-
-
Immunologisch-diagnostisches Verfahren sowie diagnostische
-
Mittel Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung diagnostischer
immuno-chemischer Bestimmungen, die auf dem Agglutionationsphänomen basieren sowie
entsprechende diagnostische Mittel.
-
Bei Serum-Reihenuntersuchungen sind gewöhnlich verschiedene Paramter
von Interesse, die aus der gleichen Serumprobe in verschiedenen parallelen oder
zeitlich gestaffelten Testansätzen gewonnen werden. Diese Verfahrensweise bedeutet
eine wiederholte Bearbeitung derselben Serumprobe zur Herstellung einer dem entsprechenden
Test gemäßen Verdünnung.
-
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, zwei oder mehr Parameter
durch eine geeignet Auswahl der Meßsysteme in einem Reaktionsgefäß bzw. einer Gefäßreihe
zu bestimmen.
-
Der besondere Vorteil einer solchen Methode liegt in der Vereinfachung
der Testdurchführung, der Arbeits- und Zeitersparnis und dem Ausschließen von Verwechslungen
innerhalb der Serumproben. Diese Methode ist durch die verschiedenen, im folgenden
aufgeführten erfindungsgemäßen Meßverfahren gekennzeichnet.
-
Es ist bekannt, daß Erythrozyten in Agglutinationsreaktionen mehr
oder weniger schnell sedimentieren. Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß
bei Mischungen von mit verschiedenen immunologisch bindefähigen Substanzen wie Antigenen
oder Antikörpern sensibilisierten Erythrozyten, die sich in ihren Sedimentationseigenschaften
unterscheiden, das Agglutinationsmuster der einen Reaktionskomponente nicht mit
dem der anderen Reaktionskomponente interferiert. Zu einem definierten Zeitpunkt
kann das Ergebnis des Testes der mit den schneller sedimentierenden Erythrozyten
in Mikrotiterplatten oder anderen für Hämagglutinationsreaktionen gedurchaafi' wirJ
eigneten Reaktionsgefäßen abgelesen 'werden, wobei die langsamer sedimentierenden
Erythrozyten noch homogen in der Suspension verteilt sind. Zu einem entsprechend
späteren Zeitpunkt wird dann das Agglutinationsmuster der zweiten Reaktionskomponente
sichtbar.
-
Sinngemäß gilt diese Aussage auch für die übrigen Komponenten sowie
auch für andere Trägermaterialien.
-
Für die Verwendung von Erythrozyten mit unterschiedlichen Sedimentationseigenschaften
bieten sich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die folgenden Möglichkeiten: a)
Die Absetzgechwindigkeit von Erythrozyten der verschiedenen Tierspezies ist innerhalb
bestimmter Grenzen unterschiedlich. Sie wird u.a. durch die Zellgröße und die Kernverhältnisse
bestimmt. So sedimentieren im allgemeinen zellkernhaltige Geflügelerythrozyten schneller
als die zellkernlosen Erythrozyten von Säugetieren Sensibilisiert man z.B. Hühnererythrozyten
mit einem Antigen A und Hammelerythrozyten mit einem Antigen B und gibt die Erythrozyten
nacheinander oder in Form einer Mischung zu einer geeigneten Verdünnung eines
Probandenserums,
so werden bei Abwesenheit von Antikörpern gegen das Antigen A die derart sensibilisierten
Hühnererythrozyten nicht agglutinieren sondern sich als ring- oder knopfartiges
Muster auf dem Boden des Reaktionsgefäßes ablagern, während die Hammelerythrozyten
noch suspendiert bleiben.
-
Zu einem der Absinkgeschwindigkeit entsprechenden späteren Zeitpunkt
werden bei Anwesenheit von Antikörpern gegen Antigen B die Hammelerythrozyten ein
teppichartiges, bei Abwesenheit von Antikörpern gegen Antigen B ein ring- oder knopfförmiges
Agglutinationsmuster am Gefäßboden ausbilden.
