendertier stammen, möglich ist, ein Tier einer anderen Art zu immunisieren und Antisera herzustellen, die es ermöglichen, den besonderen Spender zu erkennen. Insbesondere wurde gefunden, daß genügend gereinigte, aus Zellmembranen verschiedener Gewebe erhaltene Antigene von Säugetieren verwendet werden können, um andere Arten zwecks Herstellung von Antisera, die den Zelltyp oder das als Spender dienende Individuum erkennen, zu immunisieren.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die Herstellung von heterospezifischen Sera, mit denen die individuellen menschlichen Spezifitäten erkannt werden können, unter Verwendung von gereinigten und löslich gemachten menschlichen Antigenen mit Gewebe kompatibilität. Ein besonderer Vorteil der Erfindung liegt in der Herstellung von Antisera, die bei einem nicht-menschlichen Säugetier durch Immuni-

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sierung des Empfängertieres mit einem genügend gereinigten menschlichen Antigen gebildet werden. Mit solchen Antisera ist es möglich, die Zellen des jeweiligen menschlichen Spenders zu identifizieren.

Gegenstand der Erfindung ist somit die Herstellung von Antisera nach einem Verfahren, bei dem man ein Empfängersäugetier mit einem aus einem Säugetier stammenden gereinigten Transplantations-Alloantigen oder einem spezifischen Tumorantigen, das von einem Spender einer anderen Säugetierart stammt, immunisiert und aus dem Empfänger das gebildete Antiserum gewinnt.

Die hier erwähnten gereinigten Antigensubstanzen sind Substanzen, die löslich gemacht worden sind (unter Hinterlassung eines unlöslichen Rückstandes mit einem großen Volumen von Verunreinigungen) und anschließend durch Gelfiltrationssäulen (Sephadex G200) geleitet worden sind, um die Fraktion mit höherem Molekulargewicht zu entfernen, wobei ein lösliches Produkt erhalten wird, das ein Molekulargewicht im Bereich von 30.000 bis 70,000 hat. Diese hochmolekulare Fraktion ist immunogen für verschiedene Alloantigene, die als Verunreinigungen angesehen werden können, deren Anwesenheit die Substanz für das Verfahren gemäß der Erfindung wertlos machen würde·.

Die beim Verfahren gemäß der Erfindung verwendete gereinigte antigene Substanz kann nach einer beliebigen Variante der bekannten grundlegenden Reinigungsverfahren hergestellt werden, nämlich durch Herstellung eines rohen Membranextrakts, Löslichmachung des Extrakts, Reinigung des Extrakts und Abtrennung der Spezifitäten. Herstellungsverfahren dieser Art werden in der Literatur beschrieben, insbesondere in den folgenden Veröffentlichungeni

1) D.A.L.Davies, Immunology, I₁I, 115 (1966)

2) S.G.Nathanson und D.A.L.Davies, Froc.Nat.Acad.Sci. Washington £6 W (1966)

3) D.A.L. Davies, A.J.Manstone, D.O.Viza, J.Colombani,

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J.Dausset, Transplantation,6, 571 (1968).

4. D.A.L.Davies, Transplantation, 5, 51 (1967)·

5. D.A.L.Davies, J.Colombani, D.C.Viza, J.Dausset, Biochem, Biosphys. Res. Gommun. j£j5, 88 (1968).

6. D.A.L.Davies, Transplantation, 8, 51 (1969).

7. J.Colombani, N.Colombani, D.O.Viza, Degani-Bernard, J.Dausset, D.A.L.Davies, Transplantation, 9, 228 (1970).

Ein System zur spezifischen Abtrennung von HL-A, seiner von anderen Tierarten stammenden Homologen oder von Antigenen, die die speziellen Zelltypen definieren (einschließlich der Tumorzellen), kann kurz wie folgt beschrieben werden:

