CN109777816B - 硫酸软骨素abc酶蛋白的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种ChSaseABC酶蛋白的制备方法，该方法包括：分别克隆所述硫酸软骨素ABC酶基因和分子伴侣蛋白GroES基因，然后连接上述两个蛋白基因到同一个表达载体，获得含有所述硫酸软骨素ABC酶蛋白和分子伴侣蛋白GroES的重组载体；将所述重组载体转化到宿主细胞中进行表达，获得含有所述硫酸软骨素ABC酶蛋白和分子伴侣蛋白GroES的转化体；以及培养所述转化体，并进行物理破碎处理，制得所述硫酸软骨素ABC酶蛋白。本发明还提供一种ChSase ABC酶蛋白及其应用。上述ChSase ABC酶蛋白具有高酶活，能够用于生产低分子量硫酸软骨素，并且硫酸软骨素的生成条件不高、方法简便且容易控制。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和发酵工程领域中一种硫酸软骨素ABC酶的制备方法及其应用。
背景技术
硫酸软骨素裂解酶(chondroitinase或chondroitin sulfateyase，简称为“ChSase”)是一类能将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和二糖(ΔDi及寡糖)的裂解酶。
随着对ChSase的深入研究，发现硫酸软骨素ABC酶(简称为“ChSase ABC”)有着广泛的应用价值。科研人员利用ChSase ABC检测硫酸软骨素和生产低分子量硫酸软骨素。鲍伦军，杨建成等用ChSase ABC酶解-高效液相色谱的方法检测鱼翅中的透明质酸，采用ZORBAX糖分析柱，紫外检测波长为226 nm，检测到鱼翅中透明质酸的质量分数为0.86-1.96%（鲍伦军等. 鱼翅中硫酸软骨素的酶解-高效液相色谱法测定. 色谱，2002, 20(6): 557-559）。朱昱宁，敖雷等同样用酶解高效液相色谱的方法检测CS的含量，采用Ultimate XB-NH2柱，紫外检测波长为232 nm，流动相为醋酸钠缓冲液(pH5.6)-乙腈(950: 50)，流速为1.0 mL/min，此色谱条件可将CS A，B和C分开（朱昱宁等. 酶解高效液相色谱法测定硫酸软骨素的含量. 中国生化药物杂志，2012, 33(6): 827-829）。
ChSase ABC在临床应用方面也有很大的作用。例如，在缓解视网膜变性方面，可降解硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)，CSPGs是中枢神经系统(CNS)损伤后胶质瘢痕的重要组分，可抑制神经轴突再生；在提高后肢运动能力方面，ChSase ABC 可以修复脊柱损伤；近年来，Mark R Brown等经研究发现，突出椎间盘内的主要组分为蛋白聚糖，而用ChSase ABC 及ChSase AC则可特异性降解掉突出的椎管内的糖胺聚糖、降低椎管内压，同时对椎管外周组织无损害（Brown，M D．Method for treating intervertebral disc displacement withenzymes [P]: US, 4696816, 1987-09-29）。
另外，对低分子量硫酸软骨素的制备常采用酸水解法、离子交换法和酶解法。前两种方法需要较复杂的实验设备并且会污染环境，比较而言，酶解法需要的条件不高、方法简便且容易控制。酶解法的关键在于获得大量的硫酸软骨素裂解酶。分离纯化硫酸软骨素裂解酶的方法非常复杂，通常需要经过多步的色谱纯化，收率很低。异源重组表达ChSase ABC是常用来提高ChSase ABC产量的手段之一。然而对ChSase ABC的异源重组表达研究非常有限，现有技术中使用原核表达系统表达ChSase ABC酶蛋白后以活性蛋白状态存在的比例很低，变性蛋白需经过变性、复性过程，制备过程繁琐，成本较高。
发明内容
有鉴于此，为解决现有技术的不足，本发明采用分子伴侣协助硫酸软骨素ABC酶正确折叠的方法，获得了大量可溶性的ChSase ABC I蛋白，降低了包涵体的产量，大大减少了后续处理的复杂程序。
本发明的主要目的在于提供一种制备硫酸软骨素ABC酶蛋白的方法，其中，所述方法包括：
1）重组载体：分别克隆所述硫酸软骨素ABC酶基因和分子伴侣蛋白GroES基因，然后连接上述两个蛋白基因到同一个表达载体，获得含有所述硫酸软骨素ABC酶蛋白和分子伴侣蛋白GroES的重组载体；
