WO2002088366A1

WO2002088366A1 - Enzyme de clivage du facteur de von willebrand (vwf)

Info

Publication number: WO2002088366A1
Application number: PCT/JP2002/004141
Authority: WO
Inventors: Kenji Soejima; Noriko Mimura; Hiroaki Maeda; Chikateru Nozaki; Takayoshi Hamamoto; Tomohiro Nakagaki
Original assignee: Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute
Priority date: 2001-04-25
Filing date: 2002-04-25
Publication date: 2002-11-07
Also published as: EP1391516A4; AU2008243279A1; ATE525471T1; CN1537167A; AU2008201773A1; US20080254527A1; JP2008109938A; EP1956093B1; US7112666B2; US7361748B2; ES2373482T3; AU2008201773B2; CN100537770C; JP4163517B2; CA2445421C; JPWO2002088366A1; US20060073569A1; AU2008243279B2; CA2445421A1; KR101047604B1

Description

フォンビルブラント因子（ V WF )切断酵素技術分野

本願発明は、医療用医薬品の分野に係る血漿蛋白質に関する。詳細には、血液凝固に関与するフォンビルブラント因子 (_von Willebrand Factor：以下、 vWFと称することがある）の特異的切断酵素に関する。本願発明で提供される vWF切断酵素により血检性血小板減少性紫斑病（thrombotic thrombocytopenic purpura ：以下、 TTPと称することがある）等の当該酵素の欠損または低下に起因する疾病患者への補充療法の可能性が拓かれる。加えて、新規な抗血小板血栓薬としての利用も見込まれる。背景技術

vWFは、血管内皮細胞や骨髄巨核球で産生され、 2050ァミノ酸残基（モノマー約 250 kD a )からなる単一サブュニットが S— S結合にて結ばれたマルチマー構造 (分子量 500〜 20，000 kD a)を持って存在している止血因子である。血中濃度は約 10 μ g/m 1で、一般に高分子量のものほど比活性が高い。

vWFには 2つの大きな止血因子としての機能があり、 1つは血液凝固第 VIII因子と結合し、これを安定ィヒさせるキャリアー蛋白質としての働き、もう 1つは傷害血管壁の血管内皮細胞下組織に血小板を粘着 ·凝集させ、血小板血栓を形成する機能である。

血栓性血小板減少性紫斑病は、全身の体組織細動脈と毛細血管に血小板血栓を生じる疾患であり、今日の医療技術の進歩にもかかわらず、当該疾患での関連死亡率は 1971〜 1991年にかけて約 3倍に増加している。病理学的に、 TTPは血管内皮細胞障害や血管内血小板凝集によって惹き起こされると考えられており、免疫組織学的には生じた血小板血栓中に多量の vWFの存在が認められ、 V WFがこの成因に大きな役割を果たしていると考えられている。 TT P患者の V WFのマルチマ一構造は正常もしくは高分子量が優位となっており、特に通常では見られない超高分子量の vWF (unusually large vWF mul timer： UL vWFM)や高分子量 v WF重合体（large vW multimer : L vWFM)が、高ずり応力下での血小板凝集の促進と微小血栓形成に大きな役割を果たしていることが推察される。一方で、 vW Fは健常人の循環血液中で高ずり応力下、 vWF切断酵素（vWF- cleaving protea se)の作用により 842Tyr_843Me tの位置で分解を受けることが知られていた。したがって、 TTPは血漿中の当該酵素活性が何らかの原因で低下して、 U L vWFM〜L vWFMが増加して血小板凝集が亢進し、血管内に血小板血栓が形成されるためというシナリオが描かれている。

最近、 Fur l anら（B l ood, vo l. 87, 4223-4234 : 199 6、特表 2000— 508,918)、 Ts a iら（B 1 o o d, vo l. 87, 42 35-4244： 1996)により vWF特異的切断酵素の測定法が考案され、 TT Pでは、事実この酵素活性が低下していることが報告された。そして前記報告の著者等は当該酵素が血漿中のメタ口プロテア一ゼであることを示し、部分精製したことを報告したが、当該酵素を特定化するようなアミノ酸配列の決定等には至らずそれ以来進展がない。発明の開示

vWF特異的切断酵素の先天的欠損患者および後天性の当該酵素に対する抗体陽性患者の治療法として、現在まで血漿交換療法が施されており、当該酵素の精製品または遺伝子組換え体等純品による補充療法の確立が望まれる。家族性 TT P患者は、先天的に vWF特異的切断酵素が欠損しており、非家族性では後天的に当該酵素に対する自己抗体の産生が原因と報告されている。したがって、家族性 TTP患者には、本酵素の補充療法が望ましく（現実には血漿投与が行われている）、非家族性では、血漿交換による自己抗体の除去と本酵素の補充が必要である。さらに、本酵素の利用は新規な抗血小板血栓薬としての応用も見込まれる。

しかし、 vWF切断酵素は、前述のごとく Fu r l anら（B l ood, vo l. 87, 4223— 4234 : 1996、特表 2000— 508918)、 Ts a iら (B l ood, vo l. 87, 4235— 4244 : 1996 )により、血漿中のメ夕口プロテアーゼであることが示唆され、部分精製したこと、そしてその比活性において血漿から 1, 000〜10, 000倍濃縮されたと報告されているが、この条件下でもなお、これ以来現在までおよそ 5年間に渡って、その蛋白質のアミノ酸配列など本酵素本体の性状解析には進展が無く、未だ本酵素に関しての具体的、生化学的情報は一切得られていない。これは、 Fu r 1 anらの報告にもあるように、目的蛋白質が巨大であることが示唆されており、これに伴う、様々な問題点が考えられる。例えば、様々な相互作用分子ゃコファクターの存在など、本酵素の存在様式の多様性が想定され、精製法の複雑化、さらには、精製ステップでの非特異的な相互作用による分離能の低下などから、 Fur l anらの血漿画分からの精製法では本酵素の単離同定に至るには大きな困難性が立ちふさがつていたことが推察された。

上述の状況の下、本願発明者等は vWF切断酵素の単離同定を達成するべく、鋭意研究を重ねた結果、従来報告のなかった所望の vWF切断酵素の精製単離に成功し、その成熟型蛋白質のアミノ酸配列及び当該アミノ酸配列をコードする遺伝子を同定するに至った。

本願発明の vWF切断酵素は、 vWFの 842Ty r- 843Me tの結合を切断し得る性状を有し、一態様として還元あるいは非還元条件下の SDS— PAGEにおいて 105〜160kDaまたは 160〜250kDaの分子量を有することが例示され、部分配列として Leu-Leu - Val-Ala-Valを含有するポリぺプチド鎖よりなり、より好適には Ala- Ala- Gly- Gly- lie- Leu- His- Leu-Glu- Leu- Leu- Val- Ala- Valの成熟型蛋白質の N末端側アミノ酸部分配列を含有するポリぺプチド鎖よりなる。そして、下記の性状によって特徴付けられる新規な物質である。

1) vWF切断活性

本願発明酵素は、切断断片の N末端配列解析の結果、 842Tyr— 843Me tのペプチド結合を切断する。

2)ゲル濾過による分画 '

F Iペーストを出発材料とした場合、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて分画を行なうと、分子量が 1 5 0 kDa〜 3 0 0 kDaのサイズにほとんどの活性が回収されるが、実際に得られる本発明中の活性物質の一例では電気泳動で 1 0 5〜1 6 O kDa 程度の分子量を示すことから、二量体等の形成あるいは他の分子と結合しやすい可能性のある物質、または易分解性、あるいは糖鎖付加の不均一性を有しうる物質でめる。

3)硫安沈澱

例えば、 F Iペーストを出発原料とした場合、粗精製画分中で 3 3 %飽和硫安で本酵素の大部分は沈殿画分として回収される。

4) S D S - P A G E

例えば、ヒ卜プール血漿を原料とした F Iペーストあるいはクリオプレシピテー卜由来の本酵素は、 SDS-MGEにおいて、主に、分子量マーカーの 1 0 5 kDa〜l 6 0 kDa程度の分子サイズを示す。そして、配列番号 1 5の核酸配列を基に、 4 4 5番目以降 atgの開始コドンから 4 7 2 6番目以下の tgaまでの終結コドンを含んだフレームで表されるアミノ酸配列を遺伝子組換え技術を用いて発現させた場合、宿主により多少の分子サイズは異なるものの、概ね、分子量マーカ一の 1 6 0 kDa〜2 5 O kD a程度の分子サイズを示す。そして、このサイズのものは、ヒト健常者及び一部の T T P患者の血漿中にも認められる。また、この酵素は、遺伝子のクローニングの際に認められた al ternat ive spl icing産物（配列番号 16〜21) などの存在、糖鎖付加などの翻訳後修飾の違い、あるいは精製工程中での分解に起因すると思われる複数の分子種がヒト血漿中では存在する。さらに、本酵素は、非還元下の SDS-PAGE後、活性を有する状態で回収可能である。

5)アミノ酸配列分析

単離されたポリぺプチド断片のアミノ酸配列の解析の結果、部分ァミノ酸配列として Leu_Leu_Va卜 Ala- Valの配列を有し、成熟型蛋白質の N末端側アミノ酸配列として、 Ala- Ala- Gly- Gly- I le_Leu- His- Leu- Glu_Leu- Leu- Va卜 Ala- Valの配列を有するポリペプチド鎖より例示されることが明らかとなった。そしてさらには、現在のバイォインフォ一マテイクスの方法（BIOINFOMATICS : A Pract ical Guide to the Anal ys is of Genes and Proteins edi ted by Andreas D. Baxevanis and B. F. Francis Oue l let te) により、前記部分配列を基に、データベースサーチにより、信頼性高く、本アミノ酸配列をコードする核酸配列の同定を行うに至った。具体的には、プログラム tblas tnによりゲノムでのデータベースサーチを行った結果、本願発明の酵素をコードしていると推察される染色体クローン（AL158826) が同定され、さらに、 E S T (Expressed Se uence Tag) デ一夕ベースとの照合により、目的酵素の一部分及び上記ゲノムによりコードされるポリペプチドの一部と推察されるクローン

(AI346761及び AJ011374) を同定した。これを基に vWF切断酵素としての活性部位として配列番号 3または 7に示すアミノ酸配列を同定した。

配列としてゲノムから想定される GCT GCA GGC GGC ATC CTA CAC CTG GAG

CTG CTG GTG GCC GTG、より好適には E S Tによりそのトランスクリプトームが確認されている部分としての CTG CTG GTG GCC GTGが得られた。そして、得られた塩基の配列解析、アミノ酸への推定からモチーフ解析を行い、本願発明の酵素の一つの候補として、メタ口プロテアーゼドメインを有していることが推察できた。上記知見により、さらにより具体的な当該酵素の一つとしてのポリペプチド鎖の配列を開示できるに至った。また、酵素は一般的にそのアミノ酸配列の一部の置換あるい欠失、挿入、点変異の導入等でその活性が変化することが知られている（血夜凝固第 VI I因子の改変体；副島ら特開 2 0 0 1— 6 1 4 7 9 )。それで、本願発明の酵素においてもこれらと同様に 1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されるなどの改変操作で、より最適化された酵素の作製が可能である。

さらなる本酵素蛋白質の大量調製を行い、 Ν末端から 2 9個のアミノ酸配列を決定した。そのアミノ酸配列を配列番号 8に示す。この結果は、バイオインフォ一マテイクスを用いて推定された配列番号 3または 7記載の配列とほぼ一致しており、唯一異なったのは 2 7位のアミノ酸が、配列番号 3または 7記載のものが G 1 uであるのに対して、今回の Ν末端配列解析では A r gであった点であるが、これは遺伝子多型（ポリモルフィズム）と考えられた。これにより、本酵素はその成熟体として N末端に配列番号 3または 7記載のアミノ酸配列を有するポリぺプチド鎖からなることが確認された。そこで、本酵素をコードする遺伝子断片を以下の手順でクローニングした。配列番号 7中の核酸配列に依拠し、図 9中の下線部位で示される核酸配列を基に、センスプライマ一（配列番号 9) 及びアンチセンスプライマー（配列番号 10) を作製し、プライマーで挟まれた部分の遺伝子を増幅した。その断片をクロ一ニング後、塩基配列を確認した。当該断片をプローブとし、ノーザンプロット解析により、本酵素遺伝子の発現部位を確認した。その結果、本酵素遺伝子は肝臓で特徴的に発現していることが確認された。これにより、ヒト肝臓 cDNAライブラリ一を購入し、 RACE法（Rapid Amplification of cDNA Ends) を用いて、本酵素をコードする遺伝子を同定した。これらの結果、配列番号 15に示されるポリ A付加サイトまでのおよそ 5キロべ一スの mRNA (cDNA) の配列を同定した。

