DE2102245A1

DE2102245A1 - Method of making antisera

Info

Publication number: DE2102245A1
Application number: DE19712102245
Authority: DE
Inventors: Dimitri London Viza
Original assignee: Agence National de Valorisation de la Recherche ANVAR
Current assignee: Bpifrance Financement SA
Priority date: 1970-01-21
Filing date: 1971-01-19
Publication date: 1971-08-12
Also published as: ZA71167B; FR2081446B1; GB1291134A; CH530793A; NL7100777A; FR2081446A1; ES387472A1; CA953215A

Description

PATENTANWÄLTE Z I 02245PATENT Attorneys Z I 02245

DR.-ING. VON KREiSLER DR.-1 NG. SCHÖNWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL.-CHHM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCHDR.-ING. BY KREiSLER DR.-1 NG. SCHÖNWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL.-CHHM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH

KÖLN 1, DEICHMANNHAUSCOLOGNE 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den 16.1.1971 Kl/Ax/HzCologne, January 16, 1971 Kl / Ax / Hz

Agence Nationale de Valorisation de la Recherohe (ANVAR"), Tour Aurore, Paris - Defense 92 Courbevoie (Frankreich). Agence Nationale de Valorisation de la Recherohe (ANVAR ") , Tour Aurore, Paris - Defense 92 Courbevoie (France) .

Verfahren zur Herstellung von AntiseraMethod of making antisera

Die Erfindung betrifft die Herstellung von xenogenen Antisera, die es ermöglichen, einen 'bestimmten Spender zu erkennen. The invention relates to the production of xenogenic antisera, which make it possible to identify a specific donor.

Antikörper, die bei Individuen einer Art durch Immunisierung mit Hilfe von Zellen auftreten, die von einem anderen Individium der gleichen Art stammen, können bekanntlich dazu dienen, die Antigenspezifitäten zu erkennen, die den ™ einzigartigen Charakter eines Individiums definieren. Auf diesem Gebiet wurden zahlreiche Arbeiten durchgeführt, die sich.mit der Herstellung von Antisera für die Bestimmung der Gewebegruppen beim Menschen befassen, z.B. für die Transplantation von Organen, und diese Antisera werden zur Zeit von Kranken, an denen mehrere Transfusionen durchgeführt worden sind, von mohrgebärenden Frauen und in jüngster Zeit durch vorsätzlichelmmunisierung von freiwilligenAntibodies that appear in individuals of one species through immunization using cells obtained from another It is known that individuals of the same species can be used to identify the antigen specificities that cause the ™ define the unique character of an individual. Much work has been carried out in this area, which deal with the production of antisera for the determination of tissue groups in humans, e.g. for the Organ transplants, and these antisera are currently used by patients who have had multiple transfusions by car-giving women and, more recently, by deliberate immunization of volunteers

•Personen mit menschlichen Zellen eines ausgewählten Typs .erhalten. Die erhaltenen Sera sind schwach, und die erforderlichen Spezifitäten sind schwierig zu entdecken.• Individuals with human cells of a selected type. Received. The sera obtained are weak, and the specificities required are difficult to discover.

Die Immunisierung von freiv/illigen Personen mit Hilfe von Zellen ist ein Verfahren, das nicht frei von Gefahren ist. ''The immunization of free / ill persons with the help of cells is a procedure which is not free from danger. ''

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Die Arbeiten, die sich mit der Herstellung von xenogenen Antisera bei verschiedenen Arten befassen, z.B. des Antimaus-Serums des Kaninchens und des Antihumanserums der Ratte (xenogene Antisera), ermöglichten es nicht, die Individuen der Spenderart zu erkennen, da die zur Immunisierung dienenden Zellen überwiegend durch die Artcharakteristiken gekennzeichnet sind.The work dealing with the production of xenogenic antisera in different species, e.g. the anti-mouse serum the rabbit and the rat anti-human serum (xenogeneic antisera) did not allow the individuals The donor species can be identified, as the cells used for immunization are predominantly determined by the species characteristics Marked are.

Allgemein hat das bekannte Verfahren der heterologen Immunisierung mit ganzen Zellen zur Erzeugung von spezifischen Antikörpern nicht zu befriedigenden Ergebnissen geführt. Die auf diese Weise gebildeten Antikörper erkennen zwar die Artantigene, aber sie können nicht die individuellen Spezifitäten innerhalb der Art erkennen. Es war somit nur durch Isoimmunisierung möglich, Sera für die Identifizierung der Gewebegruppe beim Menschen oder bei der Maus herzustellen. Dies hat die bekannten Nachteile bezüglich der Immunisierung des Menschen: Schwierigkeit der Wahl von Freiwilligen, Gefahr der Immunisierung durch Leukozyten beim Menschen, Zufallsergebnisse usw.In general, the known method of heterologous immunization with whole cells for the production of specific antibodies did not lead to satisfactory results. the Antibodies formed in this way recognize the species antigens, but they cannot identify the individual specificities recognize within the species. It was thus only possible through isoimmunization to identify the sera To produce tissue group in humans or in the mouse. This has the known disadvantages with regard to immunization of humans: difficulty in choosing volunteers, risk of immunization by leukocytes in humans, Random results, etc.

