PT1956093E

PT1956093E - Protease de clivagem do factor von willebrand (vwf)

Info

Publication number: PT1956093E
Application number: PT08156811T
Authority: PT
Inventors: Kenji Soejima; Noriko Mimura; Hiroaki Maeda; Chikateru Nozaki; Takayoshi Hamamoto; Tomohiro Nakagaki
Original assignee: Chemo Sero Therapeut Res Inst
Priority date: 2001-04-25
Filing date: 2002-04-25
Publication date: 2011-12-30
Also published as: AU2008201773A8; CA2445421C; ES2373482T3; US7361748B2; AU2008201773B2; EP1956093B1; AU2008243279A1; CN100537770C; US7112666B2; JPWO2002088366A1; CN101613688A; AU2008243279B2; JP2003284570A; US8067221B2; US20080254527A1; JP4163517B2; EP1956093A1; US20130041137A1; CY1112000T1; AU2008201773A1

Description

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DESCRIÇÃO "PROTEASE DE CLIVAGEM DO FACTOR VON WILLEBRAND (VWF)" A presente invenção diz respeito a um ADN que codifica uma proteína plasmática relacionada com a área farmacêutica. Mais particularmente, a presente invenção diz respeito a um ADN que codifica uma protease que cliva especificamente o factor von Willebrand (que poderá ser referido daqui para a frente como "vWF"), que está associado à coagulação sanguínea. A protease de clivagem do vWF codificada pelos ADN da presente invenção permite a terapêutica de substituição para pacientes com doenças que resultam de deficiências ou diminuições desta protease, tais como a púrpura trombocitopénica trombótica (que poderá ser referida daqui para a frente como «^ΤΡ"). Adicionalmente, prevê-se o seu uso como um novo agente trombótico antiplaquetário. 0 vWF é produzido nos megacariócitos ou células endoteliais vasculares, e é um factor de coagulação do sangue em que subunidades simples que compreendem 2050 resíduos de aminoácidos (monómeros de cerca de 250 kDa) são ligadas por pontes S-S para formar uma estrutura multímera (com um peso molecular de 500 a 20000 kDa). O seu nível no sangue é de cerca de 10 pg/ml, e um factor de elevado peso molecular tem geralmente uma actividade específica mais elevada. O vWF tem duas funções principais como factor hemostático. Uma das funções é como proteína transportadora em que o vWF se liga ao factor de coagulação do sangue VIII para estabilizá-lo. Outra função é formar um rolhão plaquetário através da adesão e aglomeração de plaquetas no tecido subcelular endotelial vascular numa parede vascular lesionada. A púrpura trombocitopénica trombótica é uma doença que 2 causa a formação dum rolhão plaquetário em arteríolas somáticas e capilares sanguíneos ao longo de todo o corpo. Apesar dos avanços recentes na tecnologia médica, a morbidade associada a esta doença aproximadamente triplicou de 1971 a 1991. Patologicamente, a TTP é considerada como resultante da citotoxicidade endotelial vascular ou agregação plaquetária vascular. Imunohistologicamente, são reconhecidos uma grande quantidade de vWFs nos rolhões plaquetários resultantes, e o vWF é considerado como tendo um papel principal na sua causa. Concluiu-se que uma estrutura de multímero de vWF normal ou de elevado peso molecular é dominante num paciente com TTP, e um multímero de vWF grande não comum (ULvWFM) ou um multímero de vWF grande (LvWFM) jogam um papel principal na aceleração da agregação plaquetária ou formação de microtrombos sob um stress de corte elevado. Pelo contrário, sabe-se que o vWF degrada-se numa posição entre os resíduos Tyr 842 e Met 843 através da acção da protease de clivagem de vWF na circulação sanguínea de uma pessoa saudável sob um stress de corte elevado. Assim, considera-se que a TTP ocorre da seguinte maneira. A actividade da protease no plasma, por alguma razão, está diminuída e de ULvWFM a LvWFM estão aumentadas para acelerar a agregação plaquetária. Isto forma rolhões plaquetários nos vasos sanguíneos.

Recentemente, Furlan et al. (Blood, vol. 87, 4223-4234: 1996, Publicação de Patente JP (Kohyo) No. 2000-508918) e Tsai et al. (Blood, vol. 87, 4235-4244: 1996) desenvolveu um método para analisar a protease de clivagem específica para vWF. No seu relatório, esta actividade da protease baixou efectivamente em TTP. Os autores acima mencionados relataram que esta enzima era uma metaloprotease no plasma e parcialmente purificada. No entanto, não ainda tiveram sucesso na sequenciação de aminoácidos que deveria especificar a protease. Não houve mais desenvolvimentos desde então. 3

Até ao presente, a terapia de plasmaferese tem sido realizada para tratamento de pacientes que congenitamente têm falta da protease de clivagem específica de vWF e de pacientes que adquiriram anticorpos positivos contra esta protease. É desejável o estabelecimento de terapia de substituição usando produtos purificados ou uma substância pura tal como um produto de gene recombinante da protease acima mencionada. A TTP familiar em pacientes com falha congénita da protease de clivagem especifica para vWF, e TTP não familiar são causadas por produção à posteriori de autoanticorpos contra a protease acima mencionada. Assim, a terapia de substituição para esta protease é preferível para pacientes TTP familiar (administração de plasma é de facto realizada e é necessária a remoção de autoanticorpos por plasmaferese e substituição desta protease para TTP não familiar). Adicionalmente, o uso desta protease como um novo agente trombótico antiplaquetário também pode ser expectável.