-
b) Die Absetzgeschwindigkeit von Erythozyten derselben Tierspezies
kann durch Behandlung mit verschiedenen chemischen Agenzien verändert werden. Zweckmäßigerweise
wählt man zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens solche Substanzen, von
denen bekannt ist, daß sie gleichzeitig eine Stabilisierung der Erythrozyten und
damit verbunden eine lange Haltbarkeit der Präparationen bewirken. Als Substanzen,
die diese definierten Bedingungen erfüllen, seien beispielhaft aufgeführt: reaktive
mono- und bifunktionelle Aldehyde wie Formaldehyd, Methylglyoxal, Glutardialdehyd
und substituierte Phenol-Carbonsäuren wie Sulfosalizylsäure. Man kann stattdessen
oder darüber hinaus eine zusätzliche Veränderung der Oberfläche derart stabilisierter
Erythrozyten bewirken durch Behandlung mit Substanzgruppen, die bekanntermaßen die
Sensibilisierungsfähigkeit von Erythrozyten erhöhen.
-
Als derartige Substanzen sind beispielsweise anorganische Gerbstoffe
wie 2- und 3-wertige Chromsalze zu verstehen.
-
Überraschenderweise hat sich darüber hinaus gezeigt, daß Erythrozyten
einer Tierspezies nach Behandlung mit derartigen Agenzien keine gleichsinnigen Veränderungen
in
ihren Sedimentationseigenschaften erfahren.
-
Sensibilisiert man derartig verschieden stabilisierte Erythrozyten
mit unterschiedlichen Antigenen oder Antikörpern, so ist damit eine erfindungsgemäße
Mehrfachbestimmung in einer Serumprobe möglich.
-
Unter den vorab geschilderten Bedingungen wurde erfindungsgemäß die
Bestimmung mehrerer, d.h. mindestens und in der Regel zweier immunologisch reaktiver
Komponenten in einer einzigen Probe möglich.
-
Gegenstand der Erfindung ist demnach ein immuno-chemisches Agglutinationsverfahren,
dadurch gekennzeichnet, daß eine Serumprobe gleichzeitig oder nacheinander mit mindestens
zwei Suspensionen von mit unterschiedlich immunologisch bindefähigen Substanzen
beladenen Trägerpartikeln versetzt wird und die auftretenden Agglutinationen registrtert
werden.
-
Die Erfindung ermöglicht die immuno-chemische Bestimmung von mindestens
zwei Bestandteilen einer Serumprobe in einem Agglutinationsverfahren. Dabei wird
die zu bestimmende Probe bzw. eine danach hergestellte Verdünnungsreihe gleichzeitig
oder nacheinander mit mindestens zwei Suspensionen von mit unterschiedlichen, immunologisch
bindefähigen Substanzen wie Antigenen-, Hapten- bzw. Antikörpern-beladenen Trägerpartikeln
unterschiedlichen Sedimentationsverhaltens versetzt und die auftretende Agglutination
registriert.
-
Wie ausgeführt sind als Trägerpartikel besonders Erythrozyten verschiedener
Tierspezies geeignet. Vor allem lassen sich Hühnererythrozyten einerseits und Hammelerythrozyten
andererseits verwenden, wenn zwei Bestandteile. einer Probe bestimmt werden sollen.
-
Ein Beispiel für mehrere Bestimmungen stellt folgendes System dar:~
Suspensionen
von Hühnererythrozyten und Hammelerythrozyten werden getrennt zur Stabilisierung
gemäß DOS 25 51 208 behandelt. Die Hühnererythrozyten werden mit einem Antigen von
Rubella-Viren, die Hammelerythrozyten mit einem aus Toxoplasma gondii gewonnenen
Antigen beladen.
