CN1284130A

CN1284130A - 内抑制素的突变体,具有抗血管生成活性的“em1”及其使用方法

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Publication number: CN1284130A
Application number: CN98811953A
Authority: CN
Inventors: 维卡斯·P·萨克哈特姆
Original assignee: Beth Israel Deaconess Medical Center Inc
Current assignee: Beth Israel Deaconess Medical Center Inc
Priority date: 1997-12-08
Filing date: 1998-12-08
Publication date: 2001-02-14
Also published as: JP2001526040A; EP1038011A2; IL136665A0; AU749904B2; AU1808899A; AU1806599A; AU742866B2; KR20010015867A; CN1284134A; JP2002503449A; WO1999029855A1; IL136668A0; EP1038011B1; KR20010015869A; AU753889B2; CA2312287A1; WO1999029878A3; KR20010015868A; CN1322246A; AU1718099A

Abstract

本文描述了内抑制素的新型突变体,其中一种称为“ EMI”,具有与野生型内抑制素相同或超过它的抗血管生成活性。本发明涉及发现一种分离的抗—血管生成肽,其中肽的C－末端包括氨基酸序列SYIVLCE,其具有抗血管生成性能。称为“EM1” 的,这种蛋白质包括突变的内抑制素蛋白质,其中突变包括从突变内抑制素蛋白质的C末端的9个连续氨基酸缺失(如NSFMTSFSK)。EM1终止在氨基酸序列SYEVCIE中。本发明还包括编码EM1的分离的多核苷酸,与表达序列实施连接,及用这种构建转化的宿主细胞。也公开了EM1的抗体。本发明还涉及制备EM1,含EM1的融合蛋白质,及含EM1或其融合细胞的组合物的方法。本发明还公开了制备编码EM1的多肽的方法。

Description

内抑制素的突变体，具有抗血管生成活性的 “EM1”及其使用方法

相关申请

本申请要求1997年12月8日提交的60/082，663申请，1998年4月22日提交的60/083，663申请，和1998年11月16日提交的60/108，536申请的优先权，其全部内容参考收入本篇。

本发明的背景

转移性癌症的预后症状保持着较大可能的不利情况。尽管有放疗和化疗的改进，但经过过去几十年接受治疗的患者的长期存活率仅表现出边界改进。缺少适用于转移性癌症的显著治疗方法强调了应集中发展新型治疗方法。在这一方面，针对固体肿瘤的肿瘤脉管系统治疗在几种动物模型系统中显示出很有希望的结果(Baillie 等人(1995)Br.J.癌症72：257-67；Bicknell，R.(1994)Ann.Oncol.5(增刊)4：45-50；Fan等人(1995)趋势Pharmacol.科学16：57-66；Thorpe，P.E.及Burrows，F.J.(1995)乳腺癌研究。治疗34：237-51；Burrows，F.J.和THhorpe，P.E.(1994)Pharmacol.Ther.64：155-74)。如在裸鼠模型中，将野生VHL基因引入到786-0细胞，RCC肿瘤细胞系中，抑制了肿瘤生长(Iliopoulos等人。(1995)Nat.Med.1：822-26)和血管生成。

超过若干立方毫米(mm³)的固体肿瘤的生长取决于新血管的形成(Folkman，J.(1971)N.Engl.J.Med.285：1182-86)。大量的研究已显示原发性肿瘤和转移性生长都与血管生成有关(Folkman，J.(1971)N.Engl.J.Med.285：1182-86；Folkman，J.(1972)Ann.Surg.175：409-16；Folkman，J.和Shing，Y.(1992)J.生物化学。267：10931-34；Folkman，J(1996)科学.Am．275：150-54)。一些血管生成抑制剂已经确定。某些种类，如血小板因子-4(Maione等人(1990)科学247：77-79；Gupta等人(1995)Pro，Natl.Acad.科学(USA)92：7799-7803)，干扰素α，干扰素-可诱导蛋白质-10，和PEX(Angiolillo等人(1995)J.Exp.Med.182：155-62；Strieter等人(1995)生物化学，生物物理，研究，交流。210：51-57；Brooks等人(1998)细胞92：391-400)，是“与肿瘤无关的”，而其他两种，即抗血管生成素(angiostatin)和内抑制素(endostatin)是“与肿瘤有关的”(O’Reilly等人(1994)细胞79：315-28；O’Reilly等人(1997)细胞88：277-85)。抗血管生成素，一种由调节基质金属弹性蛋白酶的肿瘤-渗透巨噬细胞产生的有效的血管生成内生抑制剂，抑制很多种原发及转移性肿瘤的生长(Lannutti等人(1997)癌症研究，57：5277-80；O’Reilly等人(1994)冷泉港，Symp.Quant.Biol.59：471-82；O’Reilly，M.S.，(1997)Exs.79：273-94；Sim等人(1997)癌症研究。57：1329-34；Wu等人(1997)生物化学，生物物理，研究，交流236：651-54)。

目前，O’Reilly等人[(1997)细胞88：277-85]从鼠血管内皮瘤细胞系(EOMA)中分离的了内抑制素，一种血管生成抑制剂。在患有慢性肾不足但没有可检测到的肿瘤的患者中已检测到人类内抑制素片段的循环量，但这个片段含有缺失，没有抗-血管生成活性(Standker等人(1997)FEBS LETT.420：129-33)。内抑制素的氨基端序列与胶原质ⅩⅧ的羧基段部分对应。内抑制素是内皮扩增和血管生成的特异抑制剂。在Eschericha coli中表达的非重折叠沉淀蛋白质的系统用药会在异种移植物模型中产生Lewis肺癌，T241纤维肉瘤，B16恶性黑素瘤和EOMA细胞的生长退化[O’Reilly等人(1997)细胞88：277-85]。并且，在所研究的三种肿瘤类型中没有抗药记录。对内抑制素重复周期用药已报道会致使肿瘤休眠[Boehm等人(1997)自然390：404-407]。

这些研究得到的结果给治疗癌症带来了新方法，并为克服常在化疗期间可观察到的抗药性提供令人鼓舞的方法。然而，在所有这些研究中，抑制剂蛋白质的非重折叠沉淀形式是以悬浮态给肿瘤携带动物服用的。此外，需要大量的蛋白质产生肿瘤退化及致使肿瘤休眠。如Kerbel所指出的[(1997)自然390：335-36]，需要口服这些蛋白质的等同物。如果可获得可溶解态的这些蛋白质重组形式，那么就可进行理论研究。并且，在活体内条件下研究其功效之前，可用溶解蛋白质在体外进行初始试验。此外，还报道尽管这些蛋白质有很大希望，但由于制备充足蛋白质进行试验有很大困难及有关它们抗血管生成性能的不一致结果[King，R.T.(1998)华尔街J，.第一页11月12日；Leff，D.N.(1998)今日生物世界9：1，10月20日]，使得评价它们的临床潜力受到阻碍。目前明显地存在需要一种制备大量抗血管生成蛋白质可溶解形式的方法，并且其在体内和体外都有可靠的性能。

本发明的简述

本文描述了内抑制素的新型突变体，其中一种称为“EM1”，具有与野生型内抑制素相同或超过它的抗血管生成活性。

本发明涉及发现一种分离的抗-血管生成肽，其中肽的C-末端包括氨基酸序列SYIVLCIE，其具有抗血管生成性能。称为“EM1”的，这种蛋白质包括突变的内抑制素蛋白质，其中突变包括从突变内抑制素蛋白质的C末端的9个连续氨基酸缺失(如NSFMTSFSK)。EM1终止在氨基酸序列SYEVCIE中。本发明还包括编码EM1的分离的多核苷酸，与表达序列实施连接，及用这种构建转化的宿主细胞。也公开了EM1的抗体。本发明还涉及制备EM1，含EM1的融合蛋白质，及含EM1或其融合细胞的组合物的方法。本发明还公开了制备编码EM1的多肽的方法。

本发明还涉及制备EM1，含EM2的融合蛋白质，以及含EM1或其融合产物的组合物的方法。本发明还公开了制备编码EM1的多肽的方法。

此外，本发明包括抑制哺乳动物组织内血管生成活性的方法，包括用含EM1的组合物接触组织，特别抑制产生在许多疾病和病状中的血管生成，包括癌症。

本发明还公开了使用EM1诱导细胞程序死亡，或EM1的抗体阻止细胞程序死亡。本发明进一步公开在基因治疗法中使用EM1。靶细胞可以是任何哺乳动物细胞，具体地是淋巴细胞，血细胞，TIL细胞，骨髓细胞，脉管细胞，肿瘤细胞，肝细胞，和成纤维细胞。

本发明的示图简介

图1是内抑制素核苷酸序列示图(SEQ ID NO：1)。编码EM1的多核苷酸包括多核苷酸序列到核苷酸525。编码EM2的多核苷酸包括多核苷酸序列到核苷酸501。

图2是图1的核苷酸序列的翻译(SEQ ID NO：2)。

图3是用Ni-NTA柱的洗脱结果。沿X-轴显示组分数，每种组分(○)在280nm的吸收率在Y-轴。对于每种组分，洗脱缓冲液的PH(■)在右Y轴显示。

图4显示从原核表达系统中制备的蛋白质的12％非还原SDS-PAGE凝胶。尺寸kDa在左边显示，第一道含尺寸标记。2道含粗制蛋白质，3道和4道含组分7和8的样品，其在PH6.3洗脱。5和6道含组分21和22的样品，在PH4．3洗脱。7道含用DTT还原的组分22样品。

图5表示使用肝磷脂-琼脂糖柱提纯在酵母中表达的溶解鼠内抑制素。组分数沿X-轴表示，，每种组分(○)在280nm的吸收率在左边Y-轴。用来洗脱每种组分氯化钠的浓度(■)在右Y轴显示。

图6表示从肝磷脂-琼脂糖柱提纯的重组溶解鼠内抑制素的12％非还原SDS-PAGE凝胶。尺寸kDa在左边显示，第一道含尺寸标记。2道含粗制蛋白质，3道含未结合蛋白质，4道含冲洗组分，5和6道分别含组分9和10的样品，其都用0.3ml氯化钠洗脱。7和8道分别含组分21和22，其都用0.6M氯化钠洗脱。

图7是用Ni-NTA柱在酵母中表达的溶解组氨酸内抑制素的洗脱图。沿X-轴显示组分数，每种组分(○)在280nm的吸收率在左边Y-轴。用来洗脱每种组分的咪唑(mM)的浓度(■)在右Y轴显示。

图8表示在酵母中表达的溶解组氨酸内抑制素的选取组分的12％非还原SDS-PAGE凝胶。尺寸kDa在左边显示，第一道含尺寸标记。2道含粗制蛋白质，3道含流经组分(即未结合蛋白质)，4道含冲洗组分，5道含组分9，其用10mM咪唑洗脱，6和7道分别含组分35和36的样品，其用50mM咪唑洗脱，8和9道分别含组分53和54的样品，其用100mM咪唑洗脱。

图9表示由酵母和细菌表达的重组鼠内抑制素的Western印迹分析。1道含细菌表达啊组氨酸内抑制素，2道含酵母中表达的内抑制素，3道含酵母产生的组氨酸内抑制素。

图10描述了内皮细胞增殖检测法的结果。测试由酵母表达的提纯的鼠内抑制素的抑制C-PAE细胞内胸苷(甲基-³H)插入的能力。内抑制素的浓度(100ng到10000ng)在X轴表示，³H-胸苷的掺入率在Y轴表示。酵母衍生的溶解内抑制素(○)和酵母衍生的溶解组氨酸(■)的掺入率随着内抑制素的浓度增加稳定下降。

图11是柱状图，表示重组鼠内抑制素对非内皮细胞的作用。空柱表示786-0细胞，阴影柱表示A₄₉₈细胞。两种都是肾癌细胞，用2％血清中bFGF(3ng/m1)刺激。

图12A和12B是两张照片，表示使用bFGF(25ng/ml)作刺激物溶解鼠内抑制素对内皮细胞(ECV304)的抑制作用。图12A表示在对照物(+bFGF，无内抑制素)中移动的内皮细胞，图12B表示用内抑制素(20μg/ml)和bFGF治疗的移动的内皮细胞。

图13是柱状图，表示使用不同浓度的内抑制素对内皮细胞移动的抑制作用。相对细胞移动在Y轴表示治疗方式(对照物，25ng/ml bFGF，20，10，5，2.5μg/ml内抑制素)在X轴表示。

图14A，14B和14C是显微摄像图，表示存在内抑制素时对由VEGF(250ng/粒)调节的血管生成的抑制作用。图14A是负对比，图14B是正对比(VEGF)，图14C表示内抑制素加VEGF的效果。

图15A和15B是两张柱状图，表示在CAM检测法中，使用内抑制素(20，10，1，0μg/目)对VEGF(板顶部)和bFGF(板底部)调节的血管生成的抑制作用。两张图都显示随着内抑制素的浓度增加对血管生成的抑制作用稳定增加。

图16是柱状图，表示在内皮细胞增殖检测法中，多克隆抗血清对鼠内抑制素的抑制效果的中和。³H-胸苷的掺入率在Y轴表示，治疗方式(对照物，10μg内抑制素+抗血清，5μg内抑制素，5μg内抑制素+抗血清，预免疫血清，内抑制素抗血清，和内抑制素IgG)在X轴表示。

图17A和17B是两张照片，表示CAM检测法的结果，演示了多克隆抗血清对内抑制素抑制活性的中和作用。图17A表示VEGF和内抑制素(10μg/粒)的效果，图17表示内抑制素(10μg/粒)加多克隆抗血清加VEGF的效果。

图18表示通过重组内抑制素系统治疗，对786-0肿瘤生长的抑制作用。Y轴表示肿瘤体积为mm³，治疗后的天数为时间在X轴上。以10mg/kg/天实施腹腔内注射内抑制素，开始于第一天(箭头)。每个时间点表示每组5只鼠的平均值，打叉柱表示S.E.M。治疗方式为对照物PBS(○)，酵母表达内抑制素(●)，酵母表达组氨酸内抑制素(x)，和细菌表达内抑制素(□)。

图19A到19E是一组照片，表示用重组内抑制素治疗的786-0肿瘤。在治疗阶段的最后，在解剖显微镜下，全面对比物肿瘤和治疗肿瘤组检测。图19A和19B是对照物肿瘤，图19C表示用酵母衍生的内抑制素治疗的肿瘤，图19D表示细菌衍生的组氨酸内抑制素的效果，图19E表示用酵母衍生的组氨酸内抑制素治疗的肿瘤。

图20表示内抑制素突变体对无胸腺裸鼠786-0肿瘤的作用。治疗后天数在X轴上表示，肿瘤体积在Y轴。每个时间点表示每组中5只鼠的平均值。治疗方式为对照物PBS(○)，细菌衍生的野生型组氨酸内抑制素(点划线，□)，细菌衍生的EM1(△)，细菌衍生的EM2(实线，◆)。EM2和EM2都含有N-末端组氨酸标记。腹腔内注射开始于第一天(箭头)。

图21是柱状图，表示由于内抑制素的治疗增加的caspase 3活性。Y轴表示在405nm的吸收率，治疗方式(对照物，TNF-α(10ng/ml)，内抑制素(10μg/ml))在X轴表示。每种治疗方式的两个柱分别读取存在(空柱)或不存在(阴影柱)抑制剂DEVD-fmk的A₄₀₅。

图22是柱状图，表示在非内皮细胞中的caspase3活性。Y轴表示在405nm的吸收率，X轴分别表示对NIH3T3和H9c2(2-1)-成肌细胞的治疗方式(对照物，对照物+DEVD，内抑制素(10μg/ml)，内抑制素(10μg/ml)+DEVD，)。

图23是柱状图，表示用TUNEL检测法定量确定细胞程序死亡。治疗方式在X轴上表示，在X轴表示的有用内抑制素治疗的粘附细胞，用内抑制素治疗的悬浮细胞，和用TNF-α治疗的粘附细胞。细胞程序死亡的细胞百分比在X轴上表示。

图24A和24B分别为对C-PAE细胞裂解物的Bcl-2蛋白质含量的Western印迹分析图，及对总细胞裂解物的Bax表达水平的免疫印迹检测图。C-PAE细胞不用(-)或用内抑制素(10μg/ml)(+)治疗指定的时间段(0，12，24，28小时)。也表示了肌动蛋白探测。

图25A，25B，25C和25D是一组非内皮细胞裂解物的Bax蛋白质含量的两张Western印迹分析图(图25A和25B)和两张免疫印迹图(图25C和图25D)。细胞不用(-)或用内抑制素(10μg/ml)(+)治疗指定的时间段(0，12，24，28小时)。也表示了肌动蛋白探测。图25A：NIH3T3细胞裂解物；图25B：IMR-90细胞裂解物；图25C：C-PAE细胞裂解物；图25D：NIH3T3细胞裂解物。

图26A-B是表格，表示用来克隆和表达不同抗-血管生成蛋白质的构建，克隆位点，和载体。还列出了表达蛋白质的氨基酸序列。

本发明的详述

很多疾病是由于不需要的血管生成造成的。换句话说，在一些条件下，在某些时候，或在具体组织中如果可能终止毛细血管的生长和扩张，许多疾病和令人不舒服的病状可能会被抑制或减轻。几种抗血管生成蛋白质已经被发现了(如抗血管生成素，内抑制素)，但也报道了一些问题涉及(1)能够制备充足量的蛋白质使得彻底测试它们的性能，(2)由这些蛋白质产生的抗-血管生成性能的再生性。

