JPH0788397B2 - 組織由来腫瘍増殖阻害物質 - Google Patents

組織由来腫瘍増殖阻害物質

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JPH0788397B2
JPH0788397B2 JP61089844A JP8984486A JPH0788397B2 JP H0788397 B2 JPH0788397 B2 JP H0788397B2 JP 61089844 A JP61089844 A JP 61089844A JP 8984486 A JP8984486 A JP 8984486A JP H0788397 B2 JPH0788397 B2 JP H0788397B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 Bichel〔Bichel,Nature231;449−450（1971）〕は、腫
瘍増殖平衡時期に腹水腫瘍担持マウスから多くの腫瘍を
切除すると残りの腫瘍細胞が著しく増殖すると報告して
いる。十分に進行した腹水腫瘍を担持したマウスから得
た無細胞腹水を増殖性腹水腫瘍を有するマウスに注入す
ると、腹水細胞の増殖が著しく抑制された。Bichel（同
上）は、進行した腫瘍を有するマウスと早期腫瘍を有す
るマウスの２匹のマウスを外科的に結合した〔併体結合
（parabiotic）〕マウスでは、早期腫瘍の増殖が著しく
抑制されることも知見している。これらの知見に基い
て、併体結合マウスの腹膜中を循環し、十分に進行した
腹水腫瘍により産生される無細胞腹水中に存在する分散
可能な抑制因子（diffusible inhibitory principle）
の存在を仮定した〔Bichel,Europ.J.Cancer６:291−296
（1970）およびBichel（同上）〕。この抑制因子の性質
は明らかにされていなかつたが、腹水腫瘍の増殖率は腫
瘍組織の量に依存し、産生される抑制因子の量によつて
決定されると推測された。
腫瘍増殖抑制活性を有する物質についても記載されてい
る〔Holleyら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:5989（1980）
およびHolleyら,Cell Biol.Int,Reports７:525−526（1
983）〕。これらの刊行物には、アフリカミドリザルBSC
−１細胞から単離した増殖抑制物質がBSC−１細胞，ヒ
ト乳癌細胞および正常ヒト乳細胞の増殖を抑制した旨の
報告がある。最近この物質がＢ−TGF〔Assoianら,J.Bio
l.Chem.258:7155−7160（1983）〕と呼称される25000ダ
ルトンの２本鎖ヒト血小板由来ポリペプチドと同一もし
くは極めて近似していることが判明した〔Tuckerら,Sci
ence226:705−707（1984）;Robertsら,Proc.Nat.Acad.S
ci.82（Jan）:119−123（1985）〕。またMc Mahonら
は、ラツト肝から非悪性ラツト肝細胞の増殖を抑制する
が悪性ラツト肝細胞の増殖を抑制しない26000ダルトン
の物質を取り出した〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA79,456−
460（1982）〕。他の増殖抑制物質は培養雛（chick）脊
髄細胞中で同定された〔Kagenら,Experimental Neurolo
gy58:347−360（1970）;Harringtonら,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA77:423−427（1980）およびSteckら,J.Cell Bio
l.83:562−575（1979）〕。
Iwataら〔J.Cellular Biochem.Suppl.５:401（1982）〕
は、増殖刺激および増殖抑制活性を検定するためのマイ
クロ力価プレートシステムについて記載している。Toda
roら〔Todaroら,Tumor Cell Heterogeneity;Origins an
d Implications,Bristol−Myers Cancer Symposia,Volu
me4,Owens,A.H.,Coffey,D.S.およびBaylin,S.B.編（Aca
demic Press,1982）,pp.205−224〕およびIwataら〔Fe
d.Proc.Fed.AM.Soc.Exp.Biol.42:1833（1983）〕は、培
養中に増殖したヒト腫瘍細胞の組織細胞液から腫瘍抑制
活性を単離したと報告した。これらの報告中に記載され
た知見は予備的であり、詳細ではない。
1984年４月20日付で米国特許商標局に出願された（U.S.
Serial NNo.602,520）共同発明者としてKenenth K.Iwat
aが含まれている特許出願（発明の名称“Substantially
Purified Tumor Growth Inhibitory Factor（TI
F）”）は、培養中に増殖したヒト腫瘍細胞中に存在、
由来する余り特定されていない物質の予備同定に関す
る。前記物質は、既に報告された〔Todaroら,Tumor Cel
l Heterogeneity;Origins and Implications,Bristol−
Myers Cancer Symposia,Vol.4,Owens,A.H.,D.S.,および
Baylin,S.B.編（Academic Press,1982）,pp.205−224;I
wataら,Fed.Proc.Fed.Am、Soc.Exp.Biol.42:1833（198
3）〕腫瘍抑制活性に類似している。
Todaro〔Todaro,G.J.,Epigenetic Regulation of Cance
r,Terry Fox Cancer Research Conference（カナダ，バ
ンクーバー，ブリテツシユ・コロンビア大学）Abs.13
（1984）〕は最近、腫瘍細胞増殖抑制作用を有し夫々70
および90個のアミノ酸残基から構成される２個の因子を
報告した。これらの因子のソース即ち種の細胞、組織タ
イプ或いは因子の精製方法についての開示はなかつた。
発明の要旨 本発明は、複数の酸性ポリペプチドから成るヒト組織由
来の酸性化エタノール抽出物に関し、前記ポリペプチド
の各々は約20000ダルトン未満の分子量を有しており、
正常なヒト包皮フイブロブラストの成長を刺激しながら
ヒト腫瘍細胞および樹立ミンク肺細胞系（CCL64）の増
殖を抑制する性質を有する。ヒト腫瘍細胞増殖に対する
抑制活性は、酸性化エタノール抽出物の温度を約３分間
約100℃に上げても、或いは酢酸を添加してもこわれ
ず、約23℃よりむしろ約４℃で酸性化エタノール抽出物
を作成したときの方が抑制活性は高い。
本発明はまた、実質的に全ての血液、全ての細胞外可溶
性成分および実質的に全ての細胞内可溶性成分が除去す
べく処理されたヒト臍帯から誘導された酸性化エタノー
ル抽出物に関する。前記抽出物は、非還元条件下で約30
000ダルトン未満の見かけ分子量を有しており、正常な
ヒト包皮フイブロブラストの成長を刺激しながらヒト腫
瘍細胞および樹立ミンク肺細胞系（CCL64）の増殖を抑
制する性質を有する。ヒト腫瘍細胞増殖の抑制活性は、
酸性化エタノール抽出物の温度を約100℃に約３分間上
げても、また酸性化エタノール抽出物が酢酸中最高約1.
0モルまで酢酸を添加してもこわれない。
本発明はまた、複数の酸性ポリペプチドから成るヒト組
織例えばヒト臍帯あるいはヒト胎盤から誘導された酸性
化エタノール抽出物の製造方法に関し、前記ポリペプチ
ドの各々は約20000ダルトン未満の分子量を有してお
り、正常なヒト包皮フイブロブラストの成長を刺激しな
がらヒト腫瘍細胞および樹立ミンク肺細胞系（CCL64）
の増殖を抑制する性質を有する。前記方法は、適当な条
件下で、組織を処理して溶解細胞（lysed cell）および
細胞由来の溶解（solubilized）タンパク質を産生し、
溶解タンパク質を回収し、溶解タンパク質から見かけ分
子量約20000ダルトン未満のポリペプチドを別個に回収
し、こうして回収されたポリペプチドを検定してヒト腫
瘍細胞の増殖を抑制するか、樹立ミンク肺細胞系（CCL6
4）の増殖を抑制するか、或いは正常なヒト包皮線維芽
細胞の成長を促進するポリペプチドを同定し、こうして
同定されたポリペプチドを含む酸化性エタノール抽出物
を回収することから成る。
本発明はまた、約20000〜30000ダルトンの見かけ分子量
を有しており、正常なヒト包皮フイブロブラストの成長
を刺激しながらヒト腫瘍細胞および樹立ミンク肺細胞系
（CCL64）の増殖を抑制する性質を有する組織由来増殖
阻害物質（tissue−derived growth inhibitor,TGI）か
ら成るヒト臍帯からの酸性化エタノール抽出物の製造方
法に関する。前記方法は、適当な条件下で、臍帯組織か
ら静脈および動脈を除去し、組織を洗浄して痕跡血液を
全て取り除き、組織を処理して溶解細胞を産生、細胞由
来の可溶性タンパク質を除去し、酸性化エタノール抽出
によつて分解細胞から残りのタンパク質を溶解、単離さ
せて溶解タンパク質を産生し、溶解タンパク質から見か
け分子量約20000〜30000ダルトンのTGIを別個に回収
し、こうして別個に回収されたTGIを検定してヒト腫瘍
細胞の増殖を抑制し、樹立ミンク肺細胞系（CCL64）の
増殖を抑制し正常なヒト包皮フイブロブラストの成長を
促進する活性を同定し、こうして同定されたTGIを含む
酸性化エノール抽出物を回収することから成る。
本発明はまた、約5000〜16000ダルトンの見かけ分子量
を有しており、ヒト腫瘍細胞および樹立ミンク肺細胞系
（CCL64）の増殖を抑制するが正常なヒト包皮フイブロ
ブラストの成長を抑制しない性質を有する少なくとも１
個のポリペプチドから成り組織由来増殖阻害物質−１
（TGI−１）と呼称される物質を提供する。前記物質
は、 ａ）約26−36％のアセトニトリルで0.05％トリフルオロ
酢酸含有アセトニトリルの直線勾配を用いて酸性化エタ
ノール抽出物を高性能液体クロマトグラフイーにかけた
とき規定された活性として回収可能であり、約17−23％
の２−プロパノールで0.05％トリフルオロ酢酸含有２−
プロパノールの直線勾配を用いて酸性化したエタノール
抽出物を高性能液体クロマトグラフイーにかけたとき規
定された活性として回収可能であり、 ｂ）0.05％トリフルオロ酢酸含有２−プロパノールの直
線勾配を用いて高性能液体クロマトグラフイーにかけた
とき、約26％２−エタノールで溶出され優先的にヒト腫
瘍細胞の増殖を抑制するが樹立ミンク肺細胞系（CCL6
4）の増殖は抑制しない活性と約23％２−エタノールで
溶出され優先的に樹立ミンク肺細胞系（CCL64）の増殖
を抑制するがヒト腫瘍細胞の増殖を抑制しない活性の２
個の活性に分離されうる。本発明は更にTGI−１の製造
方法も提供する。
本発明はまた約20000〜30000ダルトンの見かけ分子量を
有しており、正常なヒト包皮フイブロブラストの成長を
抑制しないがヒト腫瘍細胞および樹立ミンク肺細胞系
（CCL64）の増殖を抑制する性質を有する少なくとも１
個のポリペプチドから成り組織由来増殖阻害物質（TG
I）と呼称される物質を提供する。前記物質は、約28−3
4％のアセトニトリルで0.05％トリフルオロ酢酸含有ア
セトニトリルの直線勾配を用いて酸性化エタノール抽出
物を高性能液体クロマトグラフイーにかけたとき規定さ
れた活性として回収可能であり、約0.6−0.7M NaClでNa
Clの直線勾配を用いて陽イオン交換樹脂にかけたとき規
定された活性を有するシングルピークとして溶離されう
る。
本発明はまた、約5000〜16000ダルトンの見かけ分子量
を有しており、正常なヒト包皮フイブロブラストの成長
を抑制しないがヒト腫瘍細胞および樹立ミンク肺細胞系
（CCL64）の増殖を抑制する性質を有する少なくとも１
個のポリペプチドから成り組織由来増殖抑制因子−２
（TGI−２）と呼称される物質を提供する。前記物質
は、約35−39％のアセトニトリルで0.05％トリフルオロ
酢酸含有アセトニトリルの直線勾配を用いて酸性化エタ
ノール抽出物を高性能液体クロマトグラフイーにかけた
とき規定された活性として回収可能であり、約23−27％
の２−プロパノールで0.05％トリフルオロ酢酸含有２−
プロパノールの直線勾配を用いて酸性化したエタノール
抽出物を高性能液体クロマトグラフイーにかけたとき規
定された活性として回収可能である。本発明は更にTGI
−２の製造方法も提供する。
更に、本発明は、CM−I,CM−II,CM−IIIおよびCM−IVと
呼称されるポリペプチドの不均一集合体（population）
を提供する。前記ポリペプチドの各々は、ヒト腫瘍細胞
の増殖を実質的に抑制する性質を有し、CM−Ｉを除き樹
立ミンク肺細胞系（CCL64）の増殖を実質的に抑制する
作用を有し、何れのペプチドも正常なヒト包皮フイブロ
ブラストの成長を抑制しない。前記集合体は酸性化エタ
ノール抽出物を陽イオン交換クロマトグラフイーにかけ
ることにより回収可能である。本発明は、CM−I,CM−I
I,CM−IIIおよびCM−IVと呼称されるポリペプチドの不
均一集合体の製造方法をも提供する。