この遺伝子配列から推定されたアミノ酸配列により、本酵素はプレブ口配列を有し、ディスインテグリンドメイン、メタ口プロテアーゼドメイン等を有する ADA M (A Disintegrin And Metalloprotease) ファミリ一、特に TSP- 1 (トロンポスポンジン Type-1) ドメインを有する ADAM- TSファミリ一に属するものであると推察された。最終的に、一部の核酸配列に挿入，欠失を生じたものを含めて、成熟体であるプレブ口配列が切断された以降の N末端にそれぞれ配列番号 3および 7に示される配列を有する配列番号 16から 21に示されるァイソフォームが同定された。したがって、本願発明の酵素の要件としては、 vWFを 842Tyr- 843Met で切断し、かつアミノ酸の部分配列として Leu- Leu- Va卜 Ala_Valの配列を有するものとして表されるものである。

本願発明の vWF切断酵素は大略以下の方法によって調製され得る。

本願発明における当該酵素の活性測定法の特徴は、短時間に活性の有無の評価が可能な点にある。 Fur l anら（Blood, vol. 87, 4223-4234： 1996 特表 20 00-508918) の報告では、抗 vWF抗体を用いたウエスタンブロット法による vWF切断パターンの解析で行われるため、フィルターへのトランスファーなど時間を要する。より具体的には、基質である vWFとの酵素反応に 24時間、さらにその電気泳動に 17時間、フィルタ一へのトランスファーに 3時間その後の抗 vWF抗体を用いた検出反応が続くもので少なくとも計 45時間程度を要する。これに比し、本願発明者等の行った活性測定は、基質である vWFとの酵素反応に 1 6時間、さらにその電気泳動および検出に 2時間の計 1 8時間で完了し、 3分の 1 弱の時間短縮が可能である。これに伴い、精製工程の時間短縮が可能となり、本酵素の活性失活を低減できる。したがって、精製効率が F u r 1 a nらの方法より向上しており、その結果、精製度の向上につながつている。

さらに、上述のアツセィ系を用いて、出発材料の検討を行って、従来 F u r 1 a nらが報告したクリオプレシピテートよりも F Iペースト中に本酵素活性が濃縮されていることを見出した。これを出発材料とし、前述の迅速な活性測定系を組み合わせることにより、本酵素の単離同定が可能となった。具体的な態様として、ゲル濾過クロマトグラフィ一およびイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせる精製法を適用し前記活性測定系を組み合わせる。

より具体的には、 F Iペーストをバッファ一にて可溶化し、これをゲル濾過クロマトグラフィ一を用いて分画する。本酵素活性はゲル濾過のサイズマーカーから推定して分子量 1 5 0 kDa〜3 0 0 kDaの溶出位置に分画され、この後、 3 3 %飽和硫安にて沈殿濃縮せしめる。この行程を計 3回行い、 3回目のゲル濾過の活性画分をプールしたものを 50mMTris- HC1 pH7. 1に NaCl 50mM添加したバッファーで 4°Cー晚透析した後、陰イオン交換クロマトグラフィー（DEAE) にかけ、 0. 25Mの NaClにてステツプワイズに溶出する。本願発明の酵素を単離同定するための方法として、鋭意研究した結果、驚くべきことに、非還元下の SDS- PAGE後、活性を有するバンドとして回収可能であることを見いだした。これをもとにさらに大量調製するために、精製 ·濃縮された画分を SDS-PAGEの原理を利用したバイオフォレーシスに供した。これにより、泳動分離された画分で vWF切断活性を有する画分を分取した。この段階までの比活性を概算するとおよそ 3 0， 0 0 0〜1 0 0 , 0 0 0倍近い精製度を達成したことになる。さらに、これを効率よく複数回に渡り迅速に行うことにより、現在のアミノ酸配列分析の限界である 0. 5ピコモル程度のサンプルが取得できた。これにより、アミノ酸配列分析が可能になった。つまりは、最終工程として SDS - PAG Eの原理に基づいた分離精製（バイオフォレーシス）が重要なステップであり、それは本願発明に至るまでの鋭意研究の結果得られた知見に基づくものである。

F u r 1 a nらの報告では、 1 0 , 0 0 0倍近い比活性の向上を達成したにも拘わらず、本酵素の本質的な単離同定に至らなかったのは、精製中の失活等あるいは、各種液体クロマトグラフィーに属する分離方法では、本酵素のように巨大蛋白質で様々な他の蛋白質との相互作用が可能と考えられる分子では、単離同定まで達するのが困難であったためであろうと考えられる。さらに、本酵素の血漿中での含量が微量であることが想定され、本願発明の手法が確立されるのを待たねばならなかつたのである。さらに、この方法を用いることにより、遺伝子組み換え体も精製可能である。

本願発明により得られた知見に基づき、得られた配列を基に調製されるペプチドもしくは蛋白質を抗原に、通常の免疫方法（Current Protocols in Molecular Biol ogy、 Ant ibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edited by J. McCAFFERTY et a 1.あるいは ANTIBODY ENGINEERING second edi t ion Edi ted by Carl A. K. BOR EBAE CK ) によってモノクローナルおよびポリクローナル抗体等の作製あるいはこれらのヒト型抗体の作製が可能となる。あるいは、ファージディスプレイ技術を利用した抗体作製技術 (Phage Display of Pept ides and Proteins : A Laboratory Manual E dited by Brian K. Kay et al.、 Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Ed ited by J. McCAFFERTY et al.あるいは ANTIBODY ENGINEERING second edi t ion edi t ed by Carl A. K. BOR EBAECK) により当該蛋白質と結合する抗体の作出が可能である。あるいは、これらの技術に基づき、本酵素に対する自己抗体陽性である T T P 患者検体からの本酵素活性の中和抗体もしくは単なる結合抗体の単離も可能である。そして、これらの抗体を用いることで、例えば T T Pなどの疾患の診断及び治療への応用が可能となる。

さらには、得られたゲノムあるいは E S Tの配列を基に通常の方法（Molecular C loning 2nd edition) により、本願発明の酵素をコードする c DNAやゲノム遺伝子をクローニングすることが可能である。さらに、バイオインフォ一マティックな解析 (BIOINFORMATICS: A Pract ical Guide to the Analys is of Genes and Protei ns edited by Andreas D. B axe van is and B. F. Francis Ouellette) により、これと相同な他動物種の当該蛋白質のクローニングも可能となり、その遺伝子を通常の方法 (Gene Target ing: A Practial Approach First Edit ion Edited by A. L. Joyn er、 Teratocarcinomas and embryonic stem cel l a pract ical approachなど) によって遺伝子破壊することにより、 T T P様モデル動物の作出が可能となる。とりわけマウス由来の本蛋白質をコードする遺伝子配列を同定することにより、この遺伝子のノックアウトマウスの作出が可能となる。これにより、先天的 T T Pなどの疾患モデルマゥスが作製できる。

さらには、通常の方法（J. Sambrook et al.著 Molecular Cloning 2nd edit ion 、または CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGYなど）により、これらの遺伝子を適当な発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に形質転換し、当該酵素の遺伝子組み換え産物を調製することが可能である。この時、組み込む遺伝子は、必ずしも当該蛋白質の全域をコードした遺伝子である必要はなく、用途に応じてドメインで定義されるような当該蛋白質の一部分の発現も含まれる。

例えば、本願発明のポリヌクレオチドを形質導入、トランスフエクシヨン、およびトランスフォーメ一ションの公知の技術を用いて宿主細胞中に導入する。ポリヌクレオチドは単独または他のポリヌクレオチドと共に導入される。このような他のポリヌクレオチドは、独立して導入されるか、同時導入されるか、または本発明のポリヌクレオチドと合わせて導入される。

このように、例えば本発明のポリヌクレオチドを宿主細胞中に選択マーカーをコードする他の別のポリヌクレオチドで、例えば哺乳動物細胞中、同時トランスフエクションおよび選択についての標準的技術を用いてトランスフエクシヨンする。こ' の場合、ポリヌクレオチドは一般的に宿主細胞ゲノム中に安定に組み込まれるであろう。

別法として、ポリヌクレオチドを宿主中の増殖用選択マーカーを含有するべクタ一と結合させてもよい。ベクター構築物は前記技術により宿主細胞中に導入される。一般に、プラスミドベクターは、沈殿物、例えばリン酸カルシウム沈殿物、または荷電脂質との複合体などの D NAとして導入される。エレクト口ポレーシヨンもポリヌクレオチドを宿主中に導入するために用いられる。ベクターがウィルスの場合、これは in vitroでパッケージされるか、またはパッケージング細胞中に導入され、パッケージされたウィルスを細胞中に導入する。本発明のこの態様にしたがって、ポリヌクレオチドを産生し、ポリヌクレオチドを細胞中に導入するのに適した広範囲に及ぶ技術は当業界で周知であり慣例的である。このような技術は、 S ambrookら（前掲）に記載され、これはこれらの技術を詳述した多くの標準的実験マニュアルを説明するものである。本発明のこの態様に関して、ベクタ一は、例えばプラスミドベクター、一本または二本鎖ファ一ジベクタ ―、一本または二本鎖 RNAまたは D NAウィルスベクターである。このようなべクタ一は、ポリヌクレオチド、好ましくは D NAとして、 DNAおよび R NAの細胞中への導入について周知の技術により細胞中に導入される。ベクターは、ファージおよびウィルスベクターの場合、好ましくは、感染および形質導入について周知の技術によりパッケ一ジされたまたは封入されたウイルスとして細胞中に導入される。ウィルスベクタ一は複製受容または複製欠陥のいずれであってもよい。

ベクターのうち好ましいものは、ある点において、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを発現するベクターである。一般に、このようなベクタ一は、発現されるポリヌクレオチドと操作可能に結合した宿主中の発現に有効なシス一作用制御領域を含む。適当なトランス一作用ファクタ一は（例えば、シグナルべプチダーゼあるいはフ一リンなどの翻訳後のプロセッシングに関与する酵素群など）、宿主細胞中に導入される際、宿主により供給される力補足べクタ一により供給されるかまたはベクターそれ自身により供給されるかのいずれかである。

この点に関して好ましい一態様において、ベクタ一は特異的発現を提供する。このような特異的発現は、誘発性発現またはある型の細胞でのみ発現するか、または誘発性かつ細胞特異性なものである。誘発性ベクターの中で特に好ましいのは、操作が簡単な環境因子、例えば温度および栄養添加物により発現を誘発できるベクタ —である。原核および真核細胞宿主における使用についての構成および誘発可能な発現ベクターを含む本発明のこの態様に適した種々のべクタ一は、周知であり、当業者により慣例的に用いられるものである。

遺伝子操作した宿主細胞は、通常の栄養培地中で培養でき、これは、特にプロモ一夕一の活性化、形質転換体の選択または遺伝子の増幅に適するように修飾される。一般に発現のために選択された宿主細胞について今までに用いられている温度、 p Hなどの培養条件は、当業者に明らかなように、本発明のポリペプチドの発現に適しているであろう。

非常に多種の発現べクタ一を本発明のポリペプチドの発現に用いることができる。このようなベクターは、染色体、ェピソ一ムおよびウィルス由来のベクター、例えばバクテリアプラスミド、バクテリオファージ、酵母ェピソ一ム、酵母染色体ェレメン卜、バクロウィルス、シミアンウィルス 4 0 ( 「S V 4 0」 ) などのパポバウィルス、ワクチニァウィルス、アデノウイルス、鶏痘ウィルス、偽狂犬病ウィル来のベクタ一、例えばプラスミドおよびパクテリオファージ遺伝子エレメント由来のもの、例えばコスミツドおよびファージミツドを包含し、これらはすべて本発明のこの態様にしたがって発現に用いられる。一般に、宿主においてポリペプチドを発現するため、ポリヌクレオチドの維持、増殖または発現に適したいかなるベクタ一もこの点に関して発現に用いることができる。適当な D NA配列は種々の周知の慣例技術よりベクター中に挿入される。一般に、発現用 D NA配列は、 D NA配列および 1またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼを有する発現ベクターの開裂により発現べクタ一に結合させ、次に制限フラグメントを T 4 D N Aリガーゼを用いて一緒に結合させる。この目的に用いることができる制限およびライゲーション法は当業者には周知であり、慣例的である。この点に関して、また当業者に周知であり慣例的である別の技術を用いた発現ベクターの構築に適当な方法は、 Sambrookら (前掲）に非常に詳しく説明されている。

