CN1223690A

CN1223690A - 新型抗血管生成肽、其编码多核苷酸和抑制血管生成的方法

Info

Publication number: CN1223690A
Application number: CN97195989A
Authority: CN
Inventors: D·J·达维森; 王结义; E·J·格宾斯
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: AbbVie Inc
Priority date: 1996-05-03
Filing date: 1997-05-05
Publication date: 1999-07-21
Anticipated expiration: 2017-05-05
Also published as: AU3060697A; JP4426650B2; IL126626A0; NZ332319A; CZ298260B6; ATE299888T1; CN1152962C; HUP9903530A2; EP0910571A2; WO1997041824A3; DE69733756D1; WO1997041824A2; BR9708911A; DE69733756T2; HUP9903530A3; CZ342698A3; US5972896A; JP2002502235A; EP1612272B1; AU724077B2

Abstract

公开了治疗血管生成疾病的哺乳动物kringle(5)片段和kringle(%)融合蛋白。也公开了抑制血管生成疾病的方法和组合物。

Description

新型抗血管生成肽、其编码多核苷酸和抑制血管生成的方法

本申请为1997年4月3日提交的共同未决美国序号08/832,087的后续部分，而美国序号08/832,087为1996年5月3日提交的现在未决的美国序号08/643,219的后续部分。

技术领域

本发明涉及肽化学领域。更具体地讲，本发明涉及下述肽的制备和用途，所述肽含有的氨基酸序列与哺乳动物血纤溶酶源的kringle 5区的相应序列大致相似；本发明涉及含有所述肽的药用组合物、制管张素受体的特异性抗体、制管张素检测的方法和测定、连接制管张素蛋白的细胞毒性剂和由血管生成引起或恶化的疾病的治疗。

发明背景

血管生成即形成新血管的过程，它是包括生殖、发育和伤口修复在内的正常机体活性所必需的。尽管没有完全了解该过程，但据信它包括调节内皮细胞(毛细血管的初级细胞)生长的分子的复杂的相互作用。在正常条件下，这些分子似乎将微脉管系统保持在静止状态(即没有任何毛细管生长)，其保持时间可以持续长达数周，在某些情况下长达数十年。必要时(诸如在伤口修复期间)，这些同样的分子可以在5天内经历快速增殖和转换(folkman,J．和Shing,Y.,The Journal ofBiological Chemistry,267(16),10931-10934，以及Folman,J．和Klagsbrun,M.,Science,235,442-447(1987)。

尽管血管生成在正常情况下为高度受调节的过程，但持久的非调节血管生成引起许多疾病(以血管生成疾病为特征)。另有陈述，非调节的血管生成或者可以直接引特定的疾病，或者可以使现有病况恶化。例如，已经暗示眼新血管形成为眼盲的最常见的原因，并控制大约20种眼病。在诸如关节炎的某些现有疾病中，新形成的毛细血管侵入所述关节并破坏软骨。在糖尿病中，在视网膜中形成的新毛细管侵入玻璃体、出血并引起眼盲。实体瘤的生长和转移也依赖于血管生成(Folkman,J.,Cancer Research,46,467-473(1986),Folkman,J.,Journalof the National Cancer Institute,82,4-6(1989)。例如已经表明，增大至2mm以上的肿瘤必须获得它们自身的血供应，并通过诱导新毛细血管生长而获得血供应。一旦这些新血管包埋于该肿瘤中，它们则提供肿瘤细胞进入循环的工具，并转移到诸如肝脏、肺或骨之类的较远部位(Weidner,N．等,The New England Journal of Medicine,324(1)：1-8(1991))。

迄今为止，已经描述和特征记述了几种天然产生的血管生成因子(Fidler,J．和Ellis,L.M.,Cell,79:185-189(1994))。最近，O’Reilly等已经从患病肿瘤小鼠的血清和尿中分离并纯化了一种抑制内皮细胞增殖的38千道尔顿(kDa)蛋白(O’Reilly,M．等，Cell,79:315-328(1994)和于1995年11月2日公布的国际申请WO 95/29242)。该内皮抑制剂的微序列分析表明与鼠血纤溶酶源内部片段有98％的序列同源性。作为鼠抑制剂片段命名的制管张素为包括鼠血纤溶酶源前四个kringle区的肽。来自人血纤溶酶源同一区的肽片段(即含有kringle 1-4)在体外和体内也强烈地抑制毛细管内皮细胞的增殖。衍生该肽片段的完整的血纤溶酶源不具有有效抑制剂的作用。

目前正在开发用于治疗血管生成疾病的几种血管生成抑制剂(Gasparini,G．和Harris,A.L.，J.Clin,Oncol.,13(3):765-782,(1995))，但这些化合物有一些相关的缺点。例如，苏拉明是一种有效的抑制剂，但在抗肿瘤活性所需的剂量下引起人严重的系统性毒性。诸如retinoid、干扰素和抗雌激素之类的化合物对于人类使用是安全的，但具有弱抗血管生成作用。另外的化合物可能难以制备或制备成本高。

因此，需要可用于治疗哺乳动物血管生成疾病的化合物。更具体地讲，需要治疗使用安全的血管生成抑制剂，并且所述血管生成抑制剂例如通过选择性地抑制内皮细胞增殖，同时对正常(即非癌性)细胞不表现出或表现出低程度毒性，对于病理状态表现出选择性毒性。这类化合物也应该容易并且成本有效地制备。

发明概述

在本发明的基本实施方案中，本发明提供由结构式A-B-C-X-Y(Ⅰ)表示的kringle 5肽化合物或其药学上可接受的盐、酯或前体药物，其中A不存在或为氮保护基团；Y不存在或为羧酸保护基团；B不存在或为相应于SEQ ID NO:1的大约氨基酸位置334至氨基酸位置530序列的1至大约197个天然产生的氨基酸残基；C为R¹-R²-R³-R⁴，其中R¹为赖氨酰；R²为亮氨酰或精氨酰；R³为酪氨酰、3-I-酪氨酰或苯丙氨酰；R⁴为天冬氨酰；而X不存在或为相应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置535至大约氨基酸位置546序列的1至大约12个天然产生的氨基酸残基或其同源物(homologues)和类似物。

本发明也包括由结构式A-B₁-C₁-X₁-Y(Ⅱ)表示的kringle 5肽化合物或其药学上可接受的盐、酯或前体药物，其中A不存在或为氮保护基团；Y不存在或为羧酸保护基团；B₁不存在或为相应于SEQ ID NO：1的大约氨基酸位置334至氨基酸位置513序列的1至大约176个天然产生的氨基酸残基；C₁为SEQ ID NO:1的氨基酸位置514至氨基酸位置523的序列；而X₁不存在或为相应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置524至氨基酸位置533序列的1至大约10个天然产生的氨基酸残基或其同源物和类似物。

本发明也包括需要抗血管生成疗法的病人的治疗方法，包括给与该病人含kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白的化合物。

本发明也包括需要抗血管生成疗法的病人的治疗组合物，它包括含kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白、kringle 5抗血清、kringle 5受体激动剂和拮抗剂以及连接细胞毒性药物的kringle 5拮抗剂的化合物，所述化合物或者为单独的或者与药学上可接受的赋形剂和/或可选的缓释化合物结合，以形成治疗组合物。

本发明也包括选自癌症、结构域、黄斑变性和糖尿病性视网膜病的疾病的治疗组合物，它包括含kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白的化合物。

本发明也包括一组合物，它包含分离的编码kringle5肽片段或融合蛋白的单链或双链多核苷酸序列。这样的多核苷酸最好是DNA分子。本发明也包括含有编码kringle 5肽片段或融合蛋白的DNA序列的载体，其中该载体存在于细胞中时，能够表达kringle 5肽片段或kringle5融合蛋白，本发明也包括包含含载体的细胞的组合物，其中所述载体含有编码kringle 5肽片段和kringle 5融合蛋白的DNA序列。本发明还包括基因治疗方法，用此方法，将编码kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白或kringle 5肽片段缀合物的DNA序列导入病人中，以体内修饰kringle 5水平。

本发明也包括制备kringle 5肽片段的方法，包括步骤：(a)将哺乳动物血纤溶酶源以大约1∶100至大约1∶300的比率暴露于人或猪弹性蛋白酶，以形成所述血纤溶酶源和所述弹性蛋白酶的混合物；(b)温育所述混合物并且(c)从所述混合物中分离所述kringle 5肽片段。

本发明也包括kringle 5肽片段的制备方法，包括步骤：(a)将哺乳动物血纤溶酶源以大约1∶100至大约1∶300的弹性蛋白酶：血纤溶酶源之比暴露于人或猪弹性蛋白酶，以形成所述血纤溶酶源和所述弹性蛋白酶的混合物；(b)温育所述混合物；并(c)从所述混合物中分离所述kringle 5肽片段的蛋白缀合物；(d)将所述kringle 5肽片段的蛋白缀合物以1∶0.2的比率暴露于胃蛋白酶，以形成所述胃蛋白酶和所述血纤溶酶源的混合物，并且(d)从所述混合物中分离所述kringle 5肽片段。另一方面，可以用以下方法制备kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白，所述方法包括步骤：(a)分离编码kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白的多核苷酸；(b)将该多核苷酸克隆到表达载体中；(c)将该载体转化到合适的宿主细胞中；并且让所述宿主细胞在适于可溶性kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白表达的条件下生长。

附图简述

图1显示人血纤溶酶源的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。

图2显示人(SEQ ID NO:34)、鼠(SEQ ID NO:35)、猕猴(SEQ IDNO:36)、牛(SEQ ID NO:37)和猪(SEQ ED NO:38)kringle5的比较同源性。

图3显示人血纤溶酶源的DNA序列(SEQ ID NO:12)。

图4显示在体外细胞增殖测定中测试时，单剂量的不同kringle片段对牛毛细管内皮(BCE)细胞的抗增殖活性的图表。

图5显示表达载体pHil-D8的图谱，该载体含有重组蛋白分泌的前导序列。

图6显示表达kringle 5肽片段或融合蛋白的巴斯德毕赤酵母培养物上清液(10微升/泳道)的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶照片的扫描。泳道1、6和10：阴性对照；泳道2、3和4：表达K5A的三种不同克隆；泳道5：表达K5F的克隆；泳道7和8：表达K4-5A的克隆；泳道9：表达K4-5F的克隆。箭头指示K5A(大约11 kDa)和K4-5F(大约20kDa)的蛋白带。分子量标准参照物示于前述泳道1和10的泳道中。

图7显示表达kringle 5肽片段或融合蛋白的大肠杆菌菌株的扫描考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶。除非另外陈述，否则每一泳道都含有10 μl相当于A600为10的培养物材料。泳道1：低分子量标准参照物；泳道2：K5A/pET32a，总培养物；泳道3：K5A/pET32a，总培养物(泳道2培养物的1/10)；泳道4：K5A/pET32a，可溶性部分；泳道5：K5A/pET32a，不溶性部分；泳道6：K4-5A/pET32a，总培养物；泳道7：K4-5A/pET32a，总培养物(泳道6培养物的1/10)；泳道8：K4-5A/pET32a，可溶性部分；泳道9:K4-5A/pET32a，不溶性部分；泳道10:K4-5A/pGEX-4T-2，总培养物；泳道11:K4-5A/pGEX-4T-2，可溶性部分；泳道12:K4-5A/pGEX-4T-2，不溶性部分；泳道13:kringle 5标准；泳道14：高分子量标准参照物。

发明详述

本文所用的术语“kringle 5”(下文的K5)是指哺乳动物血纤溶酶源具有三个二硫键的区域，该区影响哺乳动物血纤溶酶源分子第五个kringle区限定的特定三围构象。一个这样的二硫键连接氨基酸位置462和541的半胱氨酸残基，第二个二硫键连接氨基酸位置483和524的半胱氨酸残基，第三个二硫键连接氨基酸位置512和536的半胱氨酸残基。包括其kringle 5区在内的完整的哺乳动物血纤溶酶源分子(人血纤溶酶源分子)的氨基酸序列示于图1(SEQ ID NO:1)。

本文所用的术语“kringle 5肽片段”是指4-104氨基酸(包括4和104氨基酸)之间的肽，其序列于人血纤溶酶源相应的肽片段大致同源，在完整哺乳动物血纤溶酶源的大约氨基酸位置443具有α-N末端，在大约位置546具有α-C末端。所述kringle 5肽片段的总长可以随获得所述kringle 5肽的方法而变化，或者根据获得它的物种，在序列中可以略微改变。例如，可以采用人或猪弹性蛋白酶，通过蛋白水解切割glu-血纤溶酶源、lys-血纤溶酶源或小血纤溶酶源(miniplasminogen)，产生某些形式的kringle 5肽片段。当以该方式产生时，所述肽残基的α-C末端位于SEQ ID NO:1的大约氨基酸543，但所述α-N末端可以开始于氨基酸位置443、449或454。因此，由人或猪弹性蛋白酶消化glu-血纤溶酶源、lys-血纤溶酶源或小血纤溶酶源产生的kringle 5肽片段的总长度可以或者为101个氨基酸、95个氨基酸，或者为90个氨基酸。这些kringle 5肽片段的概述示于表1。当以上述方式产生时，获得这三种片段的库，其中大约60％的所述片段的长度为95个氨基酸，大约35％的所述片段的长度为101个氨基酸，大约5％的所述片段的长度为90个氨基酸。需要时，这些不同的片段可以通过本领域技术人员熟知的技术反向HPLC进一步纯化。虽然存在这种长度的变化，但本发明的K5肽片段仍然包括或者序列Lys-Leu-Tyr-Asp(即从SEQ ID NO:1的氨基酸位置531至氨基酸位置534)或者Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gly-Pro-Trp(即从SEQ ID NO:1的氨基酸位置514至氨基酸位置523)或其类似物。

本文所用的术语“kringle 5融合蛋白”是指包含从两个或多个单独的蛋白取出的氨基酸序列的多核苷酸，其中一个氨基酸序列为K5肽片段。将kringle 5肽片段的编码序列与至少一种其它多肽的编码序列连接，使得这两个(或更多)读框在同一读框内，通过表达这样一个多核苷酸形成融合蛋白。优选的kringle 5融合蛋白为其中kringle 5肽片段融合到人血纤溶酶源相应序列的那些kringle 5融合蛋白，所述人血纤溶酶源相应序列诸如为kringle 4(K4)、kringle 3-4(K3-4)、kringle2-4(K2-4)和kringle 1-4(K1-4)。优选的K5融合蛋白是kringle 4-5(K4-5)。本发明kringle 5融合蛋白的其它例子包括K5肽片段或连接到生物标记的K4-5。这种融合蛋白可能能够或不能切割为分离的衍生它们的蛋白。

本文所用的术语“K5肽片段缀合物”是指化学上于另一蛋白偶联形成缀合物的kringle 5肽片段。kringle 5肽片段缀合物的例子包括偶联到白蛋白或哺乳动物血纤溶酶源另一kringle区的肽片段上的kringle 5肽片段。kringle 5肽片段缀合物的分子量为大约1,000至大约25,000 kDa。

本文所用的术语：“序列大致同源性”是指人血纤溶酶源相应肽序列大约60％的氨基酸相同，优选至少大约70％的氨基酸相同，更优选大约80％的氨基酸相同，最优选大约95％的氨基酸相同。其序列与人血纤溶酶源大致同源的序列称为“同源物”。除具有序列大致同源性外，本发明的同源物证明生物学活性(即抗血管生成活性)与本文所述K5肽片段的相似。因为kringle 5肽片段的氨基酸序列或氨基酸数目在种与种之间或不同生产方法之间可以有所不同，所以kringle 5肽片段中的氨基酸总数在某些情况下不能精确地限定。已知这些序列至少73％的氨基酸相同，应该理解，kringle 5肽片段的氨基酸序列在物种之间大致相似，并且kringle 5肽片段的生产方法提供序列与人血纤溶酶源相应氨基酸序列大致同源的kringle 5肽片段。图2显示具有95个氨基酸的人kringle 5肽片段的氨基酸序列(SEQ ID NO:34)与鼠(SEQID NO:35)、猕猴(SEQ ID NO:36)、牛(SEQ ID NO:37)和猪(SEQ ID NO:38)血纤溶酶源kringle 5片段序列的比较。

本发明也设想了这样的氨基酸残基序列，它们与本文提出的序列类似，使得那些序列(类似物)证明生物学活性与公开的kringle 5肽片段或其融合蛋白的生物学活性相象。本领域众所周知可以进行修饰和改变，而大致不改变该肽生物学功能。在制造这种改变中，可以在如为其大小、电荷、疏水性、亲水性等等的侧链取代基相对相似的基础上，进行相象氨基酸残基的置换。可以进行所述类型的改变，以增强所述肽的效力或对酶促分解或药物动力学的稳定性。因此，本发明范围内认定的序列包括特征为氨基酸残基序列或类型改变的那些类似物序列，其中所述改变不改变上述K5肽片段和/或融合蛋白的基本性质和生物学活性。

可以在测试其体外抑制牛毛细管(BCE)细胞生长的能力时的效力的基础上，特征鉴定本发明的K5肽片段或K5融合蛋白。表1和图4的数据说明，具有SEQ ID NO:1氨基酸位置443至氨基酸位置543序列的K5肽片段与具有SEQ ID NO:1的氨基酸位置443至氨基酸位置546序列的kringle 5肽片段相比，表现出活性提高大约300倍(即抑制BCE细胞增殖)，与kringle 1-4肽片段相比，活性提高大约800倍。

本文所用的术语“分离的”是指该材料从其原始环境(例如若它是天然产生的，则为所述天然环境)中取出。例如天然产生的多核苷酸或活动物中存在的多肽是不分离的，但从所述天然系统中某些或所有共存材料中分离出来的同一多核苷酸或DNA或多肽则是分离的。这类多核苷酸可以是载体的部分和/或这种多核苷酸或多肽可以是组合物的部分，它们仍是分离的，因为该载体或组合物不是其天然环境的部分。

术语“引物”表示与靶核苷酸序列互补的特定寡核苷酸序列，用来与该靶核苷酸杂交，并用作或者由DNA聚合酶、RNA聚合酶或者由逆转录酶催化的核苷酸聚合的起始点。

术语“探针”表示限定的核酸区段(或核苷酸类似物区段，即PNA)，它可以用来鉴别样品中存在的含有所述互补序列的特定DNA。

本文所用的“重组多肽”是指至少一种多肽，根据其来源或操作，它们不与其天然相连的多肽的所有部分或一部分相连和/或与天然连接多肽以外的肽连接。重组或衍生多肽不必从指定核酸序列翻译。它也可以以任何方式产生，所述方式包括化学合成或重组表达系统的表达。

本文所用的术语“合成肽”是指任何长度的氨基酸聚合形式，它可以用本领域技术人员熟知的方法合成。这些合成肽可用于不同应用。

“纯化的多核苷酸”是指基本上是游离的目的多核苷酸或其片段，即含有低于大约50％、优选低于大约70％、更优选低于大约90％的与所述多核苷酸天然相连的蛋白。纯化目的多核苷酸的技术是本领域众所周知的，例如包括用破膜试剂破碎含有所述多核苷酸的细胞，并通过离子交换层析、亲和层析和根据密度的沉淀分离所述多核苷酸和蛋白。因此，“纯化多肽”是指基本上游离的多肽，即含有低于大约50％、优选低于大约70％、更优选低于大约90％的与所述目的多肽天然相连的细胞组分。纯化方法是本领域已知的。

本文所用的“多肽”表示氨基酸分子链，不是指该产物的特定长度。因此，肽、寡肽和蛋白都包括在多肽的定义内。该术语也意指该多肽表达后的修饰，例如糖基化、酰化、磷酸化等等。

