发明内容
本发明的目的是提供一种Endostatin突变体、Endostatin突变体与聚乙二醇的交联物以及它们的应用。
本发明要求保护将Endostatin自N末端第1位氨基酸残基和第3位氨基酸残基突变为其它氨基酸残基得到的蛋白质(Endostatin突变体);所述Endostatin是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列1自N末端第2-184位氨基酸残基组成的蛋白质;(b)将(a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与新生血管形成相关的由其衍生的蛋白质。所述其它氨基酸残基为含羧基的氨基酸残基、含氨基的氨基酸残基、含酰胺基的氨基酸残基或含苯环的氨基酸残基。所述Endostatin突变体具体可为如下(c)或(d):(c)由序列表中序列3自N末端第2-184位氨基酸残基组成的蛋白质;(d)由序列表中序列5自N末端第2-184位氨基酸残基组成的蛋白质。
本发明还保护含有所述Endostatin突变体的蛋白质,具体可为如下(e)或(f):(e)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质;(f)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
本发明还保护所述Endostatin突变体与聚乙二醇的交联物。
本发明还保护含有所述Endostatin突变体的蛋白质与聚乙二醇的交联物。
所述交联物的制备方法如下:所述Endostatin突变体(或含有所述Endostatin突变体的蛋白质)与单甲氧基聚乙二醇丙醛反应,得到交联物。
所述交联物的制备方法具体如下:取蛋白浓度为2mg/ml的所述Endostatin突变体(或含有所述Endostatin突变体的蛋白质)的溶液,加入单甲氧基聚乙二醇丙醛并使其浓度为10g/L,加入NaHBCN并使其浓度为20mM,室温放置4小时,得到含有交联物的溶液。
本发明还保护所述Endostatin突变体、含有所述Endostatin突变体的蛋白质、或所述交联物在制备抑制和/或阻断新生血管的生成的药物中的应用。
本发明还保护一种抑制和/或阻断新生血管的生成的药物,其活性成分为所述Endostatin突变体、含有所述Endostatin突变体的蛋白质、或所述交联物。
所述新生血管具体可为视网膜新生血管和/或脉络膜新生血管。
本发明还保护所述Endostatin突变体、含有所述Endostatin突变体的蛋白质、或所述交联物在制备抑制内皮细胞迁移的药物中的应用。
本发明还保护一种抑制内皮细胞迁移的药物,其活性成分为所述Endostatin突变体、含有所述Endostatin突变体的蛋白质、或所述交联物。
所述内皮细胞具体可为HMEC细胞。
以上任一所述的单甲氧基聚乙二醇丙醛的参数具体如下:分子量为2万,分散度<1.05。
Endostatin是一种人体本身具有的内源性血管抑制剂,其全身给药型肿瘤治疗药物恩度已在市场上广泛应用,安全性明显优于外源性血管抑制剂药物贝阀单抗。本发明构建了Endostatin N末端Histidine突变体,试验中发现Histidine N末端突变体锌离子结合明显下降,但其稳定性没有明显变化,且活性有提高。另外,突变后,其N末端失去了肽酶D的作用位点,有助于提高N末端PEG或是其他物质修饰的稳定性。因N端突变造成了Endostatin酶切位点的改变,在突变的Endostatin N末端进行PEG修饰,其稳定性增强。修饰产物在眼部球内注射后的半衰期为15天,可实现每月或是每2-3月给药一次,更利于眼科球部注射的治疗。
实施例1、M-ES蛋白和W-ES蛋白的制备
一、M-ES蛋白和PEG-M-ES的制备
1、合成序列表的序列4所示的双链DNA分子并插入载体pET-30a(+)的NdeI和EcoRI酶切位点,得到重组质粒。
2、将步骤1得到的重组质粒导入大肠杆菌DH5α,得到重组菌。
3、将步骤1得到的重组菌接种至LB液体培养基,37℃、230rpm振荡培养至OD600=0.5-0.8,加入IPTG并使其浓度为0.5mM,然后37℃、230rpm振荡培养4h,然后8000rpm离心5min并收集菌体,用含150mM NaCl的Tris-HCl缓冲液(pH9.0、50mM)悬浮菌体(5ml溶液/g湿菌体)并进行超声破碎(功率200W,每超声3秒停3秒,总时间为20min),然后12000rpm离心10min,取沉淀(包涵体)。
