KR100378787B1 - 항-맥관형성활성과종양퇴화효과를갖는상어의연골추출물및그의제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-맥관형성 특성(실험적으로 유도된 종양에서 생체내 관찰되는 혈관 면적을 감소시키는 것), 생체내에서의 종양 퇴화 활성 및 종양 세포 라인에 대해 직접적인 억제 효과를 갖는 상어 연골 추출물 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 변성 용매나 생성물을 사용하지 않으며, 효소도 사용치 않는다. 본 발명의 방법은 중성 pH의 수용액, 바람직하게는 순수한 물에서 전체 연골 혼합물을 얻고, 이 혼합물을 원심분리에 의해 펠릿과 상등액을 분리하고 추후 공정을 위해 보관하는 것으로 이루어진다. 펠릿을 동결건조시켜 생체내 및 생체외 항종양 및 항-맥관형성 활성에 대해 상등액 존재 또는 부재 하에 테스트한다. 상등액은 생체내에서 항-맥관형성 및 종양 퇴화 활성을 갖는 것으로 나타났다. 상등액의 조성을 여러가지 방식으로 조사하였다. 이 상등액을 분획화하자 그 활성 성분들 몇가지가 특성화되었다. 분획들을 그들의 암 세포 라인에 대한 생체내 직접 활성에 대해 테스트하였으며, 비-분획화된 상등액이 이같은 생체외 활성을 갖는 것으로 추정된다. 동결건조는 이러한 액체 분획들의 활성을 실질적으로 파괴하나, 고체 추출물에서는 그러한 파괴가 관찰되지 않는다.

Description

항-맥관형성 활성과 종양 퇴화 효과를 갖는 상어의 연골 추출물 및 그의 제조 방법
송아지의 어깨 견골이 고상 종양의 혈관 형성을 억제하는 물질을 함유하는 것으로 밝혀졌다(Langer 외, 1976). 이것이 항-종양제로서 커다란 잠재성을 가짐에 따라, 보다 대량의 연골 공급원을 찾게 되었다.
상어는 내골격이 완전히 연골로 이루어져 있기 때문에(송아지의 경우 체중의 0.6%인데 비해 상어의 경우 체중의 6%가 연골임), 상어는 이러한 종류의 항-맥관형성 억제제의 잠재적인 공급원이 되는 동물이다. 상어는 또한 종양 발달 경향이 낮다는 흥미로운 특성을 갖고 있기도 하다. 상어에 있어서 이같이 종양 발달 경향이 낮은 이유를 설명하기 위한 가설이 다수 제기되어 있다. Marchalonis 등(1990)은 IgM 항체가 호전적인 제제에 대해 쉽게 공격할 수 있다는 것을 보여준 바 있다. McKinney 등(1990)은 상어가 정상적인 세포들을 신생(neoplastic) 세포들로부터 분화시켜, 상기 신생 세포들을 파괴할 수 있는 매크로파지를 가지고 있음을 보였다. Rosen과 Woodhead(1980)은 연골어류(elasmobranchs: 상어와 가오리가 이에 속함)에서 종양이 드물게 나타나는 이유가 이들의 높은 체온과 관련된, 이들 조직의 높은 이온 강도에 기인한다는 가설을 세운 바 있다. 이러한 조건에서, 상기 저자들은 그면역계가 100%에 가까운 면역학적 감시 기능을 발휘한다고 믿고 있다. Moore 등(1993)은 상어가 항균성과 항원생동물성을 갖는 아미노스테롤을 생산함을 발견하였다. 마지막으로, Lee와 Lnager(1983) 및 Folkman과 Klagsbrun(1987)은 상어가 신혈관형성을 억제하는 물질을 생산함을 밝혀냈다. Lee와 Langer(상기 문헌)는 변성조건에서 상어의 연골로부터 이 물질을 추출하여 분리하였다(구아니딘 추출). 그러나, 이 추출공정은 그 시간이 오래 걸려(41일 동안), 변성된 인자를 갖는 추출물이 생산될 염려가 있다. 송아지로부터 분리된 활성 물질들의 분자량이 약 16 킬로달톤(kd)인데 비해, 상기 연구자들은 상어로부터 추출된 활성 물질의 정확한 분자량을 제시하기 못하였으며, 이 물질의 분자량이 3500 달톤을 초과한다는 정도로만 정의되어 있을 뿐이다. Oikawa 등(1990)은 Lee와 Langer가 설명한 동일한 방법을 훨씬 짧은 기간(41일이 아니라 2일 동안)에 적용시켰다. Oikawa 등에 의해 상어 연골로부터 분리된 물질은 1000 내지 10000 달톤의 분자량을 갖는다. Schinitsky(USP 4,473,551)는 100,000 달톤을 넘는 조질의 분말상 상어 연골의 수용액 추출물이 단독으로 또는 글루코사민과 배합시 항염 활성을 갖는다고 설명하였다. 이 특허에서는 상기 추출물의 어떤 성분이 항-맥관형성 또는 항종양 활성을 갖는 성분이라는 언급은 전혀 없다. Kuetner 등(USP 4,746,729)은 다형핵 호중구(PMN: polymorpho-nuclear neutrophil) 엘라스타제 억제자를 소의 연골로부터 분리하였다. 이 억제자는 연골의 수용액 추출물로부터 얻어졌으며, 이로부터 분자량 50,000 달톤 미만의 분자들이 유지되었다. Sephacryl S-200 상에서 분획화하자, 많은 분획들이 얻어졌으며 이들 중10-40 kD의 분획이 항-엘라스타제 활성을 갖는 것을 확인하고 이를 따로 모았다. 이 활성 성분의 등전점은 9.5이며 분자량은 약 15,000 달톤 정도이다. Kuetner 등(USP 4,042,457호)은 또한 소의 연골이 상피 세포 성장에 대해서는 아무런 영향을 미치지 않으면서 세포 분화 억제 활성을 갖는 분자량 50,000 달톤 미만이고 상피세포 성장에 어떤 활성도 갖지 않으면서 세포 증식 억제 활성을 갖는 어떤 성분을 가짐을 밝힌바 있다. Spilburg 등(USP 4,243,582)은 분자량 65 kD이고 pI 3.8인 두 가지 당단백질을 소의 연골로부터 분리하였는데(구아니딘-추출) 이들은 항-트립신 활성과 상피세포 성장 억제 활성을 나타내었다.
송아지와 상어의 연골은 리소자임 활성, 세포성장-촉진 활성, 타입 I 및 IV 콜라게나제, 엘라스타제, 및 프로테아제 유사 트립신, 키모트립신 및 플라스민에 대한 억제 활성과 같은 여러가지 생물학적 활성을 갖는다.
상어의 연골 추출물과 분획을 얻는 방법은 이미 알려져 있다. 이들 중 일부는 추출물 전혀 없이 분말화된 조질의 연골을 생산하는 방법일 뿐이다(USP 5,075,112). 그외의 방법들은 구아니딘과 같은 변성제를 이용하는 것이거나(USP 4,243,582), 또는 연골을 둘러싸는 근육, 신경 또는 혈관 조직을 모두 제거하기 위한 효소 반응과 유기 용매를 이용하여 지방을 제거하여(USPs 3,478,146, 4,359,682, 및 4,645,137) 연골 추출물을 얻고, 다른 방법에서는 단순하게 연골의 수용성 추출물을 생산하거나(USP 4,473,551) 또는 불용성 물질을 제거함으로써 연골의 염 용액을 생산하는 것이다(USP 4,746,729). 후자의 방법에 있어서, 특정 분자량의 특정 분획을 추가 연구와 정제를 위해 특별하게 유지시켰다(상기 내용 참조).
요약하면, 상어의 연골은 토끼의 각막 안구 분석 또는 병아리의 장뇨막(CAM: chorioallantoic membrane) 분석에서 일반적으로 테스트되는 항-맥관형성 성분(들)을 함유하는 것으로 알려져 있다. 이제까지, 제모 마우스에 이종이식된 인간의 흑색종에 대해, 생체내에서 종양에 대해 직접 분말화 전 연골이 테스트된 바 있으며(USP 5,075,112), 그의 항-맥관형성 효과를 대해 CAM에서도 이러한 테스트가 수행된 바 있다. 그러나, 종양 세포에 대한 연골 추출물의 직접적인 효과에 대한 증거는 제시된 바 없다.
맥관형성은 암의 발병에만 관련된 것은 아니다. 여러가지 생리적인 계통(괄호 안에 표시)에 영향을 미치는 많은 질환과 증상이 맥관형성-의존성이며 그의 예를 들면 다음과 같다: 관절염 및 동맥경화성 플라크(뼈 및 인대), 당뇨병성 망막증, 혈관신생성 녹내장, 트라코마 및 망막 이식 혈관신생증(눈), 건선, 강피증, 혈관종 및 비후성 낭창(피부), 혈관 부착 및 혈관선유종(혈관계), 따라서, 암 치료뿐아니라 이러한 질환의 치료에도 여하한 신규한 항-맥관형성 인자를 사용할 수 있다.
