CN105602878A - 一种透明质酸酶细胞表面展示系统及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种透明质酸酶细胞表面展示系统及其制备和应用，所述展示系统为将编码透明质酸酶的基因hyl和负责跨膜定位和转运的冰核蛋白N端结构域的基因inaQ-N融合得融合后的基因片段，表达于宿主细胞表面，得到透明质酸酶细胞表面展示系统；基因hyl具有SEQ？ID？NO：1所示的核苷酸序列；基因inaQ-N具有SEQ？ID？NO：2所示的核苷酸序列。本发明的透明质酸酶细胞表面展示系统，能够应用于制备低分子量透明质酸和寡聚透明质酸。

Description

一种透明质酸酶细胞表面展示系统及其制备和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种透明质酸酶细胞表面展示系统及其制备和应用。
背景技术
透明质酸(hyaluronicacid，HA)，是由重复连接的[-D-葡萄糖醛酸-N-乙酰葡萄糖胺-]n双糖单位组成的酸性黏多聚糖。HA广泛存在于细菌的荚膜、动物组织的间隙以及昆虫的毒液中，由于其粘弹性高、可塑性以及持水性强、生物吸收性好，故广泛应用于化妆品、医药、食品等领域。HA的生物活性与其相对分子量直接相关，目前市场上所用HA的相对平均分子质量大都大于106Da。低分子量HA(LMWHA)的相对分子质量在(1～8)×104Da之间，寡聚HA(o-HA)的相对分子质量小于104Da，LMWHA和o-HA具有抗肿瘤、免疫调节、促进伤口愈合以及促进骨和血管生成的作用，在医学中有不可小觑的应用价值。
目前，生产LMWHA和o-HA的方法有化学降解法、物理降解法、酶解法以及生物合成的方法。化学降解法以及物理降解法反应条件剧烈，不仅破坏HA的分子结构，也会对D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖的结构造成破坏，影响了LMWHA与o-HA的生物活性。而生物合成的方法其反应条件严格，可控性不好，生产成本太高，不适用于工业生产。
市场上常见的是用透明质酸酶酶解法生产LMWHA与o-HA，透明质酸酶(HAase)是可以降解HA的酶，在自然界中分布十分广泛，在哺乳动物、无脊椎动物、病原性真菌、细菌和噬菌体中均有发现。透明质酸酶主要是从动物组织中提取或通过基因工程菌表达后纯化获得，但无论是从动物组织中提取的透明质酸酶或是用细菌在胞内表达或分泌到胞外表达的透明质酸酶，其纯化步骤都比较繁琐，并且降解HA时不易与反应产物分离。
细菌细胞表面展示通常指通过DNA重组技术，将某一具有特定功能的外源蛋白的编码基因与受体细菌细胞表面的锚定单元的编码基因融合后，通过融合蛋白在受体细胞中表达、分泌以及与细胞表面特定结构成分之间的识别，所表达的融合蛋白最终锚定在宿主细胞的表面，以达到研究或应用的目的。锚定于细胞表面的外源蛋白可以克服某些大分子底物不能直接穿越细胞膜进入胞内反应位置，以及某些反应产物在胞内无法正确折叠等弊端。细胞表面展示的外源蛋白能与细胞外环境中的特定反应底物直接接触并发生作用，从而大大提高反应效率；同时，通过设计简便的胞外制备流程即可提取反应产物，从而免去某些产物通常不得不从细胞内提取与纯化等一系列复杂低效的操作过程。冰核蛋白(ice-nucleationprotein，INP)是丁香假单胞菌等菌株的外膜蛋白，可加速纯水的冰晶形成。INP通过糖基磷脂酰肌醇而锚定在细菌表面，利于大分子蛋白的表面呈现。
发明内容
本发明主要提供了一种透明质酸酶细胞表面展示系统，将其应用于制备低分子量透明质酸和寡聚透明质酸。其技术方案如下：一种重组透明质酸酶细胞表面展示系统，具体的为，将编码透明质酸酶的基因hyl和负责跨膜定位和转运的冰核蛋白N端结构域的基因inaQ-N融合得融合后的基因片段，表达于宿主细胞表面，得到透明质酸酶细胞表面展示系统；
基因hyl具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；
基因inaQ-N具有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。
优选的，所述编码透明质酸酶的基因来源于兽疫链球菌，所述宿主细胞为Escherichiacoli宿主菌。
一种重组透明质酸酶细胞表面展示系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)将SEQIDNO：1所示的编码透明质酸酶的基因hyl和SEQIDNO：2所示的负责跨膜定位和转运的冰核蛋白N端结构域的基因inaQ-N融合，得融合后的基因片段；