発現ベクター中の D N A配列を、例えば、プロモーターを含む適当な発現調整配列に操作可能に結合させ、 mR NA転写を方向付ける。このようなプロモーターの代表例は、ごく僅かの周知のプロモータ一を列挙すると、ファージラムダ P Lプロモーター、大腸菌 l a c、 t r p、 t r cおよび t a cプロモ一夕一、 S V 4 0初期および後期プロモーターおよびレトロウイルス L T Rのプロモーターを包含する。記載していない多くのプロモーターが本発明のこの態様における使用に適し、周知であり、本明細書の考察および実施例により説明されたようにしてより容易に用いられると考えられる。一般に、発現構築物は、転写開始または終止部位、および転写された領域に、翻訳のためのリボソーム結合部位を含有する。構築物により発現された成熟転写物のコ一ディング部分は翻訳されるポリぺプチドのほぼ末端に位置する開始および終止コドンに翻訳開始 AU Gを含む。加えて、構築物は、発現を調節し、引き起こす調節領域を含む。一般に、多くの通常実施されている方法にしたがって、このような領域は、レブレッサ一結合部位およびェンハンサーなどの転写を調節することにより作用する。

増殖および発現用ベクターは、選択マ一力一を含む。このようなマ一カーは増殖に適しているか、またはべクタ一はこの目的のために付; ¾的なマーカ一を含有する。この点に関して、発現べクタ一は、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特質を提供するために好ましくは 1またはそれ以上の選択マーカー遺伝子を含む。好ましいマーカ一は、真核細胞培養について、ジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性、あるいは大腸菌および他のバクテリアの培養に関して、テトラサイクリンまたはアンピシリン耐性を含む。本明細書に記載するような適当な D NA配列を含むベクター、ならびに適当なプロモーターまたは調節配列を、所望のポリべプチドの発現に適した種々の周知の技術を用いて適当な宿主中に導入する。

適当な宿主の代表例は、大腸菌、ストレブ卜マイセスおよびサルモネラ ·チフィムリゥム細胞などの細菌細胞；酵母細胞などの真菌細胞；ドロソフイラ S 2およびスポドプテラ S f 9細胞などの昆虫細胞； C HO、 C O Sおよび B owes黒色腫細胞など、さらには S P 2ノ0など接着性、浮遊性いずれの動物細胞および植物細胞を包含する。種々の発現構築物に対する宿主は周知であり、当業者は本発明の開示により本発明のこの態様にしたがってポリペプチドを発現するための宿主を容易に選択できる。

より詳細には、本発明は組換え構築物、例えば 1またはそれ以上の前記配列を含む発現構築物も包含する。構築物は、ベクタ一、例えばプラスミドまたはウィルスベクターであって、その中に本発明の配列が挿入されているものを含む。配列を正または逆の順序に挿入する。この点に関して好ましい具体例において、構築物はさらに、例えば配列に操作可能に結合したプロモータ一などを含む調節配列を有する。多数の適当なベクターおよびプロモータ一が当業者に公知であり、本発明における使用に適した多くの商業上入手可能なベクタ一がある。

以下の商業的に入手可能なベクターを例示のために記載する。細菌においての使用に好ましいベクターは Qiagenから入手可能な pQE 70、 pQE60、 pQE- 9 ； Stratageneから入手可能な pBSベクター、ファージスクリプトベクター、ブルースクリプトベクタ一、 pNH8A、 pNH16 a、 pNH18A、 pNH46 A ; Pharmaciaから入手可能な p t r c 99 a、 pKK223— 3、 pKK233 — 3、 pDR 540、 pR I T 5である。好ましい真核細胞ベクターは、 Stratagen eから入手可能な pWLNEO、 pSV2CAT、 pOG44, ； pXTlおよび pS G；および Pliarmaciaから入手可能な ρ S VK3、 pBPV、 pMSG、 pSVLである。これらのベクターは、本発明の態様にしたがって用いるために、当業者に利用可能な商業上入手可能であり、かつ周知のベクターを単に例示として列挙したものである。例えば本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの導入、維持、増殖または発現に適した他のプラスミドまたはベクターも本発明のこの態様において宿主にて用いることができる。

プロモー夕一領域は、例えば候補プロモーターフラグメント；すなわちプロモーターを含有するフラグメントを導入するための制限部位（複数）の下流のクロランフエニコ一ルァセチルトランスフェラーゼ（「CAT」）転写単位などのプロモーター領域を欠くリポーター転写単位を含有するべクタ一を用いて所望の遺伝子から選択できる。周知のように、 c a t遺伝子の上流の制限部位でプロモータ一含有フラグメン卜のベクター中に導入すると、標準 CATアツセィにより検出可能な CA T活性の産生を引き起こす。この目的に適したベクターは周知で容易に入手可能である。 2つのこのようなベクターは pKK232— 8および PCM7である。した ifiつて、本発明のポリヌクレオチドの発現用プロモーターは、周知で容易に入手可能なプロモーターだけでなく、前記技術により、リポーター遺伝子を用いて容易に得られるプロモーターも包含する。

そのうち、本発明にしたがつてポリヌクレオチドおよびポリぺプチドの発現に適した公知の細菌プロモーターは、大腸菌 1 a c Iおよび 1 a c Zプロモーター、 T 3および Τ 7プロモータ一、 gp tプロモーター、ラムダ PR、 PLプロモ一ターおよび t r p、 t r cプロモーターである。そのうち、この点に関して適当な公知の真核細胞プロモータ一は、サイトメガロウィルス（「CMV」）即時型プロモーター、 H S Vチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期 S V 4 0プロモータ一、レトロウイルス L T Rのプロモーター、例えばラウス肉腫ウィルス（「R o S V」）のプロモータ一、およびメタ口チォネイン一 Iプロモーターなどのメタロチォネィンプロモータ一を包含する。

宿主細胞における発現についての適当なべクターおよびプロモータ一の選択は、公知方法であり、発現べクタ一構築、ベクターの宿主細胞中への導入および宿主における発現に必要な技術は当業界で慣例の技術である。本発明はまた前記構築物を有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、哺乳動物細胞などのより高等な真核細胞、または酵母細胞などのより低級な真核細胞、あるいは宿主細胞は細菌細胞などの原核細胞とすることができる。

構築物の宿主細胞中への導入はリン酸カルシウムトランスフエクシヨン、 D E A E—デキストラン媒介トランスフエクシヨン、カチオン性脂質—媒介トランスフエクシヨン、エレクト口ポレーシヨン、形質導入、感染または他の方法により行うことができる。このような方法は、多くの標準実験室マニュアル、例えば、 Sambrook らの本に記載されている。

宿主細胞中の構築物は常法で用いることができ、組換え体配列によりコードされる遺伝子産物を生じる。別法として、本発明中の部分ポリペプチドは通常のぺプチド合成機により合成できる。成熟蛋白質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞において適当なプロモーターの調節下で発現できる。また、細胞を含まない翻訳系を用い、本発明の D NA構築物由来の R NAを用いてこのような蛋白質を産生することもできる。原核および真核宿主について用いる適当なクローニングおよび発現ベクターは、 Sambrookら（前掲）に記載されている。

一般に、組換え発現ベクターは、複製起点、下流構造配列の転写を方向付けるために高度に発現された遺伝子由来のプロモータ一、およびベクターに接触させた後ベクタ一を含有する細胞の単離を行うための選択マ一カーを含む。そのうち、適当なプロモーターは、 3—ホスホダリセレートキナ一ゼ（「P GK」）、 α—ファクター、酸ホスファターゼ、および熱ショック蛋白質などの糖分解酵素をコードする遺伝子から誘導できるものである。選択マーカーは大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびエス ·セレピシェの t r p 1遺伝子を包含する。

高等な真核細胞による本発明のポリペプチドをコードする D N Aの転写はェンハンサー配列をべクタ一中に揷入することにより増加させてもよい。ェンハンサ一は、所定の宿主細胞型においてプロモーターの転写活性を増加させるように作用する、通常、 D NAのシス一作用エレメントである。ェンハンサ一の例は、 S V 4 0ェンハンサ一、サイトメガロウィルス初期プロモーターェンハンサー、複製起点の後側のポリオ一マエンハンサー、 ]8ァクチンェンハンサーおよびアデノウイルスェンハンサ一などを包含する。

本発明のポリペプチドのヘテロ口一ガスな構造配列をコードする本発明のポリヌクレオチドは一般に標準的技術を用いて、これが発現用プロモーターに操作可能に結合するようにべクタ一中に挿入される。ポリぺプチドは転写開始部位が適当にリポソ一ム結合部位の 5 ' に位置するように配置される。リボソーム結合部位は発現されるポリペプチドの翻訳を開始する AU Gに対して 5 ' である。一般に、開始コドン、通常は AU Gで始まり、リボソーム結合部位と開始 AU Gの間にある他のォープンリーディングフレームは存在しない。また、一般に、ポリペプチドの末端に翻訳終止コドンがあり、転写領域の 3 ' 末端に適切に配置されたアデ二ル化シダナルおよび転写終止シグナルが存在する。

翻訳された蛋白質の小胞体のル一メン中、細胞質隙中または細胞外環境への分泌については、適当な分泌シグナルが発現されたポリべプチド中に組み込まれている。シグナルはポリべプチドに対して内因性であるかまたはへテロローガスなシグナルであってもよい。

さらには、シグナル配列に続くプロ配列に関しても内因性のものであっても良いし、その他のヘテロローガスなもの（例えば他のメタ口プロテア一ゼのプレ /プロ配列など）を用いても良い。

ポリべプチドは例えば融合蛋白質などの修飾された形態で発現され、分泌シダナルだけでなく、付加的なヘテロローガスな機能領域も包含する。したがって、例えば付加的アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域は、精製中またはそれに続く操作および保存中、宿主細胞における安定性および保存性を向上させるためにポリペプチドに添加される。また、ある領域をポリペプチドに付加して精製を促進してもよい。このような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去してもよい。ペプチド部をポリペプチドに付加し、分泌または排出を誘起するか、または安定性を向上させるかまたは精製を容易にすることは、当業界で周知の慣例的技術である。

本発明によるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの増殖、維持または発現に適当な原核宿主は、大腸菌、バチルス ·サチリスおよびサルモネラ ·チフィムリウムを包含する。種々のシユードモナス、ストレプトマイセスおよびスタフイロコッカスがこの点で適当な宿主である。さらにまた、この点に関して当業者に公知の多数の他の宿主も用いうる。代表的であるが制限的でない例として、細菌の用途に有用な発現べクタ一は、選択可能なマーカーおよび周知のクローニングベクター p B R 3 2 2 (AT C C 3 7 0 1 7 ) の遺伝子エレメントを含む市販のプラスミド由来の細菌の複製起源を含みうる。このような市販のベクターは、例えば P KK 2 2 3— 3 (Pharmacia Fine Chemicals, ウプサラ、スウェーデン）および G EM 1 (Prome ga Biotec, マディソン、ウィスコンシン州、米国）を包含する。これらの p B R 3 2 2 「主鎖」セクションを、適当なプロモーターおよび発現させる構造配列と合す適当な宿主株の形質転換および宿主株の至適細胞濃度への増殖後、選択されたプ口モーターを適当な手段（例えば、温度シフトまたは化学誘発因子）により誘発させ、細胞をさらなる期間培養する。細胞を典型的には遠心分離により収穫し、物理的または化学的手段により破碎し、得られた粗抽出物をさらに精製する。蛋白質の発現に用いた微生物細胞は、凍結一解凍サイクル、超音波処理、機械的破碎、または細胞溶解剤を含むいずれか都合のよい方法で破砕することができ、このような方法は当業者には周知である。

