CN1147305C

CN1147305C - 具有抗血管生成活性和肿瘤消退作用的鲨鱼软骨提取物及其制备方法

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Publication number: CN1147305C
Application number: CNB951934368A
Authority: CN
Inventors: E��Ű�; E·杜邦; P·布拉泽奥; C·朱尼奥
Original assignee: Les Laboratories Aeterna Inc
Current assignee: Les Laboratories Aeterna Inc
Priority date: 1994-04-28
Filing date: 1995-04-21
Publication date: 2004-04-28
Anticipated expiration: 2015-04-21
Also published as: PL317076A1; NZ284407A; NO964547L; NO964547D0; HUT76554A; PL181981B1; SI0759765T1; AU2300195A; RO114868B1; EP0759765A1; BG62954B1; DE69528258D1; US5618925A; EP0759765B1; KR100378787B1; HU220784B1; NO317674B1; FI117375B; PT759765E; CZ290520B6

Abstract

本发明涉及鲨鱼软骨提取物及其制备方法，这些提取物具有抗血管生成特性(在体内观察到减少实验诱发性肿瘤的血管壁面积)和体内的肿瘤消退活性，并且对肿瘤细胞系显示出直接抑制作用。该方法不涉及任何变性溶剂或产物，也不涉及使用任何酶。它由下述步骤组成：在中性pH水，优选纯水溶液中得到全软骨混合物，将混合物离心，沉淀碎片和上清液待进一步处理。将碎片冻干，测定冻干物和上清液或者冻干物的体内和体外抗肿瘤和抗血管生成活性。上清液表现出体内抗血管生成和抗肿瘤活性。使用不同方法研究上清液的组成。分馏该上清液表征出其中的数种活性成分。试验馏分在体外对癌细胞系的直接活性。由此可认为未分馏的上清液也具有这种体外活性。冻干在很大程度上破坏了这些馏分的活性，但在固体提取物却没有观察到这种活性的消失。

Description

具有抗血管生成活性和肿瘤消退作用的鲨鱼软骨提取物及其制备方法

发明背景

软骨是一种无血管组织，人们将其作为一种含有抗血管生成因子的潜在物质加以研究。它还是一种相对抵抗肿瘤生长的组织。涉及软骨的肿瘤，软骨肉瘤是一种血管最少的固体肿瘤。血管生成是肿瘤发展的一个重要因子。如果肿瘤细胞能激发扩大相邻的血管网以供给其营养需求，就会出现分散的固体肿块。因此，研究涉及刺激血管生成的因子对肿瘤生长的作用，研究抗血管生成因子及具有血管生成抑制活性的药物并以其作为控制肿瘤生长或使肿瘤消退的工具。

已经发现鲸仔的肩胛软骨含有一种抑制固体肿瘤中血管形成的物质(Langer等，1976)。由于这种物质作为抗肿瘤剂的潜在可能性，鼓舞着人们去寻找更广泛的软骨来源。

鲨鱼是这种血管生成抑制剂的可能来源之一，因为其内骨骼完全由软骨组成(占其体重的6％，而鲸仔中的软骨仅占其体重的0.6％)。鲨鱼还有一个令人感兴趣的特点，即其生长肿瘤的低倾向性。已有许多假设推测解释这种鲨鱼中生长肿瘤的低可能性。Marchalonis等(1990)显示IgM抗体能迅速攻击任何入侵性物质。Mckinney等(1990)也表明鲨鱼的巨噬细胞可将瘤细胞分化为普通细胞，从而破坏瘤细胞。Rosen和Woodhead(1980)假设elasmobranchs(一组附属于鲨鱼和鹞鱼的动物)中肿瘤的低发性可能是由于其组织中的高离子强度所致，这与其较高的体温相当。在这种情况下，这些作者认为免疫系统发挥着接近100％的免疫监视作用。Moore等(1993)年发现鲨鱼产生一种具有抗菌和抗原虫特性的氨基甾醇。最终，Lee和Langer(1983)及Klagsbrun(1987)显示鲨鱼产生一种抑制新血管形成的物质。Lee和Langer(在所引的书中)在变性条件下从鲨鱼软骨中提取分离出这种物质(胍提取)。但是该提取过程很长(41天)，并且会产生变性的提取物。从鲸鱼分离的活性物质的分子量为约16千道尔顿(kd)，但同组研究人员却未能获得从鲨鱼中得到的活性物质的精确分子量。对该种物质的定义仅限于其分子量大于3500道尔顿。Oikawa等(1990)应用Lee和Langer所述的一种相同提取方法，但时间要短的多(2天代替41天)。由Oikawa等从鲨鱼软骨中分离的物质的分子量为1000-10000道尔顿。Schinitsky(USP 4,473,551)描述了一种鲨鱼软骨粉的水提物，其大于100,000道尔顿的馏分单独或与葡糖胺结合具有抗炎活性。但该专利并未提示该提取物中的一种组份具有抗血管生成和抗肿瘤活性。Kuetner等(USP 4,746,729)从牛的软骨中分离出多形核中性白细胞(PMN)弹性蛋白酶抑制剂。该抑制剂是从软骨的水提物中得到的，由其获得的分子量大于50,000道尔顿。在Sephacryl S-200上分级分离得到许多馏分，在证实其具有抗弹性蛋白酶活性后，合并其中分子量为10-40千道尔顿的馏分。该活性成分的等电点是9.5，可能具有的分子量为约15,000道尔顿。Kuetner(USP 4,042,457)还表明一种分子量小于50,000道尔顿的分子量的牛软骨成分具有细胞增殖抑制活性，但对内皮细胞的生长不具有任何活性。Spilburg等(4,243,582)从牛软骨中分离出两种分子量为65KD，PI为3.8的糖蛋白(胍提取)，这两种蛋白表现出抗胰蛋白酶活性和内皮细胞生长抑制活性。

鲸鱼和鲨鱼软骨具有多种活性，如溶菌酶活性，细胞生长促进活性，对I型和IV型胶原酶及弹性蛋白酶的抑制活性，和对蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶和血浆酶的抑制活性。

获得鲨鱼软骨提取物和馏分的方法是已知的。其中的一些方法是生产软骨粉原料，而不是任何提取物(USP 5,075,112)；其它一些方法使用了变性试剂，如胍(USP 4,243,582)；或酶反应除去包围软骨的肌肉、神经或血管结构，及有机溶剂除去脂肪(USP 3,478,146，4,350,682和4,656,137)，从而获得软骨提取物；而其它一些方法仅除去不溶物简单地制备软骨的水提物(水(USP 4,473,551)或盐溶液中(USP 4,746,729))。在后一种方法中获得一定分子量的特定馏分以待进一步研究和纯化(参见上述讨论)。