“重组宿主细胞”、“宿主细胞”、“细胞”、“细胞系”“细胞培养物”和其它这类表示微生物或作为单细胞实体的高等真核生物细胞系培养物的术语，是指可以用作或已经用作重组载体或其它转移的DNA的受体的细胞，并包括已经转染的原始细胞的最初子代。

本文所用的“复制子”是指任何遗传元件，例如表现为细胞内多核苷酸复制的自主单位的质粒、染色体和病毒。

“载体”为一种复制子，其中连接另一多核苷酸区段，诸如引起复制和/或表达连接的区段。

术语“控制序列”是指实现与其连接的编码序列表达所需的多核苷酸序列。这类控制序列的性质随宿主生物而改变。在原核生物中，这类控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和终止子；在真核生物中，这类控制序列一般包括启动子、终止子以及在某些情况下的增强子。因此，术语“控制序列”计划包括其存在对表达是必需的最低限度的所有组分，也可以包括其存在是有利的其它组分，例如前导序列。

“可操作性地(operably)连接的”是指这样一种情况，在这种情况下所述组分处于允许它们以其计划的方式起作用的关系之中。因此，例如“可操作性地连接”到一编码序列的控制序列以这样的方式连接，使得在与所述控制序列相容的条件下实现该编码序列的表达。

术语“可读框”或“ORF”是指编码多肽的多核苷酸序列区；该区可以代表一部分编码序列或总编码序列。

“编码序列”是置于适当调节序列控制下时转录为mRNA并翻译为多肽的多核苷酸序列。该编码序列的边界由所述5’末端的翻译起始密码子和所述3’末端的翻译终止密码子确定的。编码序列可以包括但不限于mRNA、cDNA和重组多核苷酸序列。

术语“转化”是指宿主细胞中的外源多核苷酸插入片段，与插入使用的方法无关。包括例如直接摄取、转导或f交配。所述外源多核苷酸可以作为例如质粒的非整合载体保持，或者可以整合到宿主基因组中。

“纯化的产物”是指产物的制剂，所述产物已经和与其正常相连的细胞组分分离，并和目的样品中存在的其它类型的细胞分离。

所有肽序列按照普遍接受的惯例书写，由此所述α-N末端氨基酸残基在左边，而所述α-C末端在右边。本文所用的术语“α-N末端”是指肽中氨基酸的游离α-氨基，术语“α-C末端”是指肽中氨基酸的游离α-羧酸末端。

本文所用的术语“N-保护基团”是指计划在合成步骤中保护氨基酸或肽的α-N末端或者换句话说保护氨基酸或肽的所述氨基抵抗不良反应的那些基团。在Greene,“Protective Groups In Organic Synthesis,”(John Wiley & Sons，纽约(1981))中公开了常用的N-保护基团，该文献通过引用结合到本文中。另外，保护基团可以用作体内易于例如通过酶促水解切割以释放生物学活性母体的前体药物。N-保护基团包括低级链烷酰基，诸如甲酰基、乙酰基(“Ac”)、丙酰基、戊酰基、叔丁基乙酰基等等；其它酰基，包括2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、邻苯二酰基、邻硝基苯氧基乙酰基、α-氯丁酰基、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基等等；磺酰基，诸如苯磺酰基、对甲苯磺酰基等等；氨基甲酸酯形成基团，诸如苄酯基、对氯苄酯基、对甲氧基苄酯基、对硝基苄酯基、2-硝基苄酯基、对溴苄酯基、3,4-二甲氧基苄酯基、3,5-二甲氧基苄酯基、2,4-二甲氧基苄酯基、4-甲氧基苄酯基、2-硝基-4,5-二甲氧基苄酯基、3,4,5-三甲氧基苄酯基、1-(对联苯基)-1-甲基乙酯基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苄酯基、二苯甲酯基、叔丁酯基、二异丙基甲酯基、异丙酯基、乙酯基、甲酯基、烯丙酯基、2,2,2-三氯乙酯基、苯氧羰基、4-硝基苯氧羰基、芴基-9-甲酯基、环戊酯基、金刚烷酯基(adamantyloxycarbony1)、环己酯基、苯硫羰基等等；芳烷基，诸如苄基、三苯甲基、苯氧基甲基、9-芴基甲酯基(Fmoc)等等和甲硅烷基，诸如三甲基甲硅烷基等等。优选的N-保护基团为甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、戊酰基、叔丁基乙酰基、苯磺酰基、苄基、叔丁酯基(Boc)和苄酯基(Cbz)。例如可以用酸不稳定基团(例如Boc)保护赖氨酸的α-N末端，用碱不稳定基团(例如Fmoc)保护ε-N末端，然后在合成期间选择性地去保护。

本文所用的术语“羧基保护基团”是指羧酸保护性酯或酰胺基团，它们用来阻断或保护所述羧酸官能度，同时进行涉及该化合物其它官能位点的反应。在Greene，“Protective Groups In OrganicSynthesis，”第152-186页(1981)中公开了常用的羧基保护基团，该文献通过引用结合到本文中。另外，羧基保护基团可以用作体内易于例如通过酶促水解切割以释放生物学活性母体的前体药物。这类羧基保护基团是本领域技术人员熟知的，已经广泛用于如美国专利3,840,556号和3,719,667号中所述的青霉素和头孢霉素领域中的羧基保护中，这些专利说明书通过引用结合到本文中。代表性的羧基保护基团为C1-C8低级烷基(例如甲基、乙基或叔丁基等等)；芳烷基，诸如苯乙基或苄基和其取代衍生物，诸如烷氧基苄基或硝基苄基等等；芳基链烯基，诸如苯基乙烯基等等；芳基及其取代衍生物，诸如5-2,3-二氢化茚基等等；二烷基氨基烷基，诸如二甲基氨乙基等等)；链烷酸基烷基，诸如乙酸基甲基、丁酸基甲基、戊酸基甲基、异丁酸基甲基、异戊酸基甲基、1-(丙酸基)-1-乙基、1-(戊酸基)-1-乙基、1-甲基-1-(丙酸基)-1-乙基、戊酸基甲基、丙酸基甲基等等；环烷酸基烷基，诸如环丙酸基、环丁酰基甲基、环戊酰基甲基、环己酰基甲基等等；芳酸基烷基，诸如苯甲酰基甲基、苯甲酰基乙基等等；芳烷酸基烷基，诸如苯甲酸基甲基、2-苯甲酸基甲基等等；链烷酯基烷基或环烷酯基烷基，诸如甲酯基甲基、环己酯基甲基、1-甲酯基-1-乙基等等；链烷氧羰基氧基烷基或环烷酯基氧基烷基，诸如甲氧羰基氧基甲基、叔丁氧羰基氧基甲基、1-乙氧羰基氧基-1-乙基、1-环己氧羰基氧基-1-乙基等等；芳氧羰基氧基烷基，诸如2-(苯氧基羰基氧基)乙基、2-(5-2,3-二氢化氧羰基氧基)乙基等等；烷氧基烷酯基烷基，诸如2-(1-甲氧基-2-甲基丙-2-酯基)乙基等等；芳基链烷氧羰基氧基烷基，诸如2-(苄氧羰基氧基)乙基等等；芳基链烯氧羰基氧基烷基，诸如2-(3-苯基丙烯-2-基氧羰基氧基)乙基等等；链烷氧羰基氨基烷基，诸如叔丁氧羰基氨甲基等等；烷基氨基羰基氨基烷基，诸如甲基氨基羰基氨甲基等等；链烷酰基氨基烷基，诸如乙酰基氨基甲基等等；杂环羰基氧基烷基，诸如4-甲基哌嗪基羰基氧基甲基等等；二烷基氨基羰基烷基，诸如二甲基氨基羰基甲基、二乙基氨基羰基甲基等等；(5-(低级烷基)-2-氧代-1,3-二氧杂环戊烯-4-基)烷基，诸如(5-叔丁基-2-氧代-1,3-二氧杂环戊烯-4-基)甲基等等；和(5-苯基-2-氧代-1,3-二氧杂环戊烯-4-基)烷基，诸如(5-苯基-2-氧代-1,3-二氧杂环戊烯-4-基)甲基等等。

代表性的酰胺羧基保护基团为氨基羰基和低级烷基氨基羰基。

本发明的优选羧基保护基团为这样的化合物，其中受保护的羧基为低级烷基、环烷基或芳烷基酯，例如甲酯、乙酯、丙酯、异丙酯、丁酯、仲丁酯、异丁酯、戊酯、异戊酯辛酯、环己酯、苯甲酯等等或链烷酸基烷基、环烷酸基烷基、芳酸基烷基或芳烷基酯基烷基酯。优选的酰胺羧基保护基团为低级烷基氨基羰基。例如可以用酸不稳定基团(例如叔丁基)保护天冬氨酸的α-C末端，用氢化不稳定基团(例如苄基)保护β-C末端，在合成期间选择性地去保护。

本文所用的术语“低级烷基氨基羰基”是指将合成的kringle 5肽片段的α-C末端封端的-C(O)NHR¹⁰基团，其中R¹⁰为C₁-C₄烷基。

本文所用的术语“氨基羰基”表示将合成的kringle 5肽片段的α-C末端封端的-C(O)NH₂基团。

本文所用的术语“前体药物”是指易于在体内例如通过血液中的酶促水解转化产生母体化合物的化合物。在A.C.S．论文集系列的T.Higuchi和V.Stella,Prodrugs as Novel Delivery Systems，第14卷和Edward B.Roche编辑的Bioreversible Cariers in Drug Design,AmericanPharmaceutical Associtation and Permagon Press,1987中提供了全面的讨论，这两个文献通过引用结合到本文中。

本文所用的术语“药学上可接受的前体药物”是指(1)本发明化合物的那些前体药物，它们在正确的医学判断范围内，适用于与人类和低等动物的组织接触，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应等等，与合适的利益与风险之比相称，并且对于其计划的用途是有效的，以及(2)两性离子形式，可能时为母体化合物的两性离子形式。

本文所用的术语“活化酯衍生物”是指酰基卤，诸如酰基氯，活化酯包括但不限于甲酸和乙酸衍生的酸酐、由诸如异丁酰基氯等等的链烷酰基卤衍生的酸酐、N-羟基苯并三唑衍生的酯、N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰胺衍生的酯、2,4,5-三氯苯酚衍生的酯等等。

本文所用的术语“抗血管生成活性”是指分子抑制血管生长的能力。

本文所用的术语“内皮抑制活性”是指分子大体上抑制血管生成的能力，例如在成纤维细胞生长因子或其它已知生长因子存在下抑制培养中的牛毛细管内皮细胞生长或迁移的能力。

本文所用的术语“ED₅₀”为kringle 5肽片段或融合蛋白的剂量的缩写，与在没有所述抑制剂情况下生长或迁移的情况相比，该剂量在成纤维细胞生长因子或其它已知生长因子存在下，有效地抑制半数血管生长或抑制培养中的半数牛毛细管内皮细胞生长、或抑制半数内皮细胞迁移。

对于大部分而言，本文所用的天然产生的氨基酸和本文所用的氨酰基残基的名称采纳IUPAC委员会对有机化学命名法和IUPAC-IUB委员会对α-氨基酸命名法(推荐，1974),Biochemistry,14(2),(1975)中提出的生化命名法建议的命名习惯。因此，术语“Ala”、“Arg”、“Asn”、“Asp”、“Cys”、“Gln”、“Glu”、“Gly”、“His”、“Ile”、“Leu”、“Lys”、“Met”、“Phe”、“Pro”、“Ser”、“Thr”、“Trp”、“Tyr”和“Val”是指氨基酸丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸，肽中其相应的氨酰基残基为L-、D-或D,L-形式。没有指明具体构象时，本领域技术人员应该理解，本说明书和所附权利要求书中所述肽中氨基酸和氨酰基残基的α-碳的立体化学为天然产生的构象或“L”构象，非手性分子甘氨酸除外，非手性或者指明为“D-”的任何氨基酸也除外。

本文所用的术语“3-I-Tyr”是指L-、D-或D,L-酪氨酰残基，其中苯酚羟基邻位的氢基被碘基取代。所述碘基可以是放射性的或非放射性的。

本发明也设想了具有非天然产生侧链残基的氨基酸残基，诸如高苯丙氨酸、苯基甘氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、噻唑酰基丙氨酸(thiazoylalanine)(2-、4-和5-取代的)等等。

因此应该理解，本发明设想包括kringle 5肽片段和kringle 5融合蛋白具有抗血管生成活性的任何衍生物，包括整类本文所述kringle 5肽片段和融合蛋白及其片段和蛋白的同源物或类似物。因此，本发明不取决于生产kringle 5肽片段或融合蛋白的方式，即通过(1)蛋白水解切割分离哺乳动物血纤溶酶源，(2)通过具有kringle 5肽片段或融合蛋白氨基酸序列的编码多核苷酸的重组分子的表达，以及(3)本领域技术人员已知的固相合成技术。

在一个实施方案中，本发明提供具有一般结构B-C-X的肽，其中B为88个残基的肽，它起始于SEQ ID NO:1的Val⁴⁴³，终止于Arg⁵³⁰；C为4个残基的肽，其中R¹和R⁴为先前定义的，R²为亮氨酰，而R³为酪氨酰；X为9个残基的肽，它起始于SEQ ID NO:1的Tyr⁵³⁵，终止于Ala⁵⁴³。

在另一实施方案中，本发明提供具有一般结构B-C-X的肽，其中B为82个残基的肽，它起始于SEQ ID NO:1的Val⁴⁴⁹，终止于Arg⁵³⁰；C为4个残基的肽，其中R¹和R⁴为先前定义的，R²为亮氨酰，而R³为酪氨酰；X为9个残基的肽，它起始于SEQ ID NO:1的Tyr⁵³⁵，终止于Ala⁵⁴³。

在再一个实施方案中，本发明提供具有一般结构B-C-X的肽，其中B为77个残基的肽，它起始于SEQ ID NO:1的Val⁴⁵⁴，终止于Arg⁵³⁰；C为4个残基的肽，其中R¹和R⁴为先前定义的，R²为亮氨酰，而R³为酪氨酰；X为9个残基的肽，它起始于SEQ ID NO:1的Tyr⁵³⁵，终止于Ala⁵⁴³。

在再一个实施方案中，本发明提供具有一般结构B-C-X的肽，其中B为88个残基的肽，它起始于SEQ ID NO:1的Val⁴⁴³，终止于Arg⁵³⁰；C为4个残基的肽，其中R¹和R⁴为先前定义的，R²为亮氨酰，而R³为酪氨酰；X为12个残基的肽，它起始于SEQ ID NO:1的Tyr⁵³⁵，终止于Phe⁵⁴⁶。

在再一个实施方案中，本发明提供具有一般结构B-C-X的肽，其中B为82个残基的肽，它起始于SEQ ID NO:1的Val⁴⁴⁹，终止于Arg⁵³⁰；C为4个残基的肽，其中R¹和R⁴为先前定义的，R²为亮氨酰，而R³为酪氨酰；X为12个残基的肽，它起始于SEQ ID NO:1的Tyr⁵³⁵，终止于Phe⁵⁴⁶。

在再一个实施方案中，本发明提供具有一般结构B-C-X的肽，其中B为77个残基的肽，它起始于SEQ ID NO:1的Val⁴⁴⁹，终止于Arg⁵³⁰；C为4个残基的肽，其中R¹和R⁴为先前定义的，R²为亮氨酰，而R³为酪氨酰；X为12个残基的肽，它起始于SEQ ID NO:1的Tyr⁵³⁵，终止于Phe⁵⁴⁶。

在再一个实施方案中，本发明提供具有一般结构B-C-X的肽，其中B为176个残基的肽，它起始于SEQ ID NO:1的Val³⁵⁵，终止于Arg⁵³⁰；C为4个残基的肽，其中R¹和R⁴为先前定义的，R²为亮氨酰，而R³为酪氨酰；X为12个残基的肽，它起始于SEQ ID NO:1的Tyr⁵³⁵，终止于Ala⁵⁴³。

在再一个实施方案中，本发明提供具有一般结构B-C-X的肽，其中B为176个残基的肽，它起始于SEQ ID NO:1的Val³⁵⁵，终止于Arg⁵³⁰；C为4个残基的肽，其中R¹和R⁴为先前定义的，R²为亮氨酰，而R³为酪氨酰；X为12个残基的肽，它起始于SEQ ID NO:1的Tyr⁵³⁵，终止于Phe⁵⁴⁶。

在再一个实施方案中，本发明提供具有一般结构A-C-Y的肽，其中A为乙酰基；C为4个残基的肽，其中R¹和R⁴为先前定义的，R²为亮氨酰，而R³为酪氨酰；Y为氨基羰基。

在再一个实施方案中，本发明提供具有一般结构A-C-X-Y的肽，其中A为乙酰基；C为4个残基的肽，其中R¹和R⁴为先前定义的，R²为亮氨酰，而R³为酪氨酰；X为酪氨酸；而Y为氨基羰基。

在再一个实施方案中，本发明提供具有一般结构A-B-C-Y的肽，其中A为乙酰基；B为起始于SEQ ID NO:1的氨基酸位置Pro⁵²⁹并终止于氨基酸位置Arg⁵³⁰的二肽；C为4个残基的肽，其中R¹和R⁴为先前定义的，R²为亮氨酰，而R³为酪氨酰；而Y为氨基羰基。

在再一个实施方案中，本发明提供具有一般结构A-B-C-Y的肽，其中A为乙酰基；B为起始于SEQ ID NO:1的氨基酸位置Pro⁵²⁹并终止于氨基酸位置Arg⁵³⁰的二肽；C为4个残基的肽，其中R¹和R⁴为先前定义的，R²为亮氨酰，而R³为酪氨酰；Y为氨基羰基。

在再一个实施方案中，本发明提供具有一般结构A-B-C-X-Y的肽，其中A为乙酰基；B为起始于SEQ ID NO:1的氨基酸位置Tyr⁵²⁵并终止于氨基酸位置Arg⁵³⁰的六肽；C为4个残基的肽，其中R¹和R⁴为先前定义的，R²为亮氨酰，而R³为酪氨酰；X为酪氨酰；Y为氨基羰基。

在再一个实施方案中，本发明提供具有一般结构A-B-C-X-Y的肽，其中A为乙酰基；B为精氨酰；C为4个残基的肽，其中R¹和R⁴为先前定义的，R²为亮氨酰，而R³为酪氨酰；X为酪氨酰；Y为氨基羰基。

在再一个实施方案中，本发明提供具有一般结构A-B-C-X-Y的肽，其中A为乙酰基；B为起始于SEQ ID NO:1的氨基酸位置Pro⁵²⁹并终止于氨基酸位置Arg⁵³⁰的二肽；C为4个残基的肽，其中R¹和R⁴为先前定义的，R²为亮氨酰，而R³为酪氨酰；X为3-I-酪氨酰；Y为氨基羰基。

在再一个实施方案中，本发明提供具有一般结构A-B-C-X-Y的肽，其中A为乙酰基；B为起始于SEQ ID NO:1的氨基酸位置Pro⁵²⁹并终止于氨基酸位置Arg⁵³⁰的二肽；C为4个残基的肽，其中R¹和R⁴为先前定义的，R²为亮氨酰，而R³为酪氨酰；X为酪氨酰；Y为氨基羰基。

在再一个实施方案中，本发明提供具有一般结构A-B₁-C₁-X₁-Y的肽，其中A为乙酰基；B₁和X₁不存在，C₁为起始于SEQ ID NO:1的氨基酸位置Arg⁵¹⁴并终止于氨基酸位置Trp⁵²³的10个残基的肽；Y为氨基羰基。