本发明包括内抑制素的突变体，本文称为Ems。特别包括内抑制素的两个突变体，称为“EM1”和“EM2”。对这些突变体进行整体内抑制素测试。突变体表现非常不同的活性。不可预料地，一种突变体(“EM1”)表现出同整体内抑制素一样好或超过其的活性，另一种突变体(“EM2”)表现出损失的抗血管生成活性。在裸鼠模型中。通过系统服用EM1(20mg/kg体重)肾癌细胞的生长被抑制了。对肿瘤生长的抑制作用与从野生型内抑制素获得的抑制作用的可比的。在两者之间只有8个氨基酸残基差异的条件下，EM1和EM2之间的活性差异令人惊异。在治疗血管生成疾病中，EM1提供了一种优势，因为以重量为基础时增加小分子肽会更有效，并能更好地渗透组织。

在本发明中，描述了一种新型抗-血管生成蛋白质，EM1，一种内抑制素的突变体，以及其片段，衍生物，融合蛋白质和抗体。还描述了制备上述物质的方法。还公开了含EM1的治疗组合物，以及使用这些组合物的方法。还公开了编码EM1的多核苷酸，以及含有这些多核苷酸的载体和宿主细胞。还描述了含EM1作为生物活性组分的组合物，以及在哺乳动物组织内使用EM1抑制血管生成活性的方法，如治疗以血管生成为特点的疾病和病状。本发明还包括用来检测和治疗由血管生成引起的或与之相关的疾病和病状的组合物和方法。此外，本发明还包括使用EM1诱导细胞或组织内的细胞程序死亡，及EM1的抗体抑制细胞或组织内的细胞程序死亡。

特别地，EM1是内抑制素的缺失突变体，其中最后的9个氨基酸缺失。EM1可以胶原质ⅩⅦ类分子自然存在，但也可重组制备，如多核苷酸序列(图1，SEQ ID NO：1)编码EM1蛋白质(图2，SEQ ID NO：2)可扩增，如可使用下列表1中列出的正向和反向引物。本发明还包括哺乳动物的EM1，其片段，突变体，衍生物或融合蛋白质。

表1用来扩增抗-血管生成蛋白质的构建和引物序列

构建名	引物序列
构建名	引物序列	pET17bhis.mendo	5’-GGC ATA TGC ATA CTC ATC AGG ACTTT-3(上游)(SEQ ID NO：)
	5’-AAC TCG AGC TAT TTG GAG AAAGAG GT-3(下游)(SEQ ID NO：)	pET17bhis.mendo	5’-GGC ATA TGC ATA CTC ATC AGG ACTTT-3(上游)(SEQ ID NO：)
	5’-AAC TCG AGC TAT TTG GAG AAAGAG GT-3(下游)(SEQ ID NO：)	Pet28a/mendo	5’-GGC ATA TGC ATA CTC ATC AGG ACTTT-3(上游)
	5’-AAG CGG CCG CCT ATT TGG AGAAAG AGG T-3(下游)(SEQ ID NO：)	Pet28a/mendo	5’-GGC ATA TGC ATA CTC ATC AGG ACTTT-3(上游)
	5’-AAG CGG CCG CCT ATT TGG AGAAAG AGG T-3(下游)(SEQ ID NO：)	Pet28a/EM-1	5’-TTC CAT ATG CAT ACT CAT CAG GACTTT CAG CCA-3(上游)(SEQ ID NO：)
	5’-TTA GCG GCC GCC TAC TCA ATGCAC AGG ACG ATG TA-3(下游)(SEQ IDN0：)	Pet28a/EM-1
		Pet28a/EM-2	5’-TTC CAT ATG CAT ACT CAT CAG GACTTT CAG CCA-3’(上游)(SEQ ID NO：)
	5’-TTA GCG GCC GCC TAG TTG TGGCAG CTC GCA GCT TTC TG-3’(下游)(SEQ ID NO：)	Pet28a/EM-2
		pPICZαA/mendo	5’-GGG AAT TCC ATA CTC ATC AGG ACTTT-3’(上游)(SEQ ID NO：)

5’-AGG CGG CCG CCT ATT TGG AGAAAG AGG T-3’(下游)(SEQ ID NO：)
5’-AGG CGG CCG CCT ATT TGG AGAAAG AGG T-3’(下游)(SEQ ID NO：)	pPICZ αA/His.mendo	5’-AAG AAT TCC ATC ATC ATC ATC ATCACA GCA GC-3’(上游)(SEQ ID NO：)
5’-AAG CGG CCG CCT ATT TGG AGAAAG AGG T-3(下游)(SEQ ID NO：)	pPICZ αA/His.mendo
5’-AAG CGG CCG CCT ATT TGG AGAAAG AGG T-3(下游)(SEQ ID NO：)	pPICZ αA/Hendo	5’-TTT GAA TTC GCC CAC AGC CACCGC GAC TTC CAG CCG GTG CTC CA-3’(上游)(SEQ ID NO：)
5’AAA AGC GGC CGC CTA CTT GGAGGC AGT CAT GAA GCT GTT CTC AA-3’(下游)(SEQ ID NO：)	pPICZ αA/Hendo
	pPICZ αA/静息蛋白	5’-TTT TTT GAA TTC ATT TCA AGT GCCAAT TAT GAG AAG CCT GCT CTG CAT-3(上游)(SEQ ID NO：)
5’-AAG AAT GCG GCC GCT TAC TTCCTA GCG TCT GTC ATG AAA CTG TTTTCG AT-3’(下游)(SEQ ID NO：)	pPICZ αA/静息蛋白
	pPICZ α A/His.静息蛋白	5’-AAT TCC ATC ACC ATC ACC ATCACG-3’(上游)(SEQ ID NO：)
5’AAT TCG TGA TGG TGA TGG TGATGG-3’(下游)(SEQ ID NO：)	pPICZ α A/His.静息蛋白	5’-AAT TCC ATC ACC ATC ACC ATCACG-3’(上游)(SEQ ID NO：)

Ppet28a/M2	5’-TTT CAT ATG AIA TAC TCC TTT GATGGT CGA GAC ATA ATG ACA-3’(上游)(SEQ ID NO：)
Ppet28a/M2		5’-AAT GCG GCC GCT TAC TTC CTA GCGTCT GTC ATG AAA CTG TTT TCG AT-3’(下游)(SEQ ID NO：)
pPICZαA/M2	5’-AAG AAT TCC ATC ATC ATC ATC ATCACA GCA GC-3’(上游)(SEQ ID NO：)
pPICZαA/M2		5’-AAT GCG GCC GCT TAC TTC CTA GCGTCT GTC ATG AAA CTG TTT TCG AT-3’(下游)(SEQ ID NO：)

然后结果扩增产物能克隆到适当的载体中。“引物”表示与靶核苷酸序列互补的特异寡核苷酸序列，用来与靶核苷酸序列杂化并作为由DNA聚合酶，RNA聚合酶或反转录酶催化的核苷酸聚合反应的起始点。本文所使用的“EM1”意指内抑制素的缺失突变体，其中最后的9个氨基酸残基已缺失(即NSFMTSFSK)，术语包括(SEQ ID NO：)的氨基酸序列的片段，突变体，同系物，类似物，和等位基因变体，以及鼠静息蛋白(restin)，鼠静息蛋白氨基酸序列的片段，突变体，同系物，类似物和等位基因变体。尽管EM1最初的从鼠核酸克隆来的，但在标准检测法中，它比完整型内抑制素(即没有突变的内抑制素)表现的要好。因此，EM1包括任何与本文所描述的EM1基本上相同的哺乳动物序列，以及哺乳动物EM1氨基酸序列的哺乳动物EM1片段，突变体，同系物，类似物和等位基因变体。同样，本发明还具体地包括人类内抑制素，更具体地，人类EM1的缺失突变体等同物。

可以理解认为，本发明考虑包括任何具有内皮抑制活性(如组合物总体抑制血管生成的能力，如抑制含成纤维细胞生长因子，血管生成相关因子，或其他已知生长因子的培养基中的牛毛细管内皮细胞的生长和移动)的EM1的衍生物。本发明包括整体EM1蛋白质，EM1蛋白质的衍生物和EM1蛋白质的生物活性片段。这些包括具有EM1活性，含氨基酸取代基或含糖或其他附着在氨基酸官能团上的分子的蛋白质。本发明还包括编码EM1和EM1受体的基因，和由这些基因编码的蛋白质。

本发明还包括含分离的编码EM1的多核苷酸的组合物。以及含这种多核苷酸的载体和宿主细胞，及制备EM1和其片段，突变体，同系物，类似物和等位基因变体的方法。本文所使用的“载体”意指其中核苷酸片段能插入或克隆的载体，其有将片段核酸转移到宿主细胞中的载体功能。这样的载体还可完成转移的核酸片段的复制和/或表达。载体实例包括如从质粒，抗菌素，或哺乳动物，植物或昆虫病毒，或非病毒载体如配体核酸共轭物，脂质体，或脂质核酸复合物衍生的核酸分子。所需要的是，将转移的核酸分子与表达对照序列实施连接以形成能表达转移核酸的表达载体。核酸的这种转移通常称作“转化”，是指将外源多核苷酸插入到宿主细胞中，与用来插入的方法无关。如，包括直接吸收，转导或f-交配。外源多核苷酸可保持为非整合载体，如质粒，或者，可整合到宿主基因组中。“实施连接”是指一种状态，其中所描述的组分处于使得它们以意图的方式起作用的关系中，如控制序列与编码序列“实施连接”是以在编码序列的表达是在与控制序列相容的条件下，获得这样的方式的连接。“编码序列”是多核苷酸序列，当置于适当的调节序列的控制下时(如实施连接)，其转录成mRNA并翻译成多肽。编码序列的边界由5’-端的翻译起始密码子和3’-端的终止密码子确定。这种边界能自然产生，或能通过此领域中已知的方法引入到或加入到多核苷酸序列中。编码序列可包括，但不限于此，mRNA，cDNA，和重组多核苷酸序列。

选取克隆的多核苷酸克隆在其中的载体，可能是由于其在原核生物体中起作用，或者，它的选取是由于其在真核生物体中起作用，允许编码EM1蛋白质的多核苷酸克隆，和从多核苷酸获得的蛋白质表达的载体的两种实例，是Pet28(a)载体(美国威斯康星州Madison，Novagen)和修饰pPICαZA载体(美国加利弗尼亚州圣地亚哥InVitrogen)，其分别允许在细菌和酵母中表达蛋白质。

一旦多核苷酸已被克隆到适当的载体中，它可被转化成适当的宿主细胞。“宿主细胞”意指通过载体已经或能用作为转化核酸的受体的细胞。宿主细胞可以是原核生物或真核生物，哺乳动物，植物，或昆虫，能以单纯细胞存在，或以收集态存在，如作为培养基，或在组织培养基中，或在组织或生物体中存在。宿主细胞还可从多细胞生物体，如哺乳动物的正常或疾病组织中衍生得到。本文所使用的宿主细胞不仅包括用核酸转化的原始细胞，还包括仍然含有核酸的这种细胞的子代。

在一个具体实施中，分离的编码抗-血管生成蛋白质的多核苷酸还包括编码肽的多核苷酸接头。这样的接头对此领域中的技术人员是已知的，如接头可包括至少一种编码至少一种附加氨基酸的附加密码子。通常接头包括一个到约20或30个氨基酸。多核苷酸接头被翻译，如编码抗血管生成蛋白质的多核苷酸，致使在抗-血管生成蛋白质的氨基或羧基端带有至少一个其他氨基酸残基的抗-血管生成蛋白质的表达。一些附着在抗-血管生成蛋白质上的接头在图26中作了演示。重要的是，附加氨基酸，或氨基酸，没有损害抗-血管生成蛋白质的活性。

将选取的多核苷酸插入到载体中后，载体被转化成适当的原核株，在适合制备有生物活性的抗-血管生成蛋白质的条件下培养株(如维持在条件下)，从而制备有生物活性的抗-血管生成蛋白质，或其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质。在一个具体实施中，本发明包括将编码抗-血管生成蛋白质克隆到载体pET17b或pET28a中，然后转化到细菌中。然后细菌宿主株表达抗-血管生成蛋白质。通常，制备的抗-血管生成蛋白质量为每升培养液约10-20毫克，或更多。

在本发明的另一个具体实施中，真核载体包括修饰酵母载体。如本文所描述的，一种方法使用pPICza质粒，其中质粒含有多克隆位点。多克隆位点已将一His.Tag基元序列插入到多克隆位点中。再者，载体能修饰加上NdeI位点，或其他适当的限制性位点。这样的位点对此领域中的技术人员是熟知的。通过这个具体实施制备的抗-血管生成蛋白质包括一个含有一个，或多个组氨酸，通常为约5-20个组氨酸的组氨酸标记基元序列(His.tag)。令人惊异地，这个His.tag没有损害抗-血管生成活性。

在这个具体实施中，较好的酵母表达体系是Pichia pastores。并且，通常制备的生物活性蛋白质的浓度为每升培养基质(液体)约10-20毫克。

一种制备EM1的方法是，如扩增SEQ ID NO：1的多核苷酸，将它克隆到表达载体中，如pET28(a)，pPIZAaA，或一些其他表达载体中，将含SEQ ID NO：1的多核苷酸的载体转化到能表达由多核苷酸编码的多肽的宿主细胞中，在适于表达蛋白质的条件下培养转化的宿主细胞，然后从培养基中提取并提纯蛋白质。总体上讲是制备抗-血管生成蛋白质，具体讲是制备EM1的方法示例，在下列实例中提供，也在Vikas P.Sukhatme的1998年12月8日提交的U.S.S.N.XX/XXX，XXX，“制备抗-血管生成蛋白质的方法”中提供，其全文参考收入本篇。EM1蛋白质还可表达为转基因动物的产物如，表达为转基因牛，山羊，绵羊或猪的奶，或表达为转基因植物的产物，如与玉米中的淀粉分子相结合或化合的产物。

EM1还可通过传统的，已知的化学合成法制备。通过合成方法构建本发明的蛋白质的方法对此领域中的技术人员是已知的。合成构建的EM1蛋白质序列，由于享有初级，二级或三级结构和/或与如重组制备的EM1一致的特性，可拥有与之相同的生物属性，包括生物活性。这样，合成构建的EM1蛋白质，在筛查治疗化合物及发展抗体的免疫学方法中，可用来作为如重组制备的提纯EM1蛋白质的生物活性或免疫学上的取代物。

EM1蛋白质对于抑制血管生成是很有用的，如在下列实例中提供的标准测试中所确定的，并在下列实例中提供。EM1不抑制其他细胞种类如，IMR-90，或IC-21细胞生长。

如本文所使用的，“血管生成”意指在组织或器官中产生新血管，并包括内皮细胞扩增。在正常生理条件下，人类或动物仅在非常特异限制性的情况下进行血管生成。如，血管生成常常在伤口愈合，胎儿及胚胎发育，黄体，子宫内膜，及胎盘形成时可观察到。“内皮细胞”指衬于浆液膜腔，淋巴管，血管的薄层平坦的上皮细胞。因此，“抗-血管生成活性”是指组合物抑制血管生长的能力。血管生长是复杂的连续事件，包括局部破坏位于具体内皮细胞下的基低膜，扩增那些细胞，将细胞移动到未来血管的位置，重新组织细胞形成新的脉管膜，停止内皮细胞扩增，并且，掺入外膜细胞和其他细胞支持新血管壁。因此本文所使用的“抗-血管生成活性”包括中断任何或所有这些阶段，最终结果抑制新血管形成。

抗-血管生成活性可包括内皮细胞抑制活性，指组合物总体上抑制血管生成的能力，如在存在成纤维细胞生长因子，血管生成相关因子，或其他已知的生长因子的培养基中，抑制牛毛细管内皮细胞生长或移动的能力。“生长因子”是刺激细胞生长，再生，或合成活性的组合物。“血管生成相关因子”是抑制或促进血管生成的因子，如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，是一种血管生成促进剂。血管生成相关因子的另一种实例是血管生成抑制因子，如抗血管生成素(参阅如美国专利No.，5，801，012，美国专利No.5，837，682，美国专利No.733，876，美国专利No.5，776，704，美国专利No.5，639，725，美国专利No.5，792，845，WO96/35774，WO95/29242，WO96/41194，WO97/23500)或内抑制素(参阅如WO97/15666)。