種々の哺乳動物細胞培養系はまた、発現にも用いることができる。哺乳動物発現系の例は、 Gluzmanら、 Cel l 23： 1 7 5 ( 1 9 8 1 ) に記載されているサル腎臓線維芽細胞の C O S— 6系統を包含する。適合性ベクターの発現能を有する他の細胞系は、例えば、 C 127、 3T3、 CHO、 HeL a、ヒト腎臓 293および BH K細胞系を包含する。さらには、浮遊系の細胞株である SP2/0等のミエローマも用いることが出来る。

哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適当なプロモータ一およびェンハンサー、ならびに必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナ一およぴァクセプター部位、転写終止配列、および発現に必要な 5' フランキング非転写配列を含む。あるいは SV40スプライス部位、および SV40ポリアデニル部位由来の DNA 配列は、これらのタイプの所望の非形質転換転写遺伝子エレメントについて用いられる。この点に関して、例えば、 CAG系の発現ベクター（H. Niwa et al. , Gene, 10 8, 193-199, (1991)) 等が挙げられる。

また、当該酵素の遺伝子配列を基に通常の方法により、プローブやプライマーあるいはアンチセンス (アンチセンス技術は、アンチセンス DNAまたは RNAにより、あるいは三重らせんの形成により、遺伝子発現を制御するのに用いることができる。アンチセンス技術は、例えば、 Okano, J.、 Neurochem.、 56 : 560 (19 91) ； OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTI SENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, BocaRaton, FL (1988) に記載されている。三重らせんの形成は、例えば、 Leeら、 Nucleic Acids Research 6 : 3073 (1979) ； Cooney ら、 Science 2 1 : 456 (1988) ；および Dervanら、 Science 251 : 1 360 (1991) において考察されている。方法はポリヌクレオチドの相補 DN Aまたは RNAに対する結合に基づく。）をデザインすることによって、遺伝子診断あるいは遺伝子治療が可能となる。

例えば患者からの細胞を ex V i voでポリペプチドをコードする D N Aまたは R N A などのポリヌクレオチドで遺伝子操作し、その遺伝子操作をした細胞を次にポリべプチドで処置すべき患者に提供する。例えば、細胞を本発明のポリペプチドをコードする RNAを含有するレトロウイルスプラスミドベクターを用いて ex vivoで遺伝子操作できる。このような方法は当業界で周知であり、本発明におけるその使用は本明細書の記載から明らかである。同様に、 in vivoでのポリペプチドの発現に関して、当業界で公知の手順により細胞を in vitroで操作する。例えば、本発明のポリヌクレオチドを前記のように複製欠陥レトロウイルスベクタ一における発現用に操作する。ついで、レトロウイルス発現構築物を単離し、パッケージング細胞中に導入し、そのパッケージング細胞が対照となる遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を産生するように、本発明のポリペプチドをコードする RN Aを含有するレトロゥィルスプラスミドベクターで形質導入する。これらのプロデューサー細胞を、 in vi troにて細胞を操作し、 in vivoにてポリペプチドを発現させるために患者に投与する。このような方法によるこれらおよび他の本発明のポリぺプチドの投与法は本発明の教示により当業者には明らかである。

前記したレトロウイルスプラスミドベクタ一が由来するレトロウイルスは、例えば、モロニ一ネズミ白血病ウィルス、脾臓壊死ウィルス、ラウス肉腫ウィルス、ハ一べィ肉腫ウィルス、ニヮトリ白血症ウィルス、テナガザル白血病ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、骨髄増殖性肉腫ウィルス、および乳房腫瘍ウィルスを包含するが、これに限定されない。このようなベクタ一はポリペプチドの発現に関して 1またはそれ以上のプロモーターを含む。用いられる適当なプロモーターは、レトロゥィルス L T R ; S V 4 0プロモーター；および Mi l lerら、 Biotecimidues 7 : 9 8 0— 9 9 0 ( 1 9 8 9 ) に記載されている CMVプロモータ一、または他のプロモ一ター (例えば、ヒス卜ン、 R NAポリメラ一ゼI I Iおよび /3—ァクチンプロモ一夕一を包含するがこれに限定されない真核細胞プロモータ一などの細胞プロモ一夕一）を包含するが、これに限定されない。用いられる他のウィルスプロモーターは、アデノウイルスプロモー夕一、チミジンキナーゼ（TK) プロモーター、および B 1 9パルボウイルスプロモータ一を包含するが、これに限定されない。適当なプロモーターの選択は、本明細書に含まれる教示から当業者には自明である。

本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適当なプロモーターの制御下にある。用いることのできる適当なプロモ一夕一は、アデノウイルスメジャーレイトプロモーターなどのアデノウイルスプロモータ一；または C MVプロモーターなどのへテロローガスプロモーター；呼吸器合胞体ウィルス（「R S V」）プロモ一夕一； MMTプロモーター、メチタルチオネインプロモ一ターなどの誘導プロモ一夕一；熱ショックプロモ一タ；アルブミンプロモータ一； A t) o A Iプロモータ一；ヒトグロビンプロモータ一；単純へルぺスチミジンキナーゼプロモータ一などのゥィルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウィルス LTR (前記修飾レトロウィルス L TRを包含する）； /3—ァクチンプロモー夕一；およびヒト成長ホルモンプロモーターを包含するが、これに限定されない。プロモーターはまたポリぺプチドをコードする遺伝子を制御するネィティブプロモータ一であってもよい。レトロウィルスプラスミドベクタ一をパッケージング細胞系の形質導入に用いて、プロデュ一サー細胞系を形成する。

トランスフエクシヨンされるパッケージング細胞の例は、 PE501、 PA31 7、 Y- 2、 Y- AM、 PA12、 T19- 14X、 VT- 19- 17- H2、 YCRE 、 YCR I P、 GP+E— 86、 GP + e n vAml 2、および iller、 Human Gene Therapy 1 : 5— 14頁（ 1990 ) に記載されている DAN細胞系を包含するが、これに限定されない。

ベクターはパッケージング細胞中に当業界で公知の手段により形質導入される。このような手段は、エレクトポレーシヨン、リボソームの使用、および CaP〇₄沈降を包含するが、これに限定されない。別法として、レトロウイルスプラスミドべクターをリボソーム中に封入するか、または脂質と結合させ、宿主に投与する。プロデューサー細胞系は、ポリペプチドをコードする核酸配列（複数）を含む感染性レトロウィルスベクター粒子を生成する。このようなレトロウイルスベクタ一粒子を用いて、真核細胞を in vitroまたは in vivoのいずれかで形質導入する。

形質導入された真核細胞はポリペプチドをコードする核酸配列を発現する。形質導入されてもよい真核細胞は胚幹細胞、胎生期癌細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイ卜、内皮細胞、および気管支上皮細胞を包含するが、これに限定されない。

本発明の蛋白質分解酵素、該蛋白質分解酵素に対する抗体、該分解酵素のアン夕ゴニスト、阻害剤、ァゴニスト、活性調節剤等を生理食塩水、緩衝液等で希釈して製剤化し、医薬組成物を得ることができる。製剤の； pH は体液の p Hに近い弱酸性〜中性域の p Hが望ましく、その下限は 5.0〜 6. 4が望ましく、その上限は pH6.4〜7.4が望ましい。また、凍結乾燥形態等の長期間保存可能な形態で提供することもでき、この場合使用時に水、生理食塩水、緩衝液等で所望の濃度になるように溶解して使用することがでぎる。

本発明の製剤は、通常医薬品に用いられる薬理的に許容される添加剤（例えば担体、賦形剤、希釈剤等）、安定化剤または製薬上必要な成分を含有していてもよい。安定化剤としては、グルコース等の単糖類、サッカロ一ス、マルト一ス等の二糖類、マンニ！ ^一ル、ソルビトール等の糖アルコール、塩化ナトリウム等の中性塩、グリシン等のアミノ酸、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン一ポリオキシプロピレン共重合体（プル口ニック）、ポリオキシエチレンソルピタン脂肪酸ェステル（トウィーン）等の非イオン系界面活性剤、ヒトアルブミン等が例示され、；！〜 1 0 w/ V %程度が添加されていることが好ましい。

本発明の医薬組成物は、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射等により有効量で投与することができ、 1回または数回に分けて投与される。その投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、 1回あたり、 0. 001mg〜100ingが好ましい。

また、本発明の蛋白質分解酵素をコードする DNAのセンス DNAまたはアンチセンス D NAも同様にして製剤化し、医薬組成物を得ることができる。

さらに、本発明は、本願発明のペプチド、蛋白質、 DNAを投与して、心筋梗塞、脳梗塞における血小板血栓抑制、動脈硬化症の抑制、 P T C Aにおける再狭窄や再塞栓'梗塞の防止、 P T C Rにおける再塞栓の防止、 HU Sや 0— 1 5 7が原因となる血小板血栓の予防の方法をも含む。さらに、本発明は、心筋梗塞、脳梗塞における血小板血栓抑制、動脈硬化症の抑制、 P T C Aにおける再狭窄や再塞栓，梗塞の防止、 P T C Rにおける再塞栓の防止、 HU Sや O— 1 5 7が原因となる血小板血栓の予防のための医薬の製造における本願発明のペプチド、蛋白質、 MAの使用をも含む。

さらに、本願発明のぺプチドまたは蛋白質をリ一ド物質としてアミノ酸を改変することにより、本願発明酵素の活性を変化させた分子を調製することが可能である。メタ口プロテア一ゼドメイン内の活性中心近傍のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換する等して不活性化された変異体の作製などによって得られるアン夕ゴニストの作製、または分子認識部位と触媒部位を分離もしくはその一部もしくは両方を変化させることにより得られる変異体分子などが例示される。

また、本願発明中に述べられている vWF切断活性の評価系を利用することによりアンタゴニスト ·ァゴニストの作出が可能である。例えば、有効なアン夕ゴニス卜とは、小さな有機分子、ペプチド、ポリペプチド等で本発明のポリペプチドと結合し、これによりその活性を抑制または消失させるもので抗体を包含する。

また、同様に前記 vWF切断活性の評価系を利用することにより、 vWFを切断し得る化合物をスクリーニングすることも可能である。この際、被験化合物の切断活性を前記評価系を用いて評価すればよい。

図面の簡単な説明

図 1は、 vWFのマルチマー構造と vWF切断酵素による切断点を示す図である図 2は、 vWFのマルチマ一解析の結果（ァガロース電気泳動）を示す写真である図 3は、血漿各画分の vWF切断活性を還元条件下の SDS— PAGE (5%ゲル）で確認した結果を示す写真である。

図 4は、フラクション 1 (F 1)ペースト可溶化サンプルの非還元下の SDS— P AGE (5%ゲル）の泳動写真である。

図 5は、 F 1ペース卜可溶化サンプルを出発原料として 3回のゲル濾過クロマトグラフィ一に通液後の vWF切断酵素画分の解析結果（ゲル濾過ク口マトグラフィーのチャートを示す図、ならびに非還元下での SDS— PAGE及び還元条件下での vWF切断活性の SDS— PAGE)を示す写真であり、図 5 Aはゲル濾過クロマトグラフィ一のチャート、図 5 Bは非還元下でのフラクションの SDS— PAGEの結果、図 5 Cは還元条件下での V W F切断活性の SDS— PAGEの結果を示す。図 6は、ゲル濾過クロマトグラフィー回収画分を DEAE陰イオン交換クロマトグラフィ一によつて精製した V W F切断酵素画分の解析結果 (ゲル濾過ク口マトダラフィ一のチヤ一トを示す図、ならびに非還元下での SDS— PAGE及び還元条件下での vWF切断活性の SD S— PAGE)を示す写真であり、図 6 Aはゲル濾過ク口マトグラフィ一のチヤ一ト、図 6 Bは非還元下での溶出フラクションの SDS— PAGE (8%ゲル）の結果、図 6 Cは還元条件下での vWF切断活性の SDS— PAGEの結果を示す。図 6 C中の 3本のバンドは、図 5 Cと同様にインタクトな vWF分子（切れのこり）、 vWF切断断片、 vWF切断断片を示す。

図 7は、 DEAE陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製 ·濃縮した vW F切断酵素画分をバイオフォレーシスに基づく SDS— PAGE (非還元下）によつてさらに精製した時の泳動画分を示す写真である。

