CN103103173A - 硫酸软骨素酶b融合蛋白、其编码基因以及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了一种硫酸软骨素酶B融合蛋白、其编码基因以及其构建方法。本文提供的硫酸软骨素酶B融合蛋白包括麦芽糖结合蛋白。此外本文还提供了一种纯化硫酸软骨素酶B融合蛋白的方法。另外，本文还涉及一种生产低分子量硫酸软骨素B的方法。

Description

硫酸软骨素酶B融合蛋白、其编码基因以及其构建方法

技术领域

本发明涉及基因工程和发酵工程领域中一种硫酸软骨素酶B融合蛋白及其编码基因以及其构建方法。此外本文还提供一种纯化硫酸软骨素酶B融合蛋白的方法。另外，本文还涉及一种生产低分子量硫酸软骨素B的方法。

背景技术

硫酸软骨素裂解酶(chondroitinase或chondroitin sulfaeyase，以下有时也简称为“ChSase”)是一类能将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和二糖(ΔDi及寡糖的裂解酶。近年来，ChSase作为一种研究机体蛋白聚糖的结构与功能的工具以及作为一种新型药用酶而日益受到人们的重视。硫酸软骨素酶B(以下有时也简称为“ChSase B”)可特异性降解硫酸皮肤素及透明质酸为ΔDi-0s及寡糖。

因ChSase B仅特异性降解硫酸皮肤素(也称为硫酸软骨素B)及透明质酸，所以对该酶的药用价值的研究比较另一种硫酸软骨素酶AC(以下有时也简称为“ChSase AC”)要少一些，但随着研究的深入，发现ChSase B也有着不可忽视的应用价值：在基础理论方面，利用ChSase B可特异性的降解硫酸软骨素蛋白聚糖中硫酸软骨素侧链，许多科研人员通过对机体组织特定部位的硫酸软骨素的降解，并通过该部位硫酸软骨素降解前后功能的改变及降解产物的分析，来了解硫酸软骨素的结果与功能(参见：Shibata S，MiduraRJ，Hascall UC.Structural analysis of the linkage region oligosaccharides andunsaturated disaccharides from chondroitin sulfate using Carbopac PA.J BiolChem，1992，267(10)：6548-6555)。

在临床运用领域，近年来研究非常活跃，研究表明，硫酸软骨素糖胺聚糖与肿瘤细胞的侵入、转移密切相关(参见：Henke CA，Roongta V，MickelsonDJ，et al.CD44-related chondroitin sulfate proteoglycan，a cell surface receptorimplicated with tumor cell invasion，mediates endothelial cell migration onfibrinogen and invasion into a fibrin matrix.J Clin Invest，1996，97(11)：2541-2552)。2001年Denholm EM等发现ChSase B能抑制黑色素瘤血管的形成及瘤细胞的转移与增生等(参见：Denholm EM，Lin YQ，SilverPJ.Anti-tumor activities of chondroitinase AC and chondroitinase B：inhibitionof angiogenesis，proliferation and invasion.Eur J Pharmacol，2001，416(3)：213-221)。

在制药领域，硫酸软骨素是一种具有较强的降血脂作用和缓冲抗凝血作用的物质，临床上主要用于防止冠心病和动脉粥样硬化。目前，对低分子量硫酸软骨素的制备常采用酸水解法、离子交换法和酶解法。前两种方法需要较复杂的实验设备并且会污染环境，比较而言，酶解法需要的条件不高且容易控制，因而具备较大的优势。酶解法的关键在于获得大量的硫酸软骨素裂解酶，其中包括ChSase B的获得。

硫酸软骨素裂解酶分离纯化非常复杂，通常需要经过多步的色谱纯化，收率很低。在分离纯化硫酸软骨素裂解酶中，ChSase B的异源重组表达是替代利用微生物生产ChSase B的可行的方案。然而对ChSase B的异源重组表达研究非常有限，到目前为止国内还没有这方面的报道。只有Pojasek等在E.coil中表达了chsase基因，并分离纯化到活性蛋白，在其研究中所用的载体为pET15b和pCRT7/NT，这两个载体中的融合标签均His-tag。但His-tag存在明显的缺点，即跟亲和载体的亲和力不强，不能增加与之结合蛋白质的可溶性，难以提高纯化效果和蛋白质可溶性比例等。Pojasek的论文中关于His-tag的纯化效果和蛋白可溶性比例等内容均未给出清晰的报道(参见Kevin Pojasek，Zachary Shriver，Patrick Kiley，Ganesh Venkataraman and Ram Sasisekharan.Recombinant Expression，Purification and Kinetic Characterization ofChondroitinase AC and Chondroitinase B from Flavobacterium hparinum.Biochemical and Biophysical Research Communications，2001，286：343-351)。