“基本相同的生物活性”或“基本相同或较高的生物活性”是指组合物具有抗血管生成活性，并与EM1表现类似，如在标准测试中所确定的。“标准测试”包括，但不限于此，那些使用在分子生物领域中的测试抗-血管生成活性，细胞周期停滞，及细胞程序死亡的方法。这样的测试包括，但不限于此，内皮细胞扩增测试，内皮细胞移动测试，细胞周期分析测试，内皮细胞管形成测试，细胞程序死亡检测，如通过程序死亡细胞形态或Annexin V-FITC测试，绒毛尿囊膜(CAM)测试，及裸鼠肾癌症肿瘤生长的抑制检测。这样的测试在下面的实例中提供，并在1997年12月8日提交的U.S.S.N.60/067，888，1998年4月22日提交的U.S.S.N.60/082，663，1998年11月16日提交的U.S.S.N.60/108，536，及Vikas P.Sukhatme，1998年12月8日提交的U.S.S.N.XX/XXX，XXX，“抗-血管生成肽及其使用方法”，和Vikas P.Sukhatme，1998年12月8日提交的U.S.S.N.XX/XXX，XXX，“制备抗-血管生成蛋白质的制备方法”中提供，所有文献全文参考收入本篇。这样的方法还包括在Dhanabal等人(1998)(“内抑制素诱导内皮细胞的细胞程序死亡”J.生物化学，提交的)中，和Dhanabal等人(1999)(“人类内抑制素的克隆，表达及体内活性”，癌症研究，出版中)中。本文所描述的在一项检测中评估突变体的ED₅₀对应比较活性是一种有用的方法。

如本文所使用的，“ED₅₀”是与不存在组合物情况下所观察到的生物活性相比，将生物活性减少一半的组合物量的缩写。

本发明还描述了EM1的片段，突变体，同系物和类似物。EM1的“片段”是比EM1分子短的任何氨基酸序列，包括EM1多肽的至少25个连续氨基酸。这样的突变体可能包括或也可能不包括从克隆过程中衍生的附加氨基酸，如与全部或部分接头序列对应的氨基酸残基或氨基酸序列。包含在本发明中的这种突变体，有或没有这种附加氨基酸残基的，都必须具有与自然或全长模式的参比多肽基本相同的生物活性。

EM1的“突变体”是指与等同物参比EM1多肽的氨基酸序列相比，在氨基酸序列中包含任何变化的多肽。这种变化可以自然产生，或通过人为，化学能(如X-射线)处理产生，或通过其他形式化学引发突变产生，或通过遗传工程，或通过交配或其他形式的遗传信息交换产生。突变包括如碱基改变，缺失，掺入，倒位，转位，或重复。EM1的突变体形式与等同物参比EM1多核苷酸相比，可能表现出增加或减小的抗-血管生成活性，这样的突变体可能包含也可能不包含克隆过程衍生的附加氨基酸，如与全部或部分接头序列对应的氨基酸残基或氨基酸序列。

EM1的“类似物”是指基本上与整体EM1分子或其片段或等位基因变体相同的非自然分子，具有基本上相同的或超出的生物活性。这样的类似物包括生物活性EM1的衍生物(如化学衍生物，如上所述)，以及其片段，突变体，同系物，和等位基因变体，其衍生物表现出与未修饰的EM1多肽，片段，突变体，同系物，或等位基因变体性质上相似的拮抗效果。

EM1的“等位基因”是指与参比EM1多肽的多肽序列相比，含自然产生序列变异的多肽序列。编码EM1多肽的多核苷酸的“等位基因”是指与编码参比EM1多肽的参比多核苷酸序列相比，含序列变异的多核苷酸，其中编码EM1多肽的多核苷酸的等位基因编码了EM1多肽的等位基因形式。

假定多肽是EM1的片段，突变体，类似物或等位基因变体，或它可能是两种或多种这些物质，如多肽可能即是EM1多肽的类似物也是其突变体，这些都是可能的。如EM1分子的缩短模式(如EM1的片段)可在实验室制备。如果片段通过此领域中已知的方法引发突变，那么制备的分子就即是EM1的片段，也是EM1的突变体。在另一个实例中，制备EM1的突变体，后来发现其作为一些哺乳动物个体的EM1的等位基因存在。因此，这样的突变体EM1分子会即是EM1的突变体又是EM1的等位基因变体。片段，突变体，等位基因变体，及类似物的组合包括在本发明的范围内。

包括在本发明中的是含与EM1基本上相同的氨基酸序列的蛋白质，或含与编码EM1的多核苷酸基本上相同的核酸序列的多核苷酸。“基本上相同的序列”意指核酸或多肽表现出至少约70％的序列与参比序列一致，如另一种核酸或多肽，通常至少约80％的序列与参比序列一致，较好的至少约90％的序列与参比序列一致，更好的至少约95％一致，最好的至少约97％序列与参比序列一致。序列的比较长度一般至少75个核苷酸碱基或25个氨基酸，更好所是至少150个核苷酸碱基或50个氨基酸，最好的是243-264个核苷酸碱基或81-88个氨基酸。本文所使用的“多肽”指氨基酸分子链，不是指产物的具体长度。这样，肽，寡肽和蛋白质包含在多肽的定义内。这项术语还包括已进行表达后修饰，如糖基化，乙酰基化，磷酸化等的多肽。一般，EM1含有低于70％的氨基酸序列与内抑制素一致。

本文所使用的“序列一致性”指两种聚合分子之间的亚基序列相似性，如在两种多核苷酸或两种多肽之间。当在两种分子的亚基位置上被相同的单体亚基占据时，如，如果在两种肽中每种肽的一个位置上，被丝氨酸占据，那么它们在那个位置上是一致的。两种序列间的一致性与匹配的或一致的位置数量呈正比，如，如果在两种肽或化合物序列中一半位置(如10个亚基长度的聚合物中的5个位置)是一致的，那么两种序列50％是一致的；如果90％的位置，如10个中9个是匹配的，两种序列享有90％序列一致性。作为实例，氨基酸序列VRGLQP和HAFLQP 6个位置中有3个一致，因此有50％的序列一致性，而序列VRGLQP和AFLQP 5个位置中有3个一致，因此有60％的序列一致性。两种序列之间的一致性与匹配的或一致的位置数量呈正比。这样，如果在具体肽中参比序列部分缺失，那么要计算序列一致性时，缺失的部分不作计算，如VRGLQP和VRGLP 6个位置有5个一致，因此有83.3％的序列一致性。

一致性常常用序列分析软件计算，如BLASTN或BLASTP(可从http：//www.ncbi，nlm.nih.gov/BLAST/获得)。使用BLASTN(适用于核苷酸序列)对比两种序列(如将两种序列彼此“Blast”，http：//www.ncbi.nlm.nih，gov/gorf.bl2.html)的缺省参数赋值为，匹配=1，错配补偿=-2，open gap=5，extensiongap=2。当使用适用于蛋白质序列的BLASTP时，缺省参数赋值为，匹配=0，错配补偿=0，open gap=11，extension gap=1。

当两种序列享有“序列同源性”时，意指两种序列彼此仅保守置换不同。对于多肽序列，这种保守置换包括在序列中的给定位置用一个氨基酸置换另一个同种类别氨基酸(如，共同具有疏水性，电荷，pK或其他构象或化学属性的氨基酸，如用缬氨酸置换亮氨酸，用精氨酸置换赖氨酸)，或位于序列的某些位置上的一中或多种非保守氨基酸置换，缺失，或插入，但没有将多肽的构象或折叠改变到多肽的生物活性被毁坏的程度。“保守置换”的实例包括用一个非极性(疏水性的)残基如异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或蛋氨酸置换另一个；用一个极性(亲水性的)残基置换另一个，如精氨酸和赖氨酸之间，谷氨酰胺和天冬酰胺之间，甘氨酸和丝氨酸之间；用一个碱性残基如赖氨酸，精氨酸或组氨酸置换另一个；或用一个酸性残基如天冬氨酸或谷氨酸置换另一个；或使用化学衍生残基置换非衍生残基；只要多肽表现出所必需的生物活性。共享序列同源性的两个序列可称为“序列同系物”。

对于多肽，同源性一般使用序列分析软件测得(如威斯康星州生物技术中心大学的遗传计算机组的序列分析软件包，大学路1710，麦迪逊，WI53705)。蛋白质分析软件通过对不同置换，缺失，及其他修饰赋值同源性程度匹配类似的序列。保守置换一般包括下列组中的置换：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯基丙氨酸，酪氨酸。

本发明还包括EM1的化学衍生物。“化学衍生物”是指含一个或多个反应官能侧基团化学衍生的残基的多肽。这样的衍生残基包括如，其中游离氨基基团已被衍生形成氢氯化胺，p-甲苯磺酰基基团，苄氧羰基基团，叔-丁基氧羰基基团，氯乙酰基基团或甲酸基基团。游离羧基基团可被衍生形式盐，甲基和乙基酯或其他类型的酯或酰肼。游离羟基基团被衍生形成O-酰基或O-烃基衍生物。组氨酸的咪唑氮可被衍生形成N-imbenzyl组氨酸。作为化学衍生物还包括含一个或多个二十种标准氨基酸的自然产生的氨基酸衍生物的肽。如：4-羟基脯氨酸可被脯氨酸置换；5-羟基赖氨酸可被赖氨酸置换；3-甲基组氨酸可被组氨酸置换；高丝氨酸可被丝氨酸置换；尿氨酸可被赖氨酸置换。

编码EM1的多核苷酸可在分离的DNA或cDNA文库外克隆。核酸或多肽，本文称作的“分离的”是指核酸或多肽基本上不含(即从中分离的)它们从其中获得的生物源的物质(如存在于核酸混合物中或细胞中)，其可能已经进行了进一步的加工。“分离的”核酸或多肽包括使用本文所描述的方法，相似的方法，或其他适当的方法获得的核酸或多肽，包括基本上纯的核酸或多肽，通过化学合成制备的，通过化学或生物技术组合方法制备的核酸或多肽，及重组制备分离的核酸或多肽。因此，分离的多肽意指一种相对不含其他蛋白质，碳氢化物，脂质，以及其他与其通常相关的细胞组成的多肽。分离的核酸不会与其在生物体自然产生的基因组中立即邻接的核酸，以及核酸是从其中衍生的核酸立即邻接(即共价结合)。因此，这项术语包括如，掺入到载体中的核酸(如自主病毒或质粒)，或以与其他核酸如通过化学方法或限制内切核酸酶处理制备的核酸片段无关的独立分子存在的核酸。

本发明的多核苷酸和蛋白质还可用来设计成探针来分离的其他抗-血管生成蛋白质。较好的方法在Jacobs等人的美国专利No.5，837，490中提供，其全文参考收入本篇。设计寡核苷酸探针应较好地符合这些参数：(a)它应设计在含最少量多义碱基(“N’s”)的序列区域，如果有也很少，(b)它应设计成T_m为约80℃(对A或T假设2℃，对G或C为假设4度)。

寡核苷酸应较好地使用标记寡核苷酸通常采用的技术，用g-³²p ATP(特异活性6000Ci/毫摩尔)和T4多核苷酸激酶标记。其他标记技术也可使用。非掺入的标记应较好地通过凝胶过滤层析法或其他确定的技术除去。掺入到探针中的放射性活度的量应由闪烁计数仪测量定量。较好地，产物探针的特异活性应为约4×10⁶dpm/pmole。较好地，含全长克隆体库的细菌培养基应解冻，使用100μl的原种接种含25ml无菌L-肉汤(含氨卡青霉素100μg/ml)的无菌培养烧瓶。培养基应较好地在37℃饱和状态生长。饱和培养物应较好地用新鲜的L-肉汤稀释。这些稀释液的等分份应较好地平置以确定稀释度和体积，当在37℃在含1.5％琼脂的150mm培养皿中生长过夜后，在含L-肉汤(含100μg/ml氨卡青霉素)的固态细菌介质上将产出约5000个明显的分离良好的集落。其他获得明显的分离良好的集落的方法也可使用。

然后，应使用标准集落杂交方法将集落转移到硝化纤维滤膜中并溶解，变性，烘烤它们。高度严格条件是至少与，如在65℃1×SSC，或在42℃1×SSC及50％甲酰胺一样严格条件。中度严格条件是至少与，在65℃4×SSC，或在42℃4×SSC及50％甲酰胺一样的严格条件。比严格条件是至少与，在50℃4×SSC，或在40℃6×SSC及50％甲酰胺一样的严格条件。

然后，较好地将滤膜在65℃伴随轻柔搅拌在6×SSC中温育1小时，SSC(20×原种为175.3 gNaCl/l，88.2g柠檬酸钠/l，用氢氧化钠调节至PH7.0)含0.5％SDS，100μg/ml酵母RNA，10mMEDTA(每150mm滤膜约10mL)。较好地，然后将探针加入到浓度大于或等于1×10⁶dpm/ml杂交混合物中。较好地将滤膜在65℃轻柔搅拌温育过夜。较好地在室温无搅拌情况下用500ml2×SSC/0.5％SDS冲洗滤膜，接着在室温用500ml 2×SSC/0.1％SDS轻柔晃动15分钟。在65℃用0.1×SSC/0.5％SDS第三次冲洗是随意的。然后较好地将滤膜干燥，并进行放射自显影充分长的时间以在X-射线胶片上显现正象。其他已知的杂交方法也可使用。然后挑选正集落，在培养基中生长，使用标准方法分离的质粒DNA。然后可通过限制酶切分析，杂交分析，或DNA测序检验克隆体。

本发明还包括含EM1，及其片段，突变体，同源物，类似物和等位基因变体的融合蛋白质和嵌合蛋白质。融合或嵌合蛋白质可包括单一蛋白质的多聚体，如EM1的重复或apomigren的重复，或者融合及嵌合蛋白质可由几种蛋白质组成，如EM1和apomigren。融合蛋白质可包括两种或多种已知的抗-血管生成蛋白质的组合(如，抗血管生成素，内抑制素，静息蛋白，或抗血管生成素和它们的生物活性片段)，或抗-血管生成蛋白质与导向试剂的组合[如内抑制素和上皮生长因子(EGF)或RGD肽]，或抗血管生成蛋白质与免疫球蛋白的组合(如，内抑制素和IgG，特别将Fc部分除去)。在本文中的“静息蛋白”，是一种含约170个氨基酸到约200个氨基酸的蛋白质，与人类XV类胶原质的α1链的NC10域的约200个C-末端氨基酸相对应。如本文描述的“apomigren”，是静息蛋白的片段，含最后的80到90个连续氨基酸，与人类XV类胶原质的α1链的NC10域的C-末端相对应。融合和嵌合蛋白质还可包括EM1，其片段，突变体，同源物，类似物和等位基因变体，和其他抗-血管生成蛋白质，如内抑制素，抗血管生成素。本文所使用的“融合蛋白质”还可包括其他组成，如用来传递化疗试剂，其中编码化疗试剂的多核苷酸与编码抗-血管生成蛋白质的多核苷酸连接。融合蛋白质还可包括抗-血管生成蛋白质的多聚体，如内抑制素的二聚物或三聚物。这样的融合蛋白质可通过翻译后修饰连接(如化学连接)，或整体融合蛋白质可重组制备。

包括在本发明中的还有含EM1，以及其片段，突变体，同源物，类似物和等位基因变体作为生物组分，抑制或促进哺乳动物组织内血管生成的组合物，及使用这种组合物来诊断，预后，及治疗特点在于或与血管生成活性或血管生成活性缺少有关的疾病或病状。这种方法可包括口服，局部，注射，移植，持续释放用药，或其他给药方式。

本发明包括使用EM1和其片段，突变体，同源物，类似物，等位基因变体，以及融合和嵌合蛋白质作为组合物中的生物活性试剂，来治疗与血管生成活性有关的疾病或病状。治疗这种疾病的方法包括用含EM1，其片段，突变体，同源物，类似物，或等位基因变体的组合物接触疾病侵袭组织。

本发明包括使用治疗上有效量的EM1，或其生物活性片段，或具有抗-血管生成活性的EM1片段组合，或EM1刺激物和拮抗剂治疗由血管生成调节的疾病的方法。血管生成-调节的疾病包括，但不限于此，癌症，固体肿瘤，血液生肿瘤(如白血病)，肿瘤转移，良性肿瘤(如，血管瘤，听觉神经瘤，纤维神经瘤，砂眼，化浓性肉芽瘤)，风湿性关节炎，牛皮癣，视觉血管生成疾病(糖尿病视网膜病，早发视网膜病，斑点恶化，角膜移植排斥，新脉管青光眼，晶状体后纤维增生，虹膜发红)，Osler-Webber症，心肌血管生成，空斑新血管生成，毛细血管扩张，血友病关节，血管纤维瘤，伤口粒化。EM1对治疗内皮细胞超常或不正常兴奋的疾病也是有用的。这些疾病包括，但不限于此，肠粘连，Orohn’s症，动脉硬化，硬皮病，疤痕肥大(即瘢痕瘤)。EM1还可通过阻止胎儿种植所需的血管生成而用作避孕试剂。EM1可用于治疗作为病理结果而生成血管的疾病如猫抓痕症(Rochele minalia quintosa)和溃疡(Heliobacterpylori)。EM1和apomigren还可用来防止透析性移植脉管管路狭窄，和肥胖，如通过抑制在脂肪组织的毛细管形成从而防止其扩张。EM1还可用来治疗定位(非转移性的)疾病。“癌症”意指瘤生长，增生或增殖生长或不正常细胞发育的病理状态，包括固体肿瘤，非固体肿瘤，及任何不正常的细胞增殖，如在白血病中所观察到的。如本文所使用的，“癌症”还指血管生成有关的癌症和肿瘤，即肿瘤为了其生长(体积和/或质量的扩张)，需要增加提供其血液的血管的数量和密度。“衰退”是指肿瘤质量和尺寸的减小。如本文所使用的，“治疗上有效量”意指组合物或方法中的每种活性组分的总量足以显示出有意义的患者受益，即治疗，治愈，防止或改善有关治疗状况，或增加治疗，治愈，防止或改善这种病状的比率。当使用组合时，这项术语是指活性组分的组合量产生治疗效果，不论是组合，连续用药还是同时用药。