有効量の抽出物TGI−1,TGI,TGI−２あるいはCM−I,CM−
II,CM−IIIおよびCM−IVと呼称されるポリペプチドの不
均一集合体と適当な薬学的キヤリアを含む薬剤組成物が
提供され、前記組成物と細胞を接触させることによつて
ヒト腫瘍細胞の増殖を抑制するための方法が提供され
る。組成物は火傷の治瘍、創傷の治癒にも使用される。
本発明はまた、腫瘍の存在を検出する方法にも関する。
前記方法は、検体サンプル中に存在するTGI−1,TGIもし
くはTGI−２の量或いはCM−I,CM−II,CM−IIIもしくはC
M−IVと呼称されるポリペプチドの不均一集合体の量を
定量的に測定し、こうして得られた測定量と正常な検体
サンプル中に存在する量とを比較することから成り、量
に有意差があれば腫瘍が存在することが示される。更
に、本発明は、検体サンプル中に存在する形質転換増殖
因子アルフア（TGF−α）の量とTGI−1,TGIもしくはTGI
−２の量或いはCM−I,CM−II,CM−IIIもしくはCM−IVと
呼称されるポリペプチドの不均一集合体の量とを別個に
定量的に測定し、損雑するTGF−αの量に対するサンプ
ル中のTGI−1,TGI,TGI−２あるいは不均一集合体の量の
比率を測定し、正常な検体サンプルの対照比率を測定
し、正常検体の比率と検体の比率とを比較することから
成り、比率に有意な変動があれば腫瘍の存在が示唆され
るものである、腫瘍の検出方法にも係る。
最後に、本発明は、腫瘍担持検体からのサンプルについ
てサンプル中の１種もしくはそれ以上のTGI−1,TGI,TGI
−2,CM−I,CM−II,CM−IIIおよびCM−IVの存在を測定す
ることから成り、それ等の特定な組合せの存在の有無、
或いはそれ等の特定量もしくは相対量の存在が特定の腫
瘍の型の指標となる腫瘍型の決定方法に関する。
以下、図面についての説明をする。
第１図 ゲル過クロマトグラフイ（23℃） 第１図はヒトの臍帯の粗酸性エタノール抽出物の23℃に
於けるゲル過クロマトグラフイの溶出パターンであ
る。1.0M酢酸1.50ml中の酸性エタノール抽出物2gをバイ
オ−ゲル（Bio−Gel）P10を含む14×100cmカラム（アミ
コン（Amicon）；＃86012）にかけ、7ml/分の流速で溶
出した。Ｃ型コレクシヨンラツク（LKB）装備のスーパ
ーラツク（Super Rac（LKB2211）で１ずつのフラクシ
ヨンを回収した。各フラクシヨン（１／各フラクシヨ
ン）から1mlをとり12×75mmの滅菌スナツプトツプチユ
ーブ（フアルコン（Falcon）2058）に移した。TGI活性
は物質及び方法の欄に記載した方法で測定した。A549ヒ
ト肺ガン細胞の阻害効果は白い三角で、ミンク肺細胞
（CCL64）のそれは白丸で表示されている。最大吸収ス
ケールレンジが1.0AUFSのユビコードＳ（UvicoodS）（L
KB2138）と１チヤンネルチヤート記録計（LKB2210）
（チヤート速度1mm/分）を使用して280nmの吸収（−）
を測定した。
第２図 ゲル過クロマトグラフイ（４℃） 第２図はヒトの臍帯の粗酸性エタノール抽出物の４℃に
於けるゲル過クロマトグラフイの溶出パターンであ
る。1.0M酢酸150ml中の酸性エタノール抽出物2gをバイ
オ−ゲル（Bio−Gel）P10を含む14×100cmカラム（アミ
コン（Amicon）；＃86012）にかけ、7ml/分の流速で溶
出した。Ｃ型コレクシヨンラツク（LKB）装備のスーパ
ーラツク（Super Rac）（LKB2211）で１ずつのフラク
シヨンを回収した。各フラクシヨン（１／各フラクシ
ヨン）から1mlをとり12×75mmの滅菌スナツプトツプチ
ユーブ（フアルコン（Falcon）1058）に移した。TGI活
性は物質及び方法の欄に記載した方法で測定した。A549
ヒト肺ガン細胞の阻害効果は白い三角で、ミンク肺細胞
（CCL64）のそれは白丸で表示されている。最大吸収ス
ケールレンジが1.0AUFSのユビコードＳ（UvicordS）（L
KB2138）と１チヤンネルチヤート記録計（LKB2210）
（チヤート速度1mm/分）を使用して280nmの吸収（−）
を測定した。
第３図 ゲル過クロマトグラフイ（４℃）のフラクシ
ヨンによる細胞増殖阻害及び正常ヒト細胞刺激 第３図はヒトの臍帯の粗酸化性エタノール抽出物の４℃
に於けるゲル過クロマトグラフイの溶出パターンであ
る。1.0M酢酸150ml中の酸性エタノール抽出物をバイオ
−ゲル（Bio−Gel）P10を含む14×100cmカラム（アミコ
ン（Amicon）；＃86012）にかけ、7ml/分の流速で溶出
した。Ｃ型コレクシヨンラツク（LKB）装備のスーパー
ラツク（Super Rac）（LKB2211）で１ずつのフラクシ
ヨンを回収した。各フラクシヨン（１／各フラクシヨ
ン）から1mlをとり12×75mmの滅菌スナツプトツプチユ
ーブ（フアルコン（Falcon）2058）に移した。TGI活性
は物質及び方法の欄に記載した方法で測定した。A549ヒ
ト肺ガン細胞の阻害効果は白い三角で、ミンク肺細胞
（CCL64）のそれは白丸で表示されている。正常ヒトフ
イブロブラストの刺激は白い四角で示す。最大吸収スケ
ールレンジが1.0AUFSのユビコードＳ（UvicordS）（LKB
2138）と１チヤンネルチヤート記録計（LKB2210）（チ
ヤート速度1mm/分）を使用して280nmの吸収（−）を測
定した。
第４図 ゲル過クロマトグラフイからの活性フラクシ
ヨンの逆相高速液体クロマトグラフイ（HPLC） ヒト臍帯の酸性化エタノール抽出物（タンパク質65.8m
g）のバイオ−ゲルP10によるゲル過クロマトグラフイ
に於けるフラクシヨン４を凍結乾燥し、0.05％のトリフ
ルオロ酢酸（TFA）10ml中に再懸濁させた。フラクシヨ
ン４は280nmに於ける吸収の主ピーク後の最初のフラク
シヨンであつた（第２図参照）。この試料をベツクマン
テーブルトツプ遠心機（Beckman TJ−６）にかけ3000rp
mで20分間遠心して不溶物質を除去した。2mlの試料ルー
プ付ウオーターズ（Water′ｓ）U6K注入装置を用いて上
記の上清（supernatant）を三回に分けて注入した。次
いで試料をｕボンダパツク（uBONPAPAK）C18カラム（0.
78×30cm）（ウオーターズ＃84176）にかけた。流速は2
ml/minであり、ウオーターズUV測定器（Waters Model48
1）を用いて感度2.0AUFSにて206nm（−）で溶出をモニ
ターした。0.05％TFA含有アセトニトリルの0.25％から
の直線濃度勾配（30分間）、次いで0.05％TFA含有アセ
トニトリルの25〜45％直線濃度勾配（240分間）、そし
て0.05％TFA含有アセトニトリルの45〜100％直線濃度勾
配（30分間）によつて溶出を実施した。スーパーラツク
（LKB2211）を用いて12mlずつのフラクシヨンに回収し
た。各フラクシヨンから1mlを牛血清アルブミン（シグ
マＢ）50μｇ及び1.0M酢酸50μを含むポリスチレンチ
ユーブ（フアルコン2058）（12×75mm）に移し、TGI活
性を物質及び方法に記載した如くアツセイした。A549ヒ
ト肺ガン細胞阻害を白い三角でミンク肺細胞（CCL64）
のそれを白丸で表示する。溶媒勾配は点線（−−−−
−）で示す。
第５図 高速液体クロマトグラフイ（HPLC）からのTGI
活性プール（TGI−１）のHPLCによるリクロマトグラフ
イ 第４図のHPLCクロマトグラフイに於いて28〜34％アセト
ニトリルにて溶出されたTGI活性のプールフラクシヨン
（1.5mg）（フラクシヨン13−22）を凍結乾燥し、0.05
％のトリフルオロ酢酸（TFA）2ml中に再懸濁させた。こ
の試料をベツクマンテーブルトツプ遠心機（Backman TJ
−６）にかけ3000rpmで20分間遠心し不溶物質を除去し
た。2mlの試料ループ付ウオーターズ（Water′ｓ）U6K
注入装置を用いて上記の上清（supernatant）を二回に
分けて注入した。次いで試料をｕボンダパツク（uBONPA
PAK）C18カラム（0.39×30cm）（ウオーターズ＃2732
4）にかけた。流速は1ml/minであり、ウオーターズUV測
定器（Waters Model481）を用いて感度2.0AUFSにて206n
m（−）で溶出をモニターした。0.05％TFA含有２−プロ
パノールの０−15％直線濃度勾配（20分間）、次いで0.
05％TFA含有２−プロパノールの15〜35％直線濃度勾配
（120分間）によつて溶出を実施した。スーパーラツク
（LKB2211）を用いて4mlずつのフラクシヨンに回収し
た。各フラクシヨンから1mlを牛血清アルブミン（シグ
マＡ−6003）50μｇ及び1.0M酢酸50μを含むポリスチ
レンチユーブ（フアルコン2058）（12×75mm）に移し、
TGI活性を物質及び方法に記載した如くアツセイした。A
549ヒト肺ガン細胞阻害を白い三角で、ミンク肺細胞（C
CL64）のそれを白丸で表示する。溶媒勾配は点線（−−
−−）で示す。
第６図 高速液体クロマトグラフイ（HPLC）からのTGI
活性プール（TGI−２）の逆相HPLCによるリクロマトグ
ラフイ 第４図のHPLCクロマトグラフイに於いて35〜39％アセト
ニトリルにて溶出されたTGI活性のプールフラクシヨン
（0.8mg）（フラクシヨン25〜31）を凍結乾燥し、0.05
％のトリフルオロ酢酸（TFA）2ml中に再懸濁させた。こ
の試料をベツクマンテーブルトツプ遠心機（Beckman TJ
−６）にかけ3000rpmで30分間遠心し不溶物質を除去し
た。2mlの試料ループ付ウオーターズ（Water′ｓ）U6K
注入装置を用いて上記の上清（supernatant）を二回に
分けて注入した。次いで試料をｕボンダパツク（uBONPA
PAK）C18カラム（0.39×30cm）（ウオーターズ＃2732
4）にかけた。流速は1ml/minであり、ウオーターズUV測
定器（Waters Model481）を用いて感度1.0AUFSにて206n
m（−）で溶出をモニターした。0.05％TFA含有２−プロ
パノールの0.15％からの直線濃度勾配（20分間）、次い
で0.05％TFA含有２−プロパノールの15−35％直線濃度
勾配（120分間）によつて溶出を実施した。スーパーラ
ツク（LKB2211）を用いて4mlずつのフラクシヨンに回収
した。各フラクシヨンから1mlを牛血清アルブミン（シ
グマＡ−6003）50μｇ及び1.0M酢酸50μを含むポリス
チレンチユーブ（フアルコン2058）（12×75mm）に移
し、TGI活性を物質及び方法に記載した如くアツセイし
た。A549ヒト肺ガン細胞阻害を白い三角でミンク肺細胞
（CCL64）のそれを白丸で表示する。溶媒勾配は点線
（−−−−）で示す。
第７図 ゲル過クロマトグラフイからの活性フラクシ
ヨンの逆相高速液体クロマトグラフイ（HPLC） ヒト臍帯の酸性化エタノール抽出物のバイオ−ゲルP10
によるゲル過クロマトグラフイに於けるフラクシヨン
５を凍結乾燥し、0.05％のトリフルオロ酢酸（TFA）4ml
中に再懸濁させた。フラクシヨン５は280nmに於ける吸
収の主ピーク後の二番目のフラクシヨンであつた（第２
図参照）。この試料をベツクマンテーブルトツプ遠心機
（Beckman TJ−６）にかけ3000rpmで20分間遠心し不溶
物質を除去した。2mlの試料ループ付ウオーターズ（Wat
er′ｓ）U6K注入装置を用いて上記の上清（supernatan
t）を二回に分けて注入した。次いで試料（1.3ml総量）
をｕボンダパツク（uBONDAPAK）C18カラム（0.78×30c
m）（ウオーターズ＃84176）にかけた。流速は2ml/min
であり、ウオーターズUV測定器（Waters Model481）を
用いて感度2.0AUFSにて206nm（−）で溶出をモニターし
た。0.05％TFA含有アセトニトリルの0.25％からの直線
濃度勾配（30分間）、次いで0.05％TFA含有アセトニト
リルの25〜45％直線濃度勾配（240分間）、そして0.05
％TFA含有アセトニトリルの45〜100％直線濃度勾配（30
分間）によつて溶出を実施した。スーパーラツク（LKB2
211）を用いて12mlずつのフラクシヨンに回収した。各
フラクシヨンから1mlを牛血清アルブミン（シグマA600
3）50μｇ及び1.0M酢酸50μを含むポリスチレンチユ
ーブ（フアルコン2058）（12×87mm）に移し、TGI活性
を物質及び方法に記載した如くアツセイした。A549ヒト
肺ガン細胞阻害を白い三角で、ミンク肺細胞（CCL64）
のそれを白丸で表示する。溶媒勾配は点線（−−−−）
で示す。
第８図 高速液体クロマトグラフイ（HPLC）からのTGI
活性プール（TGI−１）の逆相HPLCリクロマトグラフイ 第７図の29−34％アセトニトリルにて溶出されたTGI活
性のプールフラクシヨン（1.1mg）（フラクシヨン14−2
5）を凍結乾燥し、0.05％のトリフルオロ酢酸（TFA）2m
l中に再懸濁させた。この試料をベツクマンテーブルト
ツプ遠心機（Beckman TJ−６）にかけ3000rpmで20分間
遠心し不溶物質を除去した。2mlの試料ループ付ウオー
ターズ（Water′ｓ）U6K注入装置を用いて上記の上清
（1.6ml）（supernatant）を二回に分けて注入した。次
いで試料をｕボンダパツク（uBONDAPAK）C18カラム（0.