Milzlymphozyten, leukämische Zellen (von der Milz oder von peripherem Blut) oder andere geeignete Zelltypen werden mit hypotonischer Kochsalzlösung eluiert (1), und das rohe Lipoprotein wird aus diesem Waschwasser der Zellen zentrifugiert. Dieses Produkt wird durch Autolyse (unter Verwendung von lysozymatisehen Kathepsinen, die in der rohen Ausgangssubstanz vorhanden sind) (2) oder durch Verwendung anderer proteolytischer Enzyme (z.B. Picin, Bromelin oder Papain) löslich gemacht (3 und 4). Die lösliche Substanz wird durch Gelfiltration fraktioniert (4·), und die aus dieser Stufe stammende aktive Fraktion ist bereits genügend gereinigt, um als immunogen für die Zwecke der Erfindung verwendet werden zu können. Eine Nachreinigung kann durch Chromatographie an Ionenaustauschersäulen (5)» durch Elektrophorese und durch Elektrofokalisation vorgenommen werden. Die Chromatographie an der Ionenaustauschersäule gewährleistet eine Trennung der Spezifitäten derart, daß ein Individuum beispielsweise verschiedene HL-A-Antigene liefern kann (6 und 7)» die getrennt für die Immunisierung verwendet werden können.

Die vorstehende allgemeine Beschreibung und die aufgeführten Literaturstellen betreffen Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Antigens, das von Mäusegeweben stammt. Die verschiedenen Arbeitsstufen gelten generell für die Herstellung einer ähnlichen Substanz aus menschlichem Gewebe (3, 5 und 7).

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Eine spezielle Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Reinigungsverfahrens wird wie folgt durchgeführt:

Die Milz von 100 Mäusen (oder das Äquivalent menschlicher Milzzelleii oder leukämischer Zellen, Feuchtgewicht 20 g) wird zu einer Suspension von Zellen zerkleinert, indem das Gewebe durch ein Sieb gegeben wird. Die Zellen werden etwa 30 Minuten in 200 ml 0,8%igem NaOl (4⁰C) gründlich gewaschen und 10 Minuten bei I5OO U/Minute zentrifugiert· Die obenstehende Schicht wird aufbewahrt und das Sediment erneut in 200 ml zusätzlichem 0,8%igem NaOl suspendiert. Diese Suspension wird 10 Minuten bei I500 Ü/Minute zentrifugiert. Das Sediment wird entfernt und die obenstehende Schicht der zuerst erhaltenen Schicht zugesetzt. Diese 400 ml Waschwasser der Zellen werden 60 Minuten bei 30.000 U/Minute zentrifugiert. Die obenstehende Schicht wird verworfen. Das Sediment wird erneut in Wasser in einer Menge von etwa bis 30 mg/ml (entsprechend I5 ml) suspendiert. Diese Suspension kann bei 4-⁰C mit Tymol als Konservierungsmittel aufbewahrt werden und wird als rohes Eluat bezeichnet.

Die Löslichmachung wird vorgenommen, indem ein "Tris"-Puffer (Trinatriumphosphat) bis p„ 8 zugesetzt wird, wobei eine Endkonzentration von 0_s05 Mol erhalten wird. Die Lösung wird 2,5 Stunden bei 37°C bebrütet, 2 Stunden bei 5O.OOO U/ Minute zentrifugiert. Die obenstehende Schicht wird beiseite gestellt. Das Sediment wird erneut in 15 nil Trinatriumphosphatpuffer von p_H 8 bei 0,05 Mol suspendiert, worauf Papain in einer Menge von etwa 1/150 (falls erforderlich mehr) des Gewichts der löslich zu machenden Substanz zügesetzt wird (2,5 mg)· Diese Suspension wird 1 Stunde bei 37°C bebrütet. Die Reaktion wird abgebrochen, indem Natriumjodacetat bis zu einer Endkonzentration von 0,05 Mol zugesetzt wird. Die Lösung wird anschließend 2 Stunden bei 5O.OOO U/Minute zentrifugiert. Das Sediment wird verworfen und die obenstehende Schicht mit der oben genannten, bei hoher Geschwindigkeit zentrifugieren obenstehenden Schicht