或者，其中增加血管生成是所需的，如在伤口愈合中，或梗塞后心脏组织中，EM1蛋白质的抗体或抗血清可用来阻断局部的自身的抗-血管生成和过程，从而增加新血管的形成以抑制组织的萎缩。

为治疗疾病，EM1可与其他组合物和方法结合使用。如传统上治疗治疗可采用外科手术，放疗，化疗，或免疫治疗，结合使用EM1，则EM1可随后给患者服用以扩大微小转移的休眠，稳定并抑制任何残留原发性肿瘤的生长。EM1，EM1片段，EM1抗血清，EM1受体刺激剂，EM1受体拮抗试剂，或它们的组合，也可与其他抗-血管生成化合物，或蛋白质，片段，抗血清，其他抗-血管生成蛋白质(如抗血管生成素，内抑制素，静息蛋白，apomigren)的受体刺激剂，受体拮抗试剂结合。此外，EM1，EM1片段，EM1抗血清，EM1受体刺激剂，EM1受体拮抗试剂，或它们的组合，可与药用可接受的赋形剂，及任意的持续释放基质，如生化能分解的聚合物，形成治疗组合物。本发明的组合物还可含有其他抗-血管生成蛋白质或嵌合化合物，如内抑制素，抗血管生成素，静息蛋白，apomigren(两个都在Vikas P.Sukhatme 1998年12月8日提交的U.S.S.N，XX/XXX，XXX，“静息蛋白及其使用方法”中所描述的，其全文参考收入本篇)，及它们的突变体，片段，和类似物。组合物可进一步含有其他试剂，或加强蛋白质活性或赠呈试剂活性或使用在治疗中，如化疗或放疗试剂。这种额外的因子和/或试剂可包括在组合物中以和本发明的蛋白质制备配合功效，或减小副作用。此外，本发明组合物的用药可与其他治疗方式同时进行，如与化疗或放疗法联合用药。

本发明包括通过使用含本发明的蛋白质的组合物与组织接触抑制哺乳动物组织中血管生成的方法。“接触”不仅意指局部使用，还指其他将组合物传递到组织中或组织细胞中的方式。

使用定时释放或持续释放给药系统也包括在本发明中。这种系统在外科手术很难进行或不可能进行的情况下是非常必要的，如患者年老，或疾病进程本身，或风险-受益分析显示控制好于治愈的情况。

如本文所使用的，持续释放基质是由可被酶分解的或酸/碱水解的或溶解的物质制成的，通常是聚合物。一旦插入到体内，基质被酶和体液作用。所需的持续释放基质是从生物相容物质中选取的，如；脂质体，聚交酯(聚合乳酸)，聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)，聚交酯共聚乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)，聚酐，聚(原酸)酯，聚合蛋白，透明质酸，胶原质，软骨素硫酸盐，羧酸，脂肪酸，磷脂，多糖，核酸，聚合氨基酸，氨基酸如苯基丙氨酸，酪氨酸，异亮氨酸，多核苷酸，聚乙烯基丙烯，聚乙烯基吡咯烷酮，及硅树脂。较好的生物可分解基质是聚交酯，聚乙交酯，或聚交酯共聚乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)中的一种。

本发明的调节血管生成组合物可以是固态，液态或浮质的，可通过任何已知的用药途径用药。固态组合物的实例包括丸剂，霜剂和可植入药剂单元。丸剂可口服，治疗霜剂可局部用药。可植入药剂单元可定位用药如在肿瘤位置上，或为了系统释放调节血管生成的组合物，可植入药剂如在皮下。液态组合物的实例包括适合皮下，静脉内，动脉内注射的配方，及适合局部和眼内用药的配方。浮质配方的实例包括适合肺脏用药的吸剂配方。

使用此领域中普通技术人员已知的配制方法，在药用可接受的配方中，上面所描述的EM1蛋白质和有抗血管生成活性的蛋白质片段能以分离的及基本上纯的蛋白质和蛋白质片段提供。这些配方能提通过标准途径用药。通常，组合可通过局部，经皮，腹腔内，颅骨内，脑室内，脑内，阴道内，子宫内，口服，直肠，注射(如静脉内，脊椎内，皮下，或肌肉)途径用药。此外，EM1可掺入到生物可分解的聚合物中使得化合物持续释放，将聚合物植入需要给药部位的邻近，如肿瘤部位或植入到EM1缓慢系统释放的部位。也可使用渗透微型泵通过套管对有关部位提供高浓度EM1控制给药，如直接进入转移性生长部位或进入脉管提供给肿瘤。生物可分解聚合物及它们的应用在，如Brem等人(1991)(J.神经外科.74：441-446)中作了详细描述，其全文参考收入本篇。

本发明的含多肽的组合物可用静脉内用药，如通过注射单位剂量。“单位剂量”当关系到本发明的治疗组合物时，是指物理上不连续的单元，适合用作受试者的单一用量，每个单元含与所需稀释剂(载体或赋形剂)一起计算产生所需疗效的预定量的活性物质。

本发明组合物的用药模式包括静脉内，肌肉，腹腔内，胸骨内，皮下，关节腔内注射和灌注。注射用药用组合物包括药用可接受的无菌水性或非水性溶液，分散体，悬浮体，或乳液，以及在使用前重组在无菌可注射溶液或分散体中的无菌粉末。适合的水性及非水性载体，稀释剂，溶剂或赋形剂包括水，乙醇，多元醇(如丙三醇，丙烯丙二醇，聚乙烯乙二醇等等)，羧基甲基纤维素，和它们适当的混合物，植物油(如棕榈油)和可注射的有机酯如乙基油酸酯。如可通过使用涂覆物质如卵磷脂，通过保持分散体中所需的颗粒大小，及通过使用表面活性剂可维持适当的流动性。这些组合物也可含辅剂如防腐剂，润湿剂，乳化剂和分散剂。可加入各种抗细菌和抗真菌试剂如对羟基苯甲酸酯类，氯丁醇，苯酚山梨酸等以确保预防微生物作用。还可按需要加入等张试剂如糖，氯化钠等。可通过加入试剂如一硬脂酸铝和白明胶，它们可延迟吸收作用，来延长可注射药用形式的吸收时间。可注射缓释形式是通过在生物可分解聚合物如聚交酯-聚乙交酯，聚(原酸酯)和聚(酐)中形成药物微型胶囊基质而制备。根据聚合物与药物的比率和使用具体聚合物的性质，可控制药物释放率。缓释可注射配方还可通过将药物捕集在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中而制备。可注射配方可通过保留细菌的滤膜过滤杀菌，或通过掺入杀菌试剂杀菌，固体杀菌组合物在使用前将其溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。

本发明治疗组合物可在其中包括药用可接受的盐组分，如可从有机或无机酸获得的盐。“药用可接受的盐”是指在合理的医学判定范围内，适合用来与人类和低等动物的组织接触并没有不适当的毒性，刺激，过敏反应等的，并与合理的受益/风险比率相匹配的那些盐。药用可接受的盐在此领域中是众所周知的。如S.M.Berge等人在J.药科学(1997)66：1 et seq.中详细描述了药用可接受的盐，其参考收入本篇。药用可接受的盐包括与无机酸如盐酸或磷酸，或有机酸如醋酸，酒石酸，扁桃酸等形成的酸加成盐(与多肽的游离氨基基团形成的)。与游离羧基基团形成的盐也可从无机碱如氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化铵，氢氧化钙或氢氧化铁，及有机碱如异丙基胺，三甲基胺，2-乙基胺乙醇，组氨酸，普鲁卡因等获得。盐也可在本发明的化合物最后分离的和提纯期间原位制备，或独立地通过用适当的有机酸与游离碱官能反应制备。典型的酸加成盐包括，但不限于此，醋酸盐，己二酸盐，海藻酸盐，柠檬酸盐，天冬氨酸盐，安息香酸盐，苯磺酸盐，硫酸氢盐，丁酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，双葡萄糖酸盐，甘油磷酸盐，半硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，延胡索酸盐，氢氯化物，氢溴化物，氢碘化物，2-羟基甲烷磺酸盐(羟乙磺酸盐)，乳酸盐，马来酸盐，甲烷磺酸盐，烟酸盐，2-萘磺酸盐，草酸盐，双羟萘酸盐，果胶脂酸盐，过硫酸盐，3-苯基丙酸盐，苦味酸盐，特戊酸盐，丙酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，硫氰酸盐，磷酸盐，谷氨酸盐，重碳酸盐，p-甲苯磺酸盐，十一酸盐。并且，碱性含氮基团可被一些试剂季铵化如小分子烷基卤代物如甲基，乙基，丙基和丁基的氯代物，溴代物和碘代物；硫酸二烷基酯如硫酸二甲酯，二乙基酯，二丁基酯和二戊基酯；长链卤代物如癸基，十二烷基，十四烷基，十八烷基氯代物，溴代物，碘代物；芳烷基卤代物如苄基和苯乙基溴代物及其他。从而获得水或油溶或可分散产物。可用来制成药用可接受的酸加成盐的酸的实例包括，无机酸如盐酸，硫酸和磷酸，有机酸如草酸，马来酸，琥珀酸，柠檬酸。

如本文所使用的，“药用可接受的”，“生理上可忍受的”及它们合乎文法的变通，如它们所指的组合物，载体，稀释剂和试剂，是可互换使用的，表示物质可给哺乳动物服用，有最小量的不利生理反应如恶心，眩晕，胃部不适等。制备含活性组分溶解或分散其中的药用组合物在此领域中是众所周知的，不必限制在配方上。通常这种组合物制备成可注射液体溶液或悬浮体，然而，在使用前可溶解或悬浮在液体中的固体形式也可制备。也可制备乳化溶液。

可将药用可接受的并与活性组分相容的适合使用在本文所描述的治疗方法中的量的赋形剂与活性组分混合。适当的赋形剂包括如，水，盐水，葡萄糖，丙三醇，乙醇等及它们的组合。此外，如果需要，组合物可含有少量辅助物质如润湿剂或乳化剂，PH缓冲试剂等加强活性组分效力的辅剂。

本发明的EM1多肽还可包括在含前体药物的组合物中。如本文所使用的，“前体药物”是指在体内很快地转化产生母体化合物的化合物，如在血液中通过酶解或水解。充分的讨论在T.Higuchi和V.Stella。的前体药物作为新型给药系统ACS讨论会系列的14卷中以及在Edward B.Roche.，的药物设计中的生物可逆载体美国药协会和Permagon出版社，1987中提供，两篇文献参考收入本篇。如本文所使用的，“药用可接受的前体药物”指(1)在合理的医学判定范围内，适合用来与人类和动物的组织接触并没有不适当的毒性，刺激，过敏反应等的，并与合理的受益/风险比率相匹配的，对它们要作的应用有效的本发明化合物的前体药物。(2)母体化合物的两性离子形式，在可能的场合。

本发明EM1的剂量取决于要治疗的疾病状况和病状，以及其他临床因素如体重和人类或动物状态和化合物服用途径。治疗人类或动物，可服用约每公斤体重约10mg到每公斤体重约20mg的EM1蛋白质或apomigren蛋白质。在组合治疗中，如，本发明的EM1蛋白质和apomigren蛋白质与放疗，化疗或免疫治疗结合时，可减小剂量，如每公斤体重约0.1mg到每公斤体重约0.2mg。根据EM1在具体动物或人体内的半衰期，EM1可每天服用几次到一周服用一次。可以理解认为本发明对人类和牲畜都适用。本发明的方法预期考虑了单次服用和多次服用，假定在同时或在经过延长的一段时间服用。此外，EM1可结合其他形式的治疗服用，如化疗，放疗，或免疫治疗。

EM1配方包括适于口服，直肠，眼(包括晶状体内，intracameral)，鼻，局部(包括口腔，舌下)，子宫内，阴道或注射(包括皮下，腹腔内，肌肉，静脉内，经皮，颅骨内，气管内，硬脑膜外)用药的配方。EM1配方可方便地置于单位剂量形式中，可通过传统制药技术制备。这样的技术包括产生活性组分和药用载体或附形剂结合物的步骤。通常，制备配方是通过均一完全地产生活性组分与液体载体或均分固体载体或两者都有的结合物，如果需要，然后定形产品。

适于注射用药的配方包括水性或及非水性无菌注射溶液，其中含抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂及给配方提供与预接受体的血液等张的溶质；水性及非水性无菌悬浮液，其中包括悬浮试剂和增稠试剂。配方可置于单位剂量的药剂中或置于多剂量的容器中，如密封的一次用量针剂和小瓶，也可储存在冷冻-干燥(冻干)状态，仅需要在使用前加入无菌液态载体，如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可从前面描述的无菌粉末，颗粒和片剂种类制备。

当口服治疗上有效量的本发明的蛋白质时，本发明的EM1蛋白质可以是片剂，胶囊，粉末，溶液或西也剂的形式。当以片剂形式服用时，本发明药用组合物可以另外包含固体载体如白明胶或辅剂。片剂，胶囊，和粉末含约5％到约95％的本发明的蛋白质，较好地含约25％到90％的本发明的蛋白质。当以液态形式服用时，可加入液态载体如水，石油，动物或植物源的油如花生油，矿物油，大豆油，或芝麻油或合成油。液态药用组合物可进一步包括生理盐水溶液，葡萄糖或其他糖类溶液，或乙二醇如1，2-亚乙基二醇，丙二醇，或聚乙二醇。当以液态形式服用时，药用组合物含约0.5％到90％重量比的本发明的蛋白质，较好地含约1％到50％的本发明的蛋白质。

当静脉内，皮肤或皮下注射服用治疗上有效量的本发明的蛋白质时，本发明的蛋白质的形式是不含热原质，注射可接受的水性溶液。制备具有适当的PH，等张性，稳定性等的这种注射接受的蛋白质溶液在此领域的技术范围内。适用于静脉内，皮肤，或皮下注射的较好的药用组合物中除了本发明的蛋白质外，还应含有等张赋形剂如氯化钠注射液，Ringer注射液，葡萄糖注射液，葡萄糖和氯化钠注射液，乳酸盐Ringer注射液，或其他此领域已知的赋形剂。本发明的药用组合物还可含有稳定剂，防腐剂，缓冲液，抗氧化剂，或其他此领域中的技术人员已知的添加剂。

在本发明的药用组合物中的本发明的蛋白质的量取决于要治疗病状的性质和严重性，及患者已进行的前期治疗的性质。根本上，由参与的医生来决定用本发明的蛋白质治疗每个具体患者的量，开始，参与医生给患者服用少剂量的本发明的蛋白质并观察患者的反应。加大服用本发明的蛋白质的量直到对患者获得最优的治疗效果，到这一点后剂量不再增加。

使用本发明的药用组合物静脉内治疗的持续时间是变化的，取决于要治疗的疾病的严重性和每个具体患者的病状和潜在特殊反应。可考虑认为本发明的蛋白质的每种应用的持续时间在连续静脉内用药的12到24小时范围内。最终，参与医生决定使用本发明的药用组合物静脉内治疗的适当的持续时间。

较好的单位药剂配方含有服用组分的日剂量或单位，日亚-剂量，或其适当的部分剂量。应理解认为，除了具体上面提及的组分，本发明的配方还可包括其他此领域中有关这类配方的传统试剂。任意地，可掺入胞毒试剂或与EM1蛋白质，或其生物官能片段结合，给患者提供双重治疗。

目前，治疗组合物对牲畜应用也是很有价值的。除了人类外，家养动物和纯种马也是使用本发明的蛋白质进行这种治疗的理想患者。

胞毒试剂如蓖麻毒素与EM1，及高亲和力EM1蛋白质片段结合，从而提供一种破坏EM1结合细胞的工具。这些细胞可在许多位置发现包括，但不限于此，微小转移和原发性肿瘤。与胞毒试剂结合的蛋白质以设计给所需位置最大给药的方式灌注。如通过套管将蓖麻毒素结合高亲和力EM1片段传递到脉管中，提供给靶部位或直接给药到靶部位。这样的试剂还以可控方式通过与灌注套管连接的受体泵传递。EM1拮抗剂的组合可与血管生成的刺激剂共同使用以增加组织的脉管形成。这种治疗用药法对破坏转移性癌症提供了有效的方法。

其他治疗方法包括服用与胞毒试剂结合的EM1，EM1片段，EM1类似物，EM1抗血清，或EM1受体刺激剂和拮抗剂。可以理解认为，EM1可来源于人类或动物。EM1也可通过化学反应合成制备，或通过结合表达系统的重组技术制备。EM1也可通过酶裂解分离的血纤维蛋白溶酶原或血纤维蛋白溶酶产生有抗血管生成活性的蛋白质而制备。EM1还可通过模拟内源酶作用将血纤维蛋白溶酶原裂解成EM1的化合物制备。EM1的产量也可通过影响血纤维蛋白溶酶原裂解酶活性的化合物来调节。

