PT1343532E

PT1343532E - Transferência de genes mediada por vetor de lentivírus

Info

Publication number: PT1343532E
Application number: PT1985065T
Authority: PT
Inventors: J Timothy Stout; Binoy Appukuttan
Original assignee: Res Dev Foundation
Priority date: 2000-12-19
Filing date: 2001-12-18
Publication date: 2013-07-29
Also published as: JP2009137998A; JP4280496B2; EP1343532A4; US20020114783A1; CN100591359C; CN101732731A; JP2004520307A; KR20030075152A; DK2301583T3; EP1343532B1; EP2301583A1; AU3405302A; PT2301583E; RU2288742C2; CA2432301C; CA2432301A1; WO2002049677A1; DK1343532T3; CN1487841A; CN101732731B

Description

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DESCRIÇÃO "TRANSFERÊNCIA DE GENES MEDIADA POR VETOR DE LENTIVÍRUS"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Âmbito da Invenção A presente invenção situa-se normalmente no âmbito da biologia molecular de vetores e terapia genética. Mais especificamente, a presente invenção está relacionada com a utilização de vetores de lentivírus na terapia genética humana na doença ocular hereditária e proliferativa.

Descrição da Técnica Associada

Uma das principais causas da cegueira humana é a proliferação celular intraocular anormal, que muitas vezes resulta na perda de claridade no eixo visual ou interno, descolamento da retina do epitélio pigmentar da retina (RPE) provocado por forças de tração que incidem diretamente na superfície da retina. Descolamento da retina prolif erativa, que está relacionada ou com a doença de diabetes proliferativas (PDR) , ou com a retinopatia da prematuridade (ROP), ou com vitreoretinopatia proliferativa (PVR), ou ainda com a degeneração macular relacionada com a idade neovascular (AMD), se não forem tratadas, em última análise resultam na perda permanente da visão. A proliferação anormal de novos vasos sanguíneos dentro do olho, neovascularização ocular, é a causa mais comum de cegueira permanente nos países desenvolvidos. A grande maioria dos casos de neovascularização intraocular está associada a três doenças: diabetes, prematuridade retinopática e degeneração macular relacionada com a idade. Enquanto estas três entidades clinicas são distintas e 2 afetam grupos de pacientes diferentes, elas partilham uma via final comum que envolve a divisão descontrolada de células endoteliais levando à formação de novos vasos sanguíneos que em último caso comprometem a função da retina. Em conjunto, estas condições perfazem aproximadamente 60% da cegueira sem cura nos Estados Unidos da América. A proliferação das células endoteliais Vasculares dentro da retina inicia o processo de retinopatia diabética proliferativa (PDR). Se não forem tratadas, estas células endoteliais continuam a dividir-se podendo, eventualmente, formar membranas fibrovasculares que se estendem por toda a superfície interna da retina ou na cavidade vítrea. A contração da superfície posterior do vítreo resulta na tração dos locais de aderência da vítreo-fibrovascular e, em último caso, no descolamento da retina. Aproximadamente 50% dos diabéticos Tipo 1 desenvolverá uma retinopatia diabética proliferativa dentro de 20 anos após o diagnóstico de diabetes, ao passo que 10% dos pacientes com doença Tipo 2 irá evidenciar uma retinopatia diabética proliferativa dentro de um período de tempo semelhante. simula a

Os vasos sanguíneos desenvolvem-se normalmente por um de dois processos: vasculogénese ou angiogénese. No decurso da vasculogénese, uma rede primitiva de capilares é criada durante a embriogénese por maturação dos progenitores mesenquimais multipotenciais. Em contrapartida, a angiogénese consiste num processo de remodelação envolvendo vasos pré-existentes. Na angiogénese, novos ramos vasculares emanam dos velhos, formando vasos e invadindo o tecido circundante. Na retina, uma vez estabelecida a rede vascular normal, a remodelação desta rede está na grande maioria sob a influência da concentração de oxigénio nos tecidos - hipóxia (escassez de oxigénio) 3 angiogénese. É este processo que provoca a cegueira de milhões de diabéticos, bebés prematuros ou nos mais idosos da sociedade.

Doenças intraoculares como a degeneração da mácula relacionada com a idade, retinopatia diabética proliferativa, retinopatia da prematuridade, glaucoma, e vitreoretinopatia proliferativa são, portanto, caracterizadas pela proliferação anormal ou outro estado para o qual a terapia genética pode ser útil. Contudo, tem sido difícil realizar a transdução de gene em células de mamíferos com algum maior grau de eficácia. Adicionalmente, os resultados vistos com tais vetores tradicionais como vetores adenovirais, lipossomas e reagentes à base de dendrímeros são muito passageiros. Também é problemático introduzir estes vetores no olho sem a indução de uma resposta inflamatória forte.

Assim, a técnica anterior é deficiente na falta de meios da transdução diferenciada terminalmente ou na proliferação de células humanas dentro do, ou procedentes do, olho. Esta invenção preenche uma necessidade de longa data e desejada na técnica.

RESUMO DA INVENÇÃO

Constitui um objetivo da presente invenção desenvolver os vetores de lentivírus e métodos de utilização destes vetores na terapia dos genes humanos na doença ocular hereditária e proliferativa. A utilidade dos vetores de lentivírus é descrita para a transdução de retina, córnea, endotélio vascular, vitreoretinopatia proliferativa e células epiteliais do pigmento da retina humanas.

Numa forma de realização da presente invenção, foi demonstrado o potencial para suprimir a divisão celular 4 intraocular pela libertação de lentivírus constitutivamente ativa (mutante ou variante) do gene do retinoblastoma (CA-rb). As células oculares humanas foram testadas in vitro e dois modelos de doença proliferativa ocular (vitreoretinopatia proliferativa e opacificação capsular posterior da extração pós-lente) foram testados in vivo. Foi observado em vários tipos de células diferentes uma importante e duradoura inibição da divisão celular in vitro. A redução na gravidade da vitreoretinopatia proliferativa na extração pós-lente da opacificação posterior capsular foi observado in vivo.

Numa outra forma de realização da presente invenção, foi demonstrado que a transferência dos genes mediada por lentivírus, cuja importância é conhecida para o desenvolvimento e inibição do crescimento dos novos vasos sanguíneos (angiogénese) ou para a morte celular pré-programada (apoptose) pode ser importante no tratamento da angiogénese ocular patológica (e.g., retinopatia diabética ou degeneração macular "molhada" relacionada com a idade) ou na morte celular patológica (e.g., degeneração macular "seca" relacionada com a idade). Estes genes foram colocados sob o controlo de um de dois promotores fortes isolados conhecidos como sendo ativos nas células epiteliais da pigmentação da retina e córnea, da retina humana, e foi demonstrada a inibição neovascularização da córnea em modelo de coelhos.

Adicionalmente, este sistema de vetores, quando se sabe que a imunidade genética é deficiente em pacientes humanos com a doença hereditária dos olhos, pode haver uma transferência desses genes para as células oculares dos humanos. A transferência destes genes, através deste 5 processo, forma as bases para a obtenção de_intervençoes terapêuticas de sucesso nos pacientes com doenças oculares. A presente invenção está concebida num método de inibição da proliferação celular intraocular para indivíduos com necessidades de tal tratamento, nomeadamente em indivíduos com a doença ocular. Este método compreende os seguintes passos: a administração ao referido indivíduo de uma dose farmacologicamente eficaz de um vetor de lentivírus contendo um gene terapêutico que inibe a proliferação celular intraocular. A presente invenção está também concebida num método de inibição da neovascularização intraocular em indivíduos com doença ocular, que compreendem os passos de: administrar ao referido indivíduo a dose farmacologicamente efetiva de um vetor de lentivírus compreendendo um gene terapêutico que inibe a neovascularização intraocular.