总之，已知鲨鱼软骨含有抗血管生成成分，成分的活性通常用兔角膜袋测定法和鸡绒膜尿囊膜(CAM)测定法进行测试。至今，已直接测试了软骨全粉在体内对肿瘤的作用，对移植到裸鼠中的异种移植物人黑素瘤的作用(USP 5,075,112)及在CAM中测试了其抗血管生成作用。但没有证据表明软骨提取物对肿瘤细胞具有直接作用。

血管生成作用不仅仅涉及到癌的生长。影响不同生理系统(以括弧表示)的许多疾病或病症都是血管生成依赖性的，这些疾病或病症的实例：关节炎和动脉粥样硬化斑(骨和韧带)，糖尿病性视网膜炎，新血管性青光眼，砂眼和角膜移植性新血管生成(眼)，牛皮癣，硬皮病，血管瘤和疤痕体质(皮肤)，血管粘连和血管纤维瘤(血液系统)。因此，发现任何新的抗血管生成因子都具有治疗这些疾病和癌症的用途。

发明概述

本发明涉及一种具有抗血管生成特性(在体内观察到减少实验诱发性肿瘤的血管壁面积)，体内肿瘤消退活性并对肿瘤细胞系显示出直接抑制作用的提取物的制备方法。这些提取物来自通称为多刺角鲨和黑刺角鲨(Squalusacanthias)的鲨鱼软骨。该方法不涉及任何变性溶剂或产物，也不涉及使用任何酶。它由下述步骤组成：在中性PH水，优选纯水溶液中得到全软骨混合物，将混合物离心，沉淀碎片和上清液待进一步处理。将碎片冻干，测定冻干物和上清液或者冻干物的体内和体外抗肿瘤和抗血管生成活性。上清液表现出体内抗血管生成和抗肿瘤活性。使用不同方法研究上清液的组成。分馏该上清液表征出其中的数种活性成分。试验馏分在体外对癌细胞系的直接活性。由此可认为未分馏的上清液也具有这种体外活性。冻干在很大程度上破坏了这些馏分的活性，因此值得强调的是固体和液体提取物及其馏分之间存在明显不同。

本发明还涉及软骨冻干物或固体提取物，软骨提取液和其馏分，及获得所有这些物质的方法。

最后，本发明涉及软骨提取物在治疗血管生成依赖性疾病中的应用。初步临床试验表明含有浓缩的未分离提取液的药物组合物能改善患血管生成依赖性疾病的患者的症状。在所述疾病中，皮肤性疾病如牛皮癣和一例前列腺癌得以成功地治疗。另外，还意外地成功地治疗了未确证为血管生成依赖性疾病的另一种皮肤病，粉刺。过度新血管形成被认为是烧伤患者疤痕肥大的特征。经试验，含有本发明软骨提取物的组合物可防止这种现象。提供含有液体软骨提取物为活性成分的药物组合物也是本发明的目的之一。

附图概述

由下图补充说明的具体实施方案将使本发明更易于理解，这些附图旨在说明本发明而不是限制本发明的范围：

附图1表示鲨鱼软骨(固体提取物)剂量的增加对ZR75-1和MCF-7细胞的抑制活性。

附图2表明在浓度增加的雌二醇本身或雌二醇与两种浓度的软骨冻干物的存在下，通过其DNA含量测定的MCF-7的量的剂量依赖性曲线。

附图3a)和b)显示经管饲给予软骨冻干物和上清液与仅给予水的生长乳腺癌的大鼠肝切片的比较。

附图4a)和b)显示经管饲给予软骨冻干物和上清液与仅给予水的生长乳腺癌的大鼠肾切片的比较。

附图5a)和b)显示经管饲给予软骨冻干物和上清液与仅给予水的生长乳腺癌的大鼠肺切片的比较。

附图6a)和b)显示经管饲给予软骨冻干物和上清液与仅给予水的生长肿瘤的大鼠乳腺肿瘤切片的比较。

附图7是由附图6a)和b)得到的矩形图，说明软骨提取物对肿瘤中血管面积的影响。

附图8表示在非变性条件下经Rotofor分离的馏分的电泳图谱；为与分离的馏分进行比较，分离前将分子量标记在左端，之后使原样品渗透。

附图9a)和9b)说明两位牛皮癣患者施用含有效量的浓缩液体软骨提取物的外用组合物(下图)与未施用时(上图)相比，其症状的明显改善，其中一名患者患角化过度9a)，另一名不患角化过度9b)。

发明详述

捕捉后，从健康的黑刺角鲨和多刺角鲨获得软骨。用乙醇处理过的手术刀和剪除去所有肌肉和连接性组织。然后将软骨真空包装到塑料袋中并于-20℃下冷冻备用。

冻干软骨的制备

于4℃融化软骨。然后使软骨和等量(重量/体积)的水通过乙醇处理过的搅肉机孔三次得到第一种混合物，所述水经反相渗透纯化并滤过0.1μm滤膜。可使用多种水溶液替代水，只要是PH中性的就可避免软骨成分的分解或变性。

然后在工业搅拌机中于4℃以最大速度搅拌该混合物10分钟使其匀化。在4℃使匀化物在Polytron崩解剂中崩解10分钟得到液化的匀化物。该步骤中残留物的粒径小于500μm。在4℃和13,600×g下将该混合物离心15分钟。将所得沉淀碎片冻干24-48小时。下文将第一种馏分定义为冻干物或固体提取物。

在24μm Whatman滤器上过滤上清液以除去可能影响超滤柱操作的颗粒。之后在孔率为500,000道尔顿的切向流过滤柱上超滤滤过物。将上清液无菌滤过0.22μm滤器，等份装入无菌瓶中备用。下面该馏分被称为上清液或提取液。

另外，还开发出高压方法以获得冻干物和上清液。其步骤为在13600×g离心15分钟，接着以在装有30μm孔率尼龙袋的CEPA离心机中以3000-4000×g转速离心代替在Whatman滤器上的粗滤。用这种方法在30分钟内可离心20kg/20L制品，得到21升上清液。所得水溶液的体积甚至大于水的初始体积，这表明甚至获取了软骨本身含有的一部分水。冻干物和上清液具有如下组成：

冻干物：

脂类 7.35％¹

蛋白 46.2％²

湿度 20.4％

钠 4.16mg/g³

钾 2.64mg/g

钙 114mg/g

镁 1.49mg/g

锌和铁痕量

上清液：

脂类 0.10％¹

蛋白 8mg/ml²

湿度 98.8％

钠 33.6mg/100g³

钾 39.2mg/100g

钙 2.Omg/100g

镁 1.1mg/100g

锌和铁痕量^1，2分别按照AOAC Official(1984)第16.219-220和2.055节中的指导测定；³按照SAA方法测定。

经Kjeldahl方法测定蛋白含量，该方法实际上测量的是有机氮(N)。用下式将有机氮转化为相应蛋白：

但为检测到蛋白多糖，一种假设是它们可能以蛋白多糖和/或粘多糖形式存在于一种或另一种提取物。在所测的温度含量中也可能包含了这些化合物。冻干物的湿度含量是出乎意料的，该湿度是通过羟基测定的。因为20％的水含量与软骨一般保持的糖的百分含量接近，而冻干物的湿度应接近0％，这种假设仍有待进一步证实。

运用USP XXII的详细说明由下述控制无菌：

1)Laboratoire de genie sanitaire du Quebec Inc.