目前，需要一种简单、方便的方法，通过该方法可以得到具有硫酸软骨素酶B活性的硫酸软骨素酶B替代物，该替代物可以与硫酸软骨素酶B相同地使用。

发明内容

本发明人意外地得到了硫酸软骨素裂解酶替代物-硫酸软骨素酶B融合蛋白，其具有硫酸软骨素酶B的活性，能够用于生产硫酸软骨素，并且硫酸软骨素的生成条件不高、方法简便且容易控制。

本文涉及以下内容：

(1).一种硫酸软骨素酶B融合蛋白，其中融合有硫酸软骨素酶B和麦芽糖结合蛋白。

(2).根据(1)所述的硫酸软骨素酶B融合蛋白，其中所述硫酸软骨素酶B具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸。

(3).根据(1)或(2)所述的硫酸软骨素酶B融合蛋白，其中所述麦芽糖结合蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸

(4).根据(1)～(3)中任一项所述的硫酸软骨素酶B融合蛋白，其中，所述麦芽糖结合蛋白通过肽段连接部分与所述硫酸软骨素酶B连接。

(5).根据(4)所述的硫酸软骨素酶B融合蛋白，其中，所述连接部分具有SEQ ID NO：3所示的序列。

(6).根据(4)所述的硫酸软骨素B融合蛋白，其中所述连接部分连接在SEQ ID NO：1的氨基酸的N端。

(7).根据(1)～(6)中任一项所述的硫酸软骨素融合蛋白B，其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸。

(8).一种硫酸软骨素酶B的替代物，其是(1)～(7)中任一项所述的硫酸软骨素酶B融合蛋白。

(9).一种编码(1)～(7)中任一项所述的融合蛋白的DNA。

(10).一种具有序列表中SEQ ID NO：5所示的碱基序列的DNA。

(11).一种重组载体，其包含(9)或(10)所述的DNA。

(12).一种转化体，其是将(11)所述的重组载体导入宿主细胞而得到的转化体。

(13).一种构建(1)～(7)中任一项所述的硫酸软骨素酶B融合蛋白的方法，包括

(i).提供含麦芽糖结合蛋白的质粒载体；和

(ii).将硫酸软骨素酶B的基因连接到上述质粒载体上。

(14).根据(13)的方法，其中所述硫酸软骨素酶B的N端与通过肽段连接部分与麦芽糖结合蛋白结合。

(15).一种纯化硫酸软骨素酶B融合蛋白的方法，其包括：

a.利用直链淀粉树脂吸附含(1)～(7)中任一项所述的硫酸软骨素酶B融合蛋白的粗产物，以及

b.利用麦芽糖洗脱纯化硫酸软骨素酶B融合蛋白。

(16).根据(15)所述的生产硫酸软骨素酶B融合蛋白的方法，在所述a和b之前，该方法还包括：

提供含麦芽糖结合蛋白的质粒载体；

将硫酸软骨素酶B的基因连接到上述质粒载体上提供重组载体；

将重组载体导入宿主细胞而得到转化体；以及

利用培养基培养该转化体并获得所述含硫酸软骨素酶B融合蛋白的粗产物。

(17).硫酸软骨素酶B融合蛋白的用途，用来代替硫酸软骨素酶B。

(18).一种生产低分子量硫酸软骨素B的方法，其包括：

使用(1)～(7)中任一项所述的硫酸软骨素酶B融合蛋白降解硫酸软骨素B原料来生产低分子量硫酸软骨素B的方法，其中得到的低分子量硫酸软骨素B的分子量为0.5kDa～25kDa。

(19).根据(18)所述的生产硫酸软骨素B的方法，其中，所述得到的硫酸软骨素B的分子量为2～10kDa。

(20).一种硫酸软骨素酶B融合蛋白的用途，用于低分子量生产硫酸软骨素B(硫酸皮肤素)，其中，生产的低分子量硫酸软骨素B(硫酸皮肤素)的分子量为0.5kDa～25kDa。

(21).根据(20)所述的硫酸软骨素酶B融合蛋白的用途，其中，生产的低分子量生产硫酸软骨素B的分子量为2～10kDa。

附图说明

图1为从肝素黄杆菌中PCR扩增得到的硫酸软骨素酶B基因电泳图谱。

图2为转化子PCR验证电泳图谱。

图3为转化子酶切验证电泳图谱。

图4为pMAL-ChSase B在7种不同的大肠杆菌(E.coli)宿主中的表达情况：A表示不同宿主的OD₆₀₀、总蛋白质浓度和酶活，B表示不同宿主的硫酸软骨素酶B融合蛋白的比酶活。

图5为大肠杆菌TB1/pMAL-ChSase B工程菌株表达硫酸软骨素酶B融合蛋白的SDS-PAGE图谱以及为硫酸软骨素酶B融合蛋白通过直链淀粉树脂亲和分离的SDS-PAGE电泳图谱。

图6为E.coli TB1/pMAL-ChSase B的IPTG浓度优化结果：A表示不同IPTG诱导浓度下的OD₆₀₀、总蛋白质浓度和酶活，B表示不同IPTG诱导浓度下硫酸软骨素酶B融合蛋白的比酶活。