-
Die Suspensionen der mit Rubella-Antigenen sensiblisierten Hühnererythrozyten
und der mit Toxoplasma gondii-Antigenen sensibilisierten Hammelerythrozyten werden
zu etwa gleichen Volumenteilen gemischt und für die Durchführung der immuno-chemischen
Antikörperbestimmungen nach den für Hämagglutionationsverfahren dem Fachmann geläufigen
Techniken vorbereitet. Für die Verdünnung der Erythrozyten auf eine Konzentration
von ca. 0,5 % wird vorteilhaft eine phosphatfreie wäßrige Pufferlösung verwendet,
insbesondere Trishydroxymethylaminomethan-HCl-Puffer. Die Hämagglutination wird
wie üblich in entsprechenden Gefäßen durchgeführt. Im Falle der Verwendung von Mikrotiterplatten
werden 50 ßl einer der bei der Hämagglutination üblichen Verdünnung der zu untersuchenden
Sera gefüllt. Zu jedem Ansatz werden 100 ßl der Erythrozytenmischung pipettiert.
Nach 30 bis 60 Minuten kann das Agglutinationsbild der Hühnererythrozyten, mithin
die An-bzw. Abwesenheit von Antikörpern gegen Rubella-Viren, nach 90 bis 180 Minuten
das Agglutinationsbild der Hammelerythrozyten und damit der Nachweis von Antikörpern
gegen Toxoplasma gondii aus dem gleichen Reaktionsansatz abgelesen werden. Bei positivem
Ergebnis der Reaktionen bedecken die agglutinierten Erythrozyten den Boden des Reaktionsgefäßes
mehr oder weniger gleichmäßig und vollständig. Bei negativem Ergebnis stellen sich
die Erythrozyten in Abhängigkeit von der Geometrie des Bodens des Reaktionsgefäßes
in scharf umrissenen ring- oder knopfähnlichen Formen dar.
-
Daraus ist abzuleiten, daß ein positives Reaktionsergebnis bei den
schneller sedimentierenden Partikeln eine nachfolgende Auswertung der zweiten Reaktionsstufe
erschweren kann. Für praktische Belange ist diese Einschränkung insofern ohne Bedeutung,
als mit derartigen Nachweisverfahren, die meist als Reihenuntersuchungen durchgeführt
werden aus einer Vielzahl von nicht reagierenden die wenigen positiv reagierenden
Seren ermittelt werden sollen und die Wahrscheinlichkeit einer positiven Reaktion
einer Probe in beiden Reaktionsschritten gering ist. In solchen Fällen muß gegebenenfalls
eine eingehendere Untersuchung dieser Proben nach anderen Verfahren vorgenommen
werden.
-
Bisher wurden die Versuchs ansätze zur Bestimmung eines immunologischen
Reaktanten durch Hämagglutinationsverfahren nach der Feststellung des Ergebnisses
verworfen.
-
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß einige Erythrozytenpräparationen,
welche in einem Reaktionsansatz bereits in einer positiven Reaktion agglutinierten
und dabei die bekannten teppichähnlichen Agglutinationsmuster bildeten,'nach erneutem
Homogenisieren, z.B. durch kräftiges Schütteln oder vergleichbare Maßnahmen, nicht
mehr zu Agglutinaten zusammenfinden. Vielmehr zeigen sie das negative Reaktionsbild
eines Ringes oder Knopfes.
-
Werden nun dem nach der ersten Bestimmung homogenisierten Reaktionsansatz
Erythrozyten zugegeben, die mit einer anderen immunologisch bindefähigen Substanz
wie einem Antigen oder Antikörper sensibilisert sind, so wird die Ausprägung des
entsprechenden Reaktionsbildes je nach An- bzw. Abwesenheit des korrespondierenden
Reaktionspartners erfolgen, ohne daß die Reaktion durch die knopfbildenden Erythrozyten
des vorangegangenen Ansatzes gestört wird. Überraschenderweise bleibt auch die Empfindlichkeit
gegenüber Grenzwerten unbeeinflußt.
-
Nach dem der Erfindung zugrunde liegenden Verfahren wird eine bei
Hämagglutinationsreaktionen übliche Serumverdünnung zusammen mit immunologisch bindefähigen
Partikeln in ein für Agglutinationsverfahren geeignetes Reaktionsgefäß gegeben.
