DK144591B - Fremgangsmaade til fremstilling af humant carcinoembryonisk antigen (cea). - Google Patents

Description

(19) DANMARK

fv V- -j

(12) FREMLÆGGELSESSKRIFT od 144591 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 2488/71 (51) lnt.CI.3 C 07 G 7100 (22) Indleveringsdag 21 . maj 1971 // G 01 N 33/56 (24) Løbedag 21. maj 1971 (41) Aim. tilgængelig 2. dec. 1971 (44) Fremlagt 5· apr. 1982 (86) International ansøgning nr. - (86) International indleveringsdag - (85) Videreførelsesdag - (62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 1. jun. 1970, 38069, US

(71) Ansøger F. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. AKTIENGESELLSCHAFT, Postfach CH-4002 Basel, CH.

(72) Opfinder Samuel Orkin Freedman, CA: Phil Gold, CA: John Henry Kmpey, CA.

(74) Fuldmægtig Plougmann & Vlngtoft Patent bureau.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af humant carcinoembryonisk antigen (CEA).

Den neoplastiske proces hos mennesker har været og er stadig emnet for intense studier. Til opnåelse af en bedre forståelse af sygdom= men er humant cancervæv blevet studeret i et forsøg på at opdage årsagen, behandlingen, forebyggelsen og/eller diagnosen af cancer.

Tidlig cancerdiagnose er meget vigtig, idet chancerne for opnåelse af fuldstændig helbredelse af sygdommen derved stiger.

ffi I et forsøg på at anvende kendte diagnosemetoder til opdagelse af ^ cancertumorers tilstedeværelse er det forsøgt at påvise tumoranti= O) IX) gener, der er specifikke over for humane carcinomer. Disse forsøg

er tidligere ikke lykkedes med mange typer af carcinoma, idet det CT

O

t— ikke har været muligt at adskille normale vævsantigener fra unormale ^ cancerantigener og at påvise cancerantigenernes specificitet.

2 144591 I bestræbelserne på at isolere unormale cancerantigener og påvise deres specificitet er det forsøgt at forårsage dannelsen af tumor= -specifikke antistoffer og at påvise deres nærværelse i sera, der fås fra dyr, der er immuniseret med humane cancerpræparater. Hvis den er konsekvent reproducerbar, kan påvisningen af tilstedeværelsen af tumor-specifikke antistoffer i animalske antisera være et værdi= fuldt diagnostisk middel.

For helt at udnytte eksistensen af tumor-specifikke antistoffer i animalske antisera som et diagnostisk middel må der udvikles en test, som påviser tilstedeværelsen af tumorantigen i patientens blod. De fremgangsmåder, der er kendte, har ikke vist sig effektive eller følsomme i påvisningen af cancer i fordøjelsessystemet.

Blandt de humane carcinoma, som har været mest indgående studeret af forskere, er adenocarcinoma i tyktarmen og fordøjelseskanalen, da disse hører til de mest udbredte cancerformer og sædvanligvis kræver kirurgisk indgreb til definitiv diagnose, efter at en grov symptomatologi er udviklet.

Forekomsten af antigener, som er specifikke over for adenocarcino= mer i colon og fordøjelsessystemet ved immunologisk tolerance- og absorptionsteknikker er påvist, Gold et al., J. Exptl. Med. 121 439 - 462 (1965).

De tumor-specifikke antigener er tidligere blevet påvist at være til stede hos patienter, som har adenocarcinoma stammende fra for= døjelsessystemepithel afledt af embryonisk entodermalt væv, dvs. oesephagus, mavesæk, duodenom, pancreas og rectum.

Det er også tidligere påvist, at det tumor-specifikke antigen også er til stede i fordøjelsesorganer hos fostre mellem anden og sjette svangerskabsmåned, Gold. et al., J. Exptl. Med. 122 467 - 487 (1965).

Af nemhedsgrunde er antigenet derfor blevet betegnet som carcino= embryonisk antigen (også kaldet CEA) fra det humane fordøjelses= system.