具体实施方式

以下，对本文的实施方式进行具体说明。

硫酸软骨素酶B融合蛋白

本文涉及的硫酸软骨素酶B融合蛋白(以下，有时也简称为“MBP-ChSaseB”)，其融合有硫酸软骨素酶B和麦芽糖结合蛋白(以下，有时也简称为“MBP”)。

本文涉及的硫酸软骨素酶B可以任何硫酸软骨素酶B。根据本文一个优选的实施方案，硫酸软骨素酶B是肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)来源的硫酸软骨素酶B。特别地，硫酸软骨素酶B是去除了编码信号肽碱基的肝素黄杆菌硫酸软骨素酶B。根据本文一个优选的实施方案，本文硫酸软骨素酶B具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸。

硫酸软骨素酶B融合蛋白中，硫酸软骨素酶B可以直接与麦芽糖结合蛋白融合，也可以通过连接部分与所述硫酸软骨素酶连接。优选通过肽段连接部分来连接。肽段连接部分是本领域技术人员可以确定的，该肽段连接部分的长度可以至少为1个氨基酸以上，优选为3个氨基酸以上。对于构成该肽段连接部分的氨基酸没有特别限定，优选，由甘氨酸、丝氨酸、或丙氨酸这样中性的氨基酸重复构成。根据本文一个优选的实施方案，该肽段连接部分为SEQ ID NO：3所示的序列。

本文涉及的麦芽糖结合蛋白可以是任何本领域普通技术人员能够得到的麦芽糖结合蛋白。优选来自于大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白。来自大肠杆菌的天然的MBP能够与麦芽糖特异吸附，参与大肠杆菌对麦芽糖的转运和利用。MBP不但能与直链淀粉结合，实现亲和分离，也能与马铃薯淀粉实现亲和分离，从而可以大大降低酶的分离纯化成本，有利于实现工业化规模的分离纯化。在一个更优选的实施方案中，本文的麦芽糖结合蛋白具有SEQ IDNO：2所示的氨基酸。

优选，本文的硫酸软骨素酶B融合蛋白具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸。

此外，根据本发明的一个方面，得到的硫酸软骨素酶B融合蛋白不需要将麦芽糖结合蛋白部分切除，具有硫酸软骨素酶B的活性，可以直接用作硫酸软骨素酶B的替代物。

DNA

本文还涉及一种编码上述所有硫酸软骨素酶B融合蛋白的DNA，其是该融合蛋白的编码序列。

用于本说明书的术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。

编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA或重组核苷酸序列。

根据本文一个优选的实施方案，DNA具有SEQ ID NO：5所示的碱基序列。

重组载体

本文还涉及重组载体，其包含编码上述硫酸软骨素酶B融合蛋白DNA。

本文涉及的重组载体包含编码上述所有的融合蛋白的DNA序列、启动子、转录和翻译终止信号。本文中所述的DNA序列可以和其它调控序列结合在一起，产生重组载体，该载体可以包括一个或多个(数个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的DNA序列。备选的，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述氨基酸序列的DNA序列来表达本文的DNA序列。在制备重组载体的过程中，将编码序列导入载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。

启动子、转录信号、翻译终止信号以及其它调控序列是任何本领域普通技术人员能够可以根据常规选择而确定的。

重组载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的构建。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA，或可以使用转座子。

根据本文一个优选的实施方案，本文的重组载体是pMAL-c2x。优选，该重组载体是通过以下步骤构建：

将SEQ ID NO：5所示的DNA片段插入质粒pMAL-c2x的多克隆位点，得到重组载体。

转化体

本文还涉及转化体，其是将包含编码上述硫酸软骨素酶B融合蛋白DNA导入宿主细胞而得到的转化体。

本文涉及的转化体可用于蛋白质的生产，通过将包含本文DNA序列的载体导入宿主细胞而得到该转化体，并在适当的培养基中培养该转化体，可以用来生产所需要的目标蛋白质。

术语“宿主细胞”包括母体细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于母体细胞。宿主细胞可以是在本文的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳酸菌属、乳球菌属、梭菌属、地芽孢杆菌属和海洋芽孢杆菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属和脲原体属。细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞。在本文的实施中有用的芽孢杆菌属细胞包括但不限于，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞。在本文的实施中有用的链球菌属细胞包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞。在本文的实施中有用的链霉菌属细胞包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。在一个具体的方面，宿主细胞是真菌细胞。在一个具体的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。在另一个具体的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。