Es wurde nun gefunden, daß es unter Verwendung eines gereinigten Produkts von Zellen, die von einem Spendertier stammen, möglich ist, ein Tier einer anderen Art zu immunisieren und Antisera herzustellen, die es ermöglichen, den besonderen Spender zu erkennen. Insbesondere wurde gefunden, daß genügend gereinigte, aus Zellmembranen verschiedener Gewebe erhaltene Antigene von Säugetieren verwendet werden können, um andere Arten zwecks Herstellung von Antisera, die den Zelltyp oder das als Spender dienende Individuum erkennen, zu immunisieren.It has now been found that it can be obtained using a purified product from cells obtained from a donor animal originate, it is possible to immunize an animal of a different species and produce antisera that enable the recognize special donors. In particular, it has been found that sufficiently purified, cell membranes of various types Tissue-derived antigens from mammals can be used to produce other species for the purpose of producing antisera that recognize the cell type or the individual serving as the donor, immunize.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die Herstellung von heterospezifischen Sera, mit denen die individuellen menschlichen Spezifitäten erkannt werden können, unter Verwendung von gereinigten und löslich gemachten menschlichen Antigenen mit Gewebe kompatibilität. Ein besonderer Vorteil der Erfindung liegt in der Herstellung von Antisera, die bei einem nicht-menschlichen Säugetier durch Immuni-The invention also relates to the production of heterospecific sera with which the individual human specificities can be detected using purified and solubilized human Antigens with tissue compatibility. A particular advantage of the invention is the production of antisera, in a non-human mammal by immuno-

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sierung des Empfängertieres mit einem genügend gereinigten menschlichen Antigen gebildet werden. Mit solchen Antisera ist es möglich, die Zellen des jeweiligen menschlichen Spenders zu identifizieren.sizing the recipient animal with a sufficiently cleaned one human antigen. With such antisera it is possible to target the cells of the respective human Identify donor.

Gegenstand der Erfindung ist somit die Herstellung von Antisera nach einem Verfahren, bei dem man ein Empfängersäugetier mit einem aus einem Säugetier stammenden gereinigten Transplantations-Alloantigen oder einem spezifischen Tumorantigen, das von einem Spender einer anderen Säugetierart stammt, immunisiert und aus dem Empfänger das gebildete Antiserum gewinnt.The invention thus relates to the production of antisera by a method in which a recipient mammal is obtained with a purified graft alloantigen derived from a mammal or a specific one Tumor antigen derived from a donor of another mammalian species is immunized and the recipient is produced Antiserum wins.

Die hier erwähnten gereinigten Antigensubstanzen sind Substanzen, die löslich gemacht worden sind (unter Hinterlassung eines unlöslichen Rückstandes mit einem großen Volumen von Verunreinigungen) und anschließend durch Gelfiltrationssäulen (Sephadex G200) geleitet worden sind, um die Fraktion mit höherem Molekulargewicht zu entfernen, wobei ein lösliches Produkt erhalten wird, das ein Molekulargewicht im Bereich von 30.000 bis 70,000 hat. Diese hochmolekulare Fraktion ist immunogen für verschiedene Alloantigene, die als Verunreinigungen angesehen werden können, deren Anwesenheit die Substanz für das Verfahren gemäß der Erfindung wertlos machen würde·.The purified antigen substances mentioned here are substances which have been solubilized (leaving an insoluble residue with a large volume of impurities) and then passed through gel filtration columns (Sephadex G200) to remove the higher molecular weight fraction, whereby a soluble product is obtained which has a molecular weight in the range of 30,000 to 70,000. This high molecular weight Fraction is immunogenic for various alloantigens, which can be regarded as impurities, their presence would render the substance worthless for the method according to the invention ·.

Die beim Verfahren gemäß der Erfindung verwendete gereinigte antigene Substanz kann nach einer beliebigen Variante der bekannten grundlegenden Reinigungsverfahren hergestellt werden, nämlich durch Herstellung eines rohen Membranextrakts, Löslichmachung des Extrakts, Reinigung des Extrakts und Abtrennung der Spezifitäten. Herstellungsverfahren dieser Art werden in der Literatur beschrieben, insbesondere in den folgenden VeröffentlichungeniThe purified antigenic substance used in the method according to the invention can have any variant the well-known basic purification process, namely by making a raw membrane extract, Solubilization of the extract, purification of the extract and separation of the specificities. Manufacturing processes of this type are described in the literature, in particular in the following publications i

1) D.A.L.Davies, Immunology, I₁I, 115 (1966)1) DAL, Davies, Immunology, I ₁ I, 115 (1966)

2) S.G.Nathanson und D.A.L.Davies, Froc.Nat.Acad.Sci. Washington £6 W (1966)2) S.G.Nathanson and D.A.L.Davies, Froc.Nat.Acad.Sci. Washington £ 6 W (1966)

3) D.A.L. Davies, A.J.Manstone, D.O.Viza, J.Colombani,3) D.A.L. Davies, A.J. Manstone, D.O. Viza, J. Colombani,

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J.Dausset, Transplantation,6, 571 (1968).J.Dausset, Transplantation, 6, 571 (1968).

4. D.A.L.Davies, Transplantation, 5, 51 (1967)·4. D.A.L.Davies, Transplantation, 5, 51 (1967) ·

5. D.A.L.Davies, J.Colombani, D.C.Viza, J.Dausset, Biochem, Biosphys. Res. Gommun. j£j5, 88 (1968).5. D.A.L.Davies, J.Colombani, D.C. Viza, J.Dausset, Biochem, Biosphys. Res. Commun. j £ j5, 88 (1968).

6. D.A.L.Davies, Transplantation, 8, 51 (1969).6. D.A.L.Davies, Transplantation, 8, 51 (1969).

7. J.Colombani, N.Colombani, D.O.Viza, Degani-Bernard, J.Dausset, D.A.L.Davies, Transplantation, 9, 228 (1970).7. J. Colombani, N. Colombani, D.O. Viza, Degani-Bernard, J.Dausset, D.A.L.Davies, Transplantation, 9, 228 (1970).