1090，1′Escarbot，Centre Industriel St-Malo，Quebec

G1n4J4；和

2)Northview Laboratories Inc.

1880，Holste Road，Northbrook，IL，60062 U.S.A.

FDA registration no.14-18028

活性测定：

冻干物：

体外测定：

对激素依赖性癌细胞系MCF-7和ZR75-1(ATCC(R)号分别是22-HTB和1500-CRL)进行测定。

ZR75-1细胞：

BASAL RPMI介质：

在5L纯水中混合52克不含酚红的RPMI(Sigma R8755)，17.875克Hepes(Sigma H0763)，0.55克丙酮酸钠(Sigma P5280)和10克NaHCO₃，并用NaOH调PH至7.40。

如果不立即使用，该溶液须避光以防止光敏物质被破坏。过滤该溶液，并将其分装到500毫升无菌瓶中，贮藏于4℃，最长期限为3个月。

细胞培养维持培养基：

加有10％(v/v)FBS(胎牛血清)，100 U青霉素G/50μg硫酸链霉素(Sigma P0906)/ml介质，2mM L-谷胺酰胺(Sigma G1517)和1nM E₂(β-雌二醇Sigma E8875)的基本RPMI培养基。

实验培养基：

加有5％FBSA(吸附在葡聚糖-活性炭上的胎牛血清)，2mM L-谷胺酰胺，100 U青霉素G/50μg硫酸链霉素/ml介质和50ng/mL胰岛素(Sigma)的基本RPMI培养基。往该培养基中加入增高浓度的上述冻干物及不同浓度的雌二醇(10^-12至-15M)。

MCF-7细胞：

基本DME-F12介质：

按照制造商的指导在纯水中现配制DME-F12介质(不含碳酸氢盐，也不含酚红；Sigma)。在1升介质中，加入1.2g碳酸氢钠并用NaOH/HCl调PH至7.4。将该溶液过滤，分配到500毫升的无菌瓶中，于4℃贮藏，最长期限为3个月。

细胞培养维持介质：

加有10％(v/v)FBS(胎牛血清)，100 U青霉素G/50μg硫酸链霉素/ml介质，2mM L-谷胺酰胺(Sigma)和1nM E₂(雌二醇)的基本DME-F12培养基。

实验培养基：

加有5％FBSA(吸附在葡聚糖-活性炭上的胎牛血清)，2mM L-谷胺酰胺，100 U青霉素G/50μg硫酸链霉素/ml介质和50ng/mL胰岛素(Sigma)的基本DME-F12培养基。如在ZR75-1细胞中所述，加入相同浓度的上述冻干物和雌二醇。

FBSA的制备：

将胎牛血清与1％(w/v)活性炭(炭使生物碱脱色)。往活性炭-血清溶液中加入葡聚糖T70溶液使其达到0.1％(w/v)的浓度。在4℃于10,000×g离心30分钟后，倾析血清，然后再与相同比例的活性炭和葡聚糖混合，在室温下搅拌3小时后再离心。之后使血清在56℃加热失活20分钟，无菌过滤后等量分装到锥形Falcon管中。

使ZR75-1和MCF-7细胞在20孔板上生长达20,000细胞/孔或在6孔板上生长达150,000细胞/孔的密度，并在有或没有如上制备的不同浓度的冻干物存在下进行处理。所有实验都进行三次。每两天用新鲜培养基替换并除去旧培养基。在实验一、二、三或四中使细胞在含有5％CO₂的恒湿环境的培养箱中在37℃分别生长17、7、3或3天。通过直接计数细胞或者测定一孔的总DNA含量测定细胞生长的抑制。

冻干物浓度细胞抑制(％)

MCF-7 ZR75-1

实验一：17天

1mg/ml 1.5 2.00

5mg/ml 14.33 33.6

10mg/ml 62.66 90.8

实验二：7天

1mg/ml 3.73 0.97

5mg/ml 15.7 29.00

10mg/ml 68.37 66.0

实验三：3天

5mg/ml 95.8 95.00

10mg/ml 94.6 98.00

实验四：3天

1mg/ml 34.4 51.5

20mg/ml 62.5 70.5

50mg/ml 95.8 95

100mg/ml 94.6 98

上文抑制细胞生长百分数表明，冷冻物可以剂量依赖性方式这两种细胞系的细胞生长。

图1显示剂量为50和100mg/ml的冷冻物在处理三天后明显引起这些细胞系的发育不良。

图2显示在10^-12-10^-9M雌二醇存在下，处理细胞的反应类似于未通过这些激素剂量率刺激的对照细胞。然而，在1nM以上时，对照细胞受到强烈刺激，且在10^-7M雌二醇存在下DNA的浓度达到3.75ug(相对地，在没有雌二醇的对照中为0.69ug)。在用30和50mg/ml冷冻物处理的细胞中，在最大刺激时测量的DNA分别为1.9和1.8ug。图2显示在30和50mg/ml雌二醇存在下，处理细胞与雌二醇的亲和常数(Km)分别比对照细胞的Km的值高3和16倍。这意思是说，当软骨冷冻固体提取物存在时，高浓度雌二醇对完成细胞的相同生长来说是必须的。所以，这种提取物降低了最大反应(其90％抑制作用)并增加处理细胞与雌二醇的亲和常数。