根据本文一个优选的实施方案，细菌宿主细胞是大肠杆菌。根据进一步优选的实施方案，细菌宿主细胞是大肠杆菌TB1。

构建硫酸软骨素酶B融合蛋白的方法

本文还涉及一种构建硫酸软骨素酶B融合蛋白的方法，包括

(i).提供含麦芽糖结合蛋白的质粒载体；和

(ii).将硫酸软骨素酶B的基因连接到上述载体上。

本文的另一实施方式涉及构建硫酸软骨素酶B融合蛋白的方法，其中，该硫酸软骨素酶B的N端通过肽段连接部分与麦芽糖结合蛋白结合。

其中涉及的质粒载体如上文所述。

纯化硫酸软骨素酶B融合蛋白的方法

本文还涉及纯化硫酸软骨素酶B融合蛋白的方法，其包括：

a.利用直链淀粉树脂吸附含硫酸软骨素酶B融合蛋白的粗产物的步骤，以及

b.利用麦芽糖洗脱纯化硫酸软骨素酶B融合蛋白的步骤。

本文涉及的生产硫酸软骨素酶B融合蛋白的方法，在所述a和b之前，该方法还包括：

提供含麦芽糖结合蛋白的质粒载体；

将硫酸软骨素酶B的基因连接到上述质粒载体上提供重组载体；

将重组载体导入宿主细胞而得到转化体；以及

利用培养基培养该转化体并获得所述含硫酸软骨素酶B融合蛋白的粗产物。

其中，转化体的培养可以使用包含碳源、氮源、无机盐、各种维生素等的常规营养培养基来进行，作为碳源，可以使用例如葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖等糖类，乙醇、甲醇等醇类，柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、马来酸、富马酸等有机酸类，废糖蜜等。作为氮源，可以单独或混合使用例如氨气、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、尿素等。此外，作为无机盐，可以使用例如磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、硫酸镁等。此外，培养基中可以添加蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白氨基酸、生物素等各种维生素等营养素。此外，在培养中，可优化培养基的氮源、碳源、无机离子，从而能够进一步促进细菌的生长和融合蛋白的表达。

培养通常在通气搅拌、振荡等需氧条件下进行。对培养温度没有特殊限制，只要是宿主微生物能够生长繁育的温度即可，此外，对培养过程中的pH也没有特殊限制，只要是宿主微生物能够生长繁育的pH即可。培养中的pH调整可以通过添加酸或碱来进行。

根据本文一个优选的实施方案，对上述的转化体培养是在诱导的条件下进行的培养，由此表达得到硫酸软骨素酶B。在一个进一步优选的实施方案中，上述诱导培养的条件是：0～1mM的IPTG。根据本文另一个优选的实施方案，上述诱导培养的条件是：0.05mM的IPTG。在一个进一步优选的实施方案中，上述诱导培养条件是：10～42℃诱导培养15～28小时。在一个更优选的方面，上述诱导培养条件是：15℃诱导培养23小时。

根据本文一个优选的实施方案，进行上述诱导培养的培养基的溶剂是水，溶质是10g/L NaCl，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨和100μg/L氨苄青霉素。

对于制备含硫酸软骨素酶B融合蛋白的粗产物的方法，没有特别地限制，可以使用各种的方法。通常，可以如下制备：利用上述的适当的培养基培养的转化体，通过使用超声波、压榨、渗透压冲击等物理方法，或者利用了表面活性剂等化学方法，或者酶处理等破碎或可溶化，以及离心分离或过滤等操作，从而得到含硫酸软骨素酶B融合蛋白的粗产物。

根据本文一个优选的实施方案，将上述培养的转化体培养物菌体采用超声波、压榨、渗透压冲击等物理方法进行破碎而得到含有硫酸软骨素酶B融合蛋白粗产物。

根据本文一个优选的实施方案，采用超声破碎获得含有硫酸软骨素酶B融合蛋白粗产物。

根据本文一个优选的实施方案，采用渗透压冲击获得含有硫酸软骨素酶B融合蛋白粗产物。在一个更优选的实施方案中，渗透压冲击是在含有20～40％蔗糖，30mM Tris-HCl，1mM EDTA的缓冲液进行的。

根据本文一个优选的实施方案，是将上述含有硫酸软骨素酶B融合蛋白的粗产物通过直链淀粉树脂(amylose树脂)实现一步亲和分离。直链淀粉树脂是任何本领域普通技术人员能够可以根据常规选择而确定的，可以使用可以商购的直链淀粉树脂，例如MBP Trap HP(商品号：28-9187-78，GEHealthcare)。在一个优选的实施方案中，通过直链淀粉树脂的上清液的流速为0.5ml/min。在一个优选的实施方案中，用于洗脱的麦芽糖的浓度为10mM。在一个优选的实施方案中，用于洗脱的麦芽糖的流速为0.5ml/min。在一个优选的实施方案中，该直链淀粉树脂是经过预平衡的。

低分子量硫酸软骨素B的生产方法

本文涉的生产低分子量硫酸软骨素B(也称为硫酸皮肤素)的方法，其包括：使用硫酸软骨素酶B融合蛋白降解硫酸软骨素B(硫酸皮肤素)原料、生产低分子量硫酸软骨素B(硫酸皮肤素)的方法，其中得到的硫酸软骨素的分子量为0.5kDa～25kDa，优选为2kDa～10kDa。