Ein System zur spezifischen Abtrennung von HL-A, seiner von anderen Tierarten stammenden Homologen oder von Antigenen, die die speziellen Zelltypen definieren (einschließlich der Tumorzellen), kann kurz wie folgt beschrieben werden:A system for the specific separation of HL-A, its homologues derived from other animal species or from antigens, that define the specific cell types (including tumor cells) can be briefly described as follows:

Milzlymphozyten, leukämische Zellen (von der Milz oder von peripherem Blut) oder andere geeignete Zelltypen werden mit hypotonischer Kochsalzlösung eluiert (1), und das rohe Lipoprotein wird aus diesem Waschwasser der Zellen zentrifugiert. Dieses Produkt wird durch Autolyse (unter Verwendung von lysozymatisehen Kathepsinen, die in der rohen Ausgangssubstanz vorhanden sind) (2) oder durch Verwendung anderer proteolytischer Enzyme (z.B. Picin, Bromelin oder Papain) löslich gemacht (3 und 4). Die lösliche Substanz wird durch Gelfiltration fraktioniert (4·), und die aus dieser Stufe stammende aktive Fraktion ist bereits genügend gereinigt, um als immunogen für die Zwecke der Erfindung verwendet werden zu können. Eine Nachreinigung kann durch Chromatographie an Ionenaustauschersäulen (5)» durch Elektrophorese und durch Elektrofokalisation vorgenommen werden. Die Chromatographie an der Ionenaustauschersäule gewährleistet eine Trennung der Spezifitäten derart, daß ein Individuum beispielsweise verschiedene HL-A-Antigene liefern kann (6 und 7)» die getrennt für die Immunisierung verwendet werden können.Spleen lymphocytes, leukemic cells (from the spleen or from peripheral blood) or other suitable cell types are eluted with hypotonic saline solution (1), and the crude Lipoprotein is centrifuged from this cell wash water. This product is produced by autolysis (using of lysozymatisehen cathepsins in the raw starting substance are present) (2) or by using other proteolytic enzymes (e.g. picin, bromelin or Papain) (3 and 4). The soluble substance is fractionated by gel filtration (4x), and the active fraction originating from this stage is already sufficiently purified, to be used as immunogenic for the purposes of the invention. Post-purification can be carried out by chromatography on ion exchange columns (5) »can be carried out by electrophoresis and by electrofocalization. The chromatography on the ion exchange column ensures a separation of the specificities such that an individual, for example can provide different HL-A antigens (6 and 7) »which can be used separately for immunization.

Die vorstehende allgemeine Beschreibung und die aufgeführten Literaturstellen betreffen Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Antigens, das von Mäusegeweben stammt. Die verschiedenen Arbeitsstufen gelten generell für die Herstellung einer ähnlichen Substanz aus menschlichem Gewebe (3, 5 und 7).The foregoing general description and references cited relate to methods of making a purified antigen derived from mouse tissues. The different Work stages generally apply to the production of a similar substance from human tissue (3, 5 and 7).

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Eine spezielle Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Reinigungsverfahrens wird wie folgt durchgeführt:A special embodiment of the cleaning process described above is carried out as follows:

Die Milz von 100 Mäusen (oder das Äquivalent menschlicher Milzzelleii oder leukämischer Zellen, Feuchtgewicht 20 g) wird zu einer Suspension von Zellen zerkleinert, indem das Gewebe durch ein Sieb gegeben wird. Die Zellen werden etwa 30 Minuten in 200 ml 0,8%igem NaOl (4⁰C) gründlich gewaschen und 10 Minuten bei I5OO U/Minute zentrifugiert· Die obenstehende Schicht wird aufbewahrt und das Sediment erneut in 200 ml zusätzlichem 0,8%igem NaOl suspendiert. Diese Suspension wird 10 Minuten bei I500 Ü/Minute zentrifugiert. Das Sediment wird entfernt und die obenstehende Schicht der zuerst erhaltenen Schicht zugesetzt. Diese 400 ml Waschwasser der Zellen werden 60 Minuten bei 30.000 U/Minute zentrifugiert. Die obenstehende Schicht wird verworfen. Das Sediment wird erneut in Wasser in einer Menge von etwa bis 30 mg/ml (entsprechend I5 ml) suspendiert. Diese Suspension kann bei 4-⁰C mit Tymol als Konservierungsmittel aufbewahrt werden und wird als rohes Eluat bezeichnet. The spleen of 100 mice (or the equivalent of human spleen cells or leukemic cells, wet weight 20 g) is minced into a suspension of cells by passing the tissue through a sieve. The cells are / centrifuged for about 30 minutes in 200 ml 0.8% sodium NAOL (4 ⁰ C) and washed thoroughly for 10 minutes at I5OO U minute · The above layer is stored and the sediment re-suspended in 200 ml of additional 0,8% NaOl suspended. This suspension is centrifuged for 10 minutes at 1500 rpm. The sediment is removed and the above layer is added to the layer obtained first. These 400 ml of cell wash water are centrifuged at 30,000 rpm for 60 minutes. The above layer is discarded. The sediment is resuspended in water in an amount of about up to 30 mg / ml (corresponding to 15 ml). This suspension can be stored as a preservative at 4 ⁰ C with thymol and is referred to as a crude eluate.