図 8は、 vWF切断酵素画分をバイオフォレーシスに基づく SDS— PAGE によってさらに精製した画分の vWF切断酵素活性の確認及び活性画分の還元下での SDS— PAGEの泳動写真であり、図 8 Aは v WF切断酵素活性の非還元下での SDS— PAGEの結果、図 8 Bは活性画分の還元下での SDS—PAGEの結果を示す。

図 9は、 vWF切断酵素遺伝子の同定に関し、ノザンプロットプロ一プ用遺伝子断片の増幅に用いたプライマ一を示す図である。

図 10は、 vWF切断酵素遺伝子の同定に関し、ノザンプロットのオートラジオグラフィーを示す写真である。図 1 OAは当該蛋白質分解酵素コード遺伝子をプローブとして用いた場合の結果、図 10 Bは 3ァクチンプローブ（RNAコント口一ル）を用いた場合の結果を示す。

図 1 1は、 vWF切断酵素遺伝子の同定に関し、 RACE反応に用いたプライマ一の位置と配列を示す図である。

図 12は、全長 cDNAクローニング用に設計したプライマーの位置を示す図である図 13は、全長 cDNAを含むベクターの構築手順を示す図である。

図 14は、各種細胞株での発現を示す写真である（抗 FLAG抗体を用いた還元条件下のウェスタンブロット； Mockは遺伝子を発現ベクターへ逆向きに挿入したもの）

。図 14中、各レーンはそれぞれ以下のサンプルを用いた結果を示す。

レーン 1 Mock (宿主： 293細胞）

レーン 2 vWF切断酵素 cDNA+FLAG (宿主： 293細胞）レーン 3 Mock (宿主： HepG2細胞）

レーン 4 vWF切断酵素 cDNA+FLAG (宿主： HepG2細胞）

レーン 5 Mock (宿主： He la細胞）

レーン 6 vWF切断酵素 cDNA+FLAG (宿主： Hela細胞）

図 1 5は、組換え発現酵素の活性測定を示す写真である（非還元下の SDS- PAGEによる vW切断の確認； Mockは遺伝子を発現ベクターへ逆向きに挿入したもの）。

図 1 5中、各レーンはそれぞれ以下のサンプルを用いた結果を示す。

レーン 1 Mock (宿主： He la細胞）

レーン 2 vWF切断酵素発現上清（宿主： He la細胞）

レーン 3 Mock (宿主： HepG2細胞）

レーン 4 vWF切断酵素発現上清（宿主： HepG2細胞）

レーン 5 Mock (宿主： 293細胞）

レーン 6 vWF切断酵素発現上清（宿主： 293細胞）

レーン 7 Mock (宿主： BHK細胞）

レーン 8 vWF切断酵素発現上清（宿主： BHK細胞）

レーン 9 Mock (宿主： COS細胞）

レーン 1 0 vWF切断酵素発現上清（宿主： COS細胞）

レーン 1 1 Mock (宿主： CH0細胞）

レーン 1 2 vWF切断酵素発現上清（宿主： CH0細胞）

図 1 6は、本酵素に対して確立された抗体によるウエスタンプロットを示す写真であり、 293細胞を宿主とした組換え vWF切断酵素を用いた各種抗血清でのウェス夕ンブロットを示す写真である。

図 1 6中、各レーンはそれぞれ以下のサンプルを用いた結果を示す。

レーン 1 マウス抗血清（精製タンパク質を投与して調製）

レーン 2 ゥサギ抗血清（発現ベクターをゥサギ皮下に投与して調製）

レーン 3 未処理ゥサギ抗血清

レーン 4 ゥサギ抗血清（部分合成ペプチドを KLHコンジユゲー卜したものを投与して調製）図 1 7は、本酵素に対して確立された抗体によるウエスタンプロットを示す写真であり、 vWF切断酵素全長の cDNA投与により得られたゥサギ抗血清を用いてヒト血漿由来各種サンプルと組換え発現体の検出を示す写真である。

図 1 7中、各レーンはそれぞれ以下のサンプルを用いた結果を示す。

レ一ン 1 ヒト血漿クリォ由来部分精製サンプル

レーン 2 ヒト血漿由来精製切断酵素 ' レーン 3 ヒトプール血漿の FIペーストのゲルろ過サンプル

レーン 4 組換え vWF切断酵素（宿主： 293細胞）

レーン 5 組換え vW切断酵素（宿主： Hela細胞）

図 1 8は、本酵素に対して確立された抗体によるウエスタンプロットを示す写真であり、 vWF切断酵素の部分合成べプチドを免疫して得られたゥサギ抗血清を用いた健常人血漿及び TTP患者血漿中の vW切断酵素並びに遺伝子組換え vWF切断酵素の確認を示す写真である。

図 1 8中、各レーンはそれぞれ以下のサンプルを用いた結果を示す。

レーン 1 ヒトプール血漿の FIペーストのゲルろ過サンプル

レーン' 2 健常人血漿 1

レーン 3 健常人血漿 2

レーン 4 健常人血漿 3

レーン 5 TTP患者血漿 1

レーン 6 TTP患者血漿 2

レーン 7 組換え vWF切断酵素（宿主： 293細胞）

レーン 8 組換え vWF切断酵素（宿主： Hela細胞）

図 1 9は、 vWF切断酵素に対して調製された抗体を用いた ELISAを示す図である。図 2 0は、抗体を用いたァフィ二ティー精製 vW切断酵素各画分の還元下での SDS- PAGE (銀染色）を示す写真である。

図 2 0中、各レーンはそれぞれ以下のサンプルを用いた結果を示す。

レーン 1 アプライ培養上清（10倍希釈）

レーン 2 素通り画分レーン 3 洗浄画分

レーン 4 溶出画分

図 21は、抗体を用いた中和活性能の評価（非還元下の vW切断活性の SDS- PAGE) を示す写真である。図 21中、各レーンはそれぞれ以下のサンプルを用いた結果を示す。

レーン 1 vWF切断酵素液正常家兎血清 =1 ： 1

レーン 2 vWF切断酵素液正常家兎血清（5倍希釈） =1 : 1

レーン 3 vWF切断酵素液ペプチド免疫家兎血清 =1 ： 1

レーン 4 切断酵素液ペプチド免疫家兎血清（5倍希釈） =1 : 1

レーン 5 vW切断酵素液組換え蛋白免疫家鬼血清 = 1 ： 1

レーン 6 vWF切断酵素液組換え蛋白免疫家兎血清（5倍希釈） =1 : 1 レーン 7 WF切断酵素液 10mM EDTA= 1 ： 1

レーン 8 vWF切断酵素液バッファーのみ =1 ： 1

レ一ン 9 バッファ一（vW切断酵素なし）：バッファー =1 ： 1

図 22は、 C末端ドメイン欠失分子種の発現ベクター構築図である。発明を実施するための最良の形態

以下に、実施例に従って本願発明を詳説するが、本願発明はこれら実施例に何等限定されるものではない。

実施例 1

(vWFの調製）

vWFは、セフアクリル S- 500HR (アマシャムフアルマシア）の 2.6X90 cmカラムにより、血漿クリオ画分 2gを 20 mLのバッファー（0.01% Tween-80 / 50 ni Tris-HCl ι ΙΟΟπιΜ NaCl H 7.4)に溶解したものをゲル濾過することにより調製した。流速は 2 mL / min.でフラクションは 6 mLづっ回収した。 vWFは、ペルォキシダ一ゼ標識ゥサギ抗ヒト vWF抗体 (DAK0社製）を用いたウェスタンプロット法により確認し、高分子量 V W F画分をプールした。これを後述するァガロース電気泳動法を利用したマルチマー解析に供した。本来、 vWFは図 1に示されるように vWFモノマー分子が、 N末端、 C末端同士で重合し、マルチマ一構造をとつており、 vWF特異的切断酵素により図中に示されるような限定分解を受けることが知られている。解析の結果、図 2に示されるように、精製した V W Fは健常人血漿中のそれと同等程度のァガロース電気泳動上でのマルチマーパターンを示した（図中のラダ一がマルチマー構造を有する vWF の泳動パターンで、上位の方がより重合が進んだ vWFであることを示す）。これにより、本質的に vWFを分解する夾雑物を含まない vWFを調製することができ、この画分は後述する vWF切断活性を測定する際の基質として使用した。

実施例 2

(v WF切断反応）

v WF切断活性のアツセィは、終濃度 10 の塩化バリゥムを加えたサンプルを 37 °Cで 5分間プレインキュベー卜し、プロテアーゼの活性化を行った。 50mLのフアルコンチューブにバッファー（15〜20mLの 1. 5M Urea I 5mM Tri s-HCl pH8. 0)を入れた。次にミリポア社製のメンプレンフィルター（0. 025〃ffl)を浮遊させ、 50 Lの vWF 基質溶液を加えて混合した活性化サンプルを 100 /x L添加した。 37°Cのィンキュベー夕一にー晚静置して翌日フィルターから回収した。回収したサンプルを、以下の SD S- PAGEの項に示す vWFの切断パターンにより評価した。

SDS-PAGE

SDS-5%ポリアクリルアミドゲルを自家調製し使用した。 vWF切断活性のアツセィ項で述べたサンプル 10 Lに、 SDS泳動バッファー (還元剤 2 -メルカプトエタノ一ル存在下または不在下) 2 Lを加え 3分間煮沸したものを泳動サンプルとした。 30mAで 1 時間電気泳動したのち、ゲルは CBB染色を利用した Gel Code Blue Stain Reagent (PI ERCE社）にて染色した。活性の有無の解釈は図 1に示されるように還元下、非還元下での切断断片の出現及び切れ残る残存断片の有無で評価される。より具体的には、後述する「実施例 3」の項、図 3を参照されたい。

ァガロース電気泳動法を利用したマルチマー解析

ゲリレの作製、電気泳動

375 niM Tr is-HCl (pH6. 8)に Low Ge l l ing Temperature (シグマ TypeVII)を 1. 4%になるように加え電子レンジで加熱し完全に溶解した後、 0. 1% SDSを加え、一旦 56°Cになるように保った。ゲル型に流し 4°Cで一晩冷やし固めた (Ruiming gel)。翌日、 375 mM Tris-HCl (pH6. 8)に High Gel l ing Temperature (SeaKem)を 0. 8 になるように混じ、電子レンジで煮沸溶解した後、一旦 56°Cに保った（Stacking gel)。前日に調製したゲルは端から 1 0 c mを残し切り取った。切り取ったところに上述のゲルを流し込み、 4°Cで 3時間以上流し固めた。 vWF切断活性のアツセィ項で述べたサンプルに、パイ口ニン Yを加え、非還元、煮沸をせずに調製後、 SDS- PAGEバッファーを用いて 10mA、 24時間以上泳動した。

ウェスタンプロット

電気泳動後、ゲルを転写緩衝液 (0. 005%SDS、 50mMリン酸緩衝液 PH7. 4)に 10分間浸し、転写装置を用いて 4°C、 0. 5Aでー晚ニトロセルロース膜に転写した。プロット液 (5%スキムミルク、 PBS)でブロッキングを 30分した後、プロット液で 1000倍希釈したペルォキシダーゼ標識ゥサギ抗ヒト vWF抗体 (MK0社製）と 6時間以上反応させた。この後ブロット液にて 3回、 PBSにて 1回洗浄してペルォキシダ一ゼの基質反応液であるコニカイムノスティン HRP- 1000 (コ二力社製）で発色を行つた。本アツセィを用いて確認された精製 vWFは、分解を受けたものではなく十分、本願発明中で利用された基質として用いるに値することが確認された（図 2 ) 。

実施例 3

(vWF切断酵素の調製）

血漿をコーンのエタノール分画に供し、出発血漿、クリオプレシピテート、フラクシヨン I (F I )上清及びペーストの 4つの画分について、タンパク量を等しくした場合の vWF切断活性の高いもの（比活性の高いもの）を選定した。図 3に示すごとく本酵素活性は FIペース卜で最も活性が高かった。この切断断片の N末端配列解析を行ったところ、クリオ、 FIペースト由来の活性本体は 842Tyr- 843Metのペプチド結合を切断することが判った。そこで、これ以降 FIペーストを主な精製の出発原料とした。

