ES2246513T3

ES2246513T3 - Nuevos peptidos anti-angiogenicos, polinucleotidos que los codifican y procedimientos de inhibicion de la angiogenesis.

Info

Publication number: ES2246513T3
Application number: ES97925478T
Authority: ES
Inventors: Donald J. Davidson; Jieyi Wang; Earl J. Gubbins
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1996-05-03
Filing date: 1997-05-05
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2017-05-05
Also published as: CZ298260B6; CN1223690A; US6251867B1; HUP9903530A3; DE69733756T2; WO1997041824A2; US5972896A; JP2002502235A; DK0910571T3; HU224827B1; ATE299888T1; AU3060697A; DE69733756D1; WO1997041824A3; IL126626A0; EP0910571B1; EP1612272B1; US6057122A; CZ342698A3; CN1152962C

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A FRAGMENTOS KRINGLE DE MAMIFEROS (5) Y A PROTEINAS DE FUSION KRINGLE (5), COMO COMPUESTOS PARA TRATAR ENFERMEDADES ANGIOGENICAS. SE DESCRIBEN ASIMISMO PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES PARA INHIBIR LAS ENFERMEDADES ANGIOGENICAS.

Description

Nuevos péptidos anti-angiogénicos, polinucleótidos que los codifican y procedimientos de inhibición de la angiogénesis.

Campo técnico

La presente invención está relacionada con el campo de la química de péptidos. Más particularmente, la invención se refiere a la preparación y a la utilización de péptidos que contienen secuencias de aminoácidos sustancialmente similares a las secuencias correspondientes de la región Kringle 5 del plasminógeno de mamífero, a composiciones farmacéuticas que contienen los péptidos, a anticuerpos específicos para el receptor de angioestatina, a medios para la detección y medida de la angioestatina, a agentes citotóxicos unidos a proteínas angioestatina y al tratamiento de enfermedades que derivan de, o están exacerbadas por, angiogénesis.

Antecedentes de la invención

La angiogénesis, el proceso mediante el cual se forman nuevos vasos sanguíneos, es esencial para actividades normales del organismo incluyendo la reproducción, el desarrollo y la reparación de heridas. Aunque el proceso no se conoce completamente, se cree que implica una interacción compleja de moléculas que regulan el crecimiento de las células endoteliales (las células primarias de los vasos sanguíneos capilares). Bajo condiciones normales, estas moléculas parece que mantienen la microvasculatura en un estado quiescente (esto es, un estado en el que no hay crecimiento capilar) durante periodos prolongados que pueden durar tanto como semanas o, en algunos casos, décadas. Cuando es necesario (tal como durante la reparación de heridas), estas mismas células pueden experimentar una proliferación y una renovación rápidas en un periodo de 5 días (Folkman, J. y Shing, Y., The Journal of Biological Chemistry, 267(16): 10931-10934 y Folkman, J. y Klagsbrun, M., Science, 235: 442-447 (1987).

Aunque la angiogénesis es un proceso sumamente regulado bajo condiciones normales, muchas enfermedades (caracterizadas como enfermedades angiogénicas) son motivadas por una angiogénesis persistente no regulada. A no ser que se manifieste de otro modo, la angiogénesis no regulada puede causar directamente una enfermedad particular o bien puede exacerbar una condición patológica existente. Por ejemplo, la neovascularización ocular ha sido implicada como la causa más común de ceguera y domina 20 enfermedades de los ojos aproximadamente. En ciertas condiciones existentes, tales como artritis, los vasos sanguíneos capilares recién formados invaden las articulaciones y destruyen el cartílago. En la diabetes, nuevos capilares formados en la retina invaden el vítreo, sangran y causan ceguera. El crecimiento y la metástasis de tumores sólidos dependen también de la angiogénesis (Folkman, J., Cancer Research, 46: 467-473 (1986), Folkman, J., Journal of the National Cancer Institute, 82: 4-6 (1989). Se ha demostrado, por ejemplo, que tumores que crecen hasta más de 2 mm deben obtener su propio suministro de sangre y lo hacen induciendo el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos capilares. Una vez que estos nuevos vasos se intercalan en el tumor, proporcionan un medio a las células tumorales para que entren en la circulación y metastaticen en sitios distantes tales como el hígado, el pulmón o el hueso (Weidner, N. y col., The New England Journal of Medicine, 324(1): 1-8
(1991)).

Hasta la fecha, se han descrito y caracterizado varios factores angiogénicos existentes de forma natural (Fidler, J.I. y Ellis, L.M., Cell, 79: 185-189 (1994)). Recientemente, O'Reilly y col. han aislado y purificado una proteína de 38 kilodaltons (kDa) de suero y orina de ratones portadores de tumores que inhibe la proliferación de células endoteliales (O'Reilly, M. y col., Cell, 79: 315-328 (1994) y Solicitud Internacional WO 95/29242, publicada el 2 de Noviembre de 1995). El análisis microsecuencial de este inhibidor endotelial mostró un 98% de homología de secuencias con un fragmento interno del plasminógeno murino. La angioestatina, como de denominó el fragmento inhibidor murino, era un péptido que incluía las primeras cuatro regiones Kringle del plasminógeno murino. Un fragmento peptídico de la misma región del plasminógeno humano (esto es, que contenía los Kringles 1-4) inhibía también potentemente la proliferación de células endoteliales capilares in vitro e in vivo. El plasminógeno intacto del que derivaba este fragmento peptídico no poseía un efecto inhibidor tan potente.

Varios inhibidores de la angiogénesis están actualmente bajo desarrollo para su utilización en el tratamiento de enfermedades angiogénicas (Gasparini, G. y Harris, A.L., J. Clin. Oncol., 13(3): 765-782 (1995)), pero existen desventajas asociadas con estos compuestos. La suramina, por ejemplo, es un potente inhibidor de la angiogénesis pero causa una toxicidad sistémica grave en humanos a las dosis requeridas para la actividad antitumoral. Compuestos tales como retinoides, interferones y antiestrógenos, son seguros para uso humano pero tienen efectos antiangiogénicos débiles. Otros compuestos más pueden ser difíciles o costosos de producir.

Por tanto, existe la necesidad de compuestos útiles para el tratamiento de enfermedades angiogénicas en mamíferos. Más específicamente, existe la necesidad de inhibidores de la angiogénesis que sean seguros para uso terapéutico y que presenten una toxicidad selectiva con respecto a la condición patológica, tal como mediante la inhibición selectiva de la proliferación de células endoteliales, a la vez que no presenten, o presenten un grado bajo de, toxicidad hacia las células normales (esto es, no cancerosas). Tales compuestos deberían ser también producidos fácilmente y de manera rentable.

Resumen de la invención

En su principal realización, la presente invención proporciona un compuesto peptídico de Kringle 5 representado por la fórmula estructural A-B-C-X-Y (I) o una sal, éster o profármaco del mismo farmacéuticamente aceptable, donde A, B, C, X e Y se definen según la reivindicación 1.

La presente invención incluye también la utilización de un compuesto que contiene un fragmento peptídico de Kringle 5 o una proteína de fusión de Kringle 5 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente con necesidad de terapia antiangiogénica.

La presente invención incluye también una composición para el tratamiento de un paciente con necesidad de terapia antiangiogénica que comprende un compuesto que contiene un fragmento peptídico de Kringle 5 o una proteína de fusión de Kringle 5, un antisuero hacia Kringle 5, agonistas y antagonistas del receptor de Kringle 5 y antagonistas de Kringle 5 unidos a agentes citotóxicos, solos o en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o opcionalmente con compuestos de liberación mantenida para formar una composición terapéutica.

La presente invención incluye también una composición para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consta de cáncer, artritis, degeneración macular y retinopatía diabética, que comprende un compuesto que contiene un fragmento peptídico de Kringle 5 o una proteína de fusión de Kringle 5.

La presente invención incluye también una composición que comprende una secuencia polinucleotídica de hebra sencilla o de doble hebra aislada que codifica un fragmento peptídico de Kringle 5 o una proteína de fusión de Kringle 5. Tal polinucleótido es preferiblemente una molécula de ADN. La presente invención incluye también un vector que contiene una secuencia de ADN que codifica un fragmento peptídico de Kringle 5 o una proteína de fusión de Kringle 5, donde el vector es capaz de expresar un fragmento peptídico de Kringle 5 o una proteína de fusión de Kringle cuando está presente en una célula, y una composición que comprende una célula que contiene un vector, donde el vector contiene una secuencia de ADN que codifica un fragmento peptídico de Kringle o una proteína de fusión de Kringle 5. La presente invención incluye además una célula de acuerdo con la reivindicación 14.

La presente invención incluye también un método para producir un fragmento peptídico de Kringle 5 que comprende las etapas de: (a) la exposición de plasminógeno de mamífero a elastasa humana o porcina en una proporción de 1:100 aproximadamente a 1:300 aproximadamente, con el fin de formar una mezcla de dicho plasminógeno y dicha elastasa; (b) la incubación de dicha mezcla y (c) el aislamiento del fragmento peptídico de Kringle 5 de dicha mezcla.

La presente invención incluye también un método para producir un fragmento peptídico de Kringle 5 que comprende las etapas de: (a) la exposición de plasminógeno de mamífero a elastasa humana o porcina en una proporción elastasa:plasminógeno de 1:100 aproximadamente a 1:300 aproximadamente, con el fin de formar una mezcla de dicha elastasa y dicho plasminógeno; (b) la incubación de dicha mezcla y (c) el aislamiento de un conjugado proteico de un fragmento peptídico de Kringle 5 de dicha mezcla; (d) la exposición de dicho conjugado proteico del fragmento peptídico de Kringle 5 a pepsina en una proporción de 1:0,2 aproximadamente para formar una mezcla de dicha pepsina y dicho plasminógeno y (d) el aislamiento de dicho fragmento peptídico de Kringle 5 de dicha mezcla. Alternativamente, puede producirse un fragmento peptídico de Kringle 5 o una proteína de fusión de Kringle 5 mediante un método que comprende las etapas de: (a) el aislamiento de un polinucleótido que codifique dicho fragmento peptídico de Kringle 5 o dicha proteína de fusión de Kringle 5; (b) el clonaje del polinucleótido en un vector de expresión; (c) la transformación con el vector de una célula huésped adecuada y el cultivo de la célula huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión del fragmento peptídico de Kringle 5 soluble o de la proteína de fusión de Kringle 5
soluble.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra la secuencia de aminoácidos del plasminógeno humano (SEC ID Nº:1).

La Fig. 2 muestra la homología comparativa de las secuencias de aminoácidos del Kringle 5 humano (SEC ID Nº:34), de ratón (SEC ID Nº:35), de mono Rhesus (SEC ID Nº:36), bovino (SEC ID Nº:37) y porcino (SEC ID Nº:38).

La Fig. 3 muestra la secuencia de ADN (SEC ID Nº:12) del plasminógeno humano.

La Fig. 4 muestra una gráfica de la actividad antiproliferativa de una dosis única de varios fragmentos Kringle sobre células endoteliales de capilares bovinos (BCE) cuando se analizaron en un ensayo de proliferación celular in vitro.

La Fig. 5 muestra un mapa del vector de expresión pHil-D8 que contiene una secuencia líder para la secreción de la proteína recombinante.

La Fig. 6 muestra un escáner de una fotografía de un gel de SDS-PAGE teñido con Azul de Coomassie de sobrenadantes del cultivo (10 \mul/calle) de Pichia pastoris que expresa un fragmento peptídico o una proteína de fusión de Kringle 5. Calles 1, 6 y 10: controles negativos; Calles 2, 3 y 4: tres clones distintos que expresan K5A; Calles 5: un clon que expresa K5F; Calles 7 y 8: clones que expresan K4-5A; Calle 9: un clon que expresa K4-5F. Las fechas indican bandas de proteína de K5A (11 kDa aproximadamente) y K4-5F (20 kDa aproximadamente). En las calles que preceden a las Calles 1 y 10 se muestran los marcadores de peso molecular.

La Fig. 7 muestra un gel de SDS-PAGE teñido con Azul de Commassie escaneado de cepas de E. coli que expresan un fragmento peptídico o una proteína de fusión de Kringle 5. A no ser que se indique de otro modo, cada calle contiene 10 \mul de material de cultivo equivalente a una A_{600} de 10. Calle 1: marcadores de bajo peso molecular; Calle 2: K5A/pET32a, cultivo total; Calle 3: K5A/pET32a, cultivo total (1/10 de la cantidad de la Calle 2); Calle 4: K5A/pET32a, fracción soluble; Calle 5: K5A/pET32a, fracción insoluble; Calle 6: K4-5A/pET32a, cultivo total; Calle 7: K4-5A/pET32a, cultivo total (1/10 de la cantidad de la Calle 6); Calle 8: K4-5A/pET32a, fracción soluble; Calle 9: K4-5A/pET32a, fracción insoluble; Calle 10: K4-5A/pGEX-4T-2, cultivo total; Calle 11: K4-5A/pGEX-4T-2, fracción soluble; Calle 12: K4-5A/pGEX-4T-2, fracción insoluble; Calle 13: estándar de Kringle 5; Calle 14: marcadores de alto peso molecular.

Descripción detallada de la invención

Según se utiliza en la presente, el término "Kringle 5" (de aquí en adelante K5) se refiere a la región del plasminógeno de mamífero que tiene tres enlaces disulfuro que contribuyen a la configuración tridimensional específica definida por la quinta región Kringle de la molécula de plasminógeno de mamífero. Uno de tales enlaces disulfuro une los residuos de cisteína situados en las posiciones de aminoácidos 462 y 541, un segundo une los residuos de cisteína situados en las posiciones de aminoácidos 483 y 524 y un tercero une los residuos de cisteína situados en las posiciones de aminoácidos 512 y 536. La secuencia de aminoácidos de una molécula de plasminógeno de mamífero completa (la molécula de plasminógeno humano), incluyendo su región Kringle 5, está mostrada en la Fig. 1 (SEC ID Nº:1).

Según se utiliza en la presente, el término "fragmento peptídico de Kringle 5" se refiere a un péptido de entre 4 y 104 aminoácidos (inclusive) con una homología de secuencias sustancial con el fragmento peptídico correspondiente del plasminógeno de mamífero, que tiene un extremo N \alpha en el aminoácido en posición 443 aproximadamente del plasminógeno de mamífero intacto y un extremo C \alpha en la posición 546 aproximadamente. La longitud total del fragmento peptídico de Kringle 5 puede variar dependiendo de la forma en que se obtenga el péptido de Kringle 5 o puede variar algo en la secuencia dependiendo de la especie de la que se obtenga. Por ejemplo, ciertas formas de fragmentos peptídicos de Kringle 5 pueden ser producidas mediante corte proteolítico de glu-plasminógeno, lys-plasminógeno o miniplasminógeno utilizando los enzimas elastasa humana o porcina. Cuando se produce de esta manera, el extremo C-terminal \alpha del péptido reside en el aminoácido 543 aproximadamente de la SEC ID Nº:1, pero el aminoácido N-terminal \alpha puede comenzar en la posición de aminoácidos 443, 449 ó 454. Por tanto, un fragmento peptídico de Kringle 5 resultante de la digestión con elastasa humana o porcina de glu-plasminógeno, lys-plasminógeno o miniplasminógeno puede tener una longitud total de 101, 95 ó 90 aminoácidos. Un resumen de estos fragmentos peptídicos de Kringle 5 está mostrado en la Tabla 1. Cuando se produce de la manera anteriormente mencionada, se obtiene un conjunto de estos tres fragmentos, en el que el 60% de los fragmentos aproximadamente tiene una longitud de 95 aminoácidos, el 35% de los fragmentos aproximadamente tiene una longitud de 101 aminoácidos y el 5% de los fragmentos aproximadamente tiene una longitud de 90 aminoácidos. Si se desea, estos diferentes fragmentos pueden ser purificados adicionalmente mediante HPLC de fase reversa, una técnica bien conocida por los expertos en el oficio. A pesar de esta variación de la longitud, un fragmento peptídico de K5 de la presente invención incluye la secuencia Lys-Leu-Tyr-Asp (esto es, desde el aminoácido en posición 531 hasta el aminoácido en posición 534 de la SEC ID Nº:1) o Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gly-Pro-Trp (esto es, desde el aminoácido en posición 514 hasta el aminoácido en posición 523 de la SEC ID Nº:1) o análogos de las mismas.

Según se utiliza en la presente, el término "proteína de fusión de Kringle 5" se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos extraída de dos o más proteínas individuales, una de las cuales es un fragmento peptídico de K5. Una proteína de fusión se forma por la expresión de un polinucleótido en el que la secuencia que codifica un fragmento peptídico de Kringle 5 ha sido unida con la secuencia que codifica al menos otro polipéptido, de tal manera que los dos (o más) marcos de lectura están en marco. Las proteínas de fusión de Kringle 5 preferidas son aquéllas en las que el fragmento peptídico de Kringle está fusionado con una secuencia correspondiente del plasminógeno humano tal como Kringle 4 (K4), Kringles 3-4 (K3-4), Kringles 2-4 (K2-4) y Kringles 1-4 (K1-4). Una proteína de fusión de K5 preferida es Kringles 4-5 (K4-5). Otros ejemplos de proteínas de fusión de Kringle 5 de la presente invención incluyen un fragmento peptídico de K5 o K4-5 unido además a una marca biológica. Tales proteínas de fusión pueden ser o no capaces de ser cortadas en las proteínas separadas de las que derivan.

Según se utiliza en la presente, el término "conjugado de un fragmento peptídico de K5" indica un fragmento peptídico de Kringle 5 acoplado químicamente a otra proteína para formar un conjugado. Ejemplos de conjugados de fragmentos peptídicos de Kringle 5 incluyen un fragmento peptídico de Kringle 5 acoplado a albúmina o a un fragmento peptídico de otra región Kringle del plasminógeno de mamífero. Los pesos moleculares de los conjugados de fragmentos peptídicos de Kringle 5 están entre 1.000 aproximadamente y 25.000 kDa aproximadamente.

Según se utiliza en la presente, el término "homología sustancial de secuencias" indica un 60% aproximadamente de identidad de aminoácidos, deseablemente al menos un 70% de identidad de aminoácidos aproximadamente, más deseablemente un 80% de identidad de aminoácidos aproximadamente y muy deseablemente un 95% de identidad de aminoácidos aproximadamente con la secuencia peptídica correspondiente del plasminógeno humano. Las secuencias que tienen una homología sustancial de secuencias con el plasminógeno humano son referidas como "homólogos". Además de tener una homología sustancial de secuencias, los homólogos de la presente invención muestran una actividad biológica similar (esto es, actividad antiangiogénesis) a la de los fragmentos peptídicos de K5 descritos en la presente. Como la secuencia de aminoácidos o el número de aminoácidos de un fragmento peptídico de Kringle 5 puede variar de especie a especie o según el método de producción, el número total de aminoácidos de un fragmento peptídico de Kringle 5 no puede ser, en algunos casos, definido exactamente. Dado que estas secuencias son idénticas en al menos un 73% de sus aminoácidos, debe comprenderse que la secuencia de aminoácidos de un fragmento peptídico de Kringle 5 es sustancialmente similar entre especies, y que los métodos de producción de los fragmentos peptídicos de Kringle 5 proporcionan fragmentos peptídicos de Kringle 5 con una homología sustancial de secuencias con las secuencias de aminoácidos correspondientes del plasminógeno humano. La Fig. 2 muestra la secuencia de aminoácidos de un fragmento peptídico de Kringle 5 humano que tiene 95 aminoácidos (SEC ID Nº:34) en comparación con las secuencias de fragmentos de Kringle 5 de plasminógeno murino (SEC ID Nº:35), de mono Rhesus (SEC ID Nº:36), bovino (SEC ID Nº:37) y porcino (SEC ID Nº:38).

La presente invención contempla también secuencias de residuos de aminoácidos que son análogas a las secuencias presentadas en la presente, de manera que esas secuencias (análogas) muestran una actividad biológica similar a la de los fragmentos peptídicos de Kringle 5 y las proteínas de fusión de los mismos descritos. Es bien conocido en la técnica que pueden realizarse modificaciones y cambios sin alterar sustancialmente la función biológica de ese péptido. En la producción de tales cambios, pueden realizarse sustituciones de residuos de aminoácidos similares sobre la base de la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral, por ejemplo, su tamaño, su carga, su hidrofobicidad, su hidrofilicidad y similares. Pueden producirse alteraciones del tipo descrito para incrementar la potencia del péptido o su estabilidad a la degradación enzimática o su farmacocinética. Por tanto, las secuencias consideradas dentro del ámbito de la invención incluyen aquéllas secuencias análogas caracterizadas por un cambio en la secuencia de residuos de aminoácidos o de un tipo en el que el cambio no altere la naturaleza y la actividad biológica fundamental de los fragmentos peptídicos y/o proteínas de fusión de K5 anteriormente mencionados.

Un fragmento peptídico de K5 o una proteína de fusión de K5 de la presente invención pueden ser caracterizados sobre la base de la potencia cuando se analicen para determinar su capacidad para inhibir el crecimiento de células capilares bovinas (BCE) in vitro. Los datos de la Tabla 1 y la Fig. 4 ilustran que el fragmento peptídico de K5 que tiene la secuencia desde el aminoácido en posición 443 hasta el aminoácido en posición 543 de la SEC ID Nº:1 muestra un incremento de la actividad de 300 veces aproximadamente (esto es, en la inhibición de la proliferación de células BCE) cuando se compara con el fragmento peptídico de Kringle que tiene la secuencia desde el aminoácido en posición 443 hasta el aminoácido en posición 546 de la SEC ID Nº:1, y un incremento de la actividad de 800 veces aproximadamente cuando se compara con los fragmentos peptídicos de Kringle 1-4.

El término "aislado", según se utiliza en la presente, significa que el material es extraído de su entorno original (por ejemplo, del entorno natural si existe en la naturaleza). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido existente en la naturaleza presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o ADN o polipéptido que es separado de algunos o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Tal polinucleótido podría ser parte de un vector y/o tal polinucleótido o polipéptido podría ser parte de una composición y estar todavía aislado, en cuanto a que el vector o la composición no es parte de su entorno natural.

El término "cebador" indica una secuencia oligonucleotídica específica complementaria a una secuencia de nucleótidos diana, y se utiliza para hibridar con la secuencia de nucleótidos diana y sirve como punto de inicio de la polimerización de nucleótidos catalizada por ADN polimerasa, ARN polimerasa o transcriptasa inversa.