3 144591

Det er fra Journ. Exp. Med. 128 (3), 1968, side 388 - 397 kendt, at CEA danner en enkelt præcipitationslinje med sit specifikke antistof i ikke-absorberet antiserum ved geldiffusionsforsøg, at det er opløseligt i perchlorsyre, at det har et spektrofoto1 2 metrisk absorptionsmaksimum ved 280 nm, og at det ved blokelektro= forese af den nedenfor beskrevne art har en karakteristisk vandrings2 længde i forhold til en given standard, men ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som beskrives nedenfor, foretages opsamlings- og kon= centreringstrinnet af de fraktioner af eluatet, som har et absorp= tionsmaksimum på 280 nm og en molekylvægt på ca. 200.000, efter chromatografien, men før elektroforesen. Ifølge den kendte teknik foretages denne behandling til sidst, dvs. efter elektroforesen.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstilles humant carci= noembryonisk antigen (CEA) ved a) homogenisering af adenocarcinomavæv fra tumorer i fordøjelses= systemepithelet afledt af embryonisk entodermalt væv, b) behandling af homogenisatet med et glycoprotein-opløsningsmiddel, c) fjernelse af bundfaldet og klaring af den resulterende opløsning, d) dialyse af den klarede opløsning, e) koncentrering af dialysatet, f) klaring af den resulterende opløsning, g) tørring af den klarede opløsning og h) oparbejdning af det vundne materiale under anvendelse af gel= chromatografi, blokelektroforese og opsamling og koncentrering af eluatfraktioner med et spektrofotometrisk absorptionsmaksimum ved 280 nm og en molekylvægt på ca. 200.000, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at nævnte oparbejdning h) består af følgende trin i den angivne rækkefølge: 1) chromatografi af det vundne materiale på to forskellige gelsøjler, af hvilke den første består af en agarosegel med ca. 4 vægtprocent agarose og en kornstørrelse på 40 - 190^u, og den anden består af en hydrofil, vanduopløselig, tværbundet dextranpolymergel, opsamling og koncentrering af de eluatfraktioner, der har et 2 spektrofotometrisk absorptionsmaksimum ved 280 nm og en molekylvægt på ca. 200.000, 4 144591 3) opløsning af de koncentrerede eluatfraktioner i en boratpuffer med en pH-værdi på 8,2 - 9,2 og en ionstyrke på 0,0125 - 0,10, 4) blokelektroforese af denne opløsning ved en spænding på 300 -500 volt og en strømstyrke på ca. 20 raA/ med ferritin som mærk= ningsstof og med en vanduopløselig, hydrofil, tværbundet dextran= polymergel med en molekylvægtudelukkelsesgrænse på . ca. 5000, en vandretentionsevne på 2,5 - 0,2 g vand/g tør gel og en partikel= størrelse på 20 - 80 mikron som elektroforesemedium og 5) opsamling af sådanne fraktioner, som, når der ved blokelektroforesen anvendes 400 volt og ca. 20 mA med en boratpuffer med en pH-værdi på 8,6 og en ionstyrke på ca. 0,05, vandrer 10 - 14 cm i anodisk retning ved blokelektroforesen på samme tid, som ferritinmærknings= stoffet vandrer 18 cm i anodisk retning.

At der ved at gå frem ifølge fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan fås et CEA-materiale, der kan radioaktivmærkes ca. 30 gange så stærkt som det kendte CEA, er yderst overraskende. Det ifølge Proc. Nat. Acad. Sci. bind 64 (1969) vundne CEA kan kun radioaktiv= mærkes til en aktivitet på 0,14yU Ci^ug, hvorimod det CEA, der kan fremstilles ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, kan radioaktivmærkes til en aktivitet på 5^u Ci^ug. Det tekniske fremskridt viser sig klart derved, at et stærkere radioaktivmærket CEA-materiale er væsentligt bedre egnet til radioimmunoforsøg og forøger dettes sensitivitet væsentligt. Følsomheden i det i den nævnte artikel beskrevne radioimmunoforsøg ligger på 2,5^ug/ml serum, hvorimod følsomheden i et radioimmunoforsøg under anvendelse af et CEA-materiale, der er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge den. foreliggende opfindelse, ligger på l,0^,ug CEA/ml serum.