Aspetos, características, e vantagens adicionais e outros da presente invenção serão perceptível na descrição seguinte das formas de realização presentemente preferidas da presente invenção. Esta forma de realização é dada para fins de divulgação.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Do modo pelo qual as características, vantagens e os objetos da invenção, acima mencionadas, assim como outros que virão a ficar claros, são atingidos e podem ser entendidos pormenorizadamente, descrições mais específicas das invenções brevemente resumidas acima podem ser tidas como referência para certas formas de realização dessas que são ilustradas nos desenhos anexos. Estes desenhos formam 6 uma parte das especificações. É de notar, contudo, que os gráficos em anexo ilustram uma forma de realização preferida da invenção e por isso não pode ser considerada como limitativa no seu âmbito. A Figura 1 retrata um vetor (fornecido pelo Dr. Inder Verma, Salk Institute, San Diego, CA). HIV: vírus da imunodeficiência humana, LTR: repetição terminal longa, GAG: gene GAG HIV, POL: transcriptase reversa HIV, ENV: gene invólucro HIV, rre: elemento de resposta rev, CMV: citomegalovirus, VSV: vírus da estomatite vesicular, Poli A: sinal de poliadenilação, Promotor especifico: qualquer promotor de melhoramento de transcrição pode ser colocado aqui de modo a modular aspetos espaciais, temporais ou quantitativos da expressão do gene terapêutico, Terapia genética: qualquer gene com potencial terapêutico pode ser aqui colocado — os exemplos incluem, mas não estão limitados a, um gene do retinoblastoma constitutivamente activo, ou aos genes cuja deficiência resultam em doença. A Figura 2 mostra a transdução in vitro das seguintes linhas celulares humanas: células epiteliais da pigmentação da retina humana (RPE), células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), Fibroblastos coroidais (CF), células (derivação retiniana) do retinoblastoma humano (Weri-Rb-1 e Y79). Estas linhas celulares foram transduzidas com partículas de lentivírus que contêm o gene marcador (o gene melhorado da proteína verde fluorescente) e a fração das células que expressam o gene marcador foram determinadas pela separação de células activada por fluorescência. Quanto mais células são transduzidas 7 com um grande número de partículas lentivirais maior é a percepção da resposta (infeção múltipla - MOI). A Figura 3A demonstra a transdução lentiviral das células cultivadas epiteliais da pigmentação da retina. A expressão do Gene Marcador (eGFP) resulta em células fluorescentes verdes. A Figura 3B mostra a análise da eficiência da transdução de separação de células ativadas por fluorescência. Os dados fora do portal R2 no primeiro painel refletem a falta de fluorescência na pré-transdução. 0 segundo painel demonstra a alteração da pós-transdução para 95% de fluorescente. A Figura 4 ilustra a atividade mitótica e a eficiência da transdução das células epiteliais do pigmento da retina humana. As células epiteliais do pigmento da retina humana foram transduzidas por vetores virai da leucemia lentiviral ou de murino (MLV). As Células foram mitoticamente inativas (confluente) ou mitoticamente ativas (crescimento) na altura em que o vetor foi exposto. Estes resultados apresentados na Figura 4 demonstram a capacidade superior dos vetores de lentivírus sobre os outros vetores retrovirais para transduzir células que não se dividem. A Figura 5 representa a estabilidade de expressão nas células epiteliais do pigmento da retina humana. As células foram expostas a vetores de lentivírus que contém eGFP e que foram subsequentemente mantidas pelo menos 12 0 dias em cultura permanente. A Figura 5A representa a estabilidade da expressão do eGFP nestas células assim como a falta de seleção para, ou contra, células transduzidas lentiviralmente (a fração de 8 células transduzidas mantém-se constante ao longo do tempo) . A Figura 5B é o resultado da análise de Southern em 5 populações de células clonais. A banda 1 contém DNA genómico da linha parental de não-transdução. As bandas 2 e 3 contêm DNA das células que foram expostas ao vetor mas que não eram verdes (não-transduzidas). As bandas 4 e 5 contêm DNA das células verdes transduzidas. As células permanecem positivas a e-GFP em resultado da integração genómica. A Figura 6 ilustra a expressão do transgene da célula fetal humana. Este gráfico apresenta um modo eficiência muito alto da transdução alcançada com vetores de lentivirus quando comparado com o vetor retroviral não lentiviral (MND-eGFP) ou sem vector virai (controlo) nas células fetais humanas. A Figura 7 demonstra a transdução da córnea. A Figura 7A é uma representação esquemática da córnea humana. A Figura 7B demonstra a transdução endotelial da córnea humana através de vetores de lentivirus contendo e-GFP. Os botões da córnea humana, retirados no momento do transplante da córnea, foram expostos a partículas lentivirais. A membrana de Descemet foi subsequentemente removida e fotografada com luz ambiente (esquerda) e em condições amenas para detetar o fluorescente (direita) . A Figura 7C demonstra a transferência do gene eGFP por mediação lentiviral para as células epiteliais da córnea humana. 0 subpainel A é uma micrografia de luz da córnea humana com uma camada epitelial separada artificialmente. A microscopia fluorescente (subpainel B) revela a fluorescência epitelial. 9 A Figura 8 fornece um exemplo da transferência do gene de lentivírus de um gene cuja deficiência resulta na doença humana. A retina humana normal ou o tecido epitelial do pigmento da retina (RPE), excisada cirurgicamente na altura da enucleação do retinoblastoma, foi exposta a vetores de lentivírus aos quais também têm falta o gene terapêutico (Mock) ou continham gene de periferina humano. Este gene, quando geneticamente deficiente em humanos é sabido que pode resultar numa grande variedade de fenótipos incapacitantes. Foram mostrados resultados de reação em cadeia da polimerase assistida por transcriptase reversa (rt-PCR) empregando primers desenhados para reconhecer somente o gene de periferina. A expressão de periferina humana na retina humana e no pigmento epitelial da retina foi claramente demonstrada. A Figura 9 demonstra - a expressão de CA-rb mRNA mediado por lentivírus. Esta mostra os resultados da reação em cadeia de polimerase assistida por transcriptase reversa (rt-PCR) empregando primers desenhados para reconhecer somente a forma constitutivamente ativa do gene do retinoblastoma. Banda 1: marcador, Banda 2: resultados da reação com RNA isolado das células eGFP transduzidas por lentivírus, Banda 3: resultados da reação com RNA isolado das células transduzidas CA-rb lentivírus. 0 produto da reação teve a medida esperada. A Figura 10 mostra o efeito inibidor do vetor do gene de retinoblastoma constitutivamente ativo a lentivírus na divisão das células da retina e do coróide humanos. As células foram expostas a diluições decrescentes de um único stock de lentivírus (diluição de 1:400 até 10 diluição de 1:50) e o crescimento foi comparado com células expostas a vetores de lentivirus que não continham o gene do retinoblastoma constitutivamente ativo. Um efeito inibidor na divisão celular foi claramente observado ao longo do tempo e este efeito foi dependente da dose. A Figura 11 mostra o efeito inibidor do CA-rb de lentivirus na divisão celular das lentes epiteliais de humanos. As células removidas a partir dos olhos de humanos aquando da extração da catarata foram expostas a diluições decrescentes de um stock de lentivirus (diluição de 1:400 até diluição de 1:50) e o crescimento foi comparado com as células expostas a vetores de lentivirus que não continham o gene de retinoblastoma constitutivamente ativo. Um efeito inibidor na divisão celular foi claramente observado ao longo do tempo e este efeito foi dependente da dose. A Figura 12 mostra os efeitos inibidores in vivo de CA-rb de lentivirus na proliferação celular intraocular da cegueira. A vitreoretinopatia proliferativa foi induzida em três grupos de coelhos. Um grupo não foi tratado, um grupo foi tratado com vetores de lentivirus sem o gene de retinoblastoma constitutivamente ativo e o último grupo foi tratado com CA-rb lentiviral aplicado intravitreamente. A vitreoretinopatia proliferativa e descolamento da retina foram visíveis nos primeiros dois sets com uma grande percentagem 90%). A fração de animais que teve descolamento da retina foi significativamente mais baixo no grupo tratado com gene retinoblastoma constitutivamente ativo (26%). São aqui apresentadas 11 duas fotografias da retina. 0 olho da esquerda tinha a retina completamente colada e foi tratada com um gene retinoblastoma constitutivamente ativo. 0 olho da direita tinha a retina completamente descolada, consequência da proliferação celular vitreoretinopática intraocular, e foi tratado com vetores de lentivirus sem o gene CA-rb. A Figura 13 mostra o efeito inibidor in vivo do CA-rb de lentivirus no processo de opacificação capsular posterior da pós extração de lentes. Três grupos de coelhos sofreram de uma facoemulsificação padrão para remover a lente cristalina nativa. 0 primeiro grupo (grupo 1) foi subsequentemente não tratado e os segundos dois grupos foram tratados ou com construções de lentivirus vazias (sem o gene terapêutico, grupo 2) ou com CA-rb de lentivirus (grupo 3) aplicado no saco capsular da lente intacta aquando do fecho da ferida da catarata. Os animais foram seriadamente examinados quanto à presença da opacificação capsular posterior. A presença da opacificação foi classificada numa escala de 1 a 5 onde o 1 representa a não opacificação e 5 representa a opacificação com a gravidade suficiente para impedir a visualização da retina por oftalmoscopia binocular indireta. Não houve resultados estatisticamente diferentes obtidos entre os grupos 1 e 2 (sem tratamento e vetores vazios). Aqui o gráfico mostra um efeito inibidor notável de CA-rb de lentivirus no desenvolvimento da opacificação da cápsula posterior. Pelo dia 28, os animais de controlo tinham um valor médio de opacificação de 4,4 enquanto os animais tratados com CA-rb de lentivirus tinham um valor médio de opacificação de 2,1. 12 A Figura 14 mostra um mapa de um gene de fusão de endostatina-18/angiostatina emitido pelo vetor de lentivirus. A Figura 15 mostra um mapa para o vetor de lentivirus pHR-CMV-Endo/Ang-ires-eGFP transportando um gene da fusão endostatina/angiostatina . A Figura 16 mostra um mapa para o vetor de lentivirus pHR-CMV-BIK-ires-eGFP transportando um gene BIK. A Figura 17 mostra um mapa para o vetor de lentivirus pHR-CMV-Endo/Kringle-ires-eGFP transportando um gene da fusão endostatina/kringle. A Figura 18 mostra um mapa para o vetor de lentivirus pHR-CMV-KDR-ires-eGFP transportando um gene KDR. A Figura 19 mostra um mapa para um vetor de lentivirus pHR-CMV-P16-ires-eGFP transportando o gene pl6. A Figura 20 mostra um mapa para o vetor de lentivirus pHR-CMV-P21-ires-eGFP transportando um gene p21. A Figura 21 mostra um mapa para o vetor de lentivirus pHR-CMV-Timpl-ires-eGFP transportando um gene Timpl. A Figura 22 mostra um mapa para o vetor de lentivirus pHR-BFl/HTLV-Ang-ires-eGFP transportando um gene angiostatina. A Figura 23 mostra um mapa para o vetor de lentivirus pHR-EF1/HTLV-Endo XV-ires-eGFP transportando um gene endostatina XV. 13 A Figura 24 mostra um mapa para o vetor de lentivírus pHR-EFl/HTLV-EndoAng-ires-eGFP transportando um gene da fusão endostatina/angiostatina. A Figura 25 mostra um mapa para o vetor de lentivírus pHR-EFl/HTLV-EndoKringle-ires-eGFP transportando um gene da fusão endostatina/kringle. A Figura 26 mostra um mapa para o vetor de lentivírus pHR-EFl/HTLV-Kringle 1-5-ires-eGFP transportando um gene Kringle. A Figura 27 mostra um mapa para o vetor de lentivírus pHR-EFl/HTLV-MigIP10-ires-eGFP-transportando o gene da fusão Mig/lPlO. A Figura 28 mostra um mapa para o vetor de lentivírus pHR-EFl/HTLV-Timpl-ires-eGFP transportando o gene Timpl. A Figura 29 mostra um mapa para o vetor de lentivírus pHR-EFl/HTLV-Timp4-ires-eGFP transportando o gene Timp4. A Figura 30 mostra um mapa para o vetor de lentivírus pHR-EFl/HTLV-P21-ires-eGFP transportando um gene p21. A Figura 31 mostra um mapa para o vetor de lentivírus pHR-EFl/HTLV-Endo XVIII-ires-eGFP transportando um gene endostatina XVIII. A Figura 32 mostra RT-PCR de mRNA isolado a partir de células transduzidas dérmicas microvasculares endoteliais (hDMVE) humanas com o gene de fusão de 14 endostatina-18/angiostatina. Banda 1: 1000/100 pb escada mix; banda 2-5: RT-PCR a partir de mRNA isolado a partir de hDMVE a transdução celular com 1 μ]0, 5 μΐ^ 10 μΐ, e 20 μΐ, de pHR' -eFla/HTLV-Endo: : Ang-IRES-eGFP virus flutuante desde um sadio de 12 lâminas sadias; banda 6: RT-PCR a partir de mRNA isolado a partir de hDMVE a incubação celular de 2 0 pL de PBS; banda 7: controlo negativo (H20 como modelo para RT-PCR); banda 8: escada 100 pb. A Figura 33 mostra a presença da eGFP na microbolsa da córnea em animais tratados. A Figura 33A mostra a fotomicrografia fluorescente demonstrando a presença da expressão da eGFP na microbolsa. A Figura 33B mostra a fotomicrografia não-fluorescente dos mesmos tecidos mostrados na Figura 33A. A Figura 33C mostra a fotomicrografia fluorescente de um tecido com um tratamento similar de um animal não tratado. A Figura 34 mostra o efeito inibidor da neovascularização em animais tratados com um vetor de lentivirus Mig/IPlO. A Figura 34A mostra uma fotografia de córnea normal (sem tratamento, sem estimulação). A Figura 34B mostra uma fotografia de uma córnea testada alcalinamente de um animal tratado com um vetor de lentivirus Mig/IPlO. É notória a falta de vasos sanguíneos na córnea. A Figura 34C mostra uma fotografia da córnea testada alcalinamente de um animal tratado com um vetor de lentivirus de controlo sem um gene terapêutico anti-angiogénico. É notória a invasão de vasos sanguíneos na córnea. A Figura 34D mostra uma fotografia da córnea testada alcalinamente de um animal não tratado. É notória a invasão de vasos sanguíneos na córnea. 15