El término "sonda" indica un segmento de ácido nucleico definido (o un segmento de nucleótidos análogo, esto es, PNA) que puede ser utilizado para identificar ADN específico presente en muestras portadoras de la secuencia complementaria.

Un "polipéptido recombinante", según se utiliza en la presente, significa al menos un polipéptido que en virtud de su origen o manipulación no está asociado con todo o con una porción del polipéptido con el que está asociado en la naturaleza y/o está unido a un polipéptido distinto de aquél al que está unido en la naturaleza. Un polipéptido recombinante o derivado no está necesariamente traducido a partir de una secuencia de ácido nucleico designada. Puede ser también generado de cualquier manera, incluyendo síntesis química o expresión de un sistema de expresión recombinante.

El término "péptido sintético", según se utiliza en la presente, indica una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que puede ser sintetizada químicamente por métodos bien conocidos por los técnicos con experiencia habitual. Estos péptidos sintéticos son útiles en varias aplicaciones.

"Polinucleótido purificado" se refiere a un polinucleótido de interés o a un fragmento del mismo que está esencialmente libre de, esto es, contiene menos de un 50% aproximadamente, preferiblemente menos de un 70% aproximadamente, y más preferiblemente menos de un 90% aproximadamente de, la proteína con la que el polinucleótido está asociado en la naturaleza. Las técnicas para purificar polinucleótidos de interés son bien conocidas en el oficio e incluyen, por ejemplo, ruptura de la célula que contiene el polinucleótido con un agente caotrópico y la separación del(los) polinucleótido(s) y proteínas mediante cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y sedimentación según la densidad. Por tanto, "polipéptido purificado" significa un polipéptido de interés o un fragmento del mismo que está esencialmente libre de, esto es, que contiene menos de un 50% aproximadamente, preferiblemente menos de un 70% aproximadamente, y más preferiblemente menos de un 90% aproximadamente, de los componentes celulares con los que el polipéptido de interés está asociado en la naturaleza. Los métodos de purificación son conocidos en la técnica.

"Polipéptido", según se utiliza en la presente, indica una cadena molecular de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto. Por tanto, péptidos, oligopéptidos y proteínas están incluidos dentro de la definición de polipéptido. Este término tiene también la intención de referirse a modificaciones del polipéptido posteriores a la expresión, por ejemplo glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares.

"Células huésped recombinantes", "células huésped", "células", "líneas celulares", "cultivos celulares", y otros términos similares que indican microorganismos o líneas celulares eucarióticas superiores cultivados como entidades unicelulares, se refieren a células que pueden ser, o han sido, utilizadas como receptoras de vectores recombinantes o de otro ADN transferido, e incluyen la progenie original de la célula original que ha sido transfectada.

Según se utiliza en la presente, "replicón" significa cualquier elemento genético, tal como un plásmido, un cromosoma o un virus, que se comporte como una unidad autónoma de replicación de polinucleótidos en una célula.

Un "vector" es un replicón al que está unido otro segmento polinucleotídico, tal como para producir la replicación y/o la expresión del segmento unido.

El término "secuencia control" se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para llevar a cabo la expresión de secuencias codificadoras a las que están ligadas. La naturaleza de tales secuencias control difiere dependiendo del organismo huésped. En procariotas, tales secuencias control incluyen generalmente un promotor, un sitio de unión de ribosomas y terminadores; en eucariotas, tales secuencias control incluyen generalmente promotores, terminadores y, en algunos casos, intensificadores. El término "secuencia control" tiene por tanto la intención de incluir como mínimo todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y puede incluir también componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa, por ejemplo secuencias líder.

"Unidos operativamente" se refiere a una situación en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera deseada. Así, por ejemplo, una secuencia control "unida operativamente" a una secuencia codificadora, está ligada de tal manera que se consigue la expresión de la secuencia codificadora bajo condiciones compatibles con las secuencias control.

El término "marco de lectura abierto" o "ORF", se refiere a una región de una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido; esta región puede representar una porción de una secuencia codificadora o una secuencia codificadora total.

Una "secuencia codificadora" es una secuencia polinucleotídica que es transcrita a ARNm y traducida a un polipéptido cuando está situada bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificadora están determinados por un codón de inicio de la traducción en el extremo 5' y un codón de parada de la traducción en el extremo 3'. Una secuencia codificadora puede incluir ARNm, ADNc y secuencias polinucleotídicas recombinantes.

El término "transformación" se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del método utilizado para la inserción. Por ejemplo, se incluyen captación directa, transducción o conjugación mediante f. El polinucleótido exógeno puede ser mantenido como un vector no integrado, por ejemplo un plásmido, o, alternativamente, puede estar integrado en el genoma huésped.

"Producto purificado" se refiere a una preparación del producto que ha sido aislada de los constituyentes celulares con los que el producto está normalmente asociado, y de otros tipos de células que pueden estar presentes en la muestra de interés.

Todas las secuencias peptídicas están escritas según el acuerdo generalmente aceptado por el que el residuo de aminoácido N-terminal \alpha está a la izquierda y el C-terminal \alpha está a la derecha. Según se utiliza en la presente, el término "N-terminal \alpha" se refiere al grupo alfa-amino libre de un aminoácido en un péptido, y el término "C-terminal \alpha" se refiere al extremo ácido carboxílico alfa libre de un aminoácido en un péptido.

Según se utiliza en la presente, el término "grupo protector de N" se refiere a aquellos grupos destinados a proteger el extremo N-terminal \alpha de un aminoácido o péptido, o a proteger por otra parte el grupo amino de un aminoácido o péptido frente a reacciones no deseables durante los procedimientos sintéticos. Grupos protectores de N utilizados comúnmente están descritos en Greene, "Protective Groups In Organic Synthesis" (John Wiley & Sons, New York (1981)).

Adicionalmente, pueden utilizarse grupos protectores como profármacos que sean fácilmente cortados in vivo, por ejemplo mediante hidrólisis enzimática, para liberar el parental biológicamente activo. Los grupos protectores de N comprenden grupos alcanoilo inferiores tales como formilo, acetilo ("Ac"), propionilo, pivaliolo, t-butilacetilo y similares; otros grupos acilo incluyen 2-cloroacetilo, 2-bromoacetilo, trifluoroacetilo, tricloroacetilo, ftalilo, o-nitrofenoxiacetilo, \alpha-clorobutirilo, benzoilo, 4-clorobenzoilo, 4-bromobenzoilo, 4-nitrobenzoilo; grupos sulfonilo tales como bencenosulfonilo, p-toluensulfonilo y similares; grupos formadores de carbamato tales como benciloxicarbonilo, p-clorobenciloxicarbonilo, p-metoxibenciloxicarbonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, 2-nitrobenciloxicarbonilo, p-bromobenciloxicarbonilo, 3,4-dimetoxibenciloxicarbonilo, 3,5-dimetoxibenciloxicarbonilo, 2,4-dimetoxibenciloxicarbonilo, 4-metoxibenciloxicarbonilo, 2-nitro-4,5-dimetoxibenciloxicarbonilo, 3,4,5-trimetoxi-benciloxicarbonilo, 1-(p-bifenilil)-1-metiletoxicarbonilo, \alpha,\alpha-dimetil-3,5-dimetoxibenciloxicarbonilo, benzhidriloxi-carbonilo, t-butiloxicarbonilo, diisopropilmetoxi-carbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo, metoxicarbonilo, aliloxicarbonilo, 2,2,2-tricloroetoxi-carbonilo, fenoxi-carbonilo, 4-nitrofenoxicarbonilo, fluorenil-9-metoxicarbonilo, ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxi-carbonilo, ciclohexiloxicarbonilo, feniltio-carbonilo; grupos arilalquilo tales como bencilo, trifenil-metilo, benciloxi-metilo, 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) y grupos sililo tales como trimetilsililo y similares. Los grupos protectores de N preferidos son formilo, acetilo, benzoilo, pivaloilo, t-butilacetilo, fenilsulfonilo, bencilo, t-butiloxicarbonilo (Boc) y benciloxicarbonilo (Cbz). Por ejemplo, la lisina puede ser protegida en el extremo N-terminal \alpha por un grupo lábil al ácido (por ejemplo Boc) y protegida en el extremo N-terminal \varepsilon por un grupo lábil a las bases (por ejemplo Fmoc) y posteriormente desprotegida selectivamente durante la síntesis.

Según se utiliza en la presente, el término "grupo protector de carboxi" se refiere a un grupo éster o amida protector de ácido carboxílico empleado para bloquear o proteger el grupo funcional ácido carboxílico mientras se llevan a cabo reacciones que implican a otros sitios funcionales del compuesto. Grupos protectores de carboxi están descritos en Greene, "Protective Groups In Organic Synthesis", pp. 152-186, (1981). Adicionalmente, puede utilizarse un grupo protector de carboxi como profármaco, por lo que el grupo protector de carboxi puede ser fácilmente cortado in vivo, por ejemplo mediante hidrólisis enzimática, para liberar el parental biológicamente activo. Tales grupos protectores de carboxi son bien conocidos por los expertos en la técnica, habiendo sido muy utilizados para la protección de grupos carboxilo en los campos de la penicilina y la cefalosporina, según está descrito en las Patentes de EE.UU. N^{os} 3.840.556 y 3.719.667.

Grupos protectores de carboxi representativos son alquilos inferiores C_{1}-C_{8} (por ejemplo, metilo, etilo o t-butilo); arilalquilos tales como fenetilo o bencilo y derivados sustituidos de los mismos tales como grupos alcoxibencilo o nitrobencilo; arilalquenilo tal como feniletenilo; arilo y derivados sustituidos del mismo tal como 5-indanilo; dialquilaminoalquilo tal como dimetilaminoetilo; grupos alcanoiloxialquilo tales como acetoximetilo, butiriloximetilo, valeriloximetilo, isobutiriloximetilo, isovaleriloximetilo, 1-(propioniloxi)-1-etilo, 1-(pivaloiloxil)-1-etilo, 1-metil-1-(propioniloxi)-1-etilo, pivaloiloximetilo, propioniloximetilo; grupos cicloalcanoiloxialquilo tales como ciclopropilcarboniloxi-metilo, ciclobutilcarboniloximetilo, ciclopentilcarboniloxi-metilo, ciclohexilcarboniloximetilo; aroiloxialquilos tales como benzoiloximetilo, benzoiloxietilo; arilalquil-carboniloxialquilos tales como bencilcarboniloximetilo, 2-bencilcarboniloxietilo; alcoxicarbonilalquilos o cicloalquiloxicarbonilalquilos tales como metoxicarbonil-metilo, ciclohexiloxicarbonilmetilo, 1-metoxicarbonil-1-etilo; alcoxicarboniloxialquilos o cicloalquiloxicarboniloxi-alquilos tales como metoxicarboniloximetilo, t-butiloxi-carboniloximetilo, 1-etoxicarboniloxi-1-etilo, 1-ciclohexiloxicarboniloxi-1-etilo; ariloxicarboniloxialquilos tales como 2-(fenoxicarboniloxi)etilo, 2-(5-indaniloxi-carboniloxi)etilo; alcoxialquilcarboniloxialquilos tal como 2-(1-metoxi-2-metilpropan-2-oiloxi)etilo; arilalquiloxi-carboniloxialquilos tal como 2-(benciloxicarboniloxi)etilo; arilalqueniloxicarboniloxialquilos tal como 2-(3-fenilpropen-2-iloxicarboniloxi)etilo; alcoxicarbonilaminoalquilos tal como t-butiloxicarbonilaminometilo; alquilaminocarbonilamino-alquilos tal como metilaminocarbonilaminometilo; alcanoil-aminoalquilos tal como acetilaminometilo; heterocicli-carboniloxialquilos tal como 4-metilpiperazinilcarboniloxi-metilo; dialquilaminocarbonialquilos tales como dimetilamino-carbonilmetilo, dietilaminocarbonilmetilo; (5-(alquilo inferior)-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)alquilos tal como (5-t-butil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)metilo; y (5-fenil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)alquilos tal como (5-fenil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)metilo.

Grupos amida protectores de carboxi representativos son los grupos aminocarbonilo y alquilo inferior-aminocarbonilo.

Los compuestos con carboxi protegido preferidos de la invención son compuestos en los que el grupo carboxi protegido es un éster de alquilo inferior, cicloalquilo o arilalquilo, por ejemplo éter metílico, éster etílico, éster propílico, éster isopropílico, éster butílico, éster sec-butílico, éster isobutílico, éster amílico, éster isoamílico, éster octílico, éster ciclohexílico, éster feniletílico y similares, o un éster alcanoiloxialquílico, cicloalcanoiloxi-alquílico, aroiloxialquílico o arilalquilcarboniloxi-alquílico. Los grupos amida protectores de carboxi preferidos son los grupos alquilo inferior-aminocarbonilo. Por ejemplo, el ácido aspártico puede ser protegido en el C-terminal \alpha por un grupo lábil al ácido (por ejemplo t-butilo) y protegido en el C-terminal \beta por un grupo lábil a la hidrogenación (por ejemplo bencilo) y posteriormente ser desprotegido selectivamente durante la síntesis.

Según se utiliza en la presente, el término "alquilo inferior-aminocarbonilo" indica un grupo -C(O)NHR^{10} que cubre el extremo C-terminal \alpha de un fragmento peptídico sintético de Kringle 5, donde R^{10} es alquilo C_{1}-C_{4}.

Según se utiliza en la presente, el término "aminocarbonilo" indica un grupo -C(O)NH_{2} que cubre el extremo C-terminal \alpha de un fragmento peptídico sintético de Kringle 5.

Según se utiliza en la presente, el término "profármaco" se refiere a compuestos que son transformados rápidamente in vivo para dar el compuesto parental, por ejemplo, mediante hidrólisis enzimática en la sangre. Se proporciona una discusión rigurosa en T. Higuchi y V. Stella, Prodrugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 del A.C.S. Symposium Series y en Edward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Permagon Press, 1987.

Según se utiliza en la presente, el término "profármaco farmacéuticamente aceptable" se refiere a (1) aquellos profármacos de los compuestos de la presente invención que son, dentro del ámbito del juicio médico bien fundado, adecuados para ser utilizados en contacto con tejidos de humanos y de animales inferiores sin toxicidad, irritación, respuestas alérgicas excesivas y similares, en proporción a una relación beneficio-riesgo adecuada y que son eficaces para su uso deseado y (2) formas zwitteriónicas, cuando sea posible, del compuesto parental.

El término "derivado éster activado", según se utiliza en la presente, se refiere a haluros de ácido tales como cloruros de ácido, y a ésteres activados incluyendo anhídridos derivados de ácido fórmico y de ácido acético, anhídridos derivados de haluros de alcoxicarbonilo tales como cloruro de isobutiloxicarbonilo, ésteres derivados de N-hidroxisuccinimida, ésteres derivados de N-hidroxiftalimida, ésteres derivados de N-hidroxibenzotriazol, ésteres derivados de N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboxamida, ésteres derivados de 2,4,5-triclorofenol.

Según se utiliza en la presente, el término "actividad antiangiogénesis" se refiere a la capacidad de una molécula para inhibir el crecimiento de vasos sanguíneos.

Según se utiliza en la presente, el término "actividad inhibidora del endotelio" se refiere a la capacidad de una molécula para inhibir la angiogénesis en general y, por ejemplo, para inhibir el crecimiento o la migración de células endoteliales de capilares bovinos en cultivo en presencia de factor de crecimiento de fibroblastos o de otros factores de crecimiento conocidos.

Según se utiliza en la presente, el término "DE_{50}" es una abreviatura de la dosis de un fragmento peptídico o de una proteína de fusión de Kringle 5 que es eficaz para inhibir el crecimiento de vasos sanguíneos, o para inhibir el crecimiento de células endoteliales de capilares bovinos en cultivo en presencia de factor de crecimiento de fibroblastos o de otros factores de crecimiento conocidos, o para inhibir la migración de células endoteliales, la mitad de lo que el crecimiento o la migración serían en ausencia del inhibidor.

Según se utilizan en la presente, por lo general, los nombres de los aminoácidos y residuos de aminoacilo existentes de forma natural utilizados en la presente siguen los acuerdos de nomenclatura sugeridos por la Commission on the Nomenclature of Organic Chemistry de la IUPAC y por la Commission on Biochemical Nomenclature de la IUPAC-IUB según se presenta en Nomenclature of \alpha-Amino Acids (Recommendations, 1974), Biochemistry, 14(2), (1975). Por consiguiente, los términos "Ala", "Arg", "Asn", "Asp", "Cys", "Gln", "Glu", "Gly", "His", "Ile", "Leu", "Lys", "Met", "Phe", "Pro", "Ser", "Thr", "Trp", "Tyr" y "Val" se refieren a los aminoácidos alanina, arginina, asparragina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina y a sus residuos de aminoacilo correspondientes en péptidos en sus formas L-, D- o D,L-. Cuando no se indique una configuración específica, una persona experta en la técnica comprenderá que la estereoquímica del carbono \alpha de los aminoácidos y de los residuos de aminoacilo en los péptidos descritos en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas es la configuración que existe en la naturaleza o configuración "L", con la excepción de la molécula aquiral de glicina y con la excepción además de cualquier aminoácido que sea aquiral o que de lo contrario esté señalado como "D-".

Según se utiliza en la presente, el término "3-I-Tyr" indica un residuo de L-, D-, o D,L-tirosilo en el que un radical hidrógeno orto respecto al hidroxilo fenólico está sustituido por un radical yoduro. El radical yoduro puede ser radiactivo o no radiactivo.

La presente invención contempla también residuos de aminoácidos con residuos de la cadena lateral que no existen en la naturaleza, tales como homofenilalanina, fenilglicina, norvalina, norleucina, ornitina, tiazoilalanina (2-, 4- y 5-sustituidos).

Por tanto, debe comprenderse que se contempla que la presente invención incluya cualquier derivado de fragmentos peptídicos de Kringle 5 y de proteínas de fusión de Kringle 5 que tenga actividad antiangiogénica e incluye la clase completa de fragmentos peptídicos y proteínas de fusión de Kringle 5 descrita en la presente y homólogos o análogos de esos fragmentos y proteínas. Adicionalmente, la invención no depende de la manera en la que se produzca el fragmento peptídico o la proteína de fusión de Kringle 5, esto es, mediante (1) corte proteolítico de un plasminógeno de mamífero aislado, (2) la expresión de una molécula recombinante que tenga un polinucleótido que codifique la secuencia de aminoácidos de un fragmento peptídico o una proteína de fusión de Kringle 5 y (3) técnicas sintéticas en fase sólida conocidas por las personas con experiencia habitual en el oficio.

En una realización, la presente invención proporciona péptidos con la estructura general B-C-X, en la que B es un péptido 88-mero que comienza en Val^{443} y finaliza en Arg^{530} de la SEC ID Nº:1; C es un péptido 4-mero en el que R^{1} y R^{4} son como se definieron previamente, R^{2} es leucilo y R^{3} es tirosilo; y X es un péptido 9-mero que comienza en Tyr^{535} y finaliza en Ala^{543} de la SEC ID Nº:1.

En otra realización, la presente invención proporciona péptidos con la estructura general B-C-X, en la que B es un péptido 82-mero que comienza en Val^{449} y finaliza en Arg^{530} de la SEC ID Nº:1; C es un péptido 4-mero en el que R^{1} y R^{4} son como se definieron previamente, R^{2} es leucilo y R^{3} es tirosilo; y X es un péptido 9-mero que comienza en Tyr^{535} y finaliza en Ala^{543} de la SEC ID Nº:1.

En otra realización más, la presente invención proporciona péptidos con la estructura general B-C-X, en la que B es un péptido 77-mero que comienza en Val^{454} y finaliza en Arg^{530} de la SEC ID Nº:1; C es un péptido 4-mero en el que R^{1} y R^{4} son como se definieron previamente, R^{2} es leucilo y R^{3} es tirosilo; y X es un péptido 9-mero que comienza en Tyr^{535} y finaliza en Ala^{543} de la SEC ID Nº:1.

En otra realización más, la presente invención proporciona péptidos con la estructura general B-C-X, en la que B es un péptido 88-mero que comienza en Val^{443} y finaliza en Arg^{530} de la SEC ID Nº:1; C es un péptido 4-mero en el que R^{1} y R^{4} son como se definieron previamente, R^{2} es leucilo y R^{3} es tirosilo; y X es un péptido 12-mero que comienza en Tyr^{535} y finaliza en Phe^{546} de la SEC ID Nº:1.

En otra realización más, la presente invención proporciona péptidos con la estructura general B-C-X, en la que B es un péptido 82-mero que comienza en Val^{449} y finaliza en Arg^{530} de la SEC ID Nº:1; C es un péptido 4-mero en el que R^{1} y R^{4} son como se definieron previamente, R^{2} es leucilo y R^{3} es tirosilo; y X es un péptido 12-mero que comienza en Tyr^{535} y finaliza en Phe^{546} de la SEC ID Nº:1.

En otra realización más, la presente invención proporciona péptidos con la estructura general B-C-X, en la que B es un péptido 77-mero que comienza en Val^{454} y finaliza en Arg^{530} de la SEC ID Nº:1; C es un péptido 4-mero en el que R^{1} y R^{4} son como se definieron previamente, R^{2} es leucilo y R^{3} es tirosilo; y X es un péptido 12-mero que comienza en Tyr^{535} y finaliza en Phe^{546} de la SEC ID Nº:1.

En otra realización más, la presente invención proporciona péptidos con la estructura general B-C-X, en la que B es un péptido 176-mero que comienza en Val^{355} y finaliza en Arg^{530} de la SEC ID Nº:1; C es un péptido 4-mero en el que R^{1} y R^{4} son como se definieron previamente, R^{2} es leucilo y R^{3} es tirosilo; y X es un péptido 12-mero que comienza en Tyr^{535} y finaliza en Ala^{543} de la SEC ID Nº:1.

En otra realización más, la presente invención proporciona péptidos con la estructura general B-C-X, en la que B es un péptido 176-mero que comienza en Val^{355} y finaliza en Arg^{530} de la SEC ID Nº:1; C es un péptido 4-mero en el que R^{1} y R^{4} son como se definieron previamente, R^{2} es leucilo y R^{3} es tirosilo; y X es un péptido 12-mero que comienza en Tyr^{535} y finaliza en Phe^{546} de la SEC ID Nº:1.