Tal como mencionado acima, no entanto, Furlan et al. (Blood, vol. 87, 4223-4234: 1996, Publicação de Patente JP (Kohyo) No. 2000-508918) e Tsai et al. (Blood, vol. 87, 4235-4244: 1996) sugeriram que a protease de clivagem vWF era uma metaloprotease no plasma. Foi relatado como sendo parcialmente purificada, e concentrada 1000 a 10000 vezes a partir de plasma nos termos da sua actividade específica. Mesmo sob essas condições, não tem havido avanços na análise das propriedades desta protease, tal como a sequência de aminoácidos da sua proteína, durante o período de aproximadamente 5 anos que já passou desde então. Ainda não foi obtida informação biológica especifica com respeito a esta protease. Como relatado por Furlan et al., a proteína de interesse é presumível que seja gigantesca, e podem haver vários problemas associados com isto. Por exemplo, são expectáveis formas diversificadas desta protease, tal como várias moléculas ou cofactores que 4 interagem. Baseado na complexidade dos processos de purificação, a capacidade de separação deteriorada por interacção não especifica durante o passo de purificação e outros factores, deduz-se que seja muito difícil isolar e identificar a protease a partir duma fracção de plasma pelo processo de purificação de acordo com Furlan et al.

De acordo com as circunstâncias acima, os inventores presentes conduziram estudos intensos de modo a isolarem e identificarem a protease de clivagem para vWF. Como resultado, tiveram sucesso no isolamento e purificação da protease de clivagem para vWF de interesse, o que ainda não tinha sido relatado. Assim, tiveram sucesso na identificação da sequência de aminoácidos da proteína matura e dum gene que codifica esta sequência de aminoácidos. A protease de clivagem para vWF codificada pelos ADN da presente invenção pode clivar uma ligação entre os resíduos Tyr 842 e Met 843 de vWF. De acordo com uma modalidade, esta protease tem um peso molecular de 105 a 160 kDa ou 160 a 250 kDa em SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras. É compreendida uma cadeia de polipéptido tendo Leu-Leu-Val-Ala-Val como uma sequência parcial. Mais preferivelmente, é compreendida por uma cadeia de polipéptido com a sequência de aminoácido N-terminal parcial duma proteína matura, i.e., Ala-Ala-Gly-Gly-Ile-Leu-His-Leu-Glu-Leu-Leu-Val-Ala-Val. É uma substância caracterizada pelas propriedades seguintes.

1) Actividade de clivagem de vWF

De acordo com a análise da sequência N-terminal do fragmento de clivagem, a protease codificada pelo ADN da presente invenção cliva uma ligação de péptido entre os resíduos Tyr 842 e Met 843. 2) Fraccionamento por filtração em gel

Quando é realizado o fraccionamento por cromatografia de filtração em gel usando pasta FI como material de 5 partida, a maioria das actividades são recolhidas numa fracção com um peso molecular de 150 a 300 kDa. De acordo com uma modalidade da presente invenção, uma substância obtida realmente activa é encontrada como tendo um peso molecular de cerca de 105 a 160 kDa em electrof orese. Assim, a protease codificada pelos ADN da presente invenção é uma substância que provavelmente forma um dimero ou similar ou liga-se a outra molécula ou uma substância que pode ser facilmente degradada ou pode ter uma cadeia de açúcar heterogénea adicionada. 3) Precipitação com sulfato de amónio

Por exemplo, quando é usada a pasta FI como material de partida, uma grande parte desta protease é recuperada como uma fracção de precipitação a partir de uma fracção grosseiramente purificada com o uso de sulfato de amónio saturado a 33%. 4) Por exemplo, a protease codificada pelos ADN da presente invenção derivada da pasta FI preparada a partir de mistura de plasma humano ou crioprecipitado que principalmente tem um tamanho molecular de cerca de 105 a 160 kDa determinado por um marcador de peso molecular em SDS-PAGE. Com base na sequência de ácidos nucleicos como mostrado em SEQ ID NO: 15, quando uma sequência de aminoácidos representada por uma grelha entre um codão de iniciação atg na posição 445 e um codão de terminação tga na posição 4726 é expressa por recombinação genética, existem algumas variações nos tamanhos moleculares que dependem dum hospedeiro. No entanto, é apresentado um tamanho molecular de cerca de 160 a 250 kDa determinado por um marcador de peso molecular. Este tamanho é observado no plasma de humanos saudáveis e em alguns pacientes com TTP. Várias espécies moleculares desta protease estão presentes no plasma humano, por