78×30cm）（ウオーターズ＃84174）にかけた。流速は1
ml/minであり、ウオーターズUV測定器（Waters Model48
1）を用いて感度1.0AUFSにて206nm（−）で溶出をモニ
ターした。0.05％TFA含有２−プロパノールの０−10％
の直線濃度勾配（20分間）次いで0.05％TFA含有２−プ
ロパノールの10−35％直線濃度勾配（220分間）、そし
て0.05％TFA含有２−プロパノールの35〜45％直線濃度
勾配（20分間）及び0.05％TFA含有２−プロパノールの4
5〜100％直線濃度勾配（20分間）によつて溶出を実施し
た。スーパーラツク（LKB2211）を用いて8mlずつのフラ
クシヨンに回収した。各フラクシヨンから1mlを牛血清
アルブミン（シグマ6003）50μｇ及び1.0M酢酸50μを
含むポリスチレンチユーブ（フアルコン2058）（12×75
mm）に移し、TGI活性を前記の如くアツセイした。A549
ヒト肺ガン細胞阻害を白い三角で、ミンク肺細胞（CCL6
4）のそれを白丸で表示する。溶媒勾配は点線（−−−
−）で示す。
第９図 ヒト臍帯抽出物の陽イオン交換クロマトグラフ
イ CM−TRISACRYLを等量の0.1M酢酸アンモニウム,pH4.0
（1.0M NaCl含有）に再懸濁した。この樹脂を３時間平
衡化させ４℃にて脱気した。この樹脂20mlを1.6×40cm
カラム（フアルマシア（Pharmacia）；＃19−0362−0
1）に詰めて２カラム容量の1.0M酢酸アンモニウム、pH
4.0次いで0.01Mの酢酸アンモニウムで洗浄した。溶出液
の電導率及びpHが平衡化バツフア（0.01M酢酸アンモニ
ウム、pH4.0）のそれと等しくなるまでカラムを洗浄し
た。ヒト臍帯の酸性化エタノール抽出物1gを1.0M酢酸50
ml中に再懸濁させ、カラム平衡化バツフアに対して、pH
及び電導率がバツフアのものに等しくなるまで４℃で透
析した。この透析した酸性化エタノール抽出物を４℃に
て流1ml/分でカラムにかけ、カラムを平衡化バツフア
で、280nmに於ける吸収（−）が最低値を示すまで洗浄
した（吸収はユビコードＳ（LKB2138）、感度1.0AUFSに
てモニターした）。次に、グラジエントミキサー（フア
ルマシアGM−1,＃19−0495−01）を用いて0.01−1.0M酢
酸アンモニウム,pH4.0の上昇直線モル濃度勾配（200m
l）をかけた。勾配の終了時に、更に30mlの1.0M酢酸ア
ンモニウム,pH4.0をカラム流した。2mlずつのフラクシ
ヨンをスーパーラツクフラクシヨンコレクター（LKB221
1）を使用して12×100mmポリスチレンチユーブ（コロン
ビアダイアグノステイクス（Columbia Diagnostics）Ｂ
−2564）中に回収した。各フラクシヨンから1mlを50μ
ｇ牛血清アルブミン（シグマA6003）及び1.0M酢酸50μ
を含む12×75mmチユーブ（フアルコン2058）に移し
た。これを凍結乾燥し物質及び方法の欄に記載の方法に
よつてTGI活性をアツセイした。A549ヒト肺ガン細胞の
阻害効果を白い三角でミンク肺細胞（CCL64）の阻害を
白丸で表示する。塩勾配は点線（−−−）で示す。
第10図 陽イオン交換クロマトグラフイからプールした
フラクシヨンのリクロマトグラフイ CM−TRISACRYLを第９図の説明中に述べたように調製し
た。CM III及びCM IVを含むフラクシヨンからの材料を
プールし凍結乾燥して1.0M酢酸50ml中に再懸濁させ、カ
ラム平衡化バツフアに対して、pH及び電導率がバツフア
のものに等しくなるまで４℃で透析した。この試料を４
℃にて流速1ml/分でカラムにかけ、カラムを120mlの平
衡化バツフアで洗浄した。ユビコードＳ（LKB2138）、
感度1.0AUFSにて280nmの吸収（−）をモニターした。次
に、グラジエントミキサー（フアルマシアGM−1,＃19−
0495−01）を用いて0.01−1.0M酢酸アンモニウム、pH4.
0の上昇直線モル濃度勾配（100ml）をかけた。勾配の終
了時に、更に30mlの1.0M酢酸アンモニウム,pH4.0をカラ
ムに流した。2mlずつのフラクシヨンをスーパーラツク
フラクシヨンコレクター（LKB2211）を使用して12×100
mmポリスチレンチユーブ（コロンビアダイアグノステイ
クスＢ−2564）中に回収した。各フラクシヨンから1ml
を50μｇ牛血清アルブミン（シグマA6003）及び1.0M酢
酸50μを含む12×75mmチユーブ（フアルコン2058）に
移した。これを凍結乾燥し物質及び方法の欄に記載の方
法によつてTGI活性をアツセイした。A549ヒト肺ガン細
胞の阻害を白い三角で、ミンク肺細胞（CCL64）の阻害
を白丸で表示する。塩勾配は点線（−−−）で示す。
第11図 陽イオン交換クロマトグラフイ（４℃）による
TGIの分別 実験の第二部に記載したように調製されたタンパク質抽
出物1.65mgを20mM酢酸アンモニウム（pH4.5）に対して
徹底的に透析し、20mM酢酸アンモニウム（pH4.5）で予
め平衡化されたCM−TRISACRYLの5mlカラム（１×6.3c
m）にかけ1.65mlずつのフラクシヨン（12×100mmポリス
チレンチユーブ）に回収した。試料添加後に、1cm光路
石英キユベツトを用いてバウシユ・アンド・ローム（Ba
usch and Lomb）1001分光光度計により測定された280nm
に於ける吸収がベースライン値（0.003より小）に戻る
まで、カラムを20mM酢酸アンモニウムpH4.5で洗浄し
た。直線塩勾配（20mM酢酸アンモニウム,pH4.5中で０−
1.0M NaCl）をかけ、上記のようにして1.65mlずつのフ
ラクシヨンの280nmの吸収を測定した。各フラクシヨン
から10μを50μｇ牛血清アルブミン（シグマA6003）
及び1.0M酢酸50μを含む12×75mmチユーブに移し、凍
結乾燥し、物質及び方法の欄に記載された方法に従つて
A549ヒト肺ガン細胞に対する阻害活性（▽…▽）アツセ
イを行つた。適当な試料を水で100倍に希釈したものの
電導率にNaCl勾配（−−−）を測定した（YSIモデル32
電導率測定計）。
第12図 陰イオン交換クロマトグラフイ（４℃）による
TGIの分別 実験の第二部に記載したように、調製されたタンパク質
1.65mgを20mM Tris−HCl（pH8.0）に対して徹底的に透
析し3,000gで15分間遠心にかけ透明にした。樹脂をまず
1.0M NaCl含有20mM Tris−HCl（pH8.0）中で３時間、次
いで0.5M Tris−HCl（pH8.0）中で１時間懸濁させてDEA
E−TRISACRYLを調製した。沈降した樹脂をブフナー漏斗
上で1000mlの水で洗浄し、最後に20mM Tris−HCl（pH8.
0）中に再懸濁させ脱気し5mlカラム（１×6.3cm）に注
ぎ、樹脂を20mM Tris−HCl（pH8.0）で平衡化した。透
明になつた試料をカラムにかけ、280nmに於ける吸収
（−），ミンク肺細胞（○…○）に対する阻害活性及び
NaCl勾配（−−−）を第11図及び物質及び方法に於いて
記載したように測定した。NaCl勾配は20mM Tirs−HCl
（pH8.0）中で０から1.0M NaClの範囲で実施した。
第13図 陽イオン交換クロマトグラフイ（４℃）による
TGIの分別 CM−TRISACRYLを最終平衡化バツフアが20mM酢酸アンモ
ニウム,pH4.5であること以外は第９図の説明に於いて記
載した如く調製した。前述のように調製したタンパク質
抽出物（9.9mg）を20mM酢酸アンモニウム（pH4.5）に対
して徹底的に透析し、20mM酢酸アンモニウム（pH4.5）
中のCM−TRISACRYLの15mlカラム（1.5×8.5cm）にかけ
た。280nmに於ける吸収（−）及びA549ヒト肺ガン細胞
に対する阻害活性（▽…▽…▽）を第11図の説明に於い
て記載した如く測定した。NaClの０〜1.0Mの直線勾配の
容量は150mlでありフラクシヨン容量は3.7mlであつた。
第14図 陽イオン交換クロマトグラフイからの活性フラ
クシヨンの逆相高速液体クロマトグラフイ（HPLC） ヒト臍帯のCM−TRISACRYLを用いた陽イオン交換クロマ
トグラフイ（第13図参照）のフラクシヨン59〜78を集
め、それを凍結乾燥し、0.05％のトリフルオロ酢酸（TF
A）10ml中に再懸濁させた。2mlの試料ループ付ウオータ
ーズ（Water′ｓ）U6K注入装置を用いて240μｇのタン
パク質を含む透析物質の総計20％を三回に分けて注入し
た。次いで試料をuBONDAPAKC18カラム（0.39×30cm）
（ウオーターズ27324）にかけた。流速は1ml/minであ
り、ウオーターズUV測定器（Waters Model481）を用い
て感度0.5AUFSにて206nm（−）で溶出をモニターした。
0.05％TFA含有アセトニトリルの０−25％の増加直線濃
度勾配（５分間）、次いで0.05％TFA含有アセトニトリ
ルの25〜45％直線濃度勾配（15分間），そして0.05％TF
A含有アセトニトリルの45〜80％直線濃度勾配（15分
間）、最後に0.05％TFA含有アセトニトリル80−100％直
線濃度勾配（５分間）によつて溶出を実施した。スーパ
ーラツク（LKB2211）を用いて1mlずつのフラクシヨンに
回収した。各フラクシヨンから500μを牛血清アルブ
ミン（シグマA0281）50μｇ及び1.0M酢酸50μを含む
ポリスチレンチユーブ（フアルコン2058）（12×75mm）
に移し、TGI活性を物質及び方法に記載した如くアツセ
イした。A549ヒト肺ガン細胞阻害を白い三角で、ミンク
肺細胞（CCL64）のそれを白丸で表示する。溶媒勾配は
点線（−−−−）で示す。
発明の詳細な説明 複数のポリペプチドを含むヒト組織由来の酸性化エタノ
ール抽出物を調製した。この抽出物の各ポリペプチドは
分子量約20,000ダルトン未満であり、各々は、正常ヒト
包皮フイブロブラストの増殖を亢進させるが、ヒト腫瘍
細胞と樹立ミンク肺細胞系（CCL64）との増殖を阻害す
る特性をもつ。酸性化エタノール抽出物を約100℃に加
熱し約３分間維持しても、又は、抽出物に約1.0モル濃
度までの酢酸を添加しても、ヒト腫瘍細胞増殖の阻害活
性は破壊されない。酸性化エタノール抽出物を約23℃で
なく約４℃で調製すると該抽出物の阻害活性が増進され
る。好適具体例によればヒト組織はヒト臍帯であるが、
ヒト胎盤の如き別の組織の使用も勿論可能である。
また、実質的に血液全部と細胞外可溶性成分全部と細胞
内可溶性成分全部とを除去すべく処理したヒト臍帯か
ら、少なくとも１つの酸性ポリペプチドを含む酸性化エ
タノール抽出物を調製した。このポリペプチドは非還元
性条件下で約30,000ダルトン未満の見掛け分子量を示
し、正常ヒト包皮フイブロブラストの増殖を亢進させる
がヒト腫瘍細胞と樹立ミンク肺細胞系（CCL64）との増
殖を阻害する特性をもつ。酸性化エタノール抽出物を約
100℃に加熱し約３分間維持しても酸性化エタノール抽
出物に約1.0モル濃度までの酢酸を添加してもヒト腫瘍
細胞増殖の阻害活性は破壊されない。
酸性化エタノール抽出物の種々の成分を調製するには、
当業者に公知の技術、例えば、高性能液体クロマトグラ
フイー及びカチオン交換クロマトグラフイーを使用する
とよい。これにより、ヒト腫瘍細胞と樹立ミンク肺細胞
系（CCL64）とに対する増殖阻害性をもちヒト包皮フイ
ブロブラストの増殖を阻害しない見掛け分子量約5,000
〜16,000ダルトンの少なくとも１つのポリペプチドを含
む物質が調製される。この物質は、組織由来増殖阻害物
質（TGI−１）と指称され、酸性化エタノール抽出物の
高性能液体クロマトグラフイーによつて回収できる。即