4、取步骤3得到的沉淀,按照1g:10mL的比例加入溶解液(溶剂为水,含6M盐酸胍、50mM Tris-HCl、20mM DTT,pH9.0),室温静置10h,然后12000rpm离心20min,取上清液。
5、取步骤4得到的上清液,装入透析袋中,在透析液(溶剂为水,含5mM Tris-HCl、2mM GSSG、0.2mM GSH,30mM环糊精,10mM甘氨酸,pH7.5)中4℃透析8小时,然后12000rpm离心20min,取上清液。
6、取100毫升步骤5得到的上清液,进行阴离子交换层析。
采用HiTrapQHP型阴离子交换层析柱,柱子长度为5cm,内径为1.6cm,采用的流动相为50毫升Tris-HCl缓冲液(pH8.5、50mM),收集全部的穿透液。
7、取步骤6得到的穿透液,采用超滤浓缩管(蛋白截留分子量为3KD)进行浓缩,得到蛋白浓度为2mg/ml的浓缩液,即为M-ES溶液。
M-ES溶液的SDS-PAGE图谱见图1的泳道1,Marker的分子量顺序(自下至上):14.4、18.4、25、35、45、66.2、116.0KDa。回收目标带并测序,测序结果表明,N端前10个氨基酸残基如序列表的序列3自N端第1至10个氨基酸残基所示。
8、取步骤7得到的M-ES溶液,加入单甲氧基聚乙二醇丙醛并使其浓度为10g/L,加入NaHBCN(一种还原剂,使修饰反应形成的双键还原为单键后更稳定)并使其浓度为20mM,室温放置4小时,采用阳离子柱层析,收集100mM NaCl洗脱组分,得到PEG-M-ES溶液。
二、W-ES蛋白和PEG-W-ES的制备
用序列表的序列2所示的双链DNA分子代替序列表的序列4所示的双链DNA分子,其它同步骤一。得到W-ES溶液和PEG-W-ES溶液。
实施例2、性能比较
一、锌离子结合实验
将实施例1制备的M-ES溶液用Tris-HCl缓冲液(pH7.4、5mM)稀释至蛋白浓度为1μM,得到M-ES待测液。在M-ES待测液中加入EDTA和ZnCl2(使EDTA和ZnCl2的浓度均为100μM),室温静置10小时,然后用Tris-HCl缓冲液(pH7.4、5mM)充分透析,然后用原子吸收光谱仪检测锌离子含量。
将实施例1制备的W-ES溶液用Tris-HCl缓冲液(pH7.4、5mM)稀释至蛋白浓度为1μM,得到W-ES待测液。在W-ES待测液中加入EDTA和ZnCl2(使EDTA和ZnCl2的浓度均为100μM),室温静置10小时,然后用Tris-HCl缓冲液(pH7.4、5mM)充分透析,然后用原子吸收光谱仪检测锌离子浓度。
进行五次重复实验,结果取平均值。
结果见表1。结果表明,与W-ES蛋白相比,M-ES蛋白结合锌离子的能力大大降低。
表1锌离子含量检测结果
|
锌离子浓度(μM) |
锌离子/蛋白(摩尔比) |
W-ES待测液 |
0.97±0.07 |
0.97 |
M-ES待测液 |
0.18±0.03 |
0.18 |
二、稳定性实验
取实施例1制备的PEG-M-ES溶液,用Tris-HCl缓冲液(pH8.0、10mM)作为溶剂制备蛋白浓度为1mg/ml的PEG-M-ES待测液,过滤除菌后分装于灭菌的西林瓶中。将过滤除菌后的PEG-M-ES待测液37℃静置,分别于0时刻、7天后和15天后取样,进行SDS-PAGE。
取实施例1制备的PEG-W-ES溶液,用Tris-HCl缓冲液(pH8.0、10mM)作为溶剂制备蛋白浓度为1mg/ml的PEG-W-ES待测液,过滤除菌后分装于灭菌的西林瓶中。将过滤除菌后的PEG-W-ES待测液37℃静置,分别于0时刻、7天后和15天后取样,进行SDS-PAGE。
采用上海天能公司Tanon-2500(R)仪器自带软件扫描目标带和降解带的信号,降解率=降解带的信号/(降解带的信号+目标带的信号)×100%。
进行五次重复实验,结果取平均值。单次实验的SDS-PAGE图谱见图2。
结果见表2。结果表明,PEG-M-ES的PEG降解率显著低于PEG-W-ES的PEG降解率,即M-ES蛋白的N端更稳定。
表2降解率的结果(%)
|
7天 |
15天 |
PEG-W-ES待测液 |
5.07±0.23 |
8.98±0.21 |
PEG-M-ES待测液 |
0.04±0.03 |
0.05±0.03 |
三、对肽酶D的稳定性实验