代表性的本发明化合物包括这样的化合物，其中A乙酰基，Y为氨基羰基，而B-C-X为(a) SEQ ID NO:1的氨基酸位置355-543的序列；(b) SEQ ID NO:1的氨基酸位置355-546的序列；(c) SEQ ID NO:1的氨基酸位置443-543的序列；(d) SEQ ID NO:1的氨基酸位置449-543的序列；(e) SEQ ID NO:1的氨基酸位置454-543的序列；(f) SEQ ID NO:1的氨基酸位置443-546的序列；(g) SEQ ID NO:1的氨基酸位置449-546的序列；(h) SEQ ID NO:1的氨基酸位置454-546的序列；(i) SEQ ID NO:1的氨基酸位置525-535的序列；(j) SEQ ID NO:1的氨基酸位置529-535的序列；以及(k) SEQ ID NO:1的氨基酸位置530-535的序列。

另一代表性的本发明化合物为下述化合物：其中A乙酰基，Y为氨基羰基，而B₁-C₁-X₁为SEQ ID NO:1的氨基酸位置514-523的序列。

通过表达包含其序列编码具有kringle 5肽片段的蛋白的多核苷酸的重组分子，并且纯化表达的肽产物，可以获得K5片段或K5融合蛋白(参见Menhart,N.等，Biochemistry,32:8799-8806(1993)。已经公布了人血纤溶酶源的DNA序列(Browne,M.J.等，Fiobrinolysis,5(4):257-260(1991)并示于图3(a-b)(SEQ ID NO:12)中。编码kringle 5的多核苷酸序列起始于SEQ ID NO:12的大约核苷酸位置1421，并终止于大约核苷酸位置1723。

通过以下步骤，可以从表达高水平人血纤溶酶源或K5融合蛋白的细胞或组织中分离编码K5肽片段或K5融合蛋白的基因，所述步骤为(1)从所述组织或细胞分离信使RNA，(2)用逆转录酶产生相应的DNA序列，并且(3)采用聚合酶链式反应(PCR)，用合适的引物扩增编码所述活性K5氨基酸序列或其融合蛋白的DNA序列。此外，可以将编码K5肽片段或K5融合蛋白的多核苷酸克隆到任何市售的表达载体(诸如pBR322、pUC载体等等)或表达/纯化载体(诸如GST融合载体(Pharmacia,Piscataway,NJ))，然后在合适的原核生物、病毒或真核生物宿主中表达。然后，可以通过常规方法，或在商用表达/纯化系统的情况下，按照厂商的说明，完成纯化。

也可以用本领域技术人员已知的固相化学的标准方法，合成K5肽片段或K5融合蛋白。例如，可以按照Steward和Young所述步骤(Steward,J.M．和Young,J.D.,Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，Pierce Chemical Company,Rockford,IL,(1984)，用Applied Biosystem的合成仪通过固相化学技术合成kringle 5肽片段。同样，可以合成多个片段，然后连接在一起，形成更大的片段。也可以制备在特定位置上具有氨基酸置换的这些合成肽片段，以测试体外和体内抗血管生成活性。对于固相肽合成，可以在J.M.Stewart和J.D.Young,Solid PhasePeptide Synthesis,W.H.Freeman Co.(San Francisco),1963和J.Meienhofer,Hormonal Proteins and Peptides，第2卷，第46页，Academic Press(纽约)，1973中发现所述许多技术的概述。对于典型的溶液合成，参见G.Schroder和Lupke,The Peptides，第1卷，AcacemicPress(纽约)。一般而言，这些方法包括连续将一种或多种氨基酸或适当保护的氨基酸加入生长中的肽链。通常，用适当的保护基团保护第一个氨基酸的或者氨基或者羧基。然后，受保护的或衍生的氨基酸或者连接到惰性固相支持体上，或者通过加入该序列中具有适当保护的互补(complimentary)(氨基或羧基)基团的下一个氨基酸，在适于形成酰胺键的条件下用于溶液中。然后从该新加入的氨基酸残基上除去所述保护基团，加入下一个氨基酸(适当保护的)，依次类推。在所有所需氨基酸都已经连接入所述适当序列中后，连续或同时除去任何剩余的保护基团(和任何固相支持体)，以提供最终的多肽。通过该一般方法的简单的修改，例如通过将受保护三肽于适当保护的二肽偶联(在不使手性中心消旋的条件下)，可以一次加入一个以上的氨基酸以使链生长，去保护后形成五肽。

特别优选的制备本发明化合物的方法包括固相肽合成，其中用酸或碱敏感基团保护所述氨基酸的α-N末端。这类保护基团应该具有对肽键形成条件稳定的性质，同时易于除去，而不破坏生长中的肽链或使其中含有的手性中心消旋。合适的保护基团为9-芴基甲酯基(Fmoc)、叔丁酯基(Boc)、苄酯基(Cbz)、联苯基异丙酯基、叔戊酯基、异冰片酯基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苄酯基、邻硝基苯亚磺酰基、2-氰基-叔丁酯基等等。9-芴基甲酯基(Fmoc)保护基团特别优选用于kringle 5肽片段的合成。其它优选的侧链保护基团，对于象赖氨酸和精氨酸的侧链氨基，为2,2,5,7,8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(pmoc)、硝基、对甲苯磺酰基、4-甲氧基苯磺酰基、Cbz、Boc和金刚烷酯基；对于象酪氨酸的侧链基团，为苄基、邻溴苄酯基、2,6-二氯苄基、异丙基、叔丁基(t-Bu)、环己基、环戊基和乙酰基(Ac)；对于象苏氨酸的侧链基团，为叔丁基、苄基和四氢吡喃基；对于组氨酸的侧链基团，为三苯甲基、苄基、Cbz、对甲苯磺酰基和2,4-二硝基苯基；对于色氨酸的侧链基团，为甲酰基；对于天冬氨酸和谷氨酸的侧链基团，为苄基和叔丁基，对于半胱氨酸的侧链基团，为三苯基甲基(三苯甲基)。在固相肽合成方法中，将所述α-C末端氨基酸连接到适当固相支持体或树脂上。适用于以上合成的固相支持体是下述材料：它们对分步缩合-去保护反应的试剂和反应条件为惰性，并且在所用介质中为不溶性的。优选用于α-C末端羧基肽合成的固相支持体为4-羟甲基苯氧基甲基-共聚(苯乙烯-1％二乙烯苯)。优选用于α-C末端酰胺肽的固相支持体为得自Applied Biosystems(Foster City,CA)的4-(2’,4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧基乙酰氨基乙基树脂。通过N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)或O-苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’,-四甲基脲鎓-六氟磷酸盐(HBTU)，加入或不加入4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、苯并三唑-1-氧基-三(二甲基氨基)鏻-六氟磷酸盐(BOP)或氯化双(2-氧代-3-噁唑烷基)膦(BOPCl)，将所述α-C末端氨基酸偶联到所述树脂上，于10-50℃的温度下，在诸如二氯甲烷或DMF的溶剂中介导偶联大约1-24小时。当所述固相支持体为4-(2’,4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧基-乙酰氨基乙基树脂时，在用α-C末端氨基酸按上述偶联之前，用仲胺、最好是用哌啶切下所述Fmoc基团。优选用于偶联到去保护4-(2’,4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧基-乙酰氨基乙基树脂的方法是DMF中的O-苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’,-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU,1当量)和1-羟基苯并三唑(HOBT,1当量)。正如本领域众所周知的，在自动多肽合成仪中可以进行连续受保护氨基酸的偶联。在最佳实施方案中，所述生长中的肽链的氨基酸的α-N末端用Fmoc保护。通过用仲胺，最好是用哌啶处理，完成从所述生长中的肽的α-N末端一侧除去所述Fmoc保护基团。然后导入大约过量3倍摩尔浓度的每种受保护氨基酸，最好在DMF中进行所述偶联。所述偶联剂通常为O-苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’,-四甲基脲鎓-六氟磷酸盐(HBTU,1当量)和1-羟基苯并三唑(HOBT,1当量)。所述固相合成结束时，或者连续或者在单次操作中，从该树脂取下所述多肽和去保护。通过用包含硫茴香醚、水、乙二硫醇和三氟乙酸的裂解试剂处理所述树脂结合的多肽，可以在单次操作中完成取下所述多肽和去保护。当其中所述多肽的α-C末端为链烷酰胺时，通过用链烷胺氨解切除所述树脂。另一方面，通过例如用甲醇进行酯基转移然后氨解，或者通过直接进行酰胺基转移，可以取下所述肽。所述受保护的肽可以在此时进行纯化，或直接开始下一个步骤。采用上述裂解混合剂完成所述侧链保护基团的除去。通过采用任何或所有以下类型的层析步骤的顺序纯化所述全面去保护的肽：在弱碱树脂(乙酸盐形式)上的离子交换；在未衍生的聚苯乙烯-二乙烯苯(例如Amberlite XAD)上的疏水性吸附层析；硅胶吸附层析；在羧甲基纤维素上的离子交换层析；例如在Sephadex G-25、LH-20上或逆流分布的分配层析；高效液相色谱(HPLC)，尤其是辛基-或十八基甲硅烷基-二氧化硅结合相柱填充的反向HPLC。采用快原子轰击(FAB)质谱测定这些kringle 5肽片段的分子量。实施例1-12描述了固相kringle 5肽片段的合成。

根据如何生产kringle 5,kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白可以存在或者不存在哺乳动物血纤溶酶源kringle 5区的上述二硫键，或在具有其它哺乳动物血纤溶酶源kringle区的的融合蛋白情况下，可以存在或不存在具有相应区的二硫键，或可以存在形成与天然哺乳动物血纤溶酶源中发现的三级结构不同的三级结构的二硫键。通过用弹性蛋白酶和/胃蛋白酶(在从所述半胱氨酸键除去的位点酶切的酶)酶切Glu-血纤溶酶源、Lys-血纤溶酶源或小血纤溶酶源产生的kringle 5肽片段，将含有天然kringle 5蛋白的三级结构；通过固相肽合成制备的kringle 5肽片段可能含有或不含有胱氨酰氨酰基残基，而通过表达制备的kringle 5肽片段可能在不同于酶切产生的kringle 5肽片段中发现的位置上具有二硫键。

包括但不限于所述实施例中具体描述的化合物的本发明化合物具有抗血管生成活性。作为血管生成抑制剂，这类化合物可用于治疗下述器官的原发性和转移的实体瘤和癌症：乳腺；结肠；直肠；肺；口咽；咽；食管；胃；胰腺；肝脏；胆囊；胆道；小肠；尿道，包括肾、膀胱和输尿管(urothelium)；雌性生殖道，包括子宫颈、子宫、卵巢、绒毛癌和妊娠滋养层疾病；雄性生殖道，包括前列腺、精囊、睾丸和生殖细胞肿瘤；内分泌腺，包括甲状腺、肾上腺和脑垂体；皮肤，包括血管瘤、黑素瘤、由骨或软组织产生的肉瘤和Kaposi氏肉瘤；脑、神经、眼和脑脊膜的肿瘤，包括星形细胞癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、成视网膜细胞瘤、神经瘤、成神经细胞瘤、神经鞘瘤和脑脊膜瘤；由造血器官恶性肿瘤引起的肿瘤，诸如白血病，并包括绿色瘤、浆细胞瘤、斑块和蕈样真菌病肿瘤和皮肤T细胞淋巴瘤/白血病；淋巴瘤，包括Hodgkin氏和非Hodgkin氏淋巴瘤；预防自身免疫病，包括类风湿性关节炎、免疫性关节炎和变性关节炎；眼病，包括糖尿病性视网膜病、早熟性视网膜病、角膜移植排斥、晶状体后纤维组织形成、新血管性青光眼、发红、由黄斑变性和缺氧引起的视网膜新血管形成；眼的异常新血管形成疾病；皮肤病，包括牛皮癣；血管病，包括血管瘤和动脉粥样硬化斑内的毛细管增殖；Osler-Webber综合症；心肌血管生成；斑块新血管形成(plaque neovascularization)；毛细管扩张；出血性关节；血管纤维瘤；伤口肉芽发生；特征为内皮细胞过度或异常刺激的疾病，包括肠粘连、节段性回肠炎、动脉粥样硬化、硬皮病和肥大瘢痕(即瘢痕瘤)和作为病理结果而具有血管生成的疾病，包括猫爪病(Rochele minalia quintosa)和溃疡(幽门螺杆菌)。另一用途是抑制排卵和建立胎盘的生育控制剂。

本发明化合物或者单独使用或者与常规给与病人用于治疗血管生成疾病的放疗和/或其它化疗治疗联用时，也可以用于预防上述肿瘤转移。例如，当用于治疗实体瘤时，本发明化合物可以与化疗药物一起给与，所述化疗药物诸如为α干扰素、COMP(环磷酰胺、长春新碱、甲氨蝶呤和强的松)、依托泊苷、mBACOD(甲氨蝶呤、博来霉素、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱和地塞米松)、PRO-MACE/MOPP(强的松、甲氨蝶呤、(W/leucovin拯救)、阿霉素、环磷酰胺、紫杉酚、依托泊苷/氮芥、长春新碱、强的松和甲基苄肼)、长春新碱、长春碱、血管抑制素(angioinhibin)、TNP-470、戊聚糖多硫酸酯、血小板因子4、制管张素、LM-609、SU-101、CM-101、Techgalan、酞胺哌啶酮、SP-PG等等。其它化学药物包括烷化剂，诸如氮芥，包括氮芥、melphan、苯丁酸氮芥、环磷酰胺和异环磷酰胺；亚硝脲，包括亚硝脲氮芥、环己亚硝脲、甲环亚硝脲和链脲霉素(streptozocin)；磺酸烷基酯，包括白消安；三嗪，包括三嗪咪唑胺；吖丙啶(ethyenimine)，包括塞替派和六甲基三聚氰胺；叶酸类似物，包括甲氨蝶呤；嘧啶类似物，包括5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷；嘌呤类似物，包括6-巯基嘌呤和6-硫代鸟嘌呤；抗肿瘤抗体，包括放线菌素D；anthracycline，包括阿霉素、博来霉素、丝裂霉素C和methramycin；激素和激素拮抗剂，包括他莫昔芬和皮质类固醇和各种药物，包括顺铂和brequinar。例如，可以用外科手术、放射或化疗和给与kringle 5，随后给与kringle 5以延长小转移瘤(micrometastases)不活性时间，并稳定和抑制任何残余原发性肿瘤的生长，以常规治疗肿瘤。

可以将诸如蓖麻毒蛋白之类的细胞毒性药物连接到kringle 5肽片段上，由此提供破坏结合kringle 5的细胞的工具。连接到细胞毒性药物的肽可以以设计以使到所需位置的传递最大化的方式输注。例如蓖麻毒蛋白连接的高亲和性kringle 5片段可以通过插管直接传递进入靶或供应所述靶位点的血管。这种药物也可以通过连接输注插管的渗透泵以控制方式传递。可以将kringle 5拮抗剂的组合物与血管生成刺激剂一起供应，以增强组织的血管形成。该类型的治疗方式可以提供一种有效的破坏转移癌的方法。

本发明化合物可以以衍生自无机酸或有机酸的药学上可接受的盐形式使用。“药学上可接受的盐”是指那些盐，它们在正确的医学判断范围内，适用于与人类和低等动物组织接触，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应等等，与合理的利益/风险比相称。药学上可接受的盐是本领域众所周知的。例如，S.M.Berge等在J.PharmaceuticalSciences,1977,66:1以及下列等等中详细地描述了药学上可接受的盐，该文献通过引用结合到本文中。在本发明化合物的最后分离和纯化期间可以现场制备所述盐，或通过将游离碱官能与合适的有机酸反应，单独制备所述盐。代表性的酸加成盐包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖醛酸盐、磷酸甘油、半硫酸盐(hemisulfate)、庚酸盐、己酸盐、延胡索酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐(羟乙基磺酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、扑酸盐(pamoate)、果胶酯酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一酸盐。此外，所述碱性含氮基团可以用诸如以下试剂季铵化：低级烷基卤，诸如甲基、乙基、丙基和丁基氯、溴和碘；硫酸二烷基酯，象硫酸二甲酯、二乙酯、二丁酯和二戊酯；长链卤化物，诸如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂酰基氯、溴和碘；芳烷基卤，象苄基和苯乙基溴和其它基团。由此获得水溶性或油溶性或可分散产物。可以用来形成药学上可接受的酸加成盐的酸的例子包括诸如烟酸、氢溴酸、硫酸和磷酸之类的无机酸、以及诸如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸之类的有机酸。

在kringle 5的最后分离和纯化期间，可以通过将含羧酸部分与合适的碱或与氨或有机伯胺、仲胺或叔胺反应，现场制备碱加成盐，所述合适的碱诸如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐。药学上可接受的盐包括但不限于基于碱金属或碱土金属的阳离子，诸如锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等等；和无毒叔胺和胺离子，包括铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺等等。可用于形成碱加成盐的其它代表性有机胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等等。本发明化合物的优选盐包括磷酸盐、tris和乙酸盐。

kringle 5肽片段、kringle 5抗血清、kringle 5受体激动剂、kringle5受体拮抗剂或它们的组合物可以与诸如可生物降解聚合物的药学上可接受的缓释基质混合，以形成治疗组合物。本文所用的缓释基质为通常为聚合物的材料制成的基质，它们可由酶促水解或酸碱水解或通过溶解而降解。所述基质一旦插入机体，酶和体液就会对其产生作用。缓释基质最好选自生物可相容材料，诸如脂质体、聚交酯(聚乳酸)、聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)、聚交酯-co-乙交酯(polylactide co-glycolide)(乳酸和乙醇酸的共聚物)聚酐、聚(正)酯、多肽、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、多氨基酸、氨基酸(诸如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅氧烷。优选的生物可降解基质为或者聚交酯、聚乙交酯或者聚交酯-co-乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)之一的基质。

kringle 5肽片段、kringle 5融合蛋白、kringle 5受体激动剂、kringle 5受体拮抗剂或它们的组合物可以与药学上可接受的赋形剂或载体混合，以形成治疗组合物。药学上可接受的载体或赋形剂是指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包囊材料或配制辅助剂。所述组合物可以胃肠外、舌下、脑池内、阴道内、腹膜内、直肠、颊或表面给与(如用粉剂、膏剂、滴剂、经皮贴剂或离子电渗疗法装置)。

本文所用的术语“胃肠外”是指给药模式，包括静脉内、肌内、腹膜内胸骨内、皮下和关节内注射和输注。用于胃肠外注射的药用组合物包含药学上可接受的无菌水溶液或非水溶液、分散体、悬浮液或乳液以及用于在使用前复制为无菌注射液或分散体的无菌粉剂。合适的水性或非水溶媒、稀释剂、溶剂或载体的例子，包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)、羧甲基纤维素和它们的合适的化合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射有机酯，诸如油酸乙酯。例如可以利用诸如卵磷脂之类的包衣材料，在分散体的情况下通过保持所需的颗粒大小，以及利用表面活性剂，保持适当的流动性。这些组合物也可以含有辅助剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂，诸如对羟基苯甲酸酯、三氯丁醇、苯酚山梨酸等等，可以确保防止微生物作用。也可以希望包括等渗剂，诸如糖、氯化钠等等。通过包含诸如单硬脂酸铝和明胶的延迟吸收的包埋剂，可以使得可注射药物形式延缓吸收。通过形成该药物在可生物降解聚合物中的微胶囊基质，制备可注射植入剂形式，所述可生物降解聚合物诸如为聚交酯-聚乙交酯、聚(正酯)和聚(酐)。根据药物与聚合物之比和所用特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。也通过将该药物包载于可与机体组织相容的脂质体或微乳液中，制备植入剂可注射制剂。例如通过截留细菌的滤膜进行过滤，或通过加入无菌固体组合物形式的灭菌剂，可以将可注射制剂灭菌，所述无菌固体组合物在临用前可以溶于或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中。

