CN101265298A - 含有非天然氨基酸的内皮抑素突变体及其衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有非天然氨基酸的内皮抑素突变体及其衍生物，特别是涉及使用原核表达系统，在不影响其活性的前提下，表达了可溶性的带有非天然氨基酸的内皮抑素。这种内皮抑素突变体被赋予了新的化学性质，可以特异性的通过非天然氨基酸的侧链与其它分子形成共价连接。

Description

含有非天然氨基酸的内皮抑素突变体及其衍生物

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及一种含有非天然氨基酸的内皮抑素突变体及其衍生物，利用内皮抑素突变体中含有的非天然氨基酸可以使其与其它分子形成特异性的共价连接。

背景技术

血管生成是一个包括内皮细胞增殖、迁移和分化、细胞外基质降解、微血管形成及芽生新的毛细血管等多个步骤的过程。它对于胚胎发育，器官形成，组织再生以及创伤修复是不可缺少的。同时，血管生成又是导致肿瘤生长和转移的必要条件。内皮抑素是能够抑制内皮细胞增殖的一类血管生成抑制剂，分子量为20KD，能够特异性地抑制内皮细胞的增殖和迁移。研究发现，内皮抑素主要针对增殖迅速的非正常组织的内皮细胞，例如，肿瘤组织内的新生血管生成，因此，内皮抑素具有体内抑制肿瘤血管生成以及抗肿瘤作用。而且，由于内皮抑素是针对不会变异的内皮细胞，且内皮细胞显露于药物的表面，因此，内皮抑素作为抗肿瘤药物还可以克服耐药性和组织毒性。

目前，内皮抑素主要利用原核系统表达。但由于其内部的非极性氨基酸较多，因此在表达过程中极易形成包涵体并且难于复性。而使用酵母表达系统大批量生产分泌形式的重组人内皮抑素生产设备投资巨大，易污染。

除了上述问题外，内皮抑素在临床应用于人体的有效剂量为每天300mg/m²，此剂量对基因工程药物来说是一个很大挑战。而且内皮抑素稳定性差，血浆半衰期短也有碍于临床应用。目前，研究者们主要通过聚乙二醇化来解决内皮抑素在临床使用上存在的问题。但是针对内皮抑素的修饰多为氨基修饰以及N末端修饰，这些修饰方法或者不能定点修饰，使产物性质不均一，或者修饰条件难于控制，获得修饰产物较少且修饰产物不稳定。

本发明提供的技术方案可以将非天然氨基酸定点引入到内皮抑素中，使之可以在原核表达系统中获得可溶性表达，同时，利用带有特殊基团的非天然氨基酸可以和其它分子形成共价结合，达到定点化学修饰的目的。

发明内容

本发明利用可以在内皮抑素非活性位点定点引入非天然氨基酸的原核表达系统在来源于人的内皮抑素内部定点引入了非天然氨基酸——对叠氮基苯丙氨酸和对乙酰基苯丙氨酸，从而实现内皮抑素的定点聚乙二醇化。而且，利用这套表达系统，在大肠杆菌中表达了可溶性的内皮抑素，简化了内皮抑素的复性和纯化步骤。

本发明具体内容为，设计并建立了一套可由大肠杆菌重组表达的，可以在内皮抑素内部定点引入非天然氨基酸的系统，该系统包括来源于Methanococcus jannaschii属的抑制型tRNA(tRNA^Tyr)以及氨酰tRNA合成酶(Mj TyrRs)。两者分别由严紧型质粒pAC-tRNA以及松弛性质粒pBR-TyrRS编码表达。内皮抑素基因经过改造，使非活性位点的氨基酸密码子定点突变为琥珀密码子TAG，然后构建到载体pAC-tRNA上并与pBR-TyrRS共转染大肠杆菌感受态细胞，利用Tet和Amp两种抗生素进行双向筛选，筛选后的单菌落接种于带有两种抗生素的LB培养基扩大培养，添加非天然氨基酸(1mM)和IPTG(1mM)诱导培养后收集菌体，超声破碎，离心取上清，利用亲和层析纯化后即可获得含有非天然氨基酸的内皮抑素。