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os lentivírus são vírus lentos cuja patogenicidade natural ocorre ao longo de um período de meses até anos. Este género virai inclui retrovírus tais como HIV. Estes vírus são conhecidos por infetarem e transduzirem uma grande variedade de terminais diferenciados, mitoticamente ativos ou tipos de células humanas inativas. A sua eficiência de transdução é muito alta, mesmo as linhas celulares tradicionalmente muito refratárias à transferência de genes tais como células endoteliais vasculares e vitreoretinopáticas proliferativas humanas, da retina, da córnea, trabeculares, lenticulares, do pigmento epitelial da retina, podem ser transduzidas usando este vetor.

Após a infeção com o lentivírus, o material genético virai integra-se ele próprio no genoma do hospedeiro. Assim, os genes virais tornam-se uma parte permanente do material genético das células hospedeiras e a expressão do gene é constante para a vida das células. Cada célula transduzida por um lentivírus transmitirá a informação genética à sua descendência. A utilização de lentivírus como vetores na terapia do gene para as doenças intraoculares é possível desde que nas condições naturais da infeção com o vírus parental, o vírus seja um patogénio intraocular que não esteja associado a uma resposta inflamatória. Trabalhos anteriores utilizando este vírus demonstraram o seu uso com sucesso na transdução de células neuronais e da retina (Naldini et al., 1996; Miyoshi et al., 1997). A presente invenção fornece um novo vetor de lentivírus que incorpora um IRES (local de entrada do ribossoma interno) elemento entre dois locais de clonagem. 0 elemento IRES permite a ligação mRNA-ribossoma e a síntese proteica. Esta estrutura pode acomodar dois genes de expressão diferentes. 16 É produzida uma única mensagem nas células transduzidas; contudo, devido ao elemento IRES, esta mensagem é funcionalmente bi-cistrónica e pode conduzir à síntese a duas proteínas diferentes. Estes dois genes são colocados sob o controlo de promotores fortes como o CMV ou HTLV. Em alternativa, um especialista na técnica poderia facilmente empregar outros promotores conhecidos como sendo ativos na retina, na córnea ou nas células epiteliais do pigmento da retina, em humanos. Desta maneira, cada um dos genes potencialmente terapêuticos discutidos a seguir pode ser ligado a um gene marcador (por exemplo gene verde fluorescente melhorado - gene eGFP) e assim as células transduzidas serão simultaneamente marcadoras e capazes de expressar o gene terapêutico de interesse. Células marcadoras podem facilmente ser isoladas in vitro e observadas in vivo. Deve ser evidente para um comum especialista na técnica que outros genes marcadores, para além do gene melhorado verde fluorescente proteico, poderiam ser incorporados no vetor de lentivírus. Desde que o nível de competência técnica comum de um cientista médio nas áreas de engenharia genética e clonagem aumentou substancialmente nos últimos anos, uma pessoa que possua competência comum nesta técnica poderia rapidamente ser capaz de construir vetores de lentivírus contendo outros genes terapêuticos de interesse para além dos que são aqui divulgados. Além disso, o sistema vetor de lentivírus aqui divulgado pode transferir genes conhecidos como sendo deficientes em pacientes humanos com a doença ocular hereditária ou outras doenças. A transferência destes genes para células oculares humanas ou outros tecidos através deste sistema forma a base de terapias uteis para pacientes com várias doenças. 0 conhecimento básico aqui pormenorizado demonstra que os vetores de lentivírus podem transferir uma variedade de genes para modificar a proliferação intraocular anormal e, 17 assim, diminuir a incidência da doença neovascular, descolamento da retina ou opacificação capsular posterior pós extração da catarata. Alguns genes terapêuticos podem ser úteis em situações clinicas para inibição in vivo da divisão celular intraocular. Estes genes incluem uma variedade de modeladores identificados recentemente para o processo de crescimento de novos vasos sanguíneos (angiogénese) ou apoptose. Acredita-se que o controlo genético da expressão destes modeladores via transferência do gene mediada por lentivírus seria útil no tratamento das doenças neovasculares intraoculares tais como a degeneração da mácula relacionada com a idade (AMD), retinopatia da prematuridade (ROP) e a retinopatia diabética proliferativa (PDR).

Os vetores de lentivírus aqui divulgados podem ser imediatamente aplicados em situações clínicas.

As células endoteliais vasculares desempenham um papel fundamental e central tanto na vasculogénese como na angiogénese. Estas células respondem mitogenicamente (tornam-se ativas no que diz respeito à divisão celular ou migração) a uma variedade de citocinas proteicas. Por exemplo, o fator de crescimento da endotelial vascular (VEGF), a angiogenina, a angiopoictina-1 (Angl) e a angiotropina são citocinas que estimulam a divisão celular endotelial, migração ou adesão célula a célula, e portanto favorece o processo da angiogénese. A endostatina, recetores VEGF solúveis (isco) (sflt), e trombospondina são citocinas proteicas endógenas que aparecem como inibidoras da angiogénese. A presente invenção demonstra que muitas destas proteínas inibidoras emitidas pelos vetores de lentivírus são úteis no tratamento da neovascularização intraocular. Exemplos de genes que podem ser incorporados 18 em vetores de lentivírus da presente invenção incluem, mas não estão limitados aos seguintes genes:

INIBIDORES DE TECIDO DE METALOPROTEINASES

Os inibidores de tecido de metaloproteinases (TIMPs) representam a família das proteínas ubíquas que são inibidoras naturais da matriz das metaloproteinases (MMPs). As metaloproteinases de matriz são um grupo de endopeptidases ligadas a zinco envolvidas numa matriz de tecidos interligados remodelando e degradando a matriz extracelular (ECM), um passo essencial no alastramento do tumor, angiogénese, e metástase. As MMPs têm cada uma tem diferentes especificidades de substrato dentro da ECM e são importantes na sua degradação. Na análise das MMPs na patologia mamária humana mostrou que várias MMPs estão envolvidos na degradação da ECM: a colagenase (MMP1) degrada colagénio intersticial fibrilar; a gelatinase (MMP2) degrada principalmente colagénio do tipo IV; e estromelisina (MMP3) tem uma gama mais vasta de ação (Bramhall et al., 1996, 1997). Existem quatro membros na família de TIMP. TIMP-1 e TIMP-2 são capazes de inibir o crescimento tumoral, alastramento, e metástase que estavam relacionadas com as atividades inibidoras da MMP. Mais ainda, tanto o TIMP-1 como o TIMP-2 estão envolvidos com a inibição do angiogénese. Ao contrário de outros membros da família do TIMP, só se encontra o TIMP-3 na ECM e pode funcionar como um marcador para diferenciação terminal. Por último, pensa-se que o TIMP-4 funciona numa maneira especifica para tecido na hemostasia da matriz extracelular (Gomez et al., 1997). 19 ΤΙΜΡ-1 Ο inibidor de tecido da metaloproteinase-1 (TIMP-1) é uma proteína 23kD que também é conhecida como o inibidor 1 da metaloproteinase, inibidor da colagenase de fibroblasto, inibidor da colagenase e actividade potenciadora de eritróide (EPA). 0 gene que codifica TIMP-1 foi descrita por Docherty et al. (1985). TIMP-1 complexa com metaloproteinases (tal como colagenases) causando uma inativação irreversível. Os efeitos do TIMP-1 foram investigados em modelos de ratos transgénicos: um que sobre expressou o TIMP-1 no fígado, e outro que expressou o antigénio 40/T do Vírus de Símios (TAg) de oncogénese virai conduzindo ao desenvolvimento hereditário de carcinomas hepatocelulares. Em duplas experiências transgénicas (as linhas do TIMP-1 foram cruzadas com a linha transgénica TAg), foi referida a sobreexpressão de TIMP-1 hepático para bloquear o desenvolvimento dos carcinomas hepatocelulares induzidos por TAg através da inibição do crescimento e a angiogénese (Martin et al., 1996). TIMP-2 0 tecido inibidor da metaloproteinase-2 (TIMP-2) é a proteína 24kD que também é conhecida como o inibidor 2 da metaloproteinase. 0 gene que codifica TIMP-2 foi descrito por Stetler-Stevenson et al. (1990). A metaloproteinase (MMP2) que desempenha um papel crítico na invasão do tumor é complexada e inibida pelo TIMP-2. Assim, o TIMP-2 pode ser útil para inibir metástases cancerígenas (Musso et al., 1997). Quando as células do melanoma B16F10 de murino (uma linha celular altamente agressiva e metastática) foram transfetadas com o plasmídeo que codifica o TIMP-2 humano e injetadas subcutaneamente em ratos, a sobre expressão do 20 TIMP-2 limitou ο crescimento e a neoangiogénese do tumor in vivo (Valente et al., 1998). TIMP-3 O tecido inibidor da metaloproteinase-3 (TIMP-3) é também conhecido como inibidor 3 da metaloproteinase. Quando o carcinoma da mama e o melanoma maligno das linhas celulares foram transfetados com os plasmídeos TIMP-3 e injetados subcutaneamente em ratos sem pelo, foi observada a supressão do crescimento do tumor (Anand-Apte et al., 1996). Contudo, a sobre expressão da TIMP-3 não teve efeito no crescimento das linhas celulares dos dois tumores in vitro. Assim, foi sugerido que se libertasse TIMP-3 para a ECM adjacente através das células tumorais que inibiram o crescimento tumoral suprimindo a libertação dos fatores de crescimento sequestrados na ECM, ou inibindo a angiogénese (Anand-Apte et al., 1996) . TIMP-4 O tecido inibidor da metaloproteinase-4 (TIMP-4) também conhecido como o inibidor 4 da metaloproteinase. O gene TIMP-4 e a localização do tecido foram descritos por Greene et al. (1996) . Estudos bioquímicos mostraram que o TIMP-4 se liga com a gelatinase humana A idêntica à do TIMP-2 (Bigg et al., 1997) . O efeito da modelação do TIMP-4 no crescimento do cancro da mama humano in vivo foi investigado por Wang et al. (1997) . A sobre expressão de TIMP-4 foi verificado inibir capacidade de invasão de células in vitro, e o crescimento tumoral foi significativamente reduzido a seguir à injeção em ratos sem pêlo de células tumorais transfectantes TIMP-4 in vivo (Wang et al., 1997). 21