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vereinigt. Diese vereinigten obenstehenden Schichten werden in einen Rotationsverdampfer auf etwa 6 ml eingeengt und anschließend auf eine Gelsäule ("Sephadex G2OO") (50x3 cm) aufgegeben. 55 Fraktionen von je 10 ml werden aufgefangen. Die Fraktionen werden unter Berücksichtigung des Verlaufs der optischen Dichte und der Ergebnisse zusammengegeben, die bei der Prüfung der Antigenspezifität, d.h. bei der Prüfung der Fraktionen auf ihre Fähigkeit, die Anwesenheit eines spezifischen Antigens durch Verwendung entsprechender Antisera zu erkennen, erhalten werden. Unter den vorstehend genannten Bedingungen sind es im allgemeinen die Reagenzgläser 18 bis 30, die die Aktivität, d.h. die Antigene H-2 und HIi-A enthalten. Der Inhalt dieser Reagenzgläser wird vereinigt, unter vermindertem Druck eingeengt, dialysiert und lyophilisiert. Die gesamte Behandlung wird in der Kälte vorgenommen. Die Ausbeute bei einem solchen Herstellungsversuch beträgt etwa 5

Durch Analyse der Produkte konnten Glykoproteine idenzifiziert werden. Da jedoch auf Grund der sehr geringen Ausbeute ein Homogenitätsbeweis fehlte, war es nicht möglich, eine Maßanalyse durchzuführen. Die Ermittlung des Molekulargewichts, berechnet nach den Methoden der Sedimentationsgeschwindigkeit und Ultrazentrifugierung bei Gleichgewicht, ergab eine Zahl von 54.000 (Summerell & Davis, Trans.Proc, 2» 479 (1969)» und Summerei & Davis, Biochem.Biophys.Acta. 207 92 (1970)) für drei untersuchte H-2-Spezifitäten der Maus· Die Ergebnisse der Gelfiltration zeigen, daß das Molekulargewicht der menschlichen HL-A-Antigene sehr dicht bei dieser Zahl liegt. Die Moleküle sind in dem zur Reinigung und Löslichmachung verwendeten Wasser löslich.

Diese Verfahrensweise wurde für HL-A-Transplantationsantigene des Menschen, für die H-2-Transplantationsantigene der Maus, für ihre Homologen des Hundes und des Schweins und für die spezifischen Antigene der Leukämie des Menschen und der Maus angewandt..

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Modifikationen dieses grundlegenden Reinigungsverfahrens können auf andere Antigene, die' an die Zellmembranen gebunden sind, angewandt werden. Nicht-HL-A-Alloantigene oder Nicht-H-2-Alloantigene, die ebenfalls für die Herstellung von xenogenen Antisera verwendet werden können, wurden nach verschiedenen Verfahren hergestellt·

Die Methode der Immunisierung des Empfängertieres ist in keinem Fall kritisch. Die gereinigte Substanz wird gewöhnlich dem Empfängertier in Form einer Lösung oder einer Suspension in einem ungiftigen, physiologisch unbedenklichen flüssigen Träger verabreicht. Es erwies sich als vorteil- ^ haft, eine Lösung oder eine Suspension der gereinigten Substanz im Verhältnis von 1 mg gereinigte Substanz pro 3 ml Flüssigkeit herzustellen. In zahlreichen Fällen ist es vorteilhaft, außerdem ein Adjuvans, z.B. ein Ad^uvans nach Freund, zu verwenden. Die während der Immunisierung verabreichte Dosis ist nicht kritisch.

Die Gewinnung des Serums aus dem immunisierten Tier erfolgt nach üblichen Verfahren, d.h. durch Abtrennung des Bluts, Koagulierung, Zentrifugierung und Gewinnung des Serums.