FIペーストの可溶化

FIペーストは 12gずつに小分けし凍結保存した。使用する前日に 4 °Cに出して融解させ、翌日、可溶化バッファ一（0. 05% ァザィド、 50 EM Tris-HCI pH7. 4、 ίΟΟ πιΜ N aCl)を 10 mg/mLになるよう、 120mL加え 37°Cで 2時間攪拌した。 lOOOOrpmで 10分間遠心した後、上清を回収し、プレフィルター、 5. Ο ΙΠフィルタ一、フィルターの順でろ過したものを可溶化サンプルとした。図 4に可溶化サンプルの SDS- PAGEを示す。

vWF切断酵素のゲルろ過クロマ卜グラフィ一

可溶化した F 1ペーストを、セファクリル S-300HR (アマシャムフアルマシア) の 5 X 90cmカラムにかけ、 1回目のゲルろ過を行った。可溶化バッファーと同じ 0. 05% Az aid、 50 mM Tri s-HCl pH7. 4、 100 mM NaCl (以後溶出バッファー）を用い、流速は 5 m L/min.、分取はサンプルアプライ後 600mL目から、フラクションは 10 mLづっ回収した。フラクションは vWF切断反応後、 SDS— PAGEで活性を確認した。酵素活性のあつたフラクションをプールし、これに、終濃度 33 %飽和となるよう飽和硫安を少量ずつ滴下した。これをさらに一晩 4°Cに静置した。翌日 10000rpm、 10分遠心し、目的の活性画分を沈殿として回収した。以上の可溶化 ·ゲルろ過 ·硫安沈澱の操作を 5バツチ行い、 — 20°Cで凍結保存した。

1回目のゲルろ過によって得られた硫安沈殿物 2〜3バチ分を、溶出バッファー 5 OniLに溶解し 1回目と同様セファクリル S- 300HR力ラム（5 X 90cm)に通液し、 2回目のゲルろ過を行った。溶出バッファー、条件、操作等については 1回目と同様である。フラクションは vWF切断反応後、 SDS— PAGEで活性を確認した。活性のあったフラクシヨンをプールし、硫安沈澱を同様に行った。この操作を 2回実施した。

2回目のゲルろ過によって得られた硫安沈殿物 2回分を、溶出バッファー 50mLに溶解し、 1、 2回目と同様、セフアクリル S- 300HRカラム（5 X 90cm)にかけ、 3回目のゲルろ過を実施した。溶出バッファ一、条件、操作等については 1、 2回目と同様である。得られたフラクションは、 vWF切断反応後、 SDS— PAGEで活性を確認したのちプールした。図 5にフラクションの SDS- PAGE及び vWF切断活性の SDS-PAGE を示す。ゲル濾過のパターンと活性のデ一夕よりフラクション 3 7番から 4 7番に渡って本酵素が溶出されてきていることが確認できた。この溶出位置は、別途行つた高分子量ゲル濾過マーカー（アマシャムフアルマシア）の溶出実験から、分子量として推定 1 5 0 kDa〜3 0 0 M)aに相当することが示唆された。この段階では、まだかなりの夾雑物が大量に存在していることが明らかとなった。

D E A E陰イオン交換クロマトグラフィー

ゲルろ過を 3回かけて得られたプールフラクションを、 50mM Tris- HC1、 50mM NaC 1 pH7. 1バッファーで一晩透析した。透析後、ハイトラップ DEAEファストフローセファロースカラム (フアルマシア） 5mLを用い、陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、さらなる精製及び濃縮を行った。平衡化及び洗浄バッファ一は 50inM Tris- HC1 H7 . 1にて行い、溶出は 0. 25Mの NaCl で溶出させた。流速は 5 mL/mm、フラクションは 5 mLずつ 5本回収しプールした。図 6に溶出フラクションの SDS- PAGE及び V WF切断活性の SDS-PAGEを示す。活性の測定の SDS- PAGEから、かなり効率よく溶出画分に v WFを切断する活性を有する本酵素が濃縮されていることが明らかとなった。

SDS-PAGEを利用した分画

DEAE陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製 ·濃縮されたサンプル 5 mlをさらに、分子量カット 1 0 , 0 0 O Daのセントリコン（アミコン社製）にて 0 . 5 mL まで濃縮し、 SDS- PAGEを利用したアト一社製バイオ ·フォレーシス I I Iにより、本酵素の単離を行った。 Laeiml i法 (Nature, vol. 227, 680-685 ： 1970)に従い、泳動槽用緩衝液を調製し、ポリアクリルアミド 8%ゲルにて展開し、泳動画分を回収した。 ' 図 7に回収画分の SDS-PAGEを示す。回収バッファ一は 50 Tris-HCl、 10%グリセロール pH 8. 8を用いた。図 7からも理解されるように、本願発明の当該工程は高分離能を有する分離法であることが判る。図 8に電気泳動によってさらに精製した画分の活性の確認及び活性画分の SDS-PAGEを示す。本酵素は SDS-PAGE後も活性を有する分子として回収することができ、この段階で、比活性として血漿中での本酵素活性を 1とした場合、血漿の平均的なタンパク含量（60mg/ml) から推定して、 3 0， 0 0 0〜 1 0 0， 0 0 0倍の精製度に達したことが推定された。

実施例 4

(部分アミノ酸配列の決定）

単離した本酵素の部分アミノ酸配列を決定した。バイオフォレシスにて単離された本酵素を常法により、 SDS-PAGE後、 PVDF膜へトランスファ一し、風乾したのち、 P Eアプライドバイオシステムズ社のオートプロテインシークェンサ一 492にて、解析を行った。その結果、上記条件で単離した本願発明の vWF切断酵素の一態様は、分子量が SDS- PAGEにおいて還元下 105〜160kDaの範囲にあるポリぺプチド鎖よりなり

、部分配列として Leu- Leu- Val- Ala_Valを、好適には Ala- Ala- Gly- Gly- lie- Leu- His-

Leu_Glu - Leu- Leu- Va卜 Ala - Valを有することが明らかとなった。

バイオインフォ一マテイクスを利用した単離酵素の推定

現在は、バイオインフォ一マテイクスの技法を用いることで、今まで蓄積されたデータベースとの照合により、実質的な遺伝子のクロ一エングなしに当該ポリぺプチドをコードする全塩基配列の推定が可能となっている（BIOINFORMATICS: A Pract ical Guide to the Analysis of Genes and Proteins edi ted by Andreas D. Baxev anis and B. F. Francis Ouel lette) 。上述した手法により決定されたアミノ酸部分配列（Ala- Ala_Gly-Gly_I le- Leu-His- Leu- Glu- Leu- Leu- Val-Ala-Val) を基に、プログラム tblastnによりデータベースサーチを行った結果、ゲノムでのデータべ一スサーチにより、本酵素をコードしていると推察される染色体クローン（AL158826) が同定され、さらに、 EST (Expressed Se uence Tag) として目的酵素の一部分及び上記ゲノムによりコードされるポリペプチドの一部と推察されるクローン（AI 34676 1及び AJ011374) を同定した。これをもとに vWF切断酵素としての活性部位として配列番号 3もしくは 7に示すァミノ酸配列を推定した。

実施例 5

(遺伝子の同定）

以下、全ての合成プライマーはグライナ一ジャパン (株) に依頼した。さらに、遺伝子組換えに関する試薬類は、特に断りのない限り、 TAKARA、 TOYOBOおよび New E ngland Biolabs社製を用いた。

ノザンブロットプローブ用遺伝子断片の調製

センスプライマー（配列番号 9 ) 及びアンチセンスプライマ一（配列番号 1 0 ) を作製し、正常ヒト組織由来 c D NAの混合物である Universal QUI CK-C lone™ c丽 A (CLONTECH社製）を銹型として、 TAKAM LA Tag wi th GC rich bufferにて P C R 反応し、プライマーで挟まれた部分の遺伝子を増幅し、その断片を Invitrogen社製 T 0P0 TA cloning^TMキットにてクロ一ニングした。数個のクロ一ンから配列番号 6記載の塩基配列を有するものを単離した。

このクローン化 DNAから EcoRI消化によりべクタ一部分を取り除き、ァガロース電気泳動により分離 ·精製し、ノザンブロッ卜のプローブ調製用の鐯型とした。

ノザンプロッ卜

上述により調製された遺伝子断片を铸型として、 [ - ³²P]dCTP (Amershani pliarm acia社製）および BcaBEST^TMラベリングキット（TAKARA社製）により、放射性プローブを調製した。そして、 Human 12 - lane Mutiple Tissue Northern Blots™ (CLON TECH社製) フィルターを用いて、 Molecular Cloning 2^nd edition P 9.52-9· 55記載の方法により、ハイブリダィズし、オートラジオグラフィ一により検出した。図 1 0に示されるように、本酵素をコードする mRNAの発現部位は、主に肝臓であることが確認された。そして、その mRNAのサイズは、 4.4キロベース以上に及ぶことが明らかとなった。

本酵素コード遺伝子の単離 ·同定

ノザンブロットの結果、 mRNAの主要発現部位は肝臓であることが確認されたため、正常ヒト肝臓由来の Poly A+ RNA¾r/Maratlion-Ready™ cDNA (CL0NTECH社製 ) を用いて、 RACE法により本酵素遺伝子の単離 ·同定を行った。

より具体的には、 5' RACEとして正常ヒト肝臓由来 Marathon- Ready^TM cDNA を用いて、製品マニュアルに基づき、添付の AP- 1プライマーと図 1 1に示す Gene Specific Primer (GSP)プライマ一群から最上流のプライマー 1位のものを除き、アンチセンスプライマーを任意に選択し（配列番号 11〜13) 、 1^st PCRを行い、さらにその内側の AP- 2と図 11中の 1^{s t} PCRで用いたプライマ一より内側の位置のアンチセンスプライマーにて nested PCR (2^nd PCR) を行ったのち、 TA cloningを実施した。出現したコロニーから常法により遺伝子を調製し（Molecular Cloning 2^nd edition p 1.25-1.28) 、自動 DNAシークェンサ一にて核酸配列の解読を行った。シークェンシングに用いたプライマーは、 PCRに用いたプライマーあるいはそれより内部のプライマーを用いて行った。さらには、逐次解読後の配列を基に設定した。

3 ' RACEは、正常ヒト肝臓由来の Poly A+ RNAから、 3'- Full RACE Core Set (TA KARA社製）を用いて、添付マニュアルに基づき、添付のオリゴ dTプライマーにて逆転写反応を行った後、図 1 1中のプライマー 2の位置のセンスプライマー（配列番号 1 4 ) と添付のオリゴ dTプライマ一での P C Rで増幅したバンドをァガロース電気泳動により分離、そして抽出後 TA cloningを行った。出現したコロニーから遺伝子を調製し、自動 D N Aシークェンサ一にて核酸配列の解読を行った。シークェンシングに用いたプライマーは、逐次解読後の配列を基に設定した。

実施例 6

(全長 cDNAを含むベクターの調製 1 )

当該蛋白質をコードしている cDNAを例えば制限酵素サイトとして Xholを付加し、開始コドンを含むセンスプライマー 1 (配列番号 2 2 ) 及び Sailサイトを付加した終結コドンを含むアンチセンスプライマー 2 (配列番号 2 3 ) を用いて（図 1 2参照）、前出の正常ヒト肝臓由来 Marathon- Readyⁿⁱ cDNAを铸型として、 TAKARA LA Ta with GC rich bufferにて一段階 PCRの後、前出の TA cloningを行い、その全長を自動]) Mシークェンサ一にて確認した。

実施例 7

(全長 cDNAを含むベクターの調製 2 )