内皮抑素在大肠杆菌表达系统中为包涵体表达，且难于复性。利用上述表达系统可以实现内皮抑素在原核表达系统中的可溶性表达，获得稳定的内皮抑素突变体。本发明充分利用了系统的定点性，根据内皮抑素的空间结构，选择空间上处于外表的非活性位点，定点引入非天然氨基酸，在不影响活性的前提下实现了定点聚乙二醇化。

表达的突变内皮抑素经过SDS-PAGE，Western-blotting检测确定所纯化产物为内皮抑素，纯化产物分别与带有炔基和酰肼基的荧光胺和生物素反应，证实突变内皮抑素带有非天然氨基酸。经过结构确证之后，利用人脐静脉内皮细胞和牛主动脉内皮细胞在细胞水平上测活，确定突变内皮抑素具有天然内皮抑素的活性。进一步利用本实验室合成的带有炔基的聚乙二醇和带有酰肼基的聚乙二醇定点修饰，获得均一的修饰产物。

附图说明

图1、SDS-PAGE分析：用于鉴定突变内皮抑素的表达。

图2、纯化后的突变内皮抑素SDS-PAGE检测。

图3、Western-blotting分析：用于鉴定突变内皮抑素的表达。

图4、纯化后的突变内皮抑素化学检测：与带有相应化学基团的荧光胺反应后，产物经过SDS-PAGE电泳，在紫外灯下观察荧光情况。

图5、纯化后的突变内皮抑素化学检测：与带有相应化学基团的生物素反应后，产物经过SDS-PAGE电泳，与亲和素结合并且化学显色。

图6、纯化后的突变内皮抑素活性检测。

图7、纯化后的定点聚乙二醇化内皮抑素。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步详述本发明。说明书及实施例中采用的菌株、质粒、化学试剂等，如未加特殊说明均按常规实验条件进行操作，或遵照供应商提供的说明进行操作。

实施例1

内皮抑素中对乙酰基苯丙氨酸的定点引入

非天然氨基酸定点引入系统包括来源于Methanococcus jannaschii属的抑制型tRNA(tRNA^Tyr)以及氨酰tRNA合成酶(Mj TyrRs)，两者分别由严紧型质粒pAC-tRNA以及松弛性质粒pBR-TyrRS编码表达。内皮抑素基因经过以下三个改变：①非活性位点Phe32定点突变为琥珀密码子TAG；②由T7promoter和T7terminator启动表达；③在内皮抑素N末端添加了His6标签。经过以上三个改变的内皮抑素基因构建到载体pAC-tRNA上，命名为pAC-tRNA-ES。pAC-tRNA-ES与pBR-TyrRS共转染感受态细胞DH10B，并涂布带有Tet(10μg/mL)和Amp(100μg/mL)两种抗生素的平板，37℃过夜培养12h。挑取双转化平板上的单菌落接种于带有两种抗生素的LB培养基，37℃摇菌，当菌体浓度达到OD600为1.0时，6000rpm、5min离心收集菌体。收集的菌体用M9培养基洗涤两次转接入GMML基本培养基[1×M9/1mM MgSO₄/0.1mM CaCl₂/8.5mM NaCl/5μM FeSO₄/1％glycerol/0.3mM Leucine]，并加入Tet(10μg/mL)和Amp(100μg/mL)两种抗生素，37℃摇菌培养24h，添加对乙酰基苯丙氨酸(1mM)和IPTG(1mM)诱导培养48h，收集菌体，重悬于pH8.0、0.1M的磷酸钠和20mM咪唑的超声缓冲液超声破碎，离心取上清。表达结果详见附图1。泳道1-3：带有对乙酰基苯丙氨酸的突变内皮抑素的表达；泳道4：培养基内没有添加非天然氨基酸的菌体，无内皮抑素的表达；泳道8：天然内皮抑素的表达；泳道9：标准蛋白Marker。