Das Produkt gemäß tfer Erfindung hat eine besondere Bedeutung für die Identifizierung von Geweben für die Transplantation. d Die Identifizierung von Gewebe ist eine Methode zur Bewertung der Unverträglichkeit (bei der Organtransplantation) zwischen den möglichen Spendern und den Empfängern. Als Reagenzien werden menschliche Alloantisera verwendet, die verschiedene Alloantigene von Leukozyten, im wesentlichen diejenigen der Reihe "HL-A",^Merkennen"· Die HL-A-Antigene sind die wichtigsten Faktoren, die bei der Abstoßung von Implantaten eine Rolle spielen. Ein gut ausgewähltes Spender-Empfänger-Paar muß minimale Unterschiede in seiner HL-A-Zusammensetzung haben. Wenn Unterschiede zwischen den beiden Individuen auftreten, d.h. wenn die Reaktion der Antisera Unverträglichkeiten ergibt, wird den Individuen nicht der Vorzug für den Austausch von Organen gegeben.

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Das Produkt gemäß der Erfindung kann auch zur Identifizierung und Klassifizierung der leukämischen Antigene und anderer Tumor-Antigene verwendet werden. Es eignet sich auch in der Therapie von Tumoren,

Es wird angenommen, daß die Erfindung auch die Charakterisierung der Spezifitäten von Tumorzellen ermöglicht. Zur Zeit ist man der Ansicht, daß alle Tumorzellen ein Antigen aufweisen, das sie von ihren Wirtszellen differenziert, und in dieser Hinsicht sind die Leukämiezellen am eingehendsten untersucht worden.

Bei einem großen Teil der durchgeführten Versuchsarbeiten wurde die gereinigte oder teilweise gereinigte HL-A-Substanz verwendet.

Die Erfindung wird nachstehend durch Beispiele der Verwendung einer solchen Substanz für die Herstellung eines xenogenen Antiserums veranschaulicht.

1) Anti-HL-A-Serum der Ratte

Ein lösliches Präparat wurde aus menschlicher Milz (HS 15) hergestellt. Das Gewebe wurde mit einem Metallsieb zerkleinert. Die Zellen wurden in einer 0,8%igen NaCl-Lösung suspendiert und in der oben beschriebenen Weise behandelt, wobei eine gereinigte Substanz erhalten wurde, die durch Inhibierung der Zytotoxizität identifiziert wurde. Mit dieser Substanz wurden zwei Batten immunisiert (2 Injektionen von 2,5 mg Antigen in einem Abstand von 1 Woche in die Pfote mit vollständigem Freund-Adjuvans). Das Serum, das 8 Tage nach der zweiten Immunisierung entnommen wurde, wurde auf Zytotoxizität auf die Lymphozyten von 13 identifizierten Individuen geprüft. j

Diese Methode schließt die Ermittlung des Prozentsatzes der Zerstörung von bestimmten lymphozytären Zellen einer bekannten HL-A-Gruppe mit verschiedenen lymphozytotoxischen Antisera von Gewebe nach den Methoden ein, die in "Histocompatibility Testing", 196? (Eds.Curtoni E.S. und Mitarbeiter (Munksgaard)

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beschrieben sind. Die Anpassung dieser Methode an eine Messung der Aktivität des Antigens nach Inhibitionsmethoden wird in der oben genannten Literaturstelle (3) beschrieben.

Das Serum wurde in seiner ursprünglichen Form und auch nach Absorption verwendet. Die Absorption wurde vorgenom-

men, indem 1 ml Serum mit 10 Lymphozyten von peripherem Blut von identifizierten Spendern eine Stunde bei 37°C bebrütet wurde. Das Serum wurde durch Zentrifugieren bei 500 G für 10 Minuten gewonnen.

Das nicht absorbierte Serum ergab 10 negative und 3 positive Reaktionen. Nach Absorption mit den Lymphozyten eines der drei Individuen, die reagiert hatten, war das Serum inaktiv gegenüber den für die Absorption verwendeten Lymphozyten, jedoch reagierte es noch mit den beiden anderen Individuen.