2）获得转化体：将所述步骤1）得到的所述重组载体转化到宿主细胞中进行表达，获得含有所述硫酸软骨素ABC酶蛋白和分子伴侣蛋白GroES的转化体；以及
3）制备硫酸软骨素ABC酶蛋白：培养所述步骤2）得到的所述转化体，并进行物理破碎处理，制得所述硫酸软骨素ABC酶蛋白。
基于上述，所述步骤1）中所述分子伴侣蛋白GroES基因编码为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
基于上述，所述步骤1）包括：分别克隆所述硫酸软骨素ABC酶基因和分子伴侣蛋白GroES基因，获得两个单独表达的蛋白基因；连接上述两个蛋白基因到同一个所述表达载体，使后续得到的所述重组载体中的分子伴侣蛋白GroES和硫酸软骨素ABC酶蛋白N端连接，或者使后续得到的所述重组载体中的分子伴侣蛋白GroES和硫酸软骨素ABC酶蛋白C端连接，或者使后续得到的所述重组载体中的分子伴侣蛋白GroES和硫酸软骨素ABC酶蛋白具有单独的启动子。
基于上述，所述步骤2）包括将所述步骤1）得到的三种所述重组载体分别转化到所述宿主细菌中进行表达。
基于上述，所述步骤1）中采用的所述表达载体为pET15b，使所述两个蛋白基因分别按pET-GroES-RBS-ChSase ABC I、pET-ChSase ABC I-RBS-GroES、pET-GroES-T7-ChSaseABC I的方法连接到pET15b上，并分别得到重组载体pET-GroES-RBS-ChSase ABC I、pET-ChSase ABC I-RBS-GroES、pET-GroES-T7-ChSase ABC I。
基于上述，所述步骤2）中的所述宿主细胞为E.coliBL21(DE3)或DH5α。
基于上述，所述步骤3）培养所述转化体的条件为采用LB培养基在37℃培养所述转化体3小时，加入终浓度为0.25 mM的IPTG在10～42℃诱导培养15～28小时。
基于上述，所述步骤3）中培养所述转化体的条件为采用LB培养基在37℃培养所述转化体3小时，加入终浓度为0.25 mM的IPTG在16℃诱导24小时。
本发明的另一目的在于提供一种由上述制备方法制备的硫酸软骨素ABC酶蛋白。
基于上述，以硫酸软骨素A为底物时，所述硫酸软骨素ABC酶融合蛋白酶活为17.25~206 IU/mL粗酶液，且最终产量达到11920~61800 IU/L发酵液。
本发明的另一目的在于提供一种重组载体，它为pET-GroES-RBS-ChSase ABC I、pET-ChSase ABC I-RBS-GroES或pET-GroES-T7-ChSase ABC I。
本发明的另一目的在于提供一种转化体，其中，它是将权利要求12所述的重组载体转化到宿主细胞中进行表达而得到的，且所述宿主细胞为E.coliBL21(DE3)和DH5α。
本发明使用特定分子伴侣蛋白GroES协助硫酸软骨素ABC酶表达及折叠，表达产物硫酸软骨素ABC酶蛋白，具有硫酸软骨素ABC酶的活性，能够用于生产硫酸软骨素，并且硫酸软骨素的生成条件不高、方法简便且容易控制。
附图说明
图1为四种不同表达宿主BL21(DE3)/pET-ChSase ABC I(B0)，BL21(DE3)/pET-GroES-RBS-ChSase ABC I(B1)，BL21(DE3)/pET-ChSase ABC I-RBS-GroES(B2)，BL21(DE3)/pET-GroES-T7-ChSase ABC I(B3)产硫酸软骨素ABC酶量的比较。
图2为B1，B2，B3三种宿主表达可溶的硫酸软骨素ABC酶的蛋白电泳图。
序列表中：
序列1为分子伴侣蛋白GroES氨基酸序列；
序列2为PCR扩增硫酸软骨素ABC酶的上游引物核苷酸序列；
序列3为PCR扩增硫酸软骨素ABC酶的下游引物核苷酸序列；
序列4为PCR扩增分子伴侣蛋白GroES的上游引物核苷酸序列；
序列5为PCR扩增分子伴侣蛋白GroES的下游引物核苷酸序列。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
硫酸软骨素ABC酶蛋白
本文涉及的硫酸软骨素ABC酶可以是任何硫酸软骨素酶，优选选自普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、嗜水气单孢菌(Aeromonas liquefaciens)及肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)来源的硫酸软骨素酶。根据本文的一个优选的实施方案，硫酸软骨素ABC酶是普通变形杆菌来源的硫酸软骨素酶；特别地，硫酸软骨素酶是去除了编码信号肽序列的普通变形杆菌的硫酸软骨素ABC酶。