当該蛋白質をコードしている cDNA (配列番号 1 5 ) の内部配列中で 1点のみで切断する制限酵素サイト Accl及び Avrllを見い出した。これを利用して、図 1 2に示すように、全長 cDNAを 3つのフラグメントに分割し、それぞれにセンスプライマ一 1 (配列番号 2 2 ) 及びアンチセンスプライマ一 3 (配列番号 2 4 ) で挟まれたフラグメント（フラグメント 1 ) 、センスプライマ一 4 (配列番号 2 5 ) 及びアンチセンスプライマー 5 (配列番号 2 6 ) で挟まれたフラグメント（フラグメント 2 ) そして、センスプライマー 6 (配列番号 2 7 ) 及びアンチセンスプライマー 2 (配列番号 2 3 ) で挟まれたフラグメント（フラグメント 3 ) を設定し、前出の正常ヒト肝臓由来 Maratl丽- Ready^{T M} cDNAを銬型として、 TAKAM LA Ta wi th GC rich buff erにてそれぞれ PCRの後、前出の TA cloningを行い、その全長を自動 DNAシ一クェンサ一にて確認した。さらに、前出の TAクローニングキットに含まれる pCR2. 1ベクタ一をセルフライゲーシヨンしたものを、 Xliol/ ndlllで切断後、 Xhol/Accl/Avrll/H indlllを含むリンカ一（配列番号 2 8及び 2 9に示す合成 DNAをァニールさせたもの ) をライゲ一シヨンし、上述の 3つのフラグメントを逐次、常法によりライゲーシヨンしてこれらのフラグメントを結合して全域を含む cDNAを調製した（図 1 3参照実施例 8

(全長 cDNAを含む発現ベクターの調製：動物細胞宿主系）

実施例 6または 7で得られた DNAを ΏιοΙ/Sal Iにて制限酵素消化し、例えば pCAGベクタ一（Niwa, Η·， et al. Gene vol. 108, 193-199) 中の Sai lサイトにライゲーシヨンし、その揷入向きと全長配列を自動 DNAシークェンサ一にて確認した。

実施例 9

(全長 cDNAを含む発現ベクターの動物細胞への形質転換）

実施例 8で調製した動物細胞用発現ベクターを 293細胞（ヒト胎児腎細胞株）、 He la細胞及び HepG2細胞を用いて、以下の手順でトランスフエクトした。まず初めにトランスフエクシヨンの 2 4時間前に 1〜3 X 10⁵個 Z35讓 dishで細胞を捲き、その翌日に上記発現ベクターを 1 当たり 2 1の Polyamine Transfect ion Reagentである TransIT (TAKARA社製）をとり、 Opt i_MEM等の無血清培地 100 に添加して、試薬添付文書に従い、 DNAとのコンプレックスを調製後、準備しておいた前記各種細胞へ滴下し、 2 ~ 8時間インキュベーションし、その後、培地交換し、さらにその 3日後 G 418添加選択培地に交換した。これからさらに 3日毎に培地交換を行い、安定発現株を作出した。一例として、 C末端に FLAGェピトープタグを含むものの一時発現を図 14 に示す。検出は抗 FLAG-M2抗体（コダック社製）を用いたウェスタンプロット法により、抗マウス Ig -アルカリフォスファターゼ酵素標識抗体系で染色して行った。この実施例に示す cDNAを用いた組換え発現体は、還元下 250kDa程度の分子サイズを示した。そして、この分子サイズは、ヒト健常人血漿中にも存在することが認められた (後述する実施例 14項の図 18) 。また、この酵素は、遺伝子のクローニングの際に認められた al ternat ive spl icing産物（配列番号 6〜21) などの存在、糖鎖付加などの翻訳後修飾の違い、あるいは精製工程中での分解に起因すると思われる複数の分子種がヒト血漿中では存在することが確認されている（後述する実施例 14項の図 17 及び Gerri tsenら、 Blood vol. 98， 4-mi (2001) 記載）。

次に、組み換え体の WF切断活性を実施例 2に示した方法で確認した (図 15) 。これらの結果、本願発明のヒト血漿由来酵素及び遺伝子組換え産物は、同じ vWFの切断活性を示すことが確認された。

実施例 1 0

(部分 cDNAを含む発現ベクターの調製：大腸菌宿主系）

一例として当該蛋白質のメタ口プロテアーゼドメイン領域をコードしている部分 c DNAを、例えば制限酵素サイトとして Ncolを付加し、開始コドンを含むセンスプライマー（配列番号 3 0 ) 及び Hindlllサイトを付加した終結コドンを含むアンチセンスプライマー（配列番号 3 1 ) を用いて、前出の正常ヒト肝臓由来 Marathon-Ready^{1 M} cDNAを铸型として、もしくは実施例 6または 7で得られた cDNAを鍀型として、 TAKAR A LA Ta with GC rich bufferにて PCRの後、 Ncol/Hindlllにて消化、大腸菌発現用ベクターである例えば、 UTl (Soej ima et al.， J. Biochem. (Tokyo) vol. 130, 269-277 (2001) ) の Ncol/Hindlll消化物とライゲーシヨンし、，常法により、大腸菌コンビテントセル JM109にトランスフォーメーションした。形成したコロニー群から数クロ一ンをとり、それらから遺伝子を調製したのち、そのプラスミドベクタ一のインサート部位の核酸配列が配列番号 3 2と同等あるいは本質的に配列番号 3 3で表されるポリペプチドをコードしている遺伝子であることを自動 DNAシークェンサ一に一し確 δ忍した。

実施例 1 1

(部分 cDNAを含む発現ベクターの大腸菌菌体内発現）

実施例 1 0により構築した発現ベクターを導入した宿主大腸菌を 50 g/mlのアンピシリンを含む LB培地 200ffll中に 30°C—晚前培養し、それを 8リットルの LB培地を含むフアーメンターに播種し、 600nmの濁度が 0. 2〜0. 5になるまで 30°Cにて培養した。その後、終濃度 lmMとなるようにィソプロピル - 1 -チォ - jS - D-ガラクトピラノシドを添加して、さらに一晩培養し、当該蛋白質のメタ口プロテアーゼドメイン領域の発現を誘導した。そして、培養した大腸菌を遠心機にて（30分 4°C) 集菌した。

続いて、集菌した大腸菌ペレットを蒸留水にて再懸濁し、終濃度 0. 6nig/inlのリゾチームを添加して、室温 30分撹拌後、一晩 4°Cに静置し、菌体を破砕した。そして、さらに超音波処理後、遠心機にて（20分 4°C) 遠心分離し、ペレットを回収し、これを 50DIMトリス lOfflM EDTA 1 トライトン X- 100 pH8. 0にて再懸濁した。この遠心分離、超音波処理、再懸濁操作を数回繰り返したのち、ペレットを蒸留水に再懸濁し、同様に遠心分離、超音波処理、再懸濁操作を数回繰り返し、インクルージョンポディーを回収した。このインクルージョンボディは、抗体作製の際の抗原として用いられた。

実施例 1 2

(他動物種ホモ口グ遺伝子の単離）

配列番号 1 5記載の核酸配列をプローブとして、 GenomeNet WWW server (ht tp ://w ww. genome, ad. j /)においてプログラム BLASTNにより、ホモロジ一サ一チを行った結果、マウス染色体 1 0番にマップされる染色体クローン AC091762及び AC090008が得られた。この配列を基に、配列番号 3 4に示す本酵素のマウスホモログを推定した。この配列から新たにプライマ一を設計し、前述したヒト v WF切断酵素コード遺伝子の単離同定で行った手法により、ノザンプロット解析を行い、ヒトと同様、肝臓で特異的に発現していることを確認した。さらに、正常マウス肝臓由来の Poly A+

RNA及び Marathoii-Ready^{T M} cDNA (CL0NTECH社製）を用いて、ヒト同様、 R A C E 法により本酵素遺伝子の単離 ·同定を行った。その結果、配列番号 3 5、 3 6に示す本酵素のマウスホモ口グの遺伝子配列が決定された。

決定されたこのマウスホモログ部分配列を基に、前出のマウス染色体 1 0番の 5 ' 側の Exon/Int nm構造を決定し、これを基に常法 (Gene Target ing: A Pract ial A pproac Firs t Edi t ion Edi ted by A丄 Joyner、 Teratocarc inomas and embryonic s tem cel l a pract ical approachなど）に従い、ノックアウト（ノックイン）マウス作出用の夕ーゲッティングベクター作製が可能となり，遺伝子変異マウスの作製が可能となった。また、さらには、本蛋白質を常法により組換え発現させることも可能である。

実施例 1 3

(抗体の作製及びその抗体を用いた本酵素の検出系の構築）マウス ·ゥサギに常法により（Current Protocols in Molecular Biology： Cha ter 11 i腿翻 logy、 Ant ibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edi ted by J. McCAFFERTY et al.あるいは ANTIBODY ENGINEERING second edi t ion Edi ted by Carl A. K. BORREBAECKなど）、ヒト血漿より部分精製した抗原タンパク、あるいはその一部のアミノ酸配列を有する合成ペプチド（一つの例として、本酵素のアイソフォームの一つの C末端領域のペプチド配列（配列番号 3 7 ) P e-Ser-Pro-Ala-Pro-Gl n-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Glu-Asn-Ser-Val-Gln-Ser-Ser) を場合によっては至適なキャリアー物質（KLH等）に結合させたもの（KLHを付加しやすくするために Cysを N末端あるいは C末端などに付加したもの）、上述の遺伝子組換えタンパク質またはそれをコードする遺伝子を導入した発現ベクターを投与し、モノクローナル抗体発現ハイプリドーマの確立及びポリクローナル抗体（抗血清）の作出を行った。

続いて、上記種々の方法により調製された抗体を用いて、常法により（Current P rotocols in Molecular Biology： Cha ter 10 analys is of proteins、 Chapter 1 1 i腿 unologyなど）、本酵素のウエスタンプロット法による検出を行った。具体的には、遺伝子組み換え体の発現の確認として、実施例 9に示す手順で得られた組み換え体発現 293細胞の培養上清の非還元状態での SDS- PAGEを行つた後、 PVDF膜への転写後、マウス、ゥサギ等の抗血清により確認した（図 16) 。その結果、分子サイズとして 1 6 0〜2 5 O kDaの範囲に本酵素由来と想定されるバンドが検出された。そして、次に、原料血漿等と組換え体での本酵素の検出を非還元下で行ったところ、 1 0 5〜1 6 O kDaあるいは 1 6 0〜2 5 0 kDaにパンドが確認された（図 17) 。また、組換え蛋白質を免疫して確立したモノクローナル抗体（Clone No. CPHSWH-10) においても同様な組換え体由来のバンドが検出できた。

さらに、本酵素のアイソフオームの一つの C末端領域のペプチド配列（配列番号， 3 7 ) Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Gln-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Glu-Asn-S e r - Va卜 Gin- Se r- Se rを KLHに結合したものを免疫原として得られたぺプチド抗体により、還元条件下、健常人血漿、 TTP患者血漿あるいは、組み換え体培養上清中から本酵素の検出を行ったところ、一部の TTP患者血漿では明瞭ではないが、概ね 2 5 0 M) a程度の本酵素由来のシグナルと想定されるバンドが確認された（図 18) 。

またさらには、得られた抗体を組み合わせることで構築される酵素免疫測定法 (EL ISA)により、組換え夕ンパク質の培養上清レベルでの濃度依存的な検量線が作製できた（図 19) 。 E L I S Aとしては以下の記述により例示されることができる。得られたマウス抗 vWF切断酵素抗体を Nunc社製 Maxisorpプレートに固相化し、 vWF切断酵素一時発現 293細胞の培養上清を 1/1、 1/2、 1/4希釈したもの（0として、 Mock上清）を 100 ^ 1ノゥエルで反応させ、例えば 37°C 1時間後、 0. 05 %Tween20/TBSでプレートを洗浄後、ゥサギ抗切断酵素抗体を例えば 100倍希釈濃度で 100 μ 1 Zゥ工ルで反応させ、例えば 37°C 1時間後、 0. 05 %Tween20/TBSでプレートを洗浄後、さらにパ一ォキシダーゼ標識抗ゥサギ Ig抗体（BioRad社製）を例えば 1000倍希釈濃度で 1 00 x 1 Zゥエルで反応させ、例えば 37°C 1時間後、 0. 05 %Tween20/TBSでプレートを洗浄後、発色基質 TMBZを用いて一定時間の発色反応後、停止液として 1 M硫酸にて反応を停止させて、 450raiの吸光度を測定する。これを応用することで、様々な検体での本酵素の定量が可能となった。