体内测定

400只40天龄的雌性Sprague-Dawley大鼠(购自Charles River Co.，St-Constant，Quebec)适应其环境12天。此时，灌胃给予20mg DMBA/1ml玉米油(9，10-二甲基-1，2-苯并蒽；购自Sigma Chemical Co.)。处理后3个月，选出240只发展为乳腺癌的大鼠并分为两组。第一组由5个亚组组成。给予治疗组的大鼠日剂量为溶于3ml水的增加浓度的冷冻提取物，共给药8周，同时对照组给予相同体积的水。第二组由4个亚组组成，也给予治疗组大鼠日剂量为溶于3ml水加或不加上清液的冷冻物(大约25mg的蛋白质)，共给药10周，同时对照组接受相同体积的水。只有第二个组中的用3000mg/Kg/天浓度的冷冻物和3ml的上清液治疗的一个亚组也通过腹膜内(i.p.)给予小剂量的上清液注射液(大约8mg蛋白质在1ml水中)。

在开始两个试验时，称量大鼠体重为151-175g并随意进食和饮水。第一组大鼠的肿瘤的平均直径为0.9cm而第二组大鼠的肿瘤的平均直径为0.6cm。

结果摘录如下：

灌胃给予的软骨提取物的日剂量％肿瘤生长的抑制(与对照

相比肿瘤直径

的减少)

第一组试验：期限为8周

500mg/Kg/天 2％

1000mg/Kg/天 4％

3000mg/Kg/天 14％

5000mg/Kg/天 15％

第二组试验：期限为10周

3000mg/Kg/天 12％

3000mg/Kg/天+3ml上清液 18％

3000mg/Kg/天+3ml上清液 20％

+1mli.p.注射的上清液

这些结果表明，冷冻物含有胃肠道可吸收的活性成分并且该成分对肿瘤的大小有影响。该作用可能是直接影响肿瘤细胞或抗介导血管生产作用。

这些结果也表明，通过辅助减少5％的肿瘤直径反映出上清液具有活性，甚至在很稀的情况下(存在于3ml上清液中的蛋白质的量大约为25mg)。

病理组织学

为了评价软骨提取物的活性分子是无毒性的，通过断头杀死上文进行体内试验所使用的动物并进行下列组织分析：肝、肺、肾、心、脑。肌肉和乳腺。去除这些组织中的脂肪，此后在布安氏液中固定两天。乙醇脱水后，固定组织被包埋在石蜡中。获得其切片并将其置于载片上，用苏木精染色并在显微镜下观察。

组织学检查揭示，当单独使用最大剂量的冷冻物(未显示)或当使用与上清液一起的冷冻物时未观察到有害的作用(见图3a和b，4a和b，和5a和b)。

这提示，冷冻物和上清液具有控制肿瘤大小进展的活性。

在癌性乳腺中(见图6a和b)，观察到血管区显著减少。然后，通过下列图片和组织图描述的结果证实这些活性成分的抗血管生成作用：

图7显示当使用冷冻物(p.o.)-上清液(p.o.+i.p.)的组合物时(涉及图6a和b)，观察到血管区减少55％。

肿瘤大小的减少可能是由于其血管形成的明显减少、对肿瘤细胞的直接作用或两种现象的组合。上文已很好地描述了这些提取物的抗血管形成作用。体外在激素依赖性细胞上已观察了直接的发育不良的作用，仍需体内确证。

因为上文所述结果显示，混悬剂具有在冷冻物对ZR-75作用之上的增强的作用，因此，进一步研究了它的组分。

含有活性分子的液体馏分的OBTENTION

除了去掉浓度梯度之外，按上文所述方法收集和加工鲨鱼软骨。离心后，弃去片状物并按上文所述的相同方法加工上清液直到灭菌滤过0.22um的滤器。

下文将上清液制成粗渗透物，如超滤后的产物。

将如此获得的粗渗透物通过FPLC(快速蛋白质液相色谱层析)。

FPLC的条件：

柱：Hiload 26mm×60cm Sephacryl S-300

FPLC系统：来自Pharmacia

在装柱之前，将所有样品都滤过0.22um的滤器。洗脱缓冲液是过滤的磷酸盐缓冲的盐水(PBS)并且排气(degazed)15分钟。装载样品的体积通常为3.2ml(可高达13ml)。流速为1ml/分钟。收集10ml馏分。通过其UV吸收率(280nm)来检测洗脱的化合物。通过使用来自Sigma的MW-GF-1000校准试剂盒来获得校准图，该校准样品与分析样品所装体积相同(3.2ml)。样品的洗脱体积是由校准试剂盒的该分子量的化合物斑点所对应的洗脱体积减去柱的空体积导出的。通过注射葡聚糖蓝(M.W.＝2000000)获得空体积。试验馏分对ZR75-1细胞的活性。鉴定感兴趣的馏分并通过进一步研究(下文)来证实其特征。

在Rotofor(Biorad 170-2950；见下文的等电聚焦)和不同截去值的Amicon滤器上进行渗透物活性成分的其它定性来获得分子量在10-30KD、30-100KD甚至超过100KD的馏分。

等电聚焦(Isoelectrofocalization)：

在4℃温度下，使用Spectra pore#7 MWCO 3500 KD(Spectrum 132110)膜，将鲨鱼软骨制剂(46ml的渗透物1Kg/L)对4升含有5％甘油的纯水透析过夜。将透析溶液与2.75ml的两性电解质(Pharmacia#80-1125-87)PH 3.5-10.0和0.5gchaps (Sigma C3023；3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethyiammonio]-1-propane-sulfohate)混合。用纯水将体积补充到55ml。将溶液装到Rotofor上。在4℃温度、保持12瓦的能量(3000Xi能量供应Biorad 165-0554)并保持水循环以保证维持水温下进行等电聚焦。开始分离时，电压调到380伏特并且电流强度调到31毫安。当电流强度稳定时(14毫安)，电压读数为870伏特。停止等电聚焦并收集20个馏分。