Die Löslichmachung wird vorgenommen, indem ein "Tris"-Puffer (Trinatriumphosphat) bis p„ 8 zugesetzt wird, wobei eine Endkonzentration von 0_s05 Mol erhalten wird. Die Lösung wird 2,5 Stunden bei 37°C bebrütet, 2 Stunden bei 5O.OOO U/ Minute zentrifugiert. Die obenstehende Schicht wird beiseite gestellt. Das Sediment wird erneut in 15 nil Trinatriumphosphatpuffer von p_H 8 bei 0,05 Mol suspendiert, worauf Papain in einer Menge von etwa 1/150 (falls erforderlich mehr) des Gewichts der löslich zu machenden Substanz zügesetzt wird (2,5 mg)· Diese Suspension wird 1 Stunde bei 37°C bebrütet. Die Reaktion wird abgebrochen, indem Natriumjodacetat bis zu einer Endkonzentration von 0,05 Mol zugesetzt wird. Die Lösung wird anschließend 2 Stunden bei 5O.OOO U/Minute zentrifugiert. Das Sediment wird verworfen und die obenstehende Schicht mit der oben genannten, bei hoher Geschwindigkeit zentrifugieren obenstehenden SchichtSolubilization is carried out by a "tris" buffer (trisodium phosphate) is added to P "8, wherein a final concentration of 0 _s is obtained 05 Mol. The solution is incubated at 37 ° C. for 2.5 hours and centrifuged at 50,000 rpm for 2 hours. The above layer is set aside. The sediment is resuspended in 15 nil of Trinatriumphosphatpuffer p _H 8 0.05 mol, followed by papain in an amount of about 1/150 (if necessary more) of the weight of the trains is set to be made soluble substance (2.5 mg) · This suspension is incubated at 37 ° C. for 1 hour. The reaction is stopped by adding sodium iodoacetate to a final concentration of 0.05 mol. The solution is then centrifuged for 2 hours at 50,000 rpm. The sediment is discarded and the above layer with the above layer centrifuged at high speed

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vereinigt. Diese vereinigten obenstehenden Schichten werden in einen Rotationsverdampfer auf etwa 6 ml eingeengt und anschließend auf eine Gelsäule ("Sephadex G2OO") (50x3 cm) aufgegeben. 55 Fraktionen von je 10 ml werden aufgefangen. Die Fraktionen werden unter Berücksichtigung des Verlaufs der optischen Dichte und der Ergebnisse zusammengegeben, die bei der Prüfung der Antigenspezifität, d.h. bei der Prüfung der Fraktionen auf ihre Fähigkeit, die Anwesenheit eines spezifischen Antigens durch Verwendung entsprechender Antisera zu erkennen, erhalten werden. Unter den vorstehend genannten Bedingungen sind es im allgemeinen die Reagenzgläser 18 bis 30, die die Aktivität, d.h. die Antigene H-2 und HIi-A enthalten. Der Inhalt dieser Reagenzgläser wird vereinigt, unter vermindertem Druck eingeengt, dialysiert und lyophilisiert. Die gesamte Behandlung wird in der Kälte vorgenommen. Die Ausbeute bei einem solchen Herstellungsversuch beträgt etwa 5united. These combined layers above become concentrated in a rotary evaporator to about 6 ml and then on a gel column ("Sephadex G2OO") (50x3 cm) given up. 55 fractions of 10 ml each are collected. The fractions are combined taking into account the course of the optical density and the results, when testing the antigen specificity, i.e. in the Examination of the fractions for their ability to detect the presence of a specific antigen by using appropriate Antisera to be recognized, to be obtained. Under the conditions mentioned above, it is generally the test tubes 18 to 30, which contain the activity i.e. antigens H-2 and HIi-A. The contents of these test tubes will be combined, concentrated under reduced pressure, dialyzed and lyophilized. The entire treatment will be in the cold performed. The yield from such a manufacturing attempt is about 5

Durch Analyse der Produkte konnten Glykoproteine idenzifiziert werden. Da jedoch auf Grund der sehr geringen Ausbeute ein Homogenitätsbeweis fehlte, war es nicht möglich, eine Maßanalyse durchzuführen. Die Ermittlung des Molekulargewichts, berechnet nach den Methoden der Sedimentationsgeschwindigkeit und Ultrazentrifugierung bei Gleichgewicht, ergab eine Zahl von 54.000 (Summerell & Davis, Trans.Proc, 2» 479 (1969)» und Summerei & Davis, Biochem.Biophys.Acta. 207 92 (1970)) für drei untersuchte H-2-Spezifitäten der Maus· Die Ergebnisse der Gelfiltration zeigen, daß das Molekulargewicht der menschlichen HL-A-Antigene sehr dicht bei dieser Zahl liegt. Die Moleküle sind in dem zur Reinigung und Löslichmachung verwendeten Wasser löslich.By analyzing the products, glycoproteins could be identified. However, since there was no evidence of homogeneity due to the very low yield, it was not possible to carry out a dimensional analysis. The determination of the molecular weight, calculated according to the methods of sedimentation rate and ultracentrifugation at equilibrium, gave a number of 54,000 (Summerell & Davis, Trans.Proc, 2 »479 (1969)» and Summerei & Davis, Biochem.Biophys.Acta. 207 92 (1970)) for three investigated H-2 specificities of the mouse. The results of the gel filtration show that the molecular weight of the human HL-A antigens is very close to this number. The molecules are soluble in the water used for cleaning and solubilization.

Diese Verfahrensweise wurde für HL-A-Transplantationsantigene des Menschen, für die H-2-Transplantationsantigene der Maus, für ihre Homologen des Hundes und des Schweins und für die spezifischen Antigene der Leukämie des Menschen und der Maus angewandt..This procedure was used for HL-A transplant antigens of humans, for the H-2 transplant antigens of the Mouse, for their dog and pig homologues and for the specific antigens of human and leukemia applied to the mouse.