연골은 무혈관(avascularized) 조직으로서 항-맥관형성(anti-angiogenic) 성분을 함유하는 유력한 후보물질로서 연구되어왔다. 연골은 또한 종양 발육에 대해서도 비교적 내성을 갖는 조직이기도 하다. 연골 관련 종양은 연골 육종은 고상 종양 중 가장 혈관화가 덜된 종양이다. 맥관형성은 종양 발육에 있어서 중요한 인자중 하나이다. 종양 세포가 인접한 혈관망을 유기시켜 그들의 필요 영양원을 충족시킬 수 있는 경우에 불연속적인 종양 덩어리가 나타난다. 따라서, 맥관형성 촉진에 연관된 인자들의 종양 발달에 있어서의 역할이 연구되어 왔으며 항-맥관현성 인자 및 맥관형성 억제 활성을 갖는 약물들 역시 종양 성장을 억제하는 수단 또는 종양의 퇴화를 촉발시키는 수단으로서 연구되어 왔다.
첨부된 도면에 의해 보충 설명되는 다음의 특정 구체예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
도 1은 ZR75-1 및 MCF-7 세포에 대해 상어 연골 (고체 추출물)의 투여량을 증가시킬 경우의 억제 활성을 도시한 도면이다.
도 2는 두 가지 농도의 연골 동결 건조물 존재 또는 부재시 에스트라디올의 농도를 증가시킬 경우 MCF-7 세포의 DNA 함량에 의해 측정되는 MCF-7 세포량의 투여량-반응 곡선이다.
도 3a)와 3b)는 유선암에 걸린 래트에게 강제 사육에 의해 연골 동결 건조물과 상등액의 배합물을 투여한 경우와, 단지 물만 투여한 경우의 간 부위를 비교한 도면이다.
도 4a)와 4b)는 유선암에 걸린 래트에게 강제 사육에 의해 연골 동결 건조물과 상등액의 배합물을 투여한 경우와, 단지 물만 투여한 경우의 신장 부위를 비교한 도면이다.
도 5a)와 5b)는 유선암에 걸린 래트에게 강제 사육에 의해 연골 동결 건조물과 상등액의 배합물을 투여한 경우와, 단지 물만 투여한 경우의 폐 부위를 비교한도면이다.
도 6a)와 6b)는 유선암에 걸린 래트에게 강제 사육에 의해 연골 동결 건조물 과 상등액의 배합물을 투여한 경우와, 단지 물만을 투여한 경우의 유선종양 부위를 비교한 도면이다.
도 7은 상기 도 6a)와 b)로부터 파생된 히스토그램으로서, 종양의 혈관면적에 대한 연골 추출물이 미치는 영향을 도시한 도면이다.
도 8은 Rotofor(Rotofor) 상에 분리된 액상 분획의 비-변성 조건에서의 전기영동 프로필을 나타낸 것으로서; 분자량 마커는 좌측에 표시한 다음에, 분리된 분획과의 비교 목적을 위해, 분획화 전 조질의 투과물 샘플을 나타내었다.
도 9a)와 9b)는 건선을 앓고 있는 두 명의 환자에 있어서 농축된 액상 연골 추출물의 유효량을 함유하는 국소용 조성물로 치료된 경우(아래쪽 사진)를 초기 상태(윗쪽 사진)와 비교하였을 경우, 유의적인 증상의 현저한 개선 정도를 도시한 것으로서, 한 명은 각화증에 걸린 환자이고[9a)], 다른 한 명은 각화증에 걸리지 않은 환자였다.
본 발명은 항-맥관형성 특성(실험적으로 유도된 종양에서 생체내 관찰되는 혈관 면적을 감소시키는 것), 생체내 종양 퇴화 활성 및 종양 세포 라인에 대해 직접적인 억제 효과를 갖는 추출물의 제조 방법에 관한 것이다. 이러한 추출물들은 흔히 Common Spiny dog Fish 및 Black Spiny dog fish (Squalus acanthias)라 불리우는 상어의 연골로부터 유도된다. 이 방법은 변성 용매나 생성물을 사용하지 않으며 효소도 사용하지 않는다. 본 발명의 방법은 중성 pH의 수용액, 바람직하게는 순수한 물에서 연골 전체의 혼합물을 얻고, 이 혼합물을 원심분리하여 펠릿과 상등액을 분리하고, 추후 공정을 위해 보관하는 것으로 이루어진다. 펠릿을 동결건조시켜 생체내 및 생체외 항종양 및 항-맥관형성 활성에 대해 상등액 존재 또는 부재 하에 테스트한다. 상등액은 생체내에서 항-맥관형성 및 종양 퇴화 활성을 갖는 것으로 나타났다. 상등액의 조성을 여러가지 방식으로 조사하였다. 이 상등액을 분획화하자 그 활성 성분들 몇 가지가 특성화되었다. 분획들을 그들의 암 세포 라인에 대한 생체내 직접 활성에 대해 테스트하였으며, 비-분획화된 상등액은 그러한 생체외 활성을 갖는 것으로 추정된다. 동결건조는 이러한 분획들의 활성을 실질적으로 파괴하며 고체상 및 액상 추출물과 그의 분획들이 명백히 구분되어야 한다.
본 발명은 또한 연골 동결 건조물 또는 고체상 추출물, 액상 연골 추출물 및 그의 액상 분획 뿐만 아니라, 이 모든 것들의 제조 방법에 관한 것이기도 하다.
마지막으로, 본 발명은 맥관형성-의존성 질환의 치료에 있어서의 연골 추출물의 용도에 관한 것이기도 하다. 예비적인 임상 시도에 따르면 비분획화된 농축액상 추출물을 함유하는 제약 조성물이 맥관형성-의존성 질환에 걸린 환자의 증상을 개선시키는데 효험이 있는 것으로 밝혀졌다. 이들 중, 건선과 같은 피부관련 장애와 전립선암 케이스가 성공적으로 테스트되었다. 맥관형성-의존성 질환으로서 자료화되지 않은 또 다른 종류의 피부질환인 여드름 역시 놀랍게도 성공적으로 치료되었다. 과도한 혈관신생 현상은 화상 환자에 있어서 비후성 낭창 특성으로 잘 알려져 있다. 본 발명의 연골 추출물을 함유하는 조성물들은 현재 이 현상을 예방하기위해 테스트되고 있다. 활성 성분으로서 액상 연골 추출물을 함유하는 제약 조성물 역시 본 발명의 또다른 목적이다.
발명에 대한 기술
건강한 상어를 포획하여, Black Spiny Dog Fish종 및 Common Spiny Dog Fish 종의 건강한 상어로부터 연골을 얻었다. 에탄올-처리된 매tm와 가위로 근육 및 연결 조직을 긁어내어 이들을 모두 제거하였다. 그 다음에 연골을 플라스틱 백에 넣어 진공포장하고 사용할 때까지 -20 ℃로 냉동시켰다.
동결건조된 연골 준비
연골을 4 ℃로 해동시켰다. 이어서 연골을 역삼투압에 의해 정제된 동량의 물(중량/용량)과 함께 에탄올 처리된 미트 초퍼의 포어를 통해 3회 통과시킨 다음 0.1 ㎛의 필터상에 여과시켜 제 1 혼합물을 얻었다. 연골 성분의 용해 또는 변성을 피하기 위해 중성의 pH만 유지된다면 물 대신 다른 많은 종류의 용액을 사용할 수 있다.
이 혼합물을 10 분간 4 ℃에서 산업용 블렌더에서 최대 속도로 교반시켜 균질화하였다. 이 균질 혼합물을 4 ℃에서 10 분간 Polytron 분해기(disintergrator) 처리함으로써 액화시켰다. 이 단계에서, 잔사 입도는 500 ㎛ 미만이다. 이 혼합물을 13,600 × g에서 4 ℃, 15 분간 원심분리시켰다. 얻어진 펠릿을 24∼48 시간 동안 동결건조시켰다. 이 첫 번째 분획을 이하, 동결 건조물 또는 고상 추출물이라 정의한다.
상등액을 24 ㎛의 Whatman 필터로 여과하여, 초여과 컬럼의 성능에 영향을 미칠 수 있는 입자들을 우선 제거하였다. 여과된 물질을 4 ℃에서 약 500,000 달톤의 공극을 갖는 탄젠트 플로우(tangential flow) 여과 컬럼상에서 초여과 처리하였다. 이 상등액을 0.22 ㎛ 필터상에서 멸균 여과시키고, 추가 사용을 위해 멸균병에 분취시켰다. 이 분획을 앞으로 상등액 또는 액상 추출물이라 칭한다.