馏分体积(ml) PH

1 3.7 3.56

2 2.1 4.01

3 2.2 4.18

4 2.3 4.31

5 2.2 4.63

6 2.1 5.03

7 2.5 5.30

8 2.1 5.50

9 2.4 5.81

10 2.5 6.26

11 2.3 7.00

12 2.4 7.29

13 2.4 7.64

14 2.5 7.94

15 2.3 8.32

16 2.5 8.62

17 2.4 8.94

18 2.9 9.30

19 3.1 9.88

20 3.6 10.71

通过在电泳凝胶上估计其分子量来鉴定这些蛋白质(Laemmli，U.K.(1970)Nature(Lond.)227：680)。

将这些馏分用装载缓冲液进行4倍稀释(见Laemmli)并将8ul等分试样在非还原的条件下进行电泳。图8显示各个馏分和等电聚焦前材料的电泳图。

将所有馏分在层流盖下通过灭菌Millipack-60滤器(其孔隙度为0.22um)灭菌装瓶。

通过Lowry剂量法评价馏分的蛋白质成分。1Kg/2L(表示为每升渗透物的粗软骨重量)的溶液以不同浓度的ZR75-1细胞在培养基中进行试验。结果概述如下：

第一个试验：

将渗透物冷冻干燥并通过FPLC。未检测出细胞减生(hypoplasiant)活性(数据未显示)。

第二个试验：

试验在Rotofor馏分上进行：蛋白质鉴定

鉴定的馏分等电点中间值分子量

7-8-9-10 5.30-6.26 5.78 29±1KD

7-8-9 5.30-6.26 5.68 60±1KD

12-13-14 7.29-7.94 7.62 48±1KD

13-14 7.64-7.94 7.79 35±1KD

对FPLC上的馏分进行的第三个试验：

馏分分子量

6和7 1-2.5KD

对100ul从Amicon分子滤器上获得的馏分进行的第四个试验：

试验浓度分子量 ZR75-1细胞培养的抑制作用

100μl/ml MW＞100KD 64％

100μl/ml 30KD＜MW＜100KD 114％

100μl/ml 10KD＜MW＜30KD 127％

400μl/ml MW＜10KD 149％

FPLC馏分6和7含有非常小的分子量(1-2.5KD)的活性成分。

馏分的减生作用可比由冷冻物所观察到的作用高达3300倍。上述结果表明冷冻基本上破坏和/或抑制洗脱液中所含的蛋白质的活性而当冷冻固体提取物时没有此破坏发生。

洗脱液中活性成分的进一步鉴定：

重新获得下列分子量范围的活性馏分(在ZR75-1细胞上试验的)，以相同渗透液(1Kg/L)开始，在10mm直径×30cm长的Superose-12柱上使用上文所述的FPLC和rotofor方法来进行另一种纯化。选择流速为1ml/分钟。收集45个1ml的馏分。

馏分20-21 相应于分子量为70-120KD的馏分的活性

馏分22 相应于分子量为60-70KD的馏分的活性

馏分29-32 相应于分子量为35-46KD的重叠馏分的活性

馏分34-35 相应于分子量为29KD的馏分的活性

馏分38-39 相应于分子量为1-2.5KD的馏分的活性

特异性

为了评价对肿瘤细胞活性的特异性，在其它源于间质的细胞、人TENON成纤维细胞(HTFs)(它是正常的成纤维细胞)上，对超滤后获得的渗透物进行试验。

B、体外

a.患者

仅使用从两名患者中获得的HTFs(一个具有新血管青光眼(NVG)和另一个具有原发性开角型青光眼(POAG))。

b.HTFs的继代培养和保养

在37℃温度下，用0.5ml 0.05％胰蛋白酶/0.5 mMEDTA(Gibco 610-5300AG)洗涤并分离各个融合的培养物。然后加入1.5ml含有15％FBS的DMF/F-12介质来中和胰蛋白酶/EDTA。

通过研制并转移到25cm² T-烧瓶中来使细胞缔合，再加入含有10％FBS的介质。达到融合后，将HTFs转入75cm²ｕ且可能为180cm²的T-烧瓶中。当获得足够的细胞时，一些细胞用于下文所述的试验，其它一并冷冻保存以便进一步实验。

c.实验方法

当完成融合时，通过上文所述方法分离来自一个患者的生长在两个或三个相同的180cm² T-烧瓶中的细胞。短时间低速离心之后，用ZMI CoulterCounter 216013(装有256-Channelyzer) 进行计数。为了下面的所有体外实验，将大约五万个细胞接种在1ml含有1％FBS的在各个16mm盘和12孔板的DMF/F-12介质中。接种后17小时，加入用1％FBS(“绝对”对照)补充的1ml新鲜的相同介质。依据实验的设计(见上下文)，补充FBS介质或不用GFs(生长因子)或用渗透物1Kg/2L(软骨重量/水体积)溶液补充并灭菌过滤。在这一天(0天)，对某些样品的细胞也进行计数以确定平皿接种效率(应当等于或大于95％)。

实验开始48小时后，清洗细胞并通过上文所述方法进行分离，然后再进行计数。细胞数表达为由“绝对”对照获得的细胞数的百分数。

每一个“绝对”或阳性对照(分别含有1％或5％FBS)和每一个实验组(用1％FBS和用单个的GF或软骨渗透物补充的)均由三份样品组成。

每一个实验在一个或两个患者的细胞上进行一次，并重复至少两次。

将生长因子(GBs)或软骨渗透物对成纤维细胞增殖的刺激作用与5％FBS的刺激作用进行比较。

在这些实验中，分别以10-100ng/ml在1％FBS中的浓度加入GFs、猪PDGF(pPDGF)和人重组bFGF(bFGF)(由Dr.P.Brazeau从Farmita；iaCarlo Erba，Milan，Italy馈赠)。实验开始48小时后，通过Trypsin-EDTA分散细胞并用Coulter计数器计数。下文所显示的所有重复三次的值等于每个孔中计数的二十分之一。

患者B：青光眼性别：男年龄：53

HTF

前一天：每孔细胞数：46170

DMF/F12-1％FBS-1％Pen.链球菌

零天：每孔细胞数：65214

DMF/F12-1％FBS-1％Pen.链球菌

第一天：每孔细胞数：62548

DMF/F12-1％FBS-1％Pen.链球菌

第二天：每孔细胞数：

样品/板 1 2 3 平均值 SEM ％对照生长

DMF/F12

板#1 1 0天 3,019 2,862 2,853 65,214 71

FBS 1％FBS

2 第一天 2,711 2,973 2,693 62,548 1,655

1％FBS

3 第二天 2,284 2,400 2,191 51,333 1,655 100

1％FBS

4 第二天 3,084 2,834 3,115 67,446 1,627 131^**

板#2 DMF/F12

PDGF

5 对照 2,558 2,181 2,216 51,931 2,199 100

(1％FBS)

6 1ng/ml 2,425 2,580 56,056 1,228 108

1％FBS

7 10ng/ml 4,080 3,875 4,282 92,116 1,648 177^***

1％FBS

8 100ng/ml 4,625 4,356 4,450 100,285 1,442 193^***

板#3 DMF/F12

b-FGF

9 对照 2,915 2,533 2,502 59,360 2,429 100

(1％FBS)

10 1ng/ml 2,744 2,554 2,761 60,174 1,213 101

1％FRS

11 10ng/ml 3,606 3,143 3,193 74,234 2,683 125

1％FBS

12 100ng/ml 4,064 3,033 3,026 75,585 6,307 127

1％FBS

板#4 DMF/F12

软骨 13 对照 2,826 2,566 2,486 58,822 1,877 100

(1Kg/2L)(1％FBS)

(过滤的)

