RU2038087C1 - Способ получения вещества из кожи свиньи, влияющего на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека - Google Patents
Способ получения вещества из кожи свиньи, влияющего на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2038087C1 RU2038087C1 SU5057017A RU2038087C1 RU 2038087 C1 RU2038087 C1 RU 2038087C1 SU 5057017 A SU5057017 A SU 5057017A RU 2038087 C1 RU2038087 C1 RU 2038087C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- differentiation
- substance
- human keratinocytes
- pig skin
- column
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, в частности к фармацевтической промышленности, и может найти применение при получении препаратов для лечения заболеваний кожи. Сущность изобретения: кожу свиньи измельчают, готогенизируют в растворе хлористого натрия, центрифугируют, подвергают термоденатурации при 75 - 85°С в течение 10 - 20 мин, центрифугируют при 5000 - 15000 g в течение 10 - 30 мин, обрабатывают охлажденным до - 20°С (или ниже) ацетоном в соотношении (1 : 6) - (1 : 8), высушивают при комнатной температуре, растворяют в 0,005 - 0,015 М растворе трис - HCl + 0,15 M Na Cl, pH 6,0 - 8,0, хроматографируют на колонке с сефадексом G - 50, собирают фракцию с мол.м. от 1400 до 15000 Д, обессоливают и лиофилизируют. По сравнению с известными предлагаемый способ позволяет существенно упростить технологию и ускорить способ получения вещества в 2, 4 раза. Вещество, выделенное предлагаемым способом, ингибирует пролиферацию кератиноцитов человека и способствует завершению их дифференцировки. 2 табл.
Description
Изобретение относится к медицине, в частности к фармацевтической промышленности, и может найти применение при получении препаратов для лечения заболеваний кожи.
Известен способ получения вещества из кожи свиньи путем ее лиофилизации, экстракции лиофилизата водой, преципитации препарата этанолом, экстракции неактивного материала н-бутанолом, ацетоном, этилацетатом, хлороформом и смесью хлороформ метанол (1:1), экстракции активного материала смесью хлороформ метанол вода (5:5:1), хроматографии на колонке с сефакрилом 300 в растворе PBS с 0,2%-ным тритоном Х-100 и диализом против воды. Однако процесс получения вещества довольно сложен и занимает много времени, приходится работать с токсическими растворителями.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения пентапептида из кожи мышей, ингибирующего пролиферацию и стимулирующего дифференцировку кератиноцитов мыши и человека, путем измельчения кожи в растворе хлористого натрия, получения водно-солевого экстракта, центрифугирования, лиофилизации, обработки уксусной кислотой, хроматографии на колонке с сефадексом G-25, хроматографии на колонке с обращенной фазой, катионно-обменной и анионо-обменной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и лиофилизации. Однако этот способ достаточно сложен, громоздок и занимает много времени.
Цель изобретения упрощение технологии и сокращения времени получения вещества, влияющего на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов. Для этого кожу свиньи измельчают, гомогенизируют в растворе хлористого натрия, центрифугируют, подвергают термоденатурации при 75-85оС в течение 10-20 мин, центрифугируют при 5000-15000 g в течение 10-30 мин, обрабатывают охлажденным до -20о (или ниже) ацетоном в соотношении 1:6 1:8, высушивают при комнатной температуре, растворяют в 0,005-0,015 М растворе трис-НСl + 0,15 М NaCl, рН 6,0-8,0; хроматографируют на колонке с сефадексом G-50, собирают фракцию с молекулярной массой от 1400 до 15000 Д, обессоливают и лиофилизируют.
Температура термоденатурации (75-85оС) и время термоденатурации подобраны таким образом, что нужное вещество остается в растворе, в то время как часть неактивного материала денатурируется. Центрифугирование при 5000-15000 g в течение 10-30 мин подобрано так, что в течение этого времени денатурированные белки удаляются. При центрифугировании ниже 5000 g и менее 30 мин часть денатурированного неактивного материала остается в супернатанте, что загрязняет препарат. Увеличивать скорость центрифугирования более 15000 g и время более 10 мин не имеет смысла, так как при этих условиях денатурированный материал полностью осаждается. Применение ацетона с температурой выше -20оС приводит к денатурации активного материала. Снижение соотношения супернатант ацетон ниже 1:6 приводит к потере активного вещества. Увеличение соотношения выше 1:8 приводит к агрегации и выпадению в осадок неактивного материала. Выбор концентрации буфера (0,005-0,015 М) и его рН (6,0-8,0) обусловлен тем, что в нем не происходит потери активности получаемого вещества, в то же время препарат хорошо разделяется по молекулярным массам на сефадексе G-50. Хлористый натрий до концентрации 0,15М добавляется к буферу для того, чтобы можно было определять активность вещества в пробах сразу после разделения на сефадексе.