本发明还包括基因治疗，其中将编码EM1，或其突变体，片段，或融合蛋白质的多核苷酸引入或调节到患者体内。多种向细胞转移或传递DNA表达基因产品蛋白质的方法，或者称为基因治疗法，在N.Yang(1992)体内基因转移到哺乳动物体细胞中。Crit.Rev.生物技术。12(4)：335-356中作了公开，其参考收入本篇。基因治疗包括将DNA序列掺入到体细胞或生殖系细胞中，使用在来自体内或体内治疗中。基因治疗是替换基因，增大正常或不正常基因的功能，并对抗感染的疾病或其他病理状况。

用基因治疗法治疗这些医学问题的方案包括：，确定缺损基因，然后加入功能基因替换缺损基因的功能或增加微弱功能基因；或预防方案，如加入产物蛋白质基因治疗病状，或使得组织或器官对治疗更敏感。预防方案的一个实例是，将基因如EM1置于患者体内预防血管生成的发生，或插入使肿瘤细胞对辐射更敏感的基因，然后辐射肿瘤会产生增强杀死肿瘤细胞效果。

在本发明中预想了许多转移EM1 DNA或EM1调节序列的方案。转染启动子序列，即是通常发现与EM1特异相关的序列，或其他增加EM1蛋白质产量的序列也预想作为基因治疗的方法。这项技术的实例在麻萨诸塞州，Cambridge的Transkaryotic治疗有限公司中可找到，使用同源重组插入开启细胞中促红细胞生成素基因的“遗传开关”。参阅1994年4月15日的基因工程新闻。这种“遗传开关”可用来激活细胞中通常不表达EM1(EM1受体)的EM1(或EM1受体)。

基因治疗的基因转移法分成三个主要的种类：物理法(如电泳，直接基因转移和粒子轰击)，化学法(脂质基载体，或其他非滤过性病毒载体)和生物法(如病毒-衍生载体和受体吸收)。如可使用的非滤过性病毒载体包括涂覆DNA的脂质体。这种脂质体/DNA复合物可直接静脉注射到患者体内。可以相信认为，脂质体/DNA复合物集中在肝脏，在肝脏复合物将DNA传递给巨噬细胞和Kupffer细胞。这些细胞寿命长，这样可提供传递DNA的长期表达。并且，为治疗DNA的定向传递，载体或基因的“裸”DNA可直接注射到需要治疗的器官，组织或肿瘤中。

基因治疗方法也可通过传递部位描述。传递基因的基本方法包括来自体内细胞基因转移，体内基因转移，和体外基因转移。在来自体内细胞基因转移中，从患者获取细胞并在细胞培养基中培养。将DNA转移到细胞中，转染的细胞数量扩增，然后重新植入患者体内。在体外基因转移中，转化的细胞是在培养基中生长的细胞，如组织培养细胞，及不是从具体患者获取的具体细胞。转染这些“实验室细胞”，选取转染的细胞并扩增，用来植入患者体内或作其他用途。

体内基因转移包括当细胞在患者体内时，将DNA引入到患者的细胞内。方法包括使用滤过性病毒调节基因转移，使用未感染病毒在患者体内传递基因，或在患者体内注射裸DNA，DNA被一部分基因产物蛋白质在其中表达的细胞吸收。另外，本文描述的其他方法，如使用“基因枪”，适用于体外插入EM1 DNA或EM1调节序列。

基因治疗的化学方法可包括脂质基化合物，没有必要是脂质体，穿过细胞膜转移DNA。脂质转染剂或细胞转染剂，脂质基正离子与负电荷DNA结合，产生能穿过细胞膜复合物，提供DNA进入细胞内部。另一种化学方法使用受体基胞吞作用，包括将特异配体与细胞表面受体结合，将其包裹并穿过细胞膜运送。配体与DNA结合，整个复合物被运送到细胞内。将配体基因复合物注射到血流中，然后靶中含有特异结合配体的受体的细胞，将配体-DNA复合物运送到细胞中。

许多基因治疗法采用滤过性病毒载体将基因插入到细胞中。如，在来自体内方法已使用改变的逆转录病毒载体将基因引入到外围及肿瘤-渗透的淋巴细胞，肝细胞，上皮细胞，肌细胞，或其他体细胞中。然后将这些改变的细胞引入到患者体内提供插入DNA的基因产物。

在体内方案中，滤过性病毒载体也已使用将基因插入到细胞中。为了指导外源基因的组织特异表达，可使用已知的对组织特异的顺式作用调节元素或启动子。或者，这也可采用将通过DNA或滤过性病毒载体原位传递到体内特异解剖部位来实现。如，将基因转移到体内血管中可通过将体外转导的内皮细胞植入到在动脉管壁上选取的部位上实施。病毒感染了也表达基因产物的环境细胞。滤过性病毒载体可直接被传递到体内部位上，如通过导管，这样仅使某些区域被病毒感染，提供了长期部位特异基因表达。使用逆转录病毒载体进行体内基因转移也已在乳房组织和肝脏组织中通过将改变的病毒注射到导向器官的血管中得到论证。

已使用在基因治疗方案中的滤过性病毒载体包括，但不限于此，逆转录病毒，其他RNA病毒如脊髓灰质炎病毒或Sindbis病毒，腺病毒，腺相关病毒，疱疹病毒，SV40，牛痘，和其他DNA病毒。复制缺损鼠逆转录病毒载体是最广泛使用的基因转移载体。鼠白血病逆转录病毒由单链RNA组成，复合核核心蛋白质和聚合酶(pol)酶，由蛋白质核心(gag)包裹及被糖蛋白包膜(env)围绕，确定了宿主范围。逆转录病毒的基因组结构包括被5’和3’长端重复单元(LTR)包围的gag，pol，及env基因。只要滤过性病毒结构蛋白质在包装细胞系中以反式提供，逆转录病毒载体系统利用最小载体含5’和3’LTRs和包装信号的事实，足以使载体包装，感染及整合到靶细胞中。适合基因转移的逆转录病毒的基本优点包括高效感染及在多数细胞类型中基因表达，精确单拷贝载体整合到靶细胞染色体DNA中，逆转录病毒基因组的操作轻松。

腺病毒由线性，双链DNA组成，复合核心蛋白质并由衣壳蛋白质包围。分子病毒学的先进技术已能利用这些生物体的生物学知识创造能将新型基因序列转导到体内靶细胞中的载体。腺病毒基载体能高水平表达基因产物蛋白质。腺病毒载体具有高效感染性，即使使用低效价病毒。另外，病毒能如不含细胞病毒一样充分感染，所以不需要注射生产者细胞系。腺病毒另一个潜在优点是能获得体内异源基因的长期表达。

DNA传递的机械方法包括融合脂质囊如脂质体或其他膜融合囊，DNA脂质粒子掺和阳离子脂质如脂质转染剂，DNA的多赖氨酸调节转移，直接注射DNA，如将DNA显微注射到生殖细胞或体细胞中，气动传递DNA涂覆粒子，如在“基因枪”中使用的金粒子，无机化学法如磷酸钙转染。粒子-调节基因转移方法在转移植物组织中首先使用。使用粒子轰击装置，或“基因枪”，产生动力将DNA-涂覆高密度粒子(金或钨)加速到能穿过靶器官，组织或细胞的高速。粒子轰击可使用在体外系统，或使用来自体内或体内技术将DNA引入到细胞，组织或器官中。另一种方法，配体调节基因治疗，包括将DNA与特异配体复合形成配体-DNA缀合物，指导DNA到特异细胞或组织中。

已经发现将质粒DNA注射到肌肉细胞中产生高比率的转染并含标记基因持续表达的细胞。质粒的DNA能或不能整合到细胞的基因组中。未整合的转染DNA会使基因产物蛋白质在末端分化，未增殖的组织中的转染和表达延长一段时间，并且不用担心在细胞或线粒体基因组中突变插入，缺失，或改变。长期，但没有必要永久，将治疗基因转移到特异细胞中能对基因疾病提供治疗或预防。DNA能定期重新注射以保持基因产物含量，在受体细胞的基因组中没有突变产生。未整合外源DNA能允许在一个细胞内存在几种不同的外源DNA构建，所有的构建表达不同的基因产物。

基因转移电穿孔法使用电流使细胞或组织对电穿孔-调节调节的基因转移敏感。使用一定电场强度的短暂电脉冲增加膜的穿透性，使DNA分子能穿过进入到细胞中。这种技术也可使用在体外系统中，或使用来自体内或体内技术将DNA引入到细胞，组织或器官中。

载体调节体内基因转移可用来转染外源DNA进入到细胞中。载体-DNA复合物能方便地引入到体液或血流中，然后部位特异地定向到身体内的靶器官或组织中。脂质体和多聚阳离子都可使用，如多赖氨酸，脂质转染剂或细胞转染剂。脂质体可培养成细胞特异的或器官特异的，这样脂质体携带的外源DNA可被靶细胞吸收。针对某些细胞的特异受体注射免疫脂质体可用来作为一种将DNA插入到携带受体细胞中的便利方法。已使用的另一个载体系统是适用于体内基因转移携带DNA到肝细胞中的脱唾液酸糖蛋白/多赖氨酸缀合物系统。

转染的DNA也可与其他种类载体复合，这样DNA可被携带到受体细胞中，然后居留在细胞质或核质中。DNA能与载体核蛋白质偶合在特异基因工程囊复合物中，并被携带直接进入细胞核中。

EM1的基因调节可通过服用与EM1基因，或与resin基因有关的控制区域，或与EM1基因的对应RNA转录物结合的化合物调节转录或翻译率来实施。另外，用编码EM1的DNA序列转染的细胞也可给患者服用以维持体内EM1源。如细胞可以用含编码EM1的核酸序列的载体转染。转染细胞可以是从患者正常组织，患者病变组织中获得的，或可以不是患者的细胞。

如，从患者体内移出的肿瘤细胞可用能表达本发明的EM1蛋白质的载体转染，并重新引入到患者体内。转染的肿瘤细胞在患者体内产生了抑制肿瘤生长的EM1含量。患者可以是人类或非人类的动物。细胞也可以通过非载体，或此领域中已知的物理或化学方法如电穿孔法，离子穿孔法，或通过“基因枪”转染。另外，EM1 DNA可在没有载体辅助的情况下直接注射到患者体内。具体地，EM1 DNA可注射到皮肤，肌肉或血液中。

转染EM1到患者体内的基因治疗方案可以是通过整合EM1DNA到细胞的基因组中，到微型染色体中，或者在细胞质或核质中作为单独的复制或非复制DNA构建。EM1表达可持续较长的一段时间，或定期重新注射以维持细胞，组织，器官，或确定的血液含量中所需的EM1蛋白质含量。

此外，本发明包括抗体和抗血清，其可用来检测新型抗-血管生成蛋白质，并也可使用在诊断，预后，或治疗特点在于或与血管生成活性或活性缺少有关的疾病和病状中。这样的抗体和抗血清也可用来在需要的位置向上调节血管生成，如在梗塞后心脏组织中，EM1蛋白质的抗体或抗血清可用来阻断局部的自身的抗-血管生成和过程，从而增加新血管的形成以抑制组织的萎缩。

这种抗体和抗血清可与药用可接受的组合物和载体结合形成诊断，预后或治疗用组合物。“抗体”或“抗血清”是指一群免疫球蛋白分子和/或免疫球蛋白分子的免疫活性蛋白质，即含抗体结合位点或互补位的分子。

使用特异结合EM1的抗体的被动抗体治疗可用来调节与血管生成相关的过程如再生，发育，伤口愈合及组织修复。此外，定向EM1抗体的Fab区域的抗血清可服用以封闭内源EM1抗血清与EM1结合的能力。

本发明的EM1还可用来产生对抑制剂和其受体特异的抗体。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。这些特异与EM1或EM1受体结合的抗体，可使用在此领域的技术人员众所周知的诊断方法和工具中，来检测或定量体液或组织中的EM1或EM1受体。这些测试的结果可用来诊断或预测癌症和其他血管生成调节的局部的出现和重现。

本发明还包括使用EM1，EM1的抗体，和含EM1和/或其抗体的组合物诊断或预后特点在于血管生成活性的疾病。如本文所使用的，“预后方法”意指能预测诊断患有疾病的人类或动物的疾病的进展的方法，具体地，是与血管生成有关的疾病。本文所使用的“诊断方法”指能在人类或动物体内确定有与血管生成有关的疾病存在或确定其类型的方法。

EM1可使用在检测及定量能结合EM1的抗体的诊断方法和工具中。这些工具可检测循环EM1抗体，其指示了在存在由原发性肿瘤原位分泌的EM1情况下微小转移的扩散。有这种循环抗-EM1抗体的患者很可能发展多种肿瘤及癌症，并很可能在治疗后或切除一段时间后重现癌症。这些抗-EM1抗体的Fab片段可用作抗原，产生抗-EM1 Fab片段抗血清，其可用来中和抗-EM1抗体。这种方法可减少被抗-EM1抗体排除的循环EM1，从而有效提高了循环EM1含量。

本发明还包括分离对EM1特异的受体。具有与组织结合高亲和力的蛋白质片段可用来在亲和柱上分离EM1受体。EM1受体的分离和提纯是阐明EM1作用机制的基本步骤。分离EM1受体及鉴定EM1刺激剂和拮抗剂会促进药物发展以调节EM1受体活性，最终途径是调节生物活性。使用原位和溶液杂交技术，分离受体能构建核苷酸探针以监控受体的定位及合成。并且，可分离出EM1受体的基因，并掺入到表达载体中及转染到细胞中，如患者的肿瘤细胞，以增加细胞种类，组织或肿瘤结合EM1及抑制局部血管生成的能力。

EM1蛋白质可用来制成亲和柱从培养的肿瘤细胞中分离EM1受体。分离及提纯EM1受体后进行氨基酸测序。利用这项信息，基因或编码EM1受体的基因可被确定并分离。接着，将克隆的核酸序列插入到能表达受体的载体中培养。这些技术对此领域的技术人员是众所周知的。将编码EM1受体的核酸序列转染到肿瘤细胞中，转染的肿瘤细胞表达受体增强了这些细胞对内源或外源EM1的反应，从而减小了转移生长率。

本发明的血管生成抑制蛋白质可在标准微量化学设备中合成，用HPLC和质量分光光度测定法检查纯度。蛋白质合成，HPLC提纯及质量分光光度法对这些领域中的技术人员是普遍了解的。EM1蛋白质和EM1受体也可在重组E.coli或酵母表达系统中制备，用柱层析提纯。

可合成完整EM1分子的不同蛋白质片段使用在几种应用中包括，但不限于下面列出的：作为培养特异抗血清的抗原，作为在EM1结合位点作用的刺激剂和拮抗剂，作为要与定向杀死结合EM1细胞的胞毒试剂结合，或结合中使用的蛋白质。包含这些蛋白质的氨基酸序列根据它们在分子外部区域的位置来选取，便于与抗血清结合。EM1的氨基和羧基末端，以及分子的中间区域在要合成的片段中独立表示。

EM1的合成蛋白质片段有多种用途。与EM1受体结合具有高度特异性及亲和力的蛋白质是放射性标记的，使用放射自显影和膜结合技术时可用来观察和定量结合位点。这种应用提供了重要的诊断和研究工具。了解EM1受体的结合属性有利于研究与受体有关的转导机制。

使用标准技术EM1和EM1衍生的蛋白质可与其他分子偶合。EM1的氨基和羧酸末端都含酪氨酸和赖氨酸残基，并用许多技术等位素及非等位素标记，如使用传统技术放射性标记(酪氨酸残基-氯胺T，iodogen，乳过氧化物酶；赖氨酸残基-Bolton-Hunter试剂)。这些偶合技术对此领域中的技术人员是众所周知的。或者，将酪氨酸和赖氨酸加入到不含这些残基的片段中，以便标记蛋白质上的活性氨基和羟基基团。根据在氨基酸上有的官能团选择偶合技术，官能团包括，但不限于氨基，sulfhydral，羧基，酰铵，酚，咪唑。用来影响这些偶合的多种试剂包括戊二醛，重氮化对二氨基联苯，碳化二亚胺，苯醌。

为了多种应用，EM1蛋白质可与同位素，酶，载体蛋白质，胞毒试剂，荧光分子，化学发光剂，生物发光剂，及其他化合物化学偶合。使用适于特异反应的不同技术来确定偶合反应的效率。如使用氯胺T和Na¹²⁵I的高特异活性用¹²⁵I放射性标记EM1蛋白质实施。用焦亚硫酸钠终止反应，混合物在一次性柱上脱盐。标记的蛋白质从柱上洗提出，分步收集。从每步收集物中移出等分份，并在用γ计数仪测量放射性活度。在这种方法中，未反应的Na¹²⁵I从标记的EM1蛋白质分离。特异放射性活度最大的蛋白质组分保存作随后使用，如分析与EM1抗血清结合的能力。