다른 방법으로서, 동결 건조물과 상등액을 얻기 위해 좀더 고성능의 공정이 개발되었다. 13600 × g에서 15 분간 원심분리하는 단계에 이어 Whatman 필터상에서 그로스(gross) 필터하는 단계를 공극 30 ㎛의 나일론 포켓이 구비된 CEPA 원심 분리기에서 3000∼4000 × g로 원심분리하는 단계로 대체시켰다. 이러한 방식으로 20 kg/(20 L) 조제물이 30 분내에 원심분리되어 상등액 21 리터를 제공할 수 있다. 얻어진 물층의 부피는 물의 개시 부피보다도 더 컸으며, 이는, 연골 조직 자체의 수분 함량의 일부가 보태졌음을 의미하는 것이다. 동결 건조물과 상등액은 다음 조성을 가질 수 있다:
실질적으로는, 유기 질소(N)을 측정하는 Kjeldahl법에 의해 단백질 함량을 평가한다. 유기 질소량은 다음 방정식에 의해 해당 단백질 양으로 전환시킨다:
탄수화물은 검출되지 않았으며, 이는 하나 또는 다른 추출물 중에, 프로테오글라이칸 및/또는 뮤코폴리사카라이드의 형태로 존재하는 것으로 추정할 수 있다. 이러한 성분들이 측정된 수분에 포함되는 것이 가능하다. 동결 건조물은 -OH기에 의해 측정된 예기치 않은 정도의 수분을 함유한다. 20% 수분 함량은 연골에 있어서 정상적으로 유도된 탄수화물의 백분율에 근접한 것인 반면, 동결 건조물의 습도는 0%에 가까워야 하므로, 이 가정은 검증을 요한다.
다음에 의해 USP XX11 명세 적용을 적용하여 멸균도를 조절하였다;
활성 분석:
동결 건조물:
시험관내 분석:
이 분석은 호르몬 의존성 암 세포 라인 MCF-7 및 ZR75-1(각각 ATCC (R) numbers 22-HTB 및 1500-CRL)에 대해 수행하였다.
ZR75-1 세포:
RPMI 기본 배지:
페놀 레드(Sigma R8755)가 없는 RPMI 1640 52 g, Hepes(유리산; Sigma H0763) 17.875 g, 나트륨 피루베이트(Sigma P5280) 0.55 g, 및 NaHCO310 g를 순수한 물 5 L에 혼합하고 NaOH를 이용하여 pH 7.40으로 조정하였다.
즉시 사용하지 않을 경우, 빛에 민감한 물질 보호를 위해 이 용액을 빛으로부터 차단하여야 한다. 이 용액을 여과하여, 500 mL 멸균병에 담고 4 ℃에서 최대 3 개월간 저장하였다.
세포 배양물 유지용 배지:
RPMI 기본 배지를 10%(v/v) FBS(소의 태아 혈청), [100 U 페니실린 G/50 ㎍ 스트렙토마이신 설페이트(Sigma P0906)]/mL 배지, 2 mM L-글루타민(Sigma G1517), 및 1 nM E2(β-에스트라디올 Sigma E8875)로 보강하였다.
실험용 배지:
RPMI 기본 배지를 5% FBSA(덱스트란-차콜상에 흡착된 송아지 태아 혈청), 2 mM L-글루타민, (100 U 페니실린 G/50 ㎍ 스트렙토마이신 설페이트)/(mL 배지), 및 50 ng/mL 인슐린(Sigma)으로 보강시켰다. 이 배지에 상기 동결 건조물을 농도를 증가시키면서 첨가하고, 여러 농도의 에스트라디올(10-12내지 10-5M)을 함께 첨가하였다.
MCF-7 세포:
DME-F12 기본 배지:
DME-F12 배지(중탄산염과 레드 페놀 함유하지 않음: Sigma)를 제조업자의 지침에 따라 순수한 물에 재조성하였다. 1 리터당, 중탄산나트륨 1.2 g을 첨가하고 pH를 NaOH/HCl을 이용하여 7.40으로 조정하였다. 이 용액을 여과하고 500 mL 멸균병에 넣어 4 ℃에서 최대 3개월간 저장하였다.
세포 배양 유지용 배지:
DME-F12 기본 배지를 10%(v/v) FBS(소의 태아 혈청), (100 U 페니실린 G/50 ㎍ 스트렙토마이신 설페이트)/(mL 배지), 2 mM L- 글루타민(Sigma), 및 1 nM E2(에스트라디올)로 보강시켰다.
실험용 배지:
DME-F12 기본 배지를 5% FBSA(덱스트란-차콜상에 흡착된 송아지 태아 혈청), 2 mM L-글루타민, (100 U 페니실린 G/50 ㎍ 스트렙토마이신 설페이트)/(mL 배지), 및 50 ng/mL 인슐린(Sigma)으로 보강시켰다. ZR75-1 세포의 경우에서처럼, 동결 건조물과 에스트라디올을 동일한 농도로 첨가하였다.
FBSA의 제조:
송아지의 태아 혈청을 1% (w/v) 차콜(charcoal: 탄소 탈색 알칼리)과 혼합하였다. 상기 차콜-혈청 용액에 덱스트란 T70 용액을 첨가하여 0.1%(w/v)의 농도가 되도록 하였다. 상기 혼합물을 4 ℃에서 밤새 교반하였다. 4 ℃에서 30 분간 10,000×g에서 원심분리한 다음, 혈청을 따라내고 차콜과 덱스트란을 동일 비율로 다시 혼합한 다음, 실온에서 3 시간 동안 교반하고 재원심분리하였다. 이어서, 혈청을 56 ℃에서 20 분간 열-불활성화시키고, 멸균 여과한 다음 멸균된 원추형 Falcon 튜브에 분취하였다.
ZR75-1 및 MCF-7 세포들을 24-웰 플라크 상에서 20,000 세포/웰 또는 6-웰플라크 상에서 150,000 세포/웰의 밀도로 생장시키고, 상술한 바와 같이 제조된 여러가지 농도의 동결 건조물 존재 또는 부재 하에서 처리하였다. 모든 실험은 3회 반복 수행하였다. 매 2 일마다 배양 배지를 회수하여 신선한 배지로 갈아주었다. 세포들을 37 ℃, 5%, CO2를 함유하는 일정 습도가 유지되는 분위기의 인큐베이터에서 생육시켰으며, 1차, 2차, 3차 로는 4차 실험에 각각 17 일, 7 일, 3 일 또는 3 일동안씩 수행하였다. 세포 성장 억제를 세포를 직접 계수하던가 또는 웰의 총 DNA함량을 측정함으로써 측정하였다.
상술한 세포 성장 억제 백분율은 동결 건조물이 투여량 의존 방식으로 이들 두 가지 세포 라인의 성장을 억제할 수 있음을 입증해준다.
도 1은 동결 건조물 50 및 100 mg/mL의 투여량이 치료 3일 후에 이들 세포 라인에 대해 명확한 형성부전을 일으켰음을 보여준다.
도 2는 10-12내지 10-9M의 에스트라디올 존재 하에서 처리된 세포들은 이러한 호르몬 농도에 의해 자극받지 않음으로써 대조군 세포와 유사하게 반응함을 보여준다. 그러나, 1 nM을 초과한 농도에서는, 대조군 세포가 강하게 자극되어, DNA의 농도는 10-7M 에스트라디올의 존재하에서 3.75 ㎍에 달하였다(에스트라디올이 없는 대조군의 경우 0.69 ㎍). 동결 건조물 30 mg/mL 및 50 mg/mL로 처리된 세포에있어서는, 최대 자극시 측정된 DNA가 각각 1.9 및 1.8 ㎍이다. 도 2는 에스트라디올 처리된 세포의 친화상수(affinity constant :Km)가 각각 30 및 50 mg/mL 존재 하에서, 대조군 세포의 Km값보다 3 및 16배 더 높음을 보여준다. 이것은 연골 동결 건조물 고체 추출물이 존재하는 경우 동일한 세포 성장 효과를 얻기 위해서는 에스트라디올의 농도가 더 높아야 함을 의미하는 것이다. 따라서, 이 추출물은 최대 반응(그의 90% 억제)을 감소시키고 처리된 세포의 에스트라디올에 대한 친화 상수를 증가시킨다.