当将硫酸软骨素的分子量降低至2kDa～10kDa时，其药效更为明显，对防止动脉粥样硬化、风湿性炎症和伤口愈合有更好的疗效。

用于生产低分子量硫酸软骨素的底物可以任意选择，只要是能够被硫酸软骨素酶B降解的底物均可。可以为硫酸皮肤素，硫酸皮肤素可以是动物来源的，例如鱼类、牛、羊等来源的硫酸皮肤素。根据本文的一个优选的技术方案，硫酸软骨素为硫酸皮肤素。

生产低分子量硫酸软骨素的底物的浓度是本领域技术人员可以根据所添加的硫酸软骨素酶B融合蛋白的浓度而适当确定的。硫酸软骨素与硫酸软骨素酶B融合蛋白反应的时间也可以根据目标的低分子量硫酸软骨素的分子量来进行确定。

实施例

下面结合具体实施例对本文作进一步说明，但本文并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。所述引物合成及测序工作均由Invitrogen生物技术有限公司完成，所有的限制性内切酶均购自NewEngland Biolabs公司；Pfu酶及dNTP购自TaKaRa公司；所有感受态细胞(如：DH5α、TB1和Top10)购自北京全式金生物技术有限公司)；硫酸软骨素酶B酶活测定底物硫酸皮肤素购自sigma公司，其它的化学药品均为一般分析纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。

实施例1、硫酸软骨素酶B融合蛋白MBP-ChSase B的表达

一、去除信号肽的肝素黄杆菌硫酸软骨素酶B编码序列的克隆

表达载体pMAL-ChSase B的构建的具体过程如下：

1、引物的设计及合成

经Genbank查询得到肝素黄杆菌硫酸软骨素酶B的DNA序列(Tkalec，A.L.，Fink，D.，Blain，F.，Zhang-Sun，G.，Laliberte，M.，Bennett，D.C.，Gu，K.，Zimmermann，J.J.and Su，H.Isolation and expression in Escherichia coli of cslAand cslB，genes coding for the chondroitin sulfate-degrading enzymeschondroitinase AC and chondroitinase B，respectively，from Flavobacteriumheparinum.Appl.Environ.Microbiol.2000，66(1)，29-35)，再根据去除编码信号肽碱基的肝素黄杆菌硫酸软骨素酶B的DNA序列设计引物，并在引物序列中引入限制性内切酶SacI和EcoRI的识别位点，所用的上下游引物分别为：

上游引物P1：5’-TATGAGCTCTCAGGTTGTTG CTTCAAATG-3’(SEQID NO：6)(带下划线的碱基为SacI的酶切位点)，

下游引物P2：5’-CGCGAATTCTTACTAGTGCTCT TTATTTCTTT TAAT-3’(SEQ ID NO：7)(带下划线的碱基为EcoRI的酶切位点)，扩增后，即分别引入SacI和EcoRI酶切位点。

2、PCR扩增去除信号肽的肝素黄杆菌硫酸软骨素酶B的编码序列

PCR扩增的反应体系为：50ng肝素黄杆菌基因组DNA模版，100pmol每种引物，1×扩增缓冲液(北京天为生物技术有限公司)，200μmol/L每种dNTP，1单位高保真Pfu酶；扩增程序为：94摄氏度预变性5分钟，94摄氏度变性1分钟，68、65.7、62.9、59.5、56.8和54摄氏度引物退火1分钟，72摄氏度延伸3分钟，30个循环后，72摄氏度延伸10分钟结束反应。该PCR结果如图1所示，表明扩增得到了1.5kb的硫酸软骨素酶B基因片段，测序表明，扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列1的第1114-2562位所示(命名为ChSase B)。图1中，泳道1-6分别为退火温度为68、65.7、62.9、59.5、56.8和54摄氏度扩增结果，泳道M为分子量marker(条带大小依次为10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1.5kb、1kb、800bp)，箭头所指处为1.5kb目标片段。

3、构建含有目的片段的克隆载体

参照试剂盒说明书进行操作，将步骤一中2中的PCR扩增的目的片段直接亚克隆入载体pMD^TM-19T Simple(TaKaRa公司)中，得连接产物。

4、转化大肠杆菌及阳性克隆转化子的筛选及测序

将步骤3获得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，具体方法为：将10μl的连接产物与100μl的大肠杆菌DH5α感受态细胞混匀，冰浴30分钟，42摄氏度热激90秒，冰浴10分钟，然后加入800μl含100μg/L氨苄青霉素的LB液体培养基(蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl 3g，水285mL)中，180rpm、37摄氏度振摇60分钟，涂于含100μg/L氨苄青霉素的LB抗性培养平板(蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl 3g，琼脂粉4.5g，水285mL，16μl X-gal和4μl IPTG/平板)进行蓝白斑筛选。37摄氏度培养12-20小时。挑选白斑并以此为模版，用引物P1和P2进行菌落PCR鉴定，PCR反应体系及反应条件与步骤2相同。反应结束后，对扩增产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，可含转化子的阳性克隆。将筛选得到的阳性克隆转至5mL含0.05mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37摄氏度、220rpm振摇12小时，将菌液交由Invitrogen生物技术有限公司进行测序，将含有具有序列表中SEQ ID NO：5的第1114-2562位核苷酸序列的硫酸软骨素酶B蛋白编码基因的pMD^TM-19T Simple重组载体命名为pMD-19-ChSase B。