此外，具有短寿命同位素的标记EM1蛋白质能观察体内受体结合位点，使用正电子发射线断层显影术或其他现代放射显影技术用EM1结合位点定位肿瘤。

在这些合成的蛋白质内系统置换氨基酸产生对EM1受体高亲和力蛋白质刺激剂和拮抗剂，增强或减小了EM1与其受体的结合。这样的刺激剂用来抑制微小转移的生长，从而限制了癌症的扩散。EM1的拮抗剂用在脉管生成不充分的情况中，阻断对EM1的抑制作用促进血管生成。如，这种治疗对促进糖尿病患者的伤口愈合有疗效。

本发明的EM1蛋白质也可用作营养源或补充物。这种应用没有限制包括：用作蛋白质或氨基酸所补充物，用作碳源，用作氮源及用作碳水化合物源。在这种情况中，本发明的EM1蛋白质可加到具体生物体的食物中，或能以单独的固态或液态制剂服用，如以粉末，丸剂，溶液，悬浮液或胶囊形式服用。对于微生物，本发明的蛋白质或多核苷酸可加到微生物在其中或其上培养的介质中。

本发明进一步由下列实例演示，这些实例并不意味着发明要以如在其范围上强加限制的任何方式来解释。相反，可清楚地理解认为，对发明的多种其他具体实施，修正，及等同物，也有这种借助方式，在阅读本文描述内容后，在此领域中的技术人员看来，这种借助方式没有背离本发明的精神和/或所附权利要求书的范围。实例

实例1：细胞和细胞息

从ATCC(美国典型培养物保藏中心，美国弗吉尼亚州，Manassas，大学路10801)获取细胞系786-0(ATCC No.CRL-1932)，肾癌细胞系；C-PAE(ATCC No.CCL-209)，牛肺部动脉内皮细胞，EVC304(ATCC No.CRL-209)，人类内皮细胞系。所有细胞系保持在DMEM(786-0和C-PAE)中或M199(ECV304)中，补充加入10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和2mML-谷氨酰胺。波士顿哈弗医学院分子生物学系B.R.Olsen提供鼠内抑制素pBACPak8的cDNA克隆。从Novagen(美国威斯康星州麦狄逊)购买原核表达载体pET17b。酵母表达系统，Pichia pastoris(pPICZαA)从(美国加利弗尼亚圣地亚哥)购买。限制性内切酶和Vent DNA聚合酶从新英格兰生物实验室(美国马萨诸塞州，Beverly)购买。

实例2：将鼠内抑制素克隆并表达到原核系统中

从pBACPak8质粒扩增编码数内抑制素的基因并在pET表达系统中开始表达。通过使用Vent DNA聚合酶，使用内抑制素pBACPαk8作为模板，将编码数胶原质ⅩⅦ羧基末端部分的序列扩增。引物使用5’-GGC ATA TGC ATA CTC ATC AGG ACTTT-3’(SEQ ID NO：3)和5’-AAC TCG AGA TTT GGA GAA GAGGGT-3’。用下列参数实施扩增30个周期：94℃变性，60℃退火，722延伸，每种处理1分钟。使用QIAquick提纯工具提纯扩增的DNA片段(555 bp)，用NdeI和XhoI(在上面的引物中划线的限制性位点)消化，连接在表达载体pET17bhis[Dhanabal等人(1995)J.免疫学方法，182：165-175]中。初始转化用宿主株HNS174(美国威斯康星州麦迪逊，Novagen)实施。正克隆两条链都进行测序。将所需的克隆体最终转化到BL21(DE3)(美国威斯康星州麦迪逊，Novagen)中表达。在pET系统中表达重组蛋白质按照制造商(美国威斯康星州麦迪逊，Novagen)的建议实施。

使用Ni-NTA琼脂糖柱提纯重组蛋白质。存在于包含物体内的蛋白质溶解在8M尿素中，并在如O’Reilly等人(1997)(细胞88：277-285)描述的变性条件下提纯。结果在图1(图3)中显示，图1(图3)显示在280nm下洗脱组分(○)的吸收率。还标绘有洗脱缓冲液的(●)PH。图1(图3)中在约7-8组分周围显示有小峰值，在21-22组分周围有明显峰值，在约组分35周围有小峰值。

选取的组分的10ml样品进行的SDS-PAGE分析显示，在非还原条件下有22-24kDa的不连续带。结果在图2(图4)中显示。图2(图4)中显示组分7和8(分别为3和4道)，以及组分21和22(分别为5和6道)的22-24kDa带。此外，也观察到46和69kDa的大分子量复合物，其由于用DTT还原产生22-24kDa(图2(图4)中7道)带。收集不同PH值(PH4.2和3.9)洗脱液的峰值，并进行梯度浓度尿素透析，终透析在PBS缓冲液(PH7.4)中进行，在这个时候大部分蛋白质从溶液中沉淀。因为从相同系统表达的非重折叠沉淀蛋白质在体内显示出生物活性，所以实施如O’Reilly等人(细胞88：277-285)描述的“蛋白质重折叠”精确程序。沉淀的蛋白质仅在体内试验中用作悬浮状态，用BCA检测法测定蛋白质的浓度(美国伊利诺斯州Rockford Pierce化学公司)(以适当的间隔溶解在尿素中)，并在-70℃以小等分份储存。因为鼠和人类的内抑制素zC-末端是保守的，所以制备两个小缺失。设计引物使9或17个氨基酸从内抑制素的C-末端缺失，产生两种突变体，分别称为EM1和EM2。对于EM1，所有4个半胱氨酸缺失。对于EM2，大部分C-末端半胱氨酸也缺失了。EM1突变体的上游引物是5’-TTCCAT ATG CAT ACT CAT CAG GAC TTT CAG GCA-3(SEQ IDNO：7)，下游引物是5’-TTA GAG GCC GCC TAC TCA ATG CAGAGG ACG ATG TA-3’(SEQ ID NO：8)。EM2突变体的上游引物是5’-TTC CAG ATG CAT ACT CAT CAG GAC TTT CAG CCA-3’(SEQ ID NO：9)，下游引物为5’-TTA GCG GCC GCC TAG TTGTGG CAG CTC GCA GCT TTC TG-3’(SEQ ID NO：10)。

将扩增的DNA片段(EM1的528 bp，EM2的505 bp)提纯，并用NdeI和NotI消化，连接在预消化的pET28(a)表达载体中。剩余的试验如上述实施。诱导条件和细菌粒子处理如O’Reilly等人(细胞88：277-285)描述的实施。在存在8M尿素中使用Ni-NTA柱实施提纯重组蛋白质，如QIA表达手册(德国Hilden，Qiagen)中所描述的。简要地，在室温将细菌粒子溶解在平衡缓冲液(8M尿素，10mM Tris和100mM磷酸钠缓冲液，PH8.0)中14小时。悬浮液超声波降解3-4次，在10，000xg下离心，溶解组分以10-20ml每小时的流量加样在用上述缓冲液预平衡的Ni-NTA柱上。用平衡缓冲液剧烈冲洗柱。用PH值从8.0到6.3，然后到4.2，最后到3.0梯度的缓冲液洗脱结合蛋白质。对于体内试验使用的内抑制素突变体，非特异与柱结合的蛋白质用平衡缓冲液冲洗，接着用10mM和25mM咪唑冲洗除去。结合蛋白质洗脱在含0.2M乙酸的平衡缓冲液中。用SDS-PAGE分析提纯组分，含提纯内抑制素的组分(野生型内抑制素使用PH4.2和3.0，对内抑制素突变体使用含0.2M乙酸的平衡缓冲液)收集并缓慢重折叠。终透析在4℃使用PBS(PH7.4)实施。透析期间蛋白质从溶液中沉淀出来。将其进一步浓缩并以小等分份储存在-70℃。通过BCA检测法测定蛋白质的浓度(美国伊利诺斯州Rockford Pierce化学公司)。

实例3在Pichia pastoris中表达鼠内抑制素

Pichia pastoris，methanotropic酵母株，具有许多高级真核表达系统的优点：(a)存在α因子信号序列以便表达的蛋白质分泌到介质中，(b)酵母株(GS115)仅分泌很低含量的简化提出过程的内源宿主蛋白质，(c)没有内毒素污染，(d)能发生糖基化作用。选取pPICZαA载体表达哺乳动物内抑制素和其突变体和片段，因为这个系统产生高价效并具有优秀生物活性的抗-血管生成蛋白质，如在Vikas P.Sukhatme 1998年12月8日提交的U.S.S.N.XX/XXX，XX，“制备抗-血管生成蛋白质的方法”中所详细描述的，其内容参考收入本篇。当使用这个表达系统时，发现哺乳动物的内抑制素在诱导后第二天表达为含峰值量表达的溶解蛋白质(20kDa)。

编码鼠内抑制素的序列进一步通过使用Vent DNA聚合酶在pET17bhis构建模板上扩增修饰，其含有上述的鼠内抑制素。使用的上游引物是5’-GGG AAT TCC ATA CTC ATC AGG ACT TT-3’(SEQ ID NO：11)，下游引物是5’-AAG CGG CCG CCT ATT TGGAGA AAG AGG T-3’(SEQ ID NO：12)。将含EcoRI和NotI限制性位点的扩增片段亚克隆到预消化的酵母表达载体中。pPICZαA载体携带带有抗生分泌的Zeocin标记的α因子分泌信号序列。初始转化在Top 10’宿主株(美国加利弗尼亚州，圣地亚哥市，InVitrogen)中实施。产物克隆体进行插入存在筛查，正克隆体实施测序。然后将质粒用SacI线性化，并用来同源重组到酵母宿主株GS115(美国加利弗尼亚州，圣地亚哥市，InVitrogen)中。使用如在Pichia表达手册中所描述的氯化锂法实施转化。通过平铺在含100μg/ml的Zeocin的YPD板上筛查重组体。测试生长在YDP/Zeocin板上的克隆体的表达。

初始筛查用来确定具有高水平表达的酵母克隆体。在2升带挡板搅拌器的烧瓶内实施大规模表达鼠内抑制素。过夜的培养物(A₆₀₀2-6)用来接种2-升烧瓶，加入500ml缓冲甘油介质。在30℃，250rmp生长细胞直到A₆₀₀16-20(2天)。随后，在5000rmp离心细胞10分钟，酵母重悬浮在300-400ml缓冲甲醇诱导介质中。收获诱导后第二，第三，和第四天的含分泌重组蛋白质的上清液。终收获后，立即处理不含细胞的上清液。

实例4：通过肝磷脂-琼脂糖层析仪提纯鼠内抑制素

根据O’Reilly等人的数据(1997)(细胞88：277-285)，使用肝磷脂-琼脂糖柱提纯。含重组体蛋白质的粗制上清液通过硫酸铵(70％)沉淀浓缩。沉淀的蛋白质溶解在含150mM氯化钠的10mM Tris缓冲液中，在4℃透析过夜，在6-8小时间隔有三个变化。透析样品进一步使用Amicon浓缩仪(YM10)通过超滤法浓缩。用肝磷脂-琼脂糖填充一次性的polyprep柱(美国加利弗逆亚州，Hercules，BioRad)，并用10mM Tris，150mM氯化钠，PH7.4平衡。浓缩样品以20ml/小时的流量使用蠕动泵加样在柱上。用平衡缓冲液冲洗柱直到A₂₈₀大于0.001。通过分级梯度氯化钠浓度(0.3M，0.6M，1M，和2M的氯化钠)将结合蛋白质洗脱在2-ml组分中。收集0.6M到1M的峰值组分，并用PBS，在PH为7.4透析。通过BCA检测法(美国伊利诺斯州，Rockford，Pierce化学公司)测定蛋白质浓度。提纯过程在4℃寒冷房间内进行。Pichia系统表达的重组体溶解内抑制素使用在所有体外检测中。

图3(图5)和图4(图6)分别显示了提纯蛋白质的洗脱图和SDS-PAGE分析图。图3(图5)表示组分数(X轴)，对应在280nm的吸收率(○)(左Y轴)和用来洗脱组分的氯化钠浓度(●)(右Y轴)标绘图。随着氯化钠浓度的增加获得两个显著的峰值。当与氯化钠浓度在0.6M时的主要峰值相比时，在0.3M氯化钠浓度的第一个峰值是小峰值。如在流经组分(图4(图6)，4道)中缺少蛋白质蛋白质所示的，大部分内抑制素蛋白质与柱结合。重组体蛋白质结合紧密，使用低度盐Tris缓冲液除去其他紧酵母衍生蛋白质。从0.3M氯化钠组分中洗脱的蛋白质含痕量内抑制素，但被其他宿主衍生大分子量蛋白质污染。提纯蛋白质在20kDa移动，因为在22kDa还原移动。收集0.6M和1M氯化钠洗脱的蛋白质组分，浓缩并用PBS(PH7.4)透析。提纯的蛋白质进一步通过FPLC使用Superose12大小分离柱(美国新泽西州，Piscataway，药物生物技术有限公司)分离。这种柱的洗脱图只显示一个峰值。10ml选取组分的等分份在12％SDS-PAGE凝胶上分析，结果在图4(图6)中显示。SDS-PAGE分析显示存在与内抑制素对应的单一22-24 kDa离散带。表达水平估定在每升培养物15-20mg。

为了进一步定性重组体蛋白质，N-末端微量测序实施7个周期。试验显示酵母α因子信号肽被加工并在丙氨酸被裂解。提纯蛋白质的信号肽裂解后的开始的7个残基(EGHTHQD)，与带有从接头序列衍生的首先的两个残基(EF)的内抑制素蛋白质的公布序列精确匹配。

实例5：在Pichia表达系统中克隆表达组氨酸内抑制素

将10个组氨酸残基的组氨酸标记放在在pETl7bhis表达载体中的鼠内抑制素构建的编码区域之前。编码区域，包括组氨酸标记序列，通过用EcoRI和NotI位点扩增穿到pPICZαA载体中，如上所述实施线性化和重组到酵母宿主株GS115中。用70％硫酸铵沉淀不含细胞介质。沉淀的蛋白质溶解在含30mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液(PH8.0)中，并在4℃在相同的缓冲液中透析，有6-8小时间隔的三个变化。使用Ni-NTA柱提纯组氨酸内抑制素重组体蛋白质，如在QIA表达手册(德国，Hilden，Qiagen)中所描述的。结合蛋白质用分级梯度咪唑(10mM，25mM，50mM，100mM)洗脱。收集50mM和100mM咪唑洗脱液的峰值组分，并用PBS透析，PH为7.4。

结果在图5(图7)中显示，图5(图7)显示了组分数(X轴)，与在280nm的吸收率(左Y轴)(○)和用来洗脱组分的咪唑浓度(右Y轴)(●)的标绘图。观察到几个吸收率峰值，第一个是最大的，接着三个小峰值。Ni-NTA柱的组氨酸内抑制素洗脱图显示重组体蛋白质结合紧密。在培养物上清液中的酵母衍生蛋白质没有与柱结合，在冲洗期间被除去。结合蛋白质通过分级梯度咪唑洗脱。加入10mM咪唑洗脱非特异结合宿主衍生蛋白质(图5(图7))。在25mM咪唑浓缩时，小组分重组蛋白质与大分子量蛋白质一起洗脱。50mM和100mM咪唑终洗脱显示了显著的峰值。SDS-PAGE分析在图6(图8)中显示。流经组分(3道)不含任何内抑制素，说明大部分蛋白质与柱结合。增加咪唑浓度到10mM和25mM产生非特异蛋白质洗脱。，提纯重组体组氨酸内抑制素以与在50mM咪唑中的22-24kDa对应的单一带移动。分子量为22kDa的蛋白质连同少量的与44-46kDa对应的蛋白质在100mM浓度中可看到。提纯蛋白质的浓度通过BCA检测法确定。表达水平估定为15mg每升培养物。

实例6：重组体酵母内抑制素的定性及多克隆抗体

的产生和Western印迹分析

制备在酵母中的鼠重组体内抑制素的多克隆抗血清，通过用10μg从Pichia表达系统衍生的提纯蛋白质免疫兔子来培养。在12％SDS=PAGE凝胶上分离细菌系统及酵母系统表达的重组体内抑制素。通过半干转移法(美国加力弗尼亚州Hercules，转-印迹，BioRad)将蛋白质转移到PVDF膜中。初级抗血清用含5％脱脂干奶的1xTBS缓冲液稀释到1∶4000。山羊抗0兔子IgG/HRP缀合物用作二级抗体(1∶5000)。用化学发光法检测免疫反应性(美国伊利诺斯州Rockford，Pierce化学公司)。

将细菌表达系统和酵母表达系统表达的提纯内抑制素置于还原及非还原条件下。图7(图9)显示与内抑制素对应的免疫反应带。通过Western印迹估定的蛋白质大小在范围22-24kDa。此外，用Penta组氨酸单克隆抗体(德国，Hilden，Qiagen)探测酵母及细菌表达的重组体组氨酸内抑制素。单克隆抗体仅对组氨酸内抑制素表现正反应，而原内抑制素没有显示任何免疫反应性。这个数据确证了在重组体蛋白质中存在组氨酸标记。抗血清对人类或鼠内抑制素没有显示交叉反应性，说明一些程度的免疫反应性对内抑制素特异。