В табл. 1 представлено сравнение двух способов выделения: известного и предлагаемого. Как видно из этих данных, известный способ включает 18 стадий, в то время как предлагаемый лишь 10 стадий. Если сравнить время выделения, то по известному способу требуется 8,5 суток, в то время как по предлагаемому лишь 3,5.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет существенно упростить технологию и сократить время получения вещества в 2,4 раза. П р и м е р 1 (известный способ). 10 г кожи (используют кожу мыши) измельчают ножницами, гомогенизируют в 50 мл физиологического раствора, соотношение вес ткани: объем физ. раствора 1:5. Гомогенат центрифугируют при 1500 g в течение 30 мин при +5оС. Супернатант лиофильно высушивают и обрабатывают 1М раствором уксусной кислоты в течение 2 ч при +4оС. Затем 15 мл раствора наносят на колонку с сефадексом G-25, уравновешенную 0,5М раствором уксусной кислоты. Низкомолекулярный материал собирают и наносят на колонку с обращенной фазой С-18 (Bondapak C18) Porasil B37-75 mu<N>), затем на колонку с катионообменником Dowex 50 в Н+ форме. Фракции, элюирующиеся 0,2 М муравьиной кислотой, собирают и подвергают анионообменной хроматографии на колонке с Dowex 1. Фракцию, не связавшуюся с колонкой, собирают, лиофилизируют и хроматографируют на колонке с Fractogel MG-2000. Собирают низкомолекулярную фракцию и разделяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на Partisil М-9, активную фракцию подвергают рехроматографии на той же колонке. Получают пентапептид, ингибирующий пролифеpацию и способствующий завершению дифференцировки кератиноцитов мыши и человека.
П р и м е р 2 (предлагаемое изобретение). Свиную кожу измельчают ножницами, гомогенизируют в физиологическом растворе. На 50 г кожи берут 650 мл физиологического раствора (соотношение вес ткани объем физ. раствора 1:13). Гомогенат центрифугируют при 2500 g в течение 30 мин при +4оС. Осадок отбрасывают, супернатант в объеме 630 мл подвергают термоденатурации при 75оС в течение 20 мин на водяной бане при постоянном перемешивании, смесь охлаждают в ледяной бане до +4оС. Денатурированный материал осаждают центрифугированием при 10000 g в течение 20 мин при +4оС. Супернатант в объеме 620 мл прикапывают к 4 л ацетона, охлажденного до -20оС. Выпавший осадок отмывают охлажденным ацетоном и высушивают под тягой при комнатной температуре. В результате получают 800 г ацетонового порошка (800 ± 50 мг). Порошок растворяют в 30 мл 0,01М трис-HCl буфера + 0,15М NaCl, рН 8,0 в течение 1 ч при комнатной температуре. Нерастворимую часть удаляют центрифугированием при 500 g в течение 10 мин при +4оС. Супернатант хроматографируют на колонке с сефадексом G-50 (2,5х80 см), уравновешенной тем же буфером. Собирают фракцию с молекулярной массой от 1400 до 15000 Д и лиофилизируют. Затем растворяют в 20 мл дистиллированной воды и обессоливают на колонке с сефадексом G-15. Собирают фракцию, выходящую в свободном объеме, и лиофилизируют. Получают вещество, ингибирующее пролиферацию и способствующее завершению дифференцировки кератиноцитов человека. Фракции с молекулярными массами более 15000 Д и менее 1400 Д не обладали подобными свойствами.
Данные о влиянии полученного вещества на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека представлены в табл.2. Выделение и культивирование кератиноцитов проводили по методу Рейнвальда и Грина. Уровень клеточной пролиферации оценивали, определяя количество выросших за 14 дней клеток. Дифференцировку кератиноцитов оценивали по их способности образовывать роговые оболочки. Выделенное вещество использовали в концентрации 100 мкг/мл.
Как видно из данных, представленных в табл.2, выделенное вещество в концентрации 100 мкг/мл ингибирует пролиферацию кератиноцитов человека и способствует завершению их дифференцировки. Использование вещества в концентрации 10 и 1 мкг/мл не выявило влияния на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека.