14 1ug/ml 2,729 2,576 2,575 58,837 936 100

1％FBS

15 10ug/ml 2,643 2,493 2,584 57,643 789 98

1％FBS

16 100ug/ml 2,918 2,883 2,766 58,483 2,461 99

1％FBS

^** P＜0.02

^***P＜0.01 通过T检验确定

尽管生长因子如PDGF(血小板衍生的生长因子)和bFGF(基本的成纤维生长因子)对HTFs显示刺激活性，但当这些细胞在软骨渗透物(1Kg/2L)存在下生长时，观察到没有作用、阳性作用或阴性作用。未观察到发育不良的作用。这提示渗透物对肿瘤细胞具有特异的发育不良作用而对正常细胞未检测到作用。同样的软骨提取物对另一类型的成纤维细胞，HSF(人皮肤成纤维细胞；数据未显示)也没有作用。尽管没有实验，可设想出冷冻物对正常细胞也没有作用。

临床试验：

在进行初步临床试验之前，超滤后获得的粗渗透物是2和20倍的浓度，提供浓缩的活性渗透物。在具有1000道尔顿孔隙度的切线流过滤柱上获得这样的浓度，它减少洗脱液体积2和20倍。浓缩的渗透物过滤通过孔隙度为0.22um的微孔滤器。当用其它离心方法(使用具有孔隙度为30um膜的CEPA离心机)制备软骨素时，获得几乎与上述20倍浓缩提取物相同蛋白质浓度的10倍浓度的浓缩提取物，如，12mg/ml(改进的方法)代替14mg/ml(实验室规模的方法)。将灭菌的10倍浓缩渗透物分成7ml的等分试样(大约85mg的蛋白质)，置于灭菌烧瓶中，在-80℃下冷冻过夜并在-20℃下储存备用。粗品和浓缩渗透物之间的主要不同之处在于蛋白质浓度的不同。将会注意到，所使用的测定蛋白质的方法测量氮化合物而不仅仅是测定蛋白质(Kieldahl法)。这可以解释为什么当通过Lowry法测定蛋白质成分时蛋白质的浓度不是按常规情况随体积浓度成比例增加。因此假定浓缩步骤允许水以及低分子量含氮化合物渗透通过。

将浓缩的渗透物用于治疗与血管生成有关的疾病。在人体实验中，试验了两种不同类型的有代表性的与血管生成有关的疾病；第一类型是皮肤病(牛皮癣)和第二类型是癌(前列腺癌)。

在皮肤疾病中，选择牛皮癣。在牛皮癣的试验中，值得注意的是与角化过度并发的牛皮癣和非并发牛皮癣之间的区别。这种疾病的角化成分基本上不受浓缩软骨渗透物的影响，相反地，血管生成成分是以该活性成分的化合物为目标的。下面实施例将说明并证实这种观点。

患有前列腺癌的患者自愿接受10倍浓缩软骨渗透物试验。该患者经历一系列连续的常规治疗，暂时获得成功。最近，在其癌症显示再犯后，他开始服用软骨提取物。

下文所显示的结果是非常鼓舞人心的并且相信预示着粗渗透物在所有与血管生成有关的疾病的治疗中(而不仅仅是所试验的具体的某种疾病)有用的。在具有血管生成成分的疾病范围内，相信，本发明软骨提取物在这一点上会是有效的，其条件是使它成为一种含有其有效量的组合物并且该组合物以适宜形式来给药。所以，合适的是，本发明不被限定于下列具体的化合物，因为本领域技术人员应当能够引申出各种组合物，其中可通过其给药方式和靶向疾病组织来引导选择。可通过不同途径给予组合物如，局部给药、口服、舌下、直肠、静脉输入、肌肉注射等等。

牛皮癣：

制备下列皮肤组合物并证实其对于患有牛皮癣的患者的效能：

-Emulgade^TM CLB 29％(W/W)

-20倍的粗渗透物69.5％(W/W)

-Germaben^TM II 1％(W/W)，和

-Lavandula Angustifolia 0.5％(W/W)将Emulgade^TM CLB(硬脂酸酯、脂肪醇和非离子乳化剂的混合物，购自Henkel Canada Ltd.)在搅拌下加入到65-700C℃。停止加热但继续保持搅拌混合物。当混合物的温度到45℃时，加入必须的油LavandulaAngustifolia和防腐剂Germaben^TM II(diazonidylurea 30％、对羟基苯甲酸甲酯11％、对羟基苯甲酸丙酯3％和丙二醇56％；购自SuttonLaboratories，NJ，U.S.A.)。当混合物的温度达到30℃时，加入软骨提取物。如此获得的组合物是光滑而不腻的霜剂；通过按照制造者的使用说明来改变Emulgade TM的百分含量，可获得各种其它形式的粘性皮肤组合物(乳剂、洗剂、油膏)。可使用其它赋形剂来获得糊剂、凝胶剂和任何形式的透皮吸收的制剂。

在十二周的时期内，将上述制剂一天两次给予十名患有牛皮癣的病人(局部使用)，这些病人已经接受过常规治疗但后来变的难治。为了这个研究，选择肢体两侧牛皮癣程度相似并对称的病人。以双盲形式继续该试验，皮肤病医生和病人都不知道哪侧是用含有软骨提取物治疗的和哪侧是用对照组合物治疗的。在五名患有未并发角化过度的牛皮癣病人中，观察到明显的改善；将两名病人身体的部分图片显示在图9a)和9b)中。在图9a)中，显示治疗一个月后，患有并发角化过度的牛皮癣的病人没有显示非常明显的红斑减少，但没有了搔痒。然而角化过度仍很重。在治疗三个月后，第二个患有未并发角化过度牛皮癣的病人的图片(图9b))显示有非常好的改善。尽管牛皮癣表现为多因素疾病，可以设想，病人的反应取决于在该疾病的建立和存在中所包括的血管生成因子的重要性。如果将该制剂与其它能治疗所包含其它因素的治疗剂(角质层分离剂、消炎剂、抗组胺剂、免疫抑制剂等等)复合，则可能会获得更好的结果。

这种复合可以服用修改剂型的形式来包括如有效量的角质层分离剂。也可通过与本发明局部制剂同时或交替地分别给予此复合治疗剂来剂型治疗。而且，复合治疗不需要通过相同途径来给药。