实例7：内皮细胞最增殖检测

制备在酵母系统中的内抑制素的抗增殖效果使用牛肺部动脉内皮细胞(C-PAE)测试。使用不同的内皮细胞及不同参数(“饥饿”时间，血清浓度，有丝分裂刺激剂的浓度和种类)实施初始试验。C-PAE细胞给出最大的可再生的反应、

将C-PAE细胞平铺在涂有纤维结合蛋白()的24个培养皿中，在每个培养皿上含2％FBS的0.5ml DMEM中有12，500个细胞。在37℃温育24个小时后，用含或不含重组体鼠内抑制素的新鲜DMEM和含3ng/ml bFGF的2％FBS(美国明尼苏达州Minneapolis研究&发展体系)置换介质。细胞用1μCi的³H-胸苷脉冲24小时。将介质吸出，细胞用PBS冲洗三次，然后加入1.5N氢氧化钠(每个培养皿100μl)溶解，在37℃温育30分钟。用液体闪烁计数器确定细胞-相关放射性活度。在相同的条件下试验进行5次，每次结果相同。

观察bFGF诱导增殖的剂量相关抑制作用。结果在图8(图10)中显示，图8(图10)中在X轴显示酵母衍生溶解内抑制素(○)和酵母衍生组氨酸溶解内抑制素(●)，在Y轴上显示³H-胸苷的掺入率。通常，随着内抑制素的浓度增加掺入率稳定下降。观察随着内抑制素浓度的增加(0.1μg/ml到10μg/ml)的抑制作用范围(对照物的30-94％)，ED值在范围600-700ng/ml。在用上述的检测法测试酵母衍生的组氨酸内抑制素时，可观察到对C-PAE细胞相同的抑制作用，如在图8(图10)中所示。随着酵母衍生的溶解内抑制素(○)或酵母衍生的溶解组氨酸内抑制素(●)的浓度增加，³H-胸苷的掺入率稳定下降。

如图9(图11)所示，在浓度范围在0.5μg/ml到10μg/ml时，重组体蛋白质不抑制肾癌细胞(786-0和A498)的增殖。图9(图11)是柱状图，显示在786-0细胞(空柱)中和A498细胞(阴影柱)中³H-胸苷的掺入率。重组体内抑制素还对IMR90和NIH3T3成纤维细胞没有作用。

实例8内皮细胞移动检测

因为C-PAE细胞对bFGF的刺激不移动，所以使用bFGF作为刺激物时使用含不同浓度的内抑制素的ECV304细胞。为了确定重组内抑制素阻断ECV304细胞朝bFGF移动的能力，移动检测使用带有聚碳酸酯膜(25×80mm不含PVD，8μ孔，美国加力弗尼亚州Livermore，Poretics公司)的有12个培养皿的Boyden趋化式箱(神经-探针有限公司，美国马里兰州CabinJohn)实施。通过用含0.5％白明胶，1mM氯化钙和150mM氯化钠的溶液涂覆箱在37℃过夜来预防生长因子与箱非特异结合。ECV304细胞在含的5ng/ml DiI(1，1’-dioctadecyl-3，3，3’，3’，-tetramethyindocarbocyanine，氯酸DiIC18，)的10％FBS中生长过夜，用含0.05％BSA的PBS冲洗。接着胰蛋白酶化，使用Coulter-计数仪(英国，Luton)计数细胞，并稀释在含0.5％FBS的介质199(Gibco/BRL，美国马里兰州Gaithersburg)中到300，000个细胞/ml。较低的箱用含25ng/ml bFGF的介质199填充。较高的箱用含不同浓度的重组蛋白质的15，000个细胞/培养皿接种。细胞允许在37℃移动4小时。这时，在膜上表面的细胞用细胞刮器移出，在较低表面的(移动的)细胞安装在3％甲醛中并用PBS冲洗。用荧光显微镜及数码相机获得在550nM的固定膜的成像。在每张膜上的细胞数量用OPTIMAS(6.0版本)软件(媒介细胞计数术，美国MD，Sliver Spring，L.P.)确定。

如图10A(图12A)和10B(12B)及图11(图13)所示，加入内抑制素导致对移动的剂量相关抑制作用。图10A(图12A)和10B(12B)是两张显微照片，表示使用bFGF(25ng/ml)作刺激物溶解鼠内抑制素对内皮细胞(ECV304)的抑制作用。图10A(图12A)表示在对照物(+bFGF，无内抑制素)中移动的内皮细胞，图10B(图12B)表示用内抑制素(20μg/ml)和bFGF治疗的移动的内皮细胞。

图11(图13)是柱状图，表示使用不同浓度的内抑制素对内皮细胞移动的抑制作用。相对细胞移动在Y轴表示，治疗方式(对照物，25ng/ml bFGF，20，10，5，2.5μg/ml内抑制素)在X轴表示。每种治疗方式重复实施。在每个培养皿中移动细胞的数量在三个不同区域计数，获得平均值。每个值是典型试验的平均值，打叉柱表示标准偏差。在浓度小于1μg/ml时，记录了对移动边缘抑制作用，而在10μg/ml时，可观察到对内皮细胞移动的60％抑制作用。这些研究首先显示了内抑制素对细胞移动的作用。内抑制素对两种非内皮细胞系(IMCD)移动的作用也进行了检测。在内髓质收集管肾细胞(IMCD)中没有观察到有效果，在IC-21巨噬前体细胞系中记录了一些程度的作用(5μg/ml时15％；20μg/ml时50％)，这说明在高浓度下，内抑制素可阻断一些细胞种类的细胞移动。

实例9：绒毛尿囊膜(CAM)检测法

使用绒毛尿囊膜(CAM)检测法测试鼠内抑制素体内阻断bFGF诱导血管生成的能力。受精白Leghorn鸡蛋(SPAFAS有限公司，Norwich CT)打开置于100mm²培养皿上，并在37℃湿润温育箱内生长11天。含vitrogen(胶原质生物物料，PaloAlto，CA)浓度为0.73mg/ml的沉淀粒子被补充加入：仅载体；VEGF(25ng/沉淀粒子)，VEGF(25ng/沉淀粒子)和内抑制素(20-0.5μg/沉淀粒子)，bFGF(50ng/沉淀粒子)，或bFGF(50ng/沉淀粒子)和内抑制素(20-0.5μg/沉淀粒子)。沉淀粒子在37℃聚合2小时。将沉淀置于尼龙网上并取向在CAM周边上。将胚胎重置于温育箱内24小时。通过注射FITC-右旋糖苷到鸡胚胎的循环系统中，评定在胶原质网上入侵的新毛细管。在试验的最后，将网切碎，依据Iruela-Arispe等人的方法(1997)(Thromb.Haemost.78：672-677)，使用程序NIH成像v1.59实施评定脉管密度。检测进行三次，进行四次独立的试验。

如图12(图14)和13(15)中所示，内抑制素能抑制由bFGF和VEGF调节的血管生成反应。图12(图14)是一组三张显微摄像图，显示只用载体[图12A(图14A)]，只用VEGF[250ng/粒子，图12B(图14B)]，及用VEGF和内抑制素[图12C(图14C)]时的脉管密度。图13A(图15A)和图13B(图15B)显示剂量相关的抑制作用。图13A(图1 5A)是柱状图，表示重组蛋白质浓度(X轴)，与对VEGF(Y轴)反应的血管生成抑制作用标绘图。图13B(图15B)是柱状图，表示重组蛋白质浓度(X轴)，与对bFGF(Y轴)反应的血管生成抑制作用标绘图。所有计数用负对照物标准化。两张图都显示随着内抑制素浓度的增加对血管生成的抑制作用稳定增加。在20μg/目时，对VEGF反应的抑制(47％)一定程度上比对bFGF反应的抑制作用(39％)更有效。

实例10：对内抑制素抑制作用的中和

内抑制素抑制作用的特异性通过使用内皮增殖和CAM检测的中和作用依据来演示。在内皮细胞增殖检测中，在室温将内抑制素用过量的多克隆抗血清或提纯抗体(IgG)温育1小时，然后加入存在3μg/ml的bFGF的C-PAT细胞中。预免疫血清用作负对照物。此外，单独使用提纯IgG和内抑制素抗体也用作对照物。通过加入1μCi的³H-胸苷24小时测定DNA合成，细胞-相关放射性活度如是所述测定。对于CAM检测，在制备沉淀粒子前，在4℃将内抑制素(10μg)和抗血清(50μg)预温育过夜。这些试验的对照试验包括只使用IgG和只使用预免疫血清。如上所述确定两个检测中的血管生成反应评定。

图14(图16)是柱状图，表示在内皮细胞增殖检测法中，多克隆抗血清对鼠内抑制素的抑制效果的中和。³H-胸苷的掺入率在Y轴表示，治疗方式(对照物，10μg内抑制素+抗血清，5μg内抑制素，5μg内抑制素+抗血清，预免疫血清，内抑制素抗血清，和内抑制素IgG)在X轴表示5每个值是从三份培养物中获得的值的平均值，打叉柱表示标准偏差。图15(图17)是两张显微照片，表示CAM检测法的结果。图15A(图17A)表示VEGF和内抑制素(10μg)的效果，图15B(图17B)表示VEGF，内抑制素(10μg)，和多克隆抗血清(50μg)的效果。图14(图16)和图15(图17)都显示通过与特异抗血清温育，内抑制素的抑制作用可被抑制。抗-内抑制素的抗血清抑制抑制作用的95％。只使用预-免疫血清和内抑制素没有刺激作用，正常的兔子IgG也没有。

实例11：在裸鼠模型中对原发性786-0RCC肿瘤的抑制6-8周大的雄性裸鼠在右侧皮下注射100ml2百万个786-0细胞。肿瘤在植入后约两周出现。肿瘤大小使用测径器测定，肿瘤体积使用标准公式计算：肿瘤体积=ab²×0.52，其中a=肿瘤长度，b=肿瘤宽度(O’Reilly等人(1994)，细胞79：315-328)。肿瘤体积在范围350mm³到400mm³。将动物完全打乱，每组有具有组内和组间肿瘤大小可比的5只鼠。用重组内抑制素(细菌或酵母版的)开始治疗，每只鼠每天接受10mg/kg体重的重组体蛋白质，通过腹腔内注射服用10天时间。对照动物每天接受PBS。隔天测定所有组中的肿瘤大小，并计算肿瘤体积。在第10天终止治疗，将动物杀死，取出每只鼠的肿瘤，安装在10％缓冲福尔马林中。

结果在图16(18)，17(19)和18(20)中显示。图16(图18)表示通过重组内抑制素系统治疗，对786-0肿瘤生长的抑制作用。Y轴表示肿瘤体积为mm³，治疗后的天数为时间在X轴上。以10mg/kg/天实施腹腔内注射内抑制素，开始于第一天(箭头)。每个时间点表示每组5只鼠的平均值，打叉柱表示S.E.M。治疗方式为对照物PBS(○)，酵母表达内抑制素(●)，酵母表达组氨酸内抑制素(x)，和细菌表达内抑制素(□)。在治疗后第5天，在对照物(936mm³)和治疗肿瘤之间出现不同。酵母内抑制素治疗的肿瘤为405mm³，细菌制备的内抑制素治疗的肿瘤为442mm³，组氨酸内抑制素治疗的肿瘤为462mm³。

图17A(图19A)到17E(19E)是用重组内抑制素治疗的786-0肿瘤的一组5张照片。图17A(图19A)和17B(19B)是对照物肿瘤，图17C(图19C)表示用酵母衍生的内抑制素治疗的肿瘤，图17D(图19D)表示细菌衍生的组氨酸内抑制素的效果，图17E(图19E)表示用酵母衍生的组氨酸内抑制素治疗的肿瘤。在治疗阶段的最后，在解剖显微镜下全面检测对照物的肿瘤和治疗组的肿瘤。对照组的肿瘤通常较大并具有较高可视性。在治疗后的第5天，在对照组和治疗组之间(图16(图18)和17(图19))，可观察到肿瘤体积减小到2.5倍。在所有治疗组中肿瘤生长被抑制，与对照组比较可观察到减缓的生长速度。在10μg/ml剂量下，细菌-(组氨酸标记的)或酵母衍生的(有或没有组氨酸标记的)内抑制素都运作的同样好。在治疗后的第10天，在对照动物中肿瘤体积为1490mm³(p值＜0.005)。服用内抑制素没有完全抑制肿瘤的生长；肿瘤生长显示，在治疗期间体积只有边缘增加。实例12：在E.coli中产生的两个密切相关的C-末端内抑制素突

变体在体内RCC中的活性方面表现出显著的不同

上述的RCC肿瘤模式使用在使用内抑制素，和在上面实例1中的原核系统中制备的突变体EM1和EM2的第二组试验中。日剂量是每公斤体重20mg蛋白质，腹腔内注射。初始肿瘤体积是150-200mm³。野生型内抑制素，也是制备在pET28(a)载体中的，以每公斤体重20mg服用作为正对照试验，服用PBS作为负对照试验。

结果在图18(图20)中显示。图18(图20)在X轴上表示治疗后天数，在Y轴表示肿瘤体积。每个时间点表示每组中5只鼠的平均值。治疗方式为对照物PBS(○)，细菌衍生的野生型组氨酸内抑制素(点划线，□)，细菌衍生的EM1(虚线，△)，细菌衍生的EM2(实线，◆)。腹腔内注射开始于第一天(箭头)。治疗后第9天，组间差距明显[图18(图20)]。在治疗后第11天，对照组中的肿瘤体积(397mm³)是两个治疗组的肿瘤体积的约两倍：内抑制素(182mm³)或EM1(259mm³)。然而，在同一天，EM2-治疗组的肿瘤体积(389mm³)与对照组的肿瘤体积(397mm³)基本相同。重要性在于在EM2和内抑制素组之间有90％置信水平，在内抑制素和对照组之间有95％的置信水平。去掉第11天每组中的最大和最小肿瘤的值，使EM2和EM1之间及EM2和内抑制素之间的置信水平增加到95％。这样，EM1蛋白质保留了内抑制素的原生物活性，而EM2，多含8个氨基酸的缺失，没有保留内抑制素的原生物活性。此外，在内抑制素组的5只鼠中的2只和EM1组中的5只鼠中的1只，在治疗的最后阶段没有检测到肿瘤。

实例13：Annexin V-FITC检测

Annexin V，一种具有对磷脂酰丝氨酸(PS)高亲和力的钙相关磷脂结合蛋白质，可用来检测早期细胞程序死亡。细胞程序死亡开始后，多数细胞种类将膜磷脂磷脂酰丝氨酸(PS)从质粒膜的内表面移位到膜外。PS可通过用Annexin的FITC缀合物染色检测，与PS自然结合的38kDa蛋白质。在PCD期间，PS的表面化通常在气泡形成及DNA片段化之前。

简要地，将200，000个细胞平铺在纤维结合蛋白涂覆的6个培养皿上的含2％FBS和3ng/ml bFGF的DMEM中。给每个培养皿加入不同浓度的重组体鼠内抑制素，治疗18小时后，收获并加工细胞。对于时间进程研究，加入10μg/ml内抑制素，3，4。6，12和18小时后处理细胞。人类重组TNT-α(40ng/ml)作为正对照物。细胞用PBS冲洗，并悬浮在结合缓冲液(10mMHEPES/氢氧化钠，PH7.4，140mM氯化钠，2.5mM氯化钙)中。加入Annexin V-FITC到终浓度为100ng/ml，然后在黑暗中温育细胞10分钟，再用PBS冲洗，并悬浮在300ml结合缓冲液中。在流动细胞计数分析前加入10μl的碘化丙锭(PI)。使用Becton Dickinson FACStar加流动细胞计数器分析细胞。使用电子补偿消除伤流荧光。在每个样品中，计数最小量10，000个细胞并以清单模式储存。使用标准细胞Quest软件(Becton-Dickinson)进行数据分析。建立四象限，以使负对照物允许小于1％正性。内抑制素以μl/ml加入到非内皮细胞(NIH3T3和786-0)中，如上述加工分析细胞。

在10μg/ml时，内抑制素显示明显的升高了Annexin荧光强度。在5和10μg/ml时，对照物和内抑制素治疗的比之间的平均荧光强度差距是很显著的(p=0.01)。对于10μg/ml的内抑制素和正对照物TNF-α(40ng/ml)，荧光强度的升高是相似的。浓度低于0.10μg/ml的内抑制素不显示任何显著的Annexin V正性。为了研究内抑制素最早引发PS表面化的时间点，我们实施了时间进程试验(图2B)。在治疗12小时后，内抑制素的效果是显著的(p=0.01)。在6小时之前的时间点，对照物和治疗样品之间没显示差异。

用荧光显微镜(Nikon)法分析样品进行FACS形态检测，显示在12小时时Annexin V染色定位在细胞膜，没有染色在细胞质中。在这段时间，大部分细胞对PI是负效应的，显示了早期的细胞程序死亡。随着增加暴露时间(24-36小时)，除了膜对Annexin V染色，一些细胞对PI转为正效应，与细胞程序死亡的更前面的阶段一致。