En otra realización más, la presente invención proporciona péptidos con la estructura general A-C-Y, en la que A es acetilo; C es un péptido 4-mero en el que R^{1} y R^{4} son como se definieron previamente, R^{2} es leucilo y R^{3} es tirosilo; e Y es aminocarbonilo.

En otra realización más, la presente invención proporciona péptidos con la estructura general A-C-X-Y, en la que A es acetilo; C es un péptido 4-mero en el que R^{1} y R^{4} son como se definieron previamente, R^{2} es leucilo y R^{3} es tirosilo; X es tirosilo; e Y es aminocarbonilo.

En otra realización más, la presente invención proporciona péptidos con la estructura general A-B-C-Y, en la que A es acetilo; B es un dipéptido que comienza en la posición de aminoácidos Pro^{529} y finaliza en la posición de aminoácidos Arg^{530} de la SEC ID Nº:1; C es un péptido 4-mero en el que R^{1} y R^{4} son como se definieron previamente, R^{2} es leucilo y R^{3} es tirosilo; e Y es aminocarbonilo.

En otra realización más, la presente invención proporciona péptidos con la estructura general A-B-C-X-Y, en la que A es acetilo; B es un hexapéptido que comienza en la posición de aminoácidos Tyr^{525} y finaliza en la posición de aminoácidos Arg^{530} de la SEC ID Nº:1; C es un péptido 4-mero en el que R^{1} y R^{4} son como se definieron previamente, R^{2} es leucilo y R^{3} es tirosilo; X es tirosilo e Y es aminocarbonilo.

En otra realización más, la presente invención proporciona péptidos con la estructura general A-B-C-X-Y, en la que A es acetilo; B es arginilo; C es un péptido 4-mero en el que R^{1} y R^{4} son como se definieron previamente, R^{2} es leucilo y R^{3} es tirosilo; X es tirosilo e Y es aminocarbonilo.

En otra realización más, la presente invención proporciona péptidos con la estructura general A-B-C-X-Y, en la que A es acetilo; B es un dipéptido que comienza en la posición de aminoácidos Pro^{529} y finaliza en la posición de aminoácidos Arg^{530} de la SEC ID Nº:1; C es un péptido 4-mero en el que R^{1} y R^{4} son como se definieron previamente, R^{2} es leucilo y R^{3} es tirosilo; X es 3-I-tirosilo e Y es aminocarbonilo.

En otra realización más, la presente invención proporciona péptidos con la estructura general A-B-C-X-Y, en la que A es acetilo; B es un dipéptido que comienza en la posición de aminoácidos Pro^{529} y finaliza en la posición de aminoácidos Arg^{530} de la SEC ID Nº:1; C es un péptido 4-mero en el que R^{1} y R^{4} son como se definieron previamente, R^{2} es leucilo y R^{3} es tirosilo; X es tirosilo e Y es aminocarbonilo.

Los compuestos representativos de la invención incluyen compuestos en los que A es acetilo e Y es aminocarbonilo y B-C-X es

(a): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 355-543 de la SEC ID Nº:1;

(b): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 355-546 de la SEC ID Nº:1;

(c): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 443-543 de la SEC ID Nº:1;

(d): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 449-543 de la SEC ID Nº:1;

(e): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 454-543 de la SEC ID Nº:1;

(f): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 443-546 de la SEC ID Nº:1;

(g): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 449-546 de la SEC ID Nº:1;

(h): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 454-546 de la SEC ID Nº:1;

(i): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 525-535 de la SEC ID Nº:1;

(j): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 529-535 de la SEC ID Nº:1; y

(k): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 530-535 de la SEC ID Nº:1.

Los fragmentos de K5 o las proteínas de fusión de K5 pueden ser obtenidos por expresión de una molécula recombinante que contenga un polinucleótido con una secuencia que codifique una proteína que tenga un fragmento peptídico de Kringle 5 y la purificación posterior del producto peptídico que es expresado (ver Menhart, N. y col., Biochemistry, 32: 8799-8806 (1993). La secuencia de ADN del plasminógeno humano ha sido publicada (Browne, M.J., y col., Fibrinolysis, 5(4): 257-260 (1991)) y está mostrada en la Fig. 3(a-b) (SEC ID Nº:12). Una secuencia polinucleotídica que codifica Kringle 5 comienza aproximadamente en el nucleótido en posición 1421 de la SEC ID Nº:12 y finaliza en el nucleótido en posición 1723 aproximadamente.

El gen que codifica un fragmento peptídico de K5 o una proteína de fusión de K5 puede ser aislado de células o tejidos que expresen niveles elevados de plasminógeno humano o de proteínas de fusión de K5 mediante (1) el aislamiento de ARN mensajero del tejido o de las células, (2) la utilización de transcriptasa inversa para generar la secuencia de ADN correspondiente y (3) la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con los cebadores apropiados para amplificar la secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de K5 activo o la proteína de fusión del mismo. Además, un polinucleótido que codifique un fragmento peptídico de K5 o una proteína de fusión de K5 puede ser clonado en cualquier vector de expresión comercialmente disponible (tal como los vectores pBR322, pUC y similares) o en vectores de expresión/purificación (tal como un vector de fusión GST (Pharmacia®, Piscataway, NJ)) y posteriormente expresado en un huésped procariótico, vírico o eucariótico adecuado. La purificación puede ser realizada posteriormente mediante medios convencionales o, en el caso de un sistema de expresión/purificación comercial, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Un fragmento peptídico de K5 o una proteína de fusión de K5 pueden ser también sintetizados mediante métodos estándar de química en fase sólida conocidos por las personas con experiencia habitual en la técnica. Por ejemplo, pueden sintetizarse fragmentos peptídicos de Kringle 5 mediante técnicas de química en fase sólida siguiendo los procedimientos descritos por Steward y Young (Steward, J.M. y Young, J.D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª Ed., Pierce Chemical Company, Rockford, IL (1984)) utilizando un sintetizador de Applied Biosystems. De manera similar, pueden sintetizarse múltiples fragmentos y ligarse posteriormente entre sí para formar fragmentos más grandes. Estos fragmentos peptídicos sintéticos pueden ser producidos también con sustituciones de aminoácidos en posiciones específicas con el fin de analizar la actividad antiangiogénesis in vitro e in vivo. Para la síntesis peptídica en fase sólida, puede encontrarse un resumen de las muchas técnicas en J.M. Steward y J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co. (San Francisco), 1963 y en J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, vol. 2, p. 46, Academic Press (New York), 1973. Para la síntesis en solución clásica ver G. Schroder y K. Lupke, The Peptides, Vol. 1, Academic Press (New York). En general, estos métodos comprenden la adición secuencial de uno o más aminoácidos o de aminoácidos protegidos adecuadamente a una cadena peptídica en crecimiento. Normalmente, el grupo amino o el grupo carboxilo del primer aminoácido está protegido por un grupo protector adecuado. El aminoácido protegido o derivatizado es posteriormente unido a un soporte sólido o utilizado en solución añadiendo el siguiente aminoácido de la secuencia que tiene el grupo complementario (amino o carboxilo) protegido adecuadamente y bajo condiciones adecuadas para formar el enlace amida. El grupo protector es eliminado posteriormente de este residuo de aminoácido recién añadido y se añade el siguiente aminoácido (protegido adecuadamente) y así sucesivamente. Una vez que todos los aminoácidos deseados se han unido en la secuencia correcta, se eliminan los grupos protectores restantes (y el soporte sólido) secuencialmente o simultáneamente para obtener el polipéptido final. Mediante una sencilla modificación de este procedimiento general, es posible añadir más de un aminoácido a la vez a la cadena en crecimiento, por ejemplo, mediante acoplamiento (bajo condiciones que no racemicen los centros quirales) de un tripéptido protegido con un dipéptido protegido apropiadamente para formar, después de la desprotección, un peptapéptido.

Un método particularmente preferido para preparar compuestos de la presente invención implica la síntesis peptídica en fase sólida, en la que el aminoácido N-terminal \alpha está protegido por un grupo sensible a ácidos o bases. Tales grupos protectores deben tener las propiedades de ser estables a las condiciones de formación del enlace peptídico mientras que son fácilmente eliminables sin destruir la cadena peptídica en crecimiento o sin racemizar cualquiera de los centros quirales contenidos en la misma. Grupos protectores adecuados son 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), t-butiloxicarbonilo (Boc), benciloxicarbonilo (Cbz), bifenilisopropiloxicarbonilo, t-amiloxicarbonilo, isoborniloxicarbonilo, \alpha,\alpha-dimetil-3,5-dimetoxibenciloxi-carbonilo, o-nitrofenilsulfenilo, 2-ciano-t-butiloxi-carbonilo. El grupo protector 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) es particularmente preferido para la síntesis de fragmentos peptídicos de Kringle 5. Otros grupos protectores de la cadena lateral preferidos son, para los grupos amino de la cadena lateral como lisina y arginina, 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo (pmc), nitro, p-toluenosulfonilo, 4-metoxibencenosulfonilo, Cbz, Boc y adamantiloxicarbonilo; para tirosina, bencilo, o-bromobenciloxicarbonilo, 2,6-diclorobencilo, isopropilo, t-butilo (t-Bu), ciclohexilo, ciclopentilo y acetilo (Ac); para serina, t-butilo, bencilo y tetrahidropiranilo; para histidina, tritilo, bencilo, Cbz, p-toluensulfonilo y 2,4-dinitrofenilo; para triptófano, formilo; para ácido aspártico y ácido glutámico, bencilo y t-butilo y para cisteína, trifenilmetilo (tritilo). En el método de síntesis peptídica en fase sólida, el aminoácido C-terminal \alpha es unido a un soporte sólido o resina adecuados. Los soportes sólidos adecuados útiles para la síntesis anterior son aquellos materiales que son inertes a los reactivos y a las condiciones de reacción de las reacciones graduales de condensación-desprotección, además de ser insolubles en el medio utilizado. El soporte sólido preferido para la síntesis de péptidos carboxi C-terminales \alpha es 4-hidroximetilfenoxi-metil-copoli(estireno-divinilbenceno 1%). El soporte sólido preferido para los péptidos amida C-terminal \alpha es la resina 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)fenoxiacetamidoetilo obtenible en Applied Biosystems (Foster City, CA). El aminoácido C-terminal \alpha es acoplado a la resina por medio de acoplamiento mediado por N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC), N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC) o hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU), con o sin 4-dimetilaminopiridina (DMAP), 1-hidroxibenzotriazol (HOBT), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tris(dimetilamino)fosfonio (BOP) o cloruro de bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfina (BOPCl), de 1 hora aproximadamente a 24 horas aproximadamente a una temperatura de entre 10ºC y 50ºC en un solvente tal como diclorometano o DMF. Cuando el soporte sólido es la resina de 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)fenoxi-acetamidoetilo, el grupo Fmoc es cortado con una amina secundaria, preferiblemente piperidina, antes del acoplamiento con el aminoácido C-terminal \alpha según se describió anteriormente. El método preferido de acoplamiento a la resina de 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)fenoxi-acetamidoetilo desprotegida es hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU, 1 equivalente) y 1-hidroxibenzotriazol (HOBT, 1 equivalente) en DMF. El acoplamiento de los aminoácidos protegidos sucesivos puede ser llevado a cabo en un sintetizador de polipéptidos automático según es bien conocido en la técnica. En una realización preferida, el N-terminal \alpha de los aminoácidos de la cadena peptídica en crecimiento está protegido con Fmoc. La eliminación del grupo protector Fmoc del lado N-terminal \alpha del péptido en crecimiento se lleva a cabo mediante tratamiento con una amina secundaria, preferiblemente piperidina. Cada aminoácido protegido es introducido posteriormente en un exceso molar de 3 veces aproximadamente, y el acoplamiento se lleva a cabo preferiblemente en DMF. El agente de acoplamiento es normalmente hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU, 1 equivalente) y 1-hidroxibenzotriazol (HOBT, 1 equivalente). Al final de la síntesis en fase sólida, el polipéptido es extraído de la resina y desprotegido, ya sea sucesivamente o en una única operación. La extracción del polipéptido y la desprotección pueden ser realizadas en una única operación tratando el polipéptido unido a la resina con un reactivo de corte que comprende tianisol, agua, etanoditiol y ácido trifluoroacético. En los casos en los que el C-terminal \alpha del polipéptido sea una alquilamida, la resina será cortada por aminolisis con una alquilamina. Alternativamente, el péptido puede ser extraído mediante transesterificación, por ejemplo, con metanol, seguido por aminolisis o por transamidación directa. El péptido protegido puede ser purificado en este punto o llevado directamente a la etapa siguiente. La eliminación de los grupos protectores de la cadena lateral se realiza utilizando el cóctel de corte anteriormente descrito. El péptido totalmente desprotegido es purificado por una secuencia de etapas cromatográficas, empleando cualquiera de, o todos, los tipos siguientes: intercambio iónico en una resina débilmente básica (forma de acetato); cromatografía de adsorción hidrofóbica sobre poliestireno-divinilbenceno no derivatizado (por ejemplo, Amberlita XAD); cromatografía de adsorción sobre gel de sílice; cromatografía de intercambio iónico en carboximetilcelulosa; cromatografía de reparto, por ejemplo en Sephadex G-25, LH-20 o distribución contracorriente; cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), especialmente HPLC de fase reversa en una columna rellena de una fase unida a octil- u octadecilsilil-sílice. Los pesos moleculares de estos fragmentos peptídicos de Kringle 5 son determinados utilizando Espectroscopía de Masas por Bombardeo con Átomos Rápido (FAB). La síntesis en fase sólida de fragmentos peptídicos de Kringle 5 está ilustrada en los Ejemplos 1 a 12.

Dependiendo de cómo son producidos, un fragmento peptídico de K5 o una proteína de fusión de K5 pueden existir con o sin los enlaces disulfuro anteriormente mencionados de la región Kringle 5 del plasminógeno de mamífero o, en el caso de una proteína de fusión con otras regiones Kringle de mamífero, con o sin los enlaces disulfuro de esas regiones correspondientes, o pueden existir con enlaces disulfuro que formen una estructura terciaria que difiera de la estructura terciaria encontrada en el plasminógeno de mamífero nativo. Los fragmentos peptídicos de Kringle 5 producidos mediante corte enzimático de Glu-, Lys- o miniplasminógeno con elastasa y/o pepsina (enzimas que cortan en sitios extraídos de los enlaces de cisteína) contendrán la estructura terciaria de la proteína Kringle 5 nativa; los fragmentos peptídicos de Kringle 5 preparados mediante síntesis peptídica en fase sólida pueden contener o no residuos de aminoacilo cistilo y los fragmentos peptídicos de Kringle 5 preparados por expresión pueden contener enlaces disulfuro en posiciones diferentes de las encontradas en los fragmentos peptídicos de Kringle 5 producidos por corte enzimático.

Los compuestos de la invención, incluyendo los especificados en los ejemplos, poseen actividad antiangiogénica. Como inhibidores de la angiogénesis, tales compuestos son útiles en el tratamiento de tumores sólidos y carcinomas primarios y metastásicos de mama; colon; recto; pulmón; orofaringe; hipofaringe; esófago; estómago; páncreas; hígado; vesícula biliar; conductos biliares; intestino delgado; tracto urinario incluyendo riñón, vejiga y urotelio; tracto genital femenino incluyendo cérvix, útero, ovarios, coriocarcinoma y enfermedad trofoblástica gestacional; tracto genital masculino incluyendo próstata, vesículas seminales, testículos y tumores de células germinales; glándulas endocrinas incluyendo tiroides, adrenales y pituitaria; piel incluyendo hemangiomas, melanomas, sarcomas originados en hueso o tejidos blandos y sarcoma de Kaposi; tumores del cerebro, nervios, ojos y meninges incluyendo astrocitomas, gliomas, glioblastomas, retinoblastomas, neuromas, neuroblastomas, Schwannomas y meningiomas; tumores sólidos derivados de enfermedades malignas hematopoyéticas tales como leucemias e incluyendo cloromas, plasmacitomas, placas y tumores de micosis fungoides y linfoma/leucemia de células T cutáneos; linfomas incluyendo linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin; profilaxis de enfermedades autoinmunes incluyendo artritis reumatoide, inmune y degenerativa; enfermedades oculares incluyendo retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, rechazo de trasplantes de córnea, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, rubeosis, neovascularización de la retina debida a degeneración macular e hipoxia; condiciones anormales de neovascularización del ojo; enfermedades cutáneas incluyendo psoriasis; enfermedades de los vasos sanguíneos incluyendo hemangiomas y proliferación capilar en las placas ateroscleróticas; Síndrome de Osler-Webber; angiogénesis del miocardio; neovascularización de placas; telangiectasia; articulaciones del hemofílico; angiofibroma; granulación de heridas; enfermedades caracterizadas por una estimulación excesiva o anormal de las células endoteliales incluyendo adhesiones intestinales, Enfermedad de Crohn, aterosclerosis, escleroderma y cicatrices hipertróficas (esto es, queloides) y enfermedades que tienen angiogénesis como consecuencia patológica, incluyendo la enfermedad por arañazo de gato (Rochele minalia quintosa) y úlceras (Helicobacter pylori). Otra utilización es como agente para el control de la natalidad que inhibe la ovulación y la formación de la placenta.

Los compuestos de la presente invención pueden ser también útiles para la prevención de metástasis procedentes de los tumores anteriormente descritos cuando son utilizados solos o en combinación con radioterapia y/u otros tratamientos quimioterapéuticos convencionalmente administrados a los pacientes para el tratamiento de enfermedades angiogénicas. Por ejemplo, cuando se utilicen en el tratamiento de tumores sólidos, los compuestos de la presente invención pueden ser administrados con agentes quimioterapéuticos tales como interferón alfa, COMP (ciclofosfamida, vincristina, metotrexato y prednisona), etopósido, mBACOD (metotrexano, bleomicina, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina y dexametasona), PRO-MACE/MOPP (prednisona, metotrexato (con rescate por leucovorin), doxorrubicina, ciclofosfamida, taxol, etopósido/mecloretamina, vincristina, prednisona y procarbazina), vincristina, vinblastina, angioinhibinas, TNP-470, pentosán polisulfato, factor plaquetario 4, angioestatina, LM-609, SU-101, CM-101, Techgalan, talidomida, SP-PG y similares. Otros agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como las mostazas nitrogenadas incluyendo mecloretamina, melfalano, clorambucilo, ciclofosfamida e ifosfamida; nitrosoureas incluyendo carmustina, lomustina, semustina y estreptozocina; sulfonatos de alquilo incluyendo busulfano; triazinas incluyendo dacarbazina; etileniminas incluyendo tiotepa y hexametilmelamina; análogos de ácido fólico incluyendo metotrexato; análogos de pirimidinas incluyendo 5-fluorouracilo, arabinósido de citosina; análogos de purinas incluyendo 6-mercaptopurina y 6-tioguanina; antibióticos antitumorales incluyendo actinomicina D; antraciclinas incluyendo doxorrubicina, bleomicina, mitomicina C y metramicina; hormonas y agonistas hormonales incluyendo tamoxifeno y corticoesteriores y agentes varios incluyendo cisplatino y brequinar. Por ejemplo, un tumor puede ser tratado convencionalmente con cirugía, radiación o quimioterapia y administración de Kringle 5 con una administración posterior de Kringle 5 para prolongar la inactividad de las micrometástasis y para estabilizar e inhibir el crecimiento de cualquier tumor primario residual.

Agentes citotóxicos tales como ricina pueden ser ligados a fragmentos peptídicos de Kringle 5 y proporcionar de este modo una herramienta para la destrucción de células que se unan a Kringle 5. Los péptidos ligados a agentes citotóxicos pueden ser infundidos de una manera diseñada para maximizar la administración al lugar deseado. Por ejemplo, pueden administrarse fragmentos de Kringle 5 de alta afinidad unidos a ricina mediante una cánula directamente a la diana o a los vasos que irrigan el sitio diana. Tales agentes pueden ser administrados también de manera controlada mediante bombas osmóticas acopladas a cánulas de infusión. Una combinación de antagonistas de Kringle 5 puede ser coaplicada con estimuladores de la angiogénesis con el fin de incrementar la vascularización del tejido. Regímenes terapéuticos de este tipo podrían proporcionar un medio eficaz para la destrucción de cáncer metastásico.

Los compuestos de la presente invención pueden ser utilizados en forma de sales farmacéuticamente aceptables derivadas de ácidos inorgánicos u orgánicos. Por "sal farmacéuticamente aceptable" se hace referencia a aquellas sales que son, dentro del ámbito del juicio médico bien fundamentado, adecuadas para ser utilizadas en contacto con los tejidos de humanos y animales inferiores sin toxicidad, irritación, respuestas alérgicas excesivas y similares en proporción a una relación beneficio/riesgo razonable. Las sales farmacéuticamente aceptables son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, S.M. Berge y col. describen con detalle sales farmacéuticamente aceptables en J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66: 1 y siguientes.

Las sales pueden ser preparadas in situ durante el aislamiento y la purificación finales de los compuestos de la invención o bien separadamente haciendo reaccionar una función base libre con un ácido orgánico adecuado. Sales de adición de ácido representativas incluyen, acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato, benzoato, becenosulfonato, bisulfato, butirato, canforato, canforsulfonato, digluconato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, fumarato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxietansulfonato (isotionato), lactato, maleato, metanosulfonato, nicotinato, 2-naftalensulfonato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, fosfato, glutamato, bicarbonato, p-toluensulfonato y undecanoato. Además, los grupos que contienen nitrógeno básico pueden ser cuaternizados con agentes tales como haluros de alquilo inferior tales como cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo; dialquil sulfatos como dimetil, dietil, dibutil y diamil sulfatos; haluros de cadena larga tales como cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo; haluros de arilalquilo como bromuros de bencilo y fenetilo y otros. De este modo se obtienen productos solubles o dispersables en agua o en aceite. Ejemplos de ácidos que pueden ser empleados para formar sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables incluyen ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico y ácidos orgánicos tales como ácido oxálico, ácido maleico, ácido succínico y ácido cítrico.