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Modifikationen dieses grundlegenden Reinigungsverfahrens können auf andere Antigene, die' an die Zellmembranen gebunden sind, angewandt werden. Nicht-HL-A-Alloantigene oder Nicht-H-2-Alloantigene, die ebenfalls für die Herstellung von xenogenen Antisera verwendet werden können, wurden nach verschiedenen Verfahren hergestellt·Modifications to this basic cleaning procedure can be applied to other antigens bound to cell membranes. Non-HL-A alloantigens or Non-H-2 alloantigens also used for the production can be used by xenogeneic antisera, were produced by different processes

Die Methode der Immunisierung des Empfängertieres ist in keinem Fall kritisch. Die gereinigte Substanz wird gewöhnlich dem Empfängertier in Form einer Lösung oder einer Suspension in einem ungiftigen, physiologisch unbedenklichen flüssigen Träger verabreicht. Es erwies sich als vorteil- ^ haft, eine Lösung oder eine Suspension der gereinigten Substanz im Verhältnis von 1 mg gereinigte Substanz pro 3 ml Flüssigkeit herzustellen. In zahlreichen Fällen ist es vorteilhaft, außerdem ein Adjuvans, z.B. ein Ad^uvans nach Freund, zu verwenden. Die während der Immunisierung verabreichte Dosis ist nicht kritisch.The method of immunizing the recipient animal is in no case critical. The purified substance becomes ordinary the recipient animal in the form of a solution or a suspension in a non-toxic, physiologically harmless one administered in a liquid carrier. It was found to be advantageous- ^ a solution or a suspension of the purified Prepare substance in the ratio of 1 mg of purified substance per 3 ml of liquid. In numerous cases it is advantageous, as well as an adjuvant, e.g. an adjuvant according to Friend to use. The dose administered during immunization is not critical.

Die Gewinnung des Serums aus dem immunisierten Tier erfolgt nach üblichen Verfahren, d.h. durch Abtrennung des Bluts, Koagulierung, Zentrifugierung und Gewinnung des Serums.The serum is obtained from the immunized animal using conventional methods, i.e. by separating the blood, Coagulation, centrifugation and collection of the serum.

Das Produkt gemäß tfer Erfindung hat eine besondere Bedeutung für die Identifizierung von Geweben für die Transplantation. d Die Identifizierung von Gewebe ist eine Methode zur Bewertung der Unverträglichkeit (bei der Organtransplantation) zwischen den möglichen Spendern und den Empfängern. Als Reagenzien werden menschliche Alloantisera verwendet, die verschiedene Alloantigene von Leukozyten, im wesentlichen diejenigen der Reihe "HL-A",^Merkennen"· Die HL-A-Antigene sind die wichtigsten Faktoren, die bei der Abstoßung von Implantaten eine Rolle spielen. Ein gut ausgewähltes Spender-Empfänger-Paar muß minimale Unterschiede in seiner HL-A-Zusammensetzung haben. Wenn Unterschiede zwischen den beiden Individuen auftreten, d.h. wenn die Reaktion der Antisera Unverträglichkeiten ergibt, wird den Individuen nicht der Vorzug für den Austausch von Organen gegeben.The product according to the invention is of particular importance for the identification of tissues for transplantation. d Tissue identification is a method of assessing intolerance (in organ transplantation) between potential donors and recipients. Human alloantisera are used as reagents, which recognize various alloantigens of leukocytes, essentially those of the series "HL-A", ^M "· The HL-A antigens are the most important factors which play a role in the rejection of implants A well-chosen donor-recipient pair must have minimal differences in their HL-A composition.If differences occur between the two individuals, that is, if the reaction of the antisera results in intolerance, the individuals are not given preference for organ exchange.

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Das Produkt gemäß der Erfindung kann auch zur Identifizierung und Klassifizierung der leukämischen Antigene und anderer Tumor-Antigene verwendet werden. Es eignet sich auch in der Therapie von Tumoren,The product according to the invention can also be used to identify and classify the leukemic antigens and other tumor antigens can be used. It is also suitable in the therapy of tumors,

Es wird angenommen, daß die Erfindung auch die Charakterisierung der Spezifitäten von Tumorzellen ermöglicht. Zur Zeit ist man der Ansicht, daß alle Tumorzellen ein Antigen aufweisen, das sie von ihren Wirtszellen differenziert, und in dieser Hinsicht sind die Leukämiezellen am eingehendsten untersucht worden.It is believed that the invention also enables the specificities of tumor cells to be characterized. To the It is currently believed that all tumor cells have an antigen that differentiates them from their host cells, and it is in this respect that the leukemic cells have been most thoroughly studied.

Bei einem großen Teil der durchgeführten Versuchsarbeiten wurde die gereinigte oder teilweise gereinigte HL-A-Substanz verwendet.Much of the experimental work carried out was the purified or partially purified HL-A substance used.

Die Erfindung wird nachstehend durch Beispiele der Verwendung einer solchen Substanz für die Herstellung eines xenogenen Antiserums veranschaulicht.The invention is illustrated below by way of examples of the use of such a substance for the preparation of a xenogenic Illustrated antiserum.

1) Anti-HL-A-Serum der Ratte1) Rat anti-HL-A serum

Ein lösliches Präparat wurde aus menschlicher Milz (HS 15) hergestellt. Das Gewebe wurde mit einem Metallsieb zerkleinert. Die Zellen wurden in einer 0,8%igen NaCl-Lösung suspendiert und in der oben beschriebenen Weise behandelt, wobei eine gereinigte Substanz erhalten wurde, die durch Inhibierung der Zytotoxizität identifiziert wurde. Mit dieser Substanz wurden zwei Batten immunisiert (2 Injektionen von 2,5 mg Antigen in einem Abstand von 1 Woche in die Pfote mit vollständigem Freund-Adjuvans). Das Serum, das 8 Tage nach der zweiten Immunisierung entnommen wurde, wurde auf Zytotoxizität auf die Lymphozyten von 13 identifizierten Individuen geprüft. jA soluble preparation was made from human spleen (HS 15). The tissue was crushed with a metal sieve. The cells were suspended in a 0.8% NaCl solution and treated in the manner described above to obtain a purified substance capable of being inhibited cytotoxicity was identified. Two batteries were immunized with this substance (2 injections of 2.5 mg of antigen in the paw with an interval of 1 week Freund's complete adjuvant). The serum that 8 days after The second immunization was taken for cytotoxicity on the lymphocytes of 13 identified individuals checked. j