ENDOSTATINA, ANGIOSTATINA PEX, KRINGLE—5 E GENES DE FUSÃO J. Folkman e os seus colegas (Boehm et al., 1997) mostraram que o tratamento de ratos com carcinomas do pulmão de Lewis com a combinação das proteínas endostatina + angiostatina induziram a regressão completa dos tumores, e esses ratos permaneceram saudáveis para o resto das suas vidas. Este efeito foi conseguido apenas com um ciclo (25 dias) de tratamento com endostatina + angiostatina, enquanto que com a endostatina sozinha são necessários 6 ciclos para induzir a dormência do tumor. D. Hanahan e os seu colegas (Bergers et al., 1999) demonstraram um efeito antitumoral superior com a combinação de proteínas endostatina + angiostatina em modelos de rato com carcinoma dos ilhéus do pâncreas. A combinação de endostatina + angiostatina resulta numa significativa regressão dos tumores, enquanto que a endostatina ou a angiostatina sozinhas não produzem qualquer efeito.

ENDOSTATINA XVIII

Endostatina, o inibidor angiogénese produzido pela hemangioendotelioma, foi pela primeira vez identificada por 0'Reilly et al. (1997). Endostatina é um fragmento exterminai 20kD de um colagénio XVIII que inibe a proliferação endotelial especificamente, e potência a inibição da angiogénese e o crescimento do tumor. De fato, foi demonstrado que os tumores primários regridem para lesões microscópicas inativas a seguir à administração de endostatina recombinante (0'Reilly et al., 1997). E referido que a endostatina inibe a angiogénese através da 22 ligação às proteoglicanas de sulfato de heparina envolvidas na sinalização do fator de crescimento (Zetter, 1998).

ENDOSTATIN XV

Recentemente, foi demonstrado que o fragmento C-terminal do colagénio XV (Endostatina XV) inibe a angiogénese tal como a Endostatina XVIII, mas com várias diferenças funcionais (Sasaki et al., 2000).

ANGIOSTATINA A angiostatina, um fragmento interno do plasminogénio compreendendo as primeiras quatro estruturas kringles, é um dos mais potentes inibidores da angiogénese endógena descrito até à data. Foi demonstrado que a administração sistémica de angiostatina suprime eficientemente o crescimento do glioma maligno in vivo (Kirsch et al., 1998). A angiostatina também foi combinada com a radioterapia convencional resultando numa erradicação aumentada do tumor sem aumentarem os efeitos tóxicos in vivo (Mauceri et al., 1998). Outros estudos demonstraram que a transferência de genes mediada por retrovírus e adenovírus de cDNA da angiostatina resultou na inibição do crescimento de células endoteliais in vitro e da angiogénese in vivo. A inibição pela angiogénese induzida por tumor produziu um aumento da morte das células tumorais (Tanaka et al., 1998). A transferência genética de um cDNA que codifica a angiostatina do rato em células de fibrossacorma T241 de murino mostraram suprimir o crescimento do tumor primário e metastático in vivo (Cao et al., 1998) . 23 ΡΕΧ ΡΕΧ é um domínio hemopexina C-terminal da MMP-2 que inibe a ligação da MMP-2 com a integrina alfavbeta3 bloqueando a atividade colagenolítica na superfície da célula exigida para angiogénese e crescimento do tumor que foi clonado e descrito por Brooks et al. (1998). KRINGLE—5 0 domínio do kringle-5 no plasminogénio humano, que partilha uma alta homologia de sequência com os quatro kringles da angiostatina, foi demostrado ser um inibidor específico da proliferação das células endoteliais. 0 Kringle 5 parece ser mais potente que a angiostatina na inibição da proliferação da célula endotelial capilar estimulada pelo fator de crescimento do fibroblasto básico (Cao et al., 1997) . Para além das suas propriedades antiproliferativas, o kringle 5 também apresenta uma atividade antimigratória similar à da angiostatina, a qual de uma forma seletiva afeta as células endoteliais (Ji et al., 1998).

GENES DE FUSÃO ANGIOSTÁTICA

Os novos genes de fusão angioestática podem ser clonados utilizando como motivo o péptido elastina (Val-Pro-Gly-Val-Gly) como ligante. Esta fusão combina dois potentes genes angiostáticos que aumentam a supressão da angiogénese do tumor. Como estas moléculas atuam através de diferentes mecanismos, a sua combinação pode resultar em efeitos sinergéticos. Exemplos de fusões angiostáticas incluindo as proteínas de fusão incluem, mas não estão limitados a, fusão da endostatina 18 com a angiostatina (endo/ang), endostatina 18 e motivo kringle 5 do plasminogénio (endo/k5) assim como as monocinas induzidas por interferão gama e a proteína 10 indutível por interferão alfa (MIG/IP10) .

QUIMIOCINAS

As quimiocinas são citocinas pró-inflamatórias com baixo peso molecular capazes de eliciar a quimiotaxia dos leucócitos. Dependendo da quimiocina considerada, a quimioatração é específica para certos tipos de células de leucócitos. A expressão dos genes de quimiocinas nos tumores pode conduzir a um mais eficiente recrutamento de leucócitos capazes da atividade antitumoral. Mais ainda, para além da sua atividade quimiostática, algumas quimiocinas possuem uma atividade anti-angiogénica: inibem a formação de vasos sanguíneos que alimentam o tumor. Por esta razão, estas quimiocinas são úteis no tratamento do cancro.

MIG

Mig, a monocina induzida por interferão gama, é uma quimiocina CXC relacionada com o IP-10 e produzida por monócitos. Mig é um quimioatrativo para células T ativadas, e também possui fortes propriedades angiostáticas. Injeções intratumoral de Mig induz a necrose do tumor (Sgadari et al., 1997). IP-10 A IP-10, a proteína 10 indutível por interferão alfa, é um membro da família da quimiocina CXC. A IP-10 é produzida principalmente por monócitos, mas também por células T, 25 fibroblastos e células endoteliais. A IP-10 liberta uma atividade quimiostática nas células linfóides tais como as células T, os monócitos e as células NK. A IP-10 é também um potente inibidor da angiogénese: inibe a neovascularização através da supressão da diferenciação das células endoteliais. Devido á sua atividade quimiostática em relação às células imunes, a IP-10 foi considerada como uma boa candidata para aumentar as respostas imunes anti-tumorais. A transferência por gene da IP-10 para dentro das células do tumor reduziu a sua tumorigenicidade e eliciou uma resposta de imunidade protetora de longo prazo (Luster e Leder, 1993). A atividade angioestática da IP-10 foi também verificado mediar a regressão do tumor: células tumorais expressando IP-10 tornam-se necróticas in vivo (Sgadari et al., 1996) . A IP-10 também mostrou que medeia os efeitos angioestáticos de IL-12 que conduz à regressão tumoral (Tannenbaum et al., 1998).

RECETORES SOLÚVEIS VEGF FLT-1 (recetor tipo fms da tirosina quinase 1) é um recetor ligado a membrana de VEGF (VEGF Recetor 1). Foi demonstrado que um fragmento solúvel do FLT-1 (sFLT-1) tem propriedades angiostáticas pela via da sua atividade antagonista contra VEGF. 0 FLT-1 solúvel atua através da ligação a VEGF mas também porque se liga e bloqueia o domínio externo de FLT-1 ligado a membrana (Kendall & Thomas 1993, Goldman et al., 1998). Um exemplo de sFLT-1 é o sFLT-1 humano abrangendo os domínios tipo imunoglobina 7 da parte externa do FLT-1.