取实施例1制备的M-ES溶液,用Tris-HCl缓冲液(pH8.0、10mM)作为溶剂制备浓度为2mg/ml的M-ES待测液。将3ml M-ES待测液与3ml50μg/ml的肽酶D溶液混匀,室温孵育,分别于10min、20min、30min、60min、90min、120min、150min和180min后取样。向500μl取样得到的样品加入50μl冰醋酸终止反应,然后取50μl,通过HPLC法检测酶切率。
取实施例1制备的W-ES溶液,用Tris-HCl缓冲液(pH8.0、10mM)作为溶剂制备浓度为2mg/ml的W-ES待测液。将3ml W-ES待测液与3ml50μg/ml的肽酶D溶液混匀,室温孵育,分别于10min、20min、30min、60min、90min、120min、150min和180min后取样。向500μl取样得到的样品加入50μl冰醋酸终止反应,然后取50μl,通过HPLC法检测酶切率。
色谱柱为纳微科技的UniSil5-120C18(4.6×250mm),货号QCS131109。溶液A:0.1%TFA水溶液;溶液B:0.1%TFA乙腈溶液。液相色谱条件:流动相为溶液A和溶液B的混合液,流速为1.0ml/min;在25分钟内流动相由15%溶液B(85%溶液A,体积比)线性上升至75%溶液B(25%溶液A,体积比);检测器波长为280nm;柱温为25℃。本段中的%均代表体积比。酶切率等于代表酶切后片段的峰的峰面积除以全部峰的峰面积。
某个样本的谱图见图3。
进行五次重复实验,结果取平均值。
结果见表3。结果表明,与W-ES蛋白相比,M-ES蛋白对肽酶D的稳定性更好。
表3酶切率检测结果(%)
|
10min |
20min |
30min |
60min |
90min |
120min |
150min |
180min |
W-ES |
18.79 |
30.47 |
41.60 |
59.52 |
70.26 |
78.35 |
84.17 |
88.65 |
M-ES |
0.07 |
0.05 |
0 |
0 |
0.11 |
0.08 |
0.03 |
0 |
四、对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的抑制实验
分别取实施例1制备的M-ES溶液、PEG-M-ES溶液或W-ES溶液,用生理盐水调整至所需浓度。
将鸡蛋种蛋放入孵化箱(37℃±0.5℃),气室向上,每天转动2-3次。第7天,在透射灯下观察并确定CAM,用牙科钻在气室顶端开1-2mm小孔。在胚头前1cm、两条卵黄静脉之间的卵壳投影部分,用铅笔勾画出1.5cm×2cm区域,用碘酒及酒精消毒后用砂轮在蛋壳表面划刻出1mm凹痕,滴少量生理盐水于凹痕内。将无菌的直径为6mm的微孔滤膜放在CAM的血管最少处,在微孔滤膜中央加入15μl待测溶液(待测溶液分别为:5μg/ml的PEG-M-ES溶液、20μg/ml的PEG-M-ES溶液、40μg/ml的PEG-M-ES溶液、5μg/ml的M-ES蛋白溶液、20μg/ml的M-ES蛋白溶液、40μg/ml的M-ES蛋白溶液、20μg/ml的W-ES蛋白溶液和生理盐水),然后用封口胶封闭窗口,继续培养3天。滴入10%福尔马林固定20min,以滤膜为中心剪下约3.5cm×3.5cm的尿囊膜,平铺于平皿中展开,晾干,置于显微镜下观察,记录以滤膜为中心、直径5mm范围内的血管数目(Blood vessel number,BVN)。计算血管抑制率(Inhibition rate,IR)。
血管抑制率=(生理盐水组的血管数-实验组的血管数)÷生理盐水组的血管数×100%。
进行五次重复实验,结果取平均值。
结果见表4。结果表明,与W-ES蛋白相比,M-ES蛋白的血管抑制率更高,PEG-M-ES的血管抑制率相对于M-ES蛋白进一步提高。
表4血管数和血管抑制率的结果
|
浓度(μg/ml) |
血管数 |
血管抑制率(%) |
生理盐水 |
|
79.49±3.51 |
0 |
PEG-M-ES |
5 |
69.20±2.37* |
12.9 |
PEG-M-ES |
20 |
40.83±6.35*# |
48.6 |
PEG-M-ES |
40 |
24.19±2.38* |
69.6 |
M-ES |
5 |
70.41±3.76* |
11.4 |
M-ES |
20 |
42.00±1.96*# |
47.2 |
