CN112813042B

CN112813042B - 乳腺脂肪组织来源的多肽及其抗肿瘤应用

Info

Publication number: CN112813042B
Application number: CN202110172264.5A
Authority: CN
Inventors: 吕明明; 陆迅; 李幸幸; 陆澄; 张敏; 陈飞
Original assignee: Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Current assignee: Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Priority date: 2021-02-08
Filing date: 2021-02-08
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2041-02-08
Also published as: CN112813042A

Abstract

本发明公开了乳腺脂肪组织来源的多肽及其抗肿瘤应用。一种乳腺脂肪组织来源的多肽PDBAG1，氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。在该多肽分子低浓度时可以抑制乳腺癌细胞的活力、促进其凋亡，主要是通过损害糖酵解储备能力、上调肿瘤细胞中活性氧发挥抗癌作用。所述的脂肪组织来源的多肽PDBAG1低剂量时便可以发挥显著的抑癌作用，该多肽为小分子多肽、易被合成，高效、低毒，具有较好的抗肿瘤效果。

Description

乳腺脂肪组织来源的多肽及其抗肿瘤应用

技术领域

本发明属于抗肿瘤领域，涉及乳腺脂肪组织内源性多肽及其抗肿瘤应用。

背景技术

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，随着治疗手段的逐渐丰富，患者的生存预后已经有了显著的提升，5年存活可以达到90％。但是三阴乳腺癌因雌激素受体、孕激素受体及人表皮生长因子受体2均阴性，临床治疗中缺乏有效的治疗手段，一直以来主要以化疗为主，依然是乳腺癌治疗的难点和困境。因此，如何解决三阴乳腺癌临床治疗问题一直是乳腺癌意义显著。

多年研究表明，三阴性乳腺癌因缺乏靶点，只能常规手术结合放化疗等进行治疗。乳腺癌的综合治疗手段已经大幅提升，对于患者的预后有较好的改善。针对激素受体阳性乳腺癌患者的激素内分泌治疗，以及针对HER2阳性患者的靶向治疗均取得了不小的成果。然而，三阴性乳腺癌缺乏有效的可利用治疗靶点。肿瘤的治疗，除了靶向肿瘤细胞本身之外，更多应关注的是其所生长的微环境。解析乳腺癌肿瘤微环境中的组分及功能具有重要意义。现有研究表明，肿瘤细胞的无限增殖以及转移均与微环境的变化有重要关系。目前基于肿瘤微环境的独特性质开发了光热治疗(Photothermal Therapy,PTT)、光动力治疗(Photodynamic Therapy,PDT)、产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)等新型特异性治疗手段,其中产生活性氧的治疗手段颇受关注。肿瘤细胞内的氧化应激主要是由大量活性氧积累产生，低浓度ROS可激活肿瘤微环境中的宿主细胞，通过诱导细胞发生线粒体自噬、改变糖代谢关键酶和基因组以及激活信号通路等生物学功能促进肿瘤的糖代谢，以此来维持肿瘤高耗能的需求；而高浓度的ROS可以通过诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤的发生和发展。

发明内容：

本发明的目的是针对现有治疗策略的不足，提供人乳脂肪组织内源性多肽PDBAG1-unmodified和PDBAG1。

本发明的另一目的是提供所述多肽的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

本发明所述的一种人乳腺脂肪组织内源性多肽PDBAG1-unmodified，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

编码所述的人乳腺脂肪组织内源性多肽PDBAG1-unmodified的基因具有SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列。

本发明所述的一种人乳腺脂肪组织内源性多肽PDBAG1，经修饰后氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明所述的多肽PDBAG1-unmodified、PDBAG1在制备抑制乳腺癌药物中的应用。

所述的人乳腺脂肪组织内源性多肽PDBAG1-unmodified、PDBAG1，在抑制乳腺癌细胞活力和促进凋亡方面的应用。

所述的人乳腺脂肪组织内源性多肽PDBAG1-unmodified、PDBAG1，在抑制乳腺癌细胞有氧糖酵解和促进线粒体ROS方面的应用。

所述多肽的获得可按照氨基酸序列通过固相合成方法获得；或者通过宿主微生物或细胞内克隆并表达携带编码所述多肽之一的核苷酸序列的DNA片段，通过现有的重组DNA技术制备获得。所使用的表达载体和宿主细胞均为重组技术为公众所知的。表达载体例如pET载体、pGEX载体；宿主细胞例如大肠杆菌(E.coli)，放线菌(Actinomycetes)，芽孢杆菌(Bacillus)，链霉菌(Streptomyces)，本发明所述的多肽可用常规的酶切方法将其从宿主细胞中分离，也可以通过常规的液相色谱法进行分离和纯化，上述的分离纯化方法都是本领域技术人员公知的技术。