SFLK-1 / KDR FLK-1 ou KDR (recetor domínio inserção de quinase) é um recetor ligado a membrana do VEGF (Recetor 2 VEGF). Foi 26 demonstrado que o fragmento solúvel do KDR (sKDR) tem propriedades angiostáticas através das sua atividade antagonista contra VEGF, talvez porque se liga a VEGF mas também porque se liga e bloqueia o domínio externo de KDR ligado a membrana (Kendall & Thomas. 1996, Millauer et al. 1994) . Um exemplo de sKDR é um sKDR humano abrangendo os domínios tipo imunoglobina 7 da parte externa do KDR.

APOPTOSE A apoptose é um termo usado para descrever o processo da morte celular programada ou do suicídio celular programado. Este processo é um componente normal do desenvolvimento e da saúde dos organismos multicelulares. A regulação anormal da apoptose tem estado implicada numa variedade de perturbações patológicas desde cancro até doenças auto-imunes .

BIK A Bik é uma potente proteína pró-apoptótica de 18kD (160 aminoácido), também conhecida como assassina interativa Bcl-2, os indutores da apoptose NBK, BP4, e BIP1. A Bik é codificada pelo gene bik (ou nbk) . A função da Bik é acelerar a morte celular programada através de um complexo com vários repressores da apoptose tais como Bcl-XL, BHRF1, Bcl-2, ou a sua proteína E1B homóloga de adenovírus. Nos estudos da transfeção transiente, a Bik promoveu a morte celular de uma forma idêntica aos membros pró-apoptóticos da família de Bcl-2, Bax e Bak (Boyd et al., 1995) .

BAK A Bak, uma homóloga Bcl-2, é uma proteína pró-apoptótica que promove a apoptoses através da ligação aos membros da 27 família dos anti-apoptóticos incluindo Bcl-2 e Bcl-XL e inibe a sua atividade como descrito anteriormente para a Bik (Chittenden et al., 1995).

BAX A Bax é uma proteína de 21kD que funciona como um regulador da apoptose. A Bax acelera a morte celular programada através da dimerização com e antagonizando o repressor da apoptóse Bcl-2. A razão destes dímeros da proteína é pensada para se relacionar com o início da apoptóse. 0 efeito da expressão recombinante da Bax em células eritroleucémicas K562 foi investigado por Kobayashi et al. (1998) . A transfeção com o vetor Bax para as células K562 resultou na indução da apoptóse. Além disso, a estabilidade das células transfetadas com Bax verificou-se que são mais sensíveis aos agentes quimioterapêuticos ara-X, doxorubicina, e SN-38 (Kobayashi et al., 1998).

BAD A proteína Bad (Bcl-2 com ligação ao componente 6, gene mau ou bbc6 ou bcl218) é uma proteína pequena (168 aminoácidos, 18kDa) que promove a morte celular. Ela compete com sucesso pela ligação a Bcl-XL e Bcl-2, afectando deste modo os níveis de heterodimerização de ambas as proteínas com Bax. Ela pode reverter a atividade repressora da morte da Bcl-XL, mas não a da Bcl-2. BCL-2 A célula B leucemia/linfoma-2 (Bcl-2) é o membro protótipo de uma família de proteínas reguladoras da morte celular. Bcl-2 é principalmente encontrada na mitocôndria e bloqueia 28 a apoptose interferindo na ativação das caspases. A transferência do gene Bcl-2 para as células do tumor mostrou aumentar o seu potencial metastático (Miyake et al., 1999). A transferência do gene Bcl-2 pode ser aplicada em transplantes da medula óssea desde que a Bcl-2 aumente a sobrevivência das células estaminais hematopoiéticas após a reconstituição do recetor irradiado (Innes et al., 1999).

Também, a transferência do gene Bcl-2 pode ser útil contra a doenças neurodegenerativas desde que a expressão de Bcl-2 nos neurónios os proteja da apoptóse (Saille et al., 1999).

BCL-XS

Bcl-XS (pequena isoforma) é um repressor negativo dominante da Bcl-2 e Bcl-XL. Foi utilizada em experiências de terapia genética para iniciar a apoptóse em tumores que expressem Bcl-2 e Bcl-XL. A expressão do Bcl-XS reduz o tamanho do tumor (Ealovega et al., 1996) e sensibiliza as células tumorais para os agentes quimioterapêuticos (Sumatran et al., 1995), sugerindo um papel para a Bcl-XS na iniciação da morte celular em tumores que expressem Bcl-2 ou Bcl-XL (Dole et al., 1996) .

GAX

Gax é um gene homeobox codificando para um fator de transcrição que inibe a proliferação celular de um modo dependente de p21. Gax é regulada para baixo quando as células são estimuladas a proliferar. A sobre expressão da Gax conduz à regulação para baixo da Bcl-2 e à regulação para cima da Bax em células activadas por mitogénio (Perlman et al., 1998). Assim, a Gax pode ser útil para inibir o crescimento de certas células tumorais. Mais ainda, a sobre expressão da Gax em células vasculares do 29 músculo liso inibe a sua proliferação (Perlman et al., 1999). Por isso, a transferência do gene Gax poderia limitar a estenose vascular que se segue às lesões vasculares.

GENES SUPRESSORES DO TUMOR Várias mutações dos genes supressores do tumor têm sido associadas a diferentes tipos de cancro. Nestes casos, a terapia do gene somático com versões tipo selvagem do gene supressor do tumor tem sido contemplada como abordagens terapêuticas anticancerigenas. As pl6, p21, p27 e p53 inibem o ciclo celular atuando nas quinases dependentes de ciclina. P16 P16, uma proteína de 15kD (148 aminoácidos) , também é conhecida como CDK4I, P16-INK4, P16-INK4A, ou múltiplo supressor 1 do tumor (MTS1) . P16 é codificado pelo gene cdkn2a ou cdkn2. A P16 forma um heterodímero com a quinase 4 e 6 dependente de ciclina, prevenindo assim as suas interações com a ciclina D tanto in vitro como in vivo.

Portanto, a P16 atua como um regulador negativo na

proliferação das células normais. As mutações da P16 (cdkn2) estão envolvidas na formação do tumor numa vasta gama de tecidos. A cdkn2a é homozigoticamente apagada, mutada, ou de outra maneira inativada numa larga proporção em que as linhas de células e alguns tumores primários incluindo melanomas e tumores do trato biliar, pâncreas e estômago (Biden et al., 1997; Castellano et al., 1997). A perda de expressão do gene pl6lKN4a é comummente observada em tumores mesotelioma e outras linhas celulares. Foi demonstrado que a transdução do pl6!NK4A com uma expressão 30 de adenovírus nas células de mesotelioma resulta numa diminuição do crescimento celular, e na morte das células transduzidas (Frizelle et al., 1998). Além disso, a transferência de gene mediada por adenovírus com pl6 tipo selvagem para três linhas celulares do glioma humano (U251 MG, U-87 MG e D54 MG) que não expressavam um gene endógeno pl6/CDKN2 resultou no impedimento do crescimento celular nas fases GO e G1 (Fueyo et al., 1996). Mais, a transferência do gene mediada por adenovírus da pl6-INK4A tipo selvagem para as linhas de células de cancro do pulmão que não expressam a proliferação do tumor inibida por pl6-INK4A tanto in vitro como in vivo (Jin et al., 1995) . Assim, a restauração da proteína P16 tipo selvagem em células tumorais poderia ter utilidade terapêutica no cancro. P21 A p21 é uma proteína com 18kD (164 aminoácidos) também conhecida como inibidor da quinase 1 dependente de ciclina (CDKNl), a diferenciação do melanoma associada à proteína 6 (MDA-6), e a proteína 1 interativa CDK. A p21 é codificada pelo gene CDKNl (Harper et al., 1993), também conhecido como CIP1 e WAF1. A p21 pode ser um importante intermediário através do qual a p53 medeia o seu papel como um inibidor da proliferação celular em resposta ao dano do DNA. A p21 pode ligar-se e inibir a atividade da quinase dependente de ciclina, prevenindo a fosforilação do substrato da quinase dependente de ciclina e bloqueando a progressão e proliferação do ciclo celular. A p21 é expressa em todos os tecidos do homem adulto. A transferência do gene p21 para as células do tumor pode ser útil na inibição do crescimento do tumor. A transferência do gene p21 mediada por adenovírus recombinante em duas 31 linhas de células humanas de células não-pequenas do cancro do pulmão (NSCLC) resultou numa indução de p21 dependente de dose e concomitante na inibição do crescimento celular devida a captura do ciclo celular G0/G1. Além disso, a injeção de um adenovirus que transporta p21 para tumores NSCLC pré-estabelecidos em ratos reduziu o crescimento do tumor e aumentou a sobrevivência dos animais (Joshi et al., 1998). Estes resultados suportam a utilização de p21 na terapia do gene cancerígeno.

De acordo com a presente invenção, podem ser empregues a biologia molecular, a microbiologia, e as técnicas de DNA recombinante convencionais dentro da especialização da técnica. Tal técnica está totalmente explicada na literatura. Ver, por exemplo, Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); "DNA Cloning: A Practical Approach," Volumes I e II (D.N. Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)); "Transcription and Translation" (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984)); "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)); "Immobilized Cells And Enzymes" (IRL Press, (1986)); B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).

Um "vetor" é um replicão, tal como plasmídeo, fago ou cosmídio, ao qual outro segmento de DNA pode ser anexado, de modo a produzir a replicação do segmento anexado.

Uma "sequência promotora" é uma região reguladora do DNA capaz de ligar RNA polimerase numa célula e iniciando a transcrição de uma sequência de codificação a jusante (direção 3'). Para fins de definição da presente invenção, a sequência promotora está ligada na sua extremidade 3' através do sítio de iniciação da transcrição e estende-se 32 para montante (direção 5') para incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição a níveis detetáveis acima da base. Dentro da sequência promotora será encontrado o local da iniciação da transcrição (convenientemente definida por mapeamento com nuclease Sl), tal como o domínio da ligação da proteína (sequências consensuais) responsável pela ligação da RNA polimerase. Promotores eucarióticos poderão muitas vezes, mas não sempre, conter caixas "TATA" e caixas "CAT". Vários promotores podem ser usados para guiar os vetores.