局部给药包括给药皮肤、粘膜和肺表面和眼睛。用于局部给药的组合物包括吸入组合物，可以加压或不加压为制备干粉。在非加压粉剂组合物中，粉碎形式的所述活性组分可以与较大的药学上可接受的惰性载体混合使用，所述惰性载体的大小例如直径大至100微米。合适的惰性载体包括糖，诸如乳酸。最好是，至少95％(重量)的所述活性组分的颗粒的有效颗粒大小为0.01-10微米。对于眼睛的局部给药，本发明化合物在药学上可接受的眼药载体中传递，使得该化合物保持与眼表面接触足够的时间，以允许该化合物透过眼睛的角膜区和内部区域，例如前房、后房、玻璃体、水状液、玻璃体液、角膜、虹膜/睫状体(cilary)、晶状体、脉络膜/视网膜和巩膜。所述药学上可接受的眼药溶媒可以例如膏剂、植物油或包囊材料。另一方面，本发明化合物可以直接注射到玻璃体液和水状液中。

该组合物可以加压，含有诸如氮气的压缩气体或液化气体抛射剂。所述液化抛射剂介质和实际上所述总组合物最好使得所述活性组分基本上不溶于其中。所述加压组合物也可以含有表面活性剂，诸如液体或固体非离子表面活性剂，或可以为固体阴离子表面活性剂。最好使用钠盐形式的固体阴离子表面活性剂。

用于直肠或阴道给药的组合物最好是栓剂，它可以通过将本发明化合物与合适的非刺激性赋形剂或载体(诸如可可油、聚乙二醇或栓剂蜡)混合来制备，所述非刺激性赋形剂或载体在室温下为固体，而在体温下为液体，因此在直肠和阴道腔中融化并释放该活性组分。

本发明化合物也可以以脂质体形式给与。正如本领域已知的，脂质体通常由磷脂或其它脂质物质衍生。通过分散于水性介质的单层或多层水合液体晶体形成脂质体。可以使用任何无毒的生理上可接受和可代谢的、能够形成脂质体的脂质。脂质体形式的本发明组合物除含有本发明化合物外，还可以含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等等。优选的脂质为磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，可以是天然的，也可以是合成的。形成脂质体的方法是本领域已知的。参见例如Prescott编辑的Methods in Cell Biology，第ⅩⅣ卷，Academic Press，纽约(1976)，第33页以及下列等等，该文献通过引用结合到本文中。

当用于上述治疗或其它治疗中时，治疗有效量的其中一个本发明化合物可以以纯形式使用，或存在这类形式时，以药学上可接受的盐形式并与或不与药学上可接受的赋形剂一起使用。“治疗有效量”的本发明化合物是指在用于任何医学治疗合理的利益/风险比下，该化合物的量足以治疗血管生成疾病(例如限制肿瘤生长或减慢或阻止肿瘤转移)。然而应该理解，本发明化合物和组合物的总的日用法将由主治医师在正确的医学判断内决定。用于任何特定病人的具体治疗有效剂量水平将取决于各种各样的因素，包括待治疗疾病和该疾病的严重性；所用特定化合物的活性；所用的特定组合物；该病人的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间；给药途径；所用特定化合物的排泄速率；治疗时间；与所用特定化合物联用或同时使用的药物和医学领域熟知的类似的因素。例如，开始以低于达到所需治疗效果需要剂量的水平给药，并逐渐加大剂量，直至达到所需效果，这正在本领域技术范围内。局部或系统性地给予人或其它哺乳动物宿主的kringle 5肽片段或融合蛋白总一日量可以为例如每日0.0001-200 mg/kg体重，更通常为1-300 mg/kg体重，总一日量可以为单个剂量或均分量。需要时，可以将有效一日量分为多个剂量用于给药。因此，单剂量组合物可以含有构成所述一日量的这种量或其约数。

应该理解，可以与本发明化合物联合用于吸入、治疗或预防血管生成疾病的药物不限于以上所列的药物，但大体上包括用于治疗或预防血管生成疾病的任何药物。

本发明也提供分离的多核苷酸，它们编码具有血管生成抑制活性的哺乳动物kringle 5肽片段或融合蛋白。这类多核苷酸可以用于表达重组kringle 5肽片段或用于基因治疗(如下述)。

本发明的多核苷酸可以为mRNA或DNA形式。DNA、cDNA、基因组DNA和合成DNA形式的多核苷酸都在本发明范围内。所述DNA可以是双链或是单链的，如果是单链，可以是编码(有义)链或非编码(反义)链。本发明的多核苷酸可以是未修饰形式，或包括诸如甲基化或封端的修饰。

编码所述多肽的编码序列可以与本文提供的编码序列相同，或可以是不同的编码序列，这些不同的编码序列是由于遗传密码的丰余性和简并性造成的，并且编码本文提供的DNA编码的同一多肽。该多核苷酸可以仅包括所述多肽的编码序列，或可以包括所述多肽的编码序列和诸如前导序列或分泌序列的另一序列或蛋白原序列、或所述多肽编码序列(和可选的另一编码序列)和非编码序列，诸如所述多肽编码序列的5’和/或3’非编码序列。

另外，本发明包括变异多核苷酸，它们含有诸如多核苷酸缺失、置换或加入的修饰；由所述变异多核苷酸序列产生的任何多肽修饰。本发明的多核苷酸也可以具有本文提供的编码序列的天然产生的等位基因变异体的编码序列。

另外，所述多肽的编码序列可以在同一读框中与一个有助于宿主细胞表达和分泌多肽的多核苷酸序列融合，其中所述多核苷酸例如为用作控制多肽从所述细胞转运的分泌序列的前导序列。具有前导序列的多肽为前蛋白，可以具有被所述宿主细胞切割形成所述多肽的前导序列。所述多核苷酸也可以编码所述蛋白加其它5’氨基酸残基的蛋白原。具有原序列的蛋白为蛋白原，在某些情况下可以为该蛋白的无活性形式。一旦切割该原序列，则保留活性蛋白。因此，本发明的多核苷酸可以编码蛋白、或具有原序列的蛋白或具有前序列(前导序列)和原序列的蛋白。

本发明的多核苷酸也可以具有在读框中与标记序列融合的所述编码序列，这便于纯化本发明的多肽。所述标记序列可以是由pGEX载体供应的GST标记，以保证在细菌宿主的情况下纯化与该标记融合的多肽，或例如当使用哺乳动物宿主、例如为COS-7细胞时，该标记序列可以为血凝素(HA)标记。相当于一个表位的HA标记得自流感血凝素蛋白。参见例如Ⅰ.Wilson等，Cell 37∶767(1984)。

该多核苷酸可以以任何方式产生，包括但不限于化学合成、复制、逆转录或转录，这基于衍生该多核苷酸区域内碱基序列提供的信息；这样，它可以表示所述原始多核苷酸的或者有义方向或者反义反向。产生多核苷酸的优选方法是美国专利4,683,195和4,683,202中描述的聚合酶链式反应，这些专利通过引用结合到本文中。

我们设想，如果多核苷酸与本文提供的序列的相同性至少为50％，最好至少为70％时，将认为多核苷酸与本文提供的序列杂交。

本发明也提供包含本发明多核苷酸的载体、用本发明载体进行遗传工程的宿主细胞和通过重组技术生产本发明多肽的方法。这类方法包括在适合kringle 5衍生多核苷酸表达的条件下培养所述宿主细胞，并从所述细胞培养物中回收所述kringle 5衍生多肽。

本发明的多核苷酸可以用于通过重组技术生产多肽。因此，所述多核苷酸序列可以包括在多种表达载体的任何一种中，特别是用于表达多肽的载体或质粒。这类载体包括染色体、非染色体和合成DNA序列，例如SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；酵母质粒；由质粒和噬菌体DNA、病毒DNA(诸如牛痘、腺病毒、禽痘病毒和假狂犬病的)组合衍生的载体。然而，可以使用任何其它的质粒或载体，只要它可在该宿主中复制和有活力。

可以用各种各样的方法将合适的DNA序列插入该载体中。一般而言，用本领域已知方法将所述DNA序列插入合适的限制性内切酶位点。这类方法或其它方法相信在本领域技术人员技术范围内。所述表达载体中的所述DNA序列操作性地连接到合适的指导mRNA合成的表达控制序列(启动子)上。这类启动子的代表性例子包括但不限于LTR或SV40启动子、大肠杆菌lac或trp、噬菌体λP sub L启动子和已知在原核生物或真核生物细胞或其病毒中控制基因表达的其它启动子。所述表达载体也含有用于翻译起始和终止转录的核糖体结合位点。该载体也可以包括适用于放大表达的序列。另外，所述表达载体最好含有一个基因，以提供选择转化宿主细胞的表型性状，诸如用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性、或诸如大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。

含有上述合适DNA序列以及合适启动子或控制序列的载体可以用来转化合适的宿主，以允许该宿主表达该蛋白。作为合适宿主的代表性例子，可以提到：细菌细胞，诸如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌；链霉菌属菌种；真菌细胞，诸如酵母；昆虫细胞，诸如果蝇属和Sf9；和动物细胞，诸如CHO、COS或Bowes等。从本文提供的内容来看，相信合适宿主的选择在在本领域技术人员技术范围内。

更详细地讲，本发明也包括重组构成物(construct)，它包括一个或多个以上广泛描述的序列。所述构成物包括其它已经正向或反向插入本发明序列的载体，诸如质粒或病毒载体。在该实施方案的优选方面，该构成物还包括调节序列，包括例如可操作性地连接到所述序列的启动子。大量的合适载体和启动子是本领域技术人员已知的且已市售。举例提供以下的载体。细菌：pSPORTl(GIBCO BRL,Gaithersburg,MD)、pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)pBs、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBsKs、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene,La Jolla,CA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核生物：pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXTl、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。然而，可以使用任何其它质粒或载体，只要它可在该宿主中复制并有活力。

启动子区可以用CAT(氯霉素转移酶)载体或具有可选择标记的其它载体选自任何所需基因。两个合适的载体是pKK232-8和pCM7。特别指定的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、SP6、T7、gpt、λPsub R和trp。真核启动子包括巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白-1。合适载体和启动子的选择完全在本领域技术人员技术范围内。

在再一实施方案中，本发明提供含有上述构成物的宿主细胞。所述宿主细胞可以是诸如哺乳动物细胞之类的高等真核细胞、或诸如酵母细胞之类的低等真核细胞，或所述宿主细胞可以是原核细胞，诸如细菌细胞。可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔将该构成物导入所述宿主细胞中(L. Davis等，“Basic Methods inMolecular Biology”，第2版，Appleton和Lang,Paramount Publishing,Easr Norwalk,CT(1994))。

宿主中的所述构成物可以以常规方式使用，以生产该重组序列编码的基因产物。另一方面，可以用常规肽合成仪合成生产本发明的多肽。

可以在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中，在合适启动子控制下表达蛋白。也可以使用细胞转化系统，用得自本发明DNA构成物的RNA生产这类蛋白。Sambrook等(分子克隆：实验室手册，第2版，(冷泉港，纽约，1989))描述了用于原核宿主和真核宿主的合适的克隆载体和表达载体，该文献通过引用结合到本文中。

通过将增强子序列插入该载体中，增加高等真核生物对本发明多肽的编码DNA的转录。增强子为DNA顺式作用元件，通常为大约10-300 bp，它作用于启动子以增加其转录。例子包括复制起点后侧(第100-270 bp)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、其复制起点右侧的多形瘤增强子和腺病毒增强子。

一般而言，重组表达载体将包括复制起点和允许该宿主细胞转化的选择标记(例如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和酿酒酵母TRPl基因)和得自高度表达基因的、指导下游结构序列转录的启动子。这类启动子可以得自编码诸如3-磷酸甘油激(PGK)之类的糖酵解酶的操纵子、α因子、酸性磷酸酶或热激蛋白，这只是其中之一。将异源结构序列以适合的状态与转录起始和终止序列以及最好和能够指导翻译蛋白分泌到内质网空间或胞外介质的前导序列一起装配。可选地，该异源序列可以编码包括赋予所需特性的N末端鉴定肽的融合蛋白，所需特性例如为表达的重组产物的稳定或简化纯化。

通过将编码所需蛋白的结构DNA序列与合适的翻译起始和终止信号一起插入具有功能启动子的可读框中，构建用于细菌的有用表达载体。该载体将包含一个或多个表型选择标记和一个复制起点，以确保维持该载体以及需要时提供在该宿主内的扩增。用于转化的合适的原核宿主包括大肠杆菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和假单孢菌属、链霉素属和葡萄球菌属内的不同菌种，尽管也可以使用其它菌种作为常规的选择。

对于细菌使用有用的表达载体包括选择标记和得自质粒的细菌复制起点，所述质粒包括众所周知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的遗传元件。其它载体包括但不限于PKK233-3(PharmaciaFineChemicals,Uppsala,Sweden)和GEMl(Promega Biotec,Madison,WI)。这些pBR322“骨架”部分与一合适启动子和待表达结构序列结合。

有用的表达载体也可以包含融合部分，以易于纯化所需本发明多肽或生产可溶性多肽。市售的融合载体例子包括但不限于pET32a(Novagen,Madison,WI)、pGEX-4T-2(Pharmacia)和pCYB3(NewEngland Biolabs,Beverly,MA)。也可以构建特别用于在细菌细胞中高水平表达kringle 5肽片段或融合蛋白的避免使用融合部分的表达载体。例如可以按Pilot-Matias,T.J.等(Gene,128:219-225(1993))所述制备载体以优化翻译偶联，该文献通过引用结合到本文中。另一方面，本发明的多肽可以与分离的辅助质粒一起共同表达，所述辅助质粒本身编码蛋白或肽有助于溶解，第一目的肽(参见例如Makrides,S.C.,Microbiological Reviews,60∶512(1996))。例如某些kringle 5肽片段(已经表明作为与硫氧还蛋白的可溶性融合蛋白生产的肽片段(参见实施例20))可以从非融合载体中与(即在相同的宿主细胞中)表达硫氧还蛋白的第二载体同时表达。

在合适的宿主菌株转化和该宿主菌株生长至合适的细胞密度后，用适当的方法(例如温度变化或化学诱导)将选定的启动子去阻遏，并且再培养细胞一段时间。通常通过离心收获细胞，用物理或化学方法破碎，保留产生的粗提取物用于进一步纯化。用于表达蛋白的微生物细胞可以用任何常规方法破碎，包括冻融循环、超声处理、机械破碎或使用细胞裂解剂；这类方法是普通技术人员熟知的。

各种哺乳动物细胞培养系统也可以用来表达重组蛋白。哺乳动物表达系统的例子包括Gluzman所述的猴肾成纤维细胞COS-7系(Cell 23：175(1981)和能够表达可相容载体的其它细胞系，诸如C127、3T3、CHO、Hela和BHK细胞系。哺乳动物表达载体将包含复制起点、合适的启动子和增强子以及任何必需的核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终点序列和5’侧翼非转录序列。得自SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40序列、早期启动子、增强子、剪接位点和多腺苷酸化位点可以用来提供所需的非转录遗传元件。有用的代表性载体包括pRc/CMV和pcDNA3(可得自Invitrogen,San Diego,CA)。

本发明也包括基因治疗，通过基因治疗，调节病人的编码kringle5肽片段或kringle 5肽片段缀合物的基因。N.Yang的将基因体内转移到哺乳动物体细胞中(Crit.Rev.Biotechn.12(4):335-356(1992))公开了将DNA转移或传递到细胞用于表达所述基因产物蛋白、或者称为基因治疗的各种方法，该文献通过引用结合到本文中。基因治疗包括将多核苷酸序列加入体细胞或种系细胞中，以用于或者活体外或体内治疗。基因治疗用来取代基因，以增加正常或异常基因功能和与传染病及其它病状战斗。

用基因疗法治疗医学难题的策略包括治疗策略或预防策略，治疗策略诸如鉴定缺陷基因，然后加入功能性基因，以或者取代所述缺陷基因的功能，或者增加略微功能性的基因，预防策略诸如加入治疗该疾病或使得该组织或器官对治疗方法更敏感的蛋白产物的编码基因。作为预防策略的例子，可以将kringle 5肽片段或kringle 5肽片段缀合物的编码基因置于病人中，因此防止发生血管生成，或可以插入使肿瘤细胞对放射更敏感的基因，使得对所述肿瘤的放射可能引起更多地杀伤所述肿瘤细胞。

本发明设计了许多方案，用于转移kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白的编码DNA或转移kringle 5肽片段调节序列(或所述融合部分的序列)的DNA。具体与kringle 5肽片段或其它序列连接的启动子以外的、可以增进kringle 5肽片段生产的启动子序列的转染，也作为基因治疗方法设计。该技术的一个例子可在Transkaryotic Therapies,Inc.,of Cambridge,Massachusetts中发现，该例子使用同源重组以插入“基因开关”，所述“基因开关”如1995年4月15日的Genetic EngineeringNews中公开的开启细胞中的红细胞生成素基因，该文献通过引用结合到本文中。这类“基因开关”可以用来激活不正常表达这些蛋白的细胞中的kringle 5肽片段(或kringle 5受体)。

基因治疗的基因转移方法分为三大类：(1)物理的(例如电穿孔、直接基因转移和粒子轰击)，(2)化学的(例如脂质基载体和其它非病毒载体)以及(3)生物的(例如病毒衍生载体)。例如，诸如包被有DNA的脂质体的非病毒载体可以直接静脉内注射到该病人中。据信所述脂质体/DNA复合物在肝脏中浓缩，在此它们将所述DNA传递到巨噬细胞和肝巨噬细胞中。载体或该基因的“裸露”DNA也可以直接注射到所需器官、组织或肿瘤中，以定向传递所述治疗DNA。

基因治疗方法也可以用传递位点描述。传递基因的基本方法包括活体外基因转移、体内基因转移和体外基因转移。在活体外基因转移中，从该病人中取出细胞，让其在细胞培养物中生长。将所述DNA转移到所述细胞中，大量扩增转染的细胞，然后再植入该病人中。在体外基因转移中，所述转化的细胞为诸如组织培养细胞的培养物中生长的细胞和来自特定病人的非特定细胞。转染这些“实验室细胞”，选择所述转染的细胞并扩增，或者用于植入病人中或者用于其它用途。体内基因转移包括当细胞在病人体内时，将所述DNA导入该病人的所述细胞中。上述所有三种基于广义的类别都可以用来达到体内、活体外和体外基因转移。

通过将DNA微注射到生殖细胞或体细胞中、诸如用于“基因枪”的金粒子的气体传递的包被DNA的粒子和诸如磷酸钙转染的戊基化学方法，可以达到DNA传递的机械(即物理)方法。已经发现，将质粒DNA物理注射到肌肉细胞中产生高百分比的、具有持久表达标记基因的转染细胞。所述质粒DNA可以整合或不整合到所述细胞的基因组中。转染DNA的非整合将允许基因产物蛋白在终端分化的非增殖性组织中转染和表达较长时间，而不担心所述细胞基因组或线粒体基因组的突变的插入、缺失或改变。长期但不必是永久地将治疗基因转染到特定细胞中，可以提供遗传病的治疗或预防用途。可以再周期性地注射所述DNA，以维持该基因产物水平，而不在所述受体细胞的基因组中发生突变。外源DNA的非整合可以允许在一个细胞内存在几种不同的外源DNA构成物，所有所述构成物都表达不同的基因产物。

粒子介导的基因转移也可以用于将DNA注射到细胞、组织和器官中。用粒子轰击装置或“基因枪”，产生一动力，以将包被DNA的高密度粒子(诸如金或钨)加速至允许透过靶器官、组织或细胞的高速度。用于基因转移的电穿孔使用电流以使得细胞或组织对电穿孔介导的基因转移敏感。用给定场强的短的电脉冲增加膜的通透性，使得DNA分子可以透入到所述细胞中。粒子介导的基因转移和电穿孔技术是本领域技术人员熟知的。