Die Ausprägung des Reaktionsbildes wird abgewartet und das Ergebnis dokumentiert.
Danach wird das Sediment suspendiert und in dasselbe Reaktionsgefäß der trägergebundene
Reaktionspartner zur Bestimmung des folgenden interessierenden Parameters zugegeben
und das Ergebnis der Hämagglutination festgestellt.
-
Für die Herstellung empfindlicher und besonders haltbarer Erythrozyten-Präparationen
zum Nachweis i.mmunologisch bindeähiger Substanzen wird verschiedentlich auf die
Bedeutung einer doppelten Aldehyd-Behandlung hingewiesen. Dabei kommen zur Stabilisierung
der Erythrozyten Methylglyoxal und Formaldehyd nacheinander zur Anwendung (Hirata
et al., J. Immunol. 100, 641 (1968); DOS 24 19 230; DOS 20 25 718; DAS 18 08 435).
Die beschriebenen Verfahren erfordern einen hohen Aufwand an Arbeit und Zeit. Überraschenderweise
wurde nun gefunden, daß die alleinige Behandlung mit einem reaktiven Aldehyd, vorzugsweise
Glutardialdehyd, zu Erythrozyten vergleichbarer Stabilität und Sensitivität führt,
wenn die folgenden Kriterien beachtet werden: Zur Gewinnung von Erythrozyten wird
Blut nach dem üblichen Verfahren mit Antikoagulanzien behandelt und die Erythrozyten
nach mehreren Waschvorgängen isoliert.
-
Die Stabilisierung erfolgt üblicherweise bei einer Erythrozyten-Konzentration
von 8 - 10 8 (v/v) in gepufferten isotonischen Lösungen im Neutralbereich durch
langsame Zugabe von Glutardialdehyd bis zu einer Endkonzentration von 0,1 - 0,5
M, vorzugsweise 0,3 M und fortgesetztes Rühren für weitere 18 - 20 Stunden.
-
zur Sensibilisierung mit Antikörpern, z.B. gerichtet gegen Hepatitis
B-Antigen, verschiedene Plasmaproteine wie Myoglobin, oC, 1 1-Fetoprotein, schwangerschaftsspezifischesB1-Globulin,
Plättchenfaktor 4, um hierfür nur einige zu nennen, ferner mikrobielle Antigene
aus Toxoplasma, Gonokokken u.a., zum Nachweis der korrespondierenden Antigene sind
die folgenden Parameter von besonderer Wichtigkeit: a) Die glutardialdehyd-behandelten
Erythrozyten werden vorteilhaft in dem Zeitraum zwischen 2 und 4 Wochen nach der
Stabilisierung sensibilisiert.
-
b) Die Sensibilisierung wird mit 28-Globulin-Präparationen mit einem
hohen Anteil an spezifis.chen Antikörpern durchgeführt. Die zur Sensibilisierung
optimale Antikörpermenge wird in einem Vorversuch nach dem dem Fachmann geläufigen
Schachbrett-Titrationsverfahren ermittelt.
-
c) Als Sensibilisierungsbedingungen eigenen sich literaturbekannte
Verfahren der gemeinsamen Inkubation von Erythrozyten und Antikörpern in sauren
Pufferlösungen, vorzugsweise Acetat-Puffer, z.B. nach Walepole, Dokumenta Geigy,
Wissenschaftliche Tabellen, S. 274 ff, J. R.
-
Geigy AG, 7. Auflage 1969, in dem pH-Bereich von 3 - 6, vorzugsweise
pH 4.
-
Die nach dem beschriebenen Verfahren sensibilisierten Erythrozyten
werden durch Überführung in ein stabilisierendes Medium für lange Zeiträume in ihrer
Reaktivität konserviert. Sie können, ohne daß ein Reaktivitätsverlust eintritt gefriergetrocknet
werden.
-
Als stabilisierendes Medium eignen sich protein- oder polysaccharid-,
vorzugsweise Haemaccel (R)-haltige, in der Biochemie gebräuchliche alkalische Pufferlösungen
in einem pH-Bereich von 7,5 - 9,5, denen z.B. Natriumglutaminat
in
einer Konzentration von 0,2 - 5 %, vorzugsweise 1 % zugesetzt wird.