Pueden prepararse sales de adición básicas in situ durante el aislamiento y la purificación finales de los fragmentos peptídicos de Kringle 5 mediante la reacción de un resto conteniendo ácido carboxílico con una base adecuada tal como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión metálico farmacéuticamente aceptable, o con amonio o una amina orgánica primaria, secundaria o terciaria. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen cationes basados en metales alcalinos o metales alcalinotérreos tales como sales de litio, sodio, potasio, calcio, magnesio y aluminio, y cationes no tóxicos de amina y amonio cuaternarios incluyendo amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, dietilamina, etilamina. Otras aminas orgánicas representativas útiles para la formación de sales de adición de base incluyen etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperidina, piperazina. Las sales preferidas de los compuestos de la invención incluyen fosfato, tris y acetato.

Los fragmentos peptídicos de Kringle 5, antisueros hacia Kringle 5, agonistas del receptor de Kringle 5, antagonistas del receptor de Kringle 5 o combinaciones de los mismos pueden ser combinados con matrices de liberación mantenida farmacéuticamente aceptables, tales como polímeros biodegradables, para formar composiciones terapéuticas. Una matriz de liberación mantenida, según se utiliza en la presente, es una matriz compuesta por materiales, normalmente polímeros, que son degradables por hidrólisis enzimática o por hidrólisis ácida-básica o por disolución. Una vez insertada en el organismo, actúan sobre la matriz enzimas y fluidos corporales. Una matriz de liberación mantenida es elegida deseablemente de materiales biocompatibles tales como liposomas, poliláctidos (ácido poliláctico), poliglicólido (polímero del ácido glicólico), polianhídridos de poliláctido coglicólido (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico), poli(orto)ésteres, polipéptidos, ácido hialurónico, colágeno, condroitín sulfato, ácidos carboxílicos, ácidos grasos, fosfolípidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, poliaminoácidos, aminoácidos tales como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleótidos, polivinil propileno, polivinilpirrolidona y silicona. Una matriz biodegradable preferida es una matriz de poliláctido, poliglicólido o poliláctido coglicólido (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico).

Fragmentos peptídicos de Kringle 5, proteínas de fusión de Kringle 5, agonistas del receptor de Kringle 5, antagonistas del receptor de Kringle 5 o combinaciones de los mismos pueden ser combinados con excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables para formar composiciones terapéuticas. Un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere a un material de carga no tóxico, sólido, semisólido o líquido, un diluyente, material para encapsulación o productos auxiliares para la formulación de cualquier tipo. Las composiciones pueden ser administradas parenteralmente, sublingualmente, intracisternalmente, intravaginalmente, intraperitonealmente, rectalmente, bucalmente o tópicamente (mediante polvo, ungüento, gotas, parche transdérmico o dispositivo de iontoforesis).

El término "parenteral", según se utiliza en la presente, se refiere a modos de administración que incluyen inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, subcutánea e intraarticular. Las composiciones farmacéuticas para inyección parenteral comprenden soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas, estériles, farmacéuticamente aceptables además de polvos estériles para reconstitución en soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de su utilización. Ejemplos de transportadores, diluyentes, solventes o vehículos acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilén glicol, polietilén glicol y similares), carboximetilcelulosa y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tal como aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede ser mantenida mediante, por ejemplo, la utilización de materiales de revestimiento tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y por la utilización de surfactantes. Estas composiciones pueden contener además adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de microorganismos puede ser asegurada por la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos tales como parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico. Puede ser deseable también incluir agentes isotónicos tales como azúcares, cloruro de sodio. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede ser producida por la inclusión de agentes tales como monoestearato de aluminio y gelatina, que retrasan la absorción. Las formas depot inyectables se producen mediante la formación de matrices de microencapsulación del fármaco en polímeros biodegradables tales como poliláctido-poliglicólido, poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Dependiendo de la proporción de fármaco respecto a polímero y de la naturaleza del polímero particular empleado, puede controlarse la velocidad de liberación del fármaco. Se preparan también formulaciones inyectables depot mediante el atrapamiento del fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales. Las formulaciones inyectables pueden ser esterilizadas, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro que retenga las bacterias o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que pueden ser disueltas o dispersadas en agua estéril o en otros medios inyectables estériles justo antes de su utilización.

La administración tópica incluye la administración a la piel, mucosas y superficies del pulmón y del ojo. Las composiciones para administración tópica, incluyendo las composiciones para inhalación, pueden ser preparadas como un polvo seco que puede estar presurizado o no presurizado. En las composiciones de polvo no presurizado, el ingrediente activo en forma dividida finamente puede ser utilizado en mezcla con un vehículo inerte farmacéuticamente aceptable de mayor tamaño que contenga partículas con un tamaño de, por ejemplo, hasta 100 micrometros de diámetro. Los vehículos inertes adecuados incluyen azúcares tales como lactosa. De forma deseable, al menos un 95% en peso de las partículas del ingrediente activo tienen un tamaño de partícula eficaz en el rango de 0,01 a 10 micrometros. Para la administración tópica en el ojo, un compuesto de la invención es administrado en un vehículo oftálmico farmacéuticamente aceptable de tal forma que el compuesto se mantenga en contacto con la superficie ocular durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que el compuesto penetre en la córnea y en las regiones internas del ojo, como por ejemplo la cámara anterior, la cámara posterior, el cuerpo vítreo, el humor acuoso, el humor vítreo, la córnea, el iris/cuerpo ciliar, el cristalino, la coroides/retina y la esclerótica. El vehículo oftálmico farmacéuticamente aceptable puede ser, por ejemplo, un ungüento, un aceite vegetal o un material de encapsulación. Alternativamente, un compuesto de la invención puede ser inyectado directamente en el humor vítreo y en el humor acuoso.

La composición puede ser presurizada y contener un gas comprimido tal como nitrógeno o un gas licuado propulsor. El medio propulsor licuado y de hecho la composición total es preferiblemente de tal forma que el ingrediente activo no se disuelva en el mismo en un grado sustancial. La composición presurizada puede contener también un agente surfactante tal como un agente surfactante no iónico líquido o sólido, o puede ser un agente surfactante aniónico sólido. Se prefiere utilizar el agente surfactante aniónico sólido en forma de una sal de sodio.

Las composiciones para administración rectal o vaginal son preferiblemente supositorios que pueden ser preparados mezclando los compuestos de esta invención con excipientes o vehículos no irritantes adecuados tales como manteca de cacao, polietilén glicol o cera para supositorios, que son sólidos a temperatura ambiente pero líquidos a la temperatura corporal y por tanto se funden en el recto o en la cavidad vaginal y liberan el compuesto activo.

Los compuestos de la presente invención pueden ser administrados también en forma de liposomas. Según es conocido en la técnica, los liposomas derivan generalmente de fosfolípidos o de otras sustancias lipídicas. Los liposomas están formados por cristales líquidos hidratados mono o multilamelares que son dispersados en un medio acuoso. Puede utilizarse cualquier lípido no tóxico, fisiológicamente aceptable y metabolizable capaz de formar liposomas. Las presentes composiciones en forma de liposomas pueden contener, además de un compuesto de la presente invención, estabilizantes, conservantes, excipientes y similares. Los lípidos preferidos son los fosfolípidos y las fosfatidil colinas (lecitinas), naturales y sintéticos. Los métodos para formar liposomas son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volumen XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), página 33 y siguientes.

Cuando se utilizan en los tratamientos anteriores o en otros tratamientos, una cantidad terapéuticamente eficaz de uno de los compuestos de la presente invención puede ser empleada en forma pura o, si tal forma existe, en forma de sal farmacéuticamente aceptable y con o sin un excipiente farmacéuticamente aceptable. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" del compuesto de la invención significa una cantidad suficiente del compuesto para tratar una enfermedad angiogénica (por ejemplo, para limitar el crecimiento de un tumor o para enlentecer o bloquear las metástasis tumorales) con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. Se comprenderá, sin embargo, que la utilización diaria total de los compuestos y composiciones de la presente invención será decidida por el médico asistente dentro del ámbito del juicio médico bien fundamentado. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores, incluyendo la enfermedad que esté siendo tratada y la gravedad de la enfermedad; de la actividad el compuesto específico empleado; de la composición específica empleada; de la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; de la hora de administración; de la vía de administración; de la velocidad de excreción del compuesto específico empleado; de la duración del tratamiento; de los fármacos utilizados en combinación, o simultáneamente, con el compuesto específico empleado y de factores similares bien conocidos en la técnicas médicas. Por ejemplo, está dentro de la experiencia en la técnica comenzar con dosis del compuesto a niveles inferiores que los requeridos para conseguir el efecto terapéutico deseado, e incrementar gradualmente la dosis hasta que se consiga el efecto deseado. La dosis diaria total de los fragmentos peptídicos de Kringle 5 o de las proteínas de fusión de Kringle 5 para ser administrada localmente o sistémicamente a un humano o a otro huésped mamífero en dosis únicas o divididas, puede ser de cantidades de, por ejemplo, 0,0001 a 200 mg/kg de peso corporal diariamente y más habitualmente de 1 a 300 mg/kg de peso corporal. Si se desea, la dosis diaria eficaz puede ser dividida en múltiples dosis para la administración. Por consiguiente, composiciones de una única dosis pueden contener cantidades o submúltiplos de las mismas de tal forma que constituyan la dosis diaria.

Se comprenderá que los agentes que pueden ser combinados con el compuesto de la presente invención para la inhibición, tratamiento o profilaxis de enfermedades angiogénicas, no están limitados a los enumerados anteriormente sino que incluyen, en principio, cualquier agente útil para el tratamiento o la profilaxis de enfermedades angiogénicas.

La presente invención proporciona también polinucleótidos aislados que codifican un fragmento peptídico o una proteína de fusión de Kringle 5 de mamífero que tienen actividad inhibidora de la angiogénesis. Tales polinucleótidos pueden ser utilizados para la expresión de fragmentos peptídicos de Kringle 5 recombinantes o en terapia génica (según se describe más adelante).

Un polinucleótido de la presente invención puede estar en forma de ARNm o de ADN. Polinucleótidos en forma de ADN, ADNc, ADN genómico y ADN sintético están dentro del ámbito de la presente invención. El ADN puede ser de doble hebra o de hebra sencilla y si es de hebra sencilla puede ser la hebra codificadora (sentido) o la hebra no codificadora (antisentido). Un polinucleótido de la invención puede ser una forma no modificada o incluir una modificación tal como metilación o formación de casquetes.

La secuencia codificadora que codifica el polipéptido puede ser idéntica a la secuencia codificadora proporcionada en la presente o bien puede ser una secuencia codificadora diferente, secuencia codificadora que, como resultado de la redundancia o de la degeneración del código genético, codifique el mismo polipéptido que el ADN proporcionado en la presente. Este polinucleótido puede incluir solamente la secuencia codificadora del polipéptido, o la secuencia codificada del polipéptido y secuencias codificadoras adicionales tales como una secuencia líder o secretora o una secuencia de una proproteína, o la secuencia codificadora del polipéptido (y opcionalmente una secuencia codificadora adicional) y una secuencia no codificadora tal como una secuencia no codificadora 5' y/o 3' de la secuencia que codifica el polipéptido.

Además, la invención incluye polinucleótidos variantes que contienen modificaciones tales como deleciones, sustituciones o adiciones del polinucleótido; y cualquier modificación del polipéptido resultante de la secuencia polinucleotídica variante. Un polinucleótido de la presente invención puede tener también una secuencia codificadora que sea una variante alélica existente de forma natural de la secuencia codificada proporcionada en la presente.

Además, la secuencia codificadora del polipéptido puede estar fusionada en el mismo marco de lectura a una secuencia polinucleotídica que facilite la expresión y la secreción de un polipéptido a partir de una célula huésped, por ejemplo una secuencia líder que funcione como secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido desde la célula. El polipéptido que tiene una secuencia líder es una preproteína y la secuencia líder puede ser cortada por la célula huésped para formar el polipéptido. Los polinucleótidos pueden codificar también una proproteína que sea la proteína más residuos de aminoácido 5' adicionales. Una proteína que tiene una prosecuencia es una proproteína y puede ser en algunos casos una forma inactiva de la proteína. Una vez que la prosecuencia es cortada, queda una proteína activa. Por tanto, el polinucleótido de la presente invención puede codificar una proteína, o una proteína que tenga una prosecuencia o una proteína que tenga una presecuencia (secuencia líder) y una prosecuencia.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden tener también la secuencia codificadora fusionada en marco con una secuencia marcadora que permita la purificación del polipéptido de la presente invención. La secuencia marcadora puede ser una marca GST suministrada por un vector pGEX para proporcionar la purificación del polipéptido fusionado al marcador en el caso de un huésped bacteriano o, por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una marca hemaglutinina (HA) cuando se utilice un huésped mamífero, por ejemplo células COS-7. La marca HA corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe. Ver, por ejemplo, I. Wilson y col., Cell, 37: 767 (1984).

El polinucleótido puede ser generado de cualquier manera, incluyendo síntesis química, replicación, transcripción inversa o transcripción, que se base en la información proporcionada por la secuencia de bases de la(s) región(es) de la(s) que deriva el polinucleótido; así, puede representar una orientación sentido o antisentido del polinucleótido original. Un método preferido para generar un polinucleótido es mediante la reacción en cadena de la polimerasa descrita en las Patentes de EE.UU. 4.683.195 y 4.683.202.

Se contempla que se considerará que los polinucleótidos hibridan con las secuencias proporcionadas en la presente si hay al menos un 50%, y preferiblemente al menos un 70%, de identidad entre el polinucleótido y la secuencia.

La presente invención proporciona también vectores que incluyen polinucleótidos de la presente invención, células huésped que están manipuladas genéticamente con los vectores de la presente invención y métodos para producir los polipéptidos de la presente invención mediante técnicas recombinantes. Tales métodos comprenden el cultivo de las células huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión del polinucleótido derivado de Kringle 5 y la recuperación del polipéptido derivado de Kringle 5 a partir del cultivo celular.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden ser empleados para producir un polipéptido mediante técnicas recombinantes. Así, la secuencia polinucleotídica puede ser incluida en alguno de una variedad de vehículos de expresión, en particular vectores o plásmidos para expresar un polipéptido. Tales vectores incluyen secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, por ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fagos; plásmidos de levaduras; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, ADN vírico tal como vaccinia, adenovirus, poxvirus de las aves de corral y pseudorrabia. Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro plásmido o vector siempre que sea replicable y viable en el huésped.

La secuencia de ADN apropiada puede ser insertada en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN es insertada en sitios apropiados de endonucleasas de restricción mediante procedimientos conocidos en la técnica. Se considera que tales procedimientos y otros están dentro del alcance de los expertos en la técnica. La secuencia de ADN en el vector de expresión está unida operativamente a secuencia(s) para el control de la expresión apropiada(s) (promotores) para dirigir la síntesis de ARNm. Ejemplos representativos de tales promotores incluyen:

El promotor de LTR o de SV40, el promotor lac o trp de E. coli, el promotor P sub L del fago lambda y otros promotores conocidos para controlar la expresión de genes en células procarióticas o eucarióticas o en sus virus. El vector de expresión contiene también un sitio de unión de ribosomas para el inicio de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector puede incluir también secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Además, los vectores de expresión contienen preferiblemente un gen con el fin de proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de las células huésped transformadas tal como resistencia a dihidrofolato reductasa o a neomicina para el cultivo de células eucarióticas, o tal como resistencia a tetraciclina o a ampicilina en E. coli.

El vector que contiene la secuencia de ADN apropiada según se describió en la presente anteriormente, además de una secuencia promotora o control apropiada, puede ser empleado para transformar un huésped apropiado con el fin de permitir que el huésped exprese la proteína. Como ejemplos representativos de huéspedes apropiados, pueden mencionarse: células bacterianas tales como E. coli, Salmonella typhimurium; especies de Streptomyces; células fúngicas tales como levaduras; células de insecto tales como de Drosophila y Sf9; y células animales tales como CHO, COS o Bowes, etc. Se considera que la selección de un huésped apropiado está dentro del alcance de las personas expertas en la técnica a partir de las descripciones proporcionadas en la presente.

Más particularmente, la presente invención incluye también construcciones recombinantes que contienen una o más de la secuencias según se describió en líneas generales anteriormente. Las construcciones contienen un vector, tal como un plásmido o un vector vírico, en el cual se ha insertado una secuencia de la invención en orientación directa o inversa. En un aspecto preferido de esta realización, la construcción contiene además secuencias reguladoras incluyendo, por ejemplo, un promotor, unidas operativamente a la secuencia. Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores y promotores adecuados, y están disponibles comercialmente. Los vectores siguientes se proporcionan a manera de ejemplo. Bacterianos: pSPORT1 (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD), pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBs, Phagescript, psiX174, pBluescript SK, pBsKS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene®, La Jolla, CA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRITS (Pharmacia®). Eucarióticos: pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene®), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia®). Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro plásmido o vector siempre que sea replicable y viable en el huésped.

Pueden seleccionarse regiones promotoras procedentes de cualquier gen deseado utilizando vectores con CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7. Promotores bacterianos especificados particulares incluyen lacI, lacZ, T3, SP6, T7, gpt, P sub R, P sub L y trp de lambda. Los promotores eucarióticos incluyen el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), el promotor de la timidina quinasa del virus del herpes simple (VHS), los promotores temprano y tardío de SV40, LTRs de retrovirus y el promotor de la metalotioneína-I de ratón. La selección del vector y el promotor apropiados está dentro del nivel de experiencia habitual en la técnica.

En una realización adicional, la presente invención proporciona células huésped que contienen la construcción anteriormente descrita. La célula huésped puede ser una célula eucariótica superior tal como una célula de mamífero, o una célula eucariótica inferior tal como una célula de levadura, o la célula huésped puede ser una célula procariótica tal como una célula bacteriana. La introducción de la construcción en la célula huésped puede ser efectuada mediante transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-Dextrano o por electroporación (L. Davis y col., "Basic Methods in Molecular Biology", 2ª edición, Appleton y Lang, Paramount Publishing, East Norwalk, CT (1994)).

Las construcciones en las células huésped pueden ser utilizadas de manera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante. Alternativamente, los polipéptidos de la invención pueden ser producidos sintéticamente con sintetizadores de péptidos convencionales.

Las proteínas pueden ser expresadas en células de mamífero, levaduras, bacterias u otras células bajo el control de los promotores apropiados. Pueden emplearse también sistemas de traducción sin células para producir tales proteínas utilizando ARNs derivados de las construcciones de ADN de la presente invención. Vectores de clonaje y expresión apropiados para ser utilizados con huéspedes procarióticos y eucarióticos están descritos por Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).

La transcripción de un ADN que codifique los polipéptidos de la presente invención por eucariotas superiores es incrementada por la inserción de una secuencia intensificadora en el vector. Los intensificadores son elementos de ADN que actúan en cis, normalmente de 10 a 300 pb aproximadamente, que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Ejemplos incluyen el intensificador de SV40 al final del lado del origen de replicación (pb 100 a 270), un intensificador del promotor temprano de citomegalovirus, un intensificador de polioma al final del lado del origen de replicación e intensificadores de adenovirus.

Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permitan la transformación de la célula huésped, por ejemplo, el gen de resistencia a ampicilina de E. coli y el gen de TRP1 de S. cerevisiae, y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural corriente abajo. Tales promotores pueden derivar de operones que codifiquen enzimas glicolíticos tales como 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), factor alfa, fosfatasa ácida, o proteínas del choque térmico, entre otros. La secuencia estructural heteróloga está ensamblada en fase apropiada con secuencias de inicio y terminación de la traducción y, preferiblemente, con una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida al espacio periplásmico o al medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluya un péptido de identificación N-terminal que imparta características deseadas, por ejemplo la estabilización o la purificación simplificada del producto recombinante expresado.

Los vectores de expresión útiles para uso bacteriano son construidos insertando una secuencia de ADN estructural que codifique una proteína deseada junto con señales adecuadas para el inicio y la terminación de la traducción en fase de lectura operativa con un promotor funcional. El vector contendrá uno o más marcadores fenotípicos seleccionables y un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector y para, si es deseable, proporcionar la amplificación en el huésped. Huéspedes procarióticos adecuados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y varias especies del género Pseudomonas; Streptomyces y Staphylococcus, aunque pueden emplearse otros también como cuestión de elección rutinaria.

Los vectores de expresión útiles para uso bacteriano contienen un marcador seleccionable y un origen de replicación bacteriano derivado de plásmidos que contienen elementos genéticos del vector de clonaje bien conocido pBR322 (ATCC 37017). Otros vectores incluyen:

pKK223-3 (Pharmacia® Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI). Estas secciones del "esqueleto" de pBR322 son combinadas con un promotor apropiado y con la secuencia estructural que va a ser expresada.

Los vectores de expresión útiles pueden contener también una pareja de fusión para facilitar la purificación de un polipéptido de la invención deseado o para producir polipéptidos solubles. Ejemplos de vectores de fusión comerciales incluyen pET32a (Novagen, Madison, WI), pGEX-4T-2 (Pharmacia®) y pCYB3 (New England Biolabs, Beverly, MA). Otro vector de fusión útil es pHil-D8 cuya estructura y preparación se describen en profundidad en el Ejemplo 19 parte B. Pueden construirse también vectores de expresión que eviten la utilización de parejas de fusión, particularmente para un nivel de expresión elevado de fragmentos peptídicos o proteínas de fusión de Kringle 5 en células bacterianas. Por ejemplo, pueden producirse vectores para optimizar el acoplamiento traduccional según está descrito por Pilot-Matias, T.J. y col., en Gene, 128: 219-225 (1993). Alternativamente, un polinucleótido de la invención puede ser coexpresado con un plásmido accesorio separado que codifique él mismo una proteína o péptido que facilite la solubilización del primer péptido de interés (ver, por ejemplo, Makrides, S.C., Microbiological Reviews, 60: 512 (1996)). Por ejemplo, ciertos fragmentos peptídicos de Kringle 5 (que se ha demostrado que son producidos como proteínas de fusión solubles con tiorredoxina (ver el Ejemplo 20)) pueden ser expresados a partir de un vector que no sea de fusión simultáneamente con (esto es, en la misma célula huésped que) un segundo vector que exprese tiorredoxina.

Después de la transformación de una cepa huésped adecuada y del cultivo de la cepa huésped hasta una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado es desreprimido mediante medios apropiados (por ejemplo, desplazamiento de la temperatura o inducción química) y las células son cultivadas durante un periodo adicional. Las células son típicamente recogidas por centrifugación, sometidas a ruptura por medios físicos o químicos y el extracto bruto resultante retenido para una purificación posterior. Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden ser sometidas a ruptura mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica o utilización de agentes de lisis celular; tales métodos son bien conocidos por el técnico habitual.

Pueden emplearse también varios sistemas de cultivo de células de mamífero para expresar proteínas recombinantes. Ejemplos de sistemas de expresión de mamífero incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono descritas por Gluzman, Cell, 23: 175 (1981) y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, tales como las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamífero contendrán un origen de replicación, un promotor y una intensificador adecuados y también los sitios de unión de ribosomas necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de ayuste, secuencias de terminación de la transcripción y secuencias 5' flanqueantes no transcritas. Pueden utilizarse secuencias de ADN derivadas del genoma vírico de SV40, por ejemplo, el origen, el promotor temprano, el intensificador, los sitios de ayuste y poliadenilación de SV40 para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos. Vectores útiles representativos incluyen pRc/CMV y pcDNA3 (disponibles en Invitrogen, San Diego, CA).

Los compuestos, composiciones, vectores y células de acuerdo con la presente invención pueden ser utilizados en el contexto de terapia génica, mediante la cual el gen que codifica los fragmentos peptídicos de Kringle 5 o conjugados de los fragmentos peptídicos de Kringle 5 es regulado en un paciente.

Varios métodos para transferir o administrar ADN a células para la expresión de la proteína producto del gen, por lo demás referidos como terapia génica, están descritos en Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo, N. Yang, Crit. Rev. Biotech., 12(4): 335-356 (1992). La terapia génica incluye la incorporación de secuencias polinucleotídicas en células somáticas o en células de la línea germinal para utilización en terapia ex vivo o in vivo. La terapia génica funciona sustituyendo genes, aumentando una función génica normal o anormal y combatiendo enfermedades infecciosas y otras patologías.

Las estrategias para tratar problemas médicos con terapia génica incluyen estrategias terapéuticas tales como la identificación del gen defectuoso y la adición posterior de un gen funcional con el fin de sustituir la función del gen defectuoso o de aumentar un gen ligeramente funcional, o bien estrategias profilácticas tales como la adición de un gen que codifique un producto proteico que tratará la condición o que hará al tejido o al órgano más susceptible a un régimen de tratamiento. Como ejemplo de estrategia profiláctica, un gen que codifique un fragmento peptídico de Kringle 5 o un conjugado de un fragmento peptídico de Kringle 5 puede ser colocado en un paciente e impedir así la aparición de angiogénesis, o bien podría insertarse un gen que hiciera que las células tumorales fueran más susceptibles a la radiación, de tal manera que la radiación del tumor produciría una destrucción incrementada de las células tumorales.

Muchos protocolos para la transferencia de ADN que codifique un fragmento peptídico de Kringle 5 o una proteína de fusión de Kringle 5 o para la transferencia de ADN de secuencias reguladoras de los fragmentos peptídicos de Kringle 5 (o las de la pareja de fusión) están previstos en esta invención. La transfección de secuencias promotoras, distintas de las asociadas específicamente con un fragmento peptídico de Kringle 5, o de otras secuencias que incrementarían la producción de fragmentos peptídicos de Kringle 5, están también previstas como métodos de terapia génica. Un ejemplo de esta tecnología se encuentra en Transkaryotic Therapies, Inc., de Cambridge, Massachusetts, que utiliza recombinación homóloga para insertar un "conmutador genético" que activa un gen de la eritropoyetina en las células, según está descrito en Genetic Engineering News, 15 de Abril de 1994.

Tales "conmutadores genéticos" podrían ser utilizados para activar un fragmento peptídico de Kringle 5 (o un receptor de Kringle 5) en células que no expresen normalmente estas proteínas.

Los métodos de transferencia de genes para terapia génica están dentro de tres categorías principales: (1) físicos (por ejemplo, electroporación, transferencia directa de genes y bombardeo de partículas), (2) químicos (por ejemplo, vehículos basados en lípidos y otros vectores no víricos) y (3) biológico (por ejemplo vectores derivados de virus). Por ejemplo, vectores no víricos tales como liposomas revestidos con ADN pueden ser inyectados directamente por vía intravenosa en el paciente. Se cree que los complejos liposoma/ADN se concentran en el hígado donde suministran el ADN a los macrófagos y a las células de Kupffer. Los vectores o el ADN "desnudo" del gen pueden ser también inyectados directamente en el órgano, tejido o tumor deseado para la administración vectorizada del ADN terapéutico.

Las metodologías de terapia génica pueden ser también descritas por el lugar de administración. Las vías fundamentales para suministrar genes incluyen la transferencia génica ex vivo, la transferencia génica in vivo y la transferencia génica in vitro. En la transferencia génica ex vivo, las células son tomadas del paciente y cultivadas en cultivo celular. El ADN es transfectado a las células y las células transfectadas son expandidas en número y posteriormente reimplantadas al paciente. En la transferencia génica in vitro, las células transformadas son células que crecen en cultivo, tales como células de un cultivo de tejidos, y no células particulares de un paciente particular. Estas "células de laboratorio" son transfectadas, y las células transfectadas son seleccionadas y expandidas para su implantación a un paciente o para otros usos. La transferencia génica in vivo implica la introducción del ADN en las células del paciente cuando las células están dentro del paciente. Estas tres categorías de amplia base descritas anteriormente, pueden ser todas utilizadas para conseguir la transferencia génica in vivo, ex vivo e in vitro.

Los métodos mecánicos (esto es físicos) para la administración de ADN pueden conseguirse mediante microinyección del ADN en células germinales o somáticas, mediante partículas revestidas con ADN administradas neumáticamente tales como las partículas de oro utilizadas en una "pistola de genes" y mediante procedimientos de química inorgánica tales como transfección con fosfato de calcio. Se ha encontrado que la inyección física de ADN plasmídico en células musculares produce un alto porcentaje de células que son transfectadas y tienen una expresión mantenida de los genes marcadores. El ADN plasmídico puede integrarse o no en el genoma de las células. La no integración del ADN transfectado permitiría la transfección y la expresión de las proteínas producto del gen en tejidos no proliferativos, diferenciados terminalmente, durante un periodo de tiempo prolongado, sin peligro de inserciones, deleciones o alteraciones mutacionales en el genoma celular o mitocondrial. La transferencia de genes terapéuticos de larga duración, pero no necesariamente permanente, a células específicas puede proporcionar tratamientos para enfermedades genéticas o para uso profiláctico. El ADN podría ser reinyectado periódicamente con el fin de mantener el nivel del producto génico sin que ocurran mutaciones en los genomas de las células receptoras. La no integración de los ADNs exógenos puede permitir la presencia de varias construcciones de ADN exógeno diferentes dentro de una célula, expresando todas las construcciones varios productos génicos.

Puede emplearse también transferencia génica mediada por partículas para inyectar ADN en células, tejidos y órganos. Con un dispositivo para el bombardeo de partículas, o "pistola de genes", se genera una fuerza motriz para acelerar partículas de alta densidad revestidas con ADN (tal como de oro o tungsteno) hasta una velocidad elevada que permita la penetración en los órganos, tejidos o células diana. La electroporación para transferencia génica utiliza una corriente eléctrica para hacer susceptibles a las células o tejidos a la transferencia de genes mediada por electroporación. Se utiliza un breve impulso eléctrico con una intensidad de campo dada para incrementar la permeabilidad de la membrana de tal manera que las moléculas de ADN puedan penetrar en las células. Las técnicas de transferencia génica
mediada por partículas y la electroporación son bien conocidas por las personas con experiencia habitual en el oficio.

Los métodos químicos de terapia génica implican la transferencia de genes mediada por un vehículo mediante la utilización de vesículas lipídicas fusogénicas tales como liposomas u otras vesículas que se fusionen a la membrana. Un vehículo que albergue un ADN de interés puede ser introducido adecuadamente en fluidos corporales o en la corriente sanguínea y posteriormente dirigido de forma específica de sitio al órgano o tejido diana del organismo. Pueden desarrollarse liposomas portadores de ADN específicos para una célula o un órgano, por ejemplo, y el ADN foráneo llevado por el liposoma puede ser absorbido por esas células específicas. La inyección de inmunoliposomas que están dirigidos a un receptor específico en ciertas células, puede ser utilizada como un medio idóneo para insertar el ADN en las células portadoras de ese receptor. Otro sistema de vehículos que ha sido utilizado es el sistema de conjugado asialoglicoproteína/polilisina para transportar ADN a los hepatocitos para transferencia génica in vivo.

El ADN transfectado puede estar también acomplejado con otros tipos de vehículos de tal manera que el ADN sea transportado a la célula receptora y depositado posteriormente en el citoplasma o en el nucleoplasma. El ADN puede ser acoplado a proteínas nucleares transportadoras en complejos de vesículas producidos específicamente y transportado directamente al núcleo.

La transferencia génica mediada por vehículos puede implicar también la utilización de compuestos basados en lípidos que no sean liposomas. Por ejemplo, las lipofectinas y las citofectinas son iones positivos basados en lípidos que se unen a ADN cargado negativamente y forman un complejo que puede transportar al ADN a través de una membrana celular. Otro método de transferencia génica mediada por vehículos implica la endocitosis basada en receptores. En este método, se produce un ligando (específico para un receptor de la superficie celular) para formar un complejo con un gen de interés y posteriormente se inyecta en la corriente sanguínea. Las células diana que tienen el receptor en la superficie celular se unirán específicamente al ligando y transportarán el complejo ligando-ADN a la célula.

Las metodologías biológicas de terapia génica emplean vectores víricos o vectores no víricos (tales como los conjugados ligando-ADN, liposomas y los complejos de lípido-ADN discutidos anteriormente) para insertar los genes en las células. Las células transfectadas pueden ser células derivadas de tejido normal del paciente, de tejido enfermo del paciente o pueden no ser células del paciente.

Puede ser deseable que una molécula de ADN recombinante que contenga una secuencia de ADN de un fragmento peptídico de Kringle 5 o una secuencia de ADN de una proteína de fusión de Kringle 5, esté unida operativamente a una secuencia para el control de la expresión con el fin de formar un vector de expresión capaz de expresar un fragmento peptídico o una proteína de fusión de Kringle 5, respectivamente. Alternativamente, la regulación génica de un fragmento peptídico de Kringle 5 o de una proteína de fusión de Kringle 5 puede ser llevada a cabo mediante la administración de compuestos que se unan al gen de Kringle 5, al gen de la pareja de fusión o a regiones control asociadas con el gen de Kringle 5 o con el gen de su pareja de fusión o con un transcrito de ARN correspondiente (de cualquiera de ellos) para modificar la tasa de transcripción o traducción.

Los vectores víricos que han sido utilizados para protocolos de terapia génica incluyen retrovirus, otros virus de ARN tales como poliovirus o virus Sindbis, adenovirus, virus adenoasociados, virus herpes, SV40, vaccinia y otros virus de ADN. Vectores retrovíricos murinos con replicación defectuosa son los vectores de transferencia génica más ampliamente utilizados. Los retrovirus de la leucemia murina están compuestos por un ARN de hebra sencilla acomplejado con una proteína nuclear central y enzimas polimerasa (pol) revestidos por un núcleo proteico (gag) y rodeado por una envoltura glicoproteica (env) que determina el rango de huéspedes. La estructura genómica de los retrovirus incluye genes gag, pol y env encerrados en las repeticiones terminales largas (LTRs) 5' y 3'. Los sistemas de vectores retrovíricos aprovechan el hecho de que un vector mínimo conteniendo las LTRs 5' y 3' y la señal de empaquetamiento es suficiente para permitir el empaquetamiento del vector y la infección e integración en las células diana, con la condición de que las proteínas estructurales del virus sean suministradas in trans en la línea celular de empaquetamiento. Las ventajas fundamentales de los vectores retrovíricos para la transferencia génica incluyen la infección y la expresión génica eficaces en la mayoría de los tipos celulares, la integración precisa de una única copia del vector en el ADN cromosómico de la célula diana y la facilidad de manipulación del genoma retrovírico. Por ejemplo, vectores retrovíricos alterados han sido utilizados en métodos ex vivo para introducir genes en linfocitos periféricos y en linfocitos que se infiltran en los tumores, en hepatocitos, células epidérmicas, miocitos u otras células somáticas (que pueden ser introducidas posteriormente en el paciente para proporcionar el producto génico procedente del ADN insertado).

El adenovirus está compuesto por ADN lineal de doble hebra acomplejado con proteínas "core" y rodeado por proteínas de la cápsida. Los avances en virología molecular han conducido a la capacidad para aprovechar la biología de estos organismos con el fin de crear vectores capaces de transducir nuevas secuencias genéticas a células diana in vivo. Los vectores basados en adenovirus expresarán los péptidos producto del gen a niveles elevados. Los vectores adenovíricos tienen una elevada eficacia de infectividad, incluso con títulos bajos de virus. Adicionalmente, el virus es completamente infectivo como virión libre de células, por lo que la inyección de líneas celulares productoras no es necesaria. Otra ventaja potencial de los vectores adenovíricos es la capacidad para conseguir una expresión de larga duración de genes heterólogos in vivo.

Los vectores víricos han sido utilizados también para insertar genes en células utilizando protocolos in vivo. Para dirigir la expresión específica de un tejido de genes foráneos, pueden utilizarse elementos reguladores o promotores que actúan en cis que se sabe que son específicos de un tejido. Alternativamente, esto puede ser realizado utilizando la administración in situ del ADN o de vectores víricos a lugares anatómicos específicos in vivo. Por ejemplo, la transferencia génica a vasos sanguíneos in vivo se llevó a cabo mediante la implantación de células endoteliales transducidas in vitro en lugares elegidos de las paredes arteriales. Las células circundantes infectadas con el virus expresaban también, a su vez, el producto génico. Un vector vírico puede ser administrado directamente al lugar in vivo (mediante un catéter, por ejemplo), permitiendo así que solamente ciertas áreas sean infectadas por el virus y proporcionando una expresión génica específica de sitio, de larga duración. Se ha demostrado también la transferencia génica in vivo utilizando vectores retrovíricos en tejido mamario y en tejido hepático mediante la inyección del virus alterado en los vasos sanguíneos que conducen a dichos órganos.

Pueden producirse y utilizarse también fragmentos peptídicos de Kringle 5 en una variedad de aplicaciones. Como ejemplos, diferentes fragmentos peptídicos de Kringle 5 pueden ser utilizados (1) como agonistas y antagonistas activos en los sitios de unión de Kringle 5, (2) como antígenos para el desarrollo de antisueros específicos, (3) como péptidos para ser utilizados en kits de diagnóstico y (4) como péptidos unidos a, o utilizados en combinación con, agentes citotóxicos para la destrucción dirigida de células que se unan a los fragmentos peptídicos de Kringle 5. Las secuencias de aminoácidos que comprenden estos fragmentos peptídicos pueden ser seleccionadas sobre la base de su posición en las regiones exteriores de la molécula que son accesibles para unirse a los antisueros, o de la potencia inhibidora de los fragmentos peptídicos hacia procesos que derivan de, o que son exacerbados por, la angiogénesis. Además, estas secuencias peptídicas pueden ser comparadas con secuencias conocidas utilizando bases de datos de secuencias proteicas tales como GenBank, Brookhaven Protein, SWISS-PROT y PIR, con el fin de determinar homologías de secuencias potenciales. Esta información facilita la eliminación de secuencias que presenten un alto grado de homología de secuencias con otras moléculas e incrementa de este modo el potencial de especificidad elevada en el desarrollo de antisueros, agonistas y antagonistas de Kringle 5.

Los fragmentos peptídicos o las proteínas de fusión de Kringle 5 pueden ser también utilizados como un medio para aislar un receptor de Kringle 5 mediante inmovilización del fragmento peptídico o proteína de fusión de Kringle 5 en un soporte sólido en, por ejemplo, una columna de afinidad a través de la cual se pasarán células endoteliales cultivadas o extractos de membrana. Como se conoce en la técnica, el aislamiento y la purificación de un receptor de Kringle 5 pueden estar seguidos por la secuenciación de aminoácidos para identificar y aislar polinucleótidos que codifiquen el receptor de Kringle 5. Tales polinucleótidos pueden ser posteriormente clonados en un vector de expresión adecuado y transfectados a células tumorales. La expresión del receptor por las células tumorales transfectadas incrementaría la sensibilidad de estas células a fragmentos peptídicos de Kringle 5 endógenos y exógenos y disminuiría de este modo la velocidad de crecimiento metastásico. Además, la expresión recombinante de este receptor permitiría la producción de mayores cantidades del receptor, por ejemplo para producir una cantidad suficiente para ser utilizada en ensayos de selección masivos de alto rendimiento automatizados con el fin de identificar antagonistas más pequeños que remeden la acción de Kringle 5.

La sustitución sistemática de aminoácidos en estos péptidos sintetizados puede producir agonistas y antagonistas peptídicos del receptor de Kringle 5 de alta afinidad que incrementen o disminuyan la unión de los fragmentos peptídicos de Kringle 5 a su receptor. Tales agonistas pueden ser utilizados para suprimir el crecimiento de micrometástasis y limitar de este modo la propagación del cáncer. En casos de vascularización inadecuada, pueden aplicarse antagonistas de los fragmentos peptídicos de Kringle 5 para bloquear los efectos inhibidores de los fragmentos peptídicos de Kringle 5 y estimular la angiogénesis. Por ejemplo, este tipo de tratamiento puede tener efectos terapéuticos al estimular la cicatrización de heridas en diabéticos.

Los fragmentos peptídicos o las proteínas de fusión o los conjugados de Kringle 5 de la presente invención pueden ser utilizados también antígenos para generar anticuerpos policlonales o monoclonales que sean específicos para el inhibidor de Kringle 5. Una forma en la que podrían utilizarse tales anticuerpos sería en métodos y kits de diagnóstico para detectar o cuantificar fragmentos peptídicos de Kringle 5 en un fluido o tejido corporal. Los resultados de estos ensayos podrían ser utilizados para diagnosticar o determinar la relevancia pronóstica de los fragmentos peptídicos de Kringle 5.

Los fragmentos peptídicos de Kringle 5 o las proteínas de fusión de Kringle 5 pueden ser marcados con isótopos radiactivos (ver el Ejemplo 13) o acoplados químicamente a proteínas para formar conjugados. Los conjugados incluyen enzimas, proteínas transportadoras, agentes citotóxicos, moléculas fluorescentes, quimioluminiscentes y bioluminiscentes que se utilizan para facilitar el análisis de la capacidad de los compuestos que contienen los fragmentos peptídicos de Kringle 5 para unirse a antisueros hacia Kringle 5, para detectar tipos celulares que posean un receptor de fragmentos peptídicos de Kringle 5 o para facilitar la purificación de los fragmentos peptídicos de Kringle 5. La técnica de acoplamiento es elegida generalmente sobre la base de los grupos funcionales disponibles en los aminoácidos de la secuencia de los fragmentos peptídicos de Kringle 5, incluyendo, alquilo, amino, sulfhidrilo, carboxilo, amida, fenol, indolil e imidazolil. Varios reactivos utilizados para realizar tales acoplamientos incluyen, entre otros, glutaraldehído, bencidina diazotada, carbodiimidas y p-benzoquinona. La eficacia de la reacción de acoplamiento es determinada utilizando diferentes técnicas apropiadas para la reacción específica. Por ejemplo, el radiomarcaje de un péptido de Kringle 5 o de un fragmento del mismo biológicamente activo con I^{125} puede ser llevado a cabo utilizando cloramina T y NaI^{125} de actividad específica elevada. La reacción es finalizada con metabisulfito de sodio y la mezcla es desalada en columnas desechables. El péptido marcado es eluido de la columna y las fracciones recogidas. Se retiran alícuotas de cada fracción y se mide la radiactividad en un contador gamma. Este procedimiento proporciona el fragmento peptídico de Kringle 5 radiomarcado libre de NaI^{125} no reaccionado. En otro ejemplo, sangre o extractos tisulares conteniendo un fragmento peptídico de Kringle 5 acoplado a Kringle 4 pueden ser purificados en una columna de afinidad con una resina de polilisina, mediante lo cual el fragmento peptídico de Kringle 4-Kringle 5 se une a la resina por la afinidad del fragmento peptídico de Kringle 4 a la lisina. La elución de la proteína unida proporcionará un fragmento peptídico de Kringle 4-Kringle 5 purificado.

Otra aplicación de la conjugación peptídica es la producción de antisueros policlonales. La producción de antisuero contra fragmentos peptídicos de Kringle 5, contra análogos de fragmentos peptídicos de Kringle 5 y contra el receptor de Kringle 5 puede ser llevada a cabo utilizando técnicas establecidas conocidas por los expertos en el oficio. Por ejemplo, fragmentos peptídicos de Kringle 5 que contengan residuos de lisina pueden ser ligados a seroalbúmina bovina (BSA) purificada utilizando glutaraldehído. La eficacia de esta reacción puede ser determinada midiendo la incorporación de péptido radiomarcado. El glutaraldehído y el péptido que no han reaccionado pueden ser separados mediante diálisis, y el conjugado puede ser utilizado para producir antisueros policlonales en conejos, ovejas, cabras u otros animales. Los fragmentos peptídicos de Kringle conjugados a una molécula transportadora tal como BSA pueden ser combinados con una mezcla adyuvante, emulsionados e inyectados subcutáneamente en múltiples sitios en el lomo, el cuello, los flancos y algunas veces en las almohadillas subplantares de un huésped adecuado. Generalmente, se aplican inyecciones de refuerzo a intervalos regulares, tal como cada 2 a 4 semanas. De 7 a 10 días después de cada inyección aproximadamente, se obtienen muestras de sangre mediante punción venosa utilizando, por ejemplo, las venas marginales de la oreja tras dilatación. Se deja que las muestras de sangre coagulen durante una noche a 4ºC y se centrifugan a 2400 x g aproximadamente a 4ºC durante 30 minutos aproximadamente. Se retira el suero, se alicuota y se almacena a 4ºC para su uso inmediato o bien de -20 a -90ºC para un análisis posterior.

Las muestras se suero procedentes de la generación de antisueros policlonales o las muestras de medio procedentes de la producción de antisueros monoclonales pueden ser analizadas para determinar el título de anticuerpos y, en particular, para la determinación de antisueros con un título elevado. Posteriormente, el antisuero hacia fragmentos peptídicos de Kringle 5 con el título más elevado puede ser analizado para establecer lo siguiente: a) la dilución óptima de antisuero para obtener la unión específica con el antígeno más elevada y la unión no específica más baja, b) la capacidad para unirse a cantidades crecientes de fragmentos peptídicos de Kringle 5 en una curva de desplazamiento estándar, c) la reactividad cruzada potencial con péptidos y proteínas relacionados, incluyendo plasminógeno y fragmentos peptídicos de Kringle 5 de especies relacionadas y d) la capacidad para detectar fragmentos peptídicos de Kringle 5 en medios de cultivo de células y en extractos de plasma, orina y tejidos. El título puede ser establecido mediante varios medios conocidos en la técnica, tal como mediante transferencia de manchas y análisis de la densidad y también mediante precipitación de los complejos péptido radiomarcado-anticuerpo utilizando proteína A, antisueros secundarios, etanol frío o carbón vegetal-dextrano, seguido por la medida de la actividad en un contador gamma. Si se desea, el antisuero con el título más elevado puede ser purificado en columnas de afinidad. Por ejemplo, fragmentos peptídicos de Kringle 5 pueden ser acoplados a una resina comercialmente disponible y utilizados para formar una columna de afinidad. Muestras de antisuero pueden ser pasadas posteriormente a través de la columna, a fin de que se unan a la columna los anticuerpos hacia Kringle 5 (a través de los fragmentos peptídicos de Kringle 5). Estos anticuerpos unidos son posteriormente eluidos, recogidos y evaluados para determinar el título y la especificidad.

Se contemplan también como parte de la presente invención kits para medir fragmentos peptídicos de Kringle 5 y el receptor de Kringle 5. Los antisueros que posean el título y la especificidad más elevados y que puedan detectar fragmentos peptídicos de Kringle 5 en extractos de plasma, orina, tejidos y medios de cultivo celular, pueden ser utilizados para establecer kits de ensayo para medir y localizar de forma rápida, fiable, sensible y específica fragmentos peptídicos de Kringle 5. Estos kits de ensayo pueden emplear las técnicas siguientes: ensayos competitivos y no competitivos, radioinmunoensayos, ensayos de bioluminiscencia y quimioluminiscencia, ensayos fluorimétricos, ensayos de sándwich, ensayos inmunorradiométricos, transferencias de manchas, ensayos con enzima unido incluyendo ELISAs, placas de microvaloración, inmunocitoquímica y tiras o varillas de inmersión revestidas con anticuerpo para una monitorización rápida de orina o sangre. Para cada kit se establece el rango, la sensibilidad, la precisión, la fiabilidad, la especificidad y la reproducibilidad del ensayo por medios bien conocidos por los expertos en la técnica.

Un ejemplo de un kit de ensayo utilizado comúnmente en investigación y en clínica es un kit de radioinmunoensayo (RIA). Un RIA para determinar fragmentos peptídicos de Kringle 5 puede ser establecido de la siguiente manera: Después de la radioyodación y purificación con éxito de un fragmento peptídico de Kringle 5, se añade el antisuero que posea el título más elevado de anticuerpos anti-fragmento peptídico de Kringle 5 a varias diluciones a tubos que contienen una cantidad relativamente constante de radioactividad, tal como 10.000 cpm, en un sistema de tampones adecuado. (Se añade tampón o suero preinmune a los demás tubos con el fin de terminar la unión no específica). Después de incubación a 4ºC durante 24 horas, se añade proteína A a todos los tubos y los tubos son agitados en vórtex, incubados a temperatura ambiente durante 90 minutos y centrifugados a 2000-2500 x g aproximadamente a 4ºC para precipitar los complejos de anticuerpo unido al antígeno marcado. Se retira el sobrenadante por aspiración y se mide la radiactividad de las pellas en un contador gamma. La dilución del antisuero que se una al 10-40% aproximadamente del péptido marcado después de la sustracción de la unión no específica es seleccionada para una caracterización posterior.

A continuación, se evalúa un rango de diluciones (de 0,1 pg a 10 ng aproximadamente) del fragmento peptídico de Kringle 5 utilizado para desarrollar el antisuero mediante la adición de cantidades conocidas del péptido a tubos que contienen péptido radiomarcado y antisuero. Después de un periodo de incubación (24 ó 48 horas, por ejemplo), se añade proteína A y se centrifugan los tubos, se retira el sobrenadante y se cuenta la radioactividad de la pella. El desplazamiento de la unión del fragmento peptídico de Kringle 5 radiomarcado por el fragmento peptídico de Kringle 5 no marcado (estándar) proporciona una curva estándar. Adicionalmente, pueden añadirse a los tubos de ensayo varias concentraciones de otros fragmentos peptídicos de Kringle 5, plasminógenos, fragmentos peptídicos de Kringle 5 de especies diferentes y péptidos homólogos, con el fin de caracterizar la especificidad del antisuero hacia el fragmento peptídico de Kringle 5.

Posteriormente, extractos de varios tejidos incluyendo, pero sin limitarse a, tumores primarios y secundarios, carcinoma de pulmón de Lewis, cultivos de células productoras de fragmentos peptídicos de Kringle 5, placenta, útero y otros tejidos tales como cerebro, hígado e intestino son preparados utilizando técnicas de extracción que han sido empleadas con éxito para extraer fragmentos peptídicos de Kringle 5. Después de tratar los extractos tisulares, se añade tampón de ensayo y diferentes alícuotas son colocadas en los tubos de RIA. Extractos de células productoras de fragmentos peptídicos de Kringle 5 conocidas producen curvas de desplazamiento que son paralelas a la curva estándar, mientras que extractos de tejidos que no produzcan fragmentos peptídicos de Kringle 5 no desplazan a los fragmentos peptídicos de Kringle 5 radiomarcados del antisuero hacia fragmentos peptídicos de Kringle 5. Tales curvas de desplazamiento indican la utilidad del ensayo de los fragmentos peptídicos de Kringle 5 para medir fragmentos peptídicos de Kringle 5 en tejidos y fluidos corporales.

Extractos tisulares que contengan fragmentos peptídicos de Kringle 5 pueden ser también caracterizados sometiendo a alícuotas de los mismos a HPLC de fase reversa. Las fracciones del eluato son recogidas, secadas en Speed Vac, reconstituidas en tampón de RIA y analizadas en el RIA de Kringle 5. En este caso, la máxima cantidad de inmunorreactividad con el fragmento peptídico de Kringle 5 está localizada en las fracciones correspondientes a la posición de elución del fragmento peptídico de Kringle 5.

El kit de ensayo anteriormente descrito proporcionará instrucciones, antisuero, un fragmento peptídico de Kringle 5 y posiblemente un fragmento peptídico de Kringle 5 radiomarcado y/o reactivos para la precipitación de los complejos fragmento peptídico de Kringle 5 unido/anticuerpo hacia Kringle 5. Tal kit sería útil para la medida de fragmentos peptídicos de Kringle 5 en fluidos biológicos y en extractos tisulares de animales y humanos con y sin tu-
mores.

Otro kit puede ser utilizado para visualizar o localizar fragmentos peptídicos de Kringle 5 en tejidos y células. Por ejemplo, las técnicas inmunohistoquímicas y los kits que emplean tales técnicas son bien conocidos por las personas con experiencia habitual en el oficio. Según se conoce en la técnica, un kit de inmunohistoquímica proporcionará un antisuero hacia un fragmento peptídico de Kringle 5 y posiblemente un suero bloqueante y un antisuero secundario unido a una molécula fluorescente tal como isotiocianato de fluoresceína, o a algún otro reactivo utilizado para visualizar el antisuero primario. Utilizando esta metodología, pueden examinarse biopsias de tumores para determinar los lugares de producción del fragmento peptídico de Kringle 5 o los lugares del receptor del fragmento peptídico de Kringle 5. Alternativamente, un kit puede suministrar ácidos nucleicos radiomarcados para ser utilizados en hibridación in situ como sondas para detectar el ARN mensajero del fragmento peptídico de Kringle 5.

Los compuestos de la invención pueden ser preparados utilizando procesos bien conocidos por las personas con experiencia habitual en la técnica. (Ver, por ejemplo, Sottrup-Jensen y col., Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, Vol. 3, Davidson, J.F., Rowan, R.M., Samama, M.M. y Desnoyers, P.C. editores, Raven Press, New York, 1978). Una manera de preparar fragmentos peptídicos de Kringle 5 es mediante corte enzimático de la proteína nativa (glu-plasminógeno) o de una variante de la misma (significando una forma truncada de la proteína de longitud completa que sea susceptible de ser cortada por digestión enzimática y que comprenda al menos una secuencia de Kringle 5 según se definió anteriormente, tal como lys-plasminógeno o miniplasminógeno). Este método requiere primeramente el aislamiento de la proteína de plasma humano en ausencia de inhibidores de plasmina y la estimulación por ello de la conversión de glu-plasminógeno en lys-plasminógeno (ver Novokhatny, V. y Kudinov, S.A., J. Mol. Biol., 179: 215-232 (1984)). Posteriormente, la molécula truncada es tratada con un enzima proteolítico a una concentración suficiente para cortar fragmentos peptídicos de Kringle 5 del polipéptido y posteriormente purificada de los fragmentos restantes por medios conocidos por los expertos en la técnica. Un enzima proteolítico preferido es la elastasa humana o porcina que corta el plasminógeno y sus variantes truncadas entre las regiones Kringle 3-4 y 4-5 (y de este modo es capaz de formar fragmentos peptídicos que contienen los Kringles 1-3 y 1-4 o los Kringles 4 ó 5 solos). Por ejemplo, el lys-plasminógeno o el glu-plasminógeno pueden ser tratados con elastasa de neutrófilos porcina o humana en una proporción de 1:100-1:300 lys-plasminógeno:elastasa aproximadamente (preferiblemente en una proporción de 1:150-1:250 y más preferiblemente en una proporción de 1:150 en una solución tampón (tal como Tris-HCl, NaCl, fosfato de sodio)). Alternativamente, la elastasa puede ser primero inmovilizada (tal como en una resina) para facilitar la purificación de los productos de corte. El glu-plasminógeno o el lys-plasminógeno es generalmente tratado con elastasa humana o porcina a temperaturas que varían de 10ºC aproximadamente a 40ºC aproximadamente y durante periodos de tiempo que varían de 4 aproximadamente a 24 horas aproximadamente, dependiendo del grado de corte deseado. Para conseguir una digestión completa de glu-plasminógeno, lys-plasminógeno o miniplasminógeno con elastasa humana o porcina se requiere la exposición de estos polipéptidos al enzima durante al menos 12 horas aproximadamente a temperatura ambiente. Variando el pH y el tiempo de exposición al enzima se tiene como resultado menos corte o un corte parcial en uno o más de los sitios susceptibles al corte. Los productos de corte son posteriormente purificados mediante cualquier medio bien conocido en la técnica (tal como cromatografía en columna). Un esquema de purificación preferido implica la aplicación de los productos de corte a una columna de lisina-Sefarosa, según se describe en el Ejemplo 14.

Síntesis en fase sólida de fragmentos Peptídicos de Kringle 5

Los ejemplos siguientes servirán para ilustrar adicionalmente la preparación de los nuevos compuestos de la invención. Los Ejemplos 1-2 no están incluidos en la invención, pero son útiles para comprender en su totalidad la preparación de los compuestos de la invención.

Ejemplo 1 N-Ac-Val-Leu-Leu-Pro-Asp-Val-Glu-Thr-Pro-Ser-Glu-Glu-Asp-NH_{2}

Una columna de amida para síntesis peptídica (Applied Biosystems) fue colocada en la posición de la columna de síntesis peptídica de un sintetizador de péptidos "Synergy" de Perkin Elmer/Applied Biosynthesis, y se utilizó la secuencia sintética siguiente:

1.: Solvatación de la resina con DMF durante 5 minutos aproximadamente.

2.: Desbloqueo del grupo Fmoc del N-terminal \alpha del aminoácido unido a la resina utilizando piperidina al 20% en DMF durante 15 minutos aproximadamente.

3.: Lavado de la resina con DMF durante 5 minutos aproximadamente.

4.: Activación del C-terminal \alpha del aminoácido Nº 1 (Fmoc-Asp(\beta-O^{t}Bu), 25 \mumoles) utilizando una solución 0,2 M de HBTU (25 \mumoles) y HOBT (25 \mumoles) en DMSO-NMP (N-metilpirrolidona) y una solución 0,4 M de diisopropiletilamina (25 \mumoles) en DMSO-NMP y acoplamiento del aminoácido activado a la resina.

5.: Acoplamiento del aminoácido protegido con Fmoc activado (preparado en la etapa 5) al aminoácido unido a la resina (preparado en la etapa 2) en DMF durante 30 minutos aproximadamente.

6.: Lavado con DMF durante 5 minutos.

7.: Repetición las etapas 3 a 6 con los aminoácidos siguientes:

	N^{o}	Aminoácido
	2.	Fmoc-Glu(\gamma-O^{t}Bu)
	3.	Fmoc-Glu(\gamma-O^{t}Bu)
	4.	Fmoc-Ser(^{t}Bu)
	5.	Fmoc-Pro
	6.	Fmoc-Thr(^{t}Bu)
	7.	Fmoc-Glu(\gamma-O^{t}Bu)
	8.	Fmoc-Val
	9.	Fmoc-Asp(\beta-O^{t}Bu)
	10.	Fmoc-Pro
	11.	Fmoc-Leu
	12.	Fmoc-Leu
	13.	Fmoc-Val

8.: Acoplamiento de ácido acético al N-terminal \alpha del péptido unido a la resina mediante las condiciones de las etapas 4 y 5.

9.: Lavado de la resina con THF durante 5 minutos aproximadamente para eliminar la DMF y contraer la resina, secado posterior de la resina con argón durante 10 minutos y nitrógeno durante 10 minutos más para proporcionar un péptido unido a la resina limpio.

10.: Corte del péptido de la resina con la desprotección concomitante de las cadenas laterales de los aminoácidos mediante agitación con un reactivo de corte (tioanisol recién preparado (100 \mul), agua (50 \mul), etanoditiol (50 \mul) y ácido trifluoroacético (1,8 ml) mezclados en el orden anterior de -5ºC a -10ºC) a 0ºC durante 10-15 minutos y posteriormente a temperatura ambiente durante 1,75 horas adicionales (más 0,5 horas adicionales para cada Arg(Pmc), si están presentes). La cantidad de reactivo de corte utilizada fue determinada mediante la siguiente fórmula:

	peso de la resina con		cantidad de reactivo
	péptido unido (mg)		de corte (\mul)
	0-10		100
	10-25		200
	25-50		400
	50-100		700
	100-200		1200

11.: Filtración y lavado del producto con ácido trifluoroacético puro, adición del filtrado en porciones de 0,5 ml a un tubo de centrífuga conteniendo 8 ml aproximadamente de éter dietílico frío, centrifugación y decantación y repetición del proceso hasta que precipite todo el péptido (si el péptido no precipitó después de la adición de éter, la mezcla fue extraída con ácido acético acuoso al 30% (3 x 1 ml) y los extractos acuosos combinados fueron liofilizados para proporcionar el producto).

12.: Utilización del péptido bruto o purificación del péptido mediante HPLC utilizando una columna Symmetry Prep C18 de 7 \mum (7,8 x 300 mm) con mezclas de solventes variables en un gradiente de acetonitrilo-(agua, TFA 0,1%) del 5% al 100% durante un periodo de 50 minutos seguido por liofilización para proporcionar 35 mg de N-Ac-Val-Leu-Leu-Pro-Asp-Val-Glu-Thr-Pro-Ser-Glu-Glu-Asp-NH_{2}.

Ejemplo 2 N-Ac-Met-Phe-Gly-Asn-Gly-Lys-Gly-Tyr-Arg-Gly-Lys-Arg-Ala-Thr-Thr-Val-Thr-Gly-Thr-Pro-NH_{2}

El compuesto del título fue preparado utilizando la secuencia sintética descrita en el Ejemplo 1 y utilizando Fmoc-Pro como aminoácido Nº 1. Se añadieron los aminoácidos siguientes utilizando las condiciones indicadas:

N^{o}	Aminoácido
2.	Fmoc-Thr(O^{t}Bu)
3.	Fmoc-Gly
4.	Fmoc-Thr(^{t}Bu)
5.	Fmoc-Val
6.	Fmoc-Thr(^{t}Bu)
7.	Fmoc-Thr(^{t}Bu)
8.	Fmoc-Ala
9.	Fmoc-Arg(Pmc)
10.	Fmoc-Lys(Boc)
11.	Fmoc-Gly
12.	Fmoc-Arg(Pmc)
13.	Fmoc-Tyr(^{t}Bu)
14.	Fmoc-Gly
15.	Fmoc-Lys(Boc)
16.	Fmoc-Gly
17.	Fmoc-Asn(Trt)
18.	Fmoc-Gly
19.	Fmoc-Phe
20.	Fmoc-Met

para proporcionar 35 mg de N-Ac-Met-Phe-Gly-Asn-Gly-Lys-Gly-Tyr-Arg-Gly-Lys-Arg-Ala-Thr-Thr-Val-Thr-Gly-Thr-Pro-NH_{2}.

Ejemplo 3 N-Ac-Gln-Asp-Trp-Ala-Ala-Gln-Glu-Pro-His-Arg-His-Ser-Ile-Phe-Thr-Pro-Glu-Thr-Asn-Pro-Arg-Ala-Gly-Leu-Glu-Lys-Asn-Tyr-NH_{2} (SEC ID Nº:40)

El compuesto del título fue preparado utilizando la secuencia sintética descrita en el Ejemplo 1 y utilizando Fmoc-Tyr(^{t}Bu) como aminoácido Nº 1. Se añadieron los aminoácidos siguientes utilizando las condiciones indicadas:

N^{o}	Aminoácido
2.	Fmoc-Asn(Trt)
3.	Fmoc-Lys(Boc)
4.	Fmoc-Glu(\gamma-O^{t}Bu)
5.	Fmoc-Leu
6.	Fmoc-Gly
7.	Fmoc-Ala
8.	Fmoc-Arg(Pmc)
9.	Fmoc-Pro
10.	Fmoc-Asn(Trt)
11.	Fmoc-Thr(^{t}Bu)
12.	Fmoc-Glu(\gamma-O^{t}Bu)
13.	Fmoc-Pro
14.	Fmoc-Thr(^{t}Bu)
15.	Fmoc-Phe
16.	Fmoc-Ile
17.	Fmoc-Ser(^{t}Bu)
18.	Fmoc-His(Trt)

(Continuación)

N^{o}	Aminoácido
19.	Fmoc-Arg(Pmc)
20.	Fmoc-His(Trt)
21.	Fmoc-Pro
22.	Fmoc-Glu(\gamma-O^{t}Bu)
23.	Fmoc-Gln(Trt)
24.	Fmoc-Ala
25.	Fmoc-Ala
26.	Fmoc-Trp
27.	Fmoc-Asp(\beta-O^{t}Bu)
28.	Fmoc-Gln(Trt)

para proporcionar 40 mg de N-Ac-Gln-Asp-Trp-Ala-Ala-Gln-Glu-Pro-His-Arg-His-Ser-Ile-Phe-Thr-Pro-Glu-Thr-Asn-Pro-Arg-Ala-Gly-Leu-Glu-Lys-Asn-Tyr-NH_{2}.

Ejemplo 4 N-Ac-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gly-Pro-Trp-NH_{2}

El compuesto del título fue preparado utilizando la secuencia sintética descrita en el Ejemplo 1 y utilizando Fmoc-Trp como aminoácido Nº 1. Se añadieron los aminoácidos siguientes utilizando las condiciones indicadas:

N^{o}	Aminoácido
2.	Fmoc-Pro
3.	Fmoc-Gly
4.	Fmoc-Gly
5.	Fmoc-Val
6.	Fmoc-Asp(\beta-O^{t}Bu)
7.	Fmoc-Gly
8.	Fmoc-Asp(\beta-O^{t}Bu)
9.	Fmoc-Pro
10.	Fmoc-Asn(Trt)
11.	Fmoc-Arg(Pmt)

para proporcionar 20 mg de N-Ac-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gly-Pro-Trp-NH_{2}.

Ejemplo 5 N-Ac-Tyr-Thr-Thr-Asn-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH_{2}

N^{o}	Aminoácido
2.	Fmoc-Asp(\beta-O^{t}Bu)
3.	Fmoc-Tyr(^{t}Bu)
4.	Fmoc-Leu
5.	Fmoc-Lys(Boc)
6.	Fmoc-Arg(Pmc)
7.	Fmoc-Pro
8.	Fmoc-Asn(Trt)
9.	Fmoc-Thr(^{t}Bu)
10.	Fmoc-Thr(^{t}Bu)
11.	Fmoc-Tyr(^{t}Bu)

para proporcionar 10 mg de N-Ac-Tyr-Thr-Thr-Asn-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH_{2}.

Ejemplo 6 N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH_{2}

El compuesto del título fue preparado utilizando la secuencia sintética descrita en el Ejemplo 1 y utilizando Fmoc-Tyr(^{t}Bu) como aminoácido Nº 1. Se añadieron los aminoácidos siguientes utilizando las condiciones indi-
cadas:

N^{o}	Aminoácido
2.	Fmoc-Asp(\beta-O^{t}Bu)
3.	Fmoc-Tyr(^{t}Bu)
4.	Fmoc-Leu
5.	Fmoc-Lys(Boc)
6.	Fmoc-Arg(Pmc)
7.	Fmoc-Pro

para proporcionar N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH_{2} (4 mg). MS (FAB) m/z 995 (M+H)^{+}.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7 N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-NH_{2}

El compuesto del título fue preparado utilizando la secuencia sintética descrita en el Ejemplo 1. Se añadieron los aminoácidos siguientes utilizando las condiciones indicadas:

N^{o}	Aminoácido
2.	Fmoc-Tyr(^{t}Bu)
3.	Fmoc-Leu
4.	Fmoc-Lys(Boc)
5.	Fmoc-Arg(Pmc)
6.	Fmoc-Leu

para proporcionar N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-NH_{2} (6 mg). MS (ESI) m/z 832 (M+H)^{+}.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8 N-Ac-Pro-Glu-Lys-Arg-Tyr-Asp-Tyr-NH_{2} (SEC ID Nº:39)

N^{o}	Aminoácido
2.	Fmoc-Asp(\beta-O^{t}Bu)
3.	Fmoc-Tyr(^{t}Bu)
4.	Fmoc-Arg(Pmc)
5.	Fmoc-Lys(Boc)
6.	Fmoc-Glu
7.	Fmoc-Pro

para proporcionar N-Ac-Pro-Glu-Lys-Arg-Tyr-Asp-Tyr-NH_{2} (6 mg). MS (FAB) m/z (1101) (M+H)^{+}.

\newpage

Ejemplo 9 N-Ac-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH_{2}

N^{o}	Aminoácido
2.	Fmoc-Asp(\beta-O^{t}Bu)
3.	Fmoc-Tyr(^{t}Bu)
4.	Fmoc-Leu
5.	Fmoc-Lys(Boc)
6.	Fmoc-Arg(Pmc)

para proporcionar N-Ac-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH_{2} (8 mg). MS (ESI) m/z 898 (M+H)^{+}.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10 N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I-Tyr-Asp-Tyr-NH_{2} (SEC ID Nº:18)

N^{o}	Aminoácido
2.	Fmoc-Asp(\beta-O^{t}Bu)
3.	Fmoc-3-I-Tyr(^{t}Bu)
4.	Fmoc-Leu
5.	Fmoc-Lys(Boc)
6.	Fmoc-Arg(Pmc)
7.	Fmoc-Pro

para proporcionar N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I-Tyr-Asp-Tyr-NH_{2} (2 mg). MS (ESI) m/z (1121) (M+H^{+}).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 11 N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I-Tyr-NH_{2} (SEC ID Nº:6)

El compuesto del título fue preparado utilizando la secuencia sintética descrita en el Ejemplo 1 y utilizando Fmoc-3-I-Tyr(^{t}Bu) como aminoácido Nº 1. Se añadieron los aminoácidos siguientes utilizando las condiciones indi-
cadas:

para proporcionar N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I-Tyr-NH_{2} (2,5 mg). MS (ESI) m/z 1121 (M+H)^{+}.

\newpage

Ejemplo 12 N-Ac-Lys-Leu-Tyr-Asp-NH_{2}

El compuesto del título fue preparado utilizando la secuencia sintética descrita en el Ejemplo 1 y utilizando Fmoc-Asp(\beta-O^{t}Bu) como aminoácido Nº 1. Se añadieron los aminoácidos siguientes utilizando las condiciones indicadas:

N^{o}	Aminoácido
2.	Fmoc-Tyr(^{t}Bu)
3.	Fmoc-Leu
4.	Fmoc-Lys

para proporcionar 2 mg de N-Ac-Lys-Leu-Tyr-Asp-NH_{2} (2 mg).

Ejemplo 13 Preparación y separación de una mezcla de N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I^{125}-Tyr^{535}-NH_{2} y N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I^{125}-Tyr^{533}-Asp-Tyr-NH_{2} (SEC ID Nº:18) y (SEC ID Nº:6), respectivamente

A una solución de 30 \mug de N-acetil-prolil-arginil-lisil-leucil-tirosil-aspartil-tirosilamida en 80 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) se añadieron una yodoperla (Pierce, Rockford, IL) y 100 \muCi de NaI^{125}. Después de 10 minutos, el exceso de reactivo NaI^{125} fue eliminado mediante la aplicación de la mezcla de reacción a una columna C18-Light SepPack de Waters y elución con agua, posteriormente con TFA al 0,1% en CH_{3}CN/agua 1:1 y la recogida de 3 x 200 \mul fracciones para proporcionar una mezcla de péptidos radiomarcados con Tyr^{533} y
Tyr^{535}.

La mezcla de péptidos calientes fue coinyectada en una columna de HPLC C18 con una solución equimolar de transportadores fríos N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I-Tyr-NH_{2} y N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I-Tyr-Asp-Tyr-NH_{2}, los tiempos de elución de los cuales habían sido predeterminados como de 36 y 38 minutos, respectivamente. Eluciones repetidas con el sistema de solventes del Ejemplo y la liofilización de las fracciones relevantes combinadas proporcionaron el compuesto deseado N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I-Tyr-NH_{2} con una impureza mínima de N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I-Tyr-Asp-Tyr-NH_{2}.

Metodologías generales Ejemplo 14 Aislamiento y purificación de fragmentos peptídicos de Kringle 5

Los fragmentos peptídicos de Kringle 5 fueron preparados a partir de la digestión de lys-plasminógeno (Lys-HPg, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) con elastasa porcina (SIGMA, St. Louis, MO) mediante una modificación del método de Powell y col. (Arch. Biochem. Biophys., 248(1): 390-400 (1986)). Se incubaron 1,5 mg de elastasa porcina con 200 mg de Lys-HPg en Tris-HCl 50 mM pH 8,0 y se agitaron por balanceo durante una noche a temperatura ambiente. La reacción fue finalizada por la adición de DPF (fluorofosfato de diisopropilo, SIGMA) a una concentración final de 1 mM. La mezcla fue agitada por balanceo durante 30 minutos adicionales, dializada frente a Tris 50 mM pH 8,0 durante una noche y concentrada. El plasminógeno cortado fue colocado sobre una columna de lisina-Sepharose® 4B de 2,5 cm x 15 cm (Brockway, W.J. y Castellino, F.J., Arch. Biochem. Biophys., 151: 194-199 (1972)) y se equilibró con Tris 50 mM pH 8,0 hasta que se alcanzó una absorbancia de 0,05 (a 280 nm). (Esta etapa fue realizada para eliminar cualquier fragmento que contuviera una región Kringle 1 y/o una región Kringle 4 (ambas de las cuales se unen a lisina)). Los fragmentos peptídicos de Kringle 5 no absorbidos fueron dializados frente a tampón Na_{2}PO_{4} 50 mM, pH 5,0, y aplicados posteriormente a una columna Mono-S de BioRad equilibrada con el mismo tampón. La porción de Kringle 5 cortada, el mini-HPg no cortado y la fracción restante del dominio de la proteasa fueron eluidos con un gradiente gradual de Fosfato 20 mM/KCl 1 M pH 5,0 0-20%, 20-50% y 50-70%. Los fragmentos peptídicos de Kringle 5 eluían en la etapa del 50%, según se determinó mediante electroforesis en gel. El pico recogido fue dializado durante una noche frente a Tris 20 mM pH 8,0.

Se determinó que los fragmentos de Kringle 5 separados eran al menos un 95% puros mediante cromatografía FPLC y DodSO4/PAGE con tinción con plata (Azul de Coomassie). El análisis de la secuencia de la porción aminoterminal de los fragmentos purificados reveló la presencia de tres polipéptidos que tenían en el extremo N \alpha las secuencias VLLPDVETPS, VAPPPVVLL y VETPSEED que correspondían a las posiciones de aminoácidos Val^{449}-Ser^{458}, Val^{443}-Leu^{450} y Val^{454}-Asp^{461} de la SEC ID Nº:1, respectivamente.

Ejemplo 15 Ensayo de proliferación Endotelial

La proliferación in vitro de células endoteliales fue determinada según está descrito por Lingen y col., en Laboratory Investigation, 74: 476-483 (1996), utilizando el kit "Cell Titer 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay" (Promega Corporation, Madison, WI). Células endoteliales de capilares bovinos (adrenales) fueron sembradas a una densidad de 1000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía un 10% de suero de ternera del donante y un 1% de BSA (seroalbúmina bovina, GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). Después de 8 horas, las células fueron hipoalimentadas durante una noche en DMEM que contenía un 0,1% de BSA y posteriormente realimentadas con medio que contenía concentraciones especificadas de inhibidor y 5 ng/ml de bFGF (factor de crecimiento de fibroblastos básico). Los resultados del ensayo fueron corregidos por las células no estimuladas (esto es, a las que no se había añadido bFGF) como línea base y por las células estimuladas con bFGF solo (esto es, a las que no se había añadido inhibidor) como proliferación máxima. Cuando se combinaron múltiples experimentos, los resultados fueron representados como el cambio en porcentaje del número de células en comparación con bFGF solo.

Ejemplo 16 Ensayo de migración de células endoteliales

El ensayo de migración de células endoteliales se llevó a cabo esencialmente según está descrito por Polverini, P.J. y col., Methods Enzymol., 198: 440-450 (1991). Brevemente, células endoteliales de capilares bovinos (adrenales) (BCE, suministradas por Judah Folkman, Harvard University Medical School) fueron hipoalimentadas durante una noche en DMEM que contenía un 0,1% de seroalbúmina bovina (BSA). Las células fueron recogidas posteriormente con tripsina y resuspendidas en DMEM con un 0,1% de BSA a una concentración de 1,5 x 10^{6} células/ml. Las células fueron añadidas al fondo de una cámara de Boyden modificada de 48 pocillos (Nucleopore Corporation, Cabin John, MD). La cámara fue ensamblada e invertida, y se dejó que las células se fijaran durante 2 horas a 37ºC a membranas de policarbonato para quimiotaxis (5 \mum de tamaño de poro) que habían sido sumergidas en gelatina 0,1% durante una noche y secadas. La cámara fue posteriormente reinvertida y se añadieron las sustancias de ensayo a los pocillos de la cámara superior (hasta un volumen total de 50 \mul); el aparato fue entonces incubado durante 4 horas a 37ºC. Se recuperaron las membranas, se fijaron y se tiñeron (DiffQuick, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) y se contó el número de células que habían migrado a la cámara superior por 10 campos de gran aumento. La migración de fondo con DMEM + BSA 0,1% fue sustraída y los datos presentados como el número de células migradas por 10 campos de gran aumento (400X) o, cuando se combinaron los resultados de múltiples experimentos, como el porcentaje de inhibición de la migración en comparación con un control positivo. Los resultados están mostrados en la Tabla 1.

Ejemplo 17 Efecto de los fragmentos peptídicos de Kringle 5 sobre la proliferación de células endoteliales in vitro

El efecto de los fragmentos peptídicos de Kringle 5 sobre la proliferación de células endoteliales fue determinado in vitro utilizando el ensayo de proliferación de células endoteliales anteriormente descrito. Para estos experimentos, se prepararon fragmentos peptídicos de Kringle 5 según se ilustró en los Ejemplos 1 a 14 y se analizaron a varias concentraciones que variaban de 100 a 1000 pM aproximadamente, utilizando bFGF como control de proliferación máxima. El fragmento peptídico de Kringle 5 de SEC ID Nº3 fue eficaz inhibiendo la proliferación de células BCE de manera dependiente de la dosis. Se determinó que la concentración de fragmento peptídico de Kringle 5 de SEC ID Nº:3 requerida para conseguir un 50% de inhibición (DE_{50}) era de 300 pM aproximadamente. En contraste, se mostró que la DE_{50} de los Kringles 1-4 era de 135 nM.

En la Tabla 1 se muestra un resumen del efecto de otros fragmentos peptídicos de Kringle sobre la inhibición de la proliferación de células BCE. El fragmento peptídico de Kringle 3 era el menos eficaz para inhibir la proliferación de células BCE (DE_{50} = 460 nM), seguido por el fragmento peptídico de Kringle 1 (DE_{50} = 320 nM), los fragmentos peptídicos de Kringle 1-4 (DE_{50} = 135 nM) y los fragmentos peptídicos de Kringle 1-3 (DE_{50} = 75 nM). El fragmento peptídico de Kringle 5 era el más eficaz para inhibir la proliferación de células BCE, con una DE_{50} de 0,3 nM.

Ejemplo 18 Efecto de los fragmentos peptídicos de Kringle 5 Sobre la migración de células endoteliales in vitro

Se determinó también el efecto de fragmentos peptídicos de Kringle 5 sobre la migración de células endoteliales in vitro utilizando el ensayo de migración de células endoteliales anteriormente descrito. Los fragmentos peptídicos de Kringle 5 inhibían la migración de células BCE de manera dependiente de la dosis, con una DE_{50} de 300 pM aproximadamente. A la concentración de fragmentos peptídicos de Kringle 5 requerida para una inhibición máxima de las células BCE, se inhibían también las células PC-3 y las células MDA 486. Este resultado, tomado junto con el resultado del Ejemplo 2, indica que la inhibición de la proliferación y migración estimuladas de las células BCE por los fragmentos peptídicos de Kringle 5 es potente y específica para células endoteliales y no para células normales o tumorales.

Todo lo anterior es meramente ilustrativo de la invención y no tiene la intención de limitar la invención a los compuestos descritos. Se pretende que las variaciones y cambios que sean obvios para los expertos en la técnica estén dentro del ámbito y la naturaleza de la invención que se definen en las reivindicaciones adjuntas.

La Tabla 1 muestra un resumen de los valores de la DE_{50} obtenidos de la inhibición de varios fragmentos de Kringle sobre la proliferación de células BCE y sobre la migración celular in vitro. En la tabla, los fragmentos peptídicos de Kringle están marcados según su homología de secuencias correspondiente con la SEC ID Nº:1. El símbolo "*" indica datos tomados de Marti, D. y col., Eur. J. Biochem., 219: 455-462 (1994), y el símbolo "-" indica que no hay datos.

TABLA 1

Fragmento de Proteico de la SEC ID N°:1	Actividad Antiproliferativa de	Inhibición de la Migración de
	Células BCE (DE_{50})	Células HMVBC (DE_{50})
Kringles 1-4 (angioestatina)*	135 nM	160 nM
Kringle 1 (Tyr^{80}-G1u^{163})*	320 nM	-
Kringle 2 (Glu^{161}-Thr^{245})*	sin actividad	-
Kringle 3 (Thr^{253}-Ser^{335})*	460 nM	-
Kringle 4 (Val^{354}-Val^{443})*	sin actividad	-
Kringles 1-3 (Tyr^{80}-Pro^{353})*	75 nM	60 nM
Kringles 2-3 (Glu^{161}-Ser^{335})*	-	-
Kringle 5 (Val^{443}-Ala^{543})	250 pM	200 pM
Kringle 5 (Val^{449}-Ala^{543})	-	240 pM
Kringle 5 (Val^{454}-Ala^{543})	-	220 pM
Kringle 5 (Val^{443}-Phe^{546})	60 nM	55 nM
Kringle 5 (Val^{449}-Phe^{546})	-	-
Kringle 5 (Val^{454}-Phe^{546})	-	-
Kringles 4-5 (Val^{355}-Ala^{543})	-	280 pM
Kringles 4-5 (Val^{355}-Phe^{546})	-	-
N-Ac-Val^{449}-Asp^{461}-NH_{2}	-	> 1 mM
N-Ac-Met^{463}-Pro^{482}-NH_{2}	-	> 1 mM
N-Ac-Gln ^{484}-Tyr^{511}-NH_{2}	-	> 100 \muM
N-Ac-Arg^{513}-Trp^{523}-NH_{2}	-	500 pM
N-Ac-Tyr^{525}-Tyr^{535}-NH_{2}	-	200 pM
N-Ac-Pro^{529}-Tyr^{535}-NH_{2}	-	120 pM
N-Ac-Pro^{529}-Asp^{534}-NH_{2}	-	123 pM
N-Ac-Pro^{150}_Tyr^{156}-NH_{2}	-	160 nM
N-Ac-Arg^{530}-Tyr^{535}-NH_{2}	-	80 pM
N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I-Tyr-Asp-Tyr-NH_{2}	-	> 100 nM
N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Tyr-Asp-3-I-Tyr-NH_{2}	-	400 pM
N-Ac – Lys^{531}- Tyr^{534} -NH_{2}	-	-

Ejemplo 19 Expresión recombinante de fragmentos de Kringle 5 en Pichia pastoris A. Producción de ADNcs que codifican fragmentos de Kringle 5 por PCR

Se empleó PCR para generar fragmentos de ADNc que codificaban fragmentos peptídicos de Kringle 5 que tenían las secuencias de aminoácidos: (1) posiciones de aminoácidos 450-543 de la SEC ID Nº:1 (de aquí en adelante, K5A), (2) posiciones de aminoácidos 450-546 de la SEC ID Nº:1 (de aquí en adelante, K5F), (3) posiciones de aminoácidos 355-543 de la SEC ID Nº:1 (de aquí en adelante, K4-5A) y (4) posiciones de aminoácidos 355-546 de la SEC ID Nº:1 (de aquí en adelante, K4-5F), para clonaje y expresión en huéspedes eucarióticos y procarióticos. Los fragmentos de ADN fueron generados utilizando un ADNc que codificaba plasminógeno humano (obtenido del Dr. E. Reich, State University of New York, Stony Brook, NY) como molde y conjuntos de cebadores directos e inversos (obtenidos de Operon Technologies, Inc., Alameda, CA) mostrados a continuación:

1

Se llevaron a cabo amplificaciones por PCR utilizando los conjuntos de cebadores SEC ID Nº:2 y SEC ID Nº:4 (para K5A), SEC ID Nº:2 y SEC ID Nº:5 (para K5F), SEC ID Nº:3 y SEC ID Nº:8 (para K4-5A) y SEC ID Nº:3 y SEC ID Nº:5 (para K4-5A), bajo condiciones estándar de PCR, esto es en un volumen total de reacción de 100 \mul conteniendo 200 \muM de cada dNTP, donde N era A, T, G y C, 0,2 \muM de cada cebador, 10 ng aproximadamente de ADN molde y 1 unidad de ADN polimerasa Vent® (New England Biolabs). Se llevaron a cabo amplificaciones en un total de 25 ciclos (1 ciclo = 94ºC durante un minuto, 48ºC durante dos minutos, 72ºC durante 1 minuto) en un Ciclador Térmico de ADN 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA). Después de la amplificación, los productos de la PCR fueron purificados en gel, digeridos con BamHI y XhoI (New England Biolabs), ligados a un vector de expresión de Pichia modificado (pHil-D8, ver más adelante) cortado con los mismos enzimas y transformados en células HB101 (BioRad) por electroporación. Se preparó ADN de los clones individuales y se sometió a digestión con enzimas de restricción y a análisis de la secuencia con el fin de identificar los clones que contenían insertos con la secuencia correcta y en la orientación apropiada. Plásmidos de los clones identificados positivamente fueron luego transformados en Pichia pastoris cepa GS115 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Con el fin de identificar los clones positivos en Pichia, las células fueron cultivadas en 5 ml de medio BMGY (Invitrogen) a 29ºC durante una noche, recogidas por centrifugación y resuspendidas en 0,5 ml de medio BMMY (Invitrogen) para la expresión. Después de incubación a 29ºC durante dos días, se recogieron los sobrenadantes de los cultivos y alícuotas de los mismos fueron sometidas a SDS-PAGE y a análisis de transferencia Western de acuerdo con técnicas conocidas. En la Fig. 6 se muestra un gel de SDS-PAGE.

B. Construcción del vector de expresión pHil-D8

El vector de expresión de Pichia, pHil-D8, fue construido mediante una modificación del vector pHil-D2 (Invitrogen) para que incluyera una secuencia líder sintética para la secreción de una proteína recombinante (ver la Fig. 5). La secuencia líder, 5'-ATGTTCTCTCCAATTTTGTCCTTGGAAATTATTTTAGCTTTGGCTACTTTGCAATCTGT
CTTCGCTCAGCCAGTTATCTGCACTACCGTTGGTTCCGCTGCCGAGGGATCC-3' (SEC ID Nº:9) codifica una señal de secreción de PHO1 (subrayado sencillo) unida operativamente a la secuencia de un propéptido (resaltada con negrita) para el corte con KEX2. Para construir pHil-D8, se llevó a cabo una PCR utilizando como molde pHil-S1 (Invitrogen), ya que este vector contiene la secuencia que codifica PHO1, un cebador directo (SEC ID Nº:7) correspondiente a los nucleótidos 509-530 de pHil-S1 y un cebador inverso (SEC ID Nº:8) que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica la última porción de la señal de secreción de PHO1 (nucleótidos 45-66 de la SEC ID Nº:9) y la secuencia del propéptido (nucleótidos 67-108 de la SEC ID N:9). Las secuencias de los cebadores (obtenidos de Operon Technologies, Alameda, CA) fueron según sigue:

2

La amplificación se llevó a cabo durante 25 ciclos según se describió en el Ejemplo 19. El producto de la PCR (de 500 pb aproximadamente) fue purificado en gel, cortado con BlpI y EcoRI y ligado a pHil-D2 cortado con los mismos enzimas. El ADN fue transformado en células de E. coli HB101 y los clones positivos identificados mediante digestión con enzimas de restricción y análisis de la secuencia. Un clon que tenía la secuencia correcta fue denominado pHil-D8.

Ejemplo 20 Expresión recombinante de fragmentos peptídicos de Kringle 5 en bacterias

Los enzimas de restricción u otros enzimas modificantes, así como los demás reactivos utilizados, fueron obtenidos de fuentes comerciales. Los cebadores fueron sintetizados en Abbott Laboratories en un sintetizador automático mediante métodos estándar conocidos en la técnica.

Los ADNs de los fragmentos peptídicos de Kringle 5 fueron también generados mediante amplificación por PCR para el clonaje y la expresión en células bacterianas (E. coli). El abordaje general llevado a cabo fue generar fragmentos de PCR de las regiones codificadoras deseadas, con y sin codones de terminación, someter los extremos a la acción de una quinasa y clonar los fragmentos directamente en los vectores de elección. Las construcciones de los vectores fueron luego transformadas en células huéspedes apropiadas y las colonias sometidas a selección por PCR con cebadores de los vectores para confirmar la presencia de un inserto. Para determinar la orientación de un inserto, las reacciones de PCR que mostraban clones positivos para el inserto fueron sometidas a PCR direccional utilizando 1 cebador del vector y 1 cebador del inserto.

A. Preparación de vectores de extremos romos, sometidos a la acción de una fosfatasa

En la Tabla 2 se muestra una descripción de vectores de expresión útiles para la producción bacteriana de fragmentos peptídicos de Kringle 5.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2

Vector	Fuente	Enzimas de	Fusión
		Restricción
UpET	pET21d modificado	SapI	Ninguna
	por Abbott
UpET-HTh	pET21d modificado	SapI	Reconocimiento de His6-Trombina
	por Abbott		N-terminal
EpET-Ubi	pET21d modificado	SapI	Reconocimiento de His6-Ubiquitina-
	por Abbott		Enteroquinasa N-terminal
pET32a	Novagen	NcoI + XhoI	Reconocimiento de Tiorredoxina,
			Enteroquinasa
pGEX-4T-2	Pharmacia®	EcoRI + NotI	GST
pCYB3	New England Biolabs	NotI + SapI	Inteína C-terminal

Todos los vectores fueron primeramente aislados y purificados utilizando columnas de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante (QIAGEN, Inc., Santa Clarita, CA). El ADN del vector (1 \mug) fue digerido con los enzimas de restricción apropiados (ver la Tabla 2) en 20 \mul de tampón NEB4 (New England Biolabs) conteniendo 100 \mug/ml de seroalbúmina bovina (BSA). La reacción fue centrifugada brevemente, se añadieron 20 \mul de H_{2}O desionizada, 0,4 \mul de la mezcla de dNTP (Pharmacia®; 20 mM de cada dNTP) y 0,25 \mul de ADN polimerasa pfu clonada (Stratagene®; 2,5 unidades/\mul) y la mezcla de reacción fue incubada a 65ºC durante 20 minutos para rellenar los extremos del vector. La mezcla de reacción fue de nuevo centrifugada brevemente y se añadieron 4 \mul de fosfatasa intestinal de ternera diluida (GIBCO, BRL, Gaithersburg, MD; 5 unidades en total). La mezcla fue posteriormente incubada a 50ºC durante una hora. Se añadieron 5 \mul de SDS al 10%, 2 \mul de NaCl 5 M, 2 \mul de EDTA 0,5 M y 45 \mul de H_{2}O; la reacción fue centrifugada brevemente e incubada posteriormente a 65ºC durante 20 minutos. Posteriormente la reacción fue extraída tres veces con fenol-cloroformo saturado en tampón (GIBCO BRL) y una vez con cloroformo. La fase acuosa fue purificada a través una columna CHROMA SPIN^{TM} 1000 TE (CLONTECH, Palo Alto, CA).

B. Generación de fragmentos de ADN por PCR

Se diseñaron y solicitaron cebadores de PCR sobre la base de la secuencia publicada del plasminógeno humano (ver la SEC ID Nº:12) y se muestran a continuación:

3

A no ser que se indique de otro modo, todas las PCRs fueron realizadas con ADN polimerasa pfu y tampón (Stratagene®), utilizando 200 \muM de cada dNTP y 1 \muM de cada cebador. Los conjuntos de cebadores utilizados fueron SEC ID Nº:11 y SEC ID Nº:13 (para K5A), y SEC ID Nº:10 y SEC ID Nº:13 (para K4-5A). Se utilizó como molde el vector pHil-D8 que contenía el K4-5A (descrito en el Ejemplo 19). Antes de su utilización como molde, este ADN fue digerido con DraI (que produce múltiples cortes fuera de las regiones Kringle) con el fin de eliminar el fondo debido al vector pHil-D8 en las transformaciones. Se utilizaron 10 ng de molde aproximadamente por cada 50 \mul de reacción de PCR. Las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo a 92ºC durante 2 minutos; posteriormente durante 15 ciclos de 94ºC, 30 segundos; 49ºC, 1 minuto; 72ºC, 4 minutos y 72ºC, 7 minutos. Después de la reacción de PCR, se añadieron 0,5 \mul de ATP 100 mM y 5 unidades de quinasa de T4 y la reacción de incubó a 37ºC durante 20 minutos para someter los extremos a la acción de la quinasa. La reacción fue calentada posteriormente a 68ºC durante 15 minutos y purificada sobre una columna de centrifugación S400-HR (Pharmacia®) para ser utilizada en las ligaduras.

C. Ligadura de los fragmentos de la PCR a vectores de expresión

Se produjeron seis construcciones recombinantes (específicamente, (i) K5A en UpET-PS3, (ii) K5A en pET32a, (iii) K4-5A en UpET-PS3, (iv) K4-5A en UpET-Ubi, (v) K4-5A en pET32a y (vi) K4-5A en pGEX-4T-2) según sigue: el vector con extremos romos y sometido ya a la acción de la fosfatasa (1 \mul de la etapa A anterior) y el fragmento de la PCR (1 \mul de la Etapa B anterior) fueron ligados en un volumen total de 5,5 \mul utilizando un Kit de Ligadura Rápida según las instrucciones del fabricante (BOEHRINGER-MANNHEIM Corp., Indianapolis, IN). La mezcla de ligadura (1 \mul) fue transformada posteriormente en 20 \mul de células competentes (células XL1-Blue Supercompetentes o células XL2-Blue Ultracompetentes (Stratagene®)) según las instrucciones del fabricante. Las células recombinantes fueron seleccionadas en placas de agar LB-Amp (MicroDiagnostics, Lombard, IL).

D. Estudios de expresión

Los vectores pGEX fueron expresados en E. coli XL1-Blue o XL2-Blue. Todos los demás vectores fueron aislados y retransformados en E. coli BL21 (DE3) (Novagen) según las instrucciones del fabricante. Colonias individuales fueron inoculadas en 2,5 ml de LB/Amp y agitadas a 225 rpm, 37ºC, durante una noche. El cultivo de una noche (0,5 ml) fue luego inoculado en 50 ml de LB/Amp en un matraz de 250 ml y agitado a 225 rpm, 37ºC, hasta una DO600 de 0,5-0,6. Posteriormente se añadió isopropil-1-tio-\beta-D-galactopiranósido (IPTG, 100 mM) a una concentración final de 1 mM. El cultivo fue agitado a 225 rpm, 30ºC, durante 3 horas antes de ser sedimentado por centrifugación. Se prepararon muestras para SDS-PAGE de acuerdo con técnicas conocidas. Experimentos preliminares mostraron que las células que tenían K5A/pET32a, K4-5A/pET32a y K4-5A/pGEX producían el máximo de proteína recombinante. Los cultivos de estos clones fueron analizados posteriormente para determinar la expresión soluble frente a insoluble mediante SDS-PAGE. Según muestra la Fig. 7, K5A/pET32a producía una proteína recombinante que era casi completamente soluble (comparar las Calles S y P de Trx-K5A), mientras que K4-5A/pET32a y K4-5A/pGEX producían un 75% aproximadamente de proteína soluble.

E. Construcción de vectores modificados por Abbott i. Preparación de casetes de VB1, VB2, VB3 y VB4

VB1, VB2, VB3 y VB4 fueron producidos como ADNs sintéticos utilizando técnicas bien conocidas por las personas con experiencia habitual en el oficio. Las secuencias de synVB1, synVB2, synVB3 y synVB4 se muestran a continuación:

4

Cada secuencia sintética se hizo de doble hebra y se clonó en pCR-Script Cam™ (Stratagene®) según las instrucciones del fabricante; los clones con la secuencia correcta fueron aislados posteriormente mediante procedimientos estándar. Se sometieron a digestión 5 \mug de ADN purificado con 8 unidades de BsmBI a 55ºC en reacciones de 20 \mul en Tampón NEB4 1X que contenía 100 \mug/ml de BSA. La reacción fue centrifugada brevemente, se añadieron 20 \mul de H_{2}O desionizada, 0,4 \mul de una mezcla de dNTP (Pharmacia®; 20 mM de cada dNTP) y 0,25 \mul de ADN polimerasa pfu clonada (Stratagene®; 2,5 unidades por \mul) y la reacción se incubó a 65ºC durante 20 minutos para rellenar los extremos. El ADN fue posteriormente procesado en geles de agarosa MetaPhor™ al 3% (FMC, Rockland, Maine) en tampón Tris-Acetato-EDTA (TAE) 0,5X. La banda de los casetes fue cortada y el ADN fue eluido mediante congelación del gel y centrifugación del tampón a través de un cartucho Ultrafree™ Probind (MILLIPORE Corp., Bedford, MA), seguido por precipitación con isopropanol utilizando Pellet Paint™ (Novagen) como transportador. El ADN (cfVB1, cfVB2, cfVB3 y cfVB4) fue lavado con etanol al 70%, secado brevemente y resuspendido en 25 \mul de tampón Tris-EDTA (TE).

ii. Construcción de UpET

El vector pET21d (Novagen) fue digerido con SapI, tratado primeramente con ADN polimerasa de T4 + dGTP, posteriormente con nucleasa de la alubia Mung, luego con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I y finalmente religado. Colonias individuales fueron sometidas a selección con el fin de seleccionar un plásmido en el que se hubiera eliminado el sitio de SapI existente. Este ADN fue posteriormente digerido con NcoI + BamHI y ligado a 5'-CATGTGAAGAGC-3' (SEC ID Nº:19) + 5'-GATCGCTCTTCA-3' (SEC ID Nº:20) para introducir un único sitio de SapI. El ADN clonado verificado, purificado, fue cortado con SapI + HindIII, se hizo de extremos romos y se trató con fosfatasa según se describió anteriormente, se ligó con el casete de cfVB1, se transformó en E. coli y se sembró en placas de LB-Amp. Se recogieron las colonias con puntas de pipeta estériles sobre placas de agar LB-Amp y en 20 \mul de mezcla para PCR AmpliTaq® (Perkin Elmer) en placas Thermowell de Costar que contenían 1 \muM de cada uno de los cebadores del vector 5'-AGATCTCGATCCCGCGAA-3' (cebador directo, SEC ID Nº:21) y 5'-ATCCGGATATAGTTCCTC-3' (SEC ID Nº:22). Las reacciones fueron calentadas a 94ºC durante 5 minutos, posteriormente sometidas a ciclos utilizando el ciclador térmico GeneAmp 9600 durante 30 ciclos de 94ºC, 30 segundos; 40ºC, 1 minuto; 72ºC, 2 minutos. Diez microlitros de cada reacción fueron procesados en geles de agarosa. Con el fin de determinar la orientación del casete, 0,25 \mul de un cribado de PCR con el tamaño correcto fueron añadidos a una reacción nueva que contenía el cebador inverso del vector y un cebador del casete 5'-CGGGCTTTTTTTTGCTCTTCA-3' (SEC ID Nº:23). Las reacciones fueron sometidas a ciclos igual que anteriormente, durante 10 ciclos adicionales. Los vectores finales fueron secuenciados utilizando un procedimiento estándar y un clon fue denominado UpET.

iii. Construcción de UpET-HTh

UpET fue digerido con SapI y preparado para ser clonado con extremos romos después de ser sometido a la acción de fosfatasa. Fue ligado al casete de cfVB2, transformado, las colonias sometidas a selección y secuenciadas igual que para la ligadura de cfVB1 anterior.

iv. Construcción de UpET-H

UpET fue digerido con SapI y preparado para ser clonado con extremos romos después de ser sometido a la acción de fosfatasa. Fue ligado al casete de cfVB3, transformado, las colonias sometidas a selección y secuenciadas igual que para la ligadura de cfVB1 anterior.

v. Construcción de UpET-Ubi

Se generó un fragmento de PCR de la ubiquitina de S. cerevisiae utilizando ADN polimerasa Ultma y tampón (Perkin Elmer), 40 \muM de cada dNTP, 1 \muM de cada uno de los cebadores 5'-CAGATTTTCGTCAAGACTT-3' (Ubi-5p, SEC ID Nº:24) y 5'-ACCACCTCTTAGCCTTAG-3' (Ubi-3p, SEC ID Nº:25) y 1,75 \mug de ADN de levadura a 94ºC, 2 minutos, posteriormente 25 ciclos de 94ºC, 1 minutos; 40ºC, 1 minuto; 72ºC, 2 minutos; posteriormente 72ºC durante 7 minutos. Se generó un fragmento de PCR a partir de 20 ng de pET15b (Novagen) utilizando los cebadores 5'-CATGGTATATCTCCTTCTT-3' (pET3p-ATG, SEC ID Nº:26) y 5'-TGAGCAATAACTAGCATAAC-3' (T7RevTerm, SEC ID Nº:27) a 94ºC, 2 minutos, posteriormente 10 ciclos de 94ºC, 45 segundos; 42ºC, 1 minuto; 72ºC, 15 minutos; posteriormente 72ºC durante 7 minutos. Los fragmentos de PCR derivados de ubiquitina y de pET15b fueron purificados en gel y ligados entre sí utilizando ligasa de T4 BRL y tampón de ligasa. Se generó posteriormente un fragmento de PCR del promotor de T7-ubiquitina (T7-ubiquitina) utilizando la ligadura como molde y ADN polimerasa Ultma y los cebadores 5'-AGATCTCGATCCCGCGAA-3' (pET5p, SEC ID Nº:28) y SEC ID Nº:25 a 94ºC, 2 minutos, posteriormente 25 ciclos de 94ºC, 30 segundos; 42ºC, 1 minuto; 72ºC, 3 minutos; posteriormente 72ºC, 7 minutos. El fragmento de PCR T7-ubiquitina fue purificado en gel.

Se generó un fragmento de PCR de la Estromelisina humana madura utilizando ADN polimerasa Ultma (igual que anteriormente) con el cebador 5'-TTAGGTCTCAGGGGAGT-3' (Strom-3p, SEC ID Nº:29) y el cebador sometido a la acción de una quinasa 5'-TTCAGAACCTTTCCTGGCA-3' (Strom-5p, SEC ID Nº:30) y 20 ng aproximadamente de molde (esto, estromelisina clonada en pET3b (Novagen)) a 94ºC, 2 minutos, posteriormente 15 ciclos de 94ºC, 1 minuto; 44ºC, 1 minuto; 72ºC, 2 minutos; posteriormente 72ºC durante 7 minutos. La reacción de PCR de la estromelisina (10 \mul) fue ligada con 100 pM de los oligos hibridados 5'-AGCGGCGACGACGACGACAAG-3' (Ek-Cut-5p, SEC ID Nº:31) y 5'-CTTGTCGTCGTCGTCGCCGCT-3' (Ek-Cut-3p, SEC ID Nº:32 que codifica un sitio de corte de enteroquinasa) en 40 \mul de ligasa y tampón de ligasa BRL. Se generó un fragmento de PCR del sitio de enteroquinasa-estromelisina madura (Ek-estromelisina) utilizando 1 \mul de esta ligadura como molde, los cebadores SEC ID Nº:29 y SEC ID Nº:31 sometido a la acción de una quinasa, ADN polimerasa Ultma y tampón a 94ºC, 2 minutos, posteriormente 10 ciclos de 94ºC, 1 minuto; 44ºC, 1 minuto; 72ºC, 2 minutos; posteriormente 72ºC durante 7 minutos. El fragmento de PCR Ek-Estromelisina fue purificado en gel.

Los fragmentos de PCR T7-ubiquitina y Ek-estromelisina fueron ligados entre sí con ligasa y tampón de ligasa de BRL. Se generó luego un fragmento de PCR T7-ubiquitina-Ek-estromelisina utilizando la ligadura como molde y ADN polimerasa Ultma, y los cebadores SEC ID Nº:28 y SEC ID Nº:29 a 94ºC, 2 minutos; posteriormente 25 ciclos de 94ºC, 30 segundos; 42ºC, 1 minuto; 72ºC, 6 minutos; posteriormente 72ºC durante 7 minutos.

Se generó un fragmento de PCR utilizando el molde estromelisina-plásmido pET3b con los cebadores SEC ID Nº:26 y SEC ID Nº:30 con las ADN polimerasas KlenTaq (AB Peptides, St. Louis, MO) y pfu a 94ºC, 2 minutos; posteriormente 15 ciclos de 94ºC, 30 segundos; 42ºC, 2 minutos; 68ºC, 20 minutos. Este fragmento de PCR fue mezclado con el fragmento de PCR T7-ubiquitina-Ek-estromelisina y transformado en células competentes de máxima eficacia DH5\alpha de BRL. Los clones correctos fueron identificados por aislamiento del ADN plasmídico, transfección en BL21(DE3) y la expresión estudiada según se describió anteriormente.

Se generó un fragmento de PCR de ubiquitina-Ek a partir de un plásmido de expresión correcto de T7-ubiquitina-Ek-estromelisina con los cebadores SEC ID Nº:24 y SEC ID Nº:32 y ADN polimerasa pfu a 94ºC, 2 minutos, posteriormente 20 ciclos de 94ºC, 30 segundos; 40ºC, 1 minuto; 72ºC, 3 minutos; posteriormente 72ºC, 7 minutos. El fragmento fue purificado sobre una columna de centrifugación S-400 HR de Pharmacia y ligado al casete de VBC1 utilizando el kit de Ligadura Rápida de ADN. Se generó un fragmento de PCR utilizando la ligadura como molde y los cebadores SEC ID Nº:24 y 5'-TGAAGAGCAAAAAAAAGCCCG-3' (SEC ID Nº:33) y ADN polimerasa pfu a 94ºC, 2 minutos, posteriormente 20 ciclos de 94ºC, 30 segundos; 40ºC, 1 minuto; 72ºC, 2 minutos, 72ºC, 7 minutos. El fragmento de la PCR fue sometido a la acción de una quinasa y ligado a Upet-H preparado para clonaje de extremos romos después de ser sometido a la acción de una fosfatasa. La ligadura fue transformada en células competentes y las colonias fueron sometidas a selección por PCR igual que anteriormente. El ADN plasmídico fue secuenciado para identificar los clones correctos de UpET-Ubi.

Claims

1. Un compuesto de fórmula A-B-C-X-Y, o una sal o éster del mismo farmacéuticamente aceptable, en la que

A está ausente o es un grupo protector de nitrógeno;

Y está ausente o es un grupo protector del ácido carboxílico;

y B-C-X es seleccionado del grupo que consta de las secuencias definidas por las posiciones de aminoácidos siguientes de la SEC ID Nº:1

(a): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 355 a 543;

(b): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 355 a 546;

(c): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 443 a 543;

(d): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 449 a 543;

(e): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 454 a 543;

(f): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 443 a 546;

(g): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 449 a 546;

(h): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 454 a 546;

(i): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 525 a 535;

(j): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 529 a 535;

(k): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 530 a 535;

(l): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 529 a 534;

(m): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 531 a 534;

(n): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 450 a 543.

2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que A es N-Ac e Y es NH_{2}.

3. El compuesto de la reivindicación 1, que tiene una DE_{50} de inhibición de la migración de células endoteliales de 100 a 500 pM.

4. El compuesto de la reivindicación 1, que tiene una DE_{50} de inhibición de la proliferación de células endoteliales de 100 a 500 pM.

5. Utilización de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad en un paciente con necesidad de terapia antiangiogéne-
sis.

6. Utilización de acuerdo con la reivindicación 5, en la que dicha enfermedad es seleccionada del grupo que consta de cáncer, artritis, degeneración macular y retinopatía diabética.

7. Utilización de acuerdo con la reivindicación 6, en la que dicha enfermedad es cáncer.

8. Utilización de acuerdo con la reivindicación 7, en la que dicho cáncer es seleccionado de entre tumores sólidos primarios y metastásicos, carcinomas, sarcomas, linfomas, psoriasis y hemangiomas.

9. Una composición que contiene el compuesto de la reivindicación 1 y un excipiente farmacéuticamente acepta-
ble.

10. Una composición que contiene una secuencia polinucleotídica de hebra sencilla o de doble hebra aislada que codifica un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1.

\newpage

11. La composición de la reivindicación 10, en la que dicha secuencia polinucleotídica es una secuencia de
ADN.

12. La composición de la reivindicación 11, en la que dicha secuencia de ADN codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de

(a): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 443 a 543 de la SEC ID Nº:1;

(b): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 449 a 543 de la SEC ID Nº:1;

(c): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 454 a 543 de la SEC ID Nº:1;

(d): la secuencia entre las posiciones de aminoácidos 355 a 543 de la SEC ID Nº:1.

13. La composición de la reivindicación 12, en la que dicha secuencia polinucleotídica codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de la SEC ID Nº:34.

14. Una célula adecuada para ser implantada en un animal humano o no humano, conteniendo dicha célula un vector, donde dicho vector contiene una secuencia de ADN que codifica un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1.

15. Un método para producir un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende las etapas de:

(a): exposición de un plasminógeno de mamífero a elastasa en una proporción de 1:100 a 1:300 para formar una mezcla de dicho plasminógeno y dicha elastasa;

(b): incubación de dicha mezcla; y

(c): aislamiento de dicho compuesto de dicha mezcla.

16. Un polinucleótido de hebra sencilla o de doble hebra aislado que codifica un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 para ser utilizado como inhibidor de angiogénesis.

17. El polinucleótido de la reivindicación 16 que es una molécula de ADN.

18. El polinucleótido de la reivindicación 16 que es una molécula de ARN.

19. Un vector que comprende un polinucleótido que codifica un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 para ser utilizado como inhibidor de angiogénesis.

20. El vector de la reivindicación 19 que es un vector de expresión.

21. El vector de la reivindicación 20, en la que el vector de expresión es construido mediante la incorporación de un polinucleótido que codifica un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 a los vectores seleccionados del grupo que consta de pHil-D8, pET32a, pGEX-4T-2, Up-ET-Ubi y pCYB3.

22. El vector de la reivindicación 20, que comprende además una célula huésped transformada con dicho vec-
tor.

23. El vector de la reivindicación 22, donde dicha célula huésped es una célula eucariótica.

24. El vector de la reivindicación 23, donde dicha célula eucariótica es Pichia pastoris.

25. El vector de la reivindicación 22, donde dicha célula huésped es una célula procariótica que es E. coli.

26. Un método para producir un compuesto soluble de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

(a): aislamiento de un polinucleótido que codifique dicho compuesto,

(b): clonaje de dicho polinucleótido en un vector de expresión,

(c): transformación de dicho vector en una célula huésped adecuada, y

(d): cultivo de dicha célula huésped a fin de que exprese dicho compuesto.

\newpage

27. Un compuesto seleccionado del grupo que consta de:

(a): A-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I-Tyr-Y;

(b): A-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I-Tyr-Asp-Tyr-Y;

(c): A-Pro-Glu-Lys-Arg-Tyr-Asp-Tyr-Y; y

(d): A-Gln-Asp-Trp-Ala-Ala-Gln-Glu-Pro-His-Arg-His-Ser-Ile-Phe-Thr-Pro-Glu-Thr-Asn-Pro-Arg-Ala-Gly-Leu-Glu-Lys-Asn-Tyr-Y,

donde A está ausente o es un grupo protector de nitrógeno;

e Y está ausente o es un grupo protector de ácido carboxílico.