Claims (1)
- СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА ИЗ КОЖИ СВИНЬИ, ВЛИЯЮЩЕГО НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ КЕРАТИНОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА, путем гомогенизации кожи в растворе хлористого натрия, центрифугирования, обессоливания и лиофилизации, отличающийся тем, что, с целью упрощения технологии и ускорения способа получения, супернатант гомогената после центрифугирования подвергают термоденатурации при 75 85oС в течение 10 20 мин, центрифугируют при 5000 15000 g в течение 10 30 мин, обрабатывают охлажденным до 20oС и ниже ацетоном в соотношении (1 6) (1 8), высушивают при комнатной температуре, растворяют в 0,005 0,015 М растворе трис ≃ HCl + 0,15 М NaCl,pH 6,0 8,0, хроматографируют на колонке с сефадексом Gt-50, собирают фракцию с мол. м. 1400 15000 Д.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5057017 RU2038087C1 (ru) | 1992-07-29 | 1992-07-29 | Способ получения вещества из кожи свиньи, влияющего на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5057017 RU2038087C1 (ru) | 1992-07-29 | 1992-07-29 | Способ получения вещества из кожи свиньи, влияющего на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2038087C1 true RU2038087C1 (ru) | 1995-06-27 |
Family
ID=21610734
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU5057017 RU2038087C1 (ru) | 1992-07-29 | 1992-07-29 | Способ получения вещества из кожи свиньи, влияющего на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2038087C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2481113C2 (ru) * | 2011-06-28 | 2013-05-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства (ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России) | Способ получения веществ, влияющих на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека а431 |
-
1992
- 1992-07-29 RU SU5057017 patent/RU2038087C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987, V 146, n 3 p 1493-1501. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2481113C2 (ru) * | 2011-06-28 | 2013-05-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства (ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России) | Способ получения веществ, влияющих на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека а431 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR100378787B1 (ko) | 항-맥관형성활성과종양퇴화효과를갖는상어의연골추출물및그의제조방법 | |
US3822348A (en) | Hormone-like substance having serum calcium reducing property | |
JP2702103B2 (ja) | 腫瘍増殖阻害因子およびその調製方法 | |
KR100347880B1 (ko) | 상어연골추출물,그의제조방법및용도 | |
EP0101063A2 (de) | Neues Polypeptid mit Wirkung auf das Immunsystem, Verfahren zu seiner Isolierung und Reinigung, seine Verwendung und dieses enthaltende Mittel | |
CA1283048C (en) | Therapeutic agent for treating hematopoietic diseases | |
SU1367837A3 (ru) | Способ получени средства, селективно тормоз щего рост или размножение нормальных и лейкемических клеток миелоидов | |
JPH03503530A (ja) | ヒト腫瘍治療薬およびその製造方法 | |
RU2038087C1 (ru) | Способ получения вещества из кожи свиньи, влияющего на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека | |
EP0029893A2 (de) | Verfahren zur Anreicherung tumorhemmender Wirkfaktoren | |
CA1274471A (en) | Tissue-derived tumor growth inhibitors, methods of preparation and uses thereof | |
JPWO2006093164A1 (ja) | ミミズ由来の成分を含むウイルス感染及び増殖阻害剤 | |
Kleinholz et al. | Neurosecretion and crustacean retinal pigment hormone: assay and properties of the light-adapting hormone | |
RU2295963C1 (ru) | Способ получения иммуностимулятора | |
CN111116702A (zh) | 一种多肽提取组合物及试剂盒 | |
CN111087442A (zh) | 一种多肽提取方法 | |
CN104974236A (zh) | 一种蝎毒多肽b4及其分离纯化方法与应用 | |
US7309501B2 (en) | Conditioned media to inhibit growth of tumor cells | |
RU2134581C1 (ru) | Средство для лечения облученных млекопитающих | |
US4041022A (en) | Process for the manufacture of thyrocalcitonin | |
JPS60243018A (ja) | ヒト内来性癌制御因子 | |
CN111346121B (zh) | 牛膝活性提取物的新用途 | |
RU2203070C2 (ru) | Способ получения иммунотропных веществ из кожи свиньи | |
US3655875A (en) | Clam extract effective against sarcoma 180 and krebs-2 carcinoma in mice | |
US4877616A (en) | Process for preparing xerosin II and xerosin III, improved biological response modifiers |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
REG | Reference to a code of a succession state |
Ref country code: RU Ref legal event code: MM4A Effective date: 20110730 |