M-ES |
40 |
25.57±5.11* |
67.8 |
W-ES |
20 |
58.72±4.92* |
26.1 |
注:*与生理盐水组比较P<0.01,#与W-ES组比较P<0.01。
五、对HMEC迁移抑制实验
分别取实施例1制备的M-ES溶液、PEG-M-ES溶液或W-ES溶液,用生理盐水调整至所需浓度。待测溶液分别为1μg/ml的PEG-M-ES溶液、16μg/ml的PEG-M-ES溶液、160μg/ml的PEG-M-ES溶液、1μg/ml的M-ES蛋白溶液、16μg/ml的M-ES蛋白溶液、160μg/ml的M-ES蛋白溶液、16μg/ml的W-ES蛋白溶液和生理盐水,各个溶液采用的溶剂均为生理盐水。
1、取第一个24孔板,每孔加入80μl待测溶液和920μl含0.5%FBS、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM高糖培养液。
2、取HMEC细胞,用0.25%胰蛋白酶-EDTA37℃消化1分钟,取细胞,用100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM高糖培养液重悬,得到8×105个细胞/ml的细胞悬液。
3、取第二个24孔板,其上放置24孔Transwell小室(8μm孔径,Millipore),每个小室加入184μl步骤2得到的细胞悬液和16μl待测溶液,37℃孵育1小时。
4、完成步骤3后,取Transwell小室,置于完成步骤1的24孔板上,在37℃、5%CO2培养箱中孵育4小时。
5、用Triple消化液(Invitrogen)作为溶剂,制备浓度为1μg/ml的Calcein-AM溶液。
6、取第三个24孔板,每孔加入950μl Calcein-AM溶液。
7、完成步骤4后,取Transwell小室,吸弃液体后放入完成步骤6的24孔板中,孵育25分钟。
8、取完成步骤7的24孔板,轻轻摇晃几次,并轻轻敲打顶部与边缘,再孵育10分钟,轻轻摇晃几次,取出Transwell小室,用移液枪吹打混匀24孔板的各孔中的细胞,每孔取出200μl细胞悬液至96孔板中,以酶标仪检测各孔的荧光强度(激发波长为485nm,发射波长为500-550nm之间的峰值)。
抑制率=(生理盐水组的荧光强度-实验组的荧光强度)÷生理盐水组的荧光强度×100%。
进行五次重复实验,结果取平均值。
结果见表5。结果表明,经PEG修饰后的M-ES活性较修饰前没有降低,与W-ES相比活性明显升高。此结果与鸡胚绒毛尿囊膜试验结果类似。
表5荧光强度的结果
样品 |
浓度(μg/ml) |
荧光值 |
抑制率(%) |
生理盐水 |
0 |
487.3±170.0 |
0 |
PEG-M-ES |
1 |
405.0±161.9* |
16.9 |
PEG-M-ES |
16 |
265.3±100.3*# |
45.6 |
PEG-M-ES |
160 |
94.0±24.4* |
80.7 |
M-ES |
1 |
415.4±127.5* |
14.8 |
M-ES |
16 |
282.9±110.7*# |
41.9 |
M-ES |
160 |
99.2±18.6* |
79.6 |
W-ES |
16 |
350.69±124.71* |
28.0 |
注:*与生理盐水组比较P<0.01,#与W-ES组比较P<0.01。
六、对鼠视网膜新生血管模型治疗效果的比较
分别取实施例1制备的M-ES溶液或PEG-M-ES溶液,用生理盐水调整至所需浓度。待测溶液分别为5mg/ml的PEG-M-ES溶液、5mg/ml的M-ES溶液。
1、OIR模型(Oxygen-induced retinopathy,氧诱导视网膜病变动物模型)
(1)生后第7天的C57BL/J6乳鼠随同母鼠放置到连接测氧仪的动物实验舱中,75%±2%氧气放置5天。
(2)取出乳鼠(乳鼠出生12天),立即用水合氯醛麻醉,眼表滴用麻药(奥布卡因滴眼液)及散瞳剂(复方托品酰胺滴眼液),待瞳孔散大后玻璃体腔注射待测溶液,双眼注射,每只眼的注射量为1.5微升。
(3)取乳鼠(乳鼠出生17天),进行荧光素葡聚糖灌注视网膜铺片检测。
经心脏将分子量为2×106的Fluorescein-dextran-FITC(Sigma,St.Louis,MO,配制方法:50mg Fluorescein-dextran-FITC溶于1ml PBS缓冲液中)注射入左心室20mg。