二、重组大肠杆菌表达载体的构建

以pMD-19-ChSase B质粒为模版，用引物P1和P2进行PCR扩增肝素黄杆菌硫酸软骨素酶B的基因，PCR反应体系及反应条件与步骤一中2相同。将pMAL-c2x载体(购自美国New England Biolabs公司和PCR产物(以pMD-19-ChSase B质粒为模版的扩增产物)分别用SacI和EcoRI双酶切，用T4DNA连接酶(TaKaRa公司)连接，转化DH5α，以P1和P2为引物，通过菌落PCR筛选转化子(如图2所示)，提取可得到1.5kb PCR产物的转化子中的pMAL-c2x重组载体，分别通过SacI和EcoRI双酶切验证(如图3所示)。图2中M为分子量marker(条带大小依次为10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1.5kb、1kb、800bp、500bp)，泳道1、2、3为PCR验证的转化子，箭头所指处为硫酸软骨素酶B基因条带。图3中M为分子量marker(条带大小依次为10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1.5kb、1kb、800bp、500bp、300bp)，泳道1、3、5、7为正确连接的重组质粒pMAL-ChSase B，泳道2、4、5、8分别为重组质粒pMAL-ChSase B被Sac I和EcoR I双切后电泳图，箭头所指处为硫酸软骨素酶B基因条带。将通过Sac I和EcoR I双酶切得到的1.5kb片段的质粒进行测序，将含有具有序列表中序列1的第1114-2562位核苷酸序列的硫酸软骨素酶B融合蛋白编码基因的pMAL-c2x重组载体命名为pMAL-ChSase B。在pMAL-ChSase B中，ChSase B基因与lacZα基因之间有两个连续的终止密码TAGTAA，从而能够有效地终止蛋白翻译不会表达lacZα蛋白。

三、硫酸软骨素酶B融合蛋白MBP-ChSase B的表达

提取步骤二中含有pMAL-ChSase B的大肠杆菌DH5α中的质粒，按照常规方法转化大肠菌TB1、Top10、JM109、BL21、BL21(DE3)和BL21(DE3)(plysS)。除E.coli TB1感受态细胞制作按照《分子克隆实验指南》中氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的说明完成外，E.coli TOP10、E.coliDH5α、E.coli JM109、E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coliBL21(DE3)(plysS)感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司。经过氨苄青霉素筛选和利用步骤一中步骤1提供的引物进行菌落PCR鉴定，得到含有pMAL-ChSase B的大肠杆菌TB1、Top10、JM109、BL21(DE3)和BL21(DE3)(plysS)，即TB 1/pMAL-ChSase B、Top 10/pMAL-ChSase B、JM109/pMAL-ChSase B、BL21/pMAL-ChSase B、BL21(DE3)/pMAL-ChSaseB、BL21(DE3)(plysS)/pMAL-ChSase B和DH5α/pMAL-ChSase B作为表达MBP-ChSase B的工程菌。

以质粒pMAL-c2x转化大肠杆菌TB1、Top10、JM109、BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)(plysS)和DH5α，得到空载体对照TB1/pMAL-c2x、Top10/pMAL-c2x、JM109/pMAL-c2x、BL21/pMAL-c2x、BL21(DE3)/pMAL-c2x、BL21(DE3)(plysS)/pMAL-c2x和DH5α/pMAL-c2x。

以下操作对上面的工程菌平行进行。

将空载体对照和工程菌分别在含氨苄青霉素抗性的LB培养基(NaCl10g/L，酵母提取物为5g/L，蛋白胨10g/L，含100μg/L氨苄青霉素)37摄氏度培养2.5小时后，加入终浓度为0.24mM IPTG 15摄氏度诱导25小时。10000rpm，10分钟离心收集菌体并用50mM Tris-HCl(pH8.0)洗涤两次，重悬至OD₆₀₀约为8.000附近。将上面OD₆₀₀约为8.000重悬液进行超声破碎(输出功率为300W，每次超声3秒和间歇3秒的处理198次)，12000rpm，30分钟离心，超声破碎后离心所得的上清液即为粗产物。酶活力(单位为IU/L)的检测采用232nm的光吸收法，1IU的酶活定义为30摄氏度每分钟产生1μmol不饱和键的反应效力。取硫酸皮肤素底物溶液0.5ml(1g/L硫酸皮肤素，50mM Tris-HCl，pH8.0)，加入上步中所得的一定体积的粗产物，其他体积以50mM Tris-HCl，pH8.0缓冲液补充，最终的反应体积为1.5ml，测单位时间内在232nm的吸光度变化ΔA₂₃₂。消光系数ε＝3800M^-1。比酶活(单位为IU/mg蛋白)的定义为酶活力与粗产物蛋白浓度(单位为mg/L)的比值。蛋白浓度监测采用常规的Bradford法。