Uma célula é "transduzida" por DNA exógeno ou heterólogo, quando esse DNA foi introduzido dentro da célula, geralmente por um vetor virai. 0 DNA transduzido pode (como no caso dos vetores de lentivírus) ou não ser integrado (covalentemente ligado) no genoma da célula. Em procariontes, leveduras, e células de mamíferos por exemplo, o DNA pode ser mantido num elemento episomal, tal como um plasmídeo. Em relação às células eucarióticas, uma célula transformada estavelmente é uma na qual o DNA transformado fica integrado num cromossoma de modo a ser herdado pelas células filhas através da replicação do cromossoma. Esta estabilidade é demonstrada pela capacidade da célula eucariótica estabelecer linhas celulares ou clones compostos por uma população de células filhas que contêm o DNA transformado. Um "clone" é uma população de células derivada de uma única célula ou de um comum antecessor por mitose. Uma "linha celular" é um clone de uma célula original que é capaz de estabilizar o crescimento in vitro durante muitas gerações.

Um "gene terapêutico" refere-se a um gene que confere um fenótipo desejado. Por exemplo, o gene da retinoblastoma constitutivamente ativo (CA-rb) é usado para prevenir a 33 proliferação intraocular ou um déficit genético é restaurado através da transferência do gene da periferina.

Como aqui foi usado, o termo "gene marcador" refere-se a uma sequência codificante anexada ao promotor heterólogo ou elementos potenciadores e cujo produto é fácil e quantificavelmente ensaiado quando a construção é introduzida nos tecidos ou células. Marcadores comummente empregues de incluem elementos radioativos, enzimas, proteínas (tal como a proteína fluorescente verde melhorada) ou químicos cuja fluorescência quando exposta à luz ultravioleta, e outros. A presente invenção é direcionada para uma nova forma de tratar doenças de cegueira hereditário ou proliferativas através de meios de transferência de gene de lentivírus. Assim, a presente invenção inclui um vetor de lentivírus, que carrega uma sequência de DNA que codifica um gene útil no tratamento dessa doença. Exemplos deste incluem, mas não estão limitados ao gene da periferina, uma forma constitutivamente ativa do gene rb e vários genes terapêuticos discutidos acima. A presente invenção é desenhada com um método de inibição da proliferação celular intraocular num indivíduo com uma doença ocular, compreendendo o passo de administrar ao referido indivíduo uma dose farmacologicamente eficaz de um vetor de lentivírus compreendendo um gene terapêutico que inibe a proliferação celular ocular. Exemplos representativos de doenças oculares, que podem ser tratadas usando este método da presente invenção, incluem a degeneração macular relacionada com a idade, retinopatia proliferativa diabética, retinopatia da prematuridade, glaucoma, e vitreoretinopatia proliferativa. 0 gene terapêutico pode ser uma forma constitutivamente ativa do 34 gene retinoblastoma, um gene pl6 ou um gene p21. Preferencialmente, o vetor de lentivírus é administrado numa dosagem, que vai desde 106 até 109 unidades de transdução no espaço capsular, vítreo ou sub-retiniano. A presente invenção é também desenhada com um método de inibição da neovascularização intraocular num indivíduo com uma doença ocular, compreendendo o passo de administrar ao referido indivíduo uma dose farmacologicamente eficaz de um vetor de lentivírus compreendendo um gene terapêutico, que inibe a neovascularização intraocular. Exemplos representativos de doenças oculares, que podem ser tratadas usando o método da presente invenção, que incluem a degeneração macular relacionada com a idade, retinopatia proliferativa diabética, retinopatia da prematuridade, glaucoma, e vitreoretinopatia proliferativa. 0 gene terapêutico pode ser um gene, que regula a angiogénese ou a apoptoses. Em geral, genes que regulam a angiogénese, incluem genes que codificam o tecido inibidor da metaloproteinase (TIMP)-l, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4, endostatina, angiostatina, endostatina XVIII, endostatina XV, o domínio da hemopexina do C-terminal, da matriz da metaloproteinase-2, o domínio kringle 5 do plasminogénio humano, a fusão proteica da endostatina com a angioestatina, uma fusão proteica da endostatina com o domínio kringle 5, do plasminogénio humano, a monoquina induzida por interferão-gama (Mig), a proteína 10 indutível por interferão alfa (IP10), uma fusão proteica de Mig e IP10, FLT-1 solúvel (como o recetor da tirosina quinase 1 tipo fms), e recetor do domínio de inserção de quinase (KDR), enquanto que os genes que regulam a apoptoses incluem genes que codificam Bcl-2, Bad, Bak, Bax, Bik, pequena isoforma Bcl-X e Gax. Preferencialmente, o vetor de lentivírus é administrado numa dosagem de desde cerca de 35 106 até 109 unidades de transdução no espaço capsular, vítreo e sub-retiniano.

Os exemplos seguintes são dados com o propósito de ilustrar as várias formas de realização da invenção, e não se pretende que limitem de qualquer forma a presente invenção: EXEMPLO 1 Células e Tecidos

Os explantes primários dos fibroblastos coroidais humanos (HCF), as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e as células epiteliais do pigmento retiniano fetal humano (HRPE) foram estabelecidas e plaqueadas em condições, as quais promoveram ou não a atividade mitótica. As células derivadas do fotorecetor estável (Y-79 e Weri-Rb-1) também foram cultivadas. A retina humana e o RPE, obtidos na altura da enucleação para retinoblastoma foi usado para demonstrar as capacidades dos vetores de lentivírus para transduzirem estas células inativas mitoticamente e induzem a expressão de um transgene da periferina exógeno humano. As córneas humanas obtidas na altura do transplante cirúrgico da córnea, foram usados para demonstrar as capacidades dos vetores de lentivírus, para transduzir estas células mitoticamente inativas, com o gene marcador, do gene melhorado da proteína verde fluorescente. EXEMPLO 2

Vetor de Lentivírus

Foi usado um sistema pseudotipado de vetorização lentiviral baseado em três plasmídeos, com o invólucro do vírus da 36 estomatite vesicular (VSV) que contém o gene da proteína verde fluorescente (GFP) como marcador (Figura 1). Os lentivírus recombinantes foram produzidas, como descrito por Naldini et al. O citomegalovírus (CMV) gene promotor precoce imediato dirige a expressão de eGFP no plasmídeo pHR'-CMV-eGFP. Os stocks de vírus foram gerados como a seguir. As células do rim Humano 293T (5xl06) foram plaqueadas em placas de 10 cm, e foram cotranfetadas no dia seguinte com 10 μg de pCMVAR8.91 (função de empacotamento do plasmídeo), 10 μρ de pHR'-CMV-eGFP (gene marcador do plasmídeo), e 2 μρ de pMD.G (o invólucro contendo plasmídeo VSV-G) através da precipitação de fosfato de cálcio no meio de crescimento D10 (DMEM de glucose alta com 10% de soro fetal de bovino) e antibióticos. Após 12-16 horas a 37°C, o meio foi removido e foi adicionado meio de crescimento D10 fresco. As células foram cultivadas durante mais 10 horas. O meio D10 fresco contendo lOmM de butirato de sódio e 20mM de tampão Hepes foi adicionado às células e as células foram cultivadas por mais 12 horas. Este meio foi substituído por um novo meio D10 contendo 20mM de tampão de Hepes, e após 12 horas, o meio contendo vírus foi recolhido. O meio fresco foi adicionado e o sobrenadante foi recolhido a todas as 24 horas durante os 4 dias seguintes. O sobrenadante virai foi armazenado a -80°C imediatamente após a recolha. O stock virai foi concentrado por ultracentrifugação do sobrenadante (19.000 rpm, rotor Beckman SW28), durante 140 minutos à temperatura ambiente e o precipitado das partículas virais resultante foi ressuspendido em 1-3 mL de solução salina tamponado com fosfato. Os stocks virais medidos foram titulados com 293 células e as amostras remanescentes foram armazenadas a -80°C. 37

Todos os sobrenadantes vetores de lentivírus foram analisados quanto à presença de retrovírus competente na replicação (RCR), pela infeção de células mononucleares do sangue periférico humano estimuladas por fitohemaglutinina, com subsequente análise do meio de cultura para p24 gag por ELISA. Não foi detetado RCR em qualquer dos sobrenadantes virais produzidos. EXEMPLO 3

Transdugão do vetor de lentivírus

Os sobrenadantes contendo 2 x 106 de partículas de lentivírus/mL deficientes em replicação, foram geradas pela transfeção de células 293T, com o vetor lentivírus acima descritos. As células foram cultivadas com partículas virais durante 24 horas e depois recolhidas em meio normal para os quatro dias antes da determinação da expressão de GFP através da seleção das células ativada por fluorescente (Figuras 2-3). A eficiência da transdução foi medida como uma função multiplicidade de infeções com MOIs, variando desde 1 até 1000. Os resultados da transdução in vitro de várias linhas celulares humanas demonstram uma correlação positiva entre a MOI e a eficiência de transdução em que mais células são transduzidas com o aumento do número de partículas lentivirais (Figura 2). A capacidade do vetor de lentivírus transduzir células não em divisão foi examinada. As células epiteliais da pigmentação da retina humana foram transduzidas pelos vetores virais da leucemia lentivírica ou de murino. As células eram mitoticamente inativas (confluentes) ou 38 mitoticamente ativas (crescimento) quando expostas ao vetor. Os resultados mostrados na Figura 4 demonstram a capacidade superior dos vetores de lentivirus sobre outros vetores retrovirais na transdução de células não em divisão. 0 vetor de lentivirus foi, também, altamente eficiente na transdução de células fetais humanas, em comparação com o vetor retroviral não de lentivirus (Figura 6) .