基因治疗的化学方法包括利用诸如脂质体的融合脂小泡或其它用于膜融合的小泡的载体介导的基因转移。含有目的DNA的载体可以方便地导入体液或血流中，然后位点最特异性地导向机体中的靶器官或组织。例如可以研制携带细胞或器官特异性DNA的脂质体，那些特定细胞吸收脂质体携带的外源DNA。注射定向到某些细胞上的特异性受体的免疫脂质体可以用作将所述DNA插入带有该受体的细胞中的便利方法。已经使用的另一载体系统是将DNA携带到肝细胞以进行体内基因转移的脱唾液酸糖蛋白/聚赖氨酸缀合物系统。

转染的DNA也可以与其它类载体复合，使得所述DNA携带到受体细胞，然后贮存在胞质或核质中。DNA可以偶联到特异性工程改造的小泡复合物中的载体核蛋白上，并直接携带到所述核中。

载体介导的基因转移也可以包括使用非脂质体的脂质基化合物。例如脂转染剂和细胞转染剂是脂质基阳离子，它们与带负电的DNA结合，形成可以携带所述DNA跨过细胞膜的复合物。载体介导的基因转移的另一方法包括基于受体的胞吞作用。在该方法中，制备配体(对细胞表面受体特异性的)以与目的基因形成复合物，然后注射到血流中。具有所述细胞表面受体的靶细胞将特异性地结合该配体，将配体-DNA复合物运送到所述细胞中。

生物基因治疗方法使用病毒载体或非病毒载体(诸如配体-DNA缀合物、脂质体和上述脂质-DNA复合物)，以将基因插入细胞中。转染的细胞可以是得自该病人正常组织的细胞、得自该病人患病组织的细胞或非病人细胞。

可能最好是，将包含kringle 5肽片段DNA序列或kringle 5融合蛋白DNA序列的重组DNA操作性地连接到表达控制序列上，以形成能够分别表达kringle 5肽片段或融合蛋白的表达载体。另一方面，可以通过给与与kringle 5基因、所述融合部分基因或与所述kringle 5基因相连的控制区或其融合部分的基因结合、或与相应的RNA转录物(两者之一的)结合以调节转录或翻译速率的化合物，完成kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白的基因调节。

已经用于基因治疗方案的病毒载体包括但不限于：逆转录病毒、诸如脊髓灰质炎病毒或辛德毕斯病毒的其它RNA病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、疱疹病毒、SV40、牛痘或其它DNA病毒。复制缺陷型鼠逆转录病毒为最广泛使用的基因转移载体。鼠白血病逆转录病毒包含与核核心蛋白和聚合酶(pol)复合的单链RNA，它们由蛋白核心(gag)包住并由决定宿主范围的糖蛋白被膜(env)包围。逆转录病毒的基因组结构包括gag、pol和env基因，它们包括在5’和3’长末端重复(LTR)上。逆转录病毒载体系统利用下述事实：假如在包装细胞系中反式提供所述病毒结构蛋白，那么含有5’和3’LTR和包装信号的基本载体(minimal vector)足以允许载体包装和感染以及整合到靶细胞中。用于基因转移的逆转录病毒载体的基本优点包括在大多数细胞类型中有效的感染和基因表达、单拷贝载体精确地整合到靶细胞染色体DNA中和所述逆转录病毒基因组的易操作性。例如，改变的逆转录病毒载体已经用于将基因活体外导入外周和肿瘤浸润的淋巴细胞、肝细胞、表皮细胞、肌细胞或其它体细胞中(然后这些细胞可以导入该病人中，以提供来自插入DNA的基因产物)。

腺病毒包含与核心蛋白复合的线状双链DNA，并用壳体蛋白包围。分子病毒学进展已经产生利用这些生物的生物学产生能够将新遗传序列体内转导到靶细胞中的能力。基于腺病毒的载体将表达高水平的基因产物肽。即使用低效价的病毒，腺病毒载体也具有高感染效率。另外，该病毒作为无细胞病毒粒子是完全有感染性的，所以生产细胞系的注射不是必需的。腺病毒载体的另一潜在优点是达到体内长期表达异源基因的能力。

病毒载体已经用来采用体内方案将基因插入细胞中。为了指导组织特异性地表达外源基因，可以使用已知为组织特异性的顺式作用调节元件或启动子。另一方面，采用DNA或病毒载体体内原位传递到特定的解剖学位点，可以做到这一点。例如，通过在动脉壁上的选定位点体外植入转导的内皮细胞达到基因体内转移到血管。感染的病毒围绕的细胞再表达该基因产物。病毒载体可以直接传递到体内位点(例如通过导管)，由此仅允许某些区域被病毒感染，并提供长期的位点特异性的基因表达。通过将改变的病毒注射到导向所述器官的血管中，也已经证明采用逆转录病毒载体在哺乳动物组织和肝组织中的体内基因转移。

也可以生产kingle 5肽片段并用于多种应用中。作为实例，kringle5的不同肽片段可以用作(1)在kringle 5结合位点有活性的激动剂和拮抗剂，(2)作为开发特异性抗血清的抗原，(3)作为用于诊断试剂盒的肽，以及(4)作为连接或与细胞毒性药物联用、以定向杀伤结合kringle5肽片段的细胞的肽。可以根据该分子外部区域上可以结合抗血清的位置、或所述肽片段对由血管生成产生或恶化的过程的抑制效力，选择包含这些肽片段的氨基酸序列。此外，可以采用蛋白序列数据库，诸如GenBank、Brookhaven Protein、SWISS-PROT和PIR，将这些肽序列与已知序列比较，以决定潜在的序列同源性。该信息有助于消除表现出与其它分子具有高度序列同源性的序列，由此在kringle 5的抗血清、激动剂和拮抗剂开发中增强高特异性的潜力。

也可以将kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白用作分离kmnigle 5受体的工具，即通过将kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白固定到固相支持体上，例如固定到亲和柱上，让培养的内皮细胞或膜提取物通过该柱。正如本领域已知的，分离和纯化kringle 5受体后，可以鉴定氨基酸序列并分离编码kringle 5受体的多核苷酸。这类多核苷酸可以克隆到合适的表达载体中，并转染到肿瘤细胞中。所述转染的肿瘤细胞表达该受体，会增强这些细胞对内源或外源kringle 5肽片段的反应，由此减低转移生长速率。此外，该载体的重组表达将允许产生更大量的受体，例如产生足够量，以用于鉴别模拟kringle 5作用的更小的拮抗剂的高生产率的筛选测定。

这些合成肽内的系统氨基酸置换可以产生对所述kringle 5受体高亲和性的肽激动剂和拮抗剂，这增强或减低kringle 5肽片段与其受体的结合。这类激动剂可以用来抑制显微转移物的生长，并由此限制癌的扩展。在血管形成不充分时，kringle 5肽片段的拮抗剂可以用来阻断kringle 5肽片段的抑制作用，并促进血管生成。例如，该类型治疗在促进糖尿病患者的伤口愈合方面可以具有治疗作用。

本发明的kringle 5肽片段或融合蛋白或缀合物也可以用作抗原，产生对所述kringle 5抑制剂特异性的多克隆或单克隆抗体。可以使用这类抗体的一个方法是在检测或定量体液或组织中kringle 5肽片段的诊断方法和试剂盒。这些试验的结果可以用来诊断或测定kringle 5肽片段的预后相关性。

kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白可以用放射性同位素(参见实施例13)标记，或化学偶联到蛋白上形成缀合物。缀合物包括酶、载体蛋白、细胞毒性药物、荧光分子、化学发光分子和生物发光分子，使用它们有助于测试含kringle 5肽片段的化合物结合kringle 5抗血清的能力、检测具有kringle 5肽片段的细胞类型或有助于纯化kringle 5肽片段。一般在所述kringle 5肽片段序列的氨基酸上可利用的官能团的基础上，选择所述偶联技术，所述官能团包括但不限于烷基、氨基、巯基、羧基、酰胺酚、吲哚基和咪唑基。用来实现这类偶联的各种试剂包括，这只是其中之一；戊二醛、重氮化联苯胺、碳二亚胺和对苯醌。采用适于该特定反应的不同技术测定偶联反应的效率。例如，采用高比活的氯胺T和NaI¹²⁵，可以完成用I¹²⁵放射性标记kringle 5肽或其生物学活性片段。用偏亚硫酸氢钠终止该反应，并在一次性柱上将该混合物脱盐。从该柱洗脱标记的肽并分部收集。从每一部分中取出数等份并在γ计数器中测定放射性活性。该方法提供不含未反应NaI¹²⁵的放射性标记的kringle 5肽片段。在另一实施例中，含有偶联到kringle 4的kringle 5肽片段的血液或组织提取物可以在聚赖氨酸树脂亲和柱上纯化，藉此kringle 4-kringle 5肽片段通过kringle 4肽片段对赖氨酸的亲和性结合到该树脂上。洗脱结合蛋白将提供纯化的kringle4-kringle 5肽片段。

肽缀合物的另一应用是生产多克隆抗血清。可以采用本领域技术人员所知的已建立的技术，进行抗kringle 5肽片段、kringle 5肽片段类似物和kringle 5受体的抗血清的生产。例如采用戊二醛可以将含有赖氨酸残基的kringle 5肽片段连接到纯化的牛血清白蛋白(BSA)上。可以通过测定放射性标记的肽的掺入，测定该反应的效率。未反应的戊二醛和肽可以通过透析分离，所述缀合物可以用来在兔、羊、山羊或其它动物中产生多克隆抗血清。与诸如BSA之类的载体分子复合的kringle 5肽片段可以与佐剂混合物混合，乳化，并皮下注射到背部、颈部、胁腹以及有时在合适宿主足趾上的多个位点上。一般而言，然后以规律的间隔、诸如每2-4周给与加强注射。每次注射后大约7-10天，通过用例如扩张后的耳缘静脉静脉穿刺获得血样，让血样于4℃过夜凝固，于4℃以大约2400×g离心大约30分钟。去除血清，分成等份贮存于4℃以立即使用，和贮存于-20℃至-90℃以用于随后的分析。

产生多克隆抗血清的血清样或产生单克隆抗血清的介质样品可以用于测定抗体效价，特别是用于测定高效价抗血清。随后，可以测试最高效价kringle 5肽片段抗血清，以确立以下：(a)用于最高特异性结合所述抗原和最低非特异性结合的最适抗血清稀释度，(b)在标准置换曲线中结合增加量的kringle 5肽片段的能力，(c)潜在的于相关肽和蛋白的交叉反应性，所述相关肽和蛋白包括相关物种的血纤溶酶原和kringle 5肽片段，以及(d)检测细胞培养基和血浆、尿和组织提取物中kringle 5肽片段的能力。可以通过本领域技术人员已知的几种方法，诸如斑点印迹和密度分析以及通过采用A蛋白、第二抗血清、冷乙醇或活性炭-葡聚糖沉淀放射性标记的肽-抗体复合物，然后用γ计数器测定活性，可以确立效价。如果需要，可以在亲和柱上纯化最高效价的抗血清。例如，可以将kringle 5肽片段偶联到市售树脂上，用来形成亲和柱。然后，可以将抗血清样品通过该柱，以使kringle 5抗体结合(通过kringle 5肽片段)到该柱上。随后将这些结合的抗体洗脱、收集并评价以测定效价和特异性。

也设想测定kringle 5肽片段和kringle 5受体的试剂盒作为本发明的部分。具有高效价和特异性并可以检测血浆、尿、组织和细胞培养基中的kringle 5肽片段的抗血清可以用来建立快速、可靠、敏感和特异性测定和定位kringle 5肽片段的分析试剂盒。这些分析试剂盒可以用来(但不限于)例如以下技术：竞争性和非竞争性测定、放射免疫测定、生物发光和化学发光测定、荧光测定、夹心测定(sandwich assay)、免疫放射测定、斑点印迹、包括ELISA的酶联测定、微量滴定板、免疫细胞化学和用于快速监测尿或血样的包被抗体的条带(strip)或浸棒(dipstick)。对于每种试剂盒，通过本领域技术人员熟知的方法，测定该分析的范围、敏感性、精确性、可靠性、特异性和重复性。

通常用于研究和临床中的测定试剂盒的一个例子是放射免疫测定(PIA)试剂盒。以以下方式建立kringle 5肽片段RIA：成功的放射性碘化和纯化kringle 5肽片段后，以几个稀释度将具有最高效价抗kringle5肽片段抗体的抗血清加入含有适当缓冲系统中的相对恒定量的放射活性(诸如10,000 cpm)的试管中。(将缓冲液或免疫前血清加入其它试管中，以测定非特异性结合)。于4℃保温24小时后，将A蛋白加入所有试管中，将试管涡旋混合，于室温保温90分钟，然后于4℃以大约2000-2500×g离心，以沉淀结合标记抗原的抗体的复合物。通过吸取取出上清液，在γ计数器中计数所述沉淀的放射活性。在减去所述非特异性结合后，选择结合大约10-40％标记肽的抗血清稀释液用于进一步特征鉴定。

下一步，通过将已知量的所述肽加入含有放射性标记的肽和抗血清的试管中，评价用于研究抗血清的kringle 5肽片段的稀释范围(大约为0.1 pg-10ng)。保温期(例如24小时或48小时)后，加入A蛋白，将试管离心，取出上清液，计数沉淀的放射性活性。用未标记kringle 5肽片段(标准)置换放射性标记kringle 5肽片段的结合，提供标准曲线。另外，将几种浓度的其它kringle 5肽片段、血纤溶酶原、来自不同物种的kringle 5肽片段和同源肽加入所述测定试管中，以特征鉴定所述kringle 5肽片段抗血清的特异性。

此后，采用已经成功地用来提取kringle 5肽片段的提取技术，制备各种组织提取物，包括但不限于原发性和继发性肿瘤、Lewis肺癌、产生kringle 5肽片段的细胞培养物、胎盘、子宫和其它组织，诸如大脑、肝脏和肠。处理组织提取物后，加入测定缓冲液，将不同等份置于RIA试管中。已知的产生kringle 5肽片段的细胞的提取物产生的置换曲线与标准曲线平行，而不产生kringle 5肽片段的组织提取物不置换来自所述kringle 5肽片段抗血清的放射性标记的kringle 5肽片段。这种置换曲线表明kringle 5肽片段测定测定组织和体液中kringle 5肽片段的实用性。

也可以通过将数等份注射到反向HPLC中，特征鉴定含有kringle5肽片断的组织提取物。收集洗脱部分，在Speed Vac中干燥，在RIA缓冲液中重建，并在kringle 5 RIA中分析。在这种情况下，将最大量的kringle 5肽片段的免疫反应性定位于kringle 5肽片段的相应洗脱位置的部分中。

上述测定试剂盒提供说明、抗血清、kringle 5肽片段和可能的放射性标记kringle 5肽片段和/或用于沉淀结合kringle 5肽片段/kringle 5抗体复合物的试剂。这样的试剂盒将可用于生物学流体和具有或不具有肿瘤的动物和人类的组织提取物中kringle 5肽片段的测定。

另一试剂盒可以用来使kringle 5肽片段在组织和细胞中可见或定位。例如免疫组织化学技术和使用这种技术的试剂盒是本领域技术人员熟知的。正如本领域已知的，免疫组织化学试剂盒将提供kringle 5肽片段抗血清和可能的封闭血清和第二抗血清，所述第二抗血清连接到荧光分子(诸如异硫氰酸荧光素)或用来使第一抗血清可见的某些其它试剂上。采用这种方法，可以检查活检肿瘤生产kringle 5肽片段的位置或kringle 5肽片段受体的位置。另一方面，试剂盒可以供应放射性标记的核酸，以用于与kringle 5肽片段信使RNA的探针的原位杂交。

采用本领域技术人员熟知的方法，可以制备本发明化合物。(参见例如Sottrup-Jensen等，Progess in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis,第3卷，Davidson,J.F.,Rowan,RM.,Samama,M.M．和Desnoyers,P.C.编辑，Raven Press，纽约，1978。制备kringle 5肽片段的一种方法是酶切天然蛋白(glu-血纤溶酶原)或其变异体(是指适合于酶消化切割并包含至少一个上述kringle 5序列的全长蛋白的截短形式，诸如lys-血纤溶酶原或小血纤溶酶原)。该方法首先需要在没有血纤溶酶抑制剂的情况下，从人血浆中分离该蛋白，由此促进glu-血纤溶酶原转化为lys-血纤溶酶原(参见Novokhatny,V和Kudinov,SA.,J.Mol.Biol.179：215-232(1984)。随后，用蛋白水解酶以足以从所述多肽切割kringle 5肽片段的浓度处理所述截短的分子，然后用本领域技术人员已知的方法，从剩余片段中纯化。优选的蛋白水解酶是人或猪弹性蛋白酶，它切割血纤溶酶原和其kringle区3-4和4-5之间的截短变异体(由此能够形成含有kringle 1-3和1-4或单独的kringle 4或5的肽片段)。例如，可以用猪或人类中性白细胞(neutrophyl)弹性蛋白酶以大约1∶100-1∶300的lys-血纤溶酶原：弹性蛋白酶的比率(缓冲液(诸如Tris-HCl、NaCl、磷酸钠等等))中的优选比率为1∶150-1∶250，最优选1∶150的比率)处理lys-血纤溶酶原或glu-血纤溶酶原。另一方面，该弹性蛋白酶可以首先固定(诸如固定到树脂上)，以便于纯化所述切割产物。根据所需的切割程度，glu-血纤溶酶原或lys-血纤溶酶原一般用人类或猪弹性蛋白酶于10-40℃的温度范围内处理，处理时间取决于所需切割程度，范围为大约4小时至24小时。为了达到用人或猪弹性蛋白酶完全消化glu-血纤溶酶原、lys-血纤溶酶原或小血纤溶酶原，需要将这些多肽于室温下暴露于该酶之中至少大约12小时。改变pH和对该酶的暴露时间，导致在一个或多个敏感切割位点上切割较少或部分切割。然后将切割产物用本领域熟知的方法(诸如柱层析)进行纯化。优选的纯化流程包括如实施例14所述将切割产物上赖氨酸-Sepharose柱。

kringle 5肽片段的固相合成

以下实施例用来进一步说明本发明新化合物的制备：

实施例1N-Ac-Val-Leu-Leu-Pro-Asp-Val-Glu-Thr-Pro-Ser-Glu-Glu-Asp-NH₂

将酰胺肽合成柱(Applied Biosystems)置于Perkin Elmer/AppliedBiosynthesis的“Synergy”肽合成仪的肽合成柱位置中，使用以下合成顺序：

1．用DMF将该树脂溶剂化大约5分钟；

2．用含20％哌啶的DMF将Fmoc基团从该树脂结合的氨基酸的α-N末端去封闭大约15分钟；

3．用DMF洗涤该树脂大约5分钟；

4．用含HBTU(25μmol)和HOBT(25 μmol)的0.2 M DMSO-NMP(N-甲基吡咯烷酮)的溶液和含二异丙基乙胺(25μmol)的0.4 M DMSO-NMP溶液活化第一号氨基酸(Fmoc-Asp(β-O^tBu),25 μmol)的α-C末端，并将所述活化氨基酸偶联到该树脂上；