宿主优化的结果如图4所示，空载体对照菌株TB1/pMAL-c2x、Top10/pMAL-c2x、JM109/pMAL-c2x、BL21/pMAL-c2x、BL21(DE3)/pMAL-c2x、BL21(DE3)(plysS)/pMAL-c2x和DH5α/pMAL-c2x诱导培养后无酶活，工程菌都表达出了有活性的可溶性MBP-ChSase B融合蛋白。并且经过测序，表达出的融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No：4所示；并且该融合蛋白MBP-ChSase B中的MBP的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示；该融合蛋白中的ChSase B的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。

可以发现，综合比较酶活、蛋白表达水平和比酶活，E.coli TB1为最佳宿主。对最佳宿主E.coli TB1表达的蛋白进行SDS-PAGE电泳：取上述超声破碎后离心所得的上清夜(粗产物)100μl做可溶蛋白组分SDS-PAGE电泳，取上述超声破碎后离心所得的沉淀来做不可溶蛋白组分SDS-PAGE电泳。结果如图5所示，图5中M为marker(由上至下分子量依次均为230kDa、150kDa、100kDa、80kDa、60kDa、50kDa、40kDa、30kDa、25kDa)，1-4分别为E.coli TB1/pMAL-ChSase B的全细胞、不可溶蛋白、可溶蛋白、直链淀粉柱纯化蛋白组分，箭头所指处为融合蛋白MBP-ChSaseB(94.35kDa)。

此外，尝试将硫酸软骨素酶B的C端与MBP融合，但未获得融合蛋白。

实施例2、通过对诱导剂IPTG浓度和对培养基成分进行优化来提高硫酸软 骨素酶B融合蛋白MBP-ChSase B的表达量和酶活

选用实施例1中的最优表达宿主E.coli TB1/pMAL-ChSase B，通过对诱导剂IPTG浓度进行优化，大幅度提高了硫酸软骨素酶B融合蛋白MBP-ChSase B的表达量，提高了单位发酵液中的酶活。

菌体培养、破碎、蛋白质量测定及酶活测定同实施例1步骤三。得到的硫酸软骨素B融合蛋白可以直接用来测定硫酸软骨素酶B的活性，未切除麦芽糖结合蛋白部分。

图6示出了对诱导剂IPTG浓度进行优化的结果。可以发现，诱导E.coliTB1/pMAL-ChSase B表达的最优IPTG浓度为0.05mM。当诱导剂IPTG的浓度为0.05mM时酶活可以达到431.66IU/L发酵液(以硫酸软骨素B为底物)，蛋白表达量可以达到321.49mg/L发酵液，比酶活可以达到1.34IU/mg蛋白。

进一步，通过对培养基的氮源、碳源、无机离子进行优化，可以进一步提高酶活，以硫酸软骨素B为底物时酶活可以达到4100IU/L发酵液。

实施例3、通过直链淀粉柱纯化硫酸软骨素酶B融合蛋白MBP-ChSase B

本发明利用的融合伴侣(fusion partner)麦芽糖结合蛋白MBP能够与直链淀粉亲和吸附实现一步分离。具体的亲和分离步骤如下：将终浓度为0.24mM IPTG诱导表达23小时的菌体100mL，10000rpm离心10分钟；同时设未诱导表达的菌体对照。接着按以下两个方案分别操作：

方案一：用柱平衡液Column buffer(20mM Tris-HCl，200mM NaCl，pH7.5)洗涤两次，重悬在5mL Column buffer中，进行超声破碎(输出功率为300W，每次超声3秒和间歇3秒的处理99次)。

方案二：渗透压冲击。将菌体重悬在100mL osmotic shock buffer I中(20-40％蔗糖，30mM Tris-HCl，1mM EDTA)15分钟，搅拌。10000rpm离心10分钟，然后重悬在等体积0.5mM硫酸镁中，冰浴10-15分钟，10000rpm，离心10分钟。

离心后上清液以0.5ml/min通过2ml预平衡的直链淀粉亲和分离柱，通过10mM 0.5ml/min麦芽糖洗脱并收集。

目标蛋白经过直链淀粉(amylose)树脂吸附后，用10mM麦芽糖在1个柱体积下能够将目标蛋白洗脱。结果如图4所示，表明经过直链淀粉树脂一步纯化后目标蛋白可占90％以上。图5中，M为marker(由上至下分子量依次均为230kDa、150kDa、100kDa、80kDa、60kDa、50kDa、40kDa、30kDa、25kDa)，1-4分别为E.coli BL21/pMAL-ChSase B的全细胞、不可溶蛋白、可溶蛋白、直链淀粉柱纯化蛋白组分，箭头所指为目标蛋白94.35kDa。