(2)验证融合后的基因片段的序列；
(3)将经验证的融合后的基因片段插入温度诱导型表达质粒中，得到重组的温度诱导型表达质粒；
(4)将重组的温度诱导型表达质粒转化入宿主菌，转化有所述重组的温度诱导型表达质粒的宿主菌成为所述重组透明质酸酶细胞表面展示系统；
(5)在温控诱导下使所述重组透明质酸酶展示在所述细菌细胞表面。
优选的，步骤(3)中所述的温度诱导型表达质粒是指含有PL启动子的温度诱导型表达质粒。
优选的，所述宿主菌为大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)。
优选的，步骤(5)中所述温控诱导的具体步骤为：
(Ⅰ)将转化有所述重组的温度诱导型表达质粒的大肠杆菌接种于培养基中，在30-36℃下震摇培养10-14h；
(Ⅱ)将步骤(Ⅰ)中的细菌培养物以培养基体积的1-10％接种量转接于新鲜培养基中，在30-36℃下震摇培养；
(Ⅲ)待步骤(Ⅱ)中的细菌培养液OD600为0.6-0.9时，将培养温度升高至39-42℃，继续震摇培养至培养液的OD600为1.7-1.9；
(Ⅳ)收集(Ⅲ)中培养液中的细胞，重悬至磷酸盐缓冲液中保存于1-4℃即可。
重组透明质酸酶细胞表面展示系统可以用于制备低分子量透明质酸和寡聚透明质酸。
采用上述透明质酸酶细胞表面展示系统及其制备和应用，本发明具有以下优点：
通过基因工程手段将透明质酸酶展示在了细菌细胞的表面，只需温控诱导即可将有活性的透明质酸酶表达在宿主细胞的表面，省去了纯化蛋白的步骤，这不仅大大降低了生产LMWHA和o-HA的成本，也使得产物与酶更容易分离，而且表面展示了透明质酸酶的细胞可以收集后重复利用，节约环保。
附图说明
图1为通过PCR扩增所获得的hyl基因片段和inaQ-N基因片段的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为通过PCR扩增验证所获得的融合基因inaQ-N-hyl的琼脂糖凝胶电泳图；
图3为本发明细胞表面展示系统经温控诱导后的SDS-PAGE电泳图；
图4为经本发明细胞表面展示系统降解的透明质酸相对平均分子量随反应时间的变化图。
具体实施方式
本具体实施方式中的透明质酸酶编码基因来源于兽疫链球菌中编码透明质酸酶的基因hyl，其编码的蛋白具有透明质酸酶活性，该基因的脱氧核糖核酸(下文称为DNA)序列如SEQIDNO：1所示，该核苷酸对应的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。所用的编码冰核蛋白N端结构域的脱氧核糖核酸序列inaQ-N如SEQIDNO：2所示，该核苷酸对应的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。所编码的蛋白具有跨膜定位和转运的作用，可直接应用于细菌表面展示系统的构建。
所使用的温度诱导型表达质粒是含有PL启动子的质粒，该启动子受λ噬菌体CI基因的调控，CI基因表达的CI857阻遏蛋白在低温(30℃)时可阻遏重组基因的表达，而当培养温度高于37℃时候该阻遏蛋白失活并启动PL启动子转录，如pBV220等。
所用的宿主菌为大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)。
以下对重组透明质酸酶细胞表面展示系统的制备方法进行具体说明。
(1)以兽疫链球菌S.equisubsp.ZooepidimicusMF002的基因组DNA为模板。根据美国国家生物技术信息中心所公开的编码透明质酸酶的基因序列GenBankNo.KP661598，设计引物，通过聚合酶链式反应(下文称为PCR)来获得编码透明质酸酶的DNA片段(下文称为hyl)；根据美国国家生物技术信息中心所公开的inaQ的基因序列GenBankNo.EU360731，设计引物，通过PCR获得inaQ基因5’端525bp的DNA片段(下文称为inaQ-N)。
(2)将上述通过PCR获得的两种DNA片段与使用相应酶切位点酶切后的温度诱导型表达质粒的片段连接，来获得含有hyl与inaQ-N的融合片段(下文称为inaQ-N-hyl)的重组的温度诱导型表达质粒，通过例如序列测定来验证重组的温度诱导型表达质粒的真实性和准确性。