Det ifølge opfindelsen anvendte elektroforesemiddel er en vanduop= løselig, hydrofil, tværbundet dextranpolymergel med en molekylvægt= + udelukkelsesgrænse på ca. 5000, en vandretentionsevne på 2,5 - 0,2 5 U4591 g H20/g tør gel, en partikelstørrelse på 20 - eo^u og et lejevolumen/= ml/g tør gel på 5. Ved blokelektroforesen opløses den aktive frak= tion i en boratpuffer med en pH-vasrdi på 8,2 - 9,2 med en ionstyrke på ca. 0,0125 - 0,10, og den anvendte spænding er ca. 300 - 500 volt, strømstyrken er ca. 20 mA, og standarden er ferritin.

For at isolere antigenet bundet til det homogeniserede tumorvæv er det nødvendigt at fraskille alt andet materiale fra homogenisatet.

Dette udføres på kendt måde ved kemiske og fysiske ekstraktions-og rensningsteknikker.

Når ekstraktions- og rensningsteknikkerne er udført, må identite= ten af den isolerede fraktion fastslås som CEA. Dette udføres ved forskellige kendte metoder, f.eks. ved dobbeltdiffusion i agargel, immunoelektroforese, hæmagglutination eller passiv cutan anafylakse.

For at kunne anvende disse metoder må specificiteten af de anvendte antistoffer for CEA påvises. Antistoffer, som opfylder dette kri= terium, kan fremstilles ved immunologiske tolerance- eller absorp= tionsteknikker.

Ved absorptionsteknikken absorberes antitumorantiserum fra normalt væv for at fjerne antinormale komponenter i antiserummet. Til= bageblivende antistofaktivitet i det absorberede antiserum, som er rettet mod tumormaterialet, betegnes derpå som tumorspecifikt. Denne fremgangsmåde er ikke fejlfri, idet der består den mulighed, at tumorspecifikke antistoffer kan være fjernet eller inaktiveret af normale vævskomponenter, som ligner, men dog ikke er identiske med tumorantigenerne, som oprindeligt forårsagede antistofdannelsen.

Ved den immunologiske toleranceteknik gøres nyfødte dyr immunologisk tolerante over for normalt væv. De tolerante dyr immuniseres derpå med tumorpræparater fra samme donorarter. Hvor der kan iagttages en tilsvarende undertrykkelse af immunreaktionen mod normale vævsbe= standdele, er der opnået udvikling af for tumoren tilsyneladende specifikke antistoffer. Ved studium af humancancer giver denne teknik mulighed for fejlfortolkning, idet det normale væv og tumorvævet stammer fra forskellige donorer. Når der anvendes vævsekstrakter, er dette problem dog ikke signifikant, da alle ekstrakter i det væ= sentlige er ens.

6 144591

Der kan anvendes tumorvæv fra colonadenocarcinoma og normalt colonvæv fra samme individ, da en coloncarcinom i almindelighed praktisk taget aldrig breder sig submukøst mere end 6 - 7 cm på hver side af en synlig tumor.

Tumorvævet fra en colonadenocarcinom og normalt colonvæv fra samme individ holdes adskilt, men behandles på samme måde. Tævet males, suspenderes i en puffer og homogeniseres derefter. Fra homogenisatet fjernes derpå faste dele. Der foretrækkes centrifugering eller fil= trering gennem stadig mindre filteråbninger. Derved fjernes alle partikler, som er større end 0,22^u, og hvori alle bakterier findes.

Den ovenstående væske eller filtratet steriliseres derefter til sikring mod bakterieforurening.

Som før nævnt kan CEA isoleres og renses ud fra primært eller meta= staseret adenocarcinomvæv fra fordøjelsessystemepithelet, som er afledt af embryonalt entodermalt væv. CEA kan også fremstilles ud fra embryonale fordøjelsesorganer fra fostre i anden til syvende svangerskabsmåned ved isolering og rensning. Den nedenstående beskrivelse er rettet på ekstraktion af cancervæv, men metoden kan dog også anvendes på embryonalt væv.

Homogeniseret CEA-holdigt væv, som enten er embryonalt væv fra for= døjelsesorganer fra fostre i første og andet trimester eller adenocar= cinomavæv fra tumorer i fordøjelsessystemepithelet, ekstraheres med et glycoprotein-opløsningsmiddel, i hvilket CEA kan opløses.

Dette er nødvendigt, idet de præcipiterbare normale proteiner og forstyrrende antigeniske materialer dermed kan adskilles fra CEA= -materialet. Egnede glycoprotein-opløsningsmidler er f.eks. perchlor= syre, trichloreddikesyre eller phosphorwolframsyre, fortrinsvis perchlorsyre, da denne syre er let tilgængelig og let at anvende.