ち、0.05％のトリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリ
ルの約26〜34％アセトニトリル直線勾配、及び、0.05％
トリフルオロ酢酸を含有する２−プロパノールの約17〜
23％２−プロパノール直線勾配で酸性化エタノール抽出
物を高性能液体クロマトグラフイーにかけると、所定活
性として回収できる。TGI−１を更に、0.05％トリフル
オロ酢酸を含む２−プロパノール直線勾配の高性能液体
クロマトグラフイーで溶出させると２つの活性成分に分
割される。１つの活性は約26％２−プロパノールで溶出
されヒト腫瘍細胞の増殖を優先的に阻害するが樹立ミン
ク肺細胞系（CCL64）の増殖を阻害しない。もう１つの
活性は約23％２−プロパノールで溶出され樹立ミンク肺
細胞系（CCL64）の増殖を優先的に阻害するがヒト腫瘍
細胞の増殖を阻害しない。
また、組織由来増殖阻害物質（TGI）と指称され、少な
くとも１つのポリペプチドから成りこのポリペプチドが
同じく正常ヒト包皮フイブロブラストの増殖を阻害しな
いがヒト腫瘍細胞と樹立ミンク肺細胞系（CCL64）とに
対する増殖阻害性をもつ別の物質が調製される。TGIの
見掛け分子量は約20,000〜30,000ダルトンの範囲であ
り、0.05％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの
約28〜34％アセトニトリル直線勾配の高性能液体クラマ
トグラフイーによつて酸性化エタノール抽出物から所定
活性として回収され、また約0.6〜0.7M NaClのNaCl直線
勾配を溶出するとカチオン交換樹脂後えばCM−トリスア
クリル（TRYSACRYL）樹脂から単一ピークの所定活性と
して回収される。
更に、組織由来増殖阻害物質−２（TGI−２）と指称さ
れる物質が得られる。この物質は、ヒト腫瘍細胞と樹立
ミンク肺細胞系（CCL64）とに対する増殖阻害性を有す
るが正常ヒト包皮フイブロブラストの増殖を阻害しない
見掛け分子量約5,000〜16,000ダルトンのポリペプチド
を１つ以上含んでおり、0.05％トリフルオロ酢酸含有の
アセトニトリルの約35〜39％アセトニトリル直線勾配の
高性能液体クロマトグラフイーによつて酸性化エタノー
ル抽出物から所定活性として回収され、また、0.05％ト
リフルオロ酢酸を含む２−プロパノールの約23〜27％２
−プロパノール直線勾配の高性能液体クロマトグラフイ
ーによつて酸性化エタノール抽出物から所定活性として
回収される。
更に、酸性化エタノール抽出物のカチオン交換クロマト
グラフイーによつて、ポリペプチドの不均一集合体、即
ちCM−I,CM−II,CM−III及びCM−IVが回収される。各集
団はヒト腫瘍細胞の増殖阻害性を有しており、CM−Ｉ以
外の全部が樹立ミンク肺細胞系（CCL64）の増殖を実質
的に阻害する特性を有しており、いずれも正常ヒト包皮
フイブロブラストの増殖を阻害しない。
TGI−1,TGI,TGI−２又はCM−I,CM−II,CM−III及びCM−
IVと指称されるポリペプチドの不均一集合体又はこれら
の種々の組合せは、薬剤組成物として使用され得る。薬
剤組成物は、有効量のTGI−1,TGI,TGI−２又はCM−I,CM
−II,CM−III及びCM−IVと指称されるポリペプチドの不
均一集合体を適当な薬剤担体と共に含む。種々の腫瘍増
殖阻害物質の有効量は、処置の指示、患者又は腫瘍の発
達時期次第で当業者に公知の方法で変更するとよい。ま
た、生理食塩水又はその他の水溶液、ゲル、クリーム等
の適当な担体も当業者に公知である。
TGI−1,TGI,TGI−２又はCM−I,CM−II,CM−III及びCM−
IVと指称されるポリペプチドの不均一集合体は、ヒト腫
瘍細胞例えば癌腫、黒色腫又は白血病細胞の増殖阻害に
使用され得る。このためには、増殖阻害に有効な量のTG
I−1,TGI,TGI−２又はCM−I,CM−II,CM−III及びCM−IV
と指称するポリペプチドの不均一集合体を細胞と接触さ
せる。TGI−1,TGI,TGI−２又はCM−I,CM−II,CM−III及
びCM−IVと指称するポリペプチドの不均一集合体はまた
火傷の治療又は傷の治癒を助けるために使用される。こ
のためには、有効量のTGI−1,TGI,TGI−２又はCM−I,CM
−II,CM−III及びCM−IVと指称するポリペプチドの不均
一集合体と適当な薬剤担体とを含有する薬剤組成物を火
傷又は傷と接触させる。
本発明によれば、複数のポリペプチドを含んでおり各ポ
リペプチドが約20,000ダルトン未満の分子量をもち各ポ
リペプチドがヒト腫瘍細胞と樹立ミンク肺細胞系（CCL6
4）との増殖阻害性をもち正常ヒト包皮フイブロブラス
トの増殖を亢進させるような酸性化エタノール抽出物を
ヒト組織から調製する方法が開示される。該方法では、
適当な条件下で、例えば組織の凍結−解凍又は均質化に
よつて組織を処理して溶解細胞と溶解細胞由来の溶解タ
ンパク質とを生成し、溶解タンパク質を回収し、溶解タ
ンパク質から別個に見掛け分子量約20,000ダルトン未満
のポリペプチドを分離回収し、分離回収したポリペプチ
ドをアツセイしてヒト腫瘍細胞の増殖阻害又は樹立ミン
ク肺細胞系（CCL64）の増殖阻害又は正常ヒト包皮フイ
ブロブラストの増殖亢進を示すポリペプチドを同定し、
このように同定されたポリペプチドを含有する酸化性エ
タノール抽出物を回収する。
本発明方法の好ましい実施態様によれば、組織の処理
は、凍結組織を約４℃で適当な時間例えば６時間を要し
て解凍し、約４℃のエタノール含有の適当な酸性抽出用
バツフアーに組織を懸濁させ、適当な時間を要して組織
を均質化して均質組織を形成し、均質組織を約４℃で適
当な時間例えば１晩撹拌して溶解細胞を生成し且つ細胞
由来のタンパク質を可溶化するステツプから成る。
本発明によれば、好ましい酸性抽出バツフアは、約375m
lの95（容量／容量）％エタノールと、7.5mlの濃塩酸と
33mgのフツ化フエニルメチルスルホニル（PMSF）と1ml
のアプロチニン（シグマA6012,0.9％NaCl及び0.9％ベン
ジルアルコール中で9.8ユニツト/mlのトリプシン阻害単
位をもつ）とを約192mlの４℃蒸留水と混合したもので
ある。
本発明の好ましい実施態様によれば、可溶タンパク質の
回収は、例えば遠心分離によつて溶解細胞から溶解タン
パク質を分離し、例えば水酸化アンモニウムの添加によ
つてpHを約5.0に上昇させ、例えば遠心分離によつて沈
殿物を除去し、例えばアルコール、エーテル又は双方の
添加によつて上清からタンパク質を沈殿させ、例えば溶
液を約４℃で約48時間静置し遠心分離することによつて
溶液から沈殿物を除去し、沈殿物から有機相を除去し、
例えば換気フード（fume food）で沈殿物を乾燥させ、
乾燥沈殿物を適当な溶媒例えば1M酢酸に再溶解し、例え
ば透析によつて低分子量溶質を溶液から取出すステツプ
から成る。
本発明は更に、見掛け分子量が約20,000〜30,000ダルト
ンでありヒト腫瘍細胞と樹立ミンク肺細胞系（CCL64）
との増殖阻害性と正常ヒト包皮フイブロブラストの増殖
亢進性とをもつ組織由来の増殖阻害物質（TGI）を含む
酸性化エタノール抽出物をヒト臍帯から調製する方法を
開示している。この方法では、適当な条件下で、臍帯組
織から静脈と動脈とを除去し、痕跡血液を完全に除去す
べく組織を洗浄し、溶解細胞を生成すべく組織を処理
し、細胞由来の可溶性タンパク質を除去し、酸性化エタ
ノール抽出によつて残留タンパク質を可溶化し分離して
溶解タンパク質を生成し、見掛け分子量約20,000〜30,0
00ダルトンのTGIを溶解タンパク質から分離回収し、分
離回収したTGIを検定してヒト腫瘍細胞の増殖阻害、樹
立ミンク肺細胞系（CCL64）の増殖阻害及び正常ヒト包
皮フイブロブラストの増殖亢進を示す活性を同定し、前
記の如く同定されたTGIを含有する酸性エタノール抽出
物を回収する。
本発明の好適実施態様によれば、組織の処理は、凍結組
織を約４℃で適当な時間例えば２時間を要して解凍し、
約４℃で切開して静脈と動脈とを除去し、約４℃の適当
なバツフアに組織を懸濁させ、適当な時間を要して組織
を均質化して溶解細胞と可溶性タンパク質とを形成し、
例えば遠心分離によつて溶解細胞から可溶性タンパク質
を分離し、約４℃の抽出バツフア中で溶解細胞を適当な
時間例えば１晩撹拌して溶解化したタンパク質を生成す
るステツプから成る。
本発明の好ましい酸性抽出用バツフアは、約375mlの95
（容量／容量）％のエタノールと7.5mlの濃塩酸と33mg
のフツ化フエニルメチルスルホニル（PMSF）と1mlのア
プロチニン（SigmaA6012、0.9％NaCl及び0.9％ベンジル
アルコール中で9.8ユニツト/mlのトリプシン阻害単位を
もつ）とを約192mlの４℃蒸留水に混合したものであ
る。
本発明の好ましい実施態様によれば、可溶タンパク質の
回収が例えば遠心分離によつて溶解細胞から溶解タンパ
ク質を分離し、例えば水酸化アンモニウムの添加によつ
てpHを約5.0に上昇させ、例えば遠心分離によつて沈殿
物を除去し、例えばアルコール、エーテル又は双方の添
加によつて上清からタンパク質を沈殿させ、例えば溶液
を約４℃で約48時間静置し遠心分離することによつて溶
液から沈殿物を除去し、沈殿物から有機相を除去し、例
えば換気フード（fume food）で沈殿物を乾燥させ、乾
燥沈殿物を適当な溶媒例えば1M酢酸に再溶解し、例えば
透析によつて低分子量溶質を溶液から取出すステツプか
らなる。
本発明の好適実施態様によれば、溶解タンパク質からの
ポリペプチドの別個の分離回収が、例えばバイオ−ゲル
（Bio−Gel）Ｐ−10樹脂を用いたタンパク質のゲル過
クロマトグラフイーによる。
本発明の好適実施態様によれば、ポリペプチドの検定
が、ヒト腫瘍細胞例えばヒト肺癌系（A549）又は樹立ミ
ンク肺細胞系（CCL64）又は正常ヒト包皮フイブロブラ
スト（HuF）を個別に適当な条件下で適当な時間にわた
りポリペプチドと接触させヒト腫瘍細胞の増殖阻害又は
樹立ミンク肺細胞系（CCL64）の増殖阻害又は正常ヒト
包皮フイブロブラストの増殖亢進を示すポリペプチドを
同定するステツプから成る。
組織由来の増殖阻害物質−１（TGI−１）と指称される
物質の調製方法は、先ず酸性化エタノール抽出物を調製
し、次に酸性化エタノール抽出物の高性能液体クロマト
グラフイー例えば逆相HPLCクロマトグラフイーによつ
て、（ｉ）0.05％トリフルオロ酢酸含有のアセトニトリ
ルの約26〜34％アセトニトリル直線勾配か又は（ii）0.
05％トリフルオロ酢酸含有の２−プロパノールの約17〜
23％２−プロパノール直線勾配を用い、酸性化エタノー
ル抽出物からTGI−１を所定活性として回収することか
ら成る。
組織由来の増殖阻害物質（TGI）と指称される物質の調
製方法は、先ず酸性化エタノール抽出物を調製し、次に
酸性化エタノール抽出物の高性能液体クロマトグラフイ
ー例えば逆相HPLCクロマトグラフイーによつて、0.05％
トリフルオロ酢酸含有のアセトニトリルの約28〜34％ア
セトニトリル直線勾配を用いて、酸性化エタノール抽出
物からTGIを所定活性として回収するか、又は、約0.6−
0.7M NaClのNaCl直線勾配で溶出させカチオン交換樹脂
例えばCM−トリスアクリルから単一活性ピークとして回
収することから成る。
組織由来の増殖阻害物質−２（TGI−２）と指称される
物質の調製方法は、先ず酸性化エタノール抽出物を調製
し、次に酸性化エタノール抽出物の高性能液体クロマト
グラフイー例えば逆相HPLCクロマトグラフイーによつ
て、（ｉ）0.05％トリフルオロ酢酸含有のアセトニトリ
ルの約35〜39％アセトニトリル直線勾配か又は（ii）0.