5．在DMF中将所述活化Fmoc保护的氨基酸(在步骤5中制备的)偶联到所述树脂结合的氨基酸(在步骤2中制备的)大约30分钟；

6．用DMF洗涤5分钟；

7．用以下氨基酸重复步骤3-6：

编号氨基酸

2 Fmoc-Glu(γ-O^tBu)

3 Fmoc-Glu(γ-O^tBu)

4 Fmoc-Ser(^tBu)

5 Fmoc-Pro

6 Fmoc-Thr(^tBu)

7 Fmoc-Glu(γ-O^tBu)

8 Fmoc-Val

9 Fmoc-Asp(β-O^tBu)

10 Fmoc-Pro

11 Fmoc-Leu

12 Fmoc-Leu

13 Fmoc-Val

8．将乙酸通过步骤4和步骤5的条件，偶联到所述树脂结合的肽的α-N末端上。

9．用THF洗涤该树脂大约5分钟，以除去DMF并收缩该树脂，然后用氩气将该树脂干燥10分钟，用氮气干燥10分钟或更长时间，以提供干净的树脂结合肽。

10．通过与切割试剂(新鲜制备的硫代茴香醚(100μl)、水(50 μl)、乙二硫醇(50 μl)和三氟乙酸(1.8ml)，按以上顺序于-5℃至-10℃混合）于0℃一起搅拌大约10-15分钟，然后于环境温度下再搅拌1.75小时(如果存在，每个Arg(Pmoc)再加上0.5小时)，从所述树脂上切割所述肽，同时伴随氨基酸侧链的去保护。用以下公式确定所用的切割试剂的量：具有结合肽的树脂的重量(mg) 切割试剂的量(μl)

0-10 100

10-25 200

25-50 400

50-100 700

100-200 1200

11．过滤并用纯净的三氟乙酸洗涤该产物，以每份0.5 ml将该滤液加入含约8ml冷乙醚的离心管中，离心并倾析，重复该过程直至所有该肽沉淀(如果加入乙醚时该肽不沉淀，那么用30％乙酸水溶液(3×1 ml)萃取该混合物，将合并的含水提取物冻干，以提供该产物)。

12．使用粗肽，或通过HPLC用7 μm Symmetry Prep C18柱(7.8×300 mm)，用以5％至100％乙腈-(水、0.1％TFA)的梯度改变的溶剂混合物，在50分钟内纯化，然后冻干，以提供35 mg N-Ac-Val-Leu-Leu-Pro-Asp-Val-Glu-Thr-Pro-Ser-Glu-Glu-Asp-NH₂。

实施例2N-Ac-Met-Phe-Gly-Asn-Gly-Lys-Gly-Tyr-Arg-Gly-Lys-Arg-Ala-Thr-Thr-

Val-Thr-Gly-Thr-Pro-NH₂

采用实施例1所述合成顺序，并采用Fmoc-Pro作为第一号氨基酸，制备标题化合物。采用指定条件加入以下氨基酸，以提供35 mgN-Ac-Met-Phe-Gly-Asn-Gly-Lys-Gly-Tyr-Arg-Gly-Lys-Arg-Ala-Thr-Thr-Val-Thr-Gly-Thr-Pro-NH₂：编号氨基酸2． Fmoc-Thr(^tBu)3． Fmoc-Gly4． Fmoc-Thr(^tBu)5． Fmoc-Val6． Fmoc-Thr(^tBu)7． Fmoc-Thr(^tBu)8． Fmoc-Ala9． Fmoc-Arg(Pmc)10． Fmoc-Lys(Boc)11． Fmoc-Gly12． Fmoc-Arg(Pmc)13． Fmoc-Tyr(^tBu)14． Fmoc-Gly15． Fmoc-Lys(Boc)16． Fmoc-Gly17． Fmoc-Asn(Trt)18． Fmoc-Gly19． Fmoc-Phe

20． Fmoc-Met

实施例3Ac-Gln-Asp-TrP-Ala-Ala-Gln-Glu-Pro-His-Arg-His-Ser-Ile-Phe-Thr-Pro-

Glu-Thr-Asn-Pro-Arg-Ala-Gly-Leu-Glu-Lys-Asn-Tyr-NH₂

采用实施例1所述合成顺序，并采用Fmoc-Tyr(^tBu)作为第一号氨基酸，制备标题化合物。采用指定条件加入以下氨基酸，以提供40mg N-Ac-Gln-Asp-Trp-Ala-Ala-Gln-Glu-Pro-His-Arg-His-Ser-lle-Phe-Thr-Pro-Glu-Thr-Asn-Pro-Arg-Ala-Gly-Leu-Glu-Lys-Asn-Tyr-NH₂：编号氨基酸2． Fmoc-Asn(Trt)3． Fmoc-Lys(Boc)4． Fmoc-Glu(γ-O^tBu)5． Fmoc-Leu6． Fmoc-Gly7． Fmoc-Ala8． Fmoc-Arg(Pmc)9． Fmoc-Pro10． Fmoc-Asn(Trt)11． Fmoc-Thr(^tBu)12． Fmoc-Glu(γ-O^tBu)13． Fmoc-Pro14． Fmoc-Thr(^tBu)15． Fmoc-Phe16． Fmoc-Ile17． Fmoc-Ser(^tBu)18． Fmoc-His(Trt)19． Fmoc-Arg(Pmc)20． Fmoc-His(Trt)21． Fmoc-Pro22． Fmoc-Glu(γ-O^tBu)23． Fmoc-Gln(Trt)24． Fmoc-Ala 25． Fmoc-Ala26 ．Fmoc-Trp27． Fmoc-Asp(β-O^tBu)28． Fmoc-Gln(Trt)

实施例4

N-Ac-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gly-Pro-Trp-NH₂

采用实施例1所述合成顺序，并采用Fmoc-Trp作为第一号氨基酸，制备标题化合物。采用指定条件加入以下氨基酸，以提供20 mgN-Ac-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gly-Pro-Trp-NH₂：编号氨基酸2． Fmoc-Pro3． Fmoc-Gly4． Fmoc-Gly5． Fmoc-Val6． Fmoc-Asp(β-O^LBu)7． Fmoc-Gly8． Fmoc-Asp(β-O^t-Bu)9． Fmoc-Pro10． Fmoc-Asn(Trt)11． Fmoc-Arg(Pmt)

实施例5

N-Ac-Tyr-Thr-Thr-Asn-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH₂

采用实施例1所述合成顺序，并采用Fmoc-Tyr(^tBu)作为第一号氨基酸，制备标题化合物。采用指定条件加入以下氨基酸，以提供10 mgN-Ac-Tyr-Thr-Thr-Asn-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH₂：编号氨基酸2． Fmoc-Asp(β-O^tBu)3． Fmoc-Tyr(^tBu)4． Fmoc-Leu5． Fmoc-Lys(Boc)6． Fmoc-Arg(Pmc) 7． Fmoc-Pro8． Fmoc-Asn(Trt)9． Fmoc-Thr(^tBu)10． Fmoc-Thr(^tBu)11． Fmoc-Tyr(^tBu)

实施例6

N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH₂

采用实施例1所述合成顺序，并采用Fmoc-Tyr(^tBu)作为第一号氨基酸，制备标题化合物。采用指定条件加入以下氨基酸，以提供N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH₂(4 mg)：编号氨基酸2． Fmoc-Asp(β-O^tBu)3． Fmoc-Tyr(^tBu)4． Fmoc-Leu5． Fmoc-Lys(Boc)6． Fmoc-Arg(Pmc)7． Fmoc-ProMS(FAB)m/z 995(M+H)⁺.

实施例7

N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-NH₂

采用实施例1所述合成顺序制备标题化合物。采用指定条件加入以下氨基酸，以提供N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-NH₂(6 mg)：编号氨基酸2． Fmoc-Tyr(^tBu)3． Fmoc-Leu4． Fmoc-Lys(Boc)5． Fmoc-Arg(Pmc)6． Fmoc-LeuMS(ESI)m/z 832(M+H)⁺.

实施例8

N-Ac-Pro-Glu-Lys-Arg-Tyr-Asp-Tyr-NH₂

采用实施例1所述合成顺序，并采用Fmoc-Tyr(^tBu)作为第一号氨基酸，制备标题化合物。采用指定条件加入以下氨基酸，以提供N-Ac-Pro-Glu-Lys-Arg-Tyr-Asp-Tyr-NH₂(6 mg)：编号氨基酸2． Fmoc-Asp(β-O^tBu)3． Fmoc-Tyr(^tBu)4． Fmoc-Arg(Pmc)5． Fmoc-Lys(Boc)6． Fmoc-Glu7． Fmoe-ProMS(FAB)m/z(1101)(M+H)⁺.

实施例9

N-Ac-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH₂

采用实施例1所述合成顺序，并采用Fmoc-Tyr(^tBu)作为第一号氨基酸，制备标题化合物。采用指定条件加入以下氨基酸，以提供N-Ac-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH₂(8 mg)：编号氨基酸2． Fmoc-Asp(β-O^tBu)3． Fmoc-Tyr(^tBu)4． Fmoc-Leu5． Fmoc-Lys(Boc)6． Fmoc-Arg(Pmc)MS(ESI)m/z 898(M+H)⁺.

实施例10

N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I-Tyr-Asp-Tyr-NH₂(SEQ ID NO:13)

采用实施例1所述合成顺序，并采用Fmoc-Tyr(^tBu)作为第一号氨基酸，制备标题化合物。采用指定条件加入以下氨基酸，以提供N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I-Tyr-Asp-Tyr-NH₂(2 mg)：编号氨基酸2． Fmoc-Asp(β-O^tBu)3． Fmoc-3-I-Tyr(^tBu)4． Fmoc-Leu5． Fmoc-Lys(Boc)6． Fmoc-Arg(Pmc)7． Fmoc-ProMS(ESI)m/z(1121)(M+H)⁺.

实施例11

N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I-Tyr-NH₂(SEQ ID NO:14)

采用实施例1所述合成顺序，并采用Fmoc-3-I-Tyr(tBu)作为第一号氨基酸，制备标题化合物。采用指定条件加入以下氨基酸，以提供N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I-Tyr-NH₂(2.5 mg)：编号氨基酸2． Fmoc-Asp(β-O^tBu)3． Fmoc-Tyr(^tBu)4． Fmoc-Leu5． Fmoc-Lys(Boc)6． Fmoc-Arg(Pmc)7． Fmoc-ProMS(ESI)m/z 1121(M+H)⁺.

实施例12

N-Ac-Lys-Leu-Tyr-Asp-NH₂

采用实施例1所述合成顺序，并采用Fmoc-Asp(β-O^tBu)作为第一号氨基酸，制备标题化合物。采用指定条件加入以下氨基酸，以提供2mg N-Ac-Lys-Leu-Tyr-Asp-NH₂(2 mg)：编号氨基酸2． Fmoc-Tyr(^tBu)3． Fmoc-Leu4． Fmoc-Lys

实施例13

分别制备并分离N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I¹²⁵-Tyr⁵³⁵-NH₂和N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I¹²⁵-Tyr⁵³³-Asp-Tyr-NH₂(SEQ ID NO:13)和(SEQ ID NO:14)的混合物。

向含30 μg N-乙酰-脯氨酰-精氨酰-赖氨酰-亮氨酰-酪氨酰-天冬氨酰-酪氨酰胺的80 ml磷酸缓冲盐水(PBS)溶液中，加入一个碘粒(iodobead)(Pierce,Rockford,IL)和100μCi NaI¹²⁵。10分钟后，通过将反应混合物上Waters C1 8-Light SepPack柱，除去过量的NaI¹²⁵，用水洗脱，然后用含0.1％TFA的1∶1 CH₃CN/水洗脱，收集3×200μl部分，提供Tyr⁵³³-和Tyr⁵³⁵-放射性标记的肽的混合物。

将该热混合物共注射到用等摩尔冷载体N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I-Tyr-NH₂和N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I-Tyr-Asp-Tyr-NH₂的溶液的C18 HPLC柱上，其洗脱时间已经分别预定为36分钟和38分钟。重复用实施例1中的溶剂系统洗脱，并冻干所述合并的相关部分，提供具有最小量杂质N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I-Tyr-Asp-Tyr-NH₂的所需化合物N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I-Tyr-NH₂。

一般方法学

实施例14

分离和纯化kringle 5肽片段

用Powell等方法(Arch Biochem.Biophys.248(1)：390-400(1986)，该文献通过引用结合到本文中)的修改方法，由猪弹性蛋白酶(SIGMA,St.Louis,MO)消化Lys血纤溶酶原(Lys-HPg,Abbott Laboratories,Abbott Park,IL)制备所述kringle 5肽片段。1.5 mg猪弹性蛋白酶与含200 mg Lys-HPg的50 mM Tris-HCl pH 8.0一起保温，并于室温下振荡过夜。加入DPF(氟磷酸二异丙酯，SIGMA)至终浓度为l mM终止该反应。将该混合物再振荡30分钟，对50 mM Tris-HCl pH 8.0透析过夜并浓缩。将切割的血纤溶酶原置于2.5 cm×15 cm的赖氨酸-Sepharose4B柱(Brockway,W.J.和Castellino,F.J.,Arch.Biochem.Biophys.151：194-199(1972)，该文献通过引用结合到本文中)上，并用50 mM TrispH8.0平衡直至达到0.05的吸收值(在280nm)。(进行这步可除去含有kringle l区和/或kringle 4区(这两者都结合赖氨酸)的任何片段)。所述非吸收kringle 5肽片段对50 mM pH 5.0 Na₂PO₄缓冲液透析，然后上用同一缓冲液平衡的BioRad Mono-S柱。用0-20％、20-50％和50-70％的阶梯梯度的20 mM磷酸盐/1 M KCI pH 5.0洗脱切割的kringle 5部分；未切割小HPg和其余的蛋白酶域部分。正如凝胶电泳测定的，所述kingle 5肽片段在50％阶梯洗脱。收集的峰对20 mM Tris pH 8.0透析过夜。

通过FPLC层析和用银染(考马斯亮蓝)的DodSO4/PAGE测定所述分离的kringle 5肽片段的纯度至少为95％。所述纯化片段的氨基末端部分的序列分析揭示，存在三个具有α-N末端序列VLLPDVETPS、VAPPPVVLL和VETPSEED的多肽，这三个序列分别相应于SEQ IDNO:1的氨基酸部分Val⁴⁴⁹-Ser⁴⁵⁸、Val⁴⁴³-Leu⁴⁵⁰和Val⁴⁵⁴-Asp⁴⁶¹。

实施例15

内皮增殖测定

按Lingen等在Laboratory Investigation,74:476-483(1996)中所述，用细胞效价96水性非放射性细胞增殖测定试剂盒(PromegaCorporation,Madison,WI)测定内皮细胞的体外增殖，该文献通过引用结合到本文中。将牛毛细管(肾上腺)内皮细胞在96孔板含10％供体小牛血清和1％BSA(牛血清白蛋白，GIBCO BRL,Gaithersburg,MD)的Dulbecco氏修改Eagle培养基(DMEM)中以1000细胞/孔的密度铺平板。8小时后，在含0.1％BSA的DMEM中饥饿所述细胞，然后再用含特定浓度的抑制剂和5 ng/ml bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)的培养基饲养。对作为基线的未刺激细胞(即未加入bFGF)和作为最大增殖的仅用bFGF刺激的细胞(即未加入抑制剂)更正该测定的结果。当组合多个实验时，所述结果以与单独的bFGF相比的细胞数变化的百分比表示。

实施例16

内皮细胞迁移测定

基本上按Polverini,P.J.等，Methods Enzymol.198∶440-450(1991)所述进行内皮细胞迁移测定，该文献通过引用结合到本文中。简单地说，将牛毛细管(肾上腺)内皮细胞(BCE，哈佛大学医学院Judah Folman提供)在含0.1％牛血清白蛋白(BSA)的DMEM中饥饿过夜。然后用胰蛋白酶收获细胞，将其以1.5×10⁶细胞/ml的浓度再悬浮于含0.1％BSA的DMEM中。将细胞加入48孔修改的Boyden小室(NucleoporeCorporation,Cabin John,MD)的底部。装配该小室，并将其反转，让细胞于37℃粘附到聚碳酸酯趋化膜(5 μm孔径大小)上2小时，该膜已经于0.1％明胶中浸泡过夜并干燥。然后将该小室再反转，将测试物质加入上部小室的孔中(至50μ1的终体积)；然后将该装置于37℃温育4小时。回收膜，固定，染色(DiffQick,Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)并在每10个高倍视野下计数迁移到上部小室的细胞数。减去向DMEM+0.1％BSA的背景迁移，该数据以每10个高倍视野(400×)迁移的细胞数表示，或当综合多个实验的结果时，该数据以与阳性对照相比的迁移抑制百分比表示。结果示于表1。

实施例17

kringle 5肽片段对内皮细胞体外增殖的作用

用上述内皮细胞增殖测定测定kringle 5肽片段对内皮细胞体外增殖的作用。对于这些实验，如实施例1-14所述制备kringle 5肽片段，并以大约100-1000pM的浓度范围的不同浓度与用作最大增殖对照的bFGF一起测试。kringle 5肽片段SEQ ID NO:3以剂量依赖性方式有效地抑制BCE细胞增殖。到达50％抑制(ED₅₀)所需的krinigle 5肽片段SEQ ID NO:3的浓度测定为大约300 pM。相反，kringle 1-4的ED₅₀表明为135 nM。

其它kringle肽片段对BCE细胞增殖的抑制作用的总结示于表1。kringle 3肽片段抑制BCE细胞增殖的效率最低(ED₅₀=460 nM)，然后是kringle 1肽片段(ED₅₀=320 nM)、kringle 1-4肽片段(ED₅₀=135 nM)和kringle 1-3肽片段(ED₅₀=75 nM)。kringle 5肽片段最有效地抑制BCE细胞增殖，ED ₅₀为0.3 nM。

实施例18

kringle 5肽片段对内皮细胞体外迁移的作用

也采用上述内皮细胞迁移测定测定了kringle 5肽片段对内皮细胞体外迁移的作用。kringle 5肽片段以剂量依赖性方式抑制BCE细胞迁移，ED₅₀为大约300 pM。在最大抑制BCE细胞所需的kringle 5肽片段的浓度下，也抑制PC-3细胞和MDA 486细胞。该结果结合实施例2的结果，表明kringle 5肽片段对BCE细胞受刺激增殖和迁移的抑制都有效，并且对内皮细胞为特异性的，对正常细胞或肿瘤细胞无特异性。

以上仅仅是本发明的说明，无意将本发明限制在公开的化合物上。对本领域技术人员明显的变化和改变在所附的权利要求书定义的本发明的范围和性质内。

表1显示由各种kringle片段体外对BCE细胞增殖和细胞迁移的抑制获得的ED50的总结。在该表中，kringle肽片段按照与SEQ ID NO:1的相应序列同源性进行标记。符号“*”表示得自Marti,D.等，Eur.J.Biochem.,219∶455-462(1994)的数据，该文献通过引用结合到本文中，而符号“-”表示无数据。