Det CEA-holdige væv homogeniseres hensigtsmæssigt med en til solu= bilisering af den totale tilstedeværende mængde CEA tilstrækkelig mængde vand. I almindelighed er en mængde på ca. 2 liter vand pr. kilogram væv tilstrækkelig. Der kan anvendes mere vand, men det er almindeligvis ikke nødvendigt.

7 Må 591

Egnede temperaturer ved tilsætningen af glycoprotein-opløsningsmiddel til vævshomogenisatet er stuetemperatur og derunder. Der arbejdes fortrinsvis ved stuetemperatur, dvs. ved 20 - 25°C. Temperaturen i glycoprotein-opløsningsmidlet, som sættes til vævshomogenisatet, kan ligeledes variere; også her anvendes fortrinsvis stuetemperatur. Almindeligvis foretrækkes en koncentreret syre som glycoproteinopløs= ningsmiddel, fortrinsvis i en koncentration på 0,5 - 2N, især 2N.

Til homogenisatet sættes hensigtsmæssigt i løbet af 10 - 30 minutter den omtrentlige samme volumenmængde opløsningsmiddel. En langsommere tilsætning kan føre til tab af antigenaktiviteten.

Der fås et bundfald, der ved en sædvanlig metode, f.eks. centrifuge= ring eller filtrering, kan fraskilles fra den ovenstående væske, som indeholder det opløste CEA.

Til yderligere rensning fjernes lavmolekylære stoffer, f.eks. per= chlorsyre, eller salte, f.eks. natriumchlorid. Selv om det er muligt at udføre denne rensning ved udfældning af de tilbageblivende proteiner, har dialyse mod vand gennem en semipermeabel membran vist sig at være egnet. Dialysen er en kritisk del af fremgangs= måden, idet alle diffusionsdygtige opløselige stoffer med undtagelse af stoffer med højere molekylvægt, hvortil også CEA-fraktionen hører, fjernes herved. Dialysen kan foretages først med ledningsvand i 24 -48 timer og derpå med koldt destilleret vand ved temperaturer mellem ca. 4 og ca. 10°C. Det er dog også muligt kun at anvende destilleret vand forudsat at temperaturen holdes lavt, og at vandet skiftes re= gelmæssigt. Dialysetrinnet kræver i alt ca. 48 - 96 timer.

Den uklare opløsning, der er tilbage efter dialysen, koncentreres. Hertil vælges frysetørring, skønt der også kan anvendes andre metoder til fjernelse af vand, f.eks. forstøvningstørring. Enhver almindelig frysetørringsteknik kan anvendes. Den foretrukne metode består i, at materialet først fryses i skaller og derpå lyofiliseres, hvad der i alt tager ca. 32 - 36 timer til opnåelse af fuldstændig tørhed. Ved en foretrukken udførelsesform afbrydes lyofiliseringen dog efter 24 - 30 timers forløb, således at produktet ikke er helt tørt. Da dette fremgangsmådetrin ikke er kritisk ved den eventuelle isolering af rent CEA, foretrækkes det, da der derved spares tid.

8 144591

Det delvis lyofiliserede materiale kan. derpå optøs ved stuetem= peratur eller højere temperatur, f.eks. 37°C. Det kan også optøs ved fortynding med en meget ringe mængde vand. Derpå kan de tilbage= værende dele fjernes. Hvis volumenet holdes på et minimum, kan klaringen foretages ved filtrering og/eller centrifugering. Alle dele, som ikke kan passere et 0,22^u-filter (dvs. svarende til de mindste bakteriers størrelse), fjernes således fra opløsningen, som klares og renses derved.