생체내 분석:
40일된 암컷 Sprague-Dawley 래트 400 마리(Charles River Co., St-Constant, Quebec으로부터 구입)를 12일간 주변 환경에 적응시켰다. 이 시기에, 20 mg DBMA/1mL 옥수수유 (9, 10-디메틸-1,2-벤잔트라센; Sigma Chemical Co.으로부터 구입)를 강제 투여하였다. 이렇게 처리하고 3 개월이 경과한 후에, 유방암이 발병된 240 마리의 래트를 선별하여 2 그룹으로 나누었다. 제 1 그룹은 5 개의 서브-그룹으로 나누었다. 처리된 그룹의 래트에게 매일 3 mL 물 중 동결건조된 추출물의 농도를 증가시켜 8 주일간 이를 투여하고 대조군에는 동일 부피의 물만 투여하였다. 제 2 그룹은 4 개 서브-그룹으로 나누었다. 처리된 그룹의 래트에게는 또한, 상등액과 함께, 또는 상등액 없이 매일 3 mL 물로 동결 건조물을 10주일간 매일 투여하였고(약 25 mg 단백질), 대조군에게는 동일 부피의 물만 주었다. 제 2 그룹의 중 3000 mg/kg/일 농도의 동결 건조물과 3 mL의 상등액으로 처리된 하나의 서브-그룹의 래트에게만 좀더 적은 투여량의 상등액(물 1 mL 중 단백질 약 8 mg)을 복강(i.p.) 주사하였다.
두 가지 실험을 시작할 때 래트들의 체중은 151∼175 g이었으며 사료와 식수는 맘껏 먹을 수 있도록 하였다. 제 1 그룹의 래트는 평균 직경 0.9 cm의 종양을 갖는 반면 제 2 그룹의 래트의 종양의 평균 직경은 0.6 cm였다.
결과를 다음에 요약하여 나타내었다:
상기 결과들은 상기 동결 건조물이 위장계에서 흡수되는 활성 성분을 함유하며 이 활성 성분이 종양의 크기에 영향을 미침을 입증해준다. 이 효과는 종양 세포에 대한 직접적인 효과이거나 또는 항-맥관형성 매개 효과일 수 있다.
또한, 이러한 결과들은 상등액이 비록 매우 묽지만(상등액 3 mL에 존재하는 단백질의 양은 약 25 mg임), 종양 크기를 약 5% 정도 추가로 감소시킴에 의해 파악되는 활성을 갖는다는 것도 보여준다.
조직병리학
본 발명 연골 추출물의 활성 분자의 비독성을 평가하기 위하여, 상기 생체내 실험에 사용된 동물들을 정자수정능력제거(decapitation)에 의해 죽인 후에, 다음 조직들을 취하여 분석하였다: 간, 폐, 신장, 심장, 뇌, 근육 및 유선. Bouin 플루이드에서 2 일간 이들을 고정시킨 후에, 이 조직들로부터 지방을 제거하였다. 에탄올에서 탈수시킨 후에, 고정된 조직을 파라핀에 묻었다. 이와 같이 처리한 조직의 단편을 유리 슬라이드 위에 얹고, 헤마톡실린으로 염색한 다음 현미경으로 관찰하였다.
이러한 조직학적인 검사는 동결건조물을 단독으로 최대량을 사용하거나(데이타 제시하지 않음), 동결 건조물을 상등액과 함께 사용한 경우(도 3a와 b, 도 4a와 b 및 도 5a와 b 참조) 모두에서 유해한 효과가 관찰되지 않는다는 것을 보여준다.
이는 동결 건조물과 상등액이 선택적인 종양 크기 퇴화 활성을 갖는다는 것을 암시한다.
악성 종양성(cancerous) 유선(도 6a 및 6b 참조)에 있어서는, 혈관 면적의 중요한 감소가 관찰되었다. 이러한 활성 분자의 항-맥관형성 효과는 다음 도면과 히스토그램에 도시 및 요약된 결과에 의해 확인된다:
도 7은 동결 건조물(p.o.: 경구) - 상등액 (p.o. + i.p.: 경구 + 복강)을 병용할 경우(도 6a 및 b 참조), 혈관면적이 55% 감소되었음을 나타낸다.
종양 크기의 감소는 종양 혈관화의 상당한 감소, 종양 세포에 대한 직접적인 영향 또는 이들 두 현상의 조합 때문일 것이다. 본 발명 추출물의 항-맥관형성 효과는 상기 도면에 잘 도시되어 있다. 직접적인 성장부진 효과는 생체외에서 호르몬 의존성 세포에서 관찰되었는데 이러한 관찰은 생체내 실험에서는 검증되지 않은 상태이다.
상술한 결과는 ZR75-1 세포에 대해서 상등액의 효과가 동결 건조물의 효과보다 더 크다는 것을 보여주는 것이므로, 그의 성분들을 추가로 더 연구하였다.
활성 성분을 함유한 액상 분획(fraction)의 제조(obtention)
상어의 연골은 생략된 농축 단계를 제외하고 상기한 바와 같은 공정으로 진다. 원심분리한 후에, 펠릿은 버리고 상등액을 앞에서 설명한 바와 같이 처리하여 0.22 ㎛ 필터를 통과시켜 멸균 여과하였다.
상등액은 이하에서 조질의 삼투액, 예컨대, 한외여과(ultrafilteration) 이후의 생성물을 의미한다.
이렇게 얻어진 조질의 삼투액은 FPLC(고속 단백질 액체 크로마토그래피(Fast Protein Liquid Chromatography))의 공정을 거쳤다.
FPLC 조건:
컬럼: Hiload 36 mm × 60 cm Sephacryl S-300
FPLC 시스템: 파마시아(PPharmacia)제
모든 샘플은 컬럼에 로딩(loading)하기 전에, 모든 시료를 0.22 ㎛ 필터로 통과시켰다. 용출 완충액으로는 여과시키고 15 분 동안 탈기시킨(degazed) 인산 완충액 생리식염수(PBS)를 사용하였다. 로딩 시료의 부피는 대개 3.2 mL(13 mL까지 가능함) 정도이었다. 유량 속도는 1 mL/min이었다. 10 mL씩 분획을 모았다. 용리된화합물은 그들의 U.V. 흡수(280 nm)에 의해 검출되었다. 칼리브레이션 차트(calibr ation chart)는 시그마(Sigma)제 MW-GF-1000 칼리브레이션 키트(calibration kit)를 이용하여 얻었으며, 이 칼리브레이션 샘플들은 분석하려 로딩된 샘플과 동일 부피로 사용하였다. 시료의 용리 부피는 칼리브레이션 키트의 분자량 대 칼럼의 공부피(void volume)를 뺀 용리 부피를 플롯팅(plotting)하여 유추하였다. 공부피는 텍스트린 블루(dextrane blue, M.W. = 2,000,000) 주입을 통해 얻었다.
각 분획들의 활성은 ZR75-1 셀을 대상으로 테스트하였다. 흥미로운 분획들이 확인되었으며 그들의 특성이 추가적인 연구(이하에 후술됨)를 통해 밝혀졌다.
삼투액의 활성 성분이 갖는 추가적인 특성은 Rotofor(Biorad 170∼2950; 다음의 등전점 측정 참고) 및 컷-오프 값이 다른 여러 종류의 아미콘(Amicon) 필터를 사용하여 실험을 수행하여, 분자량이 10∼30 KD, 30∼100 KD 및 100 KD 이상인 분획을 얻었다.
등전점 측정:
상어 연골(삼투액 1 kg/L의 45 mL)은 멤브레인 스펙트라 포어 #7 MWCO 3500 KD(스펙트럼 132110)를 사용하여, 4 ℃에서 5% 글리세린을 함유하는 순수한 물 4리터를 사용하여 하룻밤 투석하여 제조하였다. 투석된 용액은 pH 3.5∼10.0의 엠폴라이트(파마시아 #80-1125-87) 2.75 mL, CHAPS(시그마 C3023; 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane-sulfonate) 0.5 g과 혼합하였다. 여기에 순수한 물을 첨가하여 부피를 55 mL로 조정하였다. 얻어진 용액을 Rotofor상에 로딩하였다. 등전점은, 4 ℃, 12 와트의 정전력(3000xi power supply Biorad165- 0554)에서, 온도를 일정하게 유지하기 위하여 물을 순환시키면서 측정하였다. 분리 초기 개시 단계의 전압은 380 V이고 전류량은 31 mA였다. 전류량이 안정화되었을 때(14 mA로), 전압은 870 V 정도가 되었다. 등전점 측정은 중단되고 분획들 20개가 모였다.
이들 단백질들은 전기영동겔(electrophoresis gel)을 이용하여 그 분자량을 측정하고 동정하였다(Laemmli, U.K.(1970) Nature(Lond.)227: 680).
이 분획들을 로딩 버퍼로 4 배 희석하고 부분 표본(aliquots) 8 μL를 비-환원 조건(non-reducing condition)으로 전기 영동에 적용하였다. 도 8은 각 분획과등전점 측정 이전의 물질의 전기 영동적 프로필(electrophoretic profile)을 보여준다.