Para determinar a duração da expressão de transgene eGFP, as células transduzidas pelo vetor de lentivirus, foram testadas ao longo de um período superior a 120 dias. Os resultados das análises de Southern Blot em populações de clones de células transduzidas, indica que o vetor do eGFP de lentivirus foi integrado no genoma do hospedeiro (Figura 5B). A expressão do transgene eGFP integrado foi estável ao longo de 120 dias e não confere vantagem seletiva, a favor ou contra, de células transduzidas (Figura 5A). EXEMPLO 4

Transdução Corneana in situ

Os botões corneanos humanos obtidos no momento da cirurgia de transplante da córnea, foram usados para demonstrar a capacidade dos vetores de lentivirus, na transdução destas células inativas mitoticamente com o gene marcador melhorou o gene da proteína verde fluorescente (Figura 7). As células endoteliais anexas à membrana de Descemet foram descoladas do tecido transduzido da córnea, e examinadas pela luz e microscopia de fluorescência. O endotélio da córnea foi positivo para eGFP, indicando que foi atingida eficiência da transferência e expressão do gene (Figura 39 7Β) . A eficiência da transdução in situ e a expressão de eGFP na camada epitelial, foi também observada (Figura 7C).

Em conclusão, estes resultados indicam que um vetor de lentivirus de replicação deficiente é capaz de tranferir eficientemente o transgene para as células endoteliais e epiteliais da córnea humana in situ, e ativar a expressão do transgene a longo prazo. Este vetor pode ser útil no tratamento de perturbações endoteliais ou epiteliais da córnea e pode ser aplicado para modificar a composição genética do tecido da córnea do dador ex vivo, antes do transplante, de modo a modular permanentemente o processo da rejeição do aloenxerto. EXEMPLO 5

Terapia de Supressão do Crescimento para a Doença Ocular Proliferativa 0 gene da periferina humana foi usado como um exemplo de gene terapêutico. A deficiência genética do gene da periferina em humanos é conhecida por resultar numa grande variedade fenotipos incapacitantes. 0 tecido da retina normal humana ou do epitélio do pigmento da retina (RPE) cirurgicamente extraido durante a enucleação para retinoblastoma foi exposto a vetores de lentivirus o qual ou não tinha um gene terapêutico ou continha o gene da periferina humana. Os resultados na Figura 8 demonstram que que o gene da periferina foi transferido eficientemente para o tecido da retina humana pelo vetor de lentivirus. aqur

Como um outro exemplo de transferência do gene terapêutico, foi usada a forma constitutivamente ativa do gene da retinoblastoma (CA-rb). 0 vetor de lentivirus, 40 divulgado, mediado pela eficiente transferência da forma constitutivamente ativa do gene do retinoblastoma (Figura 9). 0 gene CA-rb transferido exibiu efeitos inibidores dependentes da dose na proliferação das células da coroidais e da retina humana (Figura 10) e das células epiteliais das lentes humanas (Figura 11). A forma constitutivamente ativa do gene do retinoblastoma transferido pelo vetor de lentivirus, também inibiu a proliferação celular intraocular in vivo. Dois modelos da doença proliferativa intraocular (vitreoretinopatia proliferativa e opacificação capsular posterior da pós extração de lentes) foram testados in vivo. A vitreoretinopatia proliferativa foi induzida em três grupos de coelhos (Figura 12). Um grupo foi não tratado, um grupo foi tratado com vetores de lentivirus, sem o gene CA-rb e o último grupo foi tratado com a aplicação de CA-rb de lentivirus intravitrealmente. A vitreoretinopatia proliferativa e o descolamento da retina foram notados nos primeiros dois grupos com uma alta frequência (>90%), enquanto que a fração de animais que tiveram descolamento da retina foi significativamente mais baixa no grupo tratado com CA-rb (26%).

Os resultados mostrados na Figura 13 demonstram o efeito inibidor in vivo do CA-rb de lentivirus no processo de opacificação capsular posterior de pós extração de lentes. Três grupos de coelhos foram submetidos a uma facoemulsificação padrão para remover a lente cristalina original. O primeiro grupo (grupo 1) foi subsequentemente não tratado e os outros dois grupos foram ambos tratados com construções de lentivirus vazias (sem gene terapêutico, grupo 2) ou com CA-rb de lentivirus (grupo 3), aplicado no saco capsular da lente intacta aquando do fecho da ferida da catarata. Os animais foram seriadamente examinados 41 quanto à presença da opacificação capsular posterior. A presença da opacificação foi classificada numa escala de 1 a 5, onde 1 representa a não existência de opacificação e 5 representa uma opacificação grave, suficiente para impedir a visualização da retina com um oftalmoscópio binocular indireto. Não houve resultados estatisticamente diferentes, obtidos entre os grupos 1 e 2 (sem tratamento e vetor vazio), enquanto que não foi observado efeito inibidor notável do CA-rb de lentivirus no desenvolvimento da opacificação da cápsula posterior. Ao dia 28, os animais de controlo tinham resultado médio de opacificação de 4,4, enquanto que os animais tratados com CA-rb de lentivirus tiveram um resultado de opacificação médio de 2.1. EXEMPLO 6

Vetor de lentivirus "Gene Dois"

Foi construído um novo vetor de lentivirus, que incorpora um elemento IRES (local de entrada do ribossoma interno), situado entre dois sítios de clonagem. 0 elemento IRES permite a ligação de mRNA-ribossoma e a síntese da proteína. Esta estrutura pode acomodar dois genes expressíveis diferentes. É produzida uma única mensagem nas células transduzidas; contudo, devido ao elemento IRES, esta mensagem é funcionalmente bi-cistrónica e pode guiar a síntese de duas proteínas diferentes. Desta maneira, cada um dos genes terapêuticos potenciais, acima discutidos, podem ser ligados a um gene marcador (por exemplo, o gene fluorescente verde melhorado - gene eGFP), de modo a que as células transduzidas possam simultaneamente ser marcadas e capazes de expressar o gene terapêutico de interesse. As células marcadas podem facilmente ser isoladas in vitro e observadas in vivo. Mapas genéticos para um número de 42 vetores de lentivírus transportando vários genes terapêuticos são mostrados nas Figuras 15-31. Uma vez que o nível de capacidades comuns de um cientista médio nas áreas da engenharia genética e da clonagem aumentou substancialmente nos anos recentes, uma pessoa com capacidades comuns nesta técnica poderia rapidamente ser capaz de construir vetores de lentivírus que contenham outros genes terapêuticos de interesse. EXEMPLO 7

Terapia de Gene Anti-Neovascularização

As células naive (células conhecidas por não expressarem o gene terapêutico) foram expostas aos vetores de lentivírus acima mencionados, durante 24 horas. Dois dias a seguir a esta exposição, o RNA foi isolado destas células e foi testado quanto à expressão de transgene, através da reação em cadeia da polimerase assistida por transcriptase reversa (RT-PCR). A Figura 32 mostra um produto RT-PCR positivo para o gene da fusão de endostatina-18/angiostatina a partir do mRNA isolado das células endoteliais microvasculares dérmicas humanas. A seguir à demonstração da transferência do gene mediado por lentivírus in vitro, como acima mostrado, a capacidade de inibir a neovascularização in vivo foi depois examinada. Foi induzida a neovascularização em tecidos da córnea de coelhos da seguinte maneira:

Criação de uma micro-bolsa Intraestromal da Córnea e a Inserção de Malha de Nylon Impregnada Com Lentivírus 43

Os coelhos foram submetidos a uma anestesia geral com Isoflourano (4 L/Min) e oxigénio (2 L/Min) através de máscara. Uma gota de Proparacaína foi colocada no fórnice, para a anestesia tópica. 0 Isoflourano foi reduzido para 2,5 L/Min. Foi colocada betadine no fórnice durante 30 seg. e lavado com BSS (solução salina equilibrada, Alcon inc) . Um espéculo de pálpebra foi colocado no olho. Um microcerátomo de 2,8 mm foi usado para entrar no estroma da córnea às 12 horas. Esta incisão intraestromal foi desenvolvida numa abertura intraestromal de 5 x 5 mm com forcepes McPherson e um instrumento íris Sweep para limpar de um lado para o outro. A incisão às 12 horas foi aberta em ambos os lados, com tesouras Vannas, de modo a que a abertura fosse de 4,5 mm. Uma malha de hibridização de nylon da Amersham com 4x4 mm (Bioscientista Amersham RPN 2519) impregnada com 10 pL de lentivírus, foi inserida na abertura pré-formada. Uma gota de tobramicina foi colocada na córnea. Foi descontinuado o isoflourano e foi aumentado o oxigénio nasal para 4 L/Min. Desta maneira, os coelhos eram retirados da anestesia geral com sucesso, após 20 minutos, e voltavam para as suas jaulas com as funções vitais normais. Os coelhos receberam a oferta de 0,2cc de buprenex (.3mg/cc) SQ durante dois dias para analgesia. Os coelhos, também receberam uma gota de atropina e uma gota de tobramicina durante dois dias para cicloplegia pós operatória e tratamento com antibiótico. No primeiro dia pós operatório, cada coelho recebeu uma gota de proparacaína topical para anestesia e a malha de nylon foi removida da abertura intraestromal da córnea com fórceps 12. O controlo e o tratamento da dor pós cirurgia, foram monitorizados diariamente durante duas semanas. 44

Neovascularização Induzida por Alcali

Duas semanas depois da cirurgia inicial, as córneas foram expostas a discos de filtros de 6mm Whatman #3 saturados com 20 pL de 1,0M NaOH, durante 1 minuto. Todas as córneas foram copiosamente lavadas com BSS. Os coelhos receberam uma gota de atropina e uma gota de tobramicina durante dois dias para a cicloplegia pós operatória e tratamento com antibiótico. A fotodocumentação digital foi efetuada para registar a resposta neovascular. A resposta neovascular foi medida por exame de lâmpada de fenda anotando as horas e o comprimento dos vasos nos dias 1, 3, 5, 7, e 10 após trauma. A neovascularização foi quantificada calculando a área do crescimento dos vasos como descrito abaixo.

Para uma padronização do método da avaliação da neovascularização da córnea, o seguinte protocolo e fórmula foram divididos para registar e comparar a neovascularização após queimadura alcalina. A fórmula para a área da neovascularização é derivada através do cálculo da área do setor mais largo delimitado pelo raio RT e subtraindo o setor mais pequeno delimitado pelo raio R2. A área do setor mais largo delimitada pelo raio RT, é o número de horas dividido por 12 e multiplicado por πR T2. A 45 área do setor mais pequeno delimitada pelo raio R2, é o número de horas dividido por 12 e multiplicado por 7t(R2)2. A área resultante derivada da subtração dos dois setores seria a área da neovascularização.