Das Serum zeigte ein sehr starkes Agglutinationsvermögen der Leukozyten. Dies zeigt, daß der Agglutinationstest auch erfolgreich für die Eingruppierung von Gewebe mit Hilfe von xenogenen Antisera verwendet werden kann.

2) Anti-HL-A-Serum des Kaninchens

Ein Kaninchen wurde mit dem Präparat HS 15 (S.Beispiel 1) immunisiert. Die Immunisierung erfolgte nach der gleichen Methode wie bei den Ratten. Drei Injektionen von je 3 mg Antigen wurden in Abständen von 10 Tagen vorgenommen. Das Serum wurde vor und nach der Absorption durch rote menschliche Blutkörperchen der Gruppe A (HL-A 2 negativ) kontrolliert.

Das Serum reagierte mit den Leukozyten von verschiedenen Spendern vor und nach der Absorption. Sein Titer war jedoch nach der Absorption leicht erniedrigt. Auch hier wurde festgestellt, daß das Serum des Kaninchens ein sehr hohes Agglutinationsvermögen hatte.

Bei Kontrolle durch die Zytotoxizität gegenüber Lymphozyten von fünf verschiedenen Individuen lieferte das Serum vier

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positive Ergebnisse und ein schwach positives Ergebnis.

Nach Absorption mit den Lymphozyten eines Spenders reagiert das Serum nicht mit den Lymphozyten des für die Absorption verwendeten Spenders, jedoch reagiert es noch mit den Lymphozyten anderer Spender.

3) Anti-HL-A-Serum des Kaninchens

Drei Kaninchen wurden mit einem Präparat immunisiert, das von einem Gewebe einer identifizierten menschlichen Milz stammte (Präparat HSI, hergestellt auf die für HS 15 beschriebene V/eise). Das Serum wurde durch die Zytotoxizität bewertet.

a) Vor der Immunisierung brachte es negative Ergebnisse.

b) Nach der ersten Immunisierung zeigte es eine vollständig negative Reaktion und zwei sehr schwach positive Reaktionen.

c) Nach der zweiten Immunisierung wurden 7 negative oder sehr schwache Reaktionen (+ oder -), 3 leicht positive Reaktionen (+) und 3 stark positive Reaktionen (++) an 13 Testindividuen beobachtet, die vorher identifiziert worden waren. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt.

Identifizierte Erste Immunisierung Zweite Immunisierung Individuen der Kaninchen

5Q1 502 503 501 502. 503

KH - + + ♦

GK - - - - Z I

HW - -

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VH / -

JT -

AJ -

Das Kaninchenserum zeigt demzufolge verschiedene Reaktionen gegenüber Individuen des unterschiedlichen menschlichen Typs HL-A.

Absorption

Nach der Absorption des Serums durch das zur Immunisierung verwendete ursprüngliche Präparat war das Serum völlig inaktiv geworden. Nach Absorption durch zwei verschiedene Präparate des bekannten Typs HL-A, die nur einige der Anti- " gene des ursprünglichen Präparats gemeinsam hatten, hatte die Häufigkeit der Reaktion des Serums mit den verschiedenen Spendern abgenommen.

A-) Antileukämisches Serum des Kaninchens, hergestellt durch Imnunisierung mit Extrakten von leukämischen Zellen des Menschen

Kaninchen, die mit den in der oben beschriebenen Weise hergestellten, aber aus leukämischen Zellen des Menschen erhaltenen Präparaten immunisiert worden waren, reagierten mit den Extrakten von normaler Milz zahlreicher Menschen. Dies wurde durch Doppeldiffusion in Agar bestimmt. Nach Absorption zur Unterdrückung jeder Reaktionsfähigkeit der Bestandteile λ des normalen Serums mit den zur Herstellung des löslichen Extrakts verwendeten Reagenzien, z.B. Papain, zeigten die von nicht leukämischen Zellen extrahierten löslichen Produkte kreuzweise Reaktionsfähigkeit bei der Spezifität AL-A mit dem leukämischen Extrakt. Es verblieben nur zwei Diffusionsgeraden mit Extrakten von Zellen, die vom ursprünglichen leukämischen Spender stammten. Diese Geraden wiesen das Vorhandensein von spezifischen leukämischen Antigenen auf.