모든 분획들은 라미너 플로우 후드(laminar flow hood)하에서 공극 크기 0.22 ㎛의 다공성 멸균 Millipack-60 필터를 통과시켜 병에 멸균 밀봉하였다.
분획들의 단백질 함량은 로오리 복용법(Lowry dosage method)을 통해 측정하였다. 1 kg/2 L의 용액(삼투액 리터당 조질의 연골 중량으로 표현됨)을 배양 배지에서 다양한 농도의 ZR75-1 셀로 테스트하였다. 그 결과는 다음에 요약하였다.:
1차 테스트:
삼투액은 동결 건조시키고(Lyophilized) FPLC의 공정을 거쳤다. 형성 부전 활성(hypoplasiant activity)이 발견되지 않았다(데이타가 제시되어 있지 않음).
2차 테스트:
Rotofor 분획상에 실시된 테스트: 단백질 동정
3 차 테스트:
아미콘 분자 필터로 얻어진 분획 100 μL로 실시한 4 차 테스트:
FPLC 분획 6과 7은 매우 작은 분자량: 1∼2.5 KD의 활성 성분을 포함한다.
분획들의 형성 부전 효과(hypoplasiant effect)는 동결건조물에 의해 관찰되는 것보다 최고 33000 배까지나 클 수 있다. 상기 결과들은 동결건조가 실질적으로 용리액(eluate)내에 함유된 단백질의 활성을 억제 및/또는 파괴하는 반면에, 고체 추출물을 동결건조하는 경우에는 이와 같은 손실(abolition)이 발생하지 않았다는 것을 보여준다.
용리액 중 활성 성분의 추가 동정:
활성 분획들(ZR75-1 셀로 테스트됨)은 등일한 삼투액(1 kg/L)를 사용하고, 직경 10 mm × 길이 30 cm Superose-12 컬럼을 사용한 FPLC와 상기한 바와 같은 Rotofor의 방법을 이용한 다른 유형의 정제 방법에 의해, 다음과 같은 분자량 범위로 회수하였다. 유량 속도는 1 mL/min이고, 1 mL씩 분획 45 개를 모았다.
특이성 (SPECIFICITY)
종양 세포에 대한 활성의 특이성을 평가하기 위해서, 한외여과하여 얻은 삼투액을, 정상적인 섬유아세포인 다른 간충 조직(mesenchyme) 배열 셀들, 인체 테논섬유아세포들(human TENON fibroblasts, HTFs)에 대해 테스트하였다.
B. 시험관내 실험
a. 환자
환자 두 사람(한 사람은 혈관 신생 녹내장(neovascular glaucoma, NVG)이고 다른 사람은 원발성 개방 우각 녹내장(原發性 開防 隅角 綠內障, primary open angle glaucoma, POAG)임)으로부터 얻은 HTFs만을 사용하였다.
b. HTFs의 이차 배양과 보전
각각의 융합성 배양물을 씻고, (0.05% 트립신)/(0.5 mM EDTA(깁코(Gibco) 610-5300에이쥐(AG))) 0.5 mL로 37 ℃에서 5∼10 분 동안 분리시켰다. 그 후에, 15% FBS를 함유한 DME/F-12 배지, 1.5 mL를 첨가하여 트립신/EDTA를 중화하였다.
셀들의 조합은 가루로 빻고 25 cm2의 T-플라스크에 옮겨 담아 제조하여, FBS 10%를 함유한 추가 배지를 첨가하였다. 잘 합친 후에, 이 HTFs를 75 cm2로 옮겼으며, 최종적으로는 180 cm2크기로 옮겼다. 충분한 셀들이 얻어지면, 일부 셀들을 하기 실험에 사용하고, 나머지는 추후의 실험을 동일하게 진행할 수 있도록 얼려 보관하였다.
c. 실험 프로토콜
집합체에 이르게 되면, 한 환자로부터 얻은 2-3 개의, 동일한 180 cm2T-플라스크내에서 배양시킨 셀들은 상기 공정을 통해 분리시켰다. 단기 저속의 원심분리법을 수행한 후에, 256-채널라이저(Channelyzer)를 장착한 ZMI Coulter counter 216013로 세포의 개수를 산측하였다.
이어지는 시험관내의 실험들 모두에서는, 대략 15,000의 셀들을 1% FBS를 함유한 DME/F-12 배지 1 mL로 각각 16 mm 접시와 12-웰 플레이트에 씨딩하였다. 씨딩후 17 시간이 지나, 1% FBS가 함유되어 있는 신선한 동일 배지("완전한" 대조군) 1 mL를 첨가하였다. 실험 계획(상기 및 하기한 바를 참고)에 따라, 1% FBS 배지가 함유되거나 GFs(성장 인자(Growth Factors)) 없이, 또는 흡수 1 kg/2 L(연골 중량/물의 부피) 용액과 같이 하거나 하여 멸균 여과하였다. 또한, 이 날(0 일째), 얼마간의 셀 샘플들을 산측하여 플래팅 효율성을 측정하였다(95% 이상이어야 함).
실험 착수 후 48 시간이 지나서, 셀들을 씻고 상기한 바와 같은 방법에 따라 분리하여 다시 산측하였다. 셀의 수는 "완전한" 대조군으로 얻어진 것에 대한 백분율로 나타내었다.
각각 1% 또는 5% FBS를 함유하는 "완전한" 또는 양성의 대조군 각각과 실험군에 각각에 GF 또는 3 배의 샘플들로 이루어진 연골 삼투액와, 1% FBS를 개별적으로 추가 첨가하였다.
각 실험은 환자 하나 또는 두 명의 셀들로 동시에 수행하여, 최소한 두 번 이상을 반복하였다.
성장 인자(GFs) 또는 연골 삼투액에 의한 섬유아세포 증식의 모의 실험은 5% FBS에 의한 그 모의 실험과 비교하였다.
이 실험들에서, GFs, 돼지(porcine)의 PDGF(pPDGF), 및 인체 재조합 bFGF, hr bFGF(Farmitalia, Carlo Erba, Milan, Italy의 Dr. P. Brazeau에게 선사됨)를 각각 1% FBS에 10∼100 ng/mL의 농도로 첨가하였다. 실험 착수후 48 시간이 지나서, 셀들을 트립신-EDTA에 의해 분산시키고 Coulter counter로 산측하였다. 다음에 나타나는 모든 삼중 수치들(컬럼 1, 2와 3)은 웰당 카운트의 1/20 번째와 동일하다.
[표]
PDGF(혈소판-유도 성장 인자: Platelet-Derived Growth Factor)와 bFGF(기본 섬유아세포 성장 인자: basic fibroblast growth factor) 등의 성장 인자들은 HTFs를 자극하는 활성을 보여주었으나, 이 셀들이 연골 삼투액(1kg/2L)의 존재 하에서 배양되는 동안에는 양성 또는 음성의, 아무런 효과도 관찰되지 않았다. 형성 부전의 효과(hypoplasiant effect)가 관찰되지 않았다. 이는 상기 삼투액이 정상 세포에 대해서는 검측할 수 있을 정도의 효과를 미치지 않으면서 종양 세포에 특성적으로 작용하는 형성 부전의 효과를 갖는다는 것을 제시하는 바이다. 동일한 연골 추출물 어느 것도 섬유아세포 셀, HSF(인체의 피부 섬유아세포: Human Skin Fibroblast; 데이타가 제시되어 있지 않음)의 또다른 유형에 효과가 없었다. 비록 테스트해본 것은 아니지만, 동결건조물 역시 정상 셀에 영향을 미치지 않을 것으로 추정된다.
임상 시험:
예비 임상 시험을 진행하기 전에, 한외여과 후에 얻어진 조질의 삼투액을 2∼20 배로 농축하여, 강화된 활성 삼투액을 제공할 수 있게 하였다. 이 농축 단계들은 공극이 1000 Da(Daltons)을 갖는 접선 플로우 여과 컬럼(tangential flow filtration column)으로, 용리액의 부피를 2∼20 배 정도로 줄여서 얻어겼다. 농축된 흡수는 공극 0.22 ㎛의 밀리포어 필터(millipore filter)로 여과하였다. 상기 연골을 선택적으로 사용가능한 원심분리법(공극 30 ㎛의 배지를 갖는 CEPA 원심분리기를 사용함)으로 가공하는 경우에, 10 배 농축으로 상기 20 배 농축된 추출물과 거의 동일한 단백질 농도, 예컨대, 14 mg/mL(실험실 스케일 방법) 대신에 12 mg/mL(개선 방법)를 갖는 농축 추출물을 얻을 수 있다. 상기 멸균 10 배 농축 삼투액은 멸균 플라스크내에 부분 표본 7 mL로 분포되어 하룻밤을 -80 ℃로 냉동시키고 추가로 사용할 때까지 -20 ℃로 보관하였다. 조질의 삼투액과 농축 삼투액 사이의 주요한 차이점은 그들이 갖는 단백질의 농도이다. 단백질 함량을 측정하기 위해 사용되는 방법은 단백질뿐만이 아니라 질소 화합물도 산측한다는 것이 주목되어질 것이다(Kjeldahl 방법). 이러한 이유로, Lowry 방법으로 단백질을 측정할 때처럼 농축 정도와 단백질 농도가 비례하지 않는 것이라고 생각된다. 따라서, 상기 농축 단계는 물 및 저분자량 질소 화합물의 삼투도 가능하다고 추정할 수 있다.