表1

得自SEQ ID NO:1的蛋白片段	BCE细胞的抗增殖活性(ED₅₀)	HMVEC细胞的迁移抑制(ED₅₀)
得自SEQ ID NO:1的蛋白片段	BCE细胞的抗增殖活性(ED₅₀)	HMVEC细胞的迁移抑制(ED₅₀)	kringles 1-4(制管张素)^*	135nM	160 nM
kringle 1(Tyr⁸⁰-Glu¹⁶³)^*	320nM	-	kringles 1-4(制管张素)^*	135nM	160 nM
kringle 1(Tyr⁸⁰-Glu¹⁶³)^*	320nM	-	kringle 2(Glu¹⁶¹-Thr²⁴⁵)^*	无活性	-
kringle 3(Thr²⁵³-Ser³³⁵)^*	460 nM	-	kringle 2(Glu¹⁶¹-Thr²⁴⁵)^*	无活性	-
kringle 3(Thr²⁵³-Ser³³⁵)^*	460 nM	-	kringle 4(Val³⁵⁴-Val⁴⁴³)^*	无活性	-
kringles-3(Tyr⁸⁰-Pro³⁵³)^*	75 nM	60 nM	kringle 4(Val³⁵⁴-Val⁴⁴³)^*	无活性	-
kringles-3(Tyr⁸⁰-Pro³⁵³)^*	75 nM	60 nM	kringles 2-3(Glu¹⁶¹-Ser³³⁵)^*	-	-
kringle 5(Val⁴⁴³-Ala⁵⁴³)	250pM	200pM	kringles 2-3(Glu¹⁶¹-Ser³³⁵)^*	-	-
kringle 5(Val⁴⁴³-Ala⁵⁴³)	250pM	200pM	kringle 5(Val⁴⁴⁹-Ala⁵⁴³)	-	240pM
kringle 5(Val⁴⁵⁴-Ala⁵⁴³)	-	220pM	kringle 5(Val⁴⁴⁹-Ala⁵⁴³)	-	240pM
kringle 5(Val⁴⁵⁴-Ala⁵⁴³)	-	220pM	kringle 5(Val⁴⁴³-Phe⁵⁴⁶)	60nM	55 nM
kringle 5(Val⁴⁴⁹-Phe⁵⁴⁶)		-	kringle 5(Val⁴⁴³-Phe⁵⁴⁶)	60nM	55 nM
kringle 5(Val⁴⁴⁹-Phe⁵⁴⁶)		-	kringle 5(Val⁴⁵⁴-Phe⁵⁴⁶)	-	-
kringles 4-5(Val³⁵⁵-Ala⁵⁴³)	-	280pM	kringle 5(Val⁴⁵⁴-Phe⁵⁴⁶)	-	-
kringles 4-5(Val³⁵⁵-Ala⁵⁴³)	-	280pM	kringles 4-5(Val³⁵⁵-Phe⁵⁴⁶)	-	-
N-Ac-Val⁴⁴⁹-Asp⁴⁶¹-NH₂	-	>1 mM	kringles 4-5(Val³⁵⁵-Phe⁵⁴⁶)	-	-
N-Ac-Val⁴⁴⁹-Asp⁴⁶¹-NH₂	-	>1 mM	N-Ac-Met⁴⁶³-Pro⁴⁸²-NH₂	-	>1 mM
N-Ac-Gln⁴⁸⁴-Tyr⁵¹¹-NH₂	-	>100μM	N-Ac-Met⁴⁶³-Pro⁴⁸²-NH₂	-	>1 mM
N-Ac-Gln⁴⁸⁴-Tyr⁵¹¹-NH₂	-	>100μM	N-Ac-Arg⁵¹³-Trp⁵²³-NH₂	-	500pM
N-Ac-Tyr⁵²⁵-Tyr⁵³⁵-NH₂	-	200pM	N-Ac-Arg⁵¹³-Trp⁵²³-NH₂	-	500pM
N-Ac-Tyr⁵²⁵-Tyr⁵³⁵-NH₂	-	200pM	N-Ac-Pro⁵²⁹-Tyr⁵³⁵-NH₂	-	120pM
N-Ac-Pro⁵²⁹-Asp⁵³⁴-NH₂	-	123 pM	N-Ac-Pro⁵²⁹-Tyr⁵³⁵-NH₂	-	120pM
N-Ac-Pro⁵²⁹-Asp⁵³⁴-NH₂	-	123 pM	N-Ac-Pro¹⁵⁰-Tyr¹⁵⁶-NH₂	-	160nM
N-Ac-Arg⁵³⁰-Tyr⁵³⁵-NH₂	-	80 pM	N-Ac-Pro¹⁵⁰-Tyr¹⁵⁶-NH₂	-	160nM
N-Ac-Arg⁵³⁰-Tyr⁵³⁵-NH₂	-	80 pM	N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I-Tyr-Asp-Tyr-NH₂	-	>100 nM
N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I-Tyr-NH₂	-	400pM	N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I-Tyr-Asp-Tyr-NH₂	-	>100 nM
N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I-Tyr-NH₂	-	400pM	N-Ac-Lys⁵³¹-Tyr⁵³⁴-NH₂	-	-

实施例19

kringle 5片段在巴斯德毕赤酵母中的重组表达

A．通过PCR生产编码kringle 5片段的cDNA：用PCR来产生具有(1)SEQ ID NO:1的氨基酸位置450-543氨基酸序列(下文为K5A),(2)SEQ ID NO:1的氨基酸位置450-546氨基酸序列(下文为K5F),(3)SEQ ID NO:1的氨基酸位置355-543氨基酸序列(下文为K4-5A)和(4)SEQ ID NO:1的氨基酸位置355-546氨基酸序列(下文为K4-5F)的kringle 5肽片段的编码cDNA片段，以用于在真核宿主和原核宿主中克隆和表达。用人血纤溶酶原的编码cDNA(得自纽约州立大学E.Reich博士，Stony Brook,NY)作为模板和示于以下的数套正向和反向引物(得自Operon Technologies,Inc.Alameda,CA)产生DNA片段：

5＇-ATTAATGGATCCTTGGACAAGAGGCTGCTTCCAGATGTAGAGACT-3＇	SEQ ID NO:2
5＇-ATTAATGGATCCTTGGACAAGAGGCTGCTTCCAGATGTAGAGACT-3＇	SEQ ID NO:2	5＇-ATTAATGGATCCTTGGACAAGAGGGTCCAGGACTGCTACCATGGT-3＇	SEQ ID NO:3
5＇-ATTAATCTCGAGGCATGCTTAGGCCGCACACTGATGGACA-3＇	SEQ ID NO:4	5＇-ATTAATGGATCCTTGGACAAGAGGGTCCAGGACTGCTACCATGGT-3＇	SEQ ID NO:3
5＇-ATTAATCTCGAGGCATGCTTAGGCCGCACACTGATGGACA-3＇	SEQ ID NO:4	5＇-ATTAATCTCGAGGCATGCTTAAAATGAAGGGGCCGCACACT-3＇	SEQ ID NO:5

采用引物组SEQ ID NO:2和SEQID NO:4(用于K5A)、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:5(用于K5F)、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO:8(用于K4-5A)和SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5(用于K4-5A)，在标准PCR条件下进行PCR扩增，所述条件为总体积为100 μl，含有每种dNTP200 μM，其中N为A、T、G和C，每种引物0.2μM，大约10 ng模板DNA和1单位VentDNA聚合酶(New England Biolabs)。在DNA热循环仪480(Perkin Elmer,Foster City,CA)上扩增总共25个循环(1个循环=94℃1分钟，48℃2分钟，72℃1分钟)。扩增后，凝胶纯化PCR产物，用BamHⅠ和XhoⅠ(New England Biolabs)消化，连接到用同一酶切割的修饰的毕赤酵母属表达载体(pHil-D8，参见以下)中，并通过电穿孔转化到HB101细胞(BioRad)中。从各个克隆制备DNA，经过限制酶消化和序列分析，以鉴定含有具有正确序列并且方向正确的插入片段的克隆。然后，按照厂商的指示，将来自阳性鉴定克隆的质粒转化到巴斯德毕赤酵母菌株GSll5(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。为了鉴定毕赤酵母属中的阳性克隆，让细胞于29℃过夜生长于5 mlBMGY培养基(Invitrogen)中，通过离心收集细胞，将其再悬浮于0.5mlBMMY培养基(Invitrogen)中用于表达。于29℃温育2天后，收集培养物上清液，按照已知技术将数等份经过SDS-PAGE和Western印迹分析。一个SDS-PAGE凝胶示于图6。

B．表达载体pHil-D8的构建：通过修饰载体pHil-D2(Invitrogen)，使其包括用于分泌重组蛋白的合成前导序列，构建毕赤酵母属表达载体pHil-D8(参见图5)。前导序列5’-ATGTTCTCTCCAATTTTGTCCTTGGAAATTATTTTAGCTTTGGCTACTTTGCAATCTGTCTTCGCTCAGCCAGTTATCTGCACTACCGTTGGTTCCGCTGCCGAGGGATCC-3’(SEQ ID NO:9)编码一个码操作性地连接到用于KEX2切割的前肽序列(粗体)的PHO1分泌信号(单下划线)。为了构建pHil-D8，采用pHil-S1(Invitrogen)作为模板进行PCR，因为该载体含有编码PHOl的序列，采用相应于pHil-Sl的核苷酸509-530的正向引物(SEQ ID NO:7)和具有PHO1分泌信号后一部分(SEQ ID NO:9的核苷酸45-66)的编码核苷酸序列的反向引物(SEQ ID NO:8)和所述前肽序列(SEQ ID NO:9的核苷酸67-108)。所述引物序列(得自OperonTecnologies,Inc.Alameda,CA)如下：

5＇-GAAACTTCCAAAAGTCGCCATA-3＇	SEQ ID NO:7
5＇-GAAACTTCCAAAAGTCGCCATA-3＇	SEQ ID NO:7	5＇-ATTAATGAATTCCTCGAGCGGTCCGGGATCCCTCGGCAGCGGAACCAACGGTAGTGCAGATAACTGGCTGAGCGAAGACAGATTGCAAAGTA-3＇	SEQ ID NO:8

如实施例19所述扩增25个循环。将PCR产物(大约500 bp)凝胶纯化，用BlpⅠ和EcoRⅠ切割，并连接到用同样的酶切割的pHil-D2中。将所述DNA转化到大肠杆菌HB101细胞中，通过限制酶消化和序列分析鉴别阳性克隆。一个具有合适序列的克隆命名为pHil-D8。

实施例20

kringle 5肽片段在细菌中的重组表达

所用的限制酶和其它修饰酶以及其它试剂都得自商业来源。于Abbott实验室，在自动合成仪上用本领域已知的标准方法合成引物。

也通过PCR扩增产生kringle 5肽片段的DNA，以在细菌细胞(大肠杆菌)中克隆和表达。采用的一般方法是产生具有或不具有终止密码子的所需编码区的PCR片段，用激酶处理所述末端，将所述片段克隆到选择的载体中。然后将载体构成物转化到合适的宿主细胞中，并通过PCR，用载体引物筛选菌落，以证实插入片段的存在。为了确定插入片段的方向，用1个载体引物和1个插入引物，将表现出插入片段阳性克隆的PCR反应物进行定向PCR。

A．平端磷酸化载体的制备：表2显示用于细菌生产kringle 5肽片段的表达载体的描述。

表2

载体	来源	限制酶	融合
载体	来源	限制酶	融合	UpET	Abbott修饰的pET2ld	SapⅠ	无
UpET-HTh	Abbott修饰的pET2ld	SapⅠ	N末端His6-凝血酶识别	UpET	Abbott修饰的pET2ld	SapⅠ	无
UpET-HTh	Abbott修饰的pET2ld	SapⅠ	N末端His6-凝血酶识别	UpET-Ubi	Abbott修饰的pET21d	SapⅠ	N末端His6-遍在蛋白-肠激酶识别
pET32a	Novagen	NcoⅠ+XhoⅠ	硫氧还蛋白、肠激酶识别	UpET-Ubi	Abbott修饰的pET21d	SapⅠ	N末端His6-遍在蛋白-肠激酶识别
pET32a	Novagen	NcoⅠ+XhoⅠ	硫氧还蛋白、肠激酶识别	pGEX-4T-2	Pharmacia	EcoRⅠ+NotⅠ	GST
pCYB3	New England Biolabs	NcoⅠ+SapⅠ	C末端intein	pGEX-4T-2	Pharmacia	EcoRⅠ+NotⅠ	GST

所有载体都首先用Qiagen柱按照厂商的说明(QIAGEN,Inc.,SantaClarita,CA)进行分离和纯化。载体DNA(lμg)用合适的限制酶(参见表2)，在含有100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)的20μl NEB4缓冲液(NewEngland Biolabs)中进行消化。将反应物简单地离心，加入20μl去离子水、0.4μldNTP混合物(Pharmacia；dNTP各20 mM)和0.25μl克隆的pfu DNA聚合酶(Stratagene；2.5单位/μl)，将该反应混合物于65℃温育20分钟，以填满该载体末端。再将反应物简单地离心，加入4μl稀释的牛小肠磷酸酶(GIBCO BRL,Gaithersburg,MD；总共5单位)。然后于50℃将该混合物温育1小时。加入5个5μl 10％SDS、2μl 5MNaCl、2μl 0.5M EDTA和45μl水，简单地将该反应物离心，然后于65℃温育20分钟。然后用缓冲液饱和的苯酚-氯仿(GIBCO BRL)抽提3次该反应物，用氯仿抽提一次。水相通过CHROMA SPIN^TM 100 TE柱(CLONTECH,Palo Alto,CA)纯化。

B.通过PCR产生DNA片段：根据公开的人血纤溶酶原的序列(参见SEQ ID NO:12)设计和orderPCR引物，并示于下面：

5＇-GTCCAGGACTGCTACCAT-3＇	SEQ ID NO:10
5＇-GTCCAGGACTGCTACCAT-3＇	SEQ ID NO:10	5＇-CTGCTTCCAGATGTAGAGA-3＇	SEQ ID NO:11
5＇-TTATTAGGCCGCACACTGAGGGA-3 ＇	SEQ ID NO:13	5＇-CTGCTTCCAGATGTAGAGA-3＇	SEQ ID NO:11

除非另外陈述，否则用pfu DNA聚合酶和缓冲液(Stragene)，采用dNTP各200μM和每种引物各lμM进行所有PCR。所用的引物组为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13(用于K5A)以及SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:13(用于K4-5A)。含有K4-5A的载体pHil-D8(实施例19所述)用作模板。在用作模板前，该DNA用Dral(它在所述kringle区外产生多个切口)消化，以消除由pHil-D8在转化中引起的背景。每50μlPCR反应物用大约10 ng模板。PCR反应于94℃进行2分钟；然后以94℃30秒、49℃1分钟、72℃4分钟进行15个循环，以及于72℃7分钟。在PCR反应后，加入0.5μl100 mM ATP和5单位T4激酶，该反应物于37℃保温20分钟，以用激酶处理所述末端。然后将该反应物于68℃加热15分钟，在S400-HR spin柱(Pharmacia)纯化以用于连接。

C．将PCR片段连接到表达载体中：如下制备6个重组构成物(具体为(ⅰ)UpET-PS3中的K5A,(ⅱ)pET32a中的K5A,(ⅲ)在UpET-PS3中的K4-5A,(ⅳ)在UpET-Ubi中的K4-5A,(ⅴ)pET32a中的K4-5A和(ⅵ)pGEX-4T-2中的K4-5A)：将平端、磷酸酶处理的载体(来自以上步骤A的1μl)和PCR片段(来自以上步骤B的1μl)在5.5μl的总体积中，用快速连接试剂盒按照厂商的说明(BOEHRINGER-MANNHEIM Corp.,Indianapolis,IN)进行连接。然后将连接混合物(1μl)按照厂商的说明转化到20μl的感受态细胞(XLl-Blue超感受态细胞或XL2-Blue超感受态细胞(Stratagene)。在LB-Amp琼脂平板(MicroDiagnostics,Lombard,IL)上选择重组细胞。

D．表达研究：在大肠杆菌XLl-Blue和XL2-Blue中表达pGEX载体。分离所有其它载体，并按照厂商的说明转化到大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)中。将各个菌落接种到2.5ml LB/Amp中，以225rpm、37℃振荡过夜。然后，将过夜培养物(0.5 ml)接种到250 ml烧瓶中的50 ml LB/Amp中，以225rpm、37℃振荡至OD600为05～0.6。然后加入异丙基-1-硫-B-D-吡喃半乳糖糖苷(IPTG,100mM)至最终浓度为lmM。培养物以225 rpm、30℃振荡3小时，然后离心。按照已知技术制备用于SDS-PAGE的样品。初步实验表明，具有K5A/pET32a、K4-5A/pET32a和K4-5A/pGEX的细胞产生大多数重组蛋白。然后通过SDS-PAGE分析这些克隆的培养物的可溶性对不溶性的表达。如图7所示，K5A/pET32a产生的重组蛋白完全可溶(比较Trx-K5A的泳道S和P)，而K4-5A/pET32a和K4-5A/pGEX产生大约75％的可溶性蛋白。

E． Abbott修饰载体的构建

i．VB1、VB2、VB3和VB4盒的制备：VB1、VB2、VB3和VB4作为合成DNA用本领域技术人员熟知的技术合成。synVB1、synVB2、synVB3和synVB4的序列示于以下：

synVB1	5＇-AGCGTCTCATGAAGAGCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGCCTTGGCGCGCCAACCTTAATTAACCGGGAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGCTCTTCATAGTGACTGAGACGTCG-3＇	SEQ ID NO:14
synVB1		SEQ ID NO:14	synVB2	5＇-AGCGTCTCAGGTGGTGGTCATCACCATCACCATCACGGTGGTGGTCTGGTGCCGCGCGGCAGCTGAAGAGCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGCCTTGGCGCGCCAACCTTAATTAACCGGGAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTGCTCTTCACGAGACGTCG-3＇	SEQ ID NO:15
synVB3	5＇-AGCGTCTCAGGTGGTGGTCATCACCATCACCATCACGGTGGTGGTTGAAGAGCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGCCTTGGCGCGCCAACCTTAATTAACCGGGAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGCTCTTCACGAGACGTC-3＇	SEQ ID NO:16	synVB2		SEQ ID NO:15
synVB3		SEQ ID NO:16	synVB4	5＇-AGCGTCTCAGGTGGTGGTCATCACCATCACCATCACGGTGGTGGTGATGACGATGACAAGTGAAGAGCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGCCTTGGCGCGCCAACCTTAATTAACCGGGAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGCTCTTCACGAGACGTCG-3＇	SEQ ID NO:17

将每种合成序列制备成双链，并按照厂商的说明克隆到pCR-Script Cam^TM中；然后通过标准方法分离具有正确序列的克隆。在含20μl反应物、100μg/ml BSA的1×NEB4缓冲液中将5μg纯化的DNA用8单位BsmBⅠ于55℃消化。简单地离心该反应物，加入20μl去离子水、0.4μl dNTP混合物(Pharmacia；每种dNTP 20 mM)和0.25μl克隆的pfu DNA聚合酶(atratagene；每μl2.5单位)，将该反应物于65℃保温20分钟，以填满所述末端。然后该DNA在含3％MetaPhor^TM琼脂糖凝胶(FMC,Rockland,Maine)的0.5×Tris-乙酸盐-EDTA缓冲液(TAE)中电泳。切下所述盒条带，通过冷冻该凝胶，然后通过Ultrsfree^TMProbind cartridge(MILLIPORE Corp.,Bedford,MA)离心缓冲液来洗脱所述DNA，接着用Pellet Paint^TM(Novagen)作为载体进行异丙醇沉淀。该DNA(cfVB1、cfVB2、cfVB3和cfVB4)用70％乙醇冲洗，简单地干燥，再悬浮于25μlTris-EDTA(TE)缓冲液中。

ⅱ．UpET的构建：载体pET21d(Novagen)用SapⅠ消化，首先用T4 DNA聚合酶+dGTP处理，然后用Mung Bean核酸酶处理，然后用DNA聚合酶Ⅰ克列诺片段处理，然后再连接。筛选各个菌落，以选择已经消除现有SapⅠ位点的质粒。然后，该DNA用NcoⅠ+BamHⅠ消化，并连接到5’-CATGTGAAGAGC-3’(SEQ ID NO:19)+5’-GATCGCTCTTCA-3’(SEQ ID NO:20)，以导入一个单一的SapⅠ位点。纯化的证实的克隆DNA用SapⅠ+HindⅢ切割，按上述将其平端化和用磷酸酶处理，与cfVBl盒连接，转化到大肠杆菌中，在LB-Amp平板上铺平板。用无菌移液管头在LB-Amp琼脂平板上挑出菌落，接种到 Costar Thermowell板中的20μl AmpliTaqPCR mix(Perkin ELmer)中，板中含有载体引物5’-AGATCTCGATCCCGCGAA-3’(正向引物，SEQ ID NO:21)和5’-ATCCGGATATAGTTCCTC-3’(SEQ ID NO:22)各1 μM。将反应物加热至94℃5分钟，然后用GeneAmp 9600热循环仪进行30个循环：94°30秒，40°1分钟，72°2分钟。将每种反应物10μl在琼脂糖凝胶上电泳。为了确定该盒的方向，将具有正确大小的PCR筛选物0.25μl加入含有反向载体引物和盒引物5’-CGGGCTTTTTTTTGCTCTTCA-3’(SEQ ID NO:23)的新鲜反应中。反应按上述再循环10个循环。用标准方法对最终的载体进行测序，一个克隆命名为UpET。