实施例2

内皮抑素中对叠氮基苯丙氨酸的定点引入

非天然氨基酸定点引入系统包括来源于Methanococcus jannaschii属的抑制型tRNA(tRNA^Tyr)以及氨酰tRNA合成酶(Mj TyrRs)，两者分别由严紧型质粒pAC-tRNA以及松弛性质粒pBR-TyrRS编码表达。内皮抑素基因经过以下三个改变：①非活性位点Phe32定点突变为琥珀密码子TAG；②由T7promoter和T7terminator启动表达；③在内皮抑素N末端添加了His6标签。经过以上三个改变的内皮抑素基因构建到载体pAC-tRNA上，命名为pAC-tRNA-ES。pAC-tRNA-ES与pBR-TyrRS共转染感受态细胞DH10B，并涂布带有Tet(10μg/mL)和Amp(100μg/mL)两种抗生素的平板，37℃过夜培养12h。挑取双转化平板上的单菌落接种于带有两种抗生素的LB培养基，37℃摇菌，当菌体浓度达到OD600为1.0时，6000rpm、5min离心收集菌体。收集的菌体用M9培养基洗涤两次转接入GMML基本培养基[1×M9/1mM MgSO₄/0.1mM CaCl₂/8.5mM NaCl/5μM FeSO₄/1％glycerol/0.3mM Leucine]，并加入Tet(10μg/mL)和Amp(100μg/mL)两种抗生素，37℃摇菌培养24h，添加对叠氮基苯丙氨酸(1mM)和IPTG(1mM)诱导培养48h，收集菌体，重悬于pH8.0、0.1M的磷酸钠和20mM咪唑的超声缓冲液超声破碎，离心取上清。表达结果详见附图1。泳道4：培养基内没有添加非天然氨基酸的菌体，无内皮抑素的表达；泳道5-7：带有对叠氮基苯丙氨酸突变内皮抑素的表达；泳道8：天然内皮抑素的表达；泳道9：标准蛋白Marker。

实施例3

带有非天然氨基酸内皮抑素突变体的分离纯化及其Western-blotting检测

将上述超声上清通过Ni-NTA柱进行分离纯化。先用上述超声缓冲液平衡10个柱体积，然后将上述超声上清上样，分别采用50mM咪唑，100mM咪唑，200mM咪唑，300mM咪唑的pH8.0、0.1M的磷酸钠洗脱液分别洗脱，并用分光光度法检测洗脱物的280nm光吸收，可在200mM咪唑的浓度下，出现一个高的吸收峰。分别进行SDS-PAGE和Western-blotting分析

SDS-PAGE分析：附图1为诱导后的全菌上样电泳图，根据附图1发现，当培养基内部不添加非天然氨基酸时，没有内皮抑素的表达。因此确定所表达的内皮抑素内部带有非天然氨基酸。又因为，内皮抑素基因构建到载体pET28a上的多克隆位点表达，并且以其为模板进行琥珀密码子的突变，因此表达的目的蛋白为23KD。附图2为纯化后的突变内皮抑素SDS-PAGE分析，泳道M：标准蛋白Marker；泳道1：带有对叠氮基苯丙氨酸突变内皮抑素；泳道2：带有对乙酰基苯丙氨酸的突变内皮抑素。

Western-blotting分析：所用一抗为兔抗人内皮抑素多克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，经过DAB显色后，确定表达产物为内皮抑素。详见附图3，泳道1-3：带有对乙酰基苯丙氨酸的突变内皮抑素的表达；泳道4-6：带有对叠氮基苯丙氨酸突变内皮抑素的表达；泳道7：天然内皮抑素的表达。

实施例4

含非天然氨基酸的内皮抑素与带有炔基的荧光胺和带有酰肼基的荧光胺的反应

带有叠氮基团的突变内皮抑素(0.5mg/ml)与带有炔基的荧光胺(1.0mM)在pH8.0的0.1M磷酸缓冲液中反应，反应液中加入1mM CuSO₄，1mg铜作为还原剂，37℃振荡过夜。SDS-PAGE电泳反应产物，在紫外灯下观察荧光情况。

带有乙酰基团的突变内皮抑素(0.5mg/ml)与带有酰肼基的荧光胺(1.0mM)在pH4.0的PBS缓冲液中25℃反应12h，SDS-PAGE电泳反应产物，在紫外灯下观察荧光情况。

详见附图4，泳道1：带有炔基的荧光胺与对叠氮基苯丙氨酸内皮抑素突变体的反应产物；泳道2：带有酰肼基的荧光胺与对乙酰基苯丙氨酸内皮抑素突变体的反应产物；泳道3：带有炔基的荧光胺与天然内皮抑素的反应产物；泳道4：带有酰肼基的荧光胺与天然内皮抑素的反应产物。