(3)将DNA片段插入到温度诱导型表达质粒载体，可以例如通过PCR时在目标DNA片段的两端引入合适的酶切位点，然后分别酶切目标DNA片段和质粒载体，再在例如连接酶的作用下，将酶切后的目标DNA片段以及质粒载体连接形成重组的温度诱导型表达质粒；或者通过先将两种DNA片段插入到中间质粒载体例如pMD18-TVector中，再通过酶切而获得具有所期望的酶切粘端的DNA片段，将这种DNA片段和能与之匹配的温度诱导型表达质粒载体中，最终形成重组的温度诱导型表达质粒。
(4)将上述重组的温度诱导型表达质粒转化入大肠杆菌宿主菌，可以使用42℃热激法或电转化法来进行转化，转化有上述重组的温度诱导型表达质粒的大肠杆菌成为重组透明质酸酶的细菌表面展示系统。
(5)在温控诱导下诱导在上述细菌表面展示系统表达inaQ-N-hyl所编码的蛋白质。
上述细菌表面展示系统温控诱导的具体步骤为：
(Ⅰ)将转化有重组的温度诱导型表达质粒的大肠杆菌单菌落接种于培养基例如Luria-Bertani培养基(以下称为LB培养基)中，在30-36℃下震摇培养10-14h，得到细菌培养物。根据重组质粒所携带的抗生素标记基因，培养基中可以含有相对应的抗生素例如氨苄青霉素(AMP)。
(Ⅱ)从第一步的细菌培养物中取菌液转接新鲜培养基中，接种量优选为占培养基体积的-10％，继续在30-36℃下震摇培养。
(Ⅲ)当培养物OD600为0.8左右时，将培养温度升高至39-42℃，继续震摇培养至OD600为1.8左右，此时即可使重组透明质酸酶表达在大肠杆菌细胞表面。OD600是指细菌培养液在600nm波长处的吸光值。
(Ⅳ)通过例如离心收集细胞，重悬至pH7.2的磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferedSaline，简称PBS)中，得到菌悬液，在1-4℃下进行保存备用。
上述得到的菌悬液可直接加入高分子量透明质酸溶液中30-37℃下降解透明质酸，生产低分子量透明质酸和寡聚透明质酸。
具体实施例
实施例1
1.Hyl与inaQ-N基因片段的克隆
根据美国国家生物技术信息中心的GenBank所公布的兽疫链球菌透明质酸酶基因序列设计引物(称为P1和P2)，根据GenBank中公布的inaQ的基因序列，设计引物(称为P3和P4)，分别以兽疫链球菌MF002以及丁香假单胞菌MB03基因组DNA为模板，进行PCR扩增，分别得到hyl基因片段和inaQ-N的基因片段。
P1(5’→3’)：CTGCAGATGGCAACAGGAACTGAG
P2(5’→3’)：GGATCCCCTATGATAAGGCCT
P3(5’→3’)：GAATTCATGGATCTCGACAAGGCG
P4(5’→3’)：CTGCAGGGTCTGCAAATTCTGCGG
引物P1和P4含有PstI酶切位点，引物P2含有BamHI酶切位点，引物P3含有EcoRI酶切位点。
PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保温。
将上述两组PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，分别得到大小约为2600bp和530bp的DNA片段，如图1所示。经序列测定证实，上述两个基因片段分别具有如序列表SEQIDNO：1和序列表SEQIDNO：2中所示的核苷酸序列。即获得hyl基因片段与inaQ-N基因片段。
2.温度诱导型表面展示透明质酸酶载体的构建
将上述获得的hyl基因片段与inaQ-N基因片段分别连接至pMD18-T载体，使用42℃热激法转入大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选后，挑取白斑单菌落，将所挑取出的单菌落进行培养后从中提取质粒，得到重组质粒pMD18-T-hyl与pMD18-T-inaQ-N。
用PstI/BamH对pMD18-T-hyl进行双酶切处理，用EcoRI/PstI对pMD18-T-inaQ-N进行双酶切处理，并分别经过1％琼脂糖凝胶电泳分析，回收约为2600bp和530bp大小的DNA片段，并对温度诱导型表达质粒pBV220进行EcoRI/BamHI双酶切。将上述回收的两个片段与EcoRI/BamHI双酶切处理后的pBV220在T4DNA连接酶的作用下进行酶连接，酶连接后的产物导入大肠杆菌BL21。在含有AMP的LB平板上筛选阳性克隆子，培养后提取质粒，并以其为模板，分别使用引物P3/P2、P1/P2、P3/P4进行PCR验证，如图2所示，得到了约3200bp大小的片段。对重组质粒进行测序，测序结果表明读码框正确。即得到温度诱导型表面展示透明质酸酶载体pMF006。
3.温度诱导型表面展示透明质酸酶载体的表达