Den foretrukne fremgangsmåde er 15 - 45 minutters centrifugering med høj hastighed, dvs. med ca. 12.000 - 30.000 omdrejninger/minut, for= trinsvis ca. 14.000 omdrejninger/minut, ved temperaturer op til ca. 10°0, fortrinsvis 4 - 10°C. Der kan anvendes højere tempaaturer, men det er dog ikke hensigtsmæssigt, idet sedimentationen herved . forsinkes. Efter centrifugeringen er det nødvendigt igen at klare den ovenstående opløsning og at sterilisere denne. Dette kan fore= tages ved filtrering gennem et filter med aftagende porestørrelse som tilbageholder i det væsentlige alt fast stof og bakterier. Pore= størrelsen varierer mellem 1,2 og 0,20^u. En foretrukken udførelses=· form går ud på, at opløsningen i trin f) klares ved ultracentrifu= gering med 12.000 - 16.000 omdrejninger/minut, og derefter foretages filtreringen gennem filtre med successivt fra l,2^u til 0,20^u aftagende porestørrelse, f.eks. gennem filtre med porestørrelse på 1,2/U, 0,45/U, og 0,22/U i den anførte rækkefølge.

Det vundne materiale oparbejdes derefter i trin h) under anvendelse af gelchromatografi, blokelektroforese og opsamling og koncentrering af eluatfraktioner med et spektrofotometrisk absorptionsmaksimum ved 280 nm og en molekylvægt på ca. 200.000. Det har nu vist sig, at når de CEA-holdige fraktioner vinderkastes elektroforese ved pH-værdi 8,6 i en boratpuffer med en ionstyrke på 0,05, fås et karakteristisk vandringsbillede, længden af den tilbagelagte vej afhænger af strømstyrken, af spændingen, af pufferen, af dens pH-værdi og dens ionstyrke. Ved en spænding på 400 volt og en strømstyrke på 20 mA vandrer CEA ca. 10 - 14 cm i anodisk ret= ning, medens ferritin (et farvet protein) som sammenligningsstof på samme tid vandrer 18 cm fra katodeenden i anodisk retning. Der kan også anvendes andre sammenligningsstoffer, men så skal elektrofore= sebetingelserne ændres, og vandringen af CEA og sammenligningsstoffet skal sammenlignes.

9 146591

Ifølge opfindelsen består oparbejdningstrinnet h) i de ovenfor, i den nævnte rækkefølge udførte trin. På den først anvendte agarose= gelsøjle adskilles den CEA-holdige fraktion fra materiale med højere og lavere molekylvægt og kolloide partikler. På den anden søjle med tværbundet dextrangel, som har en højere adskillelsesevne end den første søjle, fraskilles endnu tilstedeværende materiale med højere eller lavere molekylvægt end CEA.

Agarosegel er den neutrale del af agar. Der anvendes et gelmateriale fra firma AB Pharmacia, Uppsala (Sverige), som forhandles under vare= mærket "Sepharose". Gelerne fås som vandige suspensioner i 0,02%'s natriumazid som beskyttelsesmiddel. Gelstrukturen skyldes hydrogen= bindingen. Gelen fremstilles i leje-form med en udvalgt partikel= størrelse og bestemt agaroseindhold. Agarosekoncentrationen i gelen bestemmer dens fraktioneringsområde.

Gelerne til anvendelse ifølge opfindelsen har en kornstørrelse på ca. 40 - 190^,u og indeholder 4 vægtprocent agarose. Disse som "Sepharose 4B" betegnede materialer har en fraktioneringsbredde på 3 x 10^ - 3 x 10^. "Sepharose 4B" foretrækkes, da der med disse kan isoleres den CEA-holdige fraktion fra forbindelser med højere eller lavere molekylvægt, ligesom også kolloide bestanddele fra= skilles.

Den anden søjle indeholder en hydrofil, vanduopløselig tværbun= det dextranpolymergel. Dette materiale og fremgangsmåden til fremstilling deraf er beskrevet i britisk patentbeskrivelse nr.

854.715. Et sådant materiale forhandles af firma AB Pharmacia,

Uppsala (Sverige), under navnet "Sephadex". Det indeholder et tre= dimensionalt net af dextranstoffer bundet eller tværbundet, og som absorberer vand under kvældning. Gelmaterialets evne til at optage vand er omvendt proportional med tværbindingsgraden i dextranstoffet i gelmaterialet. Gelmaterialet kan fås i flere for= skellige grader, som er forskellige med hensyn til porøsitet. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes en gel med en tilnærmelsesvis udelukkelsesgrænse på 200.000, en vandretentionsevne på 20 - 2,0 g HgO/g tør gel, en kornstørrelse på 40 - 120yu og et gellejevolumen på 30 - 40 ml/g tør gel. Denne gel bærer betegnelsen "Sephadex G-200".