実施例 1 4

(抗体を用いた本酵素の精製）

得られた抗体を適当な固定化担体に結合させることでァフィ二ティ一力ラムを作製し、当該酵素の精製に供した。ァフィ二ティーカラムの調製には、チッソ社製 NHS 活性化セル口ファインを用いて、添付文書に従い抗体を固定化した。これにより調製した約 l m lの膨潤担体を用いて、実施例 9に示す当該酵素の 2 9 3細胞を宿主とした遺伝子組換え体の発現培養上清をアプライしたのち、 50mM Tris-HCl 0. 1M Na CI pH7. 5 (以下 TBS) でカラムを洗浄後、尿素を含んだ 0. 1Mグリシン PH3バッファーで溶出した。溶出された画分を 1M Tris-HCl pH8. 5にて中和し、 TBSに対して透析した。得られた精製酵素の SDS-PAGEを図 2 0に示す。また、得られた精製画分に vWFを切断する活性が存在することも確認された。そして、この組換え酵素により断片化された vWFの切断点は、その断片の N末端アミノ酸配列解析から 842Tyr- 843Metの位置であることが確認された。また、実施例 1 3に示される方法により作製されたモノクローナル抗体を用いても同様に精製に供することが可能なクローン（Clone No. C PHSWH- 7. 2および 10など）が確立された。

続いて精製された本酵素の部分アミノ酸配列を決定した。常法により、 SDS-PAGE 後、 PVDF膜へトランスファーし、風乾したのち、 PEアプライドバイオシステムズ社のオートプロテインシークェンサ一 492にて解析を行った。その結果、部分 N末端配列として Al a- Ala- Gly- Gly_I le-を有することが明らかとなった。この配列は、遺伝子構造から推定された当該酵素の成熟体の N末端配列に一致した。

実施例 1 5

(抗体による本酵素活性の中和） . 前述の家兎ポリクローナル抗体による vWF切断酵素の中和活性を評価した。遺伝子組換ぇ ?切断酵素1〜10 8 /111 1 (ブラッドフォード法にて概算）に対して、正常家兎血清、 C末端領域のペプチド配列（配列番号 3 7 ) Phe-Ser-Pro-Al a-Pro-Gl n - Pro_Arg- Arg- Leu- Leu- Pro- Gly_Pro- Gin- Glu- Asn- Ser_Va卜 Gin- Ser- Serを KLHに結合したものを免疫原として得られた家兎抗血清、および実施例 7、 8に示す発現べクタ一により発現された蛋白質により免疫誘導された抗血清のそれぞれを体積比ォ 1あるいは 5倍希釈した抗血清を 1対 1で予め 3 7 °Cで 1時間反応させた後、前述した方法で vWFの切断活性を評価したところ、図 2 1に示すごとく蛋白質により免疫誘導された抗血清で本酵素の阻害活性 (アン夕ゴニス卜活性) を有するものが調製された（メタ口プロテアーゼのインヒビターである EDTAをコントロールとした。）。このことは、単に中和抗体の作製が可能であるという知見のみならず、 vWF切断酵素に対する自己抗体陽性の後天的 ΠΡ患者様のモデルを構築できる可能性も示唆している実施例 1 6

(C末端削除改変体の構築）

図 2 2に示すストラテジーにより、実施例 6，または 7により得られた全長の vWF 切断酵素遺伝子クロ一ニングベクター（pCR2. lvWFCP) を利用して、 C末端より逐次ドメインを欠失させた変異体（T1135s top、 W1016s top, W897s top、 T581s top、 Q449s top：それぞれの数字は開始コドン ATGのコードする Metから終結コドンまでのァミノ酸の残基数を示し、 FLAGェピトープ（DNA配列： gactacaaggacgatgacgataagtga (配列番号 4 7 ) 、アミノ酸配列： Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys (配列番号 4 8 ) ) を付加した部位を示す。この際に用いたプライマーは以下の通りであり、 Sはセンスプライマーを ASはアンチセンスプライマ一を示す。 Stu I-S (配列番号 3 8 ) 、 Acc I - S (配列番号 3 9 ) 、 Avr II-S (配列番号 4 0 ) 、 Q449stop-AS (配列番号 4 1 ) 、 T581stop-AS (配列番号 4 2 ) 、 W897stop-AS (配列番号 4 3 ) 、 W1016s top-AS ( 配列番号 4 4 ) 、 T1135stop-AS (配列番号 4 5 ) 、 Ful l length - AS (配列番号 4 6 ) ) 遺伝子を調製し、実施例 8、 9同様の方法により、 pCAG発現ベクターに組み込み、 Hela細胞にその発現ベクターを遺伝子導入した。図 2 2上部の制限酵素地図下に示すプライマー対を用いて PCRフラグメント（から（F)を得て、各 PCRフラグメントを PCR2. lvWFCPにライゲ一シヨンした。さらに、 Stu I/Sal I消化し、フラグメント（A)および (B)を Stu I/Sal I消化してライゲーシヨンした。また、 Acc I消化し、フラグメント（C) を Acc I消化してライゲーシヨンした。さらに、 Avr II/Sal I消化し、フラグメント )、（E)および (F)を Avr II/Sal I消化してライゲーシヨンした。その結果、 C末端から^ 97位まで欠失した変異体においても、定性的ではあるが活性を有することが明らかになった。こういったアプローチにより、様々な機能ドメインの同定が可能になり、当該ドメインを含む酵素活性を有しない分子のデザィンを行うことでアン夕ゴニストの設計あるいはその逆にァゴニス卜の設計が可能になると考えられる。産業上の利用可能性

本願発明によりもたらされた知見により、血栓性血小板減少性紫斑病等の当該酵素の欠損に起因する疾病患者への補充療法の可能性が拓かれる。遺伝子のクローニング及び、血清、血漿からの効率的な精製法の確立が可能となる。とりわけ今回の情報により、得られた塩基配列をもとに、遺伝子組み換え化が可能となり、従来困難であった本願発明の酵素の安定的な生産、供給が可能となり、 T T Pの患者への当該酵素の補充療法、あるいは新規な抗血小板薬として心筋梗塞、脳梗塞における血小板血栓抑制、動脈硬化症の抑制、 P T C Aにおける再狭窄や再塞栓 ·梗塞の防止、 P T C Rにおける再塞栓の防止、 HU Sや O— 1 5 7が原因となる血小板血栓の予防への応用が可能となる。また、本酵素をコードする遺伝子あるいは当該酵素に対する抗体を用いた診断及び治療が可能となる。本明細書に引用されたすベての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。

Claims

：求の範囲

1. フォンビルブラント因子 (von Willebrand Factor：以下、 vWFと称することがある）の 842 Ty r -843Me tの結合を切断し得る性状を有し、部分配列として Leu- Leu - Va卜 Ala- Valのアミノ酸配列または当該アミノ酸配列のうち 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含有するポリべプチド鎖よりなる蛋白質分解酵素。

2. 成熟型蛋白質の N末端側部分配列として Ala- Ala- Gly_Gly- lie- Leu- His-Leu-G lu- Leu- Leu - Val- Ala - Valのアミノ酸配列または当該アミノ酸配列のうち 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ酸配列を含有するポリぺプチド鎖よりなる、請求項 1に記載の蛋白質分解酵素。

3. 成熟型蛋白質の N末端側部分配列として、配列番号 3もしくは 7で表されるアミノ酸配列のうち 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ酸配列または前記のいずれかのアミノ酸配列の部分配列もしくは前記アミノ酸配列を含有するポリペプチド鎖よりなる、請求項 1または請求項 2のいずれかに記載の蛋白質分解酵素。

4. 配列番号 16カら配列番号 21のいずれかに記載のァミノ酸配列のうち 1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたァミノ酸配列を含有するポリべプチド鎖よりなる、請求項 1から請求項 3のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素

5. 還元あるいは非還元条件下の SDS— PAGEにおいて 105〜： L 60kD aあるいは 160〜250 k D aの分子量を有する請求項 1から請求項 4のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素。

6. vWの 842Ty r— 843Me tの結合を切断する能力を有し、部分配列として Leu- Leu- Va卜 Ala-Valのアミノ酸配列または当該アミノ酸配列のうち 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ酸配列を含有するポリぺプチド鎖よりなる蛋白質分解酵素をコードする遺伝子断片。

7. 請求項 2から請求項 5のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素をコードする遺伝子断片。

8. vWFの 842Ty r— 843Me tを切断し得る活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列であって、 CTG CTG GTG GCC GTGからなる塩基配列または当該配列のうち 1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含有する、前記請求項 1から請求項 5のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素をコードする DNA。

9. GCT GCA GGC GGC ATC CTA CAC CTG GAG CTG CTG GTG GCC GTGからなる塩基配列または当該配列のうち 1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含有する、請求項 8記載の蛋白質分解酵素をコードする DNA。

10. 配列番号 6で表される塩基配列のうち 1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列または前記のいずれかの塩基配列の部分配列または前記塩基配列を含有する請求項 8または請求項 9記載の蛋白質分解酵素をコードする DNA。

11. 配列番号 15で表される塩基配列のうち 1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列または前記のいずれかの塩基配列の部分配列または前記塩基配列を含有する請求項 8から請求項 10のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素をコードする DNA。

12. 配列番号 6もしくは 15で表される塩基配列のうち 1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列または前記のいずれかの塩基配列の部分配列または前記塩基配列を含有する請求項 8または請求項 9記載の蛋白質分解酵素をコードする DNAを含むことを特徴とするベクタ一。

13. ポリペプチドコード領域を含み、当該ポリペプチドの発現に特化されることを特徴とする請求項 12記載のベクター。

14. 請求項 12記載のベクターで形質転換またはトランスフエクトされた細胞

15. 請求項 13記載の発現べクタ一で形質転換またはトランスフエクトされた宿主細胞。

1 6 . 請求項 1から請求項 5のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素を含有して成る医薬品組成物。

1 7 . 遺伝子異常もしくは肝臓の疾病に伴う請求項 1から請求項 5のいずれか 1 項に記載の蛋白質分解酵素の活性低下による疾病の改善に適用される、請求項 1 6 記載の医薬品組成物。

1 8 . 過剰量の vWF高分子マルチマーの生成に起因する血小板凝集の抑制に適用される、請求項 1 6または請求項 1 7に記載の医薬品組成物。

1 9 . 疾病が血栓性血小板減少性紫斑病である請求項 1 8記載の医薬品組成物。

2 0 . 請求項 1から請求項 5のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素に対する抗体。

2 1 . 請求項 1から請求項 5のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素に対する抗体であって、当該酵素の活性を阻害もしくは中和し得る請求項 2 0記載の抗体。

2 2 . 請求項 1から請求項 5のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素に対する抗体であって、当該酵素のァフィ二ティー精製に用いられ得る請求項 2 0記載の抗体

2 3 . 請求項 2 2記載の抗体を使用してなる請求項 1から請求項 5のいずれか 1 項に記載の蛋白質分解酵素の精製方法。

2 4. 請求項 1から請求項 5のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素に対する抗体を含有してなる医薬品組成物または診断薬。

2 5 . 請求項 1から請求項 5のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素のアン夕ゴ二ストもしくは阻害剤あるいはァゴニストもしくは活性調節剤。

2 6 . 請求項 1から請求項 5のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素のアン夕ゴニス卜もしくは阻害剤あるいはァゴニストもしくは活性調節剤を含有してなる医薬品組成物または診断薬。

2 7 . 請求項 8から請求項 1 1のいずれか 1項に記載の D NAまたは当該 D NA のアンチセンス D NAを含有して成る医薬品組成物または診断薬。

2 8 . 遺伝子異常もしくは肝臓の疾病に伴う、請求項 1から請求項 5のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素の活性低下による疾病の改善を目的とする遺伝子治療に用いられる、請求項 2 7記載の医薬品組成物。

2 9 . メンブレンフィルタ一上での vWF及び vW切断酵素による酵素 ·基質反応の後、当該フィルタ一より基質サンプルを回収し、ウェスタンブロッテイングに供することなく、 S D S— P A G Eに供し解析することを特徴とする vW切断活性の測定方法。

3 0 . 請求項 2 9記載の方法により被験化合物の v 切断活性を測定することを含む、 vWFを切断し得る化合物をスクリーニングする方法。

3 1 . ヒト血漿フラクション Iペーストを出発材料とする、請求項 1から請求項 5のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素の調製方法。

3 2 . 請求項 1から請求項 5のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素の他動物種ホモログまたは相同な蛋白質。

3 3 . 請求項 3 2記載の当該蛋白質の他動物種ホモログまたは相同な蛋白質をコ一ドする遺伝子。

3 4 . 請求項 3 2記載の当該蛋白質の他動物種ホモログまたは相同な蛋白質をコ一ドする遺伝子を改変された動物。