05％トリフルオロ酢酸含有の２−プロパノールの約23〜
27％２−プロパノール直線勾配を用い、酸性化エタノー
ル抽出物からTGI−２を所定活性として回収することか
ら成る。
CM−I,CM−II,CM−III及びCM−IVと指称されるポリペプ
チドの不均一集合体の調製方法では、先ず酸性化エタノ
ール抽出物を調製し、次にイオン交換クロマトグラフイ
ー例えばカチオン交換クロマトグラフイーによつて酸性
化エタノール抽出物からポリペプチド不均一集合体を回
収する。
本発明によれば、腫瘍の存在の検出方法が開示される。
該方法は、被検者から採取したサンプル例えば血液、羊
水、腹膜液、腹腔液、脳脊髄液又は尿中に存在するTGI
−1,TGI,TGI−２又はCM−I,CM−II,CM−III及びCM−IV
と指称されるポリペプチドの不均一集合体の量を定量的
に測定し、この測定量と正常被検者のサンプル中の同じ
物質の存在量とを比較することから成り、この量の有意
差、例えば有意な増量は腫瘍の存在の指標となる。
本発明によれば、腫瘍の存在のまた別の検出方法が開示
される。該方法は、被検者のサンプル中に存在するTGI
−1,TGI,TGI−２又はCM−I,CM−II,CM−III及びCM−IV
と指称するポリペプチドの不均一集合体と形質転換増殖
因子アルフア（TGF−α）との双方を別々に定量的に測
定し、該サンプル中のTGI−1,TGI,TGI−２又はCM−I,CM
−II,CM−III及びCM−IVと指称するポリペプチドの不均
一集合体の存在量の該サンプル中のTGI−αの存在量に
対する比率を決定し、正常被検者のサンプルについて上
記同様の比率を決定し、被検者のサンプルで得られた比
率と正常被検者のサンプルで得られた比率とを比較す
る。両者の値の有意な変化が腫瘍の存在の指標となる。
本発明によれば、腫瘍の型決定方法が提供される。該方
法では、腫抑をもつ被検者のサンプルについてTGI−1,T
GI,TGI−２又はCM−I,CM−II,CM−III及びCM−IVと指称
するポリペプチドの不均一集合体のうちの１種以上の存
在を測定する。これらの成分の特異的結合例えばTGIとC
M−II又はTGI−１とTGI−２の如き結合の有無によつて
特定腫瘍型例えば黒色腫又は癌腫を判定できる。
最後に、もう一つの腫瘍の型決定方法が開示される。該
方法では、腫瘍をもつ被検者のサンプルについてサンプ
ル中のTGI−1,TGI,TGI−２又はCM−I,CM−II,CM−III及
びCM−IVと指称されるポリペプチドの不均一集合体の存
在量を定量的に判定し、夫々の特異的な量又は相対量の
存在、例えばTGIの量の有意な増加、又はTGI−１対CM−
IIの比の如き比の有意な変化から腫瘍の型を判定する。
実験の詳細な説明 実験の第１部 材料及び方法 実験の第１部で「TGI活性」なる用語は、特に注釈がな
ければTGI−1,TGI−2,CM−I,CM−II,CM−III及びCM−IV
の活性を意味する。
組織抽出物からの組織由来腫瘍増殖阻害物質（TGI）の
単離 デイボレン（Davoren）等、バイオケミカル・バイオフ
イジカル・アクタ（Biochem.Biophys.Acta）63:150（19
62）及びロバート（Robert）等、プロシーデイングス・
オブ・ナシヨナル・アカデミツク・サイエンス（Proc.N
atl.Acad.Sci.）米国,77:3494（1980）により記載の酸
／エタノール抽出法の変法を用いヒト臍帯又は胎盤の組
織を抽出した。
抽出用バツフアーは、375mlの95（容量／容量）％エタ
ノール（パンクチリアス，標準強度190,ユー・エス・イ
ンダストリアル・ケミカルズ（U.S.Industrial Chemica
ls），＃UN 1170と7.5mlの濃塩酸と33mgのフツ化フエニ
ルメチルスルホニル（PMSF）（シグマＰ−7627）と1ml
のアプロチニン（シグマA6012,0.9％NaCl及び0.9％ベン
ジルアルコール中で19.8ユニツト/mlのトリプシン阻害
単位をもつ）とを４℃の蒸留水192mlと混合したもので
ある。400〜600gの凍結ヒト臍帯又は胎盤（アドバンス
ト・バイオテクノロジイー（Advanced Biotechnologie
s））（−80℃で保存）を４℃で６時間を要して解凍し
た。解凍した組織を４℃の冷却キュイジナール（Cuisin
art）フードプロセツサ（型式DLC−７−PRO）に入れ、
４℃の抽出用バツフア200mlに懸濁した。懸濁した組織
をフードプロセツサで均質化した。最初の１分間の均質
化によつて懸濁液が黄白色（クリームホワイト）になつ
た。この白色懸濁液に４℃の抽出用バツフアを更に200m
l加えた。懸濁液は暗褐色に変色した。組織懸濁液を４
℃で合計10分間均質化した。抽出用バツフアをこの均質
組織混合物に添加し、組織均質液1g当りの最終容量を6m
lとした。
均質組織懸濁液を３インチの撹拌棒を備えた大型４ビ
ーカーに移し、ラブ・ライン・マルチマグネスチア（La
b−line Multimagnestir）多段ミキサー、型式＃1278,
の1/2最大撹拌能力で撹拌した。４℃で撹拌を伴つて１
晩抽出し、均質液を１遠心ボルト（ソーバル（Sorval
l））に移し、ソーバル（Sorvall）Ｈ−6000Aロータを
備えたソーバル（Sorvall）RC−3B遠心機で４℃で3500r
pm（RCF＝350）を30分間維持して遠心した。上清を大型
４ビーカーに移し、濃水酸化アンモニウムを徐々に添
加してpH5.0に調整した。pHが上昇すると上清が茶色か
ら橙色に変色する。2.0M酢酸アンモニウム、pH5.2を総
量の１％になるように添加し、溶液を沈殿させた。ソー
バルRC−3Bで４℃で4500rpm（RCF＝5900）で４時間遠心
して沈殿物を除去した。上清を大型６フラスコに移
し、４倍容の無水エーテル（−20℃）（ベイカー（Bake
r）9244−３）と２倍容の95％エタノール（４℃）とを
加えた。混合物を−220℃で48時間静置し生じた沈殿物
を沈降させた。
48時間の沈殿の終了後、エーテル化した材料を換気フー
ドで室温に戻した。酸性化エタノール抽出物を室温まで
加温すると、沈殿物の凝集が促進される。エーテルとエ
タノールとの透明有機相を水吸引器で除去し、沈殿物を
換気フードに数時間維持して残留有機相を蒸発させた。
「乾燥した」沈殿物を1.0M酢酸に溶解し、排除限界分子
量3500の透析膜（スペクトロポー（Spectropor）3,スペ
クトラム・メジカル・インダストリー（Spectrum Medic
al Industries），ロス・アンジエルス，カルフオルニ
ア）を用い1.0M酢酸（ベイカー＃9507−５）に大まかに
透析した。透析した酸性化エタノール抽出物を250mlの
コーニング（Corning）円錐遠心管（コーニング25350）
で凍結乾燥し、未精製の酸性化エタノール抽出物として
保存した。
酸性化エタノール抽出物からTGIを沈殿させる変形手順
として、４倍容のエーテルと２倍容のエタノールとの添
加に代えて、４℃で２倍容のエタノールだけを添加して
もよい。酸性化エタノール抽出物沈殿ステツプからエー
テルを削除する利点は、引火性の溶媒を要するステツプ
が削除されるので、大量の材料の処理及び大規模化に伴
なう難点が解消されることである。
ゲル過クロマトグラフイー 凍結乾燥した酸性化エタノール粗抽出物を1.0M酢酸（10
−30mg/ml）に再懸濁させ、ソーバルＨ−6000Aロータを
備えたソーバルRC−3B遠心機で４℃で3500rpmで30分間
遠心して清澄化した。次にサンプルをカラムで処理す
る。23℃又は４℃の1.0M酢酸を用いバイオ−ゲルP10,10
0−200メツシユ（バイオ−ラツド（Bio−Rad）:150−10
40）で100〜150mlのサンプルをクロマトグラフイーにか
けた。
カラム（14×100cm）（アミコン（Amicon），＃86012）
は23℃又は４℃の1.0M酢酸中に、平衡しガス抜きしたバ
イオ−ゲルP10を13.8収容していた。2mg/mlのブルー
デキストラン（シグマ＃D5751）を含む1.0M酢酸50mlを
添加して間隙体積を測定した。較正後、100mg/mlのウシ
血清アルブミン（シグマ＃Ａ−4503）を含む1.0M酢酸10
0mlを加え続いて1.0M酢酸で大まかに洗浄してカラムを
「コンデシヨニング」した。
サンプルを適用した後、Ｃタイプ収集ラツクを備えたス
パーラツク（SuperRac）（LKB2211）を使用し、各１
の画分を、２プラスチツク組織培養ローラボトル（フ
アルコン（Falcon）,3207）に流量7ml/分で収集した。
画分を吸光範囲2.0AUFSに設定した280nmのユビコード
（Uvicord）Ｓ（LKB2138）でモニターしシングルチヤネ
ルチヤートレコーダ（LKB2210）で記録した。1mlずつの
部分サンプルを各画分から取出し、凍結乾燥し、後述の
如くにTGI活性を検定した。各画分の残りは、ヴアーチ
ス（Virtis）凍結装置24型を使用し２凍結乾燥ジヤー
（ヴアーチス＃6503−2050）で凍結乾燥した。
高性能液体クロマトグラフイー（HPLC） バイオ−ゲルP10−カラムから得たTGI活性を含む個々の
画分を凍結乾燥し、各画分中のタンパク質の量に応じて
１〜10mlの0.05％トリフルオロ酢酸（TFA）（ピアス（P
ierce）＃28901）に再懸濁させた。HPLC用の水は、Mill
i−Ｑ水精製システムで得た。全てのHPLCクロマトグラ
フイー処理に於いて出発バツフアは0.05％TFA含有のMil
li−Ｑ水から成る。注入以前に、ベツクマン（Beckma
n）卓上遠心機（ベツクマンTJ−６）で3000rpmで20分間
サンプルを遠心して不溶物質を除去した。上清をウオー
ターズｕボンダパツク（Waters uBondapak）分析C18カ
ラム（0.39×30cm）（Waters PN27324）か又は準完成
（semipreparative）カラム（0.78×30cm）（Waters PN
84176）に注入した。いずれを使用するかは個々の実験
で特定する。ウオータース全自動勾配制御装置（ウオー
タース510型）をカラム溶出に使用し、206nmに設定した
可変波長u.v.デテクタ（ウオータースラムダマツクス
（Lombda−max）481型）でモニタした。溶出用溶媒とし
て0.05％TFA含有のアセトニトリル（ベイカー9017−
３）又は２−プロパノール（フイツシヤー（Fisher）A4
52）を使用した。画分を、Ｂ型収集ラツクを備えたスー
パーラツク（SuperRac）（LKB2211）によつて13×100mm
又は16×100mmのシリカガラス（siliconized）（ピア
ス，アクアシル（Aquasil）＃42799）試験管に収集し
た。各収集画分の部分サンプルを採取し後述の如くTGI
活性を検定した。
イオン交換クロマトグラフイー 酸性化エタノール及びエーテル抽出物により得られた凍
結乾燥物質とバイオ−ゲルＰ−10ゲル過クロマトグラ
フイーより得られた種々の凍結乾燥画分との双方を別々
にイオン交換クロマトグラフイーで処理した。これらの
処理ではCM,SP及びDEAE−トリスアクリル（LKB）イオン
交換樹脂を使用した。クロマトグラフイー用サンプルを
1.0M酢酸で最終濃度約20mg/mlに希釈した。pHと導電率
との双方が出発（平衡）バツフアに等しくなるまでサン
プルを４℃で透析した。全部のイオン交換クロマトグラ
フイー処理を４℃で実施した。
a. CM−及びSP−トリスアクリルを使用したイオン交換
クロマトグラフイー 樹脂を1.0M NaClを含む等容の0.1M酢酸アンモニウム,pH
4.0に水性懸濁液として懸濁させた。樹脂を少なくとも
３時間平衡させ、４℃でガス抜きした。20mlの樹脂を1.