"Sephadex G-200" anvendes til yderligere rensning af den CEA-holdige fraktion. Da Sephadex G-200-søjlen har en større 144591 adskillelsesevne i molekylvægtområdet fra 150.000 til 250.000 opnås en yderligere adskillelse af CEA fra materialer med større og mindre molekylvægt. Denne anden søjle kan kun anvendes, når de kolloide dele er fjernet af den første søjle, da disse dele ellers tilstopper Sephadex-søjlen og gør den uvirksom. Søjlechromatografien ud= føres på følgende måde: Det lyofiliserede materiale opløses i en vandig puffer ved pH-værdien for det isoelektriske punkt for CEA, dvs. ved pH-værdi 4»5. Opløsningen hældes på den første søjle. De samlede aktive fraktioner af eluatet dialyseres som før beskrevet, lyofiliseres til fjernelse af salte, opløses igen i en vandig puffer ved den pH-værdi, hvor CEA er elektrisk neutralt, og opløsningen hældes på den anden søjle. De aktive fraktioner dia= lyseres endnu en gang og lyofiliseres. Der arbejdes ved CEA's iso= elektriske punkt for at mindske vekselvirkningen mellem antigenet og søjlerne og påfølgende forurening med fremmede stoffer i de aktive fraktioner. Skønt alle sædvanlige vandige puffere kan anvendes, foretrækkes det at anvende en 0,9$*s phosphatpufret saltopløsning. Fordelen ved anvendelsen af lavere temperaturer, dvs. temperaturer på ca. 4 - 10°C, ligger i, at der dermed opnås en forbedret opløs= ningsevne. De fra den anden søjle opsamlede fraktioner har en mole= kylvægt på 200.000 og et absorptionsmaksimum ved 280 nm målt på et UY-absorbtionsmeter. Fraktionerne fra den første kolonne er udtaget ef= ter samme kriterier, men indeholder dog materialer med molekylvægte så lave som 70.000 og så høje som 200.000.

De aktive fraktioner fra den anden kolonne underkastes elektroforese for yderligere at skille CEA-materialet fra urenheder. Dette ud= føres ved at opløse den aktive fraktion, som tidligere er koncentreret, i en boratpuffer med en pH-værdi på ca. 8,2 - 9,2 og en ion= styrke på ca. 0,0125 - 0,10. Selv om der kan anvendes en hvilkensom helst vandig boratpuffer med disse egenskaber, foretrækkes det at anvende en puffer, som forøger mobiliteten af den aktive fraktion, dvs. en boratpuffer med en pH-værdi på ca. 8,6 og en ionstyrke på ca. 0,05. Det er disse egenskaber, som gør CEA-materialets vandring magen til den foretrukne anvendte sammenligningsforbindelse, dvs. ferritin.

Den anvendte strømstyrke og den anvendte spænding bestemmer sepera= tionsgraden af molekylerne i fraktionen. I blokelektroforesen 11 144591 anvendes 300 - 500 volt, fortrinsvis 400 volt, med en strømstyrke på ca. 20 mA.

Det anvendte materiale i blokelektroforese skal bære det materiale, som undersøges, og lede elektriciteten, når det imprægneres med en puffer. Ifølge opfindelsen anvendes en tværbundet dextrangel, f.eks. "Sephadex® G-25, fin", som har en omtrentlig molekylvægt= udelukkelsesgrænse på 5000, en vandretentionsevne (g H90/g tørgel) o + ^ på 2,5 - 0,2, en partikelstørrelse på 20 - 80^u og et gellejevolumen på 5 ml/g tørgel. Den kvældes i pufferen og anbringes på en ikke-ledende blok, f.eks. "Lucite".