有益效果：

人乳腺脂肪组织内源性多肽PDBAG1-unmodified(ASKKVCIVGSGNWGSAIA)，来源于GPD1，有18个氨基酸，目前尚无其相关功能报道。生物信息学分析及实验结果显示：①PDBAG1-unmodified来源于GPD1蛋白，该区域同样存在于小鼠、大鼠和牛等GPD1蛋白上，所以PDBAG1-unmodified在哺乳动物总高度保守。②protparam在线分析发现，PDBAG1-unmodified的不稳定系数-20.94，属于稳定多肽，脂肪系数为92.22，平均亲疏水性0.528，表现为疏水亲脂性，可通过扩散或胞吞作用进入细胞内；③PDBAG1-unmodified多肽添加穿膜序列等修饰后，更加稳定、更容易进入细胞，抑癌功能进一步提高；④FITC标记的PDBAG1加入MDA-MB-231细胞中，24小时后通过激光共聚焦观察发现荧光分布于细胞质和细胞核中，表明PDBAG1能够穿过细胞膜和核膜发挥功能。细胞培养液中加入PDBAG1，有抑制三阴乳腺癌细胞活力的功能。PDBAG1处理后的三阴乳腺癌细胞凋亡增加，糖酵解储备值降低，线粒体ROS显著增加。因此，PDBAG1可以在制备杀伤肿瘤的药物中应用。

附图说明：

图1多肽PDBAG1-unmodified和PDBAG1对三阴乳腺癌细胞活力的影响

图2 FITC标记多肽PDBAG1在细胞中的分布

图3多肽PDBAG1对三阴乳腺癌细胞凋亡的影响

图4多肽PDBAG1对三阴乳腺癌细胞有氧糖酵解的影响

图5多肽PDBAG1对三阴乳腺癌细胞ROS活性氧的影响

图6多肽PDBAG1对三阴乳腺癌细胞线粒体的影响

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步说明。

实施例1多肽PDBAG1-unmodified和PDBAG1合成以及生物学参数分析

多肽PDBAG1-unmodified的序列为Ala Ser Lys Lys Val Cys Ile Val Gly SerGly Asn Trp Gly Ser Ala Ile Ala(SEQ ID NO.1)，是一个由18个氨基酸组成的多肽分子，在N端天然存在乙酰化修饰。通过在线多肽分析工具获取多肽的主要生物学参数如下：等电点(Theoretical pI)为9.32，分子量(Molecular weight,Mw)为1748.03。委托上海科肽生物科技有限公司用过固相法合成如以上所示序列的多肽。

为了更加优化该多肽分子性能，使其更好进入细胞发挥功能，我们在其N端添加穿膜肽片段：GRKKRRQRRRPPQQ，多肽序列改造为：Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg ArgArg Pro Pro Gln Gln-Ala Ser Lys Lys Val Cys Ile Val Gly Ser Gly Asn Trp GlySer Ala Ile Ala(SEQ ID NO.2)，为32个氨基酸组成的多肽，在保持了N端乙酰化修饰的同时，将其C端进行了酰胺化修饰。委托上海科肽生物科技有限公司用过固相法合成如以上所示序列的多肽以及FITC标记的多肽。

将以上合成的多肽分别用超纯水(ultra pure water)溶解为100μM，-80度储存备用。

实施例2多肽PDBAG1对三阴乳腺癌细胞的活力的影响

将三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231按照标准条件(37℃、5％CO₂)培养。第一天，按照2000个细胞/100ul培养基/每孔的密度接种在96孔培养板中；第二天，分别给予多肽PDBAG1-unmodified和PDBAG1处理(设置10、50μM高低两个浓度)，对照组给予超纯水处理；在多肽处理24h、48h、72h后，分别配置含有10％CCK-8试剂的培养基，更换培养基，标准条件继续培养1h，酶标仪检测450nm波长处的吸光值，以OD数值数描绘生长曲线。

结果如图1A和B所示，50μM浓度的多肽PDBAG1-unmodified在72小时可以显著抑制三阴乳腺癌细胞的活力，而修饰后的多肽PDBAG1在10μM浓度时便可以显著抑制三阴乳腺癌的细胞的活力，在50μM浓度下细胞几乎全部死亡。我们后续采用30μM浓度处理细胞，检测细胞功能。且多肽PDBAG1也可以抑制MDA-MB-468、MCF-7等其他乳腺癌细胞株的活力。

实施例3 FITC标记的多肽PDBAG1在细胞中的分布

将三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231按照标准条件(37℃、5％CO₂)培养。第一天，按照200000个细胞/2ml培养基/每孔的密度接种在6孔培养板中；第二天，实验组给予30μM浓度的FITC荧光标记PDBAG1处理，对照组给予超纯水处理；在多肽处理24h后，利用荧光显微镜观察多肽的入胞情况。