6×20cmのカラム（フアルマシア（Pharmacia）＃19−03
62−01）に充填しカラムの２倍容の1.0M酢酸アンモニウ
ム,pH4.0,及び0.01M酢酸アンモニウム,pH4.0,で順次洗
浄した。流出液が平衡用バツフアー（例えば0.01M酢酸
アンモニウム，フイツシヤーA637）,pH4.0の導電率に正
確に一致するまでカラムを洗浄した。サンプルを流量1m
l/分で樹脂に与え（1gm/2ml樹脂）、光学濃度が（例え
ば光学濃度０の付近で）平準化するまで平衡バツフアで
洗浄し、濃度0.01〜1.0M酢酸アンモニウ,pH4.0のカラム
流アダプターを介して200mlの上昇モル濃度直線勾配
（フアルマシア勾配ミキサーGM−1,＃19−0495−01）を
作用させた。いくつかの実験では同じカラムに第２の勾
配を作用させた。この第２勾配は1.0M酢酸アンモニウ
ム、pH4.0から50％アセトニトリルを含む1.0M酢酸アン
モニウム,pH4.0の範囲であつた。Ａ型収集ラツクを備え
たスーパーラツク（SuperRac）画分コレクター（LKB221
1）で13×100mlのポリスチレン管（コロンビア・ダイア
グノステイクス（Columbia Diagnostics）,B2564）に2m
lの画分を収集した。全部のカラムクロマトグラフイー
に280nmフイルター（LKB2138）とシングルチヤネルレコ
ーダ（LKB2210）とを備えたユヴイコード（Uvicord）Ｓ
を使用した。画分を光学濃度に基いて10μ〜1mlの部
分サンプルにしTGI活性を検定した。
b. DEAE−トリスアクリルを使用するクロマトグラフイ
ー クロマトグラフイー用樹脂の調製と処理とをCM−及びSP
−トリスアクリルの場合と全く同様に行なつた。但し、
平衡バツフアとしては、0.1M酢酸アンモニウム,pH6.0,
を使用し、0.1M〜1.0M酢酸アンモニウム,pH6.0,の範囲
の勾配溶出を使用し、サンルプを前記平衡バツフアで平
衡した。
TGI活性の単層アツセイ 10％のウシ胎仔血清（ホイツトテーカーエム・エー・バ
イオ−プロダクツ（Whittaker M.A.Bio−products）14
−501B）と２％のＬ−グルタミン（ホイツトテーカーエ
ム・エー・バイオ−プロダクツ17−605−Ａ）と１％の
ペニシリンと１％のストレプトマイシンとを含む50μ
のダルベツコ改質イーグル培地（ホイツトテーカーエム
・エー・バイオ−プロダクツ12−6143）を用い96ウエル
の組織培養プレート（ヌンク（Numc）167008）で被検細
胞を継代培養した。ヒト肺癌細胞A549と正常ヒトフイブ
ロブラスト（HuF）とは、ウエル当り５×103細胞の播種
密度を要した。ミンク細胞（ATCC:CCL64）はウエル当り
4.5×103細胞の播種密度を要した。
TGI活性は検定すべきカラム画分の部分サンプルを、1mg
/mlのウシ血清アルブミン（BSA:シグマＡ−6003）を含
む1M酢酸50μを入れた12×75mmの無菌試験管（フアル
コン2058）に移し凍結乾燥した。アツセイの直前に、凍
結乾燥サンプルを、被検細胞型毎に400μに再懸濁さ
せた。再懸濁サンプルの100μの部分サンプルを、被
検細胞収容ウエルに加えた。各サンプルを３組ずつ検定
した。５％CO2/95％空気の湿潤雰囲気中で37℃で細胞を
72時間インキユベートした。インキユベート期間が終る
と、１μCi/mlの５−〔125I〕ヨード−２′デオキシウ
リジン（125IUdR）（ニユー・イングランド・ニユーク
リア（New England Nuclear）;NEX−072）を含む100μ
の完全培地で各ウエルを24時間パルスした。単層を洗
浄バツフアＡ（ダルベツコのリン酸緩衝生理食塩水,100
mM MgCl2,1mg/mlのBSA含有,pH6.8）で洗い、メタノール
（フイツシヤーA452）中で10分間固定し、15分間風乾し
た。細胞に取込まれた125IUdRを200μの1.0N NaOHで
可溶化しプレートを60℃で20分間インキユベートした。
可溶化125IUdRをタイターテク・スーパーナタント・コ
レクシヨン・システム（Titertek Supernatant Collect
ion System）（スカトロン・インコーポレーテツド（Sc
atron Inc.）,7072）で収集した。細胞増殖量を対数増
殖期に細胞のDNAに取込まれた125IUdRの程度によつて概
算した。アツセイ以前に、採取した各ウエルをツアイス
（Zeiss）倒立顕微鏡で観察し細胞増殖量を肉眼で測定
した。増殖の阻害又は亢進を、被検サンプルを含む試験
細胞（例えばヒト腫瘍細胞）に取込まれた125IUdRと未
処置コントロール細胞に取込まれた125IUdRとの比で示
した。処理細胞を顕微鏡検査で観察したときの亢進又は
阻害が125IUdRの取込み量の増減にそれぞれ一致してい
た。
TGI活性の特性決定 a.熱処理 バイオ−ゲルＰ−10のゲル過クロマトグラフイーで得
られた画分2,4及び６の1mlの部分サンプルを12×75mmの
ポリスチレン管（フアルコン2034）で凍結乾燥し1mlの
1.0M酢酸に再懸濁させた。サンプルを沸騰湯浴で３分間
加熱し、凍結乾燥し、前記同様にTGI活性を検定した。
b.ジチオトレイトール（DTT）による処理 バイオ−ゲルＰ−10のゲル過クロマトグラフイの結果
得た画分2,4及び６からの3mlアリコートを17×125mmポ
リスチレン製スクリユーキヤツプ管（コロンビア・ダイ
アグノステイクス（Columbia Diagnostics）＃2570）内
で凍結乾燥した。処理した試料に最終濃度で0.1MDDT
（カルビオケム（Cal−biochem）＃233−153）を含む0.
1M炭酸水素アンモニウム200μ,pH7.4を加えた。対照
試料には200μの0.1M炭酸水素アンモニウム（フイシ
ヤ（Fisher）,A643,pH7.4を含ませた。これらの試料を2
3℃で１時間インキユベートし、1.0M酢酸で1mlに希釈
し、3,500ダルトンの分子量カツトオフの18mmの透析膜
（スペクトロポー（Spectropor）3,スペクトラム・メデ
イカル・インダストリーズ（Spectrum Medical Industr
ies）を用いて0.1M酢酸４を４回交換しながら透析し
た。これらの試料を12×75mmポリスチレン管（フアルコ
ン（Falcon＃2304）内で凍結乾燥し、前述の如くTGI活
性を分析した。
SDS−ポリアクリルアミドのスラブゲルによる電気泳動 各クロマトグラフイ処理によつて得た試料からのアリコ
ートを電気泳動用に凍結乾燥した。これらの試料を0.1M
トリス−HCl（シグマ（Sigma）;T−1503）、pH6.8と、1
5％のグリセロール（コダツク（Kodak）;114−9939）
と、２％の硫酸ドデシルナトリウム（SDS）（バイオ−
ラツド（Bio−Rad）;116−0302）と、５％の２−メルカ
プト−エタノール（バイオ−ラツド;161−0710）とを含
む試料バツフア80μに希釈し、本質的に前述の方法に
より５〜20％アクリルアミドモノマー勾配で電気泳動処
理した（ラエンムリ（Laemmli）,U.K.（1970年）ネーチ
ー誌227,680−685）。これらの試料を２分間煮沸した
後、一定の電流30mA/ゲルを加えながら（ホフア（Hoeff
er電源;PS1200DC）９℃で４時間バイオ−ラツドモデル1
55バーチカル電気泳動セル（バイオ−ラツド165−142
0）内の幅1.5mmのスラブゲル上に配置した。水浴サーキ
ユレータ（ハーク（Haake）,A81）により一定の温度を
維持した。ゲルを酢酸5.7％及びメタノール47％中でク
マシーブル−R250（バイオ−ラツド＃16−0400）0.5％
により一晩着色し、次いで着色剤を含まない前記と同じ
溶液で脱色した。低いタンパク質濃度を示す特定ゲルを
メリル（Merril）によるシルバー技術（メリル，シー・
アール（C.R.），ゴールドマン，デイー（Goldman,
D.），セドマン，エス（Sedman,S.）及びエバート，エ
ム・エツチ（Ebert,M.H.（1981年）211;1437−1438），
により再着色処理した（バイオ−ラツド，シルバーステ
イニングキツド（silver staining kit）；＃161−044
3）。
結 果 室温と４℃とにおけるバイオ−ゲルP10でのゲル過ク
ロマトグラフイの結果得られるTGI活性の比較 ヒト臍帯の酸性化エタノール抽出物に由来する成長抑制
活性を見掛け分子量5,000〜16,000ダルトンでバイオ−
ゲルP.10樹脂を用いるゲル過クロマトグラフイにより
溶出した。時には、3,000〜5,000ダルトンの分子量で別
の活性ピークも観察された。分子量の計算は４×100cm
カラム内で１の樹脂を用いてクロマトグラフイにかけ
た分子量基準（即ち炭酸脱水酵素−29,000;RNアーゼー1
4,400;インシユリン−6,000）の溶離プロフイルに基づ
く。前記カラムによつて得られる溶離プロフイルと14×
100cm大カラムによつて得られるプロフイルとは互に重
ね合わせることができた。同じ方法でクロマトグラフイ
にかけたヒト胎盤からの酸性化エタノール抽出物は臍帯
抽出物に極めて類似した溶離プロフイルを示した。
臍帯酸性化エタノール抽出物からの分画１〜３は極めて
濃い茶色を有するが、この色は分画が進むにつれて徐々
に消失する。幸いなことに、腫瘍細胞増殖阻害活性（TG
I）は最も高いタンパク質濃度を有する分画1,2及び３に
溶出されるにも拘らず、この活性の大部分が第１図及び
第２図から明らかなように、観察されるタンパク質ピー
クを越えて延びる。ヒト胎盤物質からの抽出物は主要タ
ンパク質ピークに対するTGIの重なりがヒト臍帯からの
物質について観察される重なりよりも大きかつた（デー
タ図示せず）。５〜20％ポリアクリルアミド勾配でのSD
S−PAGEによるゲル過クロマトグラフイ電気泳動から
の複数の同量アリコートも、分画４では分画１〜３より
かなり少ない量のタンパク質が検出されることを示し
た。分画５及び６では5600及び14,000の主要タンパク質
帯が観察され、分画７に関しては抑制活性が第２図の如
く分画10まで延びているにも拘らず極めて少量のタンパ
ク質しか残らない。より少ないタンパク質の領域に溶出
する大きな活性の顕著な利点はTGIの更に高度な精製を
容易にするという点にある。
第１図及び第２図に夫々示した室温でのバイオ−ゲルP1
0クロマトグラムと４℃でのそれとを比較すると、抑制
活性は明らかに４℃の方がより良く保存される。23℃で
は分画６を越えると活性が全く観察されない（第１図）
が、４℃では活性が更に４分画分延びて分画10まで広が
る。極めて重要なことに、回収される活性の正味量は抽
出物を４℃でクロマトグラフイにかけると少なくとも２
倍大きくなる。80％以上のTGI活性は４℃では７つの分
画に得られる（第２図）のに対し、23℃では３つの分画
にしか得られないからである。これは、３つの分画に溶
出する（23℃）同一量の活性が７つの分画に亘つて広が
る（４℃）ことに起因するのではなく、明らかにTGI活
性の収量の実際的増加に起因していた。２つのカラムか
ら別個に得た分画５の1mlアリコートと、これら分画の1
/5〜1/125希釈物とをヒト肺腺癌（A549）とミンク肺細
胞（CCL64）とに関してテストした（表Ｉ）。未希釈分
画のTGI活性は４℃でのクロマトグラフイによつて得ら
れる分画５の方が２倍大きかつた。また、４℃のクロマ
トグラフイによる分画５の25倍希釈物はヒト腫瘍細胞系
に対して最大TGI活性を示し続けた。23℃でのクロマト
グラフイによる同等希釈度の分画は検出し得る活性を全
く示さなかつた。ミンク細胞系についても同様の観察が
なされた。このデータは第１図及び第２図に見られる活
性に基づくものではなく、夫々の第５分画において同等
のTGI活性を示した２つの別個のカラムから得たもので
ある。
ヒト正常フイブロブラスト（HuFs）に対するTGIの作用
と、ヒト形質転換肺癌細胞（A549）に対するTGIの作用
との比較 バイオ−ゲルＰ−10樹脂でクロマトグラフイー（４℃）
にかけたヒト臍帯酸性化エタノール抽出物から得た分画
のアリコートを、材料及び方法の項で述べたようにヒト
正常細胞とヒト形質転換細胞とについてTGI活性テスト
をした。第３図から明らかなようにヒトA549細胞（白い
三角）に対するTGI活性は分画３から分画12までに及ぶ
が、これらの分画はヒト正常フイブロブラストの成長刺
激作用において85％も増大させた。このように前記抑制
活性はヒト腫瘍細胞に特異的なものである。この観察さ
れた抑制活性は光線顕微鏡検査で示され且つヒト正常フ
イブロブラストに対する刺激作用によつて間接的に示さ
れるように、細胞毒性に起因するものではない。TGIを
予め正常な上皮由来細胞についてテストしたが、同様の
効果が観察された。
120μｇを含む分画５のゲル過による1mlアリコート
（第１図及び第２図）を用いてTGI活性分析を行なつ
た。
高性能液体クロマトグラフイ（HPLC） バイオ−ゲルP10カラムでのゲル過により部分的に精
製し、次いで逆相HPLC（ｕボンダパツク（uBondapak）C
18樹脂）を用いて更に精製したヒト臍帯の酸性エタノー
ル抽出物からのTGIは、A549ヒト癌種及び樹立ミンク肺
細胞系CCL64の成長を双方共抑制したが、正常なヒトフ
イブロブラストの成長は抑制しなかつた。第４図はバイ
オ−ゲルＰ−10クロマトグラフイステツプから得られた
凍結乾燥分画４（19.8mg/3ml0.05％トリフルオロ酢酸）
のアセトニトリル直線勾配を用いるHPLCによつて得たTG
I活性の溶離プロフイルを示している。
A549ヒト癌種及びミンク細胞の両方に対する成長抑制活
性のピークが２つの別個のものであることが観察され
た。28〜34％のアセトニトリルで溶離する分画（分画13
〜22）と、35〜39％のアセトニトリルで溶離する分画
（分画25〜31）とを別個にプールし、２−プロパノール
直線勾配を用いてC18uボンダパツクカラムで再びクロマ
トグラフイにかけた。
TGI活性の第１ピークをTGI−１と称し、第２ピークをTG
I−２と称することにした。第５図はTGI−１（第４図）
の溶離プロフイルとTGI活性とを示している。注入材料
の濃度は0.05％トリフルオロ酢酸（TFA）1.5ml当り1.5m
gであつた。TGI−１活性は２−プロパノール直線勾配を
用いると17〜23％の間で溶出する。同様にして第６図
は、TGI−２（0.8mg/1.8ml0.05％TFA）（第５図）が２
−プロパノール直線勾配を用いると23〜27％の間（分画
17〜23）で再クロマトグラフイ処理されることを示して
いる。第４図及び第５図のTGI活性は一貫して、A549ヒ
ト癌種細胞に対するよりミンク細胞に対する方が20％高
い。
バイオ−ゲルＰ−10クロマトグラフイステツプからの別
の分画全量、即ち分画５（第３図参照）をアセトニトリ
ル直線勾配を用いるHPLCによりクロマトグラフイ処理し
た（第７図）。第４図で使用されている材料（分画４）
より後の分画である分画５はTGI−１として溶出する抑
制活性を主に含んでいた。第７図ではTGI−１は29〜34
％アセトニトリルで溶出した。増殖阻害活性はA549ヒト
癌種細胞に対するよりミンク細胞に対する方が35％高か
つた。ここでTGI活性の大部分は前記タンパク質ピーク
から分離された。活性分画（14〜25）をプールし、凍結
乾燥し、且つ２−プロパノール直線勾配を用いる逆相HP
LCによりクロマトグラフイ処理した（第８図）。差動的
阻害活性の証拠が観察された。TGI活性は23％２−プロ
パノール（分画22〜25）の活性ピークで溶出するミンク
細胞に特異的な成長抑制活性と、26％２−プロパノール
（分画25〜26）で溶出するA549ヒト癌種細胞に特異的な
増殖阻害活性とに分割された。従つて後でゲル過クロ
マトグラフイにより溶出され、汚染性タンパク質をより
少なく有する分画〔280nmでの吸光度がより小さく（第
２図）、且つゲル電気泳動によるタンパク質がより少な
い〕は２つの異なる細胞特異的阻害活性を有する。
ヒト胎盤の酸性エタノール抽出物は、ゲル過クロマト
グラフイステツプの後で、0.05％TFA含有直線アセトニ
トリル勾配を用いるC18カラムのアセトニトリル26〜34
％でやはり溶出するTGI活性を含んでいた。
イオン交換クロマトグラフイ ヒト臍帯の凍結乾燥した酸性化エタノール抽出物1gを0.