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anbringes gelen med den samme puffer, som den aktive fraktion er opløst i, på blokken, hvorefter papirkontakterne anbringes på gelen. Blokken ækvilibreres derefter i samme puffer i et elektroforeseapparat under operationsbetingel= ser. Efter endt ækvilibrering fjernes en strimmel af gelen og blandes med den pufrede lyofiliserede CEA-fraktion fra den anden kolonne. Den resulterende opslæmning hældes derefter ud på blokken på samme sted, hvorfra strimlen var fjernet, fortrinsvis i midten af blokken. Ferritin, et jernholdigt protein, anbringes ved katode= enden i blokken. Efter udførelse af elektroforesen i et bestemt tids= rum, i dette tilfælde ca. 24 timer, fjernes arealet indeholdende CEA-aktivitet, dvs. 10 - 14 cm i anodisk retning fra startzonen. Dette areal fjernes kun, hvis mærknings standarden har fjernet sig en bestemt afstand, i dette tilfælde 18 cm i anodisk retning. CEA-åktiviteten elueres under sugning igennem et éngangs 0,20^u celluloseacetatfil= ter og isoleres, fortrinsvis ved dialyse imod destilleret vand til fjernelse af det ved elueringen anvendte salt. Derved fås et materiale, som i det væsentlige er rent CEA. Dette fastslås enten ved præcip itininhibering eller direkte Ouchterlony-afprøvning imod uabsorberet tumorantiserum. En enkelt præcipitationslinje viser ren CEA-aktivitet.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler: 12 144591

Eksempel 1.--Isolering af CEA-fraktionen.

Oer udskæres tumorvæv af en adenocarcinoma i colon og fjernes mest muligt normalt væv. Det resterende tumorvæv køres gennem en kød= hakkemaskine og lagres i 1000 g’s portioner ved -20°C. 1000 g af det sønderdelte væv suspenderes med destilleret vand til et total= volumen på 4.000 ml og homogeniseres i 1 time i en vandkølet homoge= nisator ved 15.000 omdrejninger/minut. Under stadig omrøring tilsættes ved 4°C langsomt et lige så stort volumen 2N perchlorsyre, hvor= efter blandingen omrøres i 50 minutter ved stuetemperatur og een= trifugeres i 30 minutter ved 4°C ved 6.000 omdrejninger pr. minut i en afkølet centrifuge (6 x 250 ml fastvinkelrotor). Den ovenstående væske fjernes og hældes i en flad, ca. 7,6 cm bred dialyseslange, der forinden var neddyppet i 1 time i destilleret vand for at blive smidiggjort. Der dialyseres i 48 timer mod koldt ledningsvand og i yderligere 48 timer mod store mængder destilleret vand ved 4°C, som stadig udskiftes. Den dialyserede remanens anbringes i rundbundede kolber, 1500 ml pr. kolbe, fryses til skaller i et methanol-tøris= -bad og lyofiliseres i en 8-liters lyofilisator. Netop før fuldstæn= dig lyofilisering (24 - 30 timer) fjernes kolberne, og den næsten tørre rå ekstrakt smeltes, hvorefter den vundne opløsning centrifugeres i en afkølet centrifuge (8 x 30 ml fastvinkelrotor) med 14.000 omdrej= ninger/minut ved 4°C i 30 minutter. Den ovenstående væske fraskilles og filtreres gennem "Millipore" membranfiltre med porestørrelser på l,2yu, 0,45/U og 0,22^/u efter hinanden. Den klarede opløsning fryses i skaller og lyofiliseres til tørhed.

1.5 g af det tørrede rå ekstrakt opløses i 50 ml 0,05M NaH2P0-puffer (pH-værdi 4,5) i normal saltopløsning. Phosphatpufferen med pH-værdi 4.5 anvendes.som elueringsmiddel ved alle de efterfølgende søjle= chromatografier. Prøven hældes derpå over en søjle (Pharmacia K 100/100 (100 cm x 10 cm) med en lejelængde på 89 cm) med "Sepharose 4B". Temperaturen holdes på 4 - 5°C ved hjælp af recirkulerende køle= χ3 144531 middel. Opløsningen pumpes opad med en hastighed på 150 ml/time med en kontinuerligt virkende pumpe (LKB "Varioperpex 1200" peristaltisk pumpe). Der opsamles (i et opsamlingsorgan, LKB "Ultrorac 7000") 25 ml’s fraktioner, hvis absorptioner ved 280 nm måles på UV-absorp= tionsmeter. Efter en eluatmængde på 4,750 ml fremkommer de aktive fraktioner. Gennemløbet tager ca. 47 timer. De aktive fraktioner (750 ml) sammenhældes, dialyseres i 48 timer ved 4°C mod destilleret vand, fryses i skaller og lyofiliseres.