-
Derartig hergestellt sensibilisierte Erythrozyten werden vorteilhaft
in der folgenden beispielhaft aufgeführten Weise eingesetzt.
-
Für Hämagglutinationen übliche Verdünnungen der zu untersuchenden
Sera werden in entsprechende Reaktionsgefäße vorgelegt und mit den mit Anti-HBsAG-sensibilisierten
Erythrozyten gemischt. Die An- bzw. Abwesenheit von Australia-Antigen in den Sera
kann aufgrund der geläufigen Agglutinationsmuster nach 2 bis 3 Stunden abgelesen
werden.
-
Der Inhalb der Reaktionsgefäße wird sorgfältig homogenisiert, z.B.
durch Schütteln und den Ansätzen werden die Erythrozyten zugesetzt, die mit Treponema
pallidum-Antigen sensibilisiert sind. Nach weiteren 2 bis 3 Stunden bilden diese
dann die für An- bzw. Abwesenheit von Antikörpern gegen Treponema pallidum typischen
Agglutinationsmuster.
-
Gegenstand der Erfindungs sind schließlich diagnostische Mittel, bestehend
aus oder enthaltend Antigen- bzw.
-
Antikörper-beladene Trägerpartikel unterschiedlichen Sedimentationsverhaltens
für immunologische Agglutinationsverfahren. Derartige Mittel sind vorgemischte Einzelreagenzien
zur Durchführung der Mehrfachbestimmungen entsprechend dem beanspruchten Verfahren.
-
Als Beispiel für besonders sinnvolle Kombinationen von Untersuchungsparametern
seien die folgenden genannt, ohne daß hierdurch die Erfindung auf die aufgeführten
Indikationen beschränkt wird: In der Routineuntersuchung von Blutspendern ist die
berprüfung der Sera auf Hepatitis und Syphilis von zentraler Bedeutung. Beide Tests
sind heute als Hämagglutinations-
tests weist verbreitet und bieten
sich als Kombinationsteste im Sinne der Erfindung als vorgemischte Reagenzien oder
als Einzelreagenzien in zeitlich gestaffelten Testansätzen an.
-
Im Rahmen der Schwangerschaftsvorsorge ist eine einfache Methode zur
Efassung bestimmter Risikofaktoren wünschenswert. Solche Risikofaktoren sind beispielsweise
mit dem Nachweis der Antikörper gegen Toxoplasmen und Rubella-Viren in einem Hämagglutinations-Kombinationstest
mit dem erfindungsgemäßen Verfahren der zeitlich gestaffelten Testansätze bzw. vorgemischten
Reagenzien faßbar.
-
Die Erfindung wird an den nachstehenden Beispielen näher erläutert:
Beispiel
1: Herstellung eines vorgemischten Reagenzes zum Nachweis von Antikörpern gegen
Toxoplasma gondii und Rubella-Viren im Serum.
-
Die im folgenden beschriebenen Verfahren gelten für die Verarbeitung
von Hühnererythrozyten und Erythrozyten vom Hammel in gleicher Weise.
-
a) Stabilisierung der Erythrozyten Eine wäßrige Suspension frisch
gewonnener Hammel- bzw.
-
Hühnererythrozyten wird in dem gleichen Volumen Alseverls-Lösung
folgender Zusammensetzung suspendiert.
-
20,5 g Dextrose 8,0 g Natriumcitrat 0,55 g Citronensäure 4,2g Natriumchlorid
ad 1000 ml Aqua dest Danach werden die Erythrozyten bei ca. 2.000 g abzentrifugiert
und fünfmal in 10 Volumenteilen kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,15
M), pH-Wert 7,2 gewaschen. Nach dem Waschen werden die Erythrozyten bis zu einer
Konzentration von 8 % (v/v) in derselben phosphatgepufferten Kochsalzlösung suspendiert.