本文涉及的分子伴侣蛋白GroES可以是任何本领域普通技术人员能够得到的分子伴侣蛋白GroES。优选来自于大肠杆菌的分子伴侣蛋白GroES。在一个更优选的实施方案中，本文的分子伴侣蛋白GroES具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸。
重组载体
本文还涉及重组载体，其包含编码上述硫酸软骨素ABC酶蛋白和分子伴侣蛋白GroES的DNA。本文选择的重组载体是pET15b。优选，该重组载体是通过以下步骤构建：
将硫酸软骨素ABC酶蛋白和分子伴侣蛋白GroES的DNA片段插入质粒按照“发明内容”中所述的三种不同方法连接到pET15b的酶切位点区域，得到重组载体。
转化体
本文还涉及转化体，其是将包含编码上述硫酸软骨素ABC酶融合蛋白DNA导入宿主细胞而得到的转化体。
本文涉及的转化体可用于蛋白质的生产，通过将包含本文DNA序列的载体导入宿主细胞而得到该转化体，并在适当的培养基中培养该转化体，可以用来生产所需要的目标蛋白质。本文选择的宿主细胞是大肠杆菌。根据进一步优选的实施方案，细菌宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)。
三种不同硫酸软骨素ABC酶和分子伴侣蛋白GroES的连接方法
本文还涉及构建硫酸软骨素ABC酶蛋白和分子伴侣蛋白GroES的三种方法，构建后的重组质粒表示为pET-GroES-RBS-ChSase ABC I，pET-ChSase ABC I-RBS-GroES，pET-GroES-T7-ChSase ABC I。
其中涉及的质粒载体如上文所述。
根据本发明提供的一个实施方案，对上述的转化体培养是在诱导的条件下进行的培养，由此表达得到硫酸软骨素ABC酶。诱导培养的条件是：LB培养基，0.25mM的IPTG。在一个进一步优化的实施方案中，上述诱导培养条件是：10～42℃诱导培养15～28小时。在一个更优选的方面，上述诱导培养条件是：16℃诱导培养24小时。
对于制备含硫酸软骨素ABC酶融合蛋白的粗产物的方法，本发明的一个实施方案，采用超声破碎获得含硫酸软骨素ABC酶蛋白的粗产物。
实施例
下面结合具体实施例对本文作进一步说明，但本文并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。所述引物合成及测序工作均由华大基因完成，Q5TM High-Fidelity 2×Master Mix和所有的限制性内切酶均购自New EnglandBiolabs公司；所有感受态细胞(如：BL21(DE3)、DH5α)购自北京博迈德生物技术有限公司)；硫酸软骨素ABC酶酶活测定底物硫酸软骨素A购自南京奥多福尼生物科技有限公司，其它的化学药品均为分析纯试剂，购自北京化工厂。
实施例1、重组质粒pET-GroES-RBS-ChSase ABC I，pET-ChSase ABC I-RBS-
GroES，pET-GroES-T7-ChSase ABC I的构建及表达
1.表达载体pET-GroES-RBS-ChSase ABC I构建的具体过程如下：
1.1引物的设计及合成
经Genbank查询得到普通变形杆菌硫酸软骨素ABC酶和分子伴侣蛋白GroES的DNA序列，所用的上下游引物分别为：
上游引物P1：
5’-CGGGATCCAGGAGATATACCATGGCCACCAGCAATCCTGCATT-3’ (SEQ ID NO:2)（带下划线的碱基为BamHI的酶切位点），
下游引物P2：
5’-CCGCTCGAGTTATCAAGGGAGTGGCGAGAGTTTG-3’ (SEQ ID NO:3)（带下划线的碱基为Xho I的酶切位点），扩增后，即分别引入BamHI和XhoI酶切位点。
上游引物P1：
5’-GGAATTCCATATGATGAATATTCGTCCATTGCA-3’ (SEQ ID NO:4)（带下划线的碱基为NdeI的酶切位点），
下游引物P2：
5’-CGCGGATCCTTATCACGCTTCAACAATTGCCAG-3’ (SEQ ID NO:5)（带下划线的碱基为BamHI的酶切位点），扩增后，即分别引入Nde I和BamHI酶切位点。
1.2 PCR扩增去除信号肽的普通变形杆菌硫酸软骨素ABC酶和分子伴侣蛋白GroES的编码序列