상기 농축 삼투액은 맥관형성-의존 질병(angiogenesis-dependent diseases)을 치료하는 데 사용하였다. 맥관형성-의존 질병들의 대표적인 두 가지의 다른 유형들이 인체에 실제 테스트되었는데, 첫 번째 유형은 피부병(건선)이고 두 번째 유형은 암(전립선 암)이다.
피부병 중에서는, 건선 증상이 선택되었다. 테스트된 건선 중에서, 각화증에 의해 악화된 건선 증상과 악화되지 않은 것 사이에서 차이가 있음을 주목할 만하다. 맥관형성 성분이 활성 성분의 혼합물에 대한 선택이 목표인 반면에, 이 질병의 각화증 성분은 실질적으로 그 자체로 농축된 연골 흡수에 의해 영향받지 않는다. 다음의 실시예들로부터 이러한 진술들이 예시되며, 확인될 수 있을 것이다.
전립선암을 앓고 있는 환자 지원자에게 10 배 농축된 연골 삼투액을 투여하였다. 상기 환자는 일련의 종래의 치료를 받아 일시적인 효과를 보았으나, 최근 암이 재발한 후, 연골 추출물을 사용하기 시작하였다.
하기한 바와 같은 그 결과는 매우 고무적이고, 테스트한 것 하나에 대해서만 특정해서가 아니라, 모든 맥관형성-의존 질병들의 치료에서 그들의 분획과 조질의 삼투액의 유용성에 대한 전조를 나타낸다고 생각된다. 질병이 맥관형성 성분을 함유하는 한, 본 발명의 연골 추출물은 그들의 유효량을 함유한 조성물에 들어가고이 조성물이 적절한 투여에 알맞은 형태라는 이러한 점에서 효과적이게 될 것이라 생각된다. 그러므로, 이 기술 분야에서 숙련된 사람이라면 다수의 조성물을 유도할 수 있는데, 그의 선택이 표적 질환 조직과 그들의 투여를 통해 길잡이가 되기 때문에, 본 발명이 다음의 특정 조성물에 국한되지 않는다고 평가될 수 있을 것이다. 본 발명의 조성물들은 다양한 경로, 예컨대 국소용, 경구용, 설하용(sublingual), 직장용(rectal), 정맥 주사용, 근육 주사용 에 의해서, 및 확산 등의 방법에 의해 투여될 수 있다.
건선:
건선 환자에게서의 효과를 증명하기 위하여 다음과 같은 피부용 조성물을 제조하였다:
EmulgadeTMCLB, 스테아린산 에스테르, 지방산 알콜 그리고 비이온성 유화제들(Henkel Canada Ltd.에서 판매)의 혼합물을 65∼70 ℃로 교반 가열하였다. 가열을 그친 후에, 상기 혼합물을 교반한채로 두었다. 그 혼합물의 온도가 45 ℃가 되었을 때, 에썬셜 오일(essential oil)인 라벤듈라 앙거스티폴리아와 방부제 Germab enTMII(diazonidyl urea 30%, methylparaben 11%, propylparaben 3% 및 propyleneglycol 56%; 미국 뉴저지의 Sutton Laboratories에서 판매)를 첨가하였다. 상기 혼합물의 온도가 30 ℃에 이르렀을 때, 연골 추출물을 첨가하였다. 그렇게 얻어진 조성물은 부드러운 비-유성 크림형태이었으며, 제조업자의 지시에 따라, EmulgadeTMCLB의 백분율을 변화시켜 다양한 점도의 피부약적인 조성물 형태(우유, 로션, 연고)를 얻을 수 있다. 다른 부형약 또는 담체를 사용하여, 연고, 겔 및 다른 경피성 조제(transdermal preparation) 형태도를 얻을 수 있다.
상기 배합물은 12 주의 기간 동안에 걸쳐, 종래 치료법을 시도하여 반응을 얻었지만, 그 얼마 후에 건선이 재발된 환자 10 명에게 1일 2회 투여하였다. 이 연구에서 환자들은 양쪽의 멤버들에 대해 동일하고 대칭적인 건선 범위로 선택되었다. 이들 시도들은 더블 블라인드(double-blind) 방식으로, 피부과 전문의 또는 환자들 어느 누구도 대조군으로 치료하는 것과 연골 추출물을 함유한 조성물로 치료하는 효과 부위를 알지 못하도록 수행되었다. 각화증에 의해 악화된 건선을 않는 5명의 환자에게서 현저한 개선 정도가 관찰되었으며, 이들 중 환자 두 명의 신체 부위 사진을 도 9a)와 9b)에 나냈다. 도 9a)에서는 각화증을 수반하는 건선을 않는 환자임에도 불구하고 치료한지 한 달 후에 소양증을 나타내지 않은 홍반의 감소가 눈에 띠게 나타나는 것이 증명되었다. 그러나, 건선, 즉 각질 형성은 상당히 남아있었다. 두 번째 사진은 각화증에 의해 악화되지 않은 건선을 앓는 환자의 사진으로(도 9b)), 3 개월의 치료후에 훨씬 많이 개선된 것을 보여준다. 건선이 다양한 원인에서 유래된 질병으로 나타나기 때문에, 이들 환자의 반응은 이 증상의 성립및 지속에서의 맥관 형성 인자와의 연관성의 중요도 의존한다고 추정된다. 이런 유형의 배합물이 관련된 다른 성분들(각질 용해제(keratolytic agents), 소염제(anti-inflammatory agents), 항히스타미제(antihistaminics), 면역억제자(immunosuppressors) 등)을 다루는 다른 치료제가 보충된다면, 더 좋은 결과를 얻을 수 있을 것이다.
이러한 보충은 예컨대, 유효량의 각질 용해제를 함유한 보정된 배합물의 형태를 취할 수 있다. 이와 같은 보완적 치료는, 본 발명의 원칙적 배합물의 적용과 동시에 또는 교대로 하는 분리 투여 등을 통한 별도 투여에 의해 달성될 수 있을 것이다. 더욱이, 상기 보완적 약물 치료는 반드시 동일 경로에 의해 투여될 필요는 없다.
상기 배합물은 전신에 미치는 효과는 없으며(효과는 치료 부위로만 한정됨), 연골 추출물의 높은 비율에도 불구하고 어떠한 2차적 효과을 나타내지 않았다.
여드름:
여드름은 본 발명자들의 지식 범주에 속하는 것이 아니긴 하지만, 맥관 형성성분을 갖는 질병 또는 질환으로서 분류되는데, 여하튼, 여드름 환자에게 액상 연골 추출물을 테스트하였다. 여드름 환자의 연골 추출물 실험을 위해, 다음과 같은 조성의 겔 배합물을 제조하였다:
그 2× 연골 추출물은 단백질 9∼12 mg/mL를 함유한다. 이와 같은 배합물은 여드름의 얼마간의 심각한 유형(염증성 여드름(inflammatory acnae)과 키스틱 여드름(kystic acnae))의 환자 피부에 있어서 명백한 개선 정도를 나타낸다(데이타는 제시되어 있지 않음).
이와 같은 결과들은 항-맥관형성 효과 때문일 수 있거나(따라서 여드름에 맥관형성 성분이 드러나는 것임), 항-맥관형성(anti-angiogenic) 이외에 효과적인 활성 성분이 있기 때문일지도 모른다. 여기서는, 동일한 추출물이 항-맥관형성 효과이외의 다른 효과 한 가지 이상을 갖는다는 것이 주지되며, 직접적인 형성 부전의 효과는 암세포 라인에서 증명된다.
