ES2373482T3

ES2373482T3 - Proteasa de escisión del factor de von willebrand (vwf).

Info

Publication number: ES2373482T3
Application number: ES08156811T
Authority: ES
Inventors: Kenji Soejima; Noriko Mimura; Hiroaki Maeda; Chikateru Nozaki; Takayoshi Hamamoto; Tomohiro Nakagaki
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 2001-04-25
Filing date: 2002-04-25
Publication date: 2012-02-03
Anticipated expiration: 2022-04-25
Also published as: AU2008201773A8; CA2445421C; US7361748B2; AU2008201773B2; EP1956093B1; AU2008243279A1; CN100537770C; US7112666B2; JPWO2002088366A1; CN101613688A; AU2008243279B2; JP2003284570A; US8067221B2; US20080254527A1; JP4163517B2; EP1956093A1; US20130041137A1; CY1112000T1; AU2008201773A1; PT1956093E

Abstract

Un ADN que codifica una proteasa que es capaz de escindir un enlace entre los restos Tyr-842 y Met-843 del factor de von Willebrand (vWF), que comprende una secuencia de nucleótidos según se muestra en ID. SEC. Nº 6.

Description

Proteasa de escisión del factor de von Willebrand (vWF)

La presente invención se refiere a un ADN que codifica una proteína plasmática relacionada con el ámbito de los medicamentos. Más particularmente, la presente invención se refiere a un ADN que codifica una proteasa que escinde específicamente el factor de von Willebrand (en lo sucesivo, en el presente documento puede denominarse “vWF”), que está asociado con la coagulación sanguínea. La proteasa de escisión del vWF codificada por los ADN de la presente invención permite la terapia de reemplazo para pacientes con enfermedades causadas por defectos o disminución de esta proteasa, tales como la púrpura trombocitopénica trombótica (en lo sucesivo, en el presente documento puede denominarse “PTT”). Además, se prevé el uso del mismo como un nuevo agente antiplaquetario para la prevención de eventos trombóticos.

El vWF se produce en las células endoteliales vasculares o en los megacariocitos y es un factor de coagulación de la sangre en el que una sola subunidad que comprende 2.050 restos de aminoácidos (monómeros de aproximadamente 250 kDa) se une por medio de un enlace S-S para formar una estructura de multímero (con un peso molecular de 500 a 20.000 kDa). El nivel del mismo en la sangre es de aproximadamente 10 µg/ml, y por lo general un factor de alto peso molecular tiene una actividad específica más elevada.

El vWF tiene dos funciones principales como factor hemostático. Una de las funciones es como proteína vehículo en la que el vWF se une al factor VIII de coagulación sanguínea para estabilizarlo. Otra función es la de formar el tapón plaquetario mediante la adhesión y la aglomeración de las plaquetas en el tejido endotelial subcelular vascular de la pared del vaso dañado.

La púrpura trombocitopénica trombótica es una enfermedad que causa la formación de trombos hemostáticos en arteriolas somáticas y capilares sanguíneos de todo el cuerpo. A pesar de los recientes avances en tecnología médica, la morbilidad asociada con esta enfermedad prácticamente se triplicó desde 1971 hasta 1991. Desde el punto de vista patológico, se considera que la PTT es el resultado de la citotoxicidad endotelial vascular o la agregación plaquetaria vascular. Desde el punto de vista inmunohistológico, se reconoce una gran cantidad de vWF en los trombos hemostáticos resultantes, y se considera que el vWF desempeña un papel importante en la formación de los mismos. En un paciente con PTT la forma dominante es la estructura de multímero de vWF de peso molecular normal o alto, y se deduce que una estructura de multímero del vWF inusualmente grande (ULvWFM) o de multímero del vWF grande (LvWFM) desempeña un papel importante en la aceleración de la agregación plaquetaria o la formación de microtrombos en condiciones de alto esfuerzo de cizallamiento. En contraste, se sabe que el vWF es degradado en una posición entre los restos Tyr 842 y Met 843 por la acción de la proteasa de escisión del vWF en la sangre circulante de una persona sana en condiciones de alto esfuerzo de cizallamiento. Por consiguiente, se considera que la PTT se produce de la siguiente manera. Por alguna razón, se reduce la actividad de las proteasas en el plasma y aumentan los ULvWFM a LvWFM, lo que causa una aceleración de la agregación plaquetaria. Esto forma trombos hemostáticos en los vasos sanguíneos.

Recientemente, Furlan y col. (Blood, vol. 87, 4223-4234: 1996, publicación de patente JP (Kohyo) Nº 2000-508918) y Tsai y col. (Blood, vol. 87, 4235-4244: 1996) desarrollaron un procedimiento para ensayar la proteasa de escisión específica del vWF. En su informe, la actividad de la proteasa en efecto se redujo en la PTT. Los autores anteriormente mencionados informaron que esta enzima es una metaloproteasa en el plasma y está parcialmente purificada. Sin embargo, aún no han tenido éxito en la secuenciación de aminoácidos que especifique la proteasa. No ha habido otros progresos desde entonces.

Hasta la fecha, se ha realizado la terapia de plasmaféresis para el tratamiento de los pacientes que tienen carencia congénita de proteasa de escisión específica del vWF y de los pacientes que han adquirido anticuerpos positivos contra esta proteasa. Resulta deseable el establecimiento de la terapia de reemplazo con productos purificados o con una sustancia pura, tal como un producto genético recombinante de la proteasa anteriormente mencionada. Los pacientes con PTT familiar congénita carecen de la proteasa específica de vWF, mientras que la causa de la PTT no familiar se debe a la producción a posteriori de autoanticuerpos contra la proteasa anteriormente mencionada. Por consiguiente, resulta de preferencia la terapia de reemplazo de esta proteasa para los pacientes con PTT familiar (de hecho, se realiza la administración plasmática) y la eliminación de los anticuerpos mediante plasmaféresis y la sustitución de esta proteasa son necesarias para la PTT no familiar. Además, también se prevé el uso de esta proteasa como un nuevo agente antiplaquetario para prevenir eventos trombóticos.

Como se mencionó anteriormente, sin embargo, Furlan y col. (Blood, vol. 87, 4223-4234: 1996, publicación de patente JP (Kohyo) Nº 2000-508918) y Tsai y col. (Blood, Vol. 87, 4235-4244: 1996) han sugerido que la proteasa de escisión del vWF es una metaloproteasa en el plasma. Se informó que estaba parcialmente purificada y concentrada de 1.000 a 10.000 veces a partir del plasma en cuanto a su actividad específica. Incluso bajo estas condiciones, no ha habido ningún avance en el análisis de las propiedades de esta proteasa, tales como la secuencia de aminoácidos de su proteína, durante el período de aproximadamente 5 años que ha transcurrido desde entonces. No se ha obtenido más información biológica específica con respecto a esta proteasa. Según lo informado por Furlan y col., se supone que la proteína de interés es gigantesca, y puede haber varios problemas asociados a la misma. Por ejemplo, se espera que existan formas diversificadas de esta proteasa, tales como diversas moléculas o

cofactores que interactúen. En base a la complejidad de los procesos de purificación, a la capacidad de deterioro de la separación por la interacción no específica durante la etapa de purificación, y otros factores, se deduce que es muy difícil aislar e identificar la proteasa de una fracción plasmática por el procedimiento de purificación según Furlan y col.

Bajo las circunstancias anteriores, los presentes inventores han realizado estudios concentrados con el fin de aislar e identificar la proteasa de escisión del vWF. Como resultado, han conseguido aislar y purificar la proteasa de escisión del vWF de interés, que aún no había sido informada. Por lo tanto, han tenido éxito en la identificación de una secuencia de aminoácidos de la proteína madura y de un gen que codifica esta secuencia de aminoácidos.

La proteasa de escisión del vWF codificada por los ADN de la presente invención puede escindir un enlace entre los restos Tyr 842 y Met 843 del vWF. De acuerdo con una forma de realización, esta proteasa tiene un peso molecular de 105 a 160 kDa o de 160 a 250 kDa en SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras. La misma consiste en una cadena polipeptídica Leu-Leu-Val-Ala-Val como una secuencia parcial. De más preferencia, consiste en una cadena polipeptídica que tiene la secuencia de aminoácidos parcial del extremo N terminal de una proteína madura, es decir, Ala-Ala-Gly-Gly-Ile-Leu-His-Leu-Glu-Leu-Leu-Val-Ala-Val. Se trata de una sustancia que se caracteriza por las siguientes propiedades.

1) Actividad de escisión del vWF

Según el análisis de la secuencia N terminal del fragmento de escisión, la proteasa codificada por el ADN de la presente invención escinde un enlace peptídico entre los restos Tyr 842 y Met 843.

2) Fraccionamiento por filtración en gel

Cuando el fraccionamiento se realiza por cromatografía de filtración en gel utilizando pasta de FI como material de partida, las mayores actividades se recogen en una fracción con un peso molecular de 150 a 300 kDa. Según una forma de realización de la presente invención, se encuentra que una sustancia activa efectivamente obtenida tiene un peso molecular de aproximadamente 105 a 160 kDa en la electroforesis. En consecuencia, la proteasa codificada por los ADN de la presente invención es una sustancia que probablemente forme un dímero o similar, o se una a otra molécula o a una sustancia que pueda ser fácilmente degradada o que pueda tener una cadena de azúcar heterogénea añadida.

3) Precipitación con sulfato de amonio

Por ejemplo, cuando se utiliza pasta de FI como material de partida, se recupera una gran parte de esta proteasa como una fracción de precipitación de una fracción más o menos purificada con el uso de sulfato de amonio saturado al 33%.

4) SDS-PAGE

Por ejemplo, la proteasa codificada por los ADN de la presente invención derivada de la pasta de FI preparada a partir de plasma humano combinado o crioprecipitado tiene en su mayor parte un tamaño molecular de aproximadamente 105 a 160 kDa determinado por medio de un marcador de peso molecular en SDS-PAGE. En base a la secuencia del ácido nucleico como se muestra en la ID. SEC. Nº 15, cuando se expresa una secuencia de aminoácidos representada por un marco entre un codón de iniciación atg en la posición 445 y un codón de terminación tga en la posición 4726 por la recombinación genética, hay algunas variaciones en los tamaños moleculares en función del huésped. Sin embargo, se presenta un tamaño molecular de aproximadamente 160 a 250 kDa, determinado por medio de un marcador de peso molecular. Este tamaño se observa en el plasma de personas sanas y en el de algunos pacientes con PTT. Varias especies moleculares de esta proteasa están presentes en el plasma humano, causadas por la presencia de los productos de corte y empalme alternativo (ID. SEC. Nº 16 a 21) reconocidos en el momento de la clonación de genes, las diferencias de modificaciones posttraduccionales tales como la adición de cadenas de azúcar, o la degradación durante la purificación. Además, esta proteasa podría recuperarse parcialmente en un estado activo después de la SDS-PAGE en condiciones no reductoras.

5) Análisis de la secuencia de aminoácidos

Se analizó la secuencia de aminoácidos del fragmento polipeptídico aislado. Ésta presentó un ejemplo de una cadena polipeptídica que tiene una secuencia Leu-Leu-Val-Ala-Val como una secuencia de aminoácidos parcial y una secuencia Ala-Ala-Gly-Gly-Ile-Leu-His-Leu-Glu-Leu-Leu-Val-Ala-Val como una secuencia de aminoácidos N terminal de una proteína madura. Además, con las herramientas actuales de bioinformática (BIOINFORMATICS: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, editado por Andreas D. Baxevanis y B. F. Francis Ouellette), se identificó con mucha precisión un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos mediante búsquedas en una base de datos basada en la secuencia parcial anteriormente mencionada. Más específicamente, la se realizóla búsqueda en la base de datos del genoma por medio del programa tblastn. Éste identificó un clon de cromosoma (AL158826) que se deduce que codifica la proteasa de la presente invención. Además, se identificaron los clones (AI346761 y AJ011374) que se deduce que son una parte de la proteasa de interés y una parte del polipéptido a

codificar por el genoma anteriormente mencionado, a través del cotejo con la base de datos de Etiquetas de Secuencia Expresadas (EST, del inglés Expressed Sequence Tag). En base a la misma, se identificó la secuencia de aminoácidos como se muestra en la ID. SEC. Nº 3 o 7 como un sitio activo de la proteasa de escisión del vWF.

Se obtuvo la secuencia GCT GCA GGC GGC ATC CTA CAC CTG GAG CTG CTG GTG GCC GTG, una secuencia deducida a partir del genoma, y de más preferencia CTG CTG GTG GCC GTG, una parte de la misma, el transcriptoma del que fue confirmada por EST. Se analizó la secuencia de nucleótidos obtenida, y el análisis de motivos se llevó a cabo en base a la secuencia deducida. Como resultado, se encontró que tenía un dominio de metaloproteasa como candidato para la proteasa codificada por los ADN de la presente invención. En base en las conclusiones anteriores, se pudo dar a conocer una secuencia de una cadena polipeptídica como un ejemplo más específico de la proteasa. Además, se sabe que por lo general las actividades de las proteasas varían dependiendo de, por ejemplo, la sustitución, eliminación, inserción o la introducción de mutaciones puntuales en una parte de la secuencia de aminoácidos (Blood coagulation factor VII mutants Soejima y col., Publicación de Patente JP (Kokai) Nº 2001-61479 A). Del mismo modo, la proteasa codificada por los ADN de la presente invención puede ser modificada, por ejemplo, por eliminación, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos, para preparar proteasas optimizadas.

Las proteínas proteasa se produjeron a continuación en masa, y se determinaron secuencias de 29 aminoácidos del extremo N terminal. Estas secuencias de aminoácidos se muestran en la ID. SEC. Nº 8. Este resultado es sustancialmente el mismo que la secuencia según se muestra en la ID. SEC. Nº 3 o 7 deducidas por bioinformática. La única diferencia es que el aminoácido 27º en la ID. SEC. Nº 3 o 7 era Glu mientras que según el presente análisis de la secuencia N terminal era Arg. Se consideró a esta diferencia como un polimorfismo genético. Por lo tanto, se confirmó que esta proteasa comprende una cadena polipeptídica que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la ID. SEC. Nº 3 o 7 en su extremo N terminal como una unidad madura. A continuación, se clonó un fragmento del gen que codifica esta proteasa de la siguiente manera.

En base a la secuencia del ácido nucleico como se muestra en la ID. SEC. Nº 7, se preparó un cebador sentido (ID. SEC. Nº 9) y un cebador antisentido (ID. SEC. Nº 10) basándose en la secuencia del ácido nucleico subrayada en la Figura 9, y se amplificó un gen situado entre estos cebadores. Se clonó este fragmento, y a continuación se confirmó la secuencia de nucleótidos. Este fragmento fue utilizado como sonda para la transferencia Northern para analizar el sitio en el que se expresaba el gen de la proteasa. Como resultado, se encontró que este gen de la proteasa se expresaba principalmente en el hígado. Por consiguiente, se adquirió la biblioteca de ADNc de hígado humano y se identificó un gen que codifica esta proteasa mediante una técnica de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE). Basándose en estos resultados, se identificó en el caso de la mayor secuencia de aproximadamente 5 kb de ARNm (ADNc) que llega al sitio de adición poli(A) como se muestra en la ID. SEC. Nº 15.

En base a la secuencia de aminoácidos deducida a partir de la secuencia del gen, se dedujo que esta proteasa tiene una preprosecuencia, y que pertenece a la familia de las desintegrinas y metaloproteasas (ADAM) que tiene un dominio análogo a desintegrina, un dominio análogo a metaloproteasa, y similares, y en particular a la familia ADAM-TS que tiene un dominio de trombospondina tipo 1 (TSP-1). Finalmente, incluyendo las que tienen inserción o eliminación de una parte de la secuencia del ácido nucleico, se identificaron las isoformas como se muestra en las ID. SEC. Nº 16 a 21 que tienen secuencias como se muestran en la ID. SEC. Nº 3 y 7 en los extremos N terminales después de la escisión de la preprosecuencia madura. Por lo tanto, la proteasa codificada por los ADN de la presente invención escindirá el vWF entre los restos Tyr 842 y Met 843 y tendrá la secuencia Leu-Leu-Val-Ala-Val como una secuencia de aminoácidos parcial.

La proteasa de escisión del vWF codificada por los ADN de la presente invención puede prepararse por lo general por el siguiente procedimiento.

Según la presente invención, un procedimiento de ensayo de la actividad de la proteasa se caracteriza por la posibilidad de evaluar la actividad en un período de tiempo corto. Según el informe de Furlan y col. (Blood, vol. 87, 4223-4234: 1996, Publicación de Patente JP (Kohyo) Nº 2000-508918 A), se ensayó la actividad analizando los patrones de escisión del vWF por medio de transferencia Western utilizando el anticuerpo anti-vWF, y por lo tanto, se necesita tiempo para transferir la proteasa a un filtro. Más específicamente, este procedimiento requiere aproximadamente al menos 45 horas en total, es decir, 24 horas para la reacción enzimática con un sustrato de vWF, 17 horas para la electroforesis y 3 horas para la transferencia de la proteasa a un filtro, seguida por la detección utilizando el anticuerpo anti-vWF. Por el contrario, los presentes inventores completaron el ensayo de actividad en 18 horas en total, es decir, 16 horas para la reacción enzimática con un sustrato de vWF y 2 horas para la electroforesis y la detección. Esto indica que el tiempo requerido para el ensayo se puede reducir a un tercio o menos del requerido para el ensayo convencional. Esto también puede reducir el tiempo requerido para el proceso de purificación, y a su vez puede reducir el grado de la proteasa a inactivar. En consecuencia, se mejoró la eficiencia de purificación en comparación con la alcanzada por el procedimiento de Furlan y col., y, en consecuencia, el grado de purificación también se mejoró.

Además, el material de partida se examinó utilizando el sistema de ensayo anteriormente mencionado. Como resultado, se encontró que la actividad de la proteasa estaba más concentrada en la pasta de FI que en el crioprecipitado que había sido informada por Furlan y col. en el pasado. Se utilizó pasta de FI como material de

partida, y se mezclaron los ya mencionados sistemas de ensayo rápido de actividad. Esto permitió el aislamiento y la identificación de la proteasa de interés. En una forma de realización concreta, se utilizó un proceso de purificación que combina la cromatografía de filtración en gel con la cromatografía de intercambio iónico, y también se combinó el sistema de ensayo de la actividad anteriormente mencionado.

Más específicamente, la pasta de FI se disolvió con un tampón y la disolución resultante se fraccionó por cromatografía de filtración en gel. La actividad de la proteasa se fracciona en la región de elución con un peso molecular de 150 a 300 kDa deducido a partir del marcador de tamaño de la filtración en gel. Después de esto, se precipitó el producto resultante y se concentró con sulfato de amonio saturado al 33%. Este procedimiento se repitió tres veces en total. Se combinó la fracción activa obtenida en la tercera filtración en gel, y el resultante se sometió a diálisis a 4 ºC durante la noche con un tampón que comprendía NaCl 50 mM adicionado a Tris-HCl 50 mM (pH 7,1). Después de esto, el producto de la diálisis se sometió a cromatografía de intercambio aniónico (DEAE) y se eluyó por etapas con NaCl 0,25 M. Los presentes inventores han realizado estudios concentrados con el fin de encontrar un procedimiento para aislar e identificar la proteasa codificada por los ADN de la presente invención. Como resultado, encontraron que, sorprendentemente, la proteasa era recuperable como una banda activa tras SDS-PAGE no reductora. Con el fin de lograr una producción masiva más, se aplicó la fracción purificada y concentrada al Biophoresis utilizando el principio de la SDS-PAGE. Por consiguiente, se aisló una fracción que tenía actividad de escisión del vWF de la fracción sometida a electroforesis. De acuerdo con el cálculo aproximado de la actividad específica hasta esta fase, se logró una purificación de aproximadamente 30.000 a 100.000 veces. Este procedimiento se repitió varias veces de manera eficaz y rápidamente, y por lo tanto, se obtuvieron aproximadamente 0,5 pmol de muestra que es el límite actual del análisis de secuencias de aminoácidos. Por consiguiente, el análisis de la secuencia de aminoácidos se volvió factible. Más específicamente, es importante la última etapa de separación y purificación (Biophoresis) basada en el principio de la SDS-PAGE, y se basa en las conclusiones como resultado de los estudios de concentrados.

Según el informe de Furlan y col., se ha mejorado la actividad específica tanto como aproximadamente 10.000 veces, a pesar de que la proteasa no fue aislada de manera sustancial ni identificada. Esto podría ser debido a la desactivación durante la purificación o la dificultad para aislar e identificar las moléculas, que eran proteínas gigantescas capaces de interactuar con varias otras proteínas como la proteasa codificada por los ADN de la presente invención por un procedimiento de separación que utiliza diversos tipos de cromatografía líquida. Además, se dedujo que el contenido de proteasa en el plasma era muy pequeño, y por lo tanto, era necesario esperar hasta el establecimiento del procedimiento según la presente invención. Además, el uso de este procedimiento permite la purificación de genes recombinantes.

En base a los hallazgos de la presente invención, se determina que los péptidos o proteínas preparados a partir de las secuencias obtenidas son antígenos. Con el uso de los mismos, se puede preparar un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal o un anticuerpo humanizado de los mismos pueden por medio de técnicas generales de inmunización (Current Protocols in Molecular Biology, Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH, editado por J. McCAFFERTY y col. o ANTIBODY ENGINEERING segunda edición, editado por Carl A. K. BORREBAECK). Como alternativa, se puede preparar un anticuerpo que se una a la proteína anteriormente mencionada por medio de técnicas de producción de anticuerpos utilizando presentación de fagos Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, editado por Brian K. Kay y col., Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH, editado por

J. McCAFFERTY y col. o ANTIBODY ENGINEERING segunda edición, editado por Carl A. K. BORREBAECK). Como alternativa, en base a estas técnicas, se puede aislar un anticuerpo neutralizante que actúe contra la actividad de proteasa o un simple anticuerpo de unión a partir de un espécimen de un paciente con PTT que tenga un autoanticuerpo positivo contra esta proteasa. Estos anticuerpos pueden ser aplicados al diagnóstico y al tratamiento de enfermedades como la PTT.

En base al genoma obtenido o a la secuencia EST, se puede clonar el ADNc o un gen genómico que codifica la proteasa de la presente invención por medio de una técnica común (Molecular Cloning 2ª edición). Además, las técnicas de bioinformática (BIOINFORMATICS: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, editado por Andreas D. Baxevanis y B. F. Francis Ouellette) permiten la clonación de las proteínas de otras especies animales que son homólogas a la misma, y el gen resultante se fractura por una técnica común (por ejemplo, Gene Targeting: A Practical Approach, primera edición, editado por A. L. Joyner. Teratocarcinomas and embryonic stem cell a practical approach) para producir modelos animales análogos de PTT. En particular, la identificación de la secuencia del gen que codifica la proteína derivada de un ratón permite la producción de un ratón que tiene este gen pero no lo expresa (knockout). Por lo tanto, se puede preparar un modelo de ratón de la enfermedad congénita PTT o similar.

De acuerdo con una técnica común (por ejemplo, J. Sambrook y col., Molecular Cloning, 2ª edición, o CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY), estos genes se incorporan en un vector de expresión adecuado, el resultante se transforma en un célula huésped adecuada, y por consiguiente puede prepararse el producto del gen recombinante de la proteasa. En este caso, el gen a incorporar no es necesariamente el que codifica toda la región de la proteína. También incluye una expresión parcial de la proteína según la definición de un dominio en función de su uso.

Por ejemplo, el polinucleótido según la presente invención se introduce en una célula huésped mediante una técnica convencional tal como la transducción, la transfección o la transformación. El polinucleótido se introduce

exclusivamente o junto con otro polinucleótido. Otro polinucleótido se introduce de forma independiente, a la vez, o en combinación con el polinucleótido de la presente invención.

Por ejemplo, el polinucleótido de la presente invención se transfecta en una célula huésped, tal como una célula de mamífero, por medio de una técnica estándar para la transfección y la selección simultáneas utilizando otro polinucleótido que codifica un marcador de selección. En este caso, el polinucleótido se incorporará por lo general de manera estable en el genoma de la célula huésped.

Como alternativa, se puede unir el polinucleótido a un vector que comprenda un marcador de selección para la multiplicación en un huésped. Una construcción de vector se introduce en una célula huésped mediante la técnica mencionada anteriormente. En general, se introduce un vector plásmido como ADN de un precipitado, tal como un precipitado de fosfato de calcio, o un complejo con un lípido cargado. También se utiliza la electroporación para introducir el polinucleótido en un huésped. Cuando el vector es un virus, este virus se empaqueta in vitro o se introduce en una célula de empaquetado, con lo que se introduce el virus empaquetado en una célula.

En la técnica se conocen y son comunes técnicas extensas que resultan adecuadas para la producción de un polinucleótido y para la introducción del polinucleótido resultante en una célula de acuerdo con esta forma de realización de la presente invención. Estas técnicas se describen en Sambrook y col. (anteriormente mencionado), y este documento explica una diversidad de manuales experimentales convencionales que describen en detalle las técnicas mencionadas anteriormente. Con respecto a esta forma de realización de la presente invención, el vector es, por ejemplo, un vector plasmídico, un vector fago de simple o de doble hebra, o un vector viral de ARN o ADN de simple o de doble hebra. Tal vector se introduce en una célula como un polinucleótido, y, de preferencia, como ADN por medio de una técnica común para la introducción de ADN o ARN en una célula. Cuando el vector es un fago o un virus, de preferencia el vector se introduce a la célula como un virus empaquetado o sellado por una técnica conocida para la infección y la transducción. Un vector viral puede ser uno de tipo competente o defectuoso para la replicación.

Un vector de preferencia es un vector que expresa el polinucleótido o polipéptido de la presente invención en puntos. En general, tal vector comprende una región de control de acción en cis que es eficaz para la expresión en un huésped unida de manera operativa al polinucleótido a expresar. Cuando se introduce un factor de acción en trans adecuado (por ejemplo, un grupo de proteasas implicadas en el procesamiento post-traducción, tales como la peptidasa señal o furina) en una célula huésped, es suministrado por un huésped, un vector complementario o el vector mismo.

En una forma de realización de preferencia, un vector proporciona expresión específica. Tal expresión específica es una inducible o que tiene lugar sólo en un determinado tipo de célula. Como alternativa, es una expresión inducible y específica de la célula. Un vector inducible particularmente de preferencia puede inducir la expresión por un factor ambiental fácilmente operable tal como la temperatura o un aditivo nutricional. Se conocen diversos vectores que son adecuados para esta forma de realización incluyendo una construcción para el uso en células huésped procariotas y eucariotas y un vector de expresión inducible, y los expertos en la técnica pueden utilizarlos comúnmente.

Se puede cultivar una célula huésped genéticamente modificada en un medio nutritivo general, y se modifica para que sea especialmente adecuada para la activación del promotor, la selección de transformantes o la amplificación de un gen. En general, resultará obvio para los expertos en la técnica que las condiciones de cultivo convencionales tales como la temperatura o el nivel de pH para las células huésped seleccionadas para la expresión son adecuadas para la expresión del polipéptido codificado por los ADN de la invención.

Se puede utilizar una amplia variedad de vectores de expresión para expresar el polipéptido codificado por los ADN de la presente invención. Ejemplos de estos vectores incluyen los cromosomas, episomas y los vectores derivados de virus. Estos vectores derivan de plásmidos bacterianos, bacteriófagos, episomas de levaduras, elementos cromosómicos de levaduras o virus tales como el baculovirus, papovavirus como el virus 40 de simio (SV40), virus vacunal, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de la pseudorrabia o retrovirus. También se puede utilizar un vector derivado de una combinación de los anteriores, por ejemplo, un vector derivado de un plásmido y un elemento genético de bacteriófago, más específicamente, un cósmido o fagómido. Se utilizan para la expresión de acuerdo con esta forma de realización de la presente invención. En general, como los polipéptidos fueron expresados en los huéspedes, para la expresión de acuerdo con la forma de realización anteriormente mencionada se puede utilizar cualquier vector que sea adecuado para mantener, multiplicar o expresar un polinucleótido. Una secuencia de ADN adecuado se inserta en un vector por medio de diversas técnicas convencionales. En general, se une una secuencia de ADN para la expresión a un vector de expresión por escisión de una secuencia de ADN y un vector de expresión que tiene una o más endonucleasas de restricción, a continuación se une un fragmento de restricción entre sí utilizando T4 DNA ligasa. Las técnicas de restricción y de unión que se pueden utilizar con ese fin son conocidas y comunes para las personas expertas en la técnica. Con respecto a las mismas, Sambrook y col., (anteriormente mencionado) describen de manera muy precisa otro procedimiento adecuado para la construcción de un vector de expresión que utiliza otra técnica conocida y común para las personas expertas en la técnica.

Una secuencia de ADN en el vector de expresión se une de manera operativa a, por ejemplo, una secuencia reguladora de la expresión adecuada que incluye un promotor para orientar la transcripción del ARNm. Algunos ejemplos de promotores conocidos representativos son el promotor PL del fago lambda, los promotores lac, trp, trc y tac de E. coli, los promotores temprano y tardío de SV40 y el promotor LTR del retrovirus. Muchos promotores que no se describen son adecuados para uso de acuerdo con la forma de realización de la presente invención, conocidos y utilizados de manera más fácil como se describe en los ejemplos de la presente invención. En general, una construcción de expresión comprende un sitio de unión al ribosoma para la traducción en un sitio de iniciación o de terminación de la transcripción o un dominio transcripto. La región codificadora del transcripto maduro que fue expresada por la construcción comprende el AUG de iniciación en los codones de iniciación y terminación localizado sustancialmente en el extremo terminal del polipéptido a traducir. Además, la construcción comprende una región reguladora que regula e induce la expresión. En general, tal región se activa a través de la regulación del sitio de unión del represor, la transcripción de un potenciador, o similar, según diversos procedimientos convencionales.

Los vectores para la multiplicación y expresión incluyen marcadores de selección. Estos marcadores son adecuados para la multiplicación o comprenden marcadores adicionales para los fines anteriormente indicados. El vector de expresión comprende de preferencia uno o más genes marcadores de selección para proporcionar los rasgos fenotípicos con el propósito de seleccionar la célula huésped transformada. Un marcador de preferencia incluye resistencia a la neomicina o a la dihidrofolato-reductasa con respecto al cultivo de células eucariotas. Tiene resistencia a la tetraciclina o a la ampicilina con respecto a E. coli y a otros cultivos de bacterias. Un vector adecuado que comprende una secuencia de ADN y una secuencia promotora o reguladora adecuada tal como se describe en el presente documento se introduce en un huésped adecuado por medio de diversas técnicas adecuadas conocidas para la expresión del polipéptido de interés.

Ejemplos representativos de huéspedes adecuados incluyen: células bacterianas tales como E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células de hongos, tales como una célula de levadura; células de insectos tales como células S2 de Drosophila y Sf9 de Spodoptera; y células de origen animal o vegetal adhesivas o flotantes tales como las células CHO, COS, las células de melanoma Bowes y SP2/0. Se conocen diversos huéspedes para las construcciones de expresión, y los expertos en la técnica pueden seleccionar fácilmente una huésped para expresar los polipéptidos codificados por los ADN según esta forma de realización en base a la divulgación de la presente invención.

Más específicamente, la presente invención incluye una construcción recombinante, tal como una construcción de expresión que comprende una o más secuencias como se mencionó anteriormente. La construcción es un vector, tal como un vector plasmídico o viral que comprende la secuencia de la presente invención insertada en el mismo. La secuencia se inserta en dirección positiva o negativa. En un ejemplo específico de preferencia de las mismas, la construcción tiene además una secuencia reguladora que comprende un promotor o similar que está unido de manera operativa a la secuencia. Diversos vectores y promotores adecuados son conocidos por los expertos en la técnica, y hay muchos vectores disponibles en el mercado que se usan adecuadamente en la presente invención.

A continuación se dan ejemplos de vectores disponibles en el mercado. Los vectores que se utilizan de preferencia para las bacterias son pQE70, pQE60 y pQE-9 (Qiagen); vector pBS, vector PhageScript, vector Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A y pNH46A (Stratagene); y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 y pRIT5 (Pharmacia). Ejemplos de vectores eucariotas de preferencias son pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1; y PSG (Stratagene) y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL (Pharmacia). Estos vectores están disponibles en el mercado para su utilización por los expertos en la técnica de acuerdo con la forma de realización de la presente invención, y no son más que una lista de vectores conocidos. Por ejemplo, otros plásmidos o vectores adecuados para introducir, mantener, multiplicar o expresar el polinucleótido o polipéptido codificado por los ADN de la presente invención también se pueden utilizar en huéspedes según esta forma de realización de la presente invención.

Se puede seleccionar una región promotora de un gen de interés utilizando un vector que comprenda, por ejemplo, un fragmento del promotor candidato, es decir, una unidad de transcripción del informador que carezca de una región promotora, tal como una unidad de transcripción de la cloranfenicol acetil transferasa (CAT), ubicada secuencia abajo de los sitios de restricción para la introducción de fragmentos que contienen el promotor. Como es sabido públicamente, la introducción del fragmento que contiene el promotor en el vector en el sitio de restricción ubicado secuencia arriba del gen cat genera la actividad de CAT que se puede detectar mediante el ensayo convencional de CAT. Un vector que resulta adecuado para este fin es conocido y fácil de conseguir. Ejemplos de tales vectores son pKK232-8 y pCM7. Por consiguiente, el promotor para expresar el polinucleótido de la presente invención incluye no sólo un promotor conocido fácilmente disponible, sino también un promotor que se puede obtener fácilmente utilizando un gen informador según la técnica mencionada anteriormente.

Entre ellos, según la presente invención, ejemplos de promotores bacterianos conocidos que se utilizan adecuadamente para expresar polinucleótidos y polipéptidos son los promotores lacI y lacZ de E. coli, los promotores T3 y T7, el promotor gpt, los promotores PR y PL de lambda y los promotores trp y trc. Ejemplos de promotores eucariotas adecuados conocidos incluyen el promotor inmediato de Citomegalovirus (CMV), el promotor timidina cinasa de HSV, los promotores temprano y tardío de SV40, un promotor LTR de retrovirus tal como el virus del sarcoma de Rous (RoSV) y un promotor de metalotioneína tal como el promotor de metalotioneína-I.

La selección de un vector y un promotor adecuados para la expresión en una célula huésped es una técnica conocida. Las técnicas necesarias para la construcción de vectores de expresión, la introducción de un vector en una célula huésped y la expresión en un huésped son comunes en la técnica. La presente invención se refiere también a una célula huésped que tiene la construcción anteriormente mencionada. Una célula huésped puede ser una célula eucariota superior tal como una célula de mamífero, una célula eucariota inferior tal como una célula de levadura o una célula procariota tal como una célula bacteriana.

La construcción se puede introducir en una célula huésped mediante transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, por transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección u otros procedimientos. Estos procedimientos se describen en una diversidad de manuales convencionales de laboratorio, tales como un libro escrito por Sambrook y col.

Se puede utilizar la construcción en una célula huésped por un procedimiento convencional, y que produce un producto genético codificado por una secuencia recombinante. Como alternativa, se puede sintetizar un polipéptido parcial codificado por un ADN de la presente invención usando un sintetizador de péptidos general. Una proteína madura puede expresarse bajo el control de un promotor adecuado en células de un animal mamífero, en levaduras, bacterias u otras células. También, tal proteína se puede producir en un sistema de traducción libre de células con el uso de ARN derivado de la construcción de ADN de la presente invención. Vectores de expresión y clonación adecuados para huéspedes procariotas y eucariotas se describen en Sambrook y col. (mencionado anteriormente).

En general, un vector de expresión recombinante comprende: un origen de replicación; un promotor derivado de un gen altamente expresado para orientar la transcripción de una secuencia estructural secuencia abajo; y un marcador de selección para poner la célula en contacto con el vector y para aislar la célula que contiene el vector. Un promotor adecuado se puede inducir a partir de un gen que codifica enzimas glicolíticas tales como la 3-fosfoglicerato cinasa (PGK), el factor a, la fosfatasa ácida y la proteína de choque térmico. Un marcador de selección incluye el gen de resistencia a la ampicilina de E. coli y el gen trp1 de S. cerevisiae.

La transcripción del ADN que codifica el polipéptido de la presente invención utilizando una célula eucariota superior puede mejorarse mediante la inserción de una secuencia potenciadora en un vector. El potenciador es por lo general un elemento de acción en cis para el ADN para mejorar la actividad promotora de la transcripción en la célula huésped predeterminada. Ejemplos de potenciadores incluyen el potenciador de SV40, el promotor/potenciador temprano de Citomegalovirus, el potenciador de polioma detrás del origen de replicación, el potenciador de la �actina y el potenciador de adenovirus.

El polinucleótido de la presente invención que codifica una secuencia heteróloga estructural del polipéptido de la presente invención se inserta por lo general en un vector mediante técnicas convencionales, de tal manera que esté unido de manera operativa al promotor de expresión. El sitio de iniciación de la transcripción del polipéptido se sitúa adecuadamente en el sitio 5’ del sitio de unión de ribosomas. El sitio de unión de ribosomas está en posición 5’ con respecto al AUG que inicia la traducción de un polipéptido a expresar. En general, un codón de iniciación comienza desde AUG y otro marco de lectura abierto que se encuentra entre el sitio de unión de ribosomas y AUG de iniciación no está presente. El codón de terminación está presente generalmente en el extremo terminal del polipéptido, y la señal de adenilación y el terminador están convenientemente situados en el extremo 3’ de la región de transcripción.

Con respecto a la secreción de la proteína traducida en el lumen del RE, en el citoplasma o al medio extracelular, se incorpora una señal de secreción adecuada en el polipéptido expresado. La señal puede ser endógena o heteróloga al polipéptido.

Además, una prosecuencia posterior a la secuencia señal puede ser endógena o heteróloga (por ejemplo, un preprosecuencia de otra metaloproteasa).

El polipéptido se expresa en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, e incluye no sólo una señal de secreción, sino también una región funcional heteróloga adicional. Por consiguiente, se añade al polipéptido un aminoácido adicional, especialmente una región de aminoácido con carga, o similar, para mejorar la estabilidad y la estabilidad de almacenamiento en la célula huésped durante la purificación u operación posterior y el almacenamiento. Como alternativa, se puede añadir al polipéptido una región dada para acelerar la purificación. Este tipo de región se puede eliminar antes de la preparación final de los polipéptidos. La inducción de la secreción o excreción, la mejora de la estabilidad o la facilitación de la purificación con la adición de una porción de péptido al polipéptido son técnicas comunes y conocidas en la técnica.

Ejemplos de huéspedes procariotas que son adecuados para la multiplicación, el mantenimiento o para expresar el polinucleótido o polipéptido codificado por los ADN de la presente invención incluyen E. coli, Bacillus subtilis y Salmonella typhimurium. Varios tipos de Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus son huéspedes adecuados en este sentido. Además, también se pueden utilizar otros diversos tipos de huéspedes conocidos por los expertos en la técnica. Ejemplos representativos de vectores de expresión que son útiles para aplicaciones bacterianas incluyen, pero no se limitan a, el origen de replicación de bacterias derivado de plásmidos comercialmente disponibles, incluyendo un marcador de selección y un elemento genético de un vector de clonación conocido

pBR322 (ATCC 37017). Ejemplos de tales vectores comercialmente disponibles incluyen pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEM1 (Promega Biotec, Madison, Wisconsin, EE.UU.). Estas secciones de pBR322 (cadena principal) se combinan con un promotor adecuado y las secuencias estructurales a expresar.

Las células huésped se transforman y multiplican convenientemente hasta la concentración celular óptima. Después de esto, el promotor seleccionado se induce por un medio adecuado (por ejemplo, cambio de temperatura o inductor químico), y las células se cultivan más. Normalmente, las células se recogen por centrifugación y se lisan por un medio físico o químico. El extracto crudo resultante se purifica. Las células microbianas utilizadas para la expresión de la proteína pueden lisarse por cualquier medio conveniente seleccionado de un ciclo de congelacióndescongelación, tratamiento con ultrasonido, fractura mecánica y el uso de un agente citolítico. Estos procedimientos son conocidos por los expertos en la técnica.

También se pueden utilizar diversas líneas celulares para el cultivo de células de animales mamíferos para la expresión. Un ejemplo de una línea celular para expresión en mamíferos incluye las células COS-6 de fibroblastos de riñón de mono que se describen en Gluzman y col., Cell 23: 175 (1981). Ejemplos de otras células que son capaces de expresar los vectores comparables incluyen las células C127, 3T3, CHO, HeLa, 293 de riñón humano y BHK. Además, también se puede utilizar una línea celular de mieloma flotante, tal como SP2/0.

Un vector de expresión para animales mamíferos comprende un origen de replicación, un promotor y potenciador adecuado, un sitio de unión de ribosomas necesario, un sitio de poliadenilación, un donador de empalmes y sitios aceptores, una secuencia de terminación de la transcripción y una secuencia no transcripta vecina a 5’ necesaria para la expresión. Las secuencias de ADN derivadas del sitio de empalme de SV40 y el sitio de poliadenilación de SV40 se utilizan para el elemento genético no transformado o transcripto de interés. Un ejemplo de ello es un vector de expresión CAG (H. Niwa y col., Gene, 108,193-199 (1991)).

En base a la secuencia del gen de la proteasa anterior, se diseña una sonda, un cebador o una secuencia antisentido por medio de una técnica común. La técnica antisentido se puede utilizar para controlar la expresión de genes mediante el uso de ADN o ARN complementarios o antisentido o por la formación de una triple hélice. Esta técnica se describe, por ejemplo, en Okano, J., Neurochem., 56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Raton, FL (1988). La formación de triple hélice se examina, por ejemplo, en Lee y col., Nucleic Acids Research 6: 3073 (1979); Cooney y col., Science 241: 456 (1988); y en Dervan y col., Science 251: 1360 (1991). El procedimiento se basa en la unión del polinucleótido con ADN o ARN complementario. Esto permite el diagnóstico genético o la terapia genética.

Por ejemplo, las células obtenidas de un paciente se someten a ingeniería genética ex vivo utilizando un polinucleótido tal como un ADN o ARN que codifica un polipéptido. Las células resultantes se suministran a continuación a los pacientes que deben ser tratados con polipéptidos. Por ejemplo, las células pueden someterse a ingeniería genética ex vivo usando un vector plásmido de retrovirus que comprende el ARN que codifica el polipéptido de la presente invención. Esta técnica se conoce en la técnica, y su uso en la presente invención es evidente de acuerdo con la descripción dada en el presente documento. De manera similar, las células se someten a ingeniería genética in vitro, de acuerdo con un procedimiento convencional en relación con la expresión del polipéptido in vivo. Por ejemplo, el polinucleótido de la presente invención se modifica por ingeniería genética para la expresión en el vector de retrovirus deficiente para la replicación, como se mencionó anteriormente. Posteriormente, la construcción de expresión del retrovirus se aísla, se introduce en una célula de empaquetado y se transduce utilizando un vector plásmido de retrovirus que comprende el ARN que codifica el polipéptido de la presente invención. Por consiguiente, la célula de empaquetado produce partículas virales infecciosas con un gen de control. Estas células productoras se someten a ingeniería genética in vitro y luego se administran a los pacientes para permitir que los polipéptidos sean expresados in vivo. Este procedimiento de administración y otros procedimientos para la administración de polipéptidos codificados por los ADN según la presente invención serán comprendidos claramente por los expertos en la técnica en base a las enseñanzas de la presente invención.

Ejemplos de los retrovirus mencionados anteriormente, de los que deriva el vector plásmido de retrovirus, incluyen, pero no se limitan a, el virus de la leucemia murina Moloney, el virus de la necrosis esplénica, el virus del sarcoma de Rous, el virus del sarcoma de Harvey, el virus de la leucosis aviar, el virus de la leucemia del gibón, el virus de inmunodeficiencia humana, el virus del sarcoma mieloproliferativo y el virus del tumor mamario. Este tipo de vector comprende uno o más promotores para expresar polipéptidos. Ejemplos de promotores adecuados que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, LTR de retrovirus, el promotor SV40, el promotor de CMV que se describe en Miller y col., Biotechniques 7: 980-990 (1989), y otros promotores (por ejemplo, promotores celulares tales como un promotor de células eucariotas, que incluyen, pero no se limitan a, las histonas, la RNA polimerasa III y el promotor de -actina). Ejemplos de otros promotores virales que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, el promotor de adenovirus, el promotor de la timidina cinasa (TK) y el promotor del Parvovirus B19. El experto en la técnica puede seleccionar fácilmente un promotor adecuado en base a las enseñanzas de la presente invención.

Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la presente invención está bajo el control de un promotor adecuado. Ejemplos de promotores adecuados que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, un promotor de adenovirus tal como promotor tardío principal de adenovirus, un promotor heterólogo tal como el promotor de CMV, el promotor del virus sincitial respiratorio (VSR), un promotor inducible tal como el promotor de

MMT o el promotor de metalotioneína, el promotor de choque térmico, el promotor de la albúmina, el promotor de ApoAI, el promotor de la globina humana, un promotor de la timidina cinasa viral tal como el promotor de la timidina cinasa del herpes simple, LTR de retrovirus incluidos los LTR modificados de retrovirus ya mencionados, el promotor de la -actina y el promotor de la hormona del crecimiento humano. Un promotor puede ser de tipo nativo que controla el gen que codifica polipéptidos. Un vector plásmido de retrovirus se utiliza para la transducción de la línea celular de empaquetado para formar una línea celular productora.

Ejemplos de células de empaquetado a transfectar incluyen, pero no se limitan a, PE501, PA317, Y-2, Y-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, YCRE, YCR1P, GP+E-86, GP+envAm12 y la línea celular DAN que se describe en Miller, Human Gene Therapy 1: páginas 5-14 (1990).

La transducción de un vector en una célula de empaquetado se realiza por un medio conocido en la técnica. Ejemplos de tales medios incluyen, pero no se limitan a, la electroporación, el uso de un liposoma y la precipitación con CaPO4. Como alternativa, un vector plásmido de retrovirus se sella en un liposoma o se une a un lípido que se administra a un huésped. Una línea celular productora produce partículas infecciosas de vectores de retrovirus que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos. Tales partículas de vectores de retrovirus se utilizan para la transducción de células eucariotas in vitro o in vivo.

Las células eucariotas transducidas expresan las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos. Ejemplos de células eucariotas que pueden ser transducidas incluyen, pero no se limitan a, las células madre germinales, las células de carcinoma embrionario, las células madre hematopoyéticas, las células hepáticas, los fibroblastos, los sarcoblastos, los queratinocitos, las células endoteliales y las células epiteliales bronquiales.

La proteasa codificada por los ADN de la presente invención, un anticuerpo contra esta proteasa, un antagonista de esta proteasa, un inhibidor, un agonista, un modificador de la actividad, o similar, se puede diluir con solución salina fisiológica, tampón, o similar, para preparar una formulación. De esta manera, se puede obtener una composición farmacéutica. El valor de pH de la formulación es de preferencia entre ácido y neutro: cercano al nivel de pH del líquido corporal. El límite inferior del mismo se encuentra de preferencia entre 5,0 y 6,4 y el límite superior es de preferencia entre 6,4 y 7,4. Como alternativa, la formulación se puede proporcionar en un estado que permita el almacenamiento durante un largo periodo de tiempo, por ejemplo, en estado liofilizado. En tal caso, la formulación se puede utilizar tras disolverla en agua, solución salina fisiológica, tampón, o similar, a una concentración deseada en el momento de uso.

La formulación de la presente invención puede comprender un aditivo farmacéuticamente aceptable, tal como un vehículo, excipiente o diluyente que se utilice comúnmente para los productos farmacéuticos, un estabilizador o ingredientes farmacéuticamente necesarios. Ejemplos de estabilizadores incluyen los monosacáridos tales como la glucosa, disacáridos tales como la sacarosa y la maltosa, alcoholes de azúcares tales como el manitol y el sorbitol, sales neutras tales como el cloruro de sodio, aminoácidos tales como la glicina, tensioactivos no iónicos tales como el polietilenglicol, copolímeros de polioxietileno y polioxipropileno (Pluronic), éster de ácido graso de polioxietileno sorbitán (Tween) y la albúmina humana. Resulta de preferencia la adición de los mismos en cantidades de 1 a 10 % p/v.

Se puede administrar una cantidad eficaz de la composición farmacéutica de la presente invención, por ejemplo, por inyección intravenosa, inyección intramuscular o inyección hipodérmica en una o varias dosis separadas. La dosis varía en función de los síntomas, la edad, el peso corporal y otros factores, y es de preferencia de 0,001 mg a 100 mg por dosis.

Además, el ADN sentido o antisentido que codifica la proteasa de la presente invención puede prepararse de forma similar en una formulación para obtener una composición farmacéutica.

Además, la presente invención incluye procedimientos para inhibir la formación de trombos hemostáticos implicados en un infarto de miocardio o infarto cerebral, procedimientos para inhibir la arteriosclerosis, procedimientos para prevenir la reestenosis, la reembolización o el infarto implicados en la angiografía coronaria transluminal percutánea (ACTP), procedimientos para prevenir la reembolización implicada en la recanalización coronaria transluminal percutánea (RCTP) y procedimientos para prevenir la formación del trombo hemostático causados por el síndrome urémico hemolítico (SUH) o por O-157 a través de la administración del ADN de la presente invención. Por otra parte, la presente invención incluye el uso del ADN de la presente invención en la producción de fármacos para inhibir la formación del trombo hemostático implicados en el infarto de miocardio o el infarto cerebral, productos farmacéuticos para inhibir la arteriosclerosis, productos farmacéuticos para prevenir la reestenosis, la reembolización

o el infarto implicados en la ACTP, productos farmacéuticos para prevenir la reembolización implicada en la RCTP y productos farmacéuticos para prevenir la formación del tapón plaquetario causado por el síndrome urémico hemolítico o por O-157.

La proteína o el péptido codificado por los ADN de la presente invención se utiliza como sustancia principal para la modificación de aminoácidos. Esto permite la preparación de una molécula que tiene una actividad que es diferente de la de la proteasa codificada por los ADN de la presente invención. Un ejemplo de ello es una molécula variante que se puede obtener mediante la preparación de un antagonista, que se obtiene mediante la preparación de una

variante desactivada a través de la sustitución de aminoácidos entre un resto de aminoácido situado en torno al centro activo en el dominio de metaloproteasa y otros aminoácidos, separando así un sitio de reconocimiento de molécula de un sitio catalítico, o modificando uno o ambos de estos sitios.

El uso de un sistema de evaluación de la actividad de escisión del vWF descrito en el presente documento permite la producción de un antagonista/agonista. Por ejemplo, un antagonista eficaz puede ser una molécula orgánica pequeña, un péptido o un polipéptido. Un ejemplo de ello es un anticuerpo que se une al polipéptido codificado por los ADN de la presente invención, lo que inhibe o elimina su actividad.

De manera similar, el uso del sistema de evaluación anteriormente mencionado para la actividad de escisión del vWF permite la selección de un compuesto que sea capaz de escindir el vWF. En tal caso, la actividad de escisión del compuesto de prueba se puede evaluar utilizando el sistema de evaluación anteriormente mencionado.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un diagrama que muestra la estructura de multímero del vWF y el punto escindido por la proteasa de escisión del vWF.

La figura 2 es una fotografía que muestra el resultado del análisis de multímeros del vWF (electroforesis de agarosa).

La figura 3 es una fotografía que muestra el resultado de la SDS-PAGE (gel al 5%) para el análisis de la actividad de escisión del vWF de cada fracción de plasma en condiciones reductoras.

La figura 4 es una fotografía que muestra el resultado de la SDS-PAGE (gel al 5%) para el análisis de la muestra solubilizada de la pasta de fracción 1 (F1) en condiciones no reductoras.

La figura 5 es una fotografía que muestra el resultado del análisis de las fracciones de la proteasa de escisión del vWF después de ser sometido a cromatografía de filtración en gel tres veces utilizando la muestra solubilizada de pasta de F1 como material de partida. La figura 5A es un gráfico que muestra la cromatografía de filtración en gel, la figura 5B muestra el resultado de la SDS-PAGE en las fracciones en condiciones no reductoras y la figura 5C muestra los resultados de la SDS-PAGE en la actividad de escisión del vWF en condiciones reductoras.

La figura 6 es una fotografía que muestra los resultados del análisis de las fracciones de la proteasa de escisión del vWF en el que la fracción recogida por cromatografía de filtración en gel se purifica por medio de cromatografía de intercambio aniónico con DEAE. La figura 6A es un gráfico que muestra la cromatografía de filtración en gel, la figura 6B muestra el resultado de la SDS-PAGE (gel al 8%) en fracciones de elución en condiciones no reductoras y la figura 6C muestra los resultados de la SDS-PAGE en la actividad de escisión del vWF en condiciones reductoras. En la figura 6C, tres bandas indican una molécula de vWF intacta (que queda sin escindir), un fragmento de escisión de vWF y un fragmento de escisión de vWF, respectivamente, como en la figura 5C.

La figura 7 es una fotografía que muestra un fragmento sometido a electroforesis obtenido cuando la fracción de la proteasa de escisión del vWF purificada y concentrada por cromatografía de intercambio aniónico con DEAE se purifica además por SDS-PAGE basada en Biophoresis (condiciones no reductoras).

La figura 8 es una fotografía que muestra el resultado de la electroforesis en una fracción obtenida por purificación adicional de una fracción de la proteasa de escisión del vWF por SDS-PAGE basada en Biophoresis para el análisis de la actividad de escisión del vWF y la SDS-PAGE en las fracciones activas en condiciones reductoras. La figura 8A muestra los resultados de la SDS-PAGE para el análisis de la actividad de la proteasa de escisión de vWF en condiciones no reductoras y la figura 8B muestra los resultados de la SDS-PAGE para el análisis de las fracciones activas en condiciones reductoras.

La figura 9 se refiere a la identificación del gen de la proteasa de escisión del vWF, que es un diagrama que muestra los cebadores utilizados para amplificar el fragmento del gen para una sonda de transferencia Northern.

La figura 10 se refiere a la identificación del gen de la proteasa de escisión del vWF, que es una fotografía que muestra la autorradiografía de la transferencia Northern. La figura 10A muestra los resultados obtenidos cuando se usó el gen que codifica la proteasa como una sonda y la figura 10B muestra los resultados obtenidos cuando se utiliza una sonde de -actina (ARN de control).

La figura 11 se refiere a la identificación del gen de la proteasa de escisión del vWF, y es un diagrama que muestra las localizaciones y las secuencias de los cebadores utilizados en los experimentos RACE.

La figura 12 es un diagrama que muestra las localizaciones de los cebadores diseñados para la clonación del ADNc de longitud completa.

La figura 13 es un diagrama que muestra un proceso para la construcción de un vector que contiene el ADNc de longitud completa.

La figura 14 es una fotografía que muestra la expresión en varias líneas celulares (transferencia Western en condiciones reductoras utilizando anticuerpos anti-FLAG, donde el simulacro se prepara insertando de manera inversa un gen en un vector de expresión). En la figura 14, cada carril muestra los resultados utilizando la muestra indicada.

Carril 1: simulacro (huésped: célula 293) Carril 2: proteasa de escisión del vWF, ADNc + FLAG (huésped: célula 293) Carril 3: simulacro (huésped: célula HepG2) Carril 4: proteasa de escisión del vWF, ADNc + FLAG (huésped: célula HepG2) Carril 5: simulacro (huésped: células Hela) Carril 6: proteasa de escisión del vWF, ADNc + FLAG (huésped: células Hela)

La figura 15 es una fotografía que muestra el ensayo de actividad de la proteasa de expresión recombinante (análisis de escisión del vWF por SDS-PAGE en condiciones no reductoras, donde el simulacro se prepara insertando de manera inversa un gen en un vector de expresión). En la figura 15, cada carril muestra los resultados utilizando la muestra indicada.

Carril 1: simulacro (huésped: célula Hela) Carril 2: sobrenadante en el que se expresó la proteasa de escisión del vWF (huésped: célula Hela) Carril 3: simulacro (huésped: célula HepG2) Carril 4: sobrenadante en el que se expresó la proteasa de escisión del vWF (huésped: célula HepG2) Carril 5: simulacro (huésped: célula 293) Carril 6: sobrenadante en el que se expresó la proteasa de escisión del vWF (huésped: célula 293) Carril 7: simulacro (huésped: célula BHK) Carril 8: sobrenadante en el que se expresó la proteasa de escisión del vWF (huésped: célula BHK) Carril 9: simulacro (huésped: célula COS) Carril 10: sobrenadante en el que se expresó la proteasa de escisión del vWF (huésped: célula COS) Carril 11: simulacro (huésped: célula CHO) Carril 12: sobrenadante en el que se expresó la proteasa de escisión del vWF (huésped: célula CHO)

La figura 16 es una fotografía que muestra el resultado de la transferencia Western utilizando un anticuerpo establecido contra la proteasa codificada por los ADN de la presente invención, en la que la transferencia Western se lleva a cabo para varios antisueros usando la célula 293 como huésped y una proteasa de escisión del vWF recombinante. En la figura16, cada carril muestra los resultados obtenidos con el uso de la muestra indicada.

Carril 1: antisuero de ratón (preparado por la administración de la proteína purificada)

Carril 2: antisuero de conejo (preparado por la administración por vía hipodérmica de un vector de expresión a un conejo) Carril 3: antisuero de conejo sin tratar Carril 4: antisuero de conejo (preparado por la administración de péptido sintético parcial conjugado con KLH)

La figura 17 es una fotografía que muestra el resultado de la transferencia Western utilizando un anticuerpo establecido contra la proteasa codificada por los ADN de la presente invención, en la que varias muestras derivadas de plasma humano y las unidades de expresión recombinante se detectan utilizando antisuero de conejo obtenido mediante la administración de ADNc de longitud total de la proteasa de escisión del vWF. En la figura 17, cada carril muestra los resultados obtenidos con el uso de la muestra indicada.

Carril 1: muestra parcialmente purificada derivada de crioprecipitado de plasma humano Carril 2: proteasa de escisión de vWF purificada derivada de plasma humano Carril 3: muestra de pasta de FI filtrada en gel obtenida a partir de plasma humano

Carril 4: proteasa de escisión de vWF recombinante (huésped: célula 293) Carril 5: proteasa de escisión de vWF recombinante (huésped: célula Hela) La figura 18 es una fotografía que muestra el resultado de la transferencia Western utilizando un anticuerpo establecido contra la proteasa codificada por los ADN de la presente invención, en la que se utiliza antisuero de conejo obtenido por inmunización de un conejo con un péptido sintetizado parcialmente de la proteasa de escisión del vWF para confirmar la proteasa de escisión del vWP en el plasma humano de pacientes sanos y para confirmar la misma en el plasma y la proteasa de escisión del vWF procedente del gen recombinante de un paciente con PTT.

En la figura 18, cada carril muestra los resultados obtenidos con el uso de la muestra indicada. Carril 1: muestra de pasta de FI filtrada en gel obtenida a partir de plasma humano combinado Carril 2: plasma humano normal 1 Carril 3: plasma humano normal 2 Carril 4: plasma humano normal 3 Carril 5: plasma del paciente con PTT 1 Carril 6: plasma del paciente con PTT 2 Carril 7: proteasa de escisión del vWF recombinante (huésped: célula 293) Carril 8: proteasa de escisión del vWF recombinante (huésped: célula Hela)

La figura 19 es un diagrama que muestra el resultado del ELISA utilizando un anticuerpo preparado contra la

proteasa de escisión del vWF. La figura 20 es una fotografía que muestra el resultado de la SDS-PAGE (tinción de plata) para el análisis de cada fracción de la proteasa de escisión del vWF purificada por afinidad utilizando un anticuerpo en condiciones reductoras. En la figura 20, cada carril muestra los resultados obtenidos con el uso de la muestra indicada.

Carril 1: sobrenadante del cultivo aplicado (diluido 10 veces) Carril 2: fracción pasada a través Carril 3: fracción lavada Carril 4: fracción de elución

La figura 21 es una fotografía que muestra los resultados de la evaluación de la actividad neutralizante utilizando un anticuerpo (SDS-PAGE para el análisis de la actividad de escisión del vWF en condiciones no reductoras). En la figura 21, cada carril muestra los resultados obtenidos con el uso de la muestra indicada.

Carril 1: disolución de proteasa de escisión del vWF : suero normal de conejo = 1:1 Carril 2: disolución de proteasa de escisión del vWF : suero normal de conejo (diluido 5 veces) = 1:1 Carril 3: disolución de proteasa de escisión del vWF : suero de conejo inmunizado con el péptido = 1:1 Carril 4: disolución de proteasa de escisión del vWF : suero de conejo inmunizado con el péptido (diluido 5

veces) = 1:1

Carril 5: disolución de proteasa de escisión del vWF : suero de conejo inmunizado con la proteína recombinante = 1:1 Carril 6: disolución de proteasa de escisión del vWF : suero de conejo inmunizado con la proteína recombinante

(diluido 5 veces) = 1:1 Carril 7: disolución de proteasa de escisión del vWF : EDTA 10 mM = 1:1 Carril 8: disolución de proteasa de escisión del vWF : tampón solo = 1:1 Carril 9: tampón (sin proteasa de escisión del vWF) : tampón = 1:1

La figura 22 es un diagrama que muestra la construcción de un vector de expresión para una especie molecular que carece de un dominio C terminal.

La presente invención se describe a continuación en detalle con referencia a los siguientes ejemplos, aunque no se limita a estos ejemplos.

Ejemplo 1

(Preparación del vWF)

Se disolvió un crioprecipitado de plasma (2 g) en 20 ml tampón (Tween-80 al 0,01%/ Tris-HCl 50 mM/NaCl 100 mM, pH 7,4) y el resultante se sometió a filtración en gel utilizando una columna Sephacryl S-500 HR (2,6 x 90 cm, Amersham Pharmacia) para preparar el vWF. Las fracciones se recuperaron a un caudal de 2 ml/min en cantidades de 6 ml cada una. El vWF se analizó por medio de transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-vWF humano de conejo marcado con peroxidasa (DAKO), y se mezclaron las fracciones de vWF de alto peso molecular. Las fracciones combinadas se sometieron a análisis de multímeros utilizando electroforesis en agarosa como se describe a continuación.

Como se muestra en la figura 1, el vWF tenía originalmente estructura multimérica en la que las moléculas monoméricas de vWF están polimerizadas unas con otras en sus extremos N terminales o en sus extremos C terminales, y el vWF se sometió a hidrólisis parcial por la proteasa de escisión específica del vWF. Como resultado del análisis, según se muestra en la figura 2, el vWF purificado mostró un patrón multimérico en base a la electroforesis en agarosa aproximadamente equivalente al del plasma de una persona sana (la escala en el dibujo muestra el patrón de electroforesis del vWF que tiene una estructura multimérica, la parte superior indica vWF con polimerización avanzada). De esta manera se puede preparar el vWF sustancialmente sin impurezas que lo degraden, y esta fracción se utilizó como sustrato cuando se ensayó la actividad de escisión del vWF como se describe a continuación.

Ejemplo 2

(Reacción de escisión del VWF)

La actividad de escisión del vWF se ensayó de la siguiente manera. Se preincubó una muestra que comprendía cloruro de bario 10 mM (concentración final) a 37 ºC durante 5 minutos para activar la proteasa. Se colocó un tampón (15 a 20 ml, urea 1,5 M/Tris-HCl 5 mM, pH 8,0) en un tubo Falcon de 50 ml. Posteriormente, se colocó en el mismo un filtro de membrana (0,025 µm, Millipore) flotando y se añadieron 100 µl de la muestra activada preparada mezclándola con 50 µl de disolución de sustrato de vWF. El resultante se dejó en reposo en una incubadora (37 ºC) durante la noche y al día siguiente se recuperó del filtro. La muestra recuperada se evaluó en base al patrón de escisión del vWF como se describe a continuación en la sección “SDS-PAGE”.

SDS-PAGE

Se preparó y se utilizó gel de poliacrilamida al 5% con SDS de manera autóloga. Se añadió un tampón de electroforesis con SDS (2 µl, en presencia o ausencia de un agente reductor, es decir, 2-mercaptoetanol) a 10 µl de la muestra que se describe en la sección “ensayo de la actividad de escisión del vWF” y el resultante se hirvió durante 3 minutos para preparar una muestra de electroforesis. El gel se sometió a electroforesis a 30 mA durante 1 hora y a continuación se tiñó con el reactivo Gel Code Blue Stain (Pierce) utilizando tinción CBB. Como se muestra en la figura 1, la actividad se evaluó en base al desarrollo de un fragmento de escisión y la presencia o ausencia de fragmentos que quedaron sin escindir en condiciones reductoras o no reductoras. Esto se describe a continuación de manera más específica en el ejemplo 3 y en la figura 3.

Análisis de multímeros utilizando electroforesis en agarosa

Preparación del gel, electroforesis

Se añadió agarosa de baja temperatura de gelificación (Tipo VII, Sigma) a Tris-HCl 375 mM (pH 6,8) hasta alcanzar una concentración de 1,4%, posteriormente se calentó en un horno de microondas hasta la disolución total del gel. Después de esto, se añadió SDS al 0,1% y el resultante se mantuvo a 56 ºC. El resultante se vertió en un molde de gel y se dejó solidificar mediante enfriamiento a 4 ºC durante la noche (gel de desarrollo). Al día siguiente, se mezcló agarosa templada de alta gelificación (SeaKem) con Tris-HCl 375 mM (pH 6,8) hasta alcanzar una concentración de 0,8% y se disolvió por ebullición en un horno de microondas. Después, el resultante se mantuvo a 56 ºC (gel concentrador). Se escindió el gel preparado el día anterior, dejando una fracción de 10 cm desde el extremo sin escindir. El gel anteriormente mencionado se hizo fluir en la parte escindida. Se dejó fluir el gel a 4 ºC durante al menos 3 horas, seguido por la solidificación. Se añadió pironina Y a la muestra descrita en la sección anterior “ensayo de la actividad de escisión del vWF”, y el gel se preparó sin ebullición en condiciones no reductoras. El gel se sometió a electroforesis a 10 mA durante al menos durante 24 horas utilizando un tampón de SDS-PAGE.

Transferencia Western

Después de la electroforesis, se sumergió el gel en un tampón de transcripción (SDS al 0,005%, tampón de fosfato 50 mM, pH 7,4) durante 10 minutos y el resultante se transfirió a una membrana de nitrocelulosa utilizando un

aparato de transcripción a 4 ºC a 0,5 A durante la noche. El bloqueo se llevó a cabo utilizando una disolución de transferencia (leche desnatada al 5%, PBS) durante 30 minutos, a continuación se dejó reaccionar el gel durante al menos 6 horas con el anticuerpo anti-vWF humano de conejo marcado con peroxidasa (DAKO), que se diluyó 1000 veces con la disolución de transferencia. Posteriormente, se lavó el gel tres veces con la disolución de transferencia y una vez con PBS y se desarrolló el color utilizando Konica Immunostain HRP-1000 (Konica), que era una disolución de reacción con sustrato para la peroxidasa. Se encontró que el vWF purificado analizado en este ensayo no había sido degradado, pero era suficientemente útil como sustrato en la presente invención (Figura 2).

Ejemplo 3

(Preparación de la proteasa de escisión del vWF)

El plasma se sometió a fraccionamiento con etanol desarrollado por Cohn. Se seleccionó una proteasa con alta actividad de escisión del vWF (una con actividad específica alta) cuando los niveles de proteína en cuatro fracciones (es decir, plasma de partida, crioprecipitado, sobrenadante de fracción I (FI) y una pasta) se hacen equivalentes entre sí. Como se muestra en la figura 3, la actividad de la proteasa fue más alta en la pasta de FI. Se analizó la secuencia N terminal de este fragmento de escisión, y como resultado, se encontró que la actividad derivada del crioprecipitado y la pasta de FI escindía el enlace peptídico entre los restos Tyr 842 y Met 843. Por lo tanto, se determinó que la pasta de FI era un material de partida principal para la purificación después de esto.

Solubilización de la pasta de FI

Se fraccionó la pasta de FI en fracciones de 12 g cada una y a continuación se crioconservó. Se dejó fundir la pasta a 4 ºC el día anterior a su uso. Al día siguiente, se añadieron 120 ml de tampón de solubilización (azida al 0,05%, Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 100 mM) a 10 mg/ml, y la mezcla se agitó a 37 ºC durante 2 horas. El producto se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos, a continuación se recuperó el sobrenadante, posteriormente se realizó la filtración con un prefiltro, un filtro de 5,0 µm, y un filtro de 0,8 µm en ese orden. Se determinó que el resultante era una muestra solubilizada. La figura 4 muestra el resultado de la SDS-PAGE de la muestra solubilizada.

Cromatografía de filtración en gel de la proteasa de escisión del vWF

Se aplicó la pasta de F1 solubilizada a una columna Sephacryl S-300 HR (5 x 90 cm, Amersham Pharmacia) para llevar a cabo la primera filtración en gel. Se utilizó un tampón que comprendía azida al 0,05%, Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) y NaCl 100 mM (a continuación denominado en el presente documento “tampón de elución”), que era el mismo que el tampón de solubilización. El caudal fue de 5 ml/min, el fraccionamiento se inició a 600 ml después de la aplicación de la muestra y las fracciones se recuperaron en cantidades de 10 ml cada una. Las fracciones se sometieron a la reacción de escisión del vWF y sus actividades se analizaron mediante SDS-PAGE. Se mezclaron las fracciones que exhibieron actividad de proteasa y se añadió gradualmente gota a gota una pequeña cantidad de sulfato de amonio saturado a la combinación hasta alcanzar una concentración final del 33% de saturación. A continuación, se dejó la mezcla en reposo a 4 ºC durante la noche. Al día siguiente, el producto se centrifugó a

10.000 rpm durante 10 minutos, con lo que se recuperó una fracción activa de interés como un precipitado. Los procedimientos que comprendían la solubilización, la filtración en gel y la precipitación con sulfato de amonio se llevaron a cabo para 5 lotes y el resultante se crioconservó a -20 ºC.

Los precipitados obtenidos con sulfato de amonio (2 a 3 lotes) por la primera filtración en gel se disolvieron en 50 ml de tampón de elución y se hicieron pasar a través de la columna Sephacryl S-300 HR (5 x 90 cm) de la misma forma que en la primera filtración en gel para llevar a cabo la segunda filtración en gel. El tampón de elución, las condiciones, operaciones y similares fueron los mismos que los de la primera filtración en gel. Las fracciones se sometieron a la reacción de escisión del vWF y a continuación se analizaron sus actividades por medio de SDS-PAGE. Se mezclaron las fracciones con actividad y se realizó la precipitación con sulfato de amonio de manera similar. Estos procedimientos se repitieron dos veces.

Los precipitados obtenidos con sulfato de amonio (2 lotes) por la segunda filtración en gel se disolvieron en 50 ml de tampón de elución y se aplicaron a la columna Sephacryl S-300 HR (5 x 90 cm) de la misma forma que en la primera y segunda filtraciones en gel para llevar a cabo la tercera filtración en gel. El tampón de elución, las condiciones, operaciones y similares fueron los mismos que los de la primera y segunda filtración en gel. Las fracciones se sometieron a la reacción de escisión del vWF y a continuación se analizaron sus actividades por medio de SDS-PAGE, posteriormente se mezclaron. La figura 5 muestra la SDS-PAGE para el análisis de estas fracciones y la realizada para el análisis de la actividad de escisión del vWF. En base a los patrones de la filtración en gel y los datos que muestran la actividad, se encontró que la proteasa de la presente invención había eluido en la región entre la fracción 37 y la fracción 47. En base a un experimento de elución que se llevó a cabo de manera separada para el marcador de alto peso molecular de la filtración en gel (Amersham Pharmacia), se dedujo que este sitio de elución tenía un peso molecular equivalente a 150 hasta 300 kDa. En esta fase, aún había gran cantidad de impurezas.

Cromatografía de intercambio aniónico en DEAE

La fracción mezcla obtenida mediante las tres operaciones de filtración en gel se sometieron a diálisis durante la noche con un tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM y NaCl 50 mM (pH 7,1). Tras la diálisis, se llevó a cabo la cromatografía de intercambio aniónico utilizando una columna HiTrap DEAE-Sepharose Fast Flow de 5 ml (Pharmacia) para realizar otra purificación y concentración. El equilibrado y el lavado se llevaron a cabo utilizando un tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,1) y la elución se realizó con NaCl 0,25 M. El caudal fue de 5 ml/min y se recuperaron 5 fracciones de 5 ml cada una, que se mezclaron. La figura 6 muestra los resultados de la SDS-PAGE para el análisis de las fracciones de elución y los utilizados para el análisis de la actividad de escisión del vWF. En base a la SDS-PAGE para ensayar la actividad, la proteasa codificada por los ADN de la presente invención que tiene actividad de escisión del wWF estaba, de hecho, considerablemente concentrada en la fracción de elución.

Fraccionamiento por medio de SDS-PAGE

La muestra (5 ml) purificada y concentrada por medio de cromatografía de intercambio aniónico en DEAE se concentró más hasta 0,5 ml utilizando Centricon (valor de corte de peso molecular: 10.000 Da, Amicon). La proteasa codificada por los ADN de la presente invención se aisló por medio de Biophoresis III (Atto Corporation) utilizando SDS-PAGE. De acuerdo con el método de Laemmli (Nature, vol. 227, 680-685, 1970), se preparó un tampón para los tanques de electroforesis y se desarrolló con gel de poliacrilamida al 8% para recuperar la fracción de electroforesis. La figura 7 muestra el resultado de la SDS-PAGE para el análisis de las fracciones recuperadas. El tampón utilizado para la recuperación estaba compuesto por Tris-HCl 50 mM y glicerol al 10% (pH 8,8). Como resulta evidente a partir de la figura 7, este procedimiento tiene una gran capacidad para producir la separación. La figura 8 muestra los resultados del análisis de la actividad de una fracción más purificada por medio de electroforesis y los resultados de la SDS-PAGE para el análisis de las fracciones activas. La proteasa codificada por los ADN de la presente invención puede recuperarse como una molécula activa incluso después de la SDS-PAGE. Cuando se determinó que la actividad de esta proteasa en el plasma era 1 en términos de actividad específica, se pudo deducir que se había logrado un grado de purificación de 30.000 a 100.000 veces en base al contenido medio de proteínas en el plasma (60 mg/ml).

Ejemplo 4

(Determinación de la secuencia parcial de aminoácidos)

Se determinó la secuencia parcial de aminoácidos de la proteasa aislada. Esta proteasa, que se aisló utilizando Biophoresis, se transfirió a una membrana de PVDF después de la SDS-PAGE por una técnica convencional, se secó al aire y, a continuación, se sometió a análisis utilizando el secuenciador automatizado de proteínas (modelo 492; PE Applied Biosystems). Como resultado, se encontró que la proteasa de escisión del vWF codificada por los ADN de la presente invención aislada en las condiciones anteriores comprendía una cadena polipeptídica que tenía un peso molecular de 105 a 160 kDa en SDS-PAGE en condiciones reductoras. También se encontró que esta proteasa tenía, como secuencia parcial, Leu-Leu-Val-Ala-Val, y de preferencia, Ala-Ala-Gly-Gly-Ile-Leu-His-Leu-Glu-Leu-Leu-Val-Ala -Val.

Deducción de la proteasa aislada utilizando bioinformática

En la actualidad, la bioinformática permite la deducción de las secuencias de nucleótidos completas que codifican un polipéptido sin necesidad de la sustancial clonación de genes, a través de la recopilación de información de la base de datos acumulados en el pasado (BIOINFORMATICS: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, editado por Andreas D. Baxevanis y BFFrancis Ouellette). En base a la determinación de la secuencia parcial de aminoácidos mediante el proceso anteriormente mencionado (Ala-Ala-Gly-Gly-Ile-Leu-His-Leu-Glu-Leu-Leu-Val-Ala-Val), se buscó en la base de datos por medio del programa tblastn. Como resultado, mediante la búsqueda en las bases de datos genómicas se identificó un clon cromosómico (AL158826) que se dedujo que codifica la proteasa de la presente invención. Además, se identificó una parte de la proteasa de interés como la etiqueta de secuencia expresada (EST) y un clon que se dedujo que era una parte del polipéptido codificado por el genoma anteriormente mencionado (AI346761 y AJ011374). En base a esto se dedujo que la secuencia de aminoácidos como se muestra en la ID. SEC. Nº 3 o 7 correspondía a un sitio activo de la proteasa de escisión del vWF.

Ejemplo 5

(Identificación de genes)

Greiner Japan Co. Ltd realizó, a pedido, la síntesis de todos los siguientes cebadores sintéticos. Además, los reactivos utilizados para la recombinación de genes eran los fabricados por TAKARA, TOYOBO y New England Biolabs, a menos que se especificara en contra.

Preparación de un fragmento de gen como una sonda de transferencia Northern

Se preparó un cebador sentido (ID. SEC. Nº 9) y un cebador antisentido (ID. SEC. Nº 10). La PCR se llevó a cabo utilizando ADNc Universal QUICK-Clone™ (Clontech), que era una mezcla de ADNc derivado de tejido humano normal, como plantilla, y LA Taq TaKaRa con tampón rico en GC. Se amplificó un gen situado entre estos

cebadores, y el fragmento amplificado se clonó utilizando un kit TOPO TA cloning™ (Invitrogen). Se aislaron los ADN que tenían la secuencia de nucleótidos según se muestra en la ID. SEC. Nº 6 de varios clones.

Se eliminó una parte del vector de este ADN clonado por medio de la digestión con EcoRI, se separó y se purificó por electroforesis en agarosa y se determinó que el resultante era un molde para preparar sondas para la transferencia Northern.

Transferencia Northern

El fragmento del gen preparado anteriormente se utilizó como plantilla para preparar una sonda radioactiva utilizando [a-32P] dCTP (Amersham Pharmacia) y un kit de marcación BcaBEST™ (TAKARA). La hibridación se llevó a cabo utilizando el filtro Human 12-lane Multiple Tissue Northern Blots™ (Clontech) según el procedimiento descrito en Molecular Cloning 2ª edición, páginas 9.52-9.55. La detección se llevó a cabo por autorradiografía. Como se muestra en la figura 10, el ARNm que codifica la proteasa se expresó principalmente en el hígado. Se encontró que el tamaño de este ARNm era superior a 4,4 kb.

Aislamiento e identificación del gen que codifica la proteasa

Como resultado de la transferencia Northern, se encontró que el ARNm se expresaba principalmente en el hígado. Por consiguiente, el gen de la proteasa de la presente invención se aisló y se identificó según la técnica RACE utilizando ARN poli A+ derivado de hígado humano normal y ADNc Marathon-Ready™ (Clontech).

De manera más específica, la primera PCR se llevó a cabo como 5' RACE utilizando ADNc derivado de hígado humano normal ADNc Marathon-Ready™ según el manual del producto y utilizando el cebador AP-1 que se adjunta en el kit y los cebadores antisentido (ID. SEC. Nº: 11 a 13) seleccionados de manera arbitraria del grupo de Cebadores Específicos del Gen (GSP, por su sigla en inglés) excluyendo el cebador 1 situado en la parte superior de la secuencia según se muestra en la figura 11. A continuación se llevó a cabo la PCR anidada (la segunda PCR) utilizando el cebador AP-2, situado en el interior del mismo y el cebador antisentido situado en el interior del cebador utilizado para la primera PCR según se muestra en la figura 11. Después de esto, se llevó a cabo la clonación TA. Los genes se prepararon a partir de las colonias desarrolladas según una técnica convencional (Molecular Cloning 2ª edición, páginas 1.25 a 1.28) y a continuación se decodificaron las secuencias de ácidos nucleicos usando un secuenciador automático de ADN. El cebador utilizado para la secuenciación era el cebador usado para la PCR o un cebador situado en el interior del mismo. Además, el cebador se diseñó en base a la secuencia determinada después de la decodificación en serie.

La 3' RACE se inició partiendo de ARN poli A+ derivado de hígado humano normal y utilizando el 3'-Full Core RACE Core Set (TAKARA). La transcripción inversa se llevó a cabo según el manual adjunto utilizando el cebador de oligo dT adjunto. Se separó la banda amplificada mediante PCR utilizando el cebador sentido (ID. SEC. Nº 14) situado en el “cebador 2” en la figura 11 y el cebador de oligo dT adjunto por medio de electroforesis en agarosa y se extrajo, a continuación se realizó la clonación TA. Los genes se prepararon a partir de las colonias desarrolladas y las secuencias de ácidos nucleicos se decodificaron usando un secuenciador automático de ADN. Se diseño un cebador utilizado para la secuenciación en base a la secuencia determinada después de la decodificación en serie.

Ejemplo 6

(Preparación de un vector que comprende ADNc 1 de longitud total)

El ADNc que codifica la proteína se sometió a una PCR de una etapa utilizando, por ejemplo, un cebador sentido 1 (ID. SEC. Nº 22) que comprendía un sitio de restricción XhoI y un codón de iniciación y un cebador antisentido 2 (ID. SEC. Nº 23) que comprendía un sitio de restricción SalI y un codón de terminación (véase figura 12), utilizando el ADNc derivado de hígado humano normal de Marathon-Ready™ mencionado anteriormente como plantilla y la polimerasa LA Taq TaKaRa con tampón rico en GC, seguido por la clonación TA mencionada anteriormente. Después de esto, se confirmó la longitud total del producto usando un secuenciador automático de ADN.

Ejemplo 7

(Preparación de un vector que comprende ADNc 2 de longitud total)

Se encontraron los sitios de restricción AccI y AvrII que escindían el ADNc en un sólo punto de la secuencia interna del ADNc (ID. SEC. Nº 15) que codifica la proteína. Con el uso de los mismos, se dividió la longitud completa del ADNc en tres fragmentos, como se muestra en la figura 12. Se proporcionó un fragmento 1 situado entre el cebador sentido 1 (ID. SEC. Nº 22) y el cebador antisentido 3 (ID. SEC. Nº 24), un fragmento 2 situado entre el cebador sentido 4 (ID. SEC. Nº 25) y el cebador antisentido 5 (ID. SEC. Nº 26) y un fragmento 3 situado entre el cebador sentido 6 (ID. SEC. Nº 27) y el cebador antisentido 2 (ID. SEC. Nº 23), respectivamente, en cada uno de los anteriores tres fragmentos. Se sometió cada fragmento a PCR utilizando el ADNc derivado de hígado humano normal de Marathon-Ready™ mencionado anteriormente como plantilla y LA Taq TaKaRa con tampón rico en GC, seguido por la clonación TA mencionada anteriormente. La longitud total del producto se confirmó mediante un secuenciador automático de ADN. Además, el vector pCR 2.1 incluido en el kit de clonación TA mencionado

anteriormente se sometió a autounión, el producto de la unión se escindió con XhoI / HindIII, se unió a un conector que comprendía XhoI/AccI/AvrII/HindIII (preparado por medio de la hibridación del ADN sintético, según se muestra en la ID. SEC. Nº 28 o 29) y los tres fragmentos citados anteriormente se enlazaron secuencialmente de manera convencional para unirlos. Por consiguiente, el se preparó el ADNc que comprendía la región completa (véase figura 13).

Ejemplo 8

(Preparación de un vector de expresión que comprende ADNc de longitud total: una célula huésped animal)

Se digirió el ADN obtenido en el Ejemplo 6 o 7 con las enzimas de restricción XhoI/SaIl, se unió por ejemplo al sitio Sall en el vector pCAG (Niwa, H. y col., Gene, vol. 108, 193-199) y se confirmó la dirección de la inserción y la secuencia de longitud total usando un secuenciador automático de ADN.

Ejemplo 9

(Transfección de un vector de expresión que comprende ADNc de longitud total en una célula animal)

El vector de expresión para células animales preparado en el Ejemplo 8 se transfectó de la siguiente manera utilizando la célula 293 (línea celular de riñón embrionario humano), la célula Hela y la célula HepG2. Al principio, las células se diseminaron a razón de 1 a 3 x 105 células por placa de 35 mm, 24 horas antes de la transfección. Al día siguiente, se añadieron 2 µl de reactivo de transfección de poliamina, TransIT (TAKARA), por µg del vector de expresión, a 100 µl de un medio sin suero como Opti-MEM para preparar un complejo con ADN según las instrucciones incluidas en el reactivo. Después de esto, se añadió el complejo gota a gota a los diversos tipos de células preparadas previamente, y las resultantes se incubaron durante 2 a 8 horas, seguido por un cambio de medio. El medio se cambió además tres días más tarde por el medio selectivo al que se le había añadido G418. Después de esto, el medio se cambió cada tres días para producir una cepa expresada de manera estable. Un ejemplo de ello se muestra en la figura 14 como una cepa de expresión temporal que comprendía una etiqueta de epítopo FLAG en su extremo C terminal. La detección se llevó a cabo por medio de transferencia Western utilizando el anticuerpo anti-FLAG-M2 (Kodack) y tinción con el sistema de anticuerpos anti-Ig de ratón marcado con fosfatasa alcalina. La cepa recombinante expresada utilizando el ADNc como se muestra en este ejemplo presentó un tamaño molecular de aproximadamente 250 kDa en condiciones reductoras. Este tamaño molecular también se encontró en el plasma de un ser humano sano (Figura 18, Ejemplo 14 a continuación). Se encontraron diferentes especies moleculares de esta proteasa presentes en el plasma humano, lo que podría deberse a la presencia de los productos de corte y empalme alternativo (ID. SEC. Nº 6 a 21) observados en el momento de la clonación del gen, a diferencia en la modificación posterior a la traducción tal como la adición de cadenas de azúcares o a degradación durante la purificación (se describe en el Ejemplo 14 y en la figura 17 de la presente invención y en Gerritsen y col., Blood, vol. 98, 1654-1661 (2001)).

Posteriormente, se confirmó la actividad de escisión del vWF de la cepa recombinante por el procedimiento que se describe en el Ejemplo 2 (Figura 15). Como resultado, se encontró que la proteasa derivada del plasma humano y el producto recombinante del gen codificado por los ADN de la presente invención presentan las mismas actividades de escisión del vWF.

Ejemplo 10

(Preparación de un vector de expresión que comprende ADNc parcial: un huésped E. coli)

El ADNc parcial que codifica el dominio metaloproteasa de la proteína se sometió a PCR utilizando un cebador sentido que comprendía un sitio de restricción NcoI y un codón de iniciación (ID. SEC. Nº 30) y un cebador antisentido que comprendía un sitio de restricción HindIII y un codón de terminación (ID. SEC. Nº 31), el ADNc derivado de hígado humano normal Marathon-Ready™ mencionado anteriormente o el ADNc obtenido en el Ejemplo 6 o 7 como plantilla y la LA Taq Takara con tampón rico en GC. El producto de la PCR se digirió a continuación con NcoI/HindIII, se unió a la digestión con NcoI/HindIII de un vector de expresión de E. coli tal como pUT1 (Soejima y col., J. Biochem. Tokio, volumen 130, 269-277 (2001)), y se transformó en la célula competente de E. coli JM 109 mediante una técnica convencional. Se recogieron varios clones del grupo de la colonia formada, y se prepararon los genes a partir de los mismos. Después de esto, se confirmó que los genes resultantes eran los genes que codificaban el polipéptido, en los que la secuencia de ácido nucleico del sitio de inserción del vector plásmido era equivalente a la ID. SEC. Nº 32 o estaba representada sustancialmente por ID. SEC. Nº 33, utilizando un secuenciador de ADN automático.

Ejemplo 11

(Expresión del vector de expresión en E. coli que contiene ADNc parcial)

Se precultivó un huésped E. coli, con el vector de expresión construido en el Ejemplo 10 introducido en el mismo, en 200 ml de medio LB que comprendía ampicilina 50 µg/ml a 30 ºC durante la noche. Se sembró el resultante en un fermentador que comprendía 8 litros de medio LB, y el cultivo se llevó a cabo a 30 ºC hasta lograr una turbidez a

600 nm de 0,2 a 0,5. Después de esto, se añadió isopropil-1-tio--D-galactopiranósido a una concentración final de 1 mM y la mezcla se cultivó más durante la noche para inducir la expresión del dominio metaloproteasa de la proteína. La E. coli cultivada se recogió utilizando una centrífuga (4 ºC durante 30 minutos).

Posteriormente, el sedimento de E. coli recogido se resuspendió en agua destilada y se añadió lisozima (concentración final: 0,6 mg/ml) al mismo. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos, se dejó reposar a 4 ºC durante la noche y a continuación se lisaron las células. Después de la ultrasonicación, se llevó a cabo una centrifugación utilizando una centrífuga (4 ºC durante 20 minutos) y se recuperó el sedimento. El sedimento recuperado se resuspendió en un tampón que comprendía Tris 50 mM, EDTA 10 mM y Triton X-100 al 1% (pH 8,0). Estos procedimientos de centrifugación, ultrasonicación y resuspensión se repitieron varias veces, a continuación se resuspendió el sedimento en agua destilada. De manera similar, los procedimientos de centrifugación, ultrasonicación y resuspensión se repitieron varias veces para recuperar un cuerpo de inclusión. Este cuerpo de inclusión se utilizó como antígeno en la producción de un anticuerpo.

Ejemplo 12

(Aislamiento del gen homólogo de otras especies animales)

La secuencia de ácido nucleico según se muestra en la ID. SEC. Nº 15 se utilizó como sonda y se llevó a cabo la búsqueda de homología utilizando el programa BLASTN en el servidor WWW de GenomeNet (http://www.genome.ad.jp/). Como resultado, se obtuvieron los clones cromosómicos AC091762 y AC090008 que fueron mapeados en el cromosoma 10 de ratón. En base a estas secuencias, se dedujo un homólogo de la proteasa de ratón codificada por los ADN de la presente invención, como se muestra en la ID. SEC. Nº 34. A partir de esta secuencia se diseñó un nuevo cebador y el análisis de transferencia Northern se llevó a cabo mediante la técnica utilizada para aislar e identificar el gen que codifica la proteasa de escisión del vWF humano. Por lo tanto, se observó la aparición de la expresión específica en el hígado como en el caso de los seres humanos. Además, se utilizó ARN poli A+ derivado de hígado humano normal y ADNc Marathon-Ready™ (Clontech) para aislar e identificar el gen de proteasa de la presente invención mediante la técnica RACE como en el caso de los seres humanos. Como resultado, se determinaron las secuencias del gen homólogo de la proteasa de ratón como se muestra en la ID. SEC. Nº 35 y 36.

En base a la secuencia parcial homóloga de ratón determinada de esa manera, se determinó la estructura Exón/Intrón en el lado 5' del cromosoma 10 de ratón antes mencionado. Según una técnica convencional (por ejemplo, Gene Targeting: A Practial Approach First Edition, editado por A. L. Joyner, Teratocarcinomas and embryonic stem cell a practical approach), se puede preparar un vector dirigido a ratones con el gen inactivado (knock-out) o activado (knock-in) a partir de la misma. Esto permitió la producción de ratones mutantes. Además, esta proteína puede ser sometida a expresión recombinante mediante una técnica convencional.

Ejemplo 13

(Producción de un anticuerpo y construcción de un sistema de detección para la presente proteasa utilizando el anticuerpo)

Según una técnica convencional (por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology: Chapter 11 immunology, Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH, editado por J. McCAFFERTY y col. o ANTIBODY ENGINEERING segunda edición, editado por Carl A. K. BORREBAECK), se administró un vector de expresión a un ratón o una rata. Este vector de expresión comprende una sustancia preparada opcionalmente mediante la unión de una proteína antígeno parcialmente purificada de plasma humano o un péptido sintético que tiene una secuencia parcial de aminoácidos de la misma (por ejemplo, una secuencia C terminal del péptido (ID. SEC. Nº 37) Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Gln-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Glu-Asn-Ser-Val-Gln-Ser-Ser, que era una isoforma de la proteasa codificada por los ADN de la presente invención) a una sustancia vehículo óptima tal como KLH (se añadió Cys, por ejemplo, al extremo N terminal o C terminal para facilitar la adición de KLH), a la proteína recombinante del gen anteriormente mencionado, o a un gen que codifica esta proteína. De esta manera, se estableció un hibridoma que expresaba el anticuerpo monoclonal, y se produjo un anticuerpo policlonal (antisuero).

A continuación, se utilizaron los anticuerpos preparados por las diversas técnicas mencionadas anteriormente para detectar la proteasa codificada por los ADN de la presente invención mediante transferencia Western según una técnica convencional (por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology: Chapter 10 analysis of proteins, Chapter 11 immunology). De manera más específica, el sobrenadante del cultivo de la célula 293 que expresa la unidad recombinante obtenido en el procedimiento como se describe en el Ejemplo 9 se sometió a SDS-PAGE en condiciones no reductoras, se transfirió a una membrana de PVDF y se confirmó utilizando antisuero de ratón o de conejo para confirmar la expresión de la unidad recombinante genéticamente (Figura 16). Como resultado, se encontró una banda que se dedujo que derivaba de la proteasa codificada por los ADN de la presente invención en un intervalo de tamaño molecular de 160 a 250 kDa. Posteriormente, se detectó la proteasa codificada por los ADN de la presente invención utilizando plasma de partida o similar y una unidad recombinante en condiciones no reductoras. Como resultado, se encontró una banda en 105 a 160 kDa o de 160 a 250 kDa (Figura 17). Además, se

detectó una banda derivada de una unidad recombinante similar en un anticuerpo monoclonal establecido mediante la inmunización con una proteína recombinante (clon Nº CPHSWH-10).

Además, la secuencia C terminal del péptido Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Gln-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Glu-Asn-Ser-Val-Gln-Ser-Ser (ID. SEC. Nº 37), que era una isoforma de la proteasa codificada por los ADN de la presente invención, se unió a KLH. El resultante se utilizó como inmunógeno para obtener un anticuerpo contra el péptido. Con el uso del mismo, se detectó la proteasa codificada por los ADN de la presente invención en el plasma de personas sanas, en el plasma de pacientes con PTT, o en un sobrenadante de cultivo de la unidad recombinante en condiciones reductoras. Como resultado, se encontró una banda de aproximadamente 250 kDa que se dedujo que era una señal derivada de la proteasa codificada por los ADN de la presente invención, aunque no resultó clara cuando se usó plasma derivado de algunos pacientes con PTT (Figura 18).

Además, el inmunoensayo enzimático (ELISA) construido mediante la combinación de los anticuerpos obtenidos permitió la preparación de una curva de calibración que es dependiente de la concentración en el nivel de sobrenadante del cultivo de la proteína recombinante (Figura 19). Un ejemplo de ELISA es el siguiente. El anticuerpo anti proteasa de escisión del vWF de ratón obtenido se inmovilizó en la placa Maxisorp (Nunc) y se dejaron reaccionar diluciones 1/1, 1/2 y 1/4 del sobrenadante del cultivo de las células 293 que expresaban de manera temporal la proteasa de escisión del vWF en cantidades de 100 µl/pocillo (sobrenadante del simulacro como "0"). La placa se sometió a reacción, por ejemplo, a 37 ºC durante 1 hora y a continuación se lavó con Tween 20 al 0,05%/TBS. Después de esto, se dejó reaccionar el anticuerpo anti proteasa de escisión del vWF de conejo diluido 100 veces en cantidades de 100 µl/pocillo, por ejemplo, a 37 ºC durante 1 hora y se lavó la placa con Tween 20 al 0,05%/TBS. El anticuerpo anti Ig de conejo marcado con peroxidasa diluido 1000 veces (BioRad) se dejó reaccionar a continuación en cantidades de 100 µl/pocillo, por ejemplo, a 37 ºC durante 1 hora y la placa se lavó con Tween 20 al 0,05%/TBS. Después de esto, se desarrolló el color durante un período de tiempo determinado usando un sustrato de coloración TMBZ, la reacción se detuvo utilizando ácido sulfúrico 1M como líquido de terminación y se ensayó la absorbancia a 450 nm. La aplicación del mismo permitió la cuantificación de la proteasa codificada por los ADN de la presente invención en una variedad de especímenes.

Ejemplo 14

(Purificación de la proteasa utilizando un anticuerpo)

El anticuerpo obtenido se unió a un vehículo de inmovilización adecuado para preparar una columna de afinidad y la columna resultante se usó para purificar la proteasa codificada por los ADN de la presente invención. La columna de afinidad se preparó mediante la inmovilización de un anticuerpo utilizando Cellulofine para la activación del NHS (Chisso Corporation), de acuerdo con las instrucciones que se incluyen. El vehículo cargado preparado de esta manera (aproximadamente 1 ml) se utilizó para aplicar el sobrenadante de cultivo en el que el gen recombinante había sido expresado en la célula 293 de la proteasa como se describe en el Ejemplo 9. Posteriormente, la columna se lavó con Tris-HCl 50 mM y NaCl 0,1 M (pH 7,5, a continuación en el presente documento se denomina "TBS") y la elución se llevó a cabo utilizando un tampón de glicina 0,1 M que contenía urea (pH 3). La fracción eluida se neutralizó con Tris-HCl 1M (pH 8,5) y a continuación se dializó frente a TBS. La Figura 20 muestra los resultados de los análisis de SDS-PAGE de la proteasa purificada resultante. También, se encontró que la fracción purificada resultante tenía actividad de escisión del vWF. Se encontró que el punto de escisión del vWF fragmentado por esta proteasa recombinante era la posición entre los restos Tyr 842 y Met 843 en base al análisis de la secuencia de aminoácidos N terminal del fragmento. También se establecieron clones (por ejemplo, clones Nº CPHSWH-7.2 y 10) que podían someterse de manera similar a purificación con el uso del anticuerpo monoclonal preparado por el procedimiento según se describen en el Ejemplo 13.

A continuación, se determinó la secuencia parcial de aminoácidos de la proteasa purificada. Según una técnica convencional, la proteasa se sometió a SDS-PAGE, se transfirió a una membrana de PVDF, se secó al aire y a continuación se sometió a un análisis usando un secuenciador de proteínas automatizado (modelo 492; PE Applied Biosystems). Como resultado, se encontró que la proteasa comprendía Ala-Ala-Gly-Gly-Ile- como una secuencia parcial N terminal. Esta secuencia era congruente con la secuencia N terminal de la unidad madura de la proteasa codificada por los ADN de la presente invención que se dedujo a partir de la construcción genética.

Ejemplo 15

(Neutralización de la actividad proteasa utilizando un anticuerpo)

Se evaluó la actividad del anticuerpo policlonal de conejo mencionado anteriormente para neutralizar la proteasa de escisión del vWF. El suero de conejo normal, el antisuero de conejo que comprendía la secuencia C terminal del péptido (ID. SEC. Nº 37), Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Gln-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Glu-Asn-Ser-Val-Gln-Ser-Ser unida a KLH como inmunógeno, y el antisuero, cuya inmunidad había sido inducida por la proteína expresada por el vector de expresión según se muestra en el Ejemplo 7 u 8, se dejaron prerreaccionar respectivamente a 37 ºC durante 1 hora con 1 a 10 µg/ml de la proteasa de escisión del vWF recombinante del gen (aproximada por la técnica de Bradford) en una relación de volumen de 1:1. Como alternativa, se dejó prerreaccionar un antisuero diluido 5 veces en las condiciones anteriores con la proteasa en una relación de volumen de 1:1. Después de esto,

se evaluó la actividad de escisión del vWF por el procedimiento descrito anteriormente. Como resultado, se encontró que el antisuero, que tenía actividad de inhibición de la proteasa codificada por los ADN de la presente invención, era el que se había preparado mediante la inmunización con la proteína (Figura 21). (actividad antagonista) (se determinó que un inhibidor de metaloproteasa, por ejemplo, EDTA, era un control). Esto indica la posibilidad de construir un modelo similar al paciente con PTT adquirida que tiene un autoanticuerpo positivo contra la proteasa de escisión del vWF así como la simple posibilidad de producir un anticuerpo neutralizante.

Ejemplo 16

(Construcción de la unidad con modificación de C terminal eliminado)

En base a la estrategia que se muestra en la Figura 22, el vector de clonación del gen de la proteasa de escisión del vWF de longitud total (pCR 2.1 vWFCP) obtenido en el Ejemplo 6 o 7 se utilizó para añadir una variante que carecía de dominios situados en una posición siguiente al extremo C terminal (T1135parada, W1016parada, W897parada, T581parada y Q449parada: cada valor numérico indica la cantidad de restos de aminoácidos entre Met codificado por el codón de iniciación AGT y el codón de terminación, e indica un sitio que comprende el epítopo FLAG (secuencia de ADN: gactacaaggacgatgacgataagtga (ID. SEC. Nº 47) y la secuencia de aminoácidos: Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys (ID. SEC. Nº 48)). Los cebadores utilizados en el presente documento son los siguientes. "S" indica un cebador sentido y "AS" indica un cebador antisentido. Los genes Stu I-S (ID. SEC. Nº 38), Acc I-S (ID. SEC. Nº 39), Avr II-S (ID. SEC. Nº 40), Q449parada-AS (ID. SEC. Nº 41), T581parada-AS (ID. SEC. Nº 42), W897parada-AS (ID. SEC. Nº 43), W1016parada-AS (ID. SEC. Nº 44), T1135parada-AS (ID. SEC. Nº 45), y AS de longitud total (ID. SEC. Nº 46) se prepararon y se incorporaron en el vector de expresión pCAG de acuerdo con el procedimiento utilizado en los Ejemplos 8 y 9. Este vector de expresión se introdujo en la célula Hela. El par de cebadores que se muestra en la parte inferior del mapa de restricción en la parte superior de la Figura 22 se utilizó para obtener fragmentos de PCR (A) a (F). Cada fragmento de PCR se unió a pCR 2.1 vWFCP. Además, el resultante se digirió con StuI/SalI y los fragmentos (A) y (B) se digirieron con StuI/SalI y a continuación se unieron. Estos fragmentos además se digirieron con AccI y el fragmento (C) también se digirió con AccI, seguido por la unión. El producto de la unión se digirió con AvrII/SalI y los fragmentos (D), (E) y (F) también se digirieron con AvrII/Sall, seguido por la unión. Como resultado, se encontró que una variante que carecía de una región entre el extremo C terminal y la posición W897 tenía actividad, a pesar de que fue el resultado de un análisis cualitativo. Tal forma de enfoque permite la identificación de diferentes dominios funcionales. El diseño de moléculas que comprenden estos dominios y que no tienen ninguna actividad proteasa se considera para realizar el diseño de los antagonistas o agonistas.

Aplicabilidad industrial

Los hallazgos de la presente invención han dado lugar a la posibilidad de terapia de reemplazo para pacientes con enfermedades causadas por la deficiencia de una proteasa, tal como la púrpura trombocitopénica trombótica. Esta invención también reconoce el establecimiento de procedimientos para la clonación de genes y la purificación eficiente del suero o plasma. En particular, la información proporcionada por la presente invención permite la recombinación de genes basada en la secuencia de nucleótidos obtenida y la producción y provisión estable de la proteasa codificada por los ADN según la presente invención, que hasta ahora han sido difíciles de lograr. Además, estas pueden aplicarse a terapias de reemplazo para pacientes con PTT, para la inhibición de la formación de trombos hemostáticos implicados en el infarto de miocardio o infarto cerebral, la inhibición de arteriosclerosis, la prevención de restenosis, reembolización o infarto implicados en la ACTP, la prevención de la reembolización implicada en la RCTP y la prevención de la formación del trombo hemostático causados por el SUH o por O-157. El diagnóstico y tratamiento se pueden realizar utilizando el gen que codifica la proteasa de la presente invención o un anticuerpo contra la misma.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> JURIDICAL FOUNDATION THE CHEMO-SERO-THERAPEUTIC RESEARCH INSTITUTE

<120> proteasa de escisión del vWF

<130> PH1553-PCT

<160> 48

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

5 <210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10

<400> 2

Leu Leu Val Ala Val 1 5

Ala Ala Gly Gly Ile Leu His Leu Glu Leu Leu Val Ala Val 1 5 10

<210> 3 15 <211> 161

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 15

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 4 ctgctggtgg ccgtg 15 15 <210> 7

<210> 5

<211> 42

<212> ADN

<213> Homo sapiens

5

<400> 5

gctgcaggcg gcatcctaca cctggagctg ctggtggccg tg: 42

<210> 6

<211> 483

10: <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 6

<211> 161

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 29

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9 10 <211> 30

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 9 15 gctgcaggcg gcatcctaca cctggagctg 30

<210> 10

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens 20

<400>: 10 cccaatctca tgggcaatgg t 21

<210> 11

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens 5

<400> 11 cccaatctca tgggcaatgg t 21

<210> 2

<211> 30 10 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 12 ccgatgttga ggttggtgag cacatagcgc 30 15 <210> 13

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

20 <400> 13 gtgtcgtcct cagggttgat 20

<210> 14

<211> 21

<212> ADN 25 <213> Homo sapiens

<400> 14 accattgccc atgagattgg g 21

<210> 15 30 <211> 4950

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400>: 15

<210> 16

<211> 1353

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 1297

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 1378

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

<210> 19

<211> 1322

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

<210> 20

<211> 312

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

<210> 21

<211> 270

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22

<211> 43

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 22 ggactcgagc caccaatgca ccagcgtcac ccccgggcaa gat 43

<210> 23

<211> 45

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 23 tccgtcgact cattatcagg ttccttcctt tcccttccag gactg 45

<210> 24

<211> 30

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 24 ggttggcaat gtagacactg gtcaggttgg 30

<210> 25

<211> 30

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 25 ccaacctgac cagtgtctac attgccaacc 30

<210> 26

<211> 30

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 26 ctttccacct aggtgggcag ggctccaggc 30

<210> 27

<211> 30

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 27 gcctggagcc ctgcccacct aggtggaaag

<210> 28

<211> 33

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 28 tcgagaaaaa gtctacgggg gcctaggttt tta

<210> 29

<211> 33

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 29 agcttaaaaa cctaggcccc cgtagacttt ttc

<210> 30

<211> 30

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 30 tcggccatgg ccgcaggcgg catcctacac

<210> 31

<211> 28

<212> ADN

<213> Homo sapiens

5: <400> 31 ggcaagctta tcagcggggc gcggcgcc <210> 32 <211> 564 <212> ARN <213> Homo sapiens 28

10: <400> 32

<210> 33

<211> 184 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

<210> 34

<211> 2529

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 34

<210> 35

<211> 2514

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 35

<210> 36

<211> 3512

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 36

<210> 37

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400>: 37

<400>: 40

<210> 38

10: <211> 30

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 38

15: atgtgcaaca ctcaggcctg cgagaagacc 30

<210> 39

<211> 30

<212> ADN

<213> Homo sapiens

20

<400> 39

ccaacctgac cagtgtctac attgccaacc: 30

<210> 40

<211> 21

25: <212> ADN

<213> Homo sapiens

ctggagccct gcccacctag 21

<210> 41

<211> 62

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 41

<210> 42

<211> 62

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 42

<210> 43

<211> 62

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 43

<210> 44

<211> 62

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 44

<210> 45

<211> 62

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 45

<210> 46

<211> 60

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 46 tccaagcttg tcgactctta tcacttatcg tcatcgtcct tgtagtcggt tccttccttt 60

<210> 47

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 47 gactacaagg acgatgacga taagtga 27

<210> 48

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética

<400> 47

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Un ADN que codifica una proteasa que es capaz de escindir un enlace entre los restos Tyr-842 y Met-843 del factor de von Willebrand (vWF), que comprende una secuencia de nucleótidos según se muestra en ID. SEC. Nº 6. 2.- Un ADN que codifica una proteasa que es capaz de escindir un enlace entre los restos Tyr-842 y Met-843 del

5 vWF, que comprende una secuencia de nucleótidos según se muestra en ID. SEC. Nº 15. 3.- Un ADN que codifica una proteasa que es capaz de escindir un enlace entre los restos Tyr-842 y Met-843 del vWF, que comprende una secuencia de nucleótidos según se muestra en ID. SEC. Nº 7.
4.- Un vector que comprende el ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 5.- Una célula transformada o transfectada con el vector según la reivindicación 4.

10 6.- Una célula huésped transformada o transfectada con el vector según la reivindicación 4. 7.- Una composición farmacéutica que comprende el ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 8.- La composición farmacéutica según la reivindicación 7, para su uso en terapia génica para el tratamiento de la

púrpura trombocitopénica trombótica (PTT). 9.- Un agente de diagnóstico que comprende el ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 15