尽管有高比例的软骨提取物，但上文制剂没有显示系统效果(作用局限于治疗面)且没有二级作用。痤疮(ACNAE)：

即使痤疮不是本发明人的知识，因为分作血管生成类疾病，仍然吸引人来在受此影响的病人上试验液体软骨提取物。为了在受痤疮影响的病人中试验软骨提取物，制备下列凝胶制剂：

Carbopol^TM 1.2％

纯化水77.2％

NaOH 0.3％

Phenoxetol^TM 0.3％

Tween80^TM 0.3％

2×软骨提取物20.0％

40×芦荟提取物0.5％

2×软骨提取物含有9-12mg/ml的蛋白质。该制剂显示在受非常严重或不严重形式的痤疮(炎性痤疮和kystic痤疮)影响的病人皮肤方面有明显的改善(数据未显示)。

这些令人惊奇的结果可能是由于抗血管生成作用(因此揭示痤疮的血管生成成分)、或它们可能是由于活性成分具有不同与抗血管生成的作用。这里回想起相同的提取物除抗血管生成作用之外还至少具有一种其它活性：在癌细胞系中表明直接的发育不良的作用。

癌：

在患有前列腺癌的一个病人中试验了10倍浓缩的渗透物。在1986年诊断出腺瘤。那时进行了发射治疗。在1991年，PSA(前列腺血清抗原)为138ug/L，而正常可接受的较高限为4ug/L。然后，该病人通过与抗雄激素治疗(Euflex TM)结合的阉割来进行完全不同的治疗。这种治疗在三年中是有效的，此后，PSA又开始上升。从1994年六月，该病人服用10倍的渗透物(每日舌下剂量大约75mg/7ml的蒸馏水，相当于大约1-1.5mg/Kg体重/天)。假如在DMBA治疗的动物(见上文)所获得的结果是可靠的，即使该剂量的显著一部分被吞服，它可能在胃肠道中吸收。PBS从12减少到0.9ug/ml(在1994年12月获得最后一次结果)。该剂量范围也可根据给药途径、活性成分的生物利用度和被控制疾病所需的进展情况来随意改变。此时，在大鼠(见上文实施例)和人中，已证实没有毒性(数据未显示)。

在DMBA治疗的大鼠上进行的其它体内试验中，液体提取物的剂量率是大约190-220mg的蛋白质/Kg体重，它可能对减少癌血管面有很大的作用(当与很大剂量的冷冻物组合时为55％)。所以推测，大约1-200mg/Kg体重/天的剂量对于通过减少或消除血管生成来治疗癌来说是中间剂量(ED50)的合理范围。

这些结果显示软骨液体提取物在治疗与血管生成有关的疾病治疗中具有很大的潜力。软骨提取物的量及其制剂可随意改变以符合具体的需要。推测，含有活性成分的粗渗透物的馏分也是有效的。这些馏分期待作进一步的研究。

一个可以注意到的是，在蛋白质的成分上，皮肤的局部制剂可含有大范围剂量的软骨提取物。在所试验的两种具体类型的疾病，例如，在治疗牛皮癣与痤疮的制剂中的最终蛋白质浓度的比率为4-5，而渗透物的稀释比率为35。在与血管生成有关的所有预计的应用中(从滴眼药到皮肤和癌药物制剂)，推测粗渗透物的最小最终蛋白质浓度可以很低(低于0.1mg/ml)。这种较低范围的剂量取决于可及性和活性成分对作用部位的渗透性以及这些组分的有效捕获和组织对血管生成抑制剂的敏感性或反应性。通常不知道在某些应用的制剂中最终蛋白质浓度的较高限制。尝试的最高最终浓度在牛皮癣疾病制剂中大约为9mg/ml蛋白质而在前列腺癌疾病中给予的7ml剂量单位中大约为12mg/ml。因为粗渗透物在未丢失其活性的情况下不能被冷冻干燥，相信最高剂量取决于浓度的限制，可使用粗渗透物，如，直到obtention的浓糖浆。

所需材料

-冷却剂

-外科用的仪器

-肉刀

-塑料袋

-工业用搅拌机(购自Fisher Scientfic的Waring 3-速搅拌机)

-水纯化系统(反向渗透且0.1um滤器；Continental Water System，PRE2202型，系列号为91089，Modulab Bioscience RQ/Polishing System购自Fisher Scientific，Montreal，Quebec)。该系统提供高质量的不致热的水。

-精密天平Mettler，AE系列，购自Fisher Scientific

-离心机Sorvall RC-285，购自DuPont Cahada

-离心机CEPA

-30um孔隙度的尼龙袋

-高压消毒锅(Sanyo自动蒸汽灭菌器，MAC 350p型)

-Nalgene 500ml容器，在1320C灭菌10分钟并干燥35分钟

-Whaman Reeve Angel 24um孔隙度的圆锥型滤器

-超滤柱(截馏分子量：500KD和(1KD，当可使用时)；表面：25平方英尺；流速：130L/分钟；进口压力：30psi；出口压力：5psi；购自KochMembrane Systems Inc.，Wilmington，MA，USA)

-卫生离心泵(Monarch Industries，ACE-S100类，A型)，可产生130L/分钟的流速

-灭菌室(购自Ingram & Bell的NuAire层流室)

-Millipack-60 0.22um灭菌滤器

-灭菌透明或琥珀色的玻璃瓶

-Amicon DC-10浓缩器

-Rotofor Riorad 170-2950

-截流值分别为10、30和100KD的Aamicon滤器SIOY10、SIOY30和SIOY100

-FPLC Pharmacia 216007(计算机Pharmacia 216014)

-Hilstand S-300 26mm/60cm(Pharmacia)

-Superose S-12 10mm/30cm(Pharmacia)

-冷冻机Labconco 10273 A

上文已经描述了本发明，应当会意识到，在本领域技术人员的能力和知识范围内，不脱离本申请的教导通过等同操作(会完成其相同的目的)取代本发明的某些要素来对本发明进行修饰应当是十分可能的。相信这些显而易见的改变都包含在本申请的范围之内。

Claims

1.一种提取液，它基本上由上清液馏分组成，可通过以下方法得到：将全鲨鱼软骨的含水匀浆离心后，至少进行一次分级，一种分级是经分子量截留值为500千道尔顿(KDa)的膜分离，该馏分中分子的分子量低于500KDa，所述提取液包括一种具有可独立于抗血管生成活性的直接抗肿瘤活性的组分。

2.权利要求1的提取液，其包括在一种分子量截留值为1千道尔顿(KDa)的膜进行的第二次分级，该馏分中分子的分子量在1至500KDa之间。

3.根据权利要求1的提取液，其组成如下：

脂类 0.10％

蛋白 8mg/ml

湿度 98.8％

钠 33.6mg/100g

钾 39.2mg/100g

钙 2.0mg/100g

镁 1.1mg/100g

锌和铁痕量。

4.由权利要求1的提取液分离的液体组分，经快速蛋白液相色谱测定，其分子量为1至2.5KDa，所述组分具有可独立于抗血管生成活性的直接抗肿瘤活性。

5.由权利要求1的提取液分离的液体组分，Rotofor^TM分离后，经电泳测定，其分子量为29KDa，等电点在5.3-6.26，所述组分具有可独立于抗血管生成活性的直接抗肿瘤活性。