01M酢酸アンモニウム、pH4.0中でCM−トリサクリル（TR
ISACRYL）を用いて直接イオン交換クロマトグラフイに
かけた。0.01から1.0Mまでの酢酸アンモニウム、pH4.0
の直線勾配を適用した。第９図は少なくとも４つの別個
のTGI活性、CM−Ｉ、CM−II、CM−III及びCM−IVを示し
ている。CM−Ｉはその時点ではA549ヒト癌種細胞のみを
60％の抑制率で抑制していた（表２）。CMピークII及び
IIIはA549ヒト癌腫に対しても（夫々80％及び63％）ミ
ンク細胞に対しても（夫々61％及び76％）同程度の増殖
阻害活性を示す。最後の活性ピーク（CM−IV）はミンク
に対する活性特異的を示す（即ちミンク細胞の抑制率
（95％）の方がA549ヒト癌種細胞の抑制率（69％）より
高かつた）。負電荷樹脂を用いるとCM−Ｉは保持され
ず、CM−IIは多少遅れた。これはCM−ＩもCM−IIも0.01
M酢酸アンモニウム、pH4.0により勾配が開始される前に
溶出されたからである。
阻害活性を有するタンパク質はいずれもpH4.0で溶解し
得且つ負電荷樹脂に結合するため酸性タンパク質である
が、ピークCM−III及びIVはCM−トリスアクリル樹脂
（0.5M以上の酢酸アンモニウムで溶離）により強く結合
するため、恐らくそれより少し塩基性である。このこと
は正電荷樹脂（即ちDEAE−トリスアクリル）によつて保
持されるTGI活性は皆無であつたという事実によつて実
証される（データ図示せず）。より酸性の阻害因子は夫
々の活性がA549ヒト癌腫細胞に対してより大きな特異性
を示すと思われる。これら４つのTGI活性ピーク（CM−
Ｉ、CM−II、CM−III及びCM−IV）は繰返し観察された
（CM−トリスアクリルを用いる６つの別個のクロマトグ
ラフイ処理）。CM−III及びCM−IVに観察されるTGI活性
がカラムからより早く溶離され得るような物質を生じな
いようにし、且つ各活性ピークが別個の存在であるとい
う概念を裏付けるために、CM−III及びCM−IVからの物
質をプールし、凍結乾燥し、且つこの物質が由来するカ
ラムと同じ条件下でCM−トリスアクリルを用いて再びク
ロマトグラフイにかけた。CM−III及びCM−IVはこれら
を誘導せしめた元のカラム分画と全く同じ位置に溶出し
た（0.5M酢酸アンモニウムより大）（第10図）。ミンク
細胞に対するより高いTGI阻害活性は保持され、２つの
細胞系に対する阻害活性相互間の差は活性ピークを中心
に25〜30％で全く同等に維持された。
組織由来腫瘍細胞増殖阻害活性（TGI）の物理学的及び
生物学的特徴 バイオ−ゲルP10によるゲル過クロマトグラフイの結
果得られた分画２、４及び６を熱処理するか（表３）、
又はジチオトレイトール（DTT）処理による還元（表
４）にかけた。テストした分画はいずれも熱処理又は酸
処理の後でTGI活性を保持していた（表５参照）。分画
２、４及び６はヒト癌細胞の成長を抑制し且つヒト正常
細胞の成長を刺激することが判明した。分画２及び６の
TGI活性はDTTで処理すると減少したが、分画４のTGI活
性は少し増加した（表４）。このデータも別個のTGIの
存在を立証する。
TGI活性テストにかけた分画のタンパク質濃度は15〜300
μｇであつた。
TGI活性テストにかけた分画のタンパク質濃度は15〜300
μｇであつた。
TGIテストにかけた分画のタンパク質濃度は５〜300μｇ
であつた。
実験の第２部 材料及び方法 血液、静脈及び動脈を除去した組織抽出物からの組織由
来腫瘍増殖阻害物質（TGI）の分離 ヒト臍帯組織から静脈及び動脈を除去し、残りの組織を
入念に洗浄して血液を除去した後、第１部の実験で説明
したように酸／エタノール抽出にかけた。
この組織の洗浄及び均質化に用いたバツフアー（PBS−P
A）はNaCl16gと、Na2HPO4・H2O2.5gと、NaH2PO4・7H2O
0.4gと、フツ化フエニルメチルスルホニル（PMSF）（シ
グマ（Sigma）P7627）116mgと、アプロチニン（Aprotin
in）（0.9％NaCl及び0.9％ベンジルアルコール中にトリ
プシン抑制因子19.8単位/mlを有するシグマA6012）とを
含む水２をHCl及びNaOHでpH7.4に調整したもので構成
した。抽出バツフアは95％（v/v）エタノール（パンク
チリマス,190プルーフ，米国インダストリカルケミカル
ズ（U.S.Industrical Chemicals）、＃UN 1170）375ml
と、濃HCl7.5mlと、フツ化フエニルメチルスルホニル
（PMSF）（シグマＰ−7627）33mgとアプロチニン（シグ
マA6012）1mlとを４℃の蒸留水192mlと混合したもので
構成した。800〜1,000gの凍結したヒト臍帯（アドバン
スト・バイオテクノロジーズ（Advanced Biotechnologi
es）；−80℃で保存）をPBS−PA中に４℃で２時間浸漬
することにより解凍した。個々の臍帯を取出し、PBS−P
Aで洗浄した。４℃で切解して臍帯から静脈及び動脈を
除去した。切解処理した臍帯を新しいPBS−PAで洗浄し
て残留血液と血管破片とを除去した。
この組織を４℃冷却キユイジナール（Cuisinart）フー
ドプロセツサ（モデルDLC−７−PRO）内に配置し、200m
lの４℃PBS−PA中に懸濁した。この懸濁組織を前記フー
ドプロセツサにより均質化した。最初の１分間の均質化
後、更に200mlの４℃PBS−PAを加えた。この組織懸濁液
を４℃で合計10分間均質化した。得られたホモジネート
を200ml遠心分離ボトル（ソーバル（Sorvall））に移
し、ソーバルGSAロータを備えたソーバルRC5B遠心分離
器で４℃で５分間9000rpm（RCF＝13,000）の遠心分離処
理にかけた。上澄み流体を除去して廃棄し、ペレツトを
新しいPBS−PAで元のホモジネート量まで再懸濁した。
上澄み流体が透明になり、汚染血液又は血液生成物から
の赤い色がなくなるまで前述の如き遠心分離及び再懸濁
を繰返してペレツトを洗浄した。洗浄後得られたペレツ
トは白色であつた。この洗浄ペレツトを元の切解組織1g
当り6mlの最終容量で抽出用バツフア中に再懸濁した。
得られたホモジネートを３インチ撹拌棒付４大ビーカ
ーに移し、LAB−ラインマルチマグネスター（Multimagn
estir）マルチミキサー、モデル＃1278の最大撹拌能力
の1/2で撹拌した。４℃で撹拌しながら一晩抽出処理し
た後ホモジネートを１遠心分離ボトル（ソーバル）に
移し、ソーバルＨ−6000Aロータを備えたソーバルRC−3
B遠心分離器内４℃で30分間3500rpm（RCF＝3570）の遠
心分離にかけた。上澄みを４大ビーカーに移し、濃水
酸化アンモニウムをゆつくり加えながらpH5.0に調整し
た。pHを増大しても上澄みは薄い黄色を帯びた透明のま
まであつた。酢酸アンモニウム2.0M溶液、pH5.2を合計
量の１％の量で加えた。このステツプで生じた沈殿物は
ソーバルRC−3Bにより４℃で４時間4500rpm（RCF＝590
0）で遠心分離することにより完全に除去した。上澄み
を６大フラスコに移し、これに４倍容の無水エーテル
（−20℃）（ベーカー（Baker）＃9244−３）と２倍容
の95％エタノール（４℃）とを加えた。この混合物を静
止状態下−20℃で48時間放置し、形成される沈降物を定
着させた。
48時間沈殿処理した後、この物質を換気フード（fumeho
od）内で室温にした。酸性化エタノール抽出物を室温ま
で暖めると前記沈殿物の凝集が促進される。水吸引器に
よりエーテル及びエタノールの透明有機相を除去し、残
留有機相を蒸発させるべく沈殿物を換気フード内に数時
間放置した。乾燥窒素ガスを抽出物の上に緩やかに流し
て、沈殿物と共に存在する残留有機溶媒の蒸発を促進し
た。「乾燥」した沈殿物を1.0M酢酸中に溶解し、分子量
カツトオフ3500の透析膜（スペクトロポ−3,スペクトラ
ム・メデイカル・インダストリーズ，ロスアンゼルス，
カリフオルニア）を用いて1.0M酢酸（ベーカー＃9507−
５）に対し十分に透析した。透析後の酸性化抽出物をコ
ーニング（Corning）の250ml円錐状遠心分離管（コーニ
ング25350）内で凍結乾燥し、粗酸性化エタノール抽出
物として保存するか、又は20mM NH4O2C2H3,pH4.5に対し
て入念に透析した。
実験の第１部で説明したように処理した組織からの最初
の酸／エタノール抽出物のTGI活性と前述の如く処理し
た組織の場合のTGI活性との比較 組織を前述の如く処理した場合に見られる特異的活性と
合計回収活性との増加を表６に示す。この表は第１部で
説明した手順（以後「最初の手順」と称する）に従つて
処理した時の凍結臍帯と前述の如く（以後「改良手順」
と称する）処理した凍結臍帯とに関するタンパク質及び
TGI活性の収量を比較するものである。
これら２つの手順には、後で行なわれるTGI精製にとつ
て重要な明らかな差異が幾つか存在する。例えば組織の
湿潤重量に基づくと、最初の手順による酸性化エタノー
ル抽出ではタンパク質として0.33％（1000gの組織から
3.3g）が回収されるのに対し、改良手順に従うと0.015
％がタンパク質として（340gの組織から0.05g）抽出さ
れるにすぎない。改良手順を用いた場合の活性収量（3.