암:
전립선암에 걸린 환자 한 명에게 10 배 농축시킨 삼투액으로의 치료를 시도하였다. 아데노칼시노마(adenocalcinoma)은 1986년에 진단되었으며, 그때 방사선 치료가 수행되었다. 1991년에는, 정상 허용 상한선이 4 μg/L일 때, PSA(전립선 혈청 항원: Prostatic serum antigen) 단계가 138 μg/L이었다. 그 후에, 상기 환자는 항안드로겐 치료(EuflexTM)와 함께 거세에 의한 다른 치료를 동시에 받았다. 이치료는 3 년 동안 효과적이었으며, 그 후 PSA 농도가 다시 증가되었다. 1994년 6월부터, 상기 환자에게 10 배 농축된 삼투액을 투여하였다(매일당 약 1∼1.5 mg/체중 kg과 동량을, 약 (단백질 75 mg)/(증류수 7 mL)으로 매일 설하 투여함). 이 투여량중 상당량이 삼켜졌으나, DMBA-치료한 동물들(상기한 바를 참조)에서의 결과를 참조하면, 아마도 상당한 분량이 위장계로 흡수되었을 것이다. PSA 농도는 12 μg/mL 에서 0.9 μg/mL로 감소되었다(1994년 12월에 최종 결과를 얻었음). 이러한 복용법은 또한 투여 경로, 활성 성분의 생체 이용률 및 병의 경과를 조정할 수 있는 바람직한 적극성에 따라서 임의대로 변형할 수 있다. 이때에, 래트(상기 실시예)와 인체에 대해 비독성임이 증명되었다서 입증되었다(데이타 제시되어 있지 않음).
한편, DMBA-치료한 래트에 대해 수행한 다른 생체내 실험에서는, 액체 추출물의 투여 속도가 약 (단백질 190∼220 mg)/(체중 kg)이었으며, 아마도 암 혈관 면적의 축소에 가장 큰 기여를 할 것으로 여겨진다(단백질 양이 더 많은 동결건조물과 함께 사용하는 경우 55%). 따라서, 매일 약 1∼200 mg/혈액 무게 kg 정도의 복용량이, 맥관형성을 중지시키거나 감소시켜 암을 치료하는 데에 있어서, 주 복용량(median dose, ED50)으로서 합리적인 범위라고 추정된다.
이 결과들은 맥관형성-의존 질병들의 치료에 있어서, 연골 액체 추출물의 굉장한 치료 가능성을 보여준다. 연골 추출물 및 그의 배합물의 양은 특정한 필요에의해 임의대로 변화될 수 있다. 활성 성분을 함유한 불순한 삼투액의 분획들 또한 유효성을 갖는 것이라고 추정된다. 이 분획들은 추가 특성화가 요망된다.
단백질 함량을 기준으로, 피부에 대한 국소 배합물이 광범위한 정도의 투여량으로 연골 추출물을 함유할 수 있다는 것이 주지될 수 있다. 테스트되는 경우들의 두 가지 큰 특정 범주로는, 예컨대, 건선 대 여드름에 대한 배합물에서의 최종단백질 농도비는 4-5이며, 삼투액의 희석 비율은 35이다. 맥관형성-의존 질병들의 모든 예상되는 적용에 있어서(안약에서부터 피부병, 및 암 치료제 배합물까지), 조질의 삼투액의 최종 단백질 농도의 최소치가 매우 작을 수 있다고 추정된다(0.1 mg/mL 미만). 이같은 낮은 범위의 복용량은, 맥관형성 억제자에 대한 조직의 반응 및 민감성과 활성 성분들의 포착 효율성, 및 작용 부위에 대한 활성 성분들의 투과력과 접근 성능에 따라 좌우된다. 일부 적용상에 있어서 배합물들의 최종 단백질 농도의 상한선은 아직 알려져 있지 않다. 시도된 가장 높은 최종 농도는 건선의 경우에, 배합물내 단백질 약 9 mg/mL이었으며, 전립선암의 경우에서는 투여된 7 mL 투여 단위내에 12 mg/mL이었다. 조질의 삼투액이 활성을 잃지 않으며 동결건조되수 없기 때문에, 투여량 상한선은 예컨대, 농축된 시럽을 얻을 때까지 등으로, 상기 조질의 삼투액에 대해 실시할 수 있는 정도의 농도 한계에 따라 좌우된다고 여겨진다.
필요한 물질들:
- 냉각기
- 외과용 기구
- 미트 초퍼
- 플라스틱 가방
- 공업용 블렌더(피셔 사이언티픽(Fisher Sientific)제의 3-스피드 블렌더가 장착됨)
- 물의 정화 장치(역삼투압 및 0.1 ㎛ 여과: 콘티넨탈 워터 시스템(Cotinental Water System), PRE 2202 모델, 일련 번호 91089, 퀘벡, 몬트리올의 피셔 사이언티픽(Fisher Sientific)제의 모두랩 바이오사이언스 알큐/폴리싱 시스템(Modulab Bioscience RQ/Polishing System). 이 장치는 질이 높은 무발열원 물(apyrogenic water)을 제공한다.
- 정밀 저울 메틀러(Mettler), 피셔 사이언티픽제 시리즈 AE
- 캐나다 듀퐁제의 원심분리기 소르발(Sorvall) RC-285
- 원심분리기 CEPA
- 공극 30 μM의 나일론 주머니
- 오토크레이브(autoclave: 자동 증기 멸균 장치 산요(Sanyo)제, MAC 350 p 모델)
- 132 ℃로 10 분 동안 멸균하고 35 분 동안 건조한 날젠(Nalgene) 500 mL 콘테이너
- 와트만 리브 엔겔(Whatman Reeve Angel)의 공극 24 ㎛의 원뿔형 필터
- 한외여과 칼럼(차단 분자량: 500 킬로달톤(KDaltons) 및 (적용 가능할 때 1 KD); 표면: 25 스퀘어 피트(squre feet); 유속: 130 L/min,; 입구 압력(Inlet pressure): 30 psi; 출구 압력(Outlet pressure): 5psi; 미국 마이애미 월밍톤의 코크 멤브레인 시스템 인코포레이션제(Koch Membrane Systems Inc., Wilmington,MA, USA))
- 유속 130 L/min.을 제공하는 원심분리기 펌프 산니터리(Sanitary: 모나크 인더스트리(Monarch Industries), ACE-S100 모델, A 형)
- 멸균 헛(steril hut: 잉그램 & 벨(Ingram & Bell)제의 박판 플로우 헛 누에이르(laminar flow hut NuAire))
- 0.22 ㎛의 멸균 필터 밀리팩(Millipack)-60
- 멸균 소독 또는 호박색의 유리병(Sterile clear or amber glass bottle)
- 농축기 DC-10 아미콘(Amicon)
- Rotofor 비오라드 170-2950
- 각각 차단 지수 10, 30 및 100 KD의 아미콘 필터 SIOY10, SIOY30 및 SIOY100
- FPLC 파마시아 216007(컴퓨터 파마시아 216014)
- 힐스탠드(Hilstand) S-300 26 mm/60 cm(파마시아)
- 수퍼로오스(Superose) S-12 10 mm/30 cm(파마시아)
- 친액성화기 랩콘코(Lyophilizer Labconco) 10273 A
본 발명을 이상과 같이 개시하는 바이며, 본 기술 분야에서 숙련된 사람이라면, 그의 지식과 능력의 범위내에서 본 발명의 요지를 벗어나지 않으며, 등가물을 이용하는 등과 같이 본 발명의 일부 성분들을 대치하거나 변형하여 본 발명의 목적을 동일하게 훌륭히 달성할 수 있다고 여겨진다. 이러한 명백한 변형 또한 본 발명의 적용 범위에 포함된다고 여겨진다.

Claims (21)

  1. ZR75-1 암세포에 대하여 직접적인 항-종양 활성을 갖는 성분 한 가지 이상 및 항-맥관형성 활성을 갖는 성분을 한 가지 이상을 포함하고, 다음의 공정에 의하여 얻어지는 액체 추출물:
    (a) 상어 연골의 입자 크기가 500 ㎛ 이하가 될 때까지 상어 연골을 비변성 수용액내에서 균질화시켜; 입자와 조추출액(crude liquid extract)의 혼합물을 얻고;
    (b) 상기 조추출액을 상기 입자로부터 분리시키고;
    (c) 분자량이 500 KDa 이하인 연골 분자를 함유하는 최종 액체 추출물을 얻기 위하여 상기 조추출액을 추가적으로 분리하는 공정.
  2. (a) 상어 연골의 입자 크기가 500 ㎛ 이하가 될 때까지 상어 연골을 비변성 수용액내에서 균질화시켜; 입자와 조추출액의 혼합물을 얻고;
    (b) 상기 조추출액을 상기 입자로부터 분리시키고;
    (c) 분자량이 500 KDa 이하인 연골 분자를 함유하는 최종 액체 추출물을 얻기 위하여 상기 조추출액을 추가적으로 분리하는 공정을 반복하고,
    (d) 상기 최종 액체 추출물을 농축하여, 1 KDa과 500 KDa 사이를 포함하는 분자량을 갖는 연골 분자를 함유하는 농축 액체 추출물을 생성하는 단계를 추가적으로 수행하여 얻어지는 액체 추출물.