Diese Methode schließt die Ermittlung des Prozentsatzes der Zerstörung von bestimmten lymphozytären Zellen einer bekannten HL-A-Gruppe mit verschiedenen lymphozytotoxischen Antisera von Gewebe nach den Methoden ein, die in "Histocompatibility Testing", 196? (Eds.Curtoni E.S. und Mitarbeiter (Munksgaard)This method includes determining the percentage of destruction of certain lymphocytic cells of a known one HL-A group with various lymphocytotoxic antisera of tissue according to the methods listed in "Histocompatibility Testing ", 196? (Eds.Curtoni E.S. and coworkers (Munksgaard)

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beschrieben sind. Die Anpassung dieser Methode an eine Messung der Aktivität des Antigens nach Inhibitionsmethoden wird in der oben genannten Literaturstelle (3) beschrieben.are described. The adaptation of this method to a measurement of the activity of the antigen according to inhibition methods is described in the above-mentioned reference (3).

Das Serum wurde in seiner ursprünglichen Form und auch nach Absorption verwendet. Die Absorption wurde vorgenom-The serum was used in its original form and also after absorption. The absorption was carried out

men, indem 1 ml Serum mit 10 Lymphozyten von peripherem Blut von identifizierten Spendern eine Stunde bei 37°C bebrütet wurde. Das Serum wurde durch Zentrifugieren bei 500 G für 10 Minuten gewonnen.men by adding 1 ml of serum with 10 lymphocytes of peripheral Blood from identified donors was incubated at 37 ° C for one hour. The serum was centrifuged gained at 500 G for 10 minutes.

Das nicht absorbierte Serum ergab 10 negative und 3 positive Reaktionen. Nach Absorption mit den Lymphozyten eines der drei Individuen, die reagiert hatten, war das Serum inaktiv gegenüber den für die Absorption verwendeten Lymphozyten, jedoch reagierte es noch mit den beiden anderen Individuen.The unabsorbed serum gave 10 negative and 3 positive reactions. After absorption with the lymphocytes one of the three individuals who reacted, the serum was inactive to that used for absorption Lymphocytes, however, it still reacted with the other two individuals.

Das Serum zeigte ein sehr starkes Agglutinationsvermögen der Leukozyten. Dies zeigt, daß der Agglutinationstest auch erfolgreich für die Eingruppierung von Gewebe mit Hilfe von xenogenen Antisera verwendet werden kann.The serum showed a very strong agglutination capacity of the leukocytes. This shows that the agglutination test also successful for the classification of tissues using can be used by xenogenic antisera.

2) Anti-HL-A-Serum des Kaninchens2) Rabbit anti-HL-A serum

Ein Kaninchen wurde mit dem Präparat HS 15 (S.Beispiel 1) immunisiert. Die Immunisierung erfolgte nach der gleichen Methode wie bei den Ratten. Drei Injektionen von je 3 mg Antigen wurden in Abständen von 10 Tagen vorgenommen. Das Serum wurde vor und nach der Absorption durch rote menschliche Blutkörperchen der Gruppe A (HL-A 2 negativ) kontrolliert.A rabbit was treated with the preparation HS 15 (see example 1) immunized. The immunization was carried out by the same method as for the rats. Three injections of 3 mg each Antigen were made every 10 days. The serum was red before and after absorption human blood cells of group A (HL-A 2 negative) are controlled.

Das Serum reagierte mit den Leukozyten von verschiedenen Spendern vor und nach der Absorption. Sein Titer war jedoch nach der Absorption leicht erniedrigt. Auch hier wurde festgestellt, daß das Serum des Kaninchens ein sehr hohes Agglutinationsvermögen hatte.The serum reacted with the leukocytes from different donors before and after absorption. However, his titer was slightly decreased after absorption. Here, too, it was found that the serum of the rabbit was very high Had the ability to agglutinate.

Bei Kontrolle durch die Zytotoxizität gegenüber Lymphozyten von fünf verschiedenen Individuen lieferte das Serum vierWhen controlled for cytotoxicity to lymphocytes from five different individuals, the serum yielded four

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positive Ergebnisse und ein schwach positives Ergebnis.positive results and a weak positive result.

Nach Absorption mit den Lymphozyten eines Spenders reagiert das Serum nicht mit den Lymphozyten des für die Absorption verwendeten Spenders, jedoch reagiert es noch mit den Lymphozyten anderer Spender.After absorption with the lymphocytes of a donor, the serum does not react with the lymphocytes of the for absorption used donor, but it still reacts with the lymphocytes of other donors.

3) Anti-HL-A-Serum des Kaninchens3) Rabbit Anti-HL-A Serum

Drei Kaninchen wurden mit einem Präparat immunisiert, das von einem Gewebe einer identifizierten menschlichen Milz stammte (Präparat HSI, hergestellt auf die für HS 15 beschriebene V/eise). Das Serum wurde durch die Zytotoxizität bewertet.Three rabbits were immunized with a preparation obtained from tissue from an identified human spleen originated (preparation HSI, prepared in the manner described for HS 15). The serum was due to the cytotoxicity rated.

a) Vor der Immunisierung brachte es negative Ergebnisse.a) Before immunization, it gave negative results.

b) Nach der ersten Immunisierung zeigte es eine vollständig negative Reaktion und zwei sehr schwach positive Reaktionen. b) After the first immunization, it showed a completely negative reaction and two very weak positive reactions.

c) Nach der zweiten Immunisierung wurden 7 negative oder sehr schwache Reaktionen (+ oder -), 3 leicht positive Reaktionen (+) und 3 stark positive Reaktionen (++) an 13 Testindividuen beobachtet, die vorher identifiziert worden waren. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt.c) After the second immunization there were 7 negative or very weak reactions (+ or -), 3 slightly positive Responses (+) and 3 strong positive responses (++) were observed on 13 test individuals previously identified had been. The results are given in the table below.