PCR扩增的硫酸软骨素ABC酶反应体系为：50ng普通变形杆菌基因组DNA模版，100pmol每种引物，响应体积的2×Master Mix；扩增程序为：98℃预变性30秒，98℃变性7秒，40～60℃引物退火30秒，72℃延伸2分钟，30个循环后，72℃延伸2分钟结束反应。
PCR扩增的分子伴侣蛋白GroES反应体系和方法如上述1.2PCR扩增硫酸软骨素ABC酶反应体系和方法。
1.3 构建含有目的片段的克隆载体
分别使用BamHI和XhoI酶切PCR扩增的硫酸软骨素ABC酶DNA序列，同时使用NdeI和BamHI酶切PCR扩增的分子伴侣蛋白GroES的DNA序列，分离酶切产物，将酶切处理后的硫酸软骨素ABC酶DNA序列和分子伴侣蛋白GroES的DNA序列与经NdeI和XhoI酶切后pET15b载体用连接酶连接，得重组载体。
1.4转化大肠杆菌及阳性克隆转化子的筛选及测序
将步骤1.3获得的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，具体方法为：将10 μl的连接产物与50 μl的大肠杆菌DH5α感受态细胞混匀，冰浴30分钟，42℃热激90秒，冰浴2分钟，然后加入500μl LB液体培养基中，37℃孵育60分钟，涂于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB抗性培养平板进行筛选。37℃培养12～20小时。
挑选菌落并以此为模板，用引物P1和P2进行菌落PCR鉴定，PCR反应体系及反应条件与步骤1.2相同。
将筛选得到的阳性克隆转至4mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、220 rpm振摇12小时，将菌液交由华大基因进行测序，将含有硫酸软骨素ABC酶蛋白编码基因和分子伴侣蛋白GroES的pET15b重组载体命名为pET-GroES-RBS-ChSase ABC I。
重组质粒pET-ChSase ABC I-RBS-GroES，pET-GroES-T7-ChSase ABC I的构建方法与pET-GroES-RBS-ChSase ABC I的构建方法相似。
2. 硫酸软骨素ABC酶蛋白的表达
提取步骤1中构建的重组质粒pET-GroES-RBS-ChSase ABC I，pET-ChSase ABC I-RBS-GroES，pET-GroES-T7-ChSase ABC I，按照常规方法分别转化大肠杆菌BL21(DE3)。
经过氨苄青霉素筛选和利用步骤1.1提供的引物进行菌落PCR鉴定，得到分别含有重组质粒pET-GroES-RBS-ChSase ABC I，pET-ChSase ABC I-RBS-GroES，pET-GroES-T7-ChSase ABC I的BL21(DE3)， BL21(DE3)/pET-GroES-RBS-ChSase ABC I、BL21(DE3)/pET-ChSase ABC I-RBS-GroES和BL21(DE3)/pET-GroES-T7-ChSase ABC I作为表达ChSase ABCI的工程菌。
以质粒pET15b转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到空载体对照BL21(DE3)/pET15b。
以下操作对上面的工程菌平行进行。
将空载体对照和工程菌分别在含氨苄青霉素抗性的LB培养基37℃培养3小时后，加入终浓度为0.25 mM IPTG 16℃诱导24小时。
6000 rpm，6分钟离心收集菌体并用20mM Tris-HCl (pH 7.4)洗涤两次，然后加入15 mL缓冲液重悬菌体。将重悬液进行超声破碎(输出功率为300 W，每次超声5秒和间歇6秒，处理总时间为15分钟)，6000 rpm，6分钟离心，超声破碎后离心所得的上清液即为含硫酸软骨素ABC酶的粗产物。
酶活力(单位为IU/L)的检测采用232 nm的光吸收法，1 IU的酶活定义为37℃每分钟产生1 μmoL不饱和键的反应效力。取硫酸软骨素A底物溶液2 mL (20 mg/mL硫酸软骨素A，20 mM Tris-HCl，pH 7.4)，加入上步中所得的200 μL的粗产物，最终的反应体积为1.5mL，测单位时间内在232 nm的吸光度变化△A232。消光系数ε=3800M-1。
比酶活(单位为IU/mg蛋白)的定义为酶活力与粗产物蛋白浓度(单位为mg/L)的比值。蛋白浓度监测采用常规的Bradford法。