ⅲ．UpET-HTh的构建：UpET用SapⅠ消化，制备用于平端、磷酸酶处理的克隆。如以上cfVB1连接所述，将其连接到cfVB2盒中，进行转化、筛选菌落并对其测序。

ⅳ．UpET-H的构建：UpET用SapⅠ消化，制备用于平端、磷酸酶处理的克隆。如以上cfVB1连接所述，将其连接到cfVB3盒中，进行转化、筛选菌落并对其测序。

ⅴ．UpET-Ubi的构建：用Ultma DNA聚合酶和缓冲液(PerkinElmer)、dNTP各40 μM、引物5’-CAGATTTTCGTCAAGACTT-3’(Ubi-5p,SEQ ID NO:24)和5’-ACCACCTCTTAGCCTTAG-3’(Ubi-3p,SEQ ID NO:25)各lμM和1.75μg酵母DNA，于94℃2分钟，然后于94℃1分钟、40℃1分钟、72℃2分钟进行25个循环，然后于72℃7分钟，产生酿酒酵母遍在蛋白的PCR片段。用引物5’-CATGGTATATCTCCTTCTT-3’(pET3p-ATG,SEQ ID NO:26)和5’-TGAGCAATAACTAGCATAAC-3’(T7RevTerm,SEQ ID NO:27)，于94℃2分钟，然后于94℃45秒、42℃1分钟、72℃15分钟进行10个循环，然后于72℃7分钟，由20 ng pET15b(Novagen)产生一PCR片段。将遍在蛋白和pET15b衍生的PCR片段进行凝胶纯化，并用BRLT4连接酶和连接酶缓冲液将它们连接在一起。然后用该连接物作为模板，使用Ultma DNA聚合酶和引物5’-AGATCTCGATCCCGCGAA-3’(pET5p,SEQ ID NO:28)和SEQ ID NO:25，于94℃2分钟，然后于94℃30秒、42℃1分钟、72℃3分钟进行25个循环，然后于72℃7分钟，产生T7启动子-遍在蛋白(T7-遍在蛋白)PCR片段。凝胶纯化T7-遍在蛋白PCR片段。

使用Ultma DNA聚合酶(如上)和引物5’-TTAGGTCTCAGGGGAGT-3’(Strom-3p,SEQ ID NO:29)和激酶处理的引物5’-TTCAGAACCTTTCCTGGCA-3’(Strom-5p,SEQ ID NO:30)和大约20 ng模板(即克隆到pET3b(Novagen)的Stromelysin)，于94℃2分钟，然后于94℃1分钟、44℃1分钟、72℃2分钟进行15个循环，然后于72℃7分钟，产生成熟的人Stromelysin的PCR片段。将stromelysin PCR反应物(10 μl)在40μl BRL连接酶和连接酶缓冲液中，与100 pMol退火寡聚物5’-AGCGGCGACGACGACGACAAG-3’(Ek-Cut-5p,SEQ IDNO:31)和5’-CTTGTCGTCGTCGTCGCCGCT-3’(Ek-Cut-3p,SEQ IDNO:32，编码肠激酶酶切位点)连接。用lμl该连接物作为模板，用引物SEQ ID NO:29和激酶处理的SEQ ID NO:31、Ultma DNA聚合酶和缓冲液，于94℃2分钟，然后于94℃1分钟、44℃1分钟、72℃2分钟进行10个循环，然后于72℃7分钟，产生肠激酶位点-成熟stromelysin(Ek-Stromelysin)PCR片段。凝胶纯化Ek-stromelysin PCR片段。

将T7-遍在蛋白和Ek-stromelysin PCR片段在连接酶和连接酶缓冲液中连接在一起。然后，用该连接物作为模板，使用Ultma DNA聚合酶和引物SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29，于94℃2分钟，然后于94℃30秒、42℃1分钟、72℃6分钟进行25个循环，然后于72℃7分钟，产生T7-遍在蛋白-Ek-stromelysin PCR片段。

用stromelysin-pET3b质粒模板与引物SEQ ID NO:26和SEQ IDNO:30以及Klen Taq(AB肽，St.Louis,MO)和pfu DNA聚合酶，于94℃2分钟，然后于94℃30秒、42℃2分钟、68℃20分钟进行15个循环，产生一PCR片段。将该PCR片段与T7-遍在蛋白-Ek-stromelysin PCR片段混合，转化到BRL DH5α最大效率的感受态细胞中。通过如上述研究的分离质粒DNA，转染到BL21(DE3)中并进行表达，鉴别正确的克隆。

用引物SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:32以及ppfu DNA聚合酶，于94℃2分钟，然后于94℃30秒、40℃1分钟、72℃3分钟进行20个循环，然后于72℃7分钟，由正确的T7-遍在蛋白-Ek-stromelysin表达质粒产生遍在蛋白-Ek的PCR片段。在Pharmacia S-400HR Spin柱上纯化该片段，用快速DNA连接试剂盒将其连接到VBC1盒中。用该连接物作为模板，使用引物SEQ ID NO:24和5’-TGAAGAGCAAAAAAAAGCCCG-3’(SEQ ID NO:33)和pfuDNA聚合酶，于94℃2分钟，然后于94℃30秒、40℃1分钟、72℃2分钟进行20个循环，然后于72℃7分钟，产生一PCR片段。将该PCR片段用激酶处理，将其连接到制备的Uper-H上，用于平端、磷酸酶处理的克隆。将该连接物转化到感受态细胞中，通过PCR如上筛选菌落。对质粒DNA测序，以鉴别正确的UpET-Ubi克隆。

Claims

1．具有式(Ⅰ)的化合物或其药学上可接受的盐、酯或前体药物，

A-B-C-X-Y (Ⅰ)其中，

A不存在或为氮保护基团；

Y不存在或为羧酸保护基团；

B不存在或为相应于SEQ ID NO:1的大约氨基酸位置334至氨基酸位置530序列的1至大约197个天然产生的氨基酸残基；

C为R¹-R²-R³-R⁴，其中

R¹为赖氨酰；

R²为亮氨酰或精氨酰；

R³为酪氨酰、3-I-酪氨酰或苯丙氨酰；

R⁴为天冬氨酰；以及

X不存在或为相应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置535至大约氨基酸位置546序列的1至大约12个天然产生的氨基酸残基及其同源物(homologues)和类似物。

2．权利要求1的化合物，其中B存在，而A、C、X和Y如其中定义的。

3．权利要求2的化合物，其中X存在，而A、B、C和Y如其中定义的。

4．权利要求3的化合物，其中A和Y存在，而B、C和X如其中定义的。

5．权利要求3的化合物，其中A和Y如其中定义的，而B-C-X选择以下：

(a) SEQ ID NO:1的氨基酸位置355-543的序列；

(b) SEQ ID NO:1的氨基酸位置355-546的序列；

(c) SEQ ID NO:1的氨基酸位置443-543的序列；

(d) SEQ ID NO:1的氨基酸位置449-543的序列；

(e) SEQ ID NO:1的氨基酸位置454-543的序列；

(f) SEQ ID NO:1的氨基酸位置443-546的序列；

(g) SEQ ID NO:1的氨基酸位置449-546的序列；

(h) SEQ ID NO:1的氨基酸位置454-546的序列；

(i) SEQ ID NO:1的氨基酸位置525-535的序列；

(j) SEQ ID NO:1的氨基酸位置529-535的序列；以及

(k) SEQ ID NO:1的氨基酸位置530-535的序列。

6．权利要求5的化合物，其中A为N-Ac，而Y为-NH₂。

7．权利要求1的化合物，其中X不存在，而A、B、C和Y如其中定义的。

8．权利要求7的化合物，其中X、A和Y如其中定义的，而B-C为SEQ ID NO:1氨基酸位置529-534的序列。

9．权利要求1的化合物，其中B和X不存在，而A、C和Y如其中定义的。

10．权利要求9的化合物，其中C为SEQ ID NO:1氨基酸位置531-534的序列。

11．权利要求1的化合物，其中所述化合物的分子量通过还原聚丙烯酰胺凝胶电泳或质谱分析测定为0.5-25,000千道尔顿，其氨基酸序列与SEQ ID NO:1的相应氨基酸序列大致相似。

12．权利要求1的化合物，它对内皮细胞迁移抑制的ED₅₀大约为100至大约500 pM。

13．权利要求1的化合物，它对内皮细胞增殖抑制的ED₅₀大约为100至大约500 pM。

14．具有式(Ⅱ)的化合物或其药学上可接受的盐、酯或前体药物，

A-B₁-C₁-X₁-Y (Ⅱ)其中

A不存在或为氮保护基团；

Y不存在或为羧酸保护基团；

B₁不存在或为相应于SEQ ID NO:1的大约氨基酸位置334至氨基酸位置513序列的1至大约176个天然产生的氨基酸残基；

C₁为SEQ ID NO:1的氨基酸位置514至氨基酸位置523的序列；而

X₁不存在或为相应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置524至氨基酸位置533序列的1至大约10个天然产生的氨基酸残基及其同源物和类似物。

15．权利要求14的化合物，其中B₁和X₁不存在，而A、C₁和Y如其中定义的。

16．权利要求8或10或15的化合物，其中A为N-Ac，而Y为-NH₂。

17．kringle 5肽片段，它与选自人、鼠、牛、猕猴和猪血纤溶酶源的血纤溶酶源片段具有大致的序列同源性。

18．kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白，其中所述kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白与人血纤溶酶源具有大致的序列同源性。

19．在需要抗血管生成疗法的病人中治疗疾病的方法，包括给与人或动物治疗有效量的哺乳动物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白。

20．权利要求19的方法，其中所述哺乳动物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白选自人、鼠、牛、猕猴和猪kringe 5肽片段或融合蛋白。

21．权利要求20的方法，其中所述kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白为人kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白。

22．权利要求19的方法，其中所述哺乳动物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白为具有下式的化合物或其药学上可接受的盐、酯或前体药物，

A-B-C-X-Y (Ⅰ)其中，

A不存在或为氮保护基团；

Y不存在或为羧酸保护基团；

C为R¹-R²-R³-R⁴，其中

R¹为赖氨酰；

R²为亮氨酰或精氨酰；

R³为酪氨酰、3-I-酪氨酰或苯丙氨酰；

R⁴为天冬氨酰；

X存在或为相应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置535至大约氨基酸位置546序列的1至大约12个天然产生的氨基酸残基及其同源物或类似物。

23．权利要求22的方法，其中所述哺乳动物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白为所述化合物，其中A和Y如其中定义的，而B-C-X选择以下：

(a) SEQ ID NO:1的氨基酸位置355-543的序列；

(b) SEQ ID NO:1的氨基酸位置355-546的序列；

(c) SEQ ID NO:1的氨基酸位置443-543的序列；

(d) SEQ ID NO:1的氨基酸位置449-543的序列；

(e) SEQ ID NO:1的氨基酸位置454-543的序列；

(f) SEQ ID NO:1的氨基酸位置443-546的序列；

(g) SEQ ID NO:1的氨基酸位置449-546的序列；

(h) SEQ ID NO:1的氨基酸位置454-546的序列；

(i) SEQ ID NO:1的氨基酸位置525-535的序列；

(j) SEQ ID NO:1的氨基酸位置529-535的序列；以及

(k) SEQ ID NO:1的氨基酸位置530-535的序列。

24．权利要求22的方法，所述化合物为所述哺乳动物kringle 5肽片段，其中X不存在，A和Y如其中定义的，而B-C为SEQ ID NO:1氨基酸位置529-534的序列。

25．权利要求22的方法，其中所述化合物为所述哺乳动物kringle5肽片段，其中X和B不存在，而A、C和Y如其中定义的。

26．权利要求23或24或25的方法，其中A为N-Ac，而Y为-NH₂。

27．权利要求19的方法，其中所述疾病选自癌症、关节炎、黄斑变性和糖尿病性视网膜病。

28．权利要求27的方法，其中所述疾病为癌症。

29．权利要求28的方法，其中所述疾病选自原发性和继发性实体瘤、癌、肉瘤、淋巴瘤、牛皮癣和血管瘤。

30．权利要求19的方法，其中所述哺乳动物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白为具有下式的化合物或其药学上可接受的盐、酯或前体药物，

A-B₁-C₁-X₁-Y (Ⅱ)其中

A不存在或为氮保护基团；

Y不存在或为羧酸保护基团；

B_l不存在或为相应于SEQ ID NO:1的大约氨基酸位置334至氨基酸位置513序列的1至大约176个天然产生的氨基酸残基；

C_l为SEQ ID NO:1的氨基酸位置514至氨基酸位置523的序列；而

X_l不存在或为相应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置524至氨基酸位置533序列的1至大约10个天然产生的氨基酸残基及其同源物和类似物。

31．权利要求30的方法，所述化合物为所述哺乳动物kringle 5肽片段，其中B₁和X₁不存在，而A、C₁和Y如其中定义的。

32．包含分离的单链或双链多核苷酸序列的组合物，其中所述多核苷酸序列编码具有血管生成抑制活性的kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白。

33．权利要求32的组合物，其中所述多核苷酸序列为DNA序列。

34．权利要求33的组合物，其中所述DNA序列编码选自以下的氨基酸序列：

(a) SEQ ID NO:1的氨基酸位置443-543的序列；

(b) SEQ ID NO:1的氨基酸位置449-543的序列；

(c) SEQ ID NO:1的氨基酸位置454-543的序列；以及

(d) SEQ ID NO:1的氨基酸位置355-543的序列。

35．权利要求33的组合物，其中所述多核苷酸序列编码选自SEQID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37的氨基酸序列。

36．组合物，包含kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白和药学上可接受的赋形剂。

37．包括植入包含载体的人类或非人类动物细胞的方法，其中所述载体含有编码kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白的DNA序列，并且其中所述载体存在于所述细胞中时，能够表达所述kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白。

38．制备kringle 5肽片段的方法，包括以下步骤：

(a)将哺乳动物血纤溶酶源以大约1∶100至大约1∶300的比率暴露于弹性蛋白酶，以形成所述血纤溶酶源和所述弹性蛋白酶的混合物；

(b)温育所述混合物；并且

(c)从所述混合物中分离所述kringle 5肽片段。

39．分离的单链或双链多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有血管生成抑制活性的kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白。

40．权利要求39的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码的所述哺乳动物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白选自人、猕猴、牛、鼠和猪kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白。

41．权利要求40的多核苷酸，其中所述哺乳动物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白为人kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白。

42．权利要求39的多核苷酸，其中所述哺乳动物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白为具有式B-C-X或B_l-C_l-X_l的化合物，其中

C为R¹-R²-R³-R⁴，其中

R¹为赖氨酰；

R²为亮氨酰或精氨酰；

R³为酪氨酰或苯丙氨酰；以及

R⁴为天冬氨酰；

X不存在或为相应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置535至大约氨基酸位置546序列的1至大约12个天然产生的氨基酸残基；

C₁为SEQ ID NO:1的氨基酸位置514至氨基酸位置523的序列；而

X₁不存在或为相应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置524至氨基酸位置533序列的1至大约10个天然产生的氨基酸残基及其互补物。

43．权利要求42的多核苷酸，其中所述哺乳动物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白为这样的化合物，其中B存在，而C和Y如其中定义的。

44．权利要求42的多核苷酸，其中所述哺乳动物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白为这样的化合物，其中X存在，而B和C如其中定义的。

45．权利要求42的多核苷酸，其中所述哺乳动物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白为这样的片段，其中B和X存在，而C如其中定义的。

46．权利要求39的多核苷酸，其中所述哺乳动物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白选自：

(a) SEQ ID NO:1的氨基酸位置355-543的序列；

(b) SEQ ID NO:1的氨基酸位置355-546的序列；

(c) SEQ ID NO:1的氨基酸位置443-543的序列；

(d) SEQ ID NO:1的氨基酸位置449-543的序列；

(e) SEQ ID NO:1的氨基酸位置454-543的序列；

(f) SEQ ID NO:1的氨基酸位置443-546的序列；

(g) SEQ ID NO:1的氨基酸位置449-546的序列；以及

(h) SEQ ID NO:1的氨基酸位置454-546的序列。

47．权利要求42的多核苷酸，其中所述哺乳动物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白为这样的片段，其中X不存在，而B和C如其中定义的。

48．权利要求39的多核苷酸，它为DNA分子。

49．权利要求39的多核苷酸，它为RNA分子。

50．包含一多核苷酸的载体，所述多核苷酸编码具有血管生成抑制活性的kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白。

51．权利要求50的载体，它为表达载体。

52．权利要求51的载体，其中所述多核苷酸编码的所述哺乳动物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白为具有式B-C-X或B₁-C₁-X₁的化合物，其中

C为R¹-R²-R³-R⁴，其中

R¹为赖氨酰；

R²为亮氨酰或精氨酰；

R³为酪氨酰或苯丙氨酰；以及

R⁴为天冬氨酰；

C₁为SEQ ID NO:1的氨基酸位置514至氨基酸位置523的序列；而

X₁不存在或为相应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置524至氨基酸位置533序列的1至大约10个天然产生的氨基酸残基或其互补物。

53．权利要求52的载体，其中所述哺乳动物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白为这样的化合物，其中B和X存在，而C如其中定义的。

54．权利要求52的载体，其中所述哺乳动物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白为这样的化合物，其中X不存在，而B和C如其中定义的。

55．权利要求52的载体，其中所述哺乳动物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白选自：

(a) SEQ ID NO:1的氨基酸位置355-543的序列；

(b) SEQ ID NO:1的氨基酸位置355-546的序列；

(c) SEQ ID NO:1的氨基酸位置443-543的序列；

(d) SEQ ID NO:1的氨基酸位置449-543的序列；

(e) SEQ ID NO:1的氨基酸位置454-543的序列；

(f) SEQ ID NO:1的氨基酸位置443-546的序列；

(g) SEQ ID NO：1的氨基酸位置449-546的序列；以及

(h) SEQ D NO:1的氨基酸位置454-546的序列。

56．权利要求52的载体，选自pHil-D8、pET32a、pGEX-4T-2、Up-ET、UpET-Ubi和pCYB3。

57．权利要求52的载体，还包括用所述载体转化的宿主细胞。

58．权利要求57的载体，其中所述宿主细胞为真核细胞。

59．权利要求58的载体，其中所述真核细胞为巴斯德毕赤酵母。

60．权利要求57的载体，其中所述宿主细胞为大肠杆菌原核细胞。

61．制备可溶性kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白的方法，包括以下步骤：

(a)分离编码所述kringle 5肽片段的多核苷酸；

(b)将所述多核苷酸克隆到表达载体中；

(c)将所述载体转化到合适的宿主细胞中；以及

(d)让所述宿主细胞在适于所述可溶性kringle 5肽片段或kringle5融合蛋白的表达的条件下生长。

62．选自以下的化合物：

(a) A-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I-Tyr-Y；

(b) A-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I-Tyr-Asp-Tyr-Y；

(c) A-Pro-Glu-Lys-Arg-Tyr-Asp-Tyr-Y；和

(d) A-Gln-Asp-Trp-Ala-Ala-Gln-Glu-Pro-His-Arg-His-Ser-Ile-Phe-Thr-Pro-Glu-Thr-Pro-Glu-Thr-Asn-Pro-Arg-Ala-Gly-Leu-Glu-Lys-Asn-Tyr-Y。