Identifizierte Erste Immunisierung Zweite Immunisierung Individuen der KaninchenIdentified first immunization, second immunization individuals of the rabbits

5Q1 502 503 501 502. 5035Q1 502 503 501 502.503

KH - + + ♦KH - + + ♦

GK - - - - Z IGK - - - - Z I

HW - -HW - -

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VH / -VH / -

JT -JT -

AJ -AJ -

Das Kaninchenserum zeigt demzufolge verschiedene Reaktionen gegenüber Individuen des unterschiedlichen menschlichen Typs HL-A.The rabbit serum therefore shows different responses to individuals of the different human Type HL-A.

absorption

Nach der Absorption des Serums durch das zur Immunisierung verwendete ursprüngliche Präparat war das Serum völlig inaktiv geworden. Nach Absorption durch zwei verschiedene Präparate des bekannten Typs HL-A, die nur einige der Anti- " gene des ursprünglichen Präparats gemeinsam hatten, hatte die Häufigkeit der Reaktion des Serums mit den verschiedenen Spendern abgenommen.After absorption of the serum by the original preparation used for immunization, the serum was completely inactive become. After absorption by two different preparations of the known type HL-A, which only some of the anti " genes of the original preparation had in common the frequency of reaction of the serum with the different Taken from donors.

A-) Antileukämisches Serum des Kaninchens, hergestellt durch Imnunisierung mit Extrakten von leukämischen Zellen des Menschen A-) Rabbit antileukemic serum produced by immunization with extracts of human leukemic cells

Kaninchen, die mit den in der oben beschriebenen Weise hergestellten, aber aus leukämischen Zellen des Menschen erhaltenen Präparaten immunisiert worden waren, reagierten mit den Extrakten von normaler Milz zahlreicher Menschen. Dies wurde durch Doppeldiffusion in Agar bestimmt. Nach Absorption zur Unterdrückung jeder Reaktionsfähigkeit der Bestandteile λ des normalen Serums mit den zur Herstellung des löslichen Extrakts verwendeten Reagenzien, z.B. Papain, zeigten die von nicht leukämischen Zellen extrahierten löslichen Produkte kreuzweise Reaktionsfähigkeit bei der Spezifität AL-A mit dem leukämischen Extrakt. Es verblieben nur zwei Diffusionsgeraden mit Extrakten von Zellen, die vom ursprünglichen leukämischen Spender stammten. Diese Geraden wiesen das Vorhandensein von spezifischen leukämischen Antigenen auf.Rabbits immunized with the preparations prepared as described above but obtained from human leukemic cells reacted with the extracts of normal spleen from numerous humans. This was determined by double diffusion in agar. After absorption to suppress any reactivity of the components λ of the normal serum with the reagents used to prepare the soluble extract, e.g. papain, the soluble products extracted from non-leukemic cells showed cross-reactivity at the specificity AL-A with the leukemic extract. Only two diffusion lines remained with extracts of cells derived from the original leukemic donor. These lines indicated the presence of specific leukemic antigens.

Bei den bisherigen Methoden, bei denen die spezifischen Antigene der Leukämie unter Verwendung xenogener Sera, die aus ganzen Zellen oder rohen homogenisierten Produkten stammen, identifiziert werden, haben die Sera den Nachteil,In the previous methods, in which the specific antigens of leukemia using xenogenic sera, the originate from whole cells or raw homogenized products, the sera have the disadvantage

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daß sie eine Vielzahl verschiedener ungeeigneter Antikörper enthalten. Die Zahl dieser ungeeigneten Antikörper kann durch Verwendung einer gereinigten Substanz stark verringert werden·that they contain a variety of different unsuitable antibodies. The number of these unsuitable antibodies can increase can be greatly reduced by using a purified substance

Die oben genannten Ergebnisse lassen die Spezifität der in den erfindungsgemäß hergestellten Sera vorhandenen Antikörper erkennen.The above results indicate the specificity of the antibodies present in the sera produced according to the invention recognize.

Die Versuche, bei denen Sera, die gegenüber Lymphozyten eines Spenders zytotoxisch sind, mit diesen gleichen Lymphozyten absorbiert wurden, zeigen, daß diese Absorption die Sera negativ für Lymphozyten macht, die zur Absorption dienten, daß sie jedoch ihre Aktivität gegenüber anderen Lymphozyten, die anderen Individuen gehören, nicht verringert. Ebenso wurden lymphozytotoxische Sera, die nach Immunisierung mit einem löslichen Extrakt erhalten wurden, entweder durch den gleichen Extrakt oder durch andere Extrakte neutralisiert. Allein die mit dem ursprünglichen Extrakt neutralisierten Sera haben ihre Aktivität vollständig verloren. Die anderen Extrakte bewirkten lediglich eine Verringerung der Häufigkeit der Reaktionsfähigkeit der Sera mit den verschiedenen Individuen der untersuchten Gruppe.The attempts in which sera that oppose lymphocytes of a donor are cytotoxic, with these same lymphocytes absorbed, indicate that this absorption renders the sera negative for lymphocytes that were used for absorption, but that they lose their activity towards others Lymphocytes belonging to other individuals are not decreased. Likewise, lymphocytotoxic sera were found after immunization with a soluble extract, either with the same extract or with different extracts neutralized. Only the sera neutralized with the original extract have completely lost their activity. The other extracts merely reduced the frequency of the sera responsiveness with the different individuals of the group studied.

Die Erfindung zeigt somit, daß die Histokompatibilitätsantigene, wenn sie genügend gereinigt und löslich gemacht worden sind, zur Herstellung von Antisera verwendet werden können, die über die Grenzen oder Schranken der Art hinaus spezifisch sind.The invention thus shows that the histocompatibility antigens, when sufficiently purified and solubilized, they can be used to make antisera that are specific beyond the boundaries or limits of the species.