Bei den bisherigen Methoden, bei denen die spezifischen Antigene der Leukämie unter Verwendung xenogener Sera, die aus ganzen Zellen oder rohen homogenisierten Produkten stammen, identifiziert werden, haben die Sera den Nachteil,

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daß sie eine Vielzahl verschiedener ungeeigneter Antikörper enthalten. Die Zahl dieser ungeeigneten Antikörper kann durch Verwendung einer gereinigten Substanz stark verringert werden·

Die oben genannten Ergebnisse lassen die Spezifität der in den erfindungsgemäß hergestellten Sera vorhandenen Antikörper erkennen.

Die Versuche, bei denen Sera, die gegenüber Lymphozyten eines Spenders zytotoxisch sind, mit diesen gleichen Lymphozyten absorbiert wurden, zeigen, daß diese Absorption die Sera negativ für Lymphozyten macht, die zur Absorption dienten, daß sie jedoch ihre Aktivität gegenüber anderen Lymphozyten, die anderen Individuen gehören, nicht verringert. Ebenso wurden lymphozytotoxische Sera, die nach Immunisierung mit einem löslichen Extrakt erhalten wurden, entweder durch den gleichen Extrakt oder durch andere Extrakte neutralisiert. Allein die mit dem ursprünglichen Extrakt neutralisierten Sera haben ihre Aktivität vollständig verloren. Die anderen Extrakte bewirkten lediglich eine Verringerung der Häufigkeit der Reaktionsfähigkeit der Sera mit den verschiedenen Individuen der untersuchten Gruppe.

Die Erfindung zeigt somit, daß die Histokompatibilitätsantigene, wenn sie genügend gereinigt und löslich gemacht worden sind, zur Herstellung von Antisera verwendet werden können, die über die Grenzen oder Schranken der Art hinaus spezifisch sind.

Im Rahmen der Erfindung sind zahlreiche Varianten möglich. Beispielsweise ist, wie vorstehend beschrieben wurde, eine besonders interessante Anwendung die Herstellung von Antisera für die Gewebeidentifizierung beim Menschen oder beim Tier (insbesondere bei der Maus) durch Immunisierung anderer Tierarten mit einer besseren Ausbeute und unter Vermeidung aller Schwierigkeiten, die den Immunisierungen des Menschen innewohnen. Es ist offensichtlich, daß spezifische Antisera von verschiedenen Tierarten (Kaninchen, Ratte,

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Meerschweinchen, Pferd usw.) gewonnen werden können, und daß das zur Immunisierung dienende Antigen auch zu beliebigen Tierarten (Mensch, Maus usw.) gehören kann.

Es ist ferner zu bemerken, daß in der vorstehenden Beschreibung die Sera durch ihre zytotoxische Aktivität charakterisiert wurden. Man ist jedoch nicht auf diese Methode beschränkt. Es können andere Methoden angewandt werden, die die Wertbemessung von Sera ermöglichen, z.B. die bekannten Methoden der Fixierung der Bindung, Agglunitation und Immunadhärenz.

Eine weitere wichtige Anwendung der Erfindung ist die Herstellung von spezifischen Antisera gegen leukämische Antigene und Tumor-Antigene durch Heteroimmunisierung. Neuere Arbeiten beweisen, daß die menschlichen leukämischen Zellen Neoantigene aufweisen, die vom Organismus nicht als "self" anerkannt werden. Mehrere Arbeiten lassen den Schluß zu, daß eine Situation vorliegt, die derjenigen bei den festen Tumoren analog ist.