3×106単位）は最初の手順の場合より66％少ない組織
（340g対1000g）から得られ、最初の手順により得られ
る収率（２×106単位）より50％大きいため、全体的抽
出効率は増大したことになる。最初の手順では臍帯1g
（湿潤重量）当り2000単位のTGI活性が得られた。改良
手段では臍帯1g（湿潤重量）当り9700単位のTGI活性が
得られた。全体的抽出効率は改良手順に従うと５倍増加
した。また、酸性化エタノールによつてより少ないタン
パク質が抽出されたことから、抽出タンパク質を沈澱さ
せるのに必要なエーテル及びエタノールの量もよりも少
ない。更に、改良手順では抽出されるタンパク質の量及 びタンパク質の種類の数がより少ないため、後で用いる
べき精製過程でもより少ないクロマトグラフイ材料と、
より短い処理時間と、より少ないステツプとで純粋生成
物を得ることができる。
陽イオン交換樹脂CM−トリサクリルでの改良手順により
抽出したTGIの分別は、結合物質を０〜1.0M NaClの直線
勾配によつて溶離した時に施用タンパク質の大部分から
単一ピークとして溶出された。第11図はTGIをCM−トリ
サクリルカラムに施用した場合、この樹脂に結合してい
ない材料（即ち分画１〜24）からは阻害活性が全く検出
されなかつたという事実を示している。NaClを増量しな
がら直線的に加えると（−−）、樹脂に結合したタンパ
ク質の大部分（分画25〜38）が除去され、次いで有意量
の阻害活性（▽…▽，分画39〜49）が除去された。結合
TGIの除去に最も有効なNaCl濃度は約0.6Mであつた（分
画44）。第11図と第10図との比較から推察されるよう
に、第11図の実験で溶出される阻害活性は、溶出用塩濃
度（第11図ではNaCl,第10図ではNH4O2C2H3）が互に類似
している（第11図では0.6M,第10図では0.6〜0.7M）た
め、第９図に示したようなCM−トリスアクリルからのCM
−III及びCM−IVの溶離に極めて近いと思われる。この
データも、改良手順によつて組織を処理すればシングル
タイプのTGIが優先的に分離され、従つてその後の該因
子の特徴が向上することを示唆している。
改良手順による組織から抽出されるTGIの別の特徴は陰
イオン交換樹脂に結合しないことにある。第12図は、こ
の図の説明の項で述べたようにpHを8.0に調整し、且つ
抽出物を（第11図の場合と同じ量）陽イオン交換樹脂DE
AE−トリスアクリルに施用した結果、大部分の阻害活性
が非結合物質（分画１〜30）に対応する一方で、施用タ
ンパク質の大部分（280nmでの吸光度によつて規定）
（−）がカラム樹脂に結合したことを示している。これ
らの結果は第12図の条件では汚染タンパク質がTGIから
除去され得、従つてTGI精製に有用な方法であることを
意味する。これらの結果は更にTGIがpH8.0では陰イオン
交換樹脂に結合しないため陽イオンであることを示して
いる。また、改良手順によつて抽出されるTGIがイオン
特性において、最初の手順でイオン交換樹脂により抽出
されるポリペプチド（GTI−1,TGI−2,CM−I,CM−II,CM
−III及びCM−IV）に類似していることも第12図の結果
から知見される。何故なら前記ポリペプチドはいずれも
陰イオン交換樹脂に結合しないからである。
大量の試料がCM−トリサクリルによつて再現可能に分別
され得、そのため後の精製過程用により多くのTGIを供
給し得る。第13図では組織抽出物9.9mgを、より小さい
試料サイズ（2.65mgのタンパク質）とより小さいCM−ト
リサクリルカラム（5ml）とを用いる第12図の条件と同
じクロマトグラフイ条件でCM−トリスアクリルカラム
（15ml）に施用した。NaCl直線勾配による大部分のタン
パク質物質からのTGI活性の溶出は本質的にこれら２つ
の実験のいずれでも同じであつた。
第14図はｕボンダパツクC18カラムを用いるHPLCによるC
M−トリサクリルカラムからのプール試料（第13図、分
画59〜78）の分別を示している。試料施用後、アセトニ
トリル濃度を0.〜25％までに直線的に増加しても有意な
阻害活性は観察されなかつた。しかしながら、A549（ヒ
ト肺癌腫）及びCCL64（ミンク肺、０−０）の双方に対
するTGI活性は28〜34％アセトニトリル（分画21〜31）
で単一ピーク状に溶出し、一方206nmで吸光する材料の
大部分はより低いアセトニトリル濃度（分画11〜19）と
より高いアセトニトリル濃度（分画37〜50）とで溶出し
た。活性プロフイルと、206nmでの吸光度と、TGI活性を
有効に溶出せしめるアセトニトリル濃度とが第７図と第
14図との間で類似しているという事実は、改良手順によ
り分離されるTGIが実験の第１部でTGI−１と名付けたも
のに類似しているか、又はこれと同じであることを強く
立証するものである。
既知分子量の適切なタンパク質基準を用いて、ゲル過
クロマトグラフイ（セフアデツクスＧ−50,データ図示
せず）によりTGI（最初の手順でTGI−１、CM−III及びC
M−IVと称するもの）の見掛け分子量を測定した。或る
種の干渉タンパク質（例えばヘモグロビン）が存在しな
い場合には、TGI見掛け分子量は非変性条件下で20kDa〜
30kDaの間であると判明した。
ここで詳述した改良手順は、最初の手順で説明したよう
に調製したTGI含有抽出物から不活性又は干渉性化合物
を除去するための強力で簡単な方法を表わしている。こ
の改良手順はまた、必要なクロマトグラフイ材料の量を
減らし、従つてTGIの処理時間を減らすことによりTGIの
分離に用いられる種々のクロマトグラフイ操作ステツプ
の効率を向上せしめる。加えて、既述の如く、ここで説
明した如き臍帯からのTGI抽出法は、先に説明した手順
によるよりも高い再現性をもつてTGI及び他のタンパク
質をクロマトグラフイ処理せしめる。
改良手順に従つて分離したTGIの特徴を逆相高性能液体
クロマトグラフイ及びCM−トリスアクリルイオン交換ク
ロマトグラフイの双方におけるクロマトグラフイ特性に
関して調べた。TGIはrp−HPLCによるTGI−１と類似し
た、又は同じ特性を示し（第７図及び第14図を比較せ
よ）従つて類似の、又は同等の疎水性を有し、且つ陽イ
オン交換樹脂ではCM−III及びCM−IVと類似又は同じ特
性を示し（第９図及び第11図を比較）、従つて類似又は
同等のイオン特性を有することが判明した。従つて、改
良手順で分離されたTGIと、TGI−１と、CM−III及びCM
−IVとは類似又は同等のイオン特性及び疏水性を有する
類似又は同じ化合物であり、従つて類似又は同じ組成を
有すると結論される。従つて、本明細書で説明した改良
手順を用いれば、より高度な分析及び特徴検査に必要な
より純粋な形態のTGIを得るためのより有効な方法が得
られる。
【図面の簡単な説明】
第１図〜第14図は、本発明の抽出物からの種種の条件で
の活性成分の溶出パターンを示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 レスリー・アイ・ゴールド アメリカ合衆国 ニユー・ヨーク 10028 ニユー・ヨーク、イースト・エイテイー サード・ストリート 500

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記の工程ａ）〜ｆ）によってヒトの臍帯
    から得ることができる精製組織由来増殖阻害物質−１
    （TGI−１）ポリペプチド： ａ） ヒトの臍帯を酸−エタノールで処理・抽出し、酸
    −エタノール細胞抽出物を生成し、 ｂ） 酸−エタノール抽出物をゲル濾過カラムにかけ、
    溶出してゲル濾過溶出物を得、 ｃ） ゲル濾過溶出物を、高速液体クロマトグラフィー
    カラムにかけて、0.05％のトリフルオロ酢酸を含有する
    26〜34％アセトニトリル勾配によって溶出するかもしく
    は0.05％のトリフルオロ酢酸を含有する17〜34％２−プ
    ロパノール勾配によって溶出して可溶化したポリペプチ
    ドを含有するHPLC溶出物を生成し、 ｄ） 可溶化したポリペプチドを回収し、 ｅ） 回収したポリペプチドをアッセイして、樹立ミン
    ク肺細胞系（CCL64）の成長を阻害するか、あるいは正
    常なヒト包皮フィブロブラストの成長を促進するものを
    同定し、そして ｆ） こうして同定された見かけの分子量が5,000〜16,
    000ダルトンの精製組織由来増殖阻害物質（TGI−１）を
    回収する。
  2. 【請求項２】下記の工程ａ）〜ｆ）によってヒトの臍帯
    から得ることができる組織由来増殖阻害物質−１（TGI
    −１）ポリペプチドの有効量及び適切な薬剤担体からな
    る細胞増殖阻害用薬剤組成物： ａ） ヒトの臍帯を酸−エタノールで処理・抽出し、酸
    −エタノール細胞抽出物を生成し、 ｂ） 酸−エタノール抽出物をゲル濾過カラムにかけ、
    溶出してゲル濾過溶出物を得、 ｃ） ゲル濾過溶出物を、高速液体クロマトグラフィー
    カラムにかけて、0.05％のトリフルオロ酢酸を含有する
    26〜34％アセトニトリル勾配によって溶出するかもしく
    は0.05％のトリフルオロ酢酸を含有する17〜34％２−プ
    ロパノール勾配によって溶出して可溶化したポリペプチ
    ドを含有するHPLC溶出物を生成し、 ｄ） 可溶化したポリペプチドを回収し、 ｅ） 回収したポリペプチドをアッセイして、樹立ミン
    ク肺細胞系（CCL64）の成長を阻害するか、あるいは正
    常なヒト包皮フィブロブラストの成長を促進するものを
    同定し、そして ｆ） こうして同定された見かけの分子量が5,000〜16,
    000ダルトンの精製組織由来増殖阻害物質（TGI−１）を
    回収する。
  3. 【請求項３】下記の工程ａ）〜ｆ）によってヒトのヒト
    の臍帯から得ることができる組織由来増殖阻害物質−１
    （TGI−１）ポリペプチドの有効量及び適切な薬剤担体
    からなる創傷治癒又は火傷治療用薬剤組成物： ａ） ヒトの臍帯を酸−エタノールで処理・抽出し、酸
    −エタノール細胞抽出物を生成し、 ｂ） 酸−エタノール抽出物をゲル濾過カラムにかけ、
    溶出してゲル濾過溶出物を得、 ｃ） ゲル濾過溶出物を、高速液体クロマトグラフィー
    カラムにかけて、0.05％のトリフルオロ酢酸を含有する
    26〜34％アセトニトリル勾配によって溶出するかもしく
    は0.05％のトリフルオロ酢酸を含有する17〜34％２−プ
    ロパノール勾配によって溶出して可溶化したポリペプチ
    ドを含有するHPLC溶出物を生成し、 ｄ） 可溶化したポリペプチドを回収し、 ｅ） 回収したポリペプチドをアッセイして、樹立ミン
    ク肺細胞系（CCL64）の成長を阻害するか、あるいは正
    常なヒト包皮フィブロブラストの成長を促進するものを
    同定し、そして ｆ） こうして同定された見かけの分子量が5,000〜16,
    000ダルトンの精製組織由来増殖阻害物質（TGI−１）を
    回収する。
  4. 【請求項４】ヒトの臍帯から精製した組織由来増殖阻害
    物質−１（TGI−１）の製造方法であって、 ａ） ヒトの臍帯を酸−エタノールで処理・抽出し、酸
    −エタノール細胞抽出物を生成し、 ｂ） 酸−エタノール抽出物をゲル濾過カラムにかけ、
    溶出してゲル濾過溶出物を得、 ｃ） ゲル濾過溶出物を、高速液体クロマトグラフィー
    カラムにかけて、0.05％のトリフルオロ酢酸を含有する
    26〜34％アセトニトリル勾配によって溶出するかもしく
    は0.05％のトリフルオロ酢酸を含有する17〜34％２−プ
    ロパノール勾配によって溶出して可溶化したポリペプチ
    ドを含有するHPLC溶出物を生成し、 ｄ） 可溶化したポリペプチドを回収し、 ｅ） 回収したポリペプチドをアッセイして、樹立ミン
    ク肺細胞系（CCL64）の成長を阻害するか、あるいは正
    常なヒト包皮フィブロブラストの成長を促進するものを
    同定し、そして ｆ） こうして同定された見かけの分子量が5,000〜16,
    000ダルトンの精製組織由来増殖阻害物質（TGI−１）を
    回収する ことからなる前記方法。
  5. 【請求項５】被検者からの試料中に存在するTGI−１の
    量を定量し、こうして決定された量を正常人からの試料
    中に存在する量と比較することから成り、その量の有意
    の差が腫瘍の存在を示すものである腫瘍の存在の検出方
    法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4886747A (en) * 1985-03-22 1989-12-12 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding TGF-β and its uses
US5284763A (en) * 1985-03-22 1994-02-08 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding TGF-β and its uses
NZ222168A (en) * 1986-10-20 1991-05-28 Oncogene Science Inc Tumour growth inhibiting protein related to tgf-#b#1 and tgf-#b#2, preparation by genetic engineering methods, antibodies and pharmaceutical compositions
DE3907822A1 (de) * 1989-03-10 1990-09-13 Adolf Dr Loefflmann Verwendung einer peroxidaseaktivitaet zeigenden proteinfraktion aus dem photosyntheseapparat von pflanzen als arzneimittel, insbesondere zur krebsbekaempfung, sowie verfahren zur gewinnung einer proteinmischung und arzneimittel zur krebsbekaempfung
GB9106678D0 (en) * 1991-03-28 1991-05-15 Ferguson Mark W J Wound healing
RU2065307C1 (ru) * 1994-12-13 1996-08-20 Александр Васильевич Тихонов Способ лечения первичного рака печени и набор для лечения первичного рака печени
AU3556400A (en) 1999-03-17 2000-10-04 Novartis Ag Pharmaceutical compositions
RU2240810C2 (ru) * 2002-01-30 2004-11-27 Левон Никитович Мкртчян Эмбриональный противоопухолевый модулятор мкртчяна, способ его получения и применения

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5221570B2 (ja) * 1973-08-30 1977-06-11
AU3108984A (en) * 1983-06-03 1985-01-04 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Purified transforming growth factor-beta derived from human platelets and placentas
US4524026A (en) * 1983-08-29 1985-06-18 Yoshio Sakagami Novel proteinous cancer-cell proliferation inhibitory factors

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