综上，通过融合蛋白首次实现硫酸软骨素酶B在大肠杆菌中70％以上有活性、正确折叠的可溶蛋白形式存在；实施例的结果说明利用麦芽糖结合蛋白(MBP)作为融合标签，克服了His-tag的确定，具有起始转录效率高、显著提高酶重组表达的可溶性等优点。

本文还可通过亲和分离实现了该融合蛋白的一步纯化。与现有技术中使用的鱼精蛋白沉淀(参见ANA LYDIA TKALEC，DOMINIQUE FINK等人Isolation and Expression in Escherichia coli of cslA and cslB，Genes Coding forthe Chondroitin Sulfate-Degrading Enzymes Chondroitinase AC andChondroitinase B，Respectively，from Flavobacterium heparinum.APPL.ENVIRON.MICROBIOL.2000，66(1)：29-35)和一步柱纯化法相比(参见表1)，可以大大缩短纯化需要的时间，并且纯化所用的设备明显减少，降低了纯化硫酸软骨素酶的生产成本。利用直链淀粉树脂的纯化仅需要进行2个小时左右，即可获得能够用于工业生产的硫酸软骨素酶B融合蛋白。纯度达到可以应用的95％以上。

表1鱼精蛋白沉淀和一步柱纯化法相比

综上，本文经优化以硫酸软骨素B为底物时酶活可以达到4100IU/L发酵液。本文获得的硫酸软骨素酶B融合蛋白与原始来自肝素黄杆菌的硫酸软骨素酶B相比，具有更高的活性，具体结果如表2所示。

表2

[1]：ANA LYDIA TKALEC，DOMINIQUE FINK等人Isolation and Expression inEscherichia coli of cslA and cslB，Genes Coding for the Chondroitin Sulfate-DegradingEnzymes Chondroitinase AC and Chondroitinase B，Respectively，from Flavobacteriumheparinum.APPL.ENVIRON.MICROBIOL.2000，66(1)：29-35.

[2]：Pojasek，K.，Shriver，Z.，Kiley，P.，Venkataraman，G.和Sasisekharan，R.(2001).Recombinant expression，purification，and kinetic characterization of chondroitinaseAC andchondroitinase B from Flavobacterium heparinum.Biochem.Biophys.Res.Commun.286，343-351.

本文将在硫酸软骨素酶B的生产中发挥重要作用，并且通过本文生产的硫酸软骨素酶B融合蛋白可以作为硫酸软骨素酶B的替代物，应用于硫酸软骨素酶B的各领域。

以上全面描述了本发明的优选实施例，但是可对它们进行各种替代和修改。因此，不应参照以上描述来决定本发明的范围，而是应参照所附权利要求书及其全部等同物来决定本发明的范围。任何特征，(不论是否为优选)均可与任何其他特征(不论是否为优选)相结合。本发明的权利要求书不应被理解为具有方法+功能的限制，除非在某一权利要求中通过术语“...的方法”明确地列举出此类限制。将本文中出现的参考文献并入作为参考。

Claims (10)

1.一种硫酸软骨素酶B融合蛋白，其中融合有硫酸软骨素酶B和麦芽糖结合蛋白。

2.根据权利要求1所述的硫酸软骨素酶B融合蛋白，其中所述硫酸软骨素酶B具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸。

3.根据权利要求1或2所述的硫酸软骨素酶B融合蛋白，其中所述麦芽糖结合蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸

4.根据权利要求1～3中任一项所述的硫酸软骨素酶B融合蛋白，其中，所述麦芽糖结合蛋白通过肽段连接部分与所述硫酸软骨素酶B连接。

5.根据权利要求4所述的硫酸软骨素酶B融合蛋白，其中，所述连接部分具有SEQ ID NO：3所示的序列。

6.根据权利要求4所述的硫酸软骨素B融合蛋白，其中所述连接部分连接在SEQ ID NO：1的氨基酸的N端。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的硫酸软骨素融合蛋白B，其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸。

8.一种硫酸软骨素酶B的替代物，其是权利要求1～7中任一项所述的硫酸软骨素酶B融合蛋白。

9.一种纯化硫酸软骨素酶B融合蛋白的方法，其包括：

a.利用直链淀粉树脂吸附含权利要求1～7中任一项所述的硫酸软骨素酶B融合蛋白的粗产物，以及

b.利用麦芽糖洗脱纯化硫酸软骨素酶B融合蛋白。

10.硫酸软骨素酶B融合蛋白的用途，用来代替硫酸软骨素酶B。

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