Foi realizada uma microscopia confocal para documentar a expressão da proteína fluorescente verde melhorada, o gene marcador incluído na mensagem bicistrónica do lentivírus. A Figura 33 mostra a fotomicrografia demostrando a presença de eGFP dentro da microabertura da córnea em animais tratados com o vetor de lentivírus.

Para demonstrar o efeito inibidor na neovascularização, a neovascularização foi induzida em animais como acima descrito. Após tratamento com o vetor de lentivírus contendo o gene da fusão Mig/IPlO, foi observado um efeito inibidor (Figura 34). Como mostrado na Tabela 1, foi observada uma redução significativa da neovascularização em animais tratados com o gene da fusão Mig/IPlO ou com o gene Kringle 1-5, transferidos por vetores de lentivírus. TABELA 1

Inibição da Neovascularização Após Transferência do gene de

Lentivírus GENE mirb de neovascularização Animais tratados mm2 de neovascularização Animais não tratados gene de Fusão Mig/IPlO 5 7,0 mnb 132,2 mirb Kringle 1-5 0, 9 mmz 17,0 mmz

Foram aqui citadas, as seguintes referências:

Naldini et al., (1996) Science 272: 263-267.

Miyoshi et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 10319-10323. 46

Quaisquer patentes ou publicações mencionadas nesta especificação, são indicativas dos níveis desses especialistas na técnica aos quais a invenção pertence. Mais ainda, estas patentes e publicações são incorporadas aqui como referência na mesma extensão em que cada publicação individual foi especificamente e individualmente indicada para ser incorporada como referência.

Um especialista na técnica compreenderá imediatamente que a presente invenção está bem adaptada para realizar os objetos e obter os fins e vantagens mencionados, tais como os objetivos, fins e vantagens aqui inerentes. Os presente exemplos, juntamente com os métodos, procedimentos, tratamentos, moléculas, e compostos específicos, aqui descritos, são presentemente representativos das formas de realização preferidas.

Lisboa, 22 de Julho de 2013

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Vetor de lentivírus recombinante compreendendo um primeiro gene terapêutico que reduz ou inibe a angiogénese ocular para uso no tratamento da degeneração da mácula relacionada com a idade num indivíduo, em que o referido primeiro gene terapêutico é selecionado a partir do grupo que consiste em endostatina, angiostatina, endostatina XVIII, endoestatina XV, o domínio hemopexina C-terminal da matriz de metaloproteinase-2, o domínio kringle 5 de plasminogénio humano, a monoquina induzida por interferão-gama (Mig), a proteína 10 induzível por interferão alfa (IP10), FLT-1 solúvel (recetor de tirosina quinase 1 tipo fms), e receptor de domínio de inserção da quinase (KDR). Vetor de lentivírus da reivindicação 1, em que o referido primeiro endostatina. gene terapêutico codifica Vetor de lentivírus da reivindicação 1, em que o referido primeiro angiostatina. gene terapêutico codifica

4. Vetor de lentivírus da reivindicação 1, referido primeiro endostatina XVIII. gene terapêutico em que o codifica Vetor de lentivírus da reivindicação 1, em que o gene terapêutico codifica referido primeiro endostatina XV. Vetor de lentivírus da reivindicação 1, em que o referido primeiro gene terapêutico codifica o domínio 6 . 2 da hemopexina C-terminal da matriz da mataloproteinase-2.

7. Vetor de lentivírus da reivindicação 1, em que o referido primeiro gene terapêutico codifica o dominio kringle 5 de plasminogénio humano.

8. Vetor de lentivírus da reivindicação 1, em que o referido primeiro gene terapêutico codifica Mig.

9. Vetor de lentivírus da reivindicação 1, em que o referido primeiro gene terapêutico codifica IP10.

10. Vetor de lentivírus da reivindicação 1, em que o referido primeiro gene terapêutico codifica FLT-1 solúvel.

11. Vetor de lentivírus da reivindicação 1, em que o referido primeiro gene terapêutico codifica KDR.

12. Vetor de lentivírus da reivindicação 1, compreendendo adicionalmente um segundo gene terapêutico que inibe a angiogénese, em que o referido segundo gene terapêutico é selecionado a partir do grupo que consiste em endostatina, angiostatina, endostatina XVIII, endostatina XV, o domímio hemopexina C-terminal da matriz de metaloproteinase-2, o domínio kringle 5 de plasminogénio humano, a monoquina induzida por interferão-gama (Mig), a proteína 10 induzível por interferão alfa (IP10), FLT-1 solúvel (recetor de tirosina quinase 1 tipo fms), e receptor de domínio de inserção da quinase (KDR), e em que o vetor de lentivírus codifica a proteína de fusão que compreende a primeira sequência de aminoácidos codificada pelo 3 primeiro gene terapêutico e uma segunda sequência de aminoácidos codificada pelo segundo gene terapêutico.

13. Vetor de lentivirus da reivindicação 1, compreendendo adicionalmente um segundo gene terapêutico que inibe a angiogénese, em que o referido segundo gene terapêutico é selecionado a partir do grupo que consiste em endostatina, angiostatina, endostatina XVIII, endostatina XV, o domímio hemopexina C-terminal da matriz de metaloproteinase-2, o domínio kringle 5 de plasminogénio humano, a monoquina induzida por interferão-gama (Mig), a proteína 10 induzível por interferão alfa (IP10), FLT-1 solúvel (recetor de tirosina quinase 1 tipo fms), e receptor de domínio de inserção da quinase (KDR), e em que o vetor de lentivirus compreende um elemento IRES (sítio interno de entrada de ribossoma) entre o referido primeiro gene terapêutico e o referido segundo gene terapêutico de modo a que uma primeira sequência de aminoácidos codificada pelo primeiro gene terapêutico e uma segunda sequência de aminoácido codificada pelo segundo gene terapêutico são produzidos a partir de um único transcrito.

14. O vetor de lentivirus da reivindicação 12, compreendendo adicionalmente um ligante entre a primeira sequência de aminoácido e a segunda sequência de aminoácido.

15. Vetor de lentivirus da reivindicação 12, em que o vetor de lentivirus codifica a proteína de fusão de endostatina XVIII e angiostatina.

16. O vetor de lentivirus da reivindicação 12, em que o vetor de lentivirus codifica a proteína de fusão de 4 endostatina XVIII e o domínio kringle 5 do plasminogénio humano.

17. Vetor de lentivírus da reivindicação 12, em que o vetor de lentivírus codifica a proteína de fusão de Mig e IP10.

18. Uso de um vetor de lentivírus compreendendo um gene terapêutico que reduz ou inibe a angiogénese ocular no fabrico de um medicamento para inibição da neovascularização num indivíduo com degeneração macular relacionada com a idade, em que o referido gene terapêutico é selecionado do grupo que consiste em endostatina, angiostatina, endostatina XVIII, endoestatina XV, o domínio hemopexina C-terminal da matriz de metaloproteinase-2, o domínio kringle 5 de plasminogénio humano, a fusão proteica da endostatina com a angioestatina, uma fusão proteica da endostatina com o domínio kringle 5 do plasminogénio humano, a monoquina induzida por interferão-gama (Mig), a proteína 10 induzível por interferão alfa (IP10), uma fusão proteica de Mig e IP10, FLT-1 solúvel (recetor de tirosimna quinase 1 tipo fms), e receptor de domínio de inserção da quinase (KDR).

19. Uso de acordo com a reivindicação 18, em que o vetor de lentivírus é um vetor de lentivírus como estabelecido em qualquer das reivindicações 1-17.

20. Uso da reivindicação 18, em que o referido vetor de lentivírus é administrado numa dosagem de desde cerca de 106 até 109 partículas de transdução no espaço capsular, vítreo ou sub-retiniano. 5

21. Método para transdução ex vivo do tecido da córnea com um gene terapêutico, o qual compreende expor uma célula da córnea a qual forma parte do tecido da córnea a um vetor de lentivirus recombinantes compreendendo o referido gene terapêutico operativamente ligado a um promotor conhecido como sendo ativo em células da córnea, em que o gene terapêutico é selecionado a partir do grupo que consiste em endostatina, angiostatina, endostatina XVIII, endoestatina XV, o domínio hemopexina C-terminal da matriz de metaloproteinase-2, o domínio kringle 5 de plasminogénio humano, a monoquina induzida por interferão-gama (Mig), a proteína 10 induzível por interferão alfa (IP10), FLT-1 solúvel (recetor de tirosimna quinase 1 tipo fms), e receptor de domínio de inserção da quinase (KDR).

22. Tecido da córnea compreendendo células transduzidas com um vetor de lentivirus recombinante, em que o vetor de lentivirus recombinante compreende um primeiro gene terapêutico acoplado a um promotor conhecido como sendo ativo em células da córnea, e em que o gene terapêutico é selecionado a partir do grupo que consiste em endostatina, angiostatina, endostatina XVIII, endoestatina XV, o domínio hemopexina C-terminal da matriz de metaloproteinase-2, o domínio kringle 5 de plasminogénio humano, a monoquina induzida por interferão-gama (Mig), a proteína 10 induzível por interferão alfa (IP10), FLT-1 solúvel (recetor de tirosimna quinase 1 tipo fms), e receptor de domínio de inserção da quinase (KDR).

23. Tecido da córnea da reivindicação 22, em que as células são transduzidas com um vetor de lentivirus 6 como estabelecido em qualquer uma das reivindicações 1-17 .

24. Tecido da córnea da reivindicação 22, em que o tecido da córnea é um tecido de córnea humana.

25. Tecido da córnea como estabelecido em qualquer das reivindicações 22-24 para uso no tratamento da neovascularização da córnea num indivíduo.

26. Tecido da córnea da reivindicação 25, em que o tecido da córnea é transduzido in situ. Lisboa,