Zu einem Volumenteil der Erythrozytensuspension wird das gleiche Volumen einer 3
%igen Glutardialdehydlösung in gepufferter Kochsalz lösung tropfenweise unter langsamen
Rühren der Zellsuspension zugesetzt. Danach rührt man die Suspension ca. 17 Stunden
bei Raumtemperatur, trennt die Flüssigkeit ab, wäscht fünfmal mit gepufferter Kochsalzlösung
und resuspendiert die stabilisierten Erythrozyten in physiologischer Kochsalzlösung
zu einer Konzentration von 10 %. Die
Suspension wird durch Zugabe
von 0,1 mg/ml Natriumtimerfonat konserviert.
-
b) Sensibilisierung der Erythrozyten Ein Volumenteil der Suspension
aldehydstabilisierter Erythrozyten wird durch Zentrifugation sedimentiert und das
Sediment in den gleichen Volumen einer Mischung aus einem Teil m/15 Phosphat-Puffer,
pH 7,2 und drei Volumenteilen physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert. Die
Erythrozytensuspension wird dem gleichen Volumen einer wäßrigen Chrom-III-Chlorid-Lösung
einer Konzentration von 0,1 % zugesetzt und der Reaktionsansatz unter häufigem Schütteln
30 Minuten bei 370C inkubiert. Überschüssige Chromsalze werden durch mehrfaches
Waschen mit physiologischer Kochsalzlösung entfernt.
-
c) Sensibilisierung mit Antigenen Ein Volumenteil der derart vorbehandelten
Erythrozytensuspension wird mit einer Antigenlösung in physiologischer Kochsalzlösung
deren Konzentration in Vorversuchen nach dem in der Immunologie gebräuchlichen Schachbrettverfahren
ermittelt wurde und einem Volumenteil m/15 Phosphatpuffer, pH 6,4, gemischt und
1 Stunde bei +37"C unter häufigem Schütteln inkubiert. Der Ansatz wird sodann abzentrifugiert
und das Sediment zweimal mit einer Lösung, bestehend aus einem Volumenteil m/15
Phosphatpuffer und vier Volumenteilen physiologischer Kochsalzlösung, enthaltend
0,1 % Gummi arabicum, gewaschen. Die Erythrozyten werden in dem vierfachen Volumen
eines Tris-HCl-Puffers, pH 8,1, dem 1 % Natriumglutaminat und 20 % Kaninchenserum
zugesetzt sind, suspendiert Die.resultierende Erythrozytenkonzentration ist etwa
2,5 %.
-
In der geschilderten Weise werden die Hühnererythrozyten mit einem
Antigen aus Rubella-Viren und die Hammelerythrozyten mit einem Antigen aus Toxoplasma
gondii sensibilisiert. Die derart vorbereiteten Erythrozytensuspensionen werden
zu gleichen Volumenteilen gemischt und können ohne Reaktivitätsverlust gefriergetrocknet
werden. Die gefriergetrockneten Erythrozyten werden in dem ursprünglichen Volumen
dest. Wasser aufgenommen und zu einer Gebrauchsverdünnung von 1 : 5 (entsprechend
einer 0,5 %igen Erythrozytensuspension) mit Tris-HC1-Puffer, pH 8,1, zu einem Reagenziengemisch
verdünnt.
-
In Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (V-Form werden 50 ßl einer
1 : 5 Verdünnung eines Patientenserums pipettiert. Der Serumverdünnung werden 100
ßl des Reagenziengemisches zugegeben, der Ansatz wird geschüttelt und an einen erschütterungsfreien
Platz gestellt. Die Ablesung des Agglutinationsmusters der sedimentierenden Hühnererythrozyten,
mithin der Nachweis von Antikörpern gegen Rubella-Viren, kann nach 30 bis 60 Minuten
erfolgen.
-
Die Beurteilung des Agglutinationsmusters der mit Toxoplasma gondii-Antigenen
sensibilisierten Hammelerythrozyten, mithin der Nachweis von Antikörpern gegen Toxoplasma
gondii im Patientenserum, wird nach einer Gesamtstandzeit von 90 bis 180 Minuten
abgelesen.