(4)取出小鼠眼球放置于4%多聚甲醛溶液中室温固定30分钟,取出视网膜,在解剖显微镜下进行视网膜铺片,荧光显微镜(Zeiss Axiophot,Thornwood,NY)进行观察并照相,无血管灌注区面积应用ImageJ软件进行分析统计,得到血管内皮细胞核数。
以步骤(2)中用等体积生理盐水代替待测溶液的处理作为模型对照组(OIR);以步骤(1)中不进行“75%±2%氧气放置5天”且步骤(2)中用等体积生理盐水代替待测溶液的处理作为正常对照组(Normal),其无血管灌注区面积为0。
每组设置9只乳鼠,结果取平均值。
抑制率=1-(给药组血管内皮细胞核数)/OIR组血管内皮细胞核数。
照片见图4。各组的血管内皮细胞核数见图5。结果表明:PEG-M-ES与M-ES对视网膜无血管灌注区的抑制率相似,均达到75%左右。
2、CNV小鼠动物模型(choroidal neovascularization,脉络膜新生血管小鼠动物模型)
(1)6-8周C57BL/6J小鼠(体重为20-25g)经氯胺酮腹腔麻醉。
(2)用复方托品酰胺滴眼液对小鼠双眼进行散瞳,同时眼表滴用麻药奥布卡因滴眼液。
(3)将盖玻片置于散瞳后的小鼠眼睛前用于压平角膜,随后将小鼠放置于激光机前行激光视网膜光凝,采取的激光诱导CNV模型的激光参数为532nm、150mW、100ms、50mm,当激光在视网膜上诱导出点状爆破后即刻停止激光。
(4)在激光诱导CNV的即刻,进行玻璃体腔药物注射,玻璃体腔注射待测溶液,双眼注射,每只眼的注射量为2微升。
(5)14天后对小鼠进行眼底荧光造影(麻醉后腹腔注射荧光素钠造影剂0.03ml),测量CNV的大小及渗漏的面积,测量仪器为PhoenixMicron IV小动物眼底成像系统,CNV大小及渗漏面积应用ImageJ软件进行分析统计。
以步骤(4)中用等体积生理盐水代替待测溶液的处理作为模型对照组(其相对CNV面积定义为1);以步骤(3)中不进行激光视网膜光凝且步骤(4)中用等体积生理盐水代替待测溶液的处理作为正常对照组,其相对CNV面积为0。
每组设置10只乳鼠,结果取平均值。
抑制率=1-(给药组相对渗漏面积/模型对照组相对渗漏面积)。
照片见图6。相对渗漏面积结果见图7。结果表明:PEG-M-ES与M-ES对脉络膜新生血管的抑制率相似,均为51%左右。
七、M-ES-PEG和W-ES-PEG在家兔眼球内注射药代半衰期的比较
分别取实施例1制备的M-ES溶液或PEG-M-ES溶液,用生理盐水调整至所需浓度。待测溶液分别为5mg/ml的PEG-M-ES溶液、5mg/ml的M-ES溶液。
1、成年雌性新西兰兔(体重为2-2.5kg,中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心)经速眠新腹腔麻醉。
2、用复方托品酰胺滴眼液对新西兰兔双眼进行散瞳,同时眼表滴用奥布卡因滴眼液。
3、用胰岛素注射器行玻璃体腔注射,双眼注射,每只眼注射50μl待测溶液,棉签按压5秒。
4、取材时间点为:0h,12h,24h,2天,6天,12天,45天。耳缘动脉取血、耳静脉注射空气处死后取前房水每眼约0.1ml、玻璃体0.4ml、以及视网膜分别装于1.5mlEppendrof管,4℃保存。
5、采用Endostatin ELIA试剂盒(R&D公司)检测血药浓度,并计算药代参数。
结果见表6和图8。PEG-M-ES半衰期达到14.67天,且在第45天血药浓度仍为有效浓度。因此可实现每月甚至每45天给药一次,方便患者使用。
表6药代动力学参数的结果
房室参数 |
M-ES |
PEG-M-ES |
T1/2(d) |
0.94 |
14.67 |
Ke(1/d) |
0.737 |
0.047 |
V1/F(L/kg) |
0.009 |
0.015 |
CL/F(L/d/kg) |
0.007 |
0.001 |
AUC(0-t)(μg/L*d) |
145446.445 |
1362757.32 |
AUC(0-∞)(μg/L*d) |
145446.449 |
1387366.32 |
Ka(1/d) |
0.738 |
0.052 |
t1/2Ka(d) |
0.939 |
13.412 |
Tlag(d) |
0 |
39.019 |
用序列6所示DNA分子代替序列4所示DNA分子依次进行实施例1和实施例2,结果与序列4的结果一致。