实施例5

与带有炔基的生物素和带有酰肼基的生物素的反应

反应条件与实施例4条件相同，反应产物经SDS-PAGE电泳，利用带有辣根过氧化物酶的亲和素与生物素结合，采用化学发光法显色。详见附图5，泳道1：带有炔基的生物素与对叠氮基苯丙氨酸内皮抑素突变体的反应产物；泳道2：带有酰肼基的生物素与对乙酰基苯丙氨酸内皮抑素突变体的反应产物；泳道3：带有炔基的生物素与天然内皮抑素的反应产物；泳道4：带有酰肼基的生物素与天然内皮抑素的反应产物。

实施例6

突变内皮抑素活性检测

制备牛主动脉内皮细胞，培养于含有10％小牛血清的DMEM培养基中。将细胞用0.05％的胰酶消化并悬浮于2％小牛血清的DMEM培养基中，以每孔2000个细胞的浓度接种于96孔培养板中，37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养24h。更换培养基为含有5ng/mL的bFGF(basicfibroblast growth factor)、2％小牛血清的DMEM培养基200μL，并添加不同剂量的内皮抑素突变体。48小时后，加入10μL MTT(100mg/mL)，37℃培养4h，每孔移走180μL的培养基，加入100μL的DMSO，在酶标仪上读取OD570nm的吸光值。

根据MTT所读取的数值分析，内皮抑素突变体与原始内皮抑素活性检测相对比，突变内皮抑素保留了大部分的活性，在Phe32位点内引入的非天然氨基酸——对叠氮基苯丙氨酸以及对乙酰基苯丙氨酸对内皮抑素的活性没有影响。详见附图6，A：对叠氮基苯丙氨酸内皮抑素对牛主动脉内皮细胞的抑制率；B：对乙酰基苯丙氨酸内皮抑素对牛主动脉内皮细胞的抑制率；C：天然内皮抑素对牛主动脉内皮细胞的抑制率。

实施例7

突变内皮抑素的定点聚乙二醇化

带有叠氮基团的突变内皮抑素(5mg/ml)与带有炔基的聚乙二醇(摩尔比1∶10)在pH8.0的0.02M磷酸缓冲液中反应，反应液中加入10mM CuSO₄，10mg铜作为还原剂，37℃振荡过夜。经CM离子交换柱初步纯化后，SDS-PAGE电泳检测反应产物。

带有乙酰基团的突变内皮抑素(0.5mg/ml)与带有酰肼基的聚乙二醇(摩尔比1∶10)在pH4.0的PBS缓冲液中4℃反应24h，经CM离子交换柱初步纯化后，SDS-PAGE电泳检测反应产物。结果见附图7。泳道1：带有乙酰基的突变内皮抑素；泳道2：带有叠氮基的突变内皮抑素；泳道3：带有乙酰基的突变内皮抑素的聚乙二醇化产物；泳道4：带有叠氮基的突变内皮抑素的聚乙二醇化产物。

Claims (9)

1.一种含有非天然氨基酸的重组内皮抑素突变体，其特征为所述的内皮抑素突变体中某一个或几个位点氨基酸突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸选自苯丙氨酸衍生物。

2.权利要求1所述内皮抑素突变体，其特征为内皮抑素来源于人类、小鼠、大鼠。

3.权利要求1所述内皮抑素突变体，其特征为内皮抑素突变体的突变位点为内皮抑素的第6位到第66位序列中的任一位点，或第165位到第179位序列中的任一位点。

4.权利要求1所述内皮抑素突变体，其特征为内皮抑素突变位点为第6位、66位、165位或179位。

5.权利要求1所述内皮抑素突变体，其特征为内皮抑素突变体中所含的非天然氨基酸为对叠氮基苯丙氨酸、对乙酰基苯丙氨酸或连接有半乳糖基的苯丙氨酸。

6.权利要求1所述内皮抑素突变体的衍生物，其特征为内皮抑素突变体通过非天然氨基酸的侧链与高分子聚合物或小分子化学物质形成共价连接。

7.权利要求7所述的内皮抑素突变体的衍生物，其特征为所述高分子聚合物为聚乙二醇、连接有生物素、泛酸、硫辛酸的聚乙二醇、多聚唾液酸。

8.权利要求7所述的内皮抑素突变体的衍生物，其特征为所述小分子化学物质为生物素、泛酸、硫辛酸。

9.权利要求1～9所述内皮抑素突变体及其衍生物用于制备抗肿瘤药物的用途。

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