以硫酸软骨素A为底物检测三种不同宿主BL21(DE3)/pET-GroES-RBS-ChSase ABCI、BL21(DE3)/pET-ChSase ABC I-RBS-GroES和BL21(DE3)/pET-GroES-T7-ChSase ABC I的产量，及与未加分子伴侣蛋白GroES的BL21(DE3)/pET-ChSase ABC I的比较，结果如图1所示。
空载体对照菌株未表达出有活性的蛋白，工程菌都表达出了有活性的可溶性ChSase ABC I蛋白，且最优的表达菌株为BL21(DE3)/pET-GroES-T7-ChSase ABC I，以硫酸软骨素A为底物时，表达后的酶活为50.65 IU/mL粗酶液，且最终产量达到35000 IU/L发酵液。以硫酸软骨素A为底物时，所述硫酸软骨素ABC酶融合蛋白酶活为17.25~50.65 IU/mL粗酶液，且最终产量达到11920~35000 IU/L发酵液。BL21(DE3)/pET-GroES-RBS-ChSase ABCI、BL21(DE3)/pET-ChSase ABC I-RBS-GroES，以硫酸软骨素A为底物时，表达后酶活分别为29.68 IU/mL粗酶液，且最终产量达到20509 IU/L发酵液和17.25 IU/mL粗酶液，且最终产量可达到11920 IU/L发酵液。
对宿主E. coli BL21(DE3)表达的蛋白进行SDS-PAGE电泳，取上述超声破碎后离心所得的上清液（粗产物）30 μl做可溶蛋白组分SDS-PAGE电泳，取上述超声破碎后离心所得的沉淀来做不可溶蛋白组分SDS-PAGE电泳。结果如图2所示，图2中M为marker(由上至下分子量依次均为250kDa、150kDa、100kDa、70kDa、55kDa、40kDa、30kDa、20kDa、15kDa)，泳道1为BL21(DE3)/pET-GroES-RBS-ChSase ABC I表达产物(110kDa)、泳道2为BL21(DE3)/pET-ChSase ABC I-RBS-GroES 表达产物(110kDa)、泳道3为BL21(DE3)/pET-GroES-T7-ChSaseABC I表达产物(110kDa)，箭头所指处为ChSase ABC I。结果表明宿主菌都表达出了可溶性的硫酸软骨素ABC酶蛋白，且B3菌株（BL21(DE3)/pET-GroES-T7-ChSase ABC I）表达的ChSase ABC I量最多。
需要说明的是，所述硫酸软骨素ABC酶融合蛋白酶活的高低与工程菌的培养基有关，例如，采用含氨苄青霉素抗性的TB培养基（12.54g/L K2HPO4，2.31g/L KH2PO4，24g/L酵母提取物，12g/L蛋白胨，4ml/L 甘油，含100μg/L 氨苄青霉素）培养工程菌时，按照上述的蛋白浓度监测方法，以硫酸软骨素A为底物时，可溶性ChSase ABC I蛋白的酶活可以达到150~206 IU/mL粗酶液，且最终产量达到45000~61800 IU/L发酵液。
因此，本发明提供的制备方法将在硫酸软骨素ABC酶的生产中发挥重要作用，并且通过本发明生产的硫酸软骨素ABC酶蛋白可以与原始菌株来源的硫酸软骨素ABC酶同样地应用于生产实践。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京电子科技职业学院
<120> 硫酸软骨素ABC酶融合蛋白的制备方法及其应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 97
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 1
MetAsnIleArgProLeuHisAspArgValIleValLysArgLysGluValGluThrLys
SerAlaGlyGlyIleValLeuThrGlySerAlaAlaAlaLysSerThrArgGlyGluVal
LeuAlaValGlyAsnGlyArgIleLeuGluAsnGlyGluValLysProLeuAspValLys
ValGlyAspIleValIlePheAsnAspGlyTyrGlyValLysSerGluLysIleAspAsn
GluGluValLeuIleMetSerGluSerAspIleLeuAlaIleValGluAla
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
CGGGATCCAGGAGATATACCATGGCCACCAGCAATCCTGCATT 43
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