-
Beispiel 2 Herstellung eines vorgemischten Reagenzes zum simultanen
Nachweis von Antikörpern gegen Treponema pallidum und Toxoplasma gondii im Serum.
-
a) Stabilisierung von Hammelerythrozyten mit Formaldehyd in 300 ml
Hammelblut werden 100 ml 3,5 %iger Citratlösung aufgefangen und noch am gleichen
Tage aufgearbeitet.
-
Die Erythrozyten werden bei 2.000 g sedimentiert und
fünfmal
in 10 Volumenteilen kalter (100C) physiologischer Kochsalz lösung gewaschen. Die
gewaschenen Erythrozyten werden in acht Volumenteilen phosphatgepufferter Kochsalzlösung,
pH 6,8, suspendiert. 1/4 des Volumens einer 14 %igen Formaldehyd-Lösung, pH 5,5,
wird in einen Dialyseschlauch gefüllt und der Dialyseschlauch wird an einem Ende
verschlossen. Die Erythrozytensuspension wird in ein Becherglas gefüllt und der
mit Formaldehydlösung gefüllte Dialyseschlauch wird in die Suspension eingehängt.
Unter leichtem Rühren oder Schütteln wird die Suspension in dem Becherglas bewegt.
-
Dabei diffundiert der Formaldehyd aus dem Dialyseschlauch in die
Erythrozytensuspension und bewirkt einen langsamen Anstieg der Formalinkonzentration.
-
Nach 3 Stunden wird der im Dialyseschlauch verbliebene Rest der Formaldehydlösung
der Erythrozytensuspension zugegeben. Die Erythrozytensuspension wird weitere 16
Stunden gerührt. Anschließend werden vorhandene Zelltrümmer durch Gazefiltration
abgetrennt. Die Erythrozyten werden fünfmal mit dem 10-fachen Volumen physiologischer
Kochsalz lösung gewaschen und anschließend in einer Lösung aus einem Volumenteil
m/15 Phosphatpuffer, pH 7,2,und 3 Volumenteilen physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert.
Zur Konservierung wird 0,01 % Natriumtimerfonat zugesetzt.
-
b) Stabilisierung von Hammelerythrozyten mit Methylglyoxal Die Behandlung
von Hammelerythrozyten mit Methylglyoxal erfolgt wie unter Beispiel 1 beschrieben.
-
c) Sensibilisierung der unterschiedlich stabilisierten Hammelerythrozyten
mit Antigenen Die Sensibilisierung der Formaldehyd-stabilisierten Hammelerythrozyten
mit einem Antigen aus Toxoplasma gondii und die Sensibilisierung der Methylglyoxal-
stabilisierten
Hamnelerythrozyten mit einem Antigen aus Treponema pallidum erfolgt nach Behandlung
mit wäßriger Chrom-III-Chlorid-Lösung wie unter Beispiel 1 b) und 1 c) beschrieben.
Die unterschiedlich stabilisierten und mit verschiedenen Antigenen sensibilisierten
Erythrozyten werden wie bereits beschrieben zu gleichen Volumenteilen gemischt und
lyophilisiert.
-
Zur Testdurchführung werden die gefriergetrockneten Erythrozyten in
dem ursprünglichen Volumen mit dest.
-
Wasser aufgenommen und zu einer Gebrauchsverdünnung (ca. 0,5 teige
Erythrozytensuspension) mit Tris-HCl-Puffer, pH 8,X, verdünnt.
-
In Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (U-Form) werden 50 ßl einer
1:10 Verdünnung eines Patientenserums pipettiert. Den Ansätzen wird 100 1 des vorgemischten
Reagenzes zugefügt und die Reaktionsgemäße werden nach Schütteln an einen erschütterungsfreien
Platz gestellt.
-
Die Beurteilung des Reaktionsverlaufes wird nach ca.