将成功转化入温度诱导型表面展示透明质酸酶载体的大肠杆菌BL21命名为MF106，挑取MF106单菌落，接种于含有100μg/mL的LB培养基中，220rpm，30℃培养12h后，以5％接种量接种于更大体积的相同的培养基中，继续30℃，震摇培养至OD600为0.8时，将培养温度升高至42℃，继续震摇培养至OD600为1.8。于4℃，8000×g离心10min收集菌体，然后将菌体重悬于pH7.2的PBS缓冲液中，调OD600至1.5，取样进行SDS-PAGE分析，结果如图3所示，对比胞内表达，本表面展示体系表达了一个分子量约为1.16×105Da的蛋白，与目的蛋白大小相吻合，菌悬液于4℃保存备用。
实施例2
将平均相对分子质量为1.6×106Da的HA用pH7.2的缓冲液配制成0.1％的溶液，将上述备用菌悬液于4℃，8000×g离心10min，弃上清后，悬浮于相同体积上述1％的HA溶液中，于37℃震摇恒温水浴锅中反应，每15min使用黏度法检测相对分子量，共反应2h，反应10min时，相对分子量从初始的1.6×106Da降至5.5×105Da左右，之后HA的相对分子量随反应时间下降，反应100min后，HA的相对分子量降低至1×104Da。如图4所示。可见，对透明质酸的降解效率高，速度快。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
SEQUENCELISTING
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<213>兽疫链球菌
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Claims (7)

1.一种重组透明质酸酶细胞表面展示系统，其特征在于：将编码透明质酸酶的基因hyl和负责跨膜定位和转运的冰核蛋白N端结构域的基因inaQ-N融合得融合后的基因片段，表达于宿主细胞表面，得到透明质酸酶细胞表面展示系统；
基因hyl具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；
基因inaQ-N具有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组透明质酸酶细胞表面展示系统，其特征在于：所述编码透明质酸酶的基因来源于兽疫链球菌，所述宿主细胞为Escherichiacoli宿主菌。
3.一种权利要求1所述的重组透明质酸酶细胞表面展示系统的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将SEQIDNO：1所示的编码透明质酸酶的基因hyl和SEQIDNO：2所示的负责跨膜定位和转运的冰核蛋白N端结构域的基因inaQ-N融合，得融合后的基因片段；
(2)验证融合后的基因片段的序列；
(3)将经验证的融合后的基因片段插入温度诱导型表达质粒中，得到重组的温度诱导型表达质粒；
(4)将重组的温度诱导型表达质粒转化入宿主菌，转化有所述重组的温度诱导型表达质粒的宿主菌成为所述重组透明质酸酶细胞表面展示系统；
(5)在温控诱导下使所述重组透明质酸酶展示在所述细菌细胞表面。
4.根据权利要求3所述的重组透明质酸酶细胞表面展示系统的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的温度诱导型表达质粒是指含有PL启动子的温度诱导型表达质粒。
5.根据权利要求3所述的重组透明质酸酶细胞表面展示系统的制备方法，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)。
6.根据权利要求3所述的重组透明质酸酶细胞表面展示系统的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述温控诱导的具体步骤为：
(Ⅰ)将转化有所述重组的温度诱导型表达质粒的大肠杆菌接种于培养基中，在30-36℃下震摇培养10-14h；
(Ⅱ)将步骤(Ⅰ)中的细菌培养物以培养基体积的1-10％接种量转接于新鲜培养基中，在30-36℃下震摇培养；
(Ⅲ)待步骤(Ⅱ)中的细菌培养液OD600为0.6-0.9时，将培养温度升高至39-42℃，继续震摇培养至培养液的OD600为1.7-1.9；
(Ⅳ)收集(Ⅲ)中培养液中的细胞，重悬至磷酸盐缓冲液中保存于1-4℃即可。
7.重组透明质酸酶细胞表面展示系统在制备低分子量透明质酸和寡聚透明质酸中的应用。
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