  3. 제 1 항에 있어서, 다음과 같은 조성을 갖는 액체 추출물:
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 직접적인 항-종양 활성을 갖는 성분인 다음과 같은 분획을 한 가지 이상 포함하는 액체 추출액:
    (i) 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)하여 측정하였을 때, 1 내지 2.5 KDa의 분자량을 갖는 액체 분획;
    (ii) 로토포(Rotofor) 분리 후 전기영동하여 측정하였을 때, 29 KDa의 분자량 및 5.3 내지 6.26의 등전점을 갖는 액체 분획;
    (iii) 로토포 분리 후 전기영동하여 측정하였을 때, 35 KDa의 분자량 및 7.64 내지 7.94의 등전점을 갖는 액체 분획;
    (iv) 로토포 분리 후 전기영동하여 측정하였을 때, 48 KDa의 분자량 및 7.29내지 7.94의 등전점을 갖는 액체 분획;
    (v) 로토포 분리 후 전기영동하여 측정하였을 때, 60 KDa의 분자량 및 5.30 내지 6.26의 등전점을 갖는 액체 분획.
  5. 다음의 액체 분획 중에서 선택되는 어느 하나의 액체 분획:
    (i) 고속 단백질 액체 크로마토그래피하여 측정하였출 때, 1 내지 2.5 KD의 분자량을 갖는 액체 분획;
    (ii) 로토포(Rotofor) 분리 후 전기영동하여 측정하였을 때, 29 KDa의 분자량 및 5.3 내지 6.26의 등전점을 갖는 액체 분획;
    (iii) 로토포 분리 후 전기영동하여 측정하였을 때, 35 KDa의 분자량 및 7.64 내지 7.94의 등전점을 갖는 액체 분획;
    (iv) 로토포 분리 후 전기영동하여 측정하였을 때, 48 KDa의 분자량 및 7.29내지 7.94의 등전점을 갖는 액체 분획;
    (v) 로토포 분리 후 전기영동하여 측정하였을 때, 60 KDa의 분자량 및 5.30 내지 6.26의 등전점을 갖는 액체 분획.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 직접적인 항-종양 활성을 갖는 성분인 다음과 같은 분획을 한 가지 이상 포함하는 액체 추출물:
    (i) 로토포 분리 후 고속 단백질 액체 크로마토그래피하여 측정하였을 때, 70 내지 120 KDa의 분자량을 갖는 액체 분획;
    (ii) 로토포 분리 후 고속 단백질 액체 크로마토그래피하여 측정하였을 때, 60 내지 70 KDa의 분자량을 갖는 액체 분획;
    (iii) 로토포 분리 후 고속 단백질 액체 크로마토그래피하여 측정하였을 때, 35 내지 46 KDa의 분자량을 갖는 액체 분획;
    (iv) 로토포 분리 후 고속 단백질 액체 크로마토그래피하여 측정하였을 때, 29 KDa의 분자량을 갖는 액체 분획;
    (v) 로토포 분리 후 고속 단백질 액체 크로마토그래피하여 측정하였을 때, 1 내지 2.5 KDa의 분자량을 갖는 액체 분획.
  7. 다음의 액체 분획 중에서 선택되는 어느 하나의 액체 분획:
    (i) 로토포 분리 후 고속 단백질 액체 크로마토그래피하여 측정하였을 때, 70 내지 120 KDa의 분자량을 갖는 액체 분획;
    (ii) 로토포 분리 후 고속 단백질 액체 크로마토그래피하여 측정하였을 때, 60 내지 70 KDa의 분자량을 갖는 액체 분획;
    (iii) 로토포 분리 후 고속 단백질 액체 크로마토그래피하여 측정하였을 때, 35 내지 46 KDa의 분자량을 갖는 액체 분획;
    (iv) 로토포 분리 후 고속 단백질 액체 크로마토그래피하여 측정하였을 때, 29 KDa의 분자량을 갖는 액체 분획;
    (v) 로토포 분리 후 고속 단백질 액체 크로마토그래피하여 측정하였을 때, 1 내지 2.5 KDa의 분자량을 갖는 액체 분획.
  8. 다음의 단계를 포함하는 상어 연골 액체 추출물의 제조방법:
    (a) 상어 연골의 전체 입자 크기가 500 ㎛ 이하가 될 때까지 상어 연골을 비변성 수용액에서 균질화시키고; 입자와 조추출액의 혼합물을 얻는 단계;
    (b) 상기 조추출액을 상기 입자로부터 분리시키는 단계;
    (c) 분자량이 500 KDa 이하인 연골 분자를 함유하는 최종 액체 추출물을 얻기 위하여 조추출액을 추가적으로 분리하는 단계.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 비변성 수용액이 물로 구성되고 상기 단계가 4 ℃에서 수행되는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, (a) 단계가 30 이내에 수행되는 방법.
  11. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상어 연골 및 상기 비변성 수용액이 수용액 1 내지 2 리터 당 연골이 습윤 중량으로 1 Kg의 비율인 방법.
  12. 제 8 항에 있어서, 상기 분리 단계 (a) 가 원심분리에 의하여 수행되는 방법.
  13. 제 8 항 내지 제 10 항 제 12 항에 있어서, 상기 최종 액체 추출물을 농축하여, 1 KDa과 500 KDa 사이를 포함하는 범위의 분자량을 갖는 연골 분자를 함유하는 농축 액체 추출물을 얻는 단계 (d)를 추가적으로 포함하는 방법.
  14. 제 8 항 내지 제 10 항 및 제 12 항에 있어서, 상기 최종 액체 추출물을 분획화하여, 상기 액체 추출물을 액체 분획을 얻는 단계 (d)를 추가적으로 포함하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 단계 (d)가 분획의 ZR75-1 세포에 대한 항-종양 활성을 테스트하고, 그것에 의하여 한 가지 이상의 항-종양 액체 분획을 얻는 것을 포함하는 방법.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 분획화 단계를 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)에 의하여 수행하고, 상기 얻어진 분획이 1 KDa 내지 2.5 KDa 사이의 분자량을 갖는 연골 분자를 함유하는 방법.
  17. 제 14 항에 있어서, 상기 분획화 단계를 로토포(Rotofor) 분리 및 전기영동에 의하여 수행하고, 상기 액체 분획이 다음과 같은 연골 분자를 함유하는 방법:
    - 분자량이 29 KDa 이고 등전점이 5.3 내지 6.26 이거나;
    - 분자량이 35 KDa 이고 등전점이 7.64 내지 7.94 이거나;
    - 분자량이 48 KDa 이고 등전점이 7.29 내지 7.94 이거나; 또는,
    - 분자량이 60 KDa 이고 등전점이 5.30 내지 6.26인 연골 분자.
  18. 제 14 항에 있어서, 상기 분획화 단계를 로토포 분리 및 고속 단백질 액체크로마토그래피(FPLC)에 의하여 수행하고, 상기 액체 분획이 다음과 같은 연골 분자를 함유하는 방법:
    - 70 KDa 내지 120 KDa 사이를 포함하는 분자량을 갖거나;
    - 60 KDa 내지 70 KDa 사이를 포함하는 분자량을 갖거나;
    - 35 KDa 내지 46 KDa 사이를 포함하는 분자량을 갖거나;
    - 29 KDa 의 분자량을 갖거나; 또는,
    - 1 KDa 내지 2.5 KDa 사이를 포함하는 분자량을 갖는 연골 분자.
  19. 제 1 항 내지 제 4 항 및 제 6 항 중 어느 한 항에서 정의된 연골 추출의 유효량과 약제학적으로 허용되는 부형제(vehicle)를 함유하는, 피부 질환, 여드름(acne), 암 또는 종양 증식 및 맥관형성으로 구성되는 군 중에서 선택되는 병인 요소를 한 가지 이상 갖는 질병의 치료를 위한 약제 조성물.
  20. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 방법을 재현하고, 얻어진 최종 액체 연골 추출물과 추가적인 약제학적으로 허용되는 부형제를 사용하여 약제 조성물을 제조하는 단계를 포함하는, 피부 질환, 여드름, 암 또는 종양 증식 및 맥관형성으로 구성되는 군 중에서 선택되는 병인 요소를 한 가지 이상 갖는 질병의 치료를 위한 약제 조성물의 제조방법.
  21. 제 13 항의 방법을 재현하고, 얻어진 최종 액체 연골 추출물과 추가적인 약제학적으로 허용되는 부형제를 사용하여 약제 조성물을 제조하는 단계를 포함하는, 피부 질환, 여드름, 암 또는 종양 증식 및 맥관형성으로 구성되는 군 중에서 선택되는 병인 요소를 한 가지 이상 갖는 질병의 치료를 위한 약제 조성물의 제조방법.
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