CCGCTCGAGTTATCAAGGGAGTGGCGAGAGTTTG 34
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
GGAATTCCATATGATGAATATTCGTCCATTGCA 33
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
CGCGGATCCTTATCACGCTTCAACAATTGCCAG 33
Claims (7)
1.一种硫酸软骨素ABC酶蛋白的制备方法，其包括以下步骤：
1）重组载体：分别克隆所述硫酸软骨素ABC酶蛋白基因和分子伴侣蛋白GroES基因，获得两个单独表达的蛋白基因；然后连接所述两个蛋白基因到同一个表达载体pET15b，使后续得到的所述重组载体中的分子伴侣蛋白GroES和硫酸软骨素ABC酶蛋白N端连接获得重组载体pET-GroES-RBS-ChSase ABC I，或者使后续得到的所述重组载体中的分子伴侣蛋白GroES和硫酸软骨素ABC酶蛋白具有单独的启动子获得重组载体pET-GroES-T7-ChSase ABCI；其中，所述分子伴侣蛋白GroES基因编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述硫酸软骨素ABC酶蛋白来源于普通变形杆菌；
2）获得转化体：将所述步骤1）得到的所述重组载体转化到宿主细胞中进行表达，获得含有所述硫酸软骨素ABC酶蛋白和分子伴侣蛋白GroES的转化体；以及
3）制备硫酸软骨素ABC酶蛋白：培养所述步骤2）得到的所述转化体，并进行物理破碎处理，制得所述硫酸软骨素ABC酶蛋白；其中，以硫酸软骨素A为底物时，所述硫酸软骨素ABC酶融合蛋白酶活为50.65～206 IU/mL粗酶液，且最终产量达到35000～61800 IU/L发酵液。
2.根据权利要求1所述的硫酸软骨素ABC酶蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤2）包括将所述步骤1）得到的两种所述重组载体分别转化到所述宿主细菌中进行表达。
3.根据权利要求2所述的硫酸软骨素ABC酶蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中的所述宿主细胞为E.coliBL21(DE3)或DH5α。
4. 根据权利要求3所述的硫酸软骨素ABC酶蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤3）培养所述转化体的条件为采用LB培养基在37℃培养所述转化体3小时，加入终浓度为0.25mM的IPTG在10℃～42℃诱导培养15～28小时。
5. 根据权利要求4所述的硫酸软骨素ABC酶蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中培养所述转化体的条件为采用LB培养基在37℃培养所述转化体3小时，加入终浓度为0.25 mM的IPTG在16℃诱导24小时。
6. 一种重组载体，其特征在于，它为pET-GroES-RBS-ChSase ABC I或pET-GroES-T7-ChSase ABC I，其中，GroES基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示，所述重组载体主要是由以下方法获得：分别克隆硫酸软骨素ABC酶蛋白基因和分子伴侣蛋白GroES基因，获得两个单独表达的蛋白基因；然后连接所述两个蛋白基因到同一个表达载体pET15b，使后续得到的所述重组载体中的分子伴侣蛋白GroES和硫酸软骨素ABC酶蛋白N端连接获得重组载体pET-GroES-RBS-ChSase ABC I，或者使后续得到的所述重组载体中的分子伴侣蛋白GroES和硫酸软骨素ABC酶蛋白具有单独的启动子获得重组载体pET-GroES-T7-ChSase ABCI；其中，所述分子伴侣蛋白GroES基因编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述硫酸软骨素ABC酶蛋白来源于普通变形杆菌。
7.一种转化体，其特征在于，它是将权利要求6所述的重组载体转化到宿主细胞中进行表达而得到的，其中，所述宿主细胞为E.coliBL21(DE3)或DH5α。
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