Die Erfindung ist somit auf leukämische Antigene oder Antigene von festen Tumoren beim Menschen anwendbar, nachdem sie isoliert und gereinigt worden sind. Die Erfindung ermöglicht die Herstellung von spezifischen antileukämischen Antisera sowie von spezifischen Antisera gegen Tumorzellen durch Immunisierung von Tieren. Der Anwendungsbereich der Erfindung ist somit sehr weit.

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Claims (1)

1. Patentansprüche £

   Verfahren zur Herstellung von Antisera, dadurch gekennzeichnet, daß man als Empfänger ein Säugetier mit einem Transplantationsalloantigen eines Säugetiers oder einem spezifischen Tumorantigen, das löslich gemacht, von hochmolekularen Verunreinigungen abgetrennt worden ist und ein Molekulargewicht zwischen 30.000 und 70.000 hat, immunisiert und das hierbei gebildete Antiserum gewinnt.

   Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Transplantations-Alloantigene von Säugetieren oder die spezifischen Tumorantigene aus einem menschlichen Gewebe erhalten worden sind, das an Lymphozyten oder Zellen des Typs, der als Quelle des gewünschten Antigens geeignet ist, reich ist, wobei das Antigen löslich gemacht und einer Gelfiltration unterworfen worden ist, um ein gereinigtes Produkt zu erhalten, das ein Molekulargewicht von etwa 54.000 - 5000 hat.

   Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das gereinigte Transplantations-Alloantigen des Säugetiers oder das spezifische Tumor-Antigen erhalten worden ist durch Verkleinerung des an lymphozytären Zellen reichen Spendergewebes, durch Suspendierung des Zellprodukts in einem geeigneten flüssigen Träger, Abtrennung der obenstehenden Flüssigkeit vom suspendierten Peststoff durch einmalige oder mehrmalige Zentrifugierung, anschließende Trennung des Peststoffs und der obenstehenden Flüssigkeit durch ültrazentrifugierung, Löslichmachung der festen Substanz und, falls erforderlich, Einengung der erhaltenen Lösung und Abtrennung der hochmolekularen Verunreinigungen durch Fraktionierung in einer Gelfiltrationsapparatur.

   Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß die Löslichmachune erfolgt, indem das bei der Ultrazentrifuge erung erhaltene Sediment mit Papain oder einem anderen wirksamen Enzym bebrütet wird.

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   5. Verfahren nach Anspruch 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen aus Lymphozyten des peripheren Bluts oder aus Zellen einer Gewebekultur erhalten worden ist.

   6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5* dadurch gekennzeichnet, daß man die gereinigte Substanz dem Empfängertier in Form einer Lösung oder einer Suspension in einem ungiftigen, physiologisch unbedenklichen flüssigen Träger verabreicht, der gegebenenfalls ein Adjuvans enthält.

   7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das Serum des immunisierten Tiers durch Entnahme des Bluts, Koagulierung des Bluts, Zentrifugierung und Isolierung des flüssigen Serums gewinnt.

   öle .*

   Mittel zur Bestimmung und Einstufung von Gewebe sehen oder beim Tier.

   bjjrfW

   9. Verwendung der Antisera nach Ansprüchen---'! bis 7 bei der Organtransplantation zur Bestimmung>erer Verträglichkeit von vorgesehenen Spendern und ein^m Empfänger.

   10. Verwendung der Antisera^rfach Ansprüchen 1 bis 7 als spe- ^

   zifische, dem Menscheja^nach der Methode der passiven Immuntherapie zuv^rabreichende Mittel gegen leukämische Antigene und TJdmorantigene.

   11. Verwejaflung der Antisera nach Ansprüchen 1 bis 7 als spezifische, diagnostischen Zwecken dienende Mittel für die »Feststellung von leukämischen.Antigenen und Krebsantige-

   I,

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