200 mg af det vundne tørrede materiale fra "Sepharose 4-B"-søjlen opløses derpå i 10 ml af standardpufferen og chromatograferes på "Sephadex G-200". (Søjle: Pharmacia K 50/100 (100 cm x 10 cm) med en lejelængde på 90 cm). Temperaturen holdes på 4°C med recirkulerende kølemiddel. Ted en gennemstrømningshastighed på 40 ml/time i opad= gående retning (med en konstant virkende pumpe (LKB "Perpex 10200" peristallisk pumpe)) samles fraktioner på 10 ml, som konstant måles 1 et spektrofotometer ved 280 nm. Gennemløbet tager i alt 30 timer. Efter 820 ml eluatmængde fremkommer de aktive fraktioner (190 ml), som sammenhældes, dialyseres i 48 timer ved 4°C mod store mængder destilleret vand, fryses i skaller og lyofiliseres.

Eksempel 2.

Rensning af den isolerede CEA-holdige fraktion ved blokelektroforese.

Blokelektroforesematerialet "Sephadex G-25", fint, kvældes i vand i 2 timer ved 80°C, vaskes ved dekantering med boratpuffer (pH-værdi 8,6; ionstyrke 0,05) og filtreres derpå igennem en sintret glasplade ved anvendelse af vakuum.

En gelopslæmning fordeles ligeligt i et lag på 1 cm på en "lucit"-blok= bærer (mål 61 cm x 7,5 cm x 1 cm), og overfladen behandles med en vat= tot, til den er fast, men ikke helt tør. Blokken forsynes derpå med chromatografipapirkontakter (3 mm) (Whatman), som alle er indstillet i papirets strømretning, hvorefter blokken ækvilibreres i 1 time under driftsbetingelserne (400 V og ca. 20 mA) ved 4°C. Pra midten af blokken

Claims (1)

14 144591 fjernes derpå en strimmel på 1 cm, hvorefter materialet blandes godt med 60 mg tørt CEA fra eksempel 1, som først er opløst i en mindst mulig mængde (ca. 0,5 ml) 0,05M boratopløsning. Den resul= terende grød tilbagehældes i midterstrimmelen. Derpå dryppes 1-2 dråber af en ferritinopløsning (omkrystalliseret seks gange; koncen= tration 100 mg/ml) på katodeenden af blokken, hvorefter elektro= foresen startes. Efter 24 timers forløb har ferritin-standarden bevæget sig ca. 18 cm i anodisk retning. Efter afsluttet elektro= forese udsnittes strimler på 2 cm af blokken imellem startzonen og anodeenden, og de elueres med 2M NaCl-opløsning, som har passeret en 0,20yU éngangs gittermembran ("Nalgene")· Aktiviteten lokaliseres i en afstand på 10 - 14 cm fra startzonen i anodisk retning; en svagere aktivitet kan påvises i en afstand på 8 - 10 cm fra start= zonen. Hver aktiv strimmel elueres, og eluatet dialyseres i en 3 cm*s dia= lyseslange mod mange gange udskiftede store rumfang destilleret vand ved 4°C»i 48 timer. Dialysatet fryses i skaller og frysetørres. Det tørrede, rensede CEA lagres under reduceret tryk over calcium= chlorid ved' 4°C. Produktet har følgende karakteristiske egenskaber: Det danner en enkelt præcipitationslinje med ikke-absorberet anti= serum ved geldiffusionsafprøvning; det er opløseligt i perchlor= syre; vandrer ved blokelektroforese i anodisk retning 10 - 14 cm, medens en ferritin-standard samtidig vandrer 18 cm i anodisk retning (boratpuffer med pH-værdi 8,6 og en ionstyrke på 0,05, spænding 400 7, strømstyrke 20 mA). Endvidere har produktet en molekylvægt på 200.000 og et spektrofotometrisk absorptionsmaksimum ved 280 nm. Patentkrav. Fremgangsmåde til fremstilling af humant carcinoembryonisk antigen (CEA) ved a) homogenisering af adenocarcinomavæv fra tumorer i fordøjelses= . systemepithelet afledt af embryonisk entodermalt væv, b) behandling af homogenisatet med et glycoprotein-opløsningsmiddel, c) fjernelse af bundfaldet og klaring af den resulterende opløsning, d) dialyse af den klarede opløsning, e) koncentrering af dialysatet, f) klaring af den resulterende opløsning, g) tørring af den klarede opløsning og