-
45 bis 60 Minuten für die Methylglyoxal-stabilisierten Hammelerythrozyten,
also zur Beurteilung des Vorliegens von Antikörpern gegen Treponema pallidum, durchgeführt.
-
Nach einer Gesamtstandzeit von 90 bis 120 Minuten ist das Reaktionsergebnis
mit den Formaldehyd-stabilisierten Hammelerythrozyten, also der Nachweis von Antikörpern
zugegen Toxoplasma gondii, zu beurteilen.
-
Beispiel 3: Herstellung von Reagenzien zum zeitlich gestaffelten Nachweis
von Australia-Antigen (HBsAg) und Antikörpern gegen Treponema pallidum aus einer
Serumprobe.
-
a) Herstellung des Reagenzes zum Nachweis von Australia-Antigen
Humanerythrozyten
werden durch Glutardialdehydbehandlung, wie unter Beispiel 1 a) beschrieben, stabilisiert.
-
Die stabilisierten Erythrozyten werden einmal mit Acetat-Puffer nach
Walpol, pH 4,2, gewaschen und im vierfachen Volumen zu einer Erythrozytenkonzentration
von 2,5 % resuspendiert. Ein Volumenteil der Erythrozytensuspension wird mit einem
Volumenteil einer Antikörperlösung gegen HBsAg, enthaltend ca. 1 ßg/ml mittels eines
Immunadsorbens gereinigte Antikörper, gemischt und ca. 3 Stunden unter häufigem
Schütteln bei +370C inkubiert. Die Sensibilisierung wird durch zweimaliges Waschen
mit physiologischer Kochsalzlösung, enthaltend 0,5 % Gummi arabicum, beendet und
die Erythrozyten anschließend im Ausgangsvolumen Tris-HGl-Puffer, pH 8,1, enthaltend
1 % Natriumglutaminat und 10 % Haemaccel r resuspendiert. Das Reagenz kann ohne
Reaktivitätsverlust lyophilisiert werden. Zur Rekonstitution wird das Reagenz im
Ursprungsvolumen dest Wasser aufgenommen und vor Gebrauch mit 1 : 10 Tris-HCl-Puffer,
pH 8,1, enthaltend 2 % Kaninchenserum, verdünnt.
-
b) Herstellung eines Reagenzes zum Nachweis von Antikörpern gegen
Treponema pallidum Die Stabilisierung von Hammelerythrozyten mit Glutardialdehyd
erfolgt wie unter Beispiel 1 a) beschrieben.
-
Die stabilisierten Zellen werden mit einem Antigen aus Treponema
pallidum sensibilisiert. Die Sensibilisierung erfolgt wie unter Beispiel 1 b) und
1 c) beschrieben.
-
c) Testdurchführung: Je 2 iil Patientenserum wird in die Vertiefungen
von Mikrotiterplatten pipettiert. Den Ansätzen werden 50 ijl der mit Anti-HBsAg
sensibilisierten Humanerythrozyten zugegeben. Die Reaktionsansätze werden geschüttelt
und an einen erschütterungsfreien Platz gestellt.
-
Die Beurteilung des Agglutinationsmusters erfolgt nach 2 Stunden Nach
Dokumentation des Versuchsergebnisses werden die Reaktionsansätze zur vollständigen
Homogenisierung der Erythrozytensuspension kräftig geschüttelt.
-
Den Reaktionsansätzen werden je 50 tjl der mit Treponema pallidum
sensibilisierten Hammelerythrozyten zugegeben.
-
Die Ansätze werden kurz geschüttelt und an einen erschütterungsfreien
Platz gestellt. Die Ablesung der Agglutinationsmuster bezüglich Antikörpernachweis
gegen Treponema pallidum erfolgt nach weiteren 3 Stunden. Die Ausprägung der Agglutinationsbilder
wird nicht durch die Humanerythrozyten des vorangegangenen Testes auf Australia-Antigen
gestört, die, in Form negativer Reaktionsbilder als scharf umrissene Knöpfe am Boden
des Reaktionsgemäßes lokalisiert sind.