Im Rahmen der Erfindung sind zahlreiche Varianten möglich. Beispielsweise ist, wie vorstehend beschrieben wurde, eine besonders interessante Anwendung die Herstellung von Antisera für die Gewebeidentifizierung beim Menschen oder beim Tier (insbesondere bei der Maus) durch Immunisierung anderer Tierarten mit einer besseren Ausbeute und unter Vermeidung aller Schwierigkeiten, die den Immunisierungen des Menschen innewohnen. Es ist offensichtlich, daß spezifische Antisera von verschiedenen Tierarten (Kaninchen, Ratte,Numerous variants are possible within the scope of the invention. For example, as described above, is a A particularly interesting application is the production of antisera for tissue identification in humans or in Animal (especially in the mouse) by immunizing other animal species with a better yield and with avoidance of all the difficulties inherent in human immunizations. It is obvious that specific Antisera from different animal species (rabbit, rat,

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Meerschweinchen, Pferd usw.) gewonnen werden können, und daß das zur Immunisierung dienende Antigen auch zu beliebigen Tierarten (Mensch, Maus usw.) gehören kann.Guinea pig, horse, etc.) can be obtained, and that the antigen used for immunization can also belong to any animal species (human, mouse, etc.).

Es ist ferner zu bemerken, daß in der vorstehenden Beschreibung die Sera durch ihre zytotoxische Aktivität charakterisiert wurden. Man ist jedoch nicht auf diese Methode beschränkt. Es können andere Methoden angewandt werden, die die Wertbemessung von Sera ermöglichen, z.B. die bekannten Methoden der Fixierung der Bindung, Agglunitation und Immunadhärenz.It should also be noted that in the above description the sera are characterized by their cytotoxic activity became. However, one is not limited to this method. Other methods can be used that include enable the value measurement of sera, e.g. the known methods of fixation of the bond, agglunitation and Immune adherence.

Eine weitere wichtige Anwendung der Erfindung ist die Herstellung von spezifischen Antisera gegen leukämische Antigene und Tumor-Antigene durch Heteroimmunisierung. Neuere Arbeiten beweisen, daß die menschlichen leukämischen Zellen Neoantigene aufweisen, die vom Organismus nicht als "self" anerkannt werden. Mehrere Arbeiten lassen den Schluß zu, daß eine Situation vorliegt, die derjenigen bei den festen Tumoren analog ist.Another important application of the invention is the production of specific antisera against leukemic antigens and tumor antigens by heteroimmunization. Recent work shows that human leukemic cells Have neoantigens that are not recognized by the organism as "self" are recognized. Several studies lead to the conclusion that the situation is that of the solid tumors is analogous.

Die Erfindung ist somit auf leukämische Antigene oder Antigene von festen Tumoren beim Menschen anwendbar, nachdem sie isoliert und gereinigt worden sind. Die Erfindung ermöglicht die Herstellung von spezifischen antileukämischen Antisera sowie von spezifischen Antisera gegen Tumorzellen durch Immunisierung von Tieren. Der Anwendungsbereich der Erfindung ist somit sehr weit.The invention is thus applicable to leukemic antigens or solid tumor antigens in humans after they have been isolated and purified. The invention enables the production of specific antileukemic Antisera and specific antisera against tumor cells by immunizing animals. The scope of the Invention is thus very far.

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Claims

Claims £

Process for the production of Antisera, characterized in that that the recipient is a mammal with a transplant alloantigen of a mammal or a specific tumor antigen that has been solubilized, separated from high molecular weight impurities and has a molecular weight between 30,000 and 70,000, immunized and the thereby formed antiserum wins.

A method according to claim 1, characterized in that the mammalian transplant alloantigens or the specific tumor antigens have been obtained from human tissue rich in lymphocytes or cells of the type suitable as a source of the desired antigen, the antigen has been solubilized and subjected to gel filtration to obtain a purified product which has a molecular weight of about 54,000 - has 5000th

Method according to claim 1 or 2, characterized in that the purified transplantation alloantigen des Mammal or the specific tumor antigen has been obtained by reducing the size of the lymphocytic Cells reach donor tissue by suspending the cell product in a suitable liquid carrier, separating it the above liquid from the suspended pesticide by centrifugation once or several times, subsequent separation of the pesticide and the above liquid by ultracentrifugation, Solubilization of the solid substance and, if necessary, concentration of the solution obtained and separation of the high molecular weight impurities by fractionation in a gel filtration apparatus.

Method according to claim 3 »characterized in that the solubilization is carried out by the ultracentrifuge The sediment obtained is incubated with papain or another effective enzyme.

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5. The method according to claim 3 and 4, characterized in that that the antigen has been obtained from peripheral blood lymphocytes or from cells of a tissue culture.

6. The method according to claim 1 to 5 *, characterized in that that the purified substance is given to the recipient animal in the form of a solution or suspension in a non-toxic, administered physiologically harmless liquid carrier, which optionally contains an adjuvant.

7. The method according to claim 1 to 6, characterized in that the serum of the immunized animal by removal of the blood, coagulation of the blood, centrifugation and isolation of the liquid serum wins.

oils. *

Means for determining and grading tissue or see animal.

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9. Use of the antisera according to claims --- '! to 7 at the Organ transplantation to determine> tolerance from intended donors and a ^ m recipient.

10. Use of the antisera ^ rfach claims 1 to 7 as spe- ^

cifische, the Menscheja ^ according to the method of the passive Agents providing immunotherapy against leukemic antigens and tumor antigens.

11. Verwejaflung the antisera according to claims 1 to 7 as specific, diagnostic means for the »detection of leukemic antigens and cancer antigens

I,I,

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