在研究的两种其他内皮细胞系中观察到了相同量的AnnexinV染色，BAE和BCE。我们已测试了人类内抑制素对三种牛内皮细胞系的作用。在给置信细胞加入人类内抑制素时，我们没有检测到Annexin V染色，而当使用人类内皮细胞(HUVE，和HMVE-L)时，它产生了Annexin V荧光强度的明显升高(准备中的原稿)。这些数据显示，细胞程序死亡，如用AnnexinV染色所测定的，发生在不同的对鼠和人类内抑制素反应的内皮细胞中。

至于非内皮细胞，786-0和NIH3T3细胞没有显示任何明显的Annexin正性。此外，对其他非内皮细胞(IMR-90，A10和H9c2(2-1)-成肌细胞)进行筛查，发现内抑制素没有效果。根据这些结果，内抑制素的作用显示对内皮细胞的选择性。

实例14：Caspase 3检测

Caspase 3(CPP32)是一种在哺乳动物细胞程序死亡期间早期激活的细胞内蛋白酶，其通过降解特异结构，调节，和DNA修复蛋白质引发细胞断裂。这种蛋白酶活性可通过检测从标记的低物(DEVD-pNA)裂解后的生色团的(p-硝基酰苯胺)分光光度法测定。

这种检测在75cm²组织培养烧瓶内实施，或在纤维结合蛋白-涂覆的6个培养皿中实施。用每个培养皿0.5-1×10⁶个细胞接种6个培养皿，用2×10⁶个细胞接种烧瓶。细胞在含10％FBS的DMEM中保持过夜。第二天，旧介质用新鲜介质(2％FBS)置换，细胞在37℃温育过夜。接着饥饿处理，细胞在DMEM(5％FBS)中用bFGF(3ng/m1)刺激。与bFGF一起，加入酵母内抑制素(10μg/ml终浓度)，细胞生长24小时。对于对照培养皿，仅加入PBS缓冲液。作为正对照物，使用TNF-α，终浓度为20ng/ml。24小时后，离心上清液并收集。培养皿(烧瓶)胰蛋白酶化并收集附着细胞并与上清液细胞混合。计数细胞，并重新悬浮在细胞裂解缓冲液(美国加利弗尼亚州Palo Alto，克隆技术)中，浓度为4×10⁶个细胞/ml。剩余步骤按照制造商的建议(美国加利弗尼亚州Palo Alto，克隆技术)。Caspase的特异抑制剂，DEVD-fmk，用来确证如制造商所建议的特异性。在微型板读取器(美国加利弗尼亚州，Hercules，BioRad)上测定在405nm的吸收率。通过比较诱导的样品(酵母内抑制素或TNF-α)与未诱导的对照物可确定蛋白酶活性的增加倍数。同样地，使用非内皮细胞(NIH3T3和H9c2(2-1)-成肌细胞)，并如上所述进行分析。

首先用10μg/ml的内抑制素实施时间进程试验，确定caspase3活性的增加。在2，4，8，和14小时时，治疗的样品和对照样品之间caspase 3活性没有差距。然而，在用内抑制素治疗24小时后caspase 3活性超过对照物。用内抑制素和TNF-α(正对照物)治疗的样品在图21中显示。当与对照物比较时，24小时后用内抑制素治疗的样品显示出caspase 3活性增加到1.8倍，而TNF-α也提供了可比的增加(1.75倍)。检测至少重复5次获得相同的结果。当caspase 3(DEVD-fmk)特异抑制剂包含在相同的样品中时，蛋白酶活性基线位置(比较黑色块与相应的白色块)，说明测定的活性增加是对caspase 3特异的。图22显示，仅对于NIH3T3细胞，可观察到caspase-3的边缘增加，而在成肌细胞中，在治疗样品和对照培养物之间没有差异。

实例15：TUNEL染色的显微镜检测

核DNA的片段化是一种出现在细胞程序死亡的细胞核中的明显形态改变。TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶-调节dUTP切口-末端-标记)检测在用内抑制素，TNF-α治疗的细胞和对照细胞上实施。对于附着细胞，C-PAE细胞以5，000个细胞每个培养皿密度接种在纤维结合蛋白涂覆的(10μg/ml)Lab-Tek箱的玻片上，并在含10％FBS的0.4ml的DMEM介质中生长。两天后，将旧介质吸去，加入含2％FBS的新鲜DMEM，细胞饥饿过液。接着，含3ng/ml bFGF的0.36ml新鲜介质(含2％FBS)连同酵母内抑制素(10μg/ml)或TNF-α(20ng/ml)一同加入。对于对照样品，加入含3ng/ml bFGF的新鲜介质(含2％FBS)。接着进行诱导(24小时)，玻片用PBS冲洗两次，随后在4℃安装在新鲜的4％甲醛/PBS中25分钟。玻片用PBS冲洗，在0.2％Triton X-100/PBS中在冰上透化处理细胞5分钟，然后在室温用新鲜PBS冲洗两次，每次5分钟。如下述实施TUNEL检测。

TUNEL检测如在ApoAlert DNA片段化检测工具使用手册(美国加利弗尼亚州Palo Alto克隆技术)中所描述的实施，除了碘化丙锭(美国密苏里州圣路易斯，Sigma)的终浓度是1μg/ml。检测后，加入一滴抗褪色溶液，玻片的治疗部分用玻璃盖片覆盖，边缘用透明指甲油密封。玻片立即置于配有绿荧光(520nm)和红荧光(＞620nm)双滤光片的荧光显微镜下观察。使用数码显微镜(Nikon显微摄像-SA)摄像，并使用1.1.02版本的SPOT软件处理。对于正对照物(TNF-α)，选取5个随机区域，对于样品，选取15个随机区域。然后计数每个区域的红色细胞和绿色细胞的量，(在给定区域内确定绿色细胞除以红色细胞量的百分比)。然后计算不同区域的平均值(用S.E.M)。

对于在悬浮液中的细胞，飘浮细胞通过在4℃在300xg下离心作用收集。将旧介质吸干，细胞重新悬浮到500ml PBS(PH7.4)中。细胞再次离心，将PBS除去，沉淀粒子重新悬浮在75ml新鲜PBS中。使用干净的玻片，将重悬浮的细胞铺在聚-L-赖氨酸涂覆的玻片(Jersey实验室提供)上。通过在4℃将玻片浸没在新鲜的4％甲醛/PBS中25分钟，将细胞固定。剩余步骤如上所述实施。

在存在酶TdT的情况下，在绿荧光下用内抑制素和TNF-α治疗的玻片显示大量的正细胞，而在对照物中没有观察到正细胞。在没有酶的情况下，用内抑制素治疗的玻片显示背景细胞荧光。

计数在若干区域内的细胞程序死亡的细胞数量，细胞程序死亡细胞的百分比(绿色细胞除以每区域的红色细胞量)在图23中标绘出，图23这柱状图。在对照细胞中的细胞程序死亡率是1.24％。在用内抑制素治疗的细胞中，在悬浮细胞中观察到细胞程序死亡率增加到30倍(38.3％)，而在附着细胞中观察到细胞程序死亡率增加到15倍(19.4％)。使用TNF-α时，细胞程序死亡率是6.4％。相反，在抗血管生成素治疗的BCE(牛肾上腺皮层毛细管内皮细胞)细胞中TUNEL-正性百分比为2％，当与对照细胞(1.2％)相比时，有1.6倍增加，说明内抑制素是比抗血管生成素更强的细胞程序死亡试剂。

实例16：通过Western印迹分析Bc-1和Bax表达

将C-PAE细胞()接种在10cm的培养皿上，培养皿上育涂覆纤维结合蛋白(10μg/ml)和含3ng/ml的bFGF的2％FBS。加入10μg/ml浓度的内抑制素，收获治疗后12，24和28小时的细胞。细胞用PH为7.4的PBS缓冲液冲洗三次，细胞重新悬浮在1ml含新鲜加入的完全蛋白酶抑制剂片(BoerhingerMannheim)，100mg/ml Pefabloc，1mg/ml抑肽素的1X EBC缓冲液(50mM Tris-Hcl，PH 8.0，120mM氯化钠，1％NonidetP-40)。在整个细胞裂解液中的蛋白质浓度通过BCA法测定。将30mg整个细胞提取物加样到415％梯度聚丙烯酰胺凝胶上。使用半干转移印迹设备(美国加利弗尼亚州Hercules，BioRad)实施转移。将膜封闭在含5％脱脂干奶的冲洗缓冲液(1×TBS)中，并在37℃温育1小时。从Santa Cruz生物技术(美国加利弗尼亚州Santa Cruz)购买人类Bcl-2(N-19){sc-492-G}的直接羊抗体。从相同的制造商购买Bax(B-9){sc7490}和Bcl-XS/L{sc1690}的亲和提纯鼠多克隆抗体。多克隆抗-肌动蛋白抗体(美国密苏里州圣路易斯，Sigma)用来标准化蛋白质加样。二级抗体是与辣根过氧化物酶(美国伊力诺斯州，ArlingtonHeights，Amersham公司)缀合的抗山羊，鼠和兔子免疫球蛋白。使用加强的化学发光试剂(美国伊力诺斯州，Rockford，Pierce化学公司)检测免疫反应性。使用平床扫描仪(Scan-Jet 4C)扫描影像，并使用NIH影像软件定量影像。通过用每个试验内的Bcl-2信号除以肌动蛋白信号实施正态化。

抗-细胞程序死亡成员如Bcl-2和Bcl-X_L预防PCD对多数刺激剂反应。相反地，促-细胞程序死亡蛋白质如Bax和Bak能加速细胞死亡；在某些情况下，它们足以致使细胞程序死亡而与其他信号无关。内抑制素治疗细胞的及对照物C-PAE细胞的整体细胞体提取物进行Bcl-2和Bax表达水平检测。在生长滞留C-PAE细胞中，Bcl-2表达水平高。其保持相对一致达28小时。相反，内抑制素治疗的细胞表现Bcl-2的明显减少，如图24A中所示。光密度检测显示与对照细胞相比，在治疗后12，24和28小时Bcl-2的量为减少1.2，1.5，和3倍，使用肌动蛋白含量作为正态化对照物。相反，对照物和治疗培养物之间Bax表达相似(图24B)。

在NIH3T3和IMR-90细胞中没有检测到Bcl-2蛋白质。在这些细胞系中Bax表达水平不受内抑制素治疗的影响，如在图25A和25B中所示。在C-PAE细胞中，在早期时间点(12小时)，Bcl-2量减少2倍，而在NIH3T3细胞中它的表达不变(图25C和图25D)。有趣的是，我们在C-PAE细胞中仅检测到Bcl-X的大分子促细胞程序死亡形式，而在NIH3T3细胞中大分子和小分子形式都检测到了。

这些发现表明，内抑制素通过改变Bcl-2的表达来发挥其调节活性。有趣地，VEGF已显示出增加内皮细胞中Bcl-2含量。因为内抑制素拮抗VEFG的增殖作用，Bcl-2显示为一个调节点。最近的研究表明Bc-2蛋白质与其他蛋白质结合，如Bax，BclXS，Bik，和Bad，最终加强细胞存活(Newton，K，和Strasser，A(1998)，Curr.Opin.Genet，Dev.8：68-75；Jacobson，M.D.(1997)，Curr，Biol7：R277-81)。另一种Bcl-2同系物的功能，Bax的功能还没有解开。Bcl-2和Bcl-X_L通过Bax的异二聚化作用发挥功能，过量表达Bax加速细胞程序死亡。最近，有显示FGF-2通过与BCL-2有关和无关的机制抑制内皮细胞的细胞程序死亡。在我们的研究中，我们确实在内抑制素治疗的培养物中观察到Bcl-2(和Bcl-X_L)表达的不同。但没有观察到Bax量的不同。这可能说明Bcl-2作用与Bax无关，如T细胞所显示的。等同物

虽然本发明用其较好的具体实施进行了具体的显示及描述，但此领域中的技术人员应该理解的是，在没有背离如所附权利要求书所限定的本发明精神和范围的条件下，可以有各种形式及细节上的不同的改变。

Claims

1．一种分离的抗血管生成肽，其中分离的肽的C-末端包括氨基酸序列SYIVLCIE。

2．一种分离的EM1，其包括突变的内抑制素蛋白质，其中从内抑制素的C末端包括9个连续氨基酸的缺失，其中分离的EM1的特点在于具有抗血管生成活性。

3．依据权利要求2的分离的EM1，其中分离的EM1的C-末端包括氨基酸序列SYIVLCIE。

4．依据权利要求2的分离的EM1，其中9个连续氨基酸的缺失包括氨基酸序列NSFMTSFSK。

5．依据权利要求1的分离的多核苷酸，包括：

(a)SEQ ID NO：的核苷酸序列；

(b)与SEQ ID NO：的核苷酸序列互补的序列；

(c)在严格条件下与SEQ ID NO：的核苷酸序列杂交的序列。

6．分离的多核苷酸，包括由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的引物扩增的核苷酸序列。

7．依据权利要求3的分离的多核苷酸，其中多核苷酸与表达控制序列实施连接。

8．用权利要求7的多核苷酸转化的宿主细胞。

9．依据权利要求8的宿主细胞，其中细胞是从包括细菌，酵母，哺乳动物昆虫或植物的细胞中选取的。

10．一种制备由权利要求3的多核苷酸编码的蛋白质的方法，其中方法包括：

(a)生长用权利要求3的多核苷酸转化的宿主细胞的培养物，其中宿主细胞是从包括细菌，酵母，哺乳动物，昆虫或植物的细胞中选取的；

(b)从培养物中提纯蛋白质；

从而制备由权利要求3的多核苷酸编码的蛋白质。

11．一种融合蛋白质，其包括两种或多种蛋白质分子，并进一步包括权利要求3的EM1。

12．依据权利要求11的融合蛋白质，进一步包括至少一种蛋白质分子是从包括静息蛋白，内抑制素，抗血管生成素，apomigren，和EM1的组中选取的。

13．一种组合物，其包括作为生物活性组分的权利要求3的EM1。

14．根据权利要求13的组合物，和药用-相容的载体。

15．一种组合物，其包括作为生物活性组分的权利要求11的融合蛋白质。

16．一种组合物，其包括作为生物活性组分的权利要求12的蛋白质。

17．一种抑制哺乳动物组织中的血管生成活性的方法，该方法包括用包括权利要求3的EM1的组合物接触组织。

18．一种使用权利要求17的组合物治疗疾病的方法，该方法包括给患有特点在于血管生成活性的疾病的患者服用组合物。

19．依据权利要求18的方法，其中疾病是从下列疾病中选取的包括：与血管生成有关的癌症，良性肿瘤，风湿性关节炎，牛皮癣，视觉血管生成疾病，Osler-Webber症，心肌血管生成，空斑新血管生成，毛细血管扩张，血友病关节，血管纤维瘤，伤口粒化，肠粘连，动脉硬化，硬皮病，疤痕肥大，猫抓痕症，Heliobacter pylori溃疡，透析性移植脉管管路狭窄，避孕，肥胖。

20．依据权利要求19的方法，其中疾病是癌症。

21．依据权利要求20的方法，其中疾病是肾癌症。

22．一种使用包括权利要求3的分离的EM1的组合物诱导细胞或组织内细胞程序死亡的方法，该方法包括用组合物接触细胞或组织。

23．一种使用权利要求13到16的任何组合物治疗疾病的方法，该方法包括给患有特点在于血管生成活性的疾病的患者服用组合物。

24．依据权利要求23的方法，其中疾病是癌症。

25．依据权利要求24的方法，其中疾病是肾癌症。

26．一种提供哺乳动物EM1蛋白质的方法，该方法包括将哺乳动物细胞引入到人类体内，所说的哺乳动物细胞已在体外进行了将编码含EM1的氨基酸序列的多核苷酸插入到其中的处理，并在所说的哺乳动物体内表达治疗上有效量的EM1蛋白质。

27．依据权利要求26的方法，其中细胞是淋巴细胞。

28．依据权利要求27的方法，其中淋巴细胞从T-淋巴细胞和B-淋巴细胞中选取。

29．依据权利要求26的方法，其中细胞从下列中选取包括：血细胞，TIL细胞，骨髓细胞，脉管细胞，肿瘤细胞，肝脏细胞，肌肉细胞，成纤维细胞。

30．依据权利要求26的方法，其中多核苷酸通过滤过性病毒载体插入到细胞中。

31．一种制备分离的多核苷酸的方法，该方法包括的步骤有：

(a)制备一种或多种多核苷酸探针，在中度严格条件下与从下列核苷酸序列中选取的序列杂交：

(ⅰ)SEQ ID NO：1，从核苷酸1到核苷酸525；

(ⅱ)编码含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，从氨基酸1到氨基酸175的蛋白质的分离的多核苷酸；

(b)将所说的探针与哺乳动物DNA杂交；

(c)分离用探针探测的DNA多核苷酸；

其中分离的多核苷酸的核苷酸序列与SEQ ID NO：1的核苷酸序列，从核苷酸1到核苷酸525对应。

32．依据权利要求31制备的分离的多核苷酸。

33．分离的多核苷酸，其包括权利要求32的多核苷酸。

34．权利要求2的分离的抗血管生成内抑制素突变体片段的抗体。

35．权利要求2的EM1的分离的突变体，衍生物，类似物或同系物。