6.由权利要求1的提取液分离的液体组分，Rotofor^TM分离后，经电泳测定，其分子量为35KDa，等电点在7.64-7.94，所述组分具有可独立于抗血管生成活性的直接抗肿瘤活性。

7.由权利要求1的提取液分离的液体组分，Rotofor^TM分离后，经电泳测定，其分子量为48KDa，等电点在7.29-7.94，所述组分具有可独立于抗血管生成活性的直接抗肿瘤活性。

8.由权利要求1的提取液分离的液体组分，Rotofor^TM分离后，经电泳测定，其分子量为60KDa，等电点在5.30-6.26，所述组分具有可独立于抗血管生成活性的直接抗肿瘤活性。

9.由权利要求1的提取液分离的液体组分，Rotofor^TM分离后，经快速蛋白液相色谱测定，其分子量为70-120KDa，所述组分具有可独立于抗血管生成活性的直接抗肿瘤活性。

10.由权利要求1的提取液分离的液体组分，Rotofor^TM分离后，经快速蛋白液相色谱测定，其分子量为60-70KDa，所述组分具有可独立于抗血管生成活性的直接抗肿瘤活性。

11.由权利要求1的提取液分离的液体组分，Rotofor^TM分离后，经快速蛋白液相色谱测定，其分子量为35-46KDa，所述组分具有可独立于抗血管生成活性的直接抗肿瘤活性。

12.由权利要求1的提取液分离的液体组分，Rotofor^TM分离后，经快速蛋白液相色谱测定，其分子量为29KDa，所述组分具有可独立于抗血管生成活性的直接抗肿瘤活性。

13.由权利要求1的提取液分离的液体组分，Rotofor^TM分离后，经快速蛋白液相色谱测定，其分子量为1-2.5KDa，所述组分具有可独立于抗血管生成活性的直接抗肿瘤活性。

14.如权利要求4-13的任一项定义的馏分，它们具有直接抗肿瘤活性，其中所述直接抗肿瘤活性是对乳腺癌细胞系体外可测量的。

15.一种获得鲨鱼软骨提取液的方法，它包括以下步骤：

a)在大约中性pH水溶液中匀化鲨鱼软骨直至鲨鱼软骨的粒径小于或等于500微米，得到颗粒和粗体液的混合物；

b)将所述粗提液与所述颗粒分离；及

c)进一步分离粗提液以得到含分子量小于或等于500KDa的软骨分子的最终提取液。

16.权利要求15的方法，其中所述中性pH水溶液由水组成，所述步骤均在4℃下进行。

17.权利要求15的方法，其中步骤a)在30分钟内完成。

18.权利要求15的方法，其中所述鲨鱼软骨和所述中性pH水溶液的比例每1升溶液匀化湿重1Kg的软骨。

19.权利要求15的方法，其中所述分离步骤b)通过离心完成。

20.权利要求15的方法，它还包括步骤d)将最终提取液浓缩，得到含分子量在1KDa和500KDa之间的软骨分子的浓缩提取液。

21.权利要求15的方法，它还包括步骤d)分离所述提取液，得到所述提取液的液体馏分。

22.权利要求21的方法，其中所述分离步骤通过快速蛋白液相色谱进行，并且其中所得液体馏分含分子量在1KDa和2.5KDa之间的软骨分子。

23.权利要求21的方法，所述分离步骤通过Rotofor^TM分离和电泳进行，其中所述液体馏分含有分子量为29KDa的软骨分子且等电点为5.3至6.26。

24.权利要求21的方法，所述分离步骤通过Rotofor^TM分离和电泳进行，其中所述液体馏分含有分子量为35KDa的软骨分子且等电点为7.64至7.94。

25.权利要求21的方法，所述分离步骤通过Rotofor^TM分离和电泳进行，其中所述液体馏分含有分子量为48KDa的软骨分子且等电点为7.29至7.94。

26.权利要求21的方法，所述分离步骤通过Rotofor^TM分离和电泳进行，其中所述液体馏分含有分子量为60KDa的软骨分子且等电点为5.30至6.26。

27.权利要求21的方法，其中所述分离步骤通过Rotofor^TM分离和快速蛋白液相色谱进行，并且其中所得液体馏分含分子量在70KDa和120KDa之间的软骨分子。

28.权利要求21的方法，其中所述分离步骤通过Rotofor^TM分离和快速蛋白液相色谱进行，并且其中所得液体馏分含分子量在60KDa和70KDa之间的软骨分子。

29.权利要求21的方法，其中所述分离步骤通过Rotofor^TM分离和快速蛋白液相色谱进行，并且其中所得液体馏分含分子量在35KDa和46KDa之间的软骨分子。

30.权利要求21的方法，其中所述分离步骤通过Rotofor^TM分离和快速蛋白液相色谱进行，并且其中所得液体馏分含分子量在29KDa。

31.权利要求21的方法，其中所述分离步骤通过Rotofor^TM分离和快速蛋白液相色谱进行，并且其中所得液体馏分含分子量在1KDa和2.5KDa之间的软骨分子。

32.权利要求15、20和21的任一项的方法，其中方法的步骤是在4℃下进行的。

33.一种治疗肿瘤增殖和血管生成疾病或适应症的组合物，它含有有效量的如权利要求1-3的任一项定义的软骨提取液和药学上适宜的载体。

34.权利要求33的组合物，其中所述疾病为皮肤病症或皮肤疾病。

35.权利要求34的组合物，其为局部施用的且其中加入软骨提取液以使软骨蛋白终的浓度为2至10毫克/毫升组合物。

36.权利要求35的组合物，其中所述的疾病为牛皮癣，且所述软骨蛋白终浓度为10毫克/毫升。

37.权利要求35的组合物，其中所述的疾病为粉刺，且所述软骨蛋白终浓度为2毫克/毫升。

38.权利要求33的组合物，其中所述的疾病为癌症。

39.如权利要求38的组合物，其中7毫升水中的所述软骨提取液的终浓度为75毫克蛋白。

40.如权利要求39的组合物，该组合物为舌下用组合物。

41.鲨鱼软骨提取物在制备用于治疗肿瘤增殖或血管生成疾病或适应症的药物的用途，它包括向需此治疗的患者施用有效量的如权利要求1-3的任一项定义的软骨提取液和药学上适宜的载体。