结果如图2所示，多肽PDBAG1可以进入三阴乳腺癌细胞内，在细胞核和细胞质中均有分布，提示其发挥功能的机制可能。

实施例4多肽PDBAG1对三阴乳腺癌细胞凋亡的影响

将三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231按照标准条件(37℃、5％CO₂)培养。第一天，按照200000个细胞/2ml培养基/每孔的密度接种在6孔培养板中；第二天，实验组给予30μM浓度的多肽PDBAG1处理，对照组给予超纯水处理；在多肽处理24h后，利用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。

结果如图3所示，多肽PDBAG1可以显著促进三阴乳腺癌细胞株的凋亡。

实施例5多肽PDBAG1对三阴乳腺癌细胞糖代谢的影响

将三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231按照标准条件(37℃、5％CO₂)培养。第一天，按照80000个细胞/500ul培养基/每孔的密度接种在seahorseXF24孔培养板中；第二天，实验组给予30μM浓度的多肽PDBAG1处理，对照组给予超纯水处理；在多肽处理24h后，利用seahorse细胞能量代谢分析仪检测细胞糖酵解压力的变化情况。

结果如图4所示，多肽PDBAG1可以显著损害三阴乳腺癌细胞株的糖酵解储备能力。

实施例6多肽PDBAG1对三阴乳腺癌细胞ROS活性氧的影响

将三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231按照标准条件(37℃、5％CO₂)培养。第一天，按照200000个细胞/2ml培养基/每孔的密度接种在6孔培养板中；第二天，实验组给予30μM浓度的多肽PDBAG1处理，对照组给予超纯水处理；在多肽处理24h后，利用流式细胞仪检测细胞中ROS活性氧变化情况。

结果如图5所示，多肽PDBAG1可以显著升高三阴乳腺癌细胞内活性氧的水平。

实施例7多肽PDBAG1对三阴乳腺癌细胞线粒体的影响

将三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468按照标准条件(37℃、5％CO₂)培养。第一天，按照200000个细胞/2ml培养基/每孔的密度接种在6孔培养板中；第二天，实验组给予30μM浓度的多肽PDBAG1处理，对照组给予超纯水处理；在多肽处理24h后，利用MitoTracker^TMRed与Hoechst共染色，荧光显微镜观察线粒体情况。

结果如图6所示，对照组线粒体形态完整，紧凑，多肽PDBAG1处理后，两组细胞线粒体染色荧光强度显著下调，形态松散，线粒体受到损伤。

序列表

<110> 南京市妇幼保健院

<120> 乳腺脂肪组织来源的多肽及其抗肿瘤应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Ser Lys Lys Val Cys Ile Val Gly Ser Gly Asn Trp Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ile Ala

<210> 2

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gln Ala Ser

1 5 10 15

Lys Lys Val Cys Ile Val Gly Ser Gly Asn Trp Gly Ser Ala Ile Ala

20 25 30

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctagcaaga aagtctgcat tgtaggctcc gggaactggg gctcagccat cgcc 54

Claims

1.一种脂肪组织来源的多肽PDBAG1-unmodified，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

2.根据权利要求1所述的多肽PDBAG1-unmodified，其特征在于，所述的多肽PDBAG1-unmodified的N端天然存在乙酰化修饰。

3.权利要求1所述的多肽PDBAG1-unmodified在制备抑制三阴性乳腺癌的药物中的应用。

4.权利要求1所述的多肽PDBAG1-unmodified在制备抑制三阴性乳腺癌细胞增殖活力和/或促进其凋亡的试剂中的应用。

5.权利要求1所述的PDBAG1-unmodified在制备抑制三阴性乳腺癌细胞有氧糖酵解和促进线粒体ROS的试剂中的应用。

6.一种脂肪组织来源的多肽PDBAG1，其特征在于，所述的多肽PDBAG1在权利要求1所述的多肽PDBAG1-unmodified的N端添加穿膜肽片段：GRKKRRQRRRPPQQ，在保持了N端乙酰化修饰的同时，将其C端进行了酰胺化修饰。

7.根据权利要求6所述的脂肪组织来源的多肽PDBAG1，其特征在于，氨基酸序列如SEQID No.2所示。

8.权利要求6所述的多肽PDBAG1在制备抑制三阴性乳腺癌的药物中的应用。

9.权利要求6所述的多肽PDBAG1在制备抑制三阴性乳腺癌细胞增殖活力和/或促进其凋亡的试剂中的应用。

10.权利要求6所述的多肽PDBAG1在制备抑制三阴性乳腺癌细胞有氧糖酵解和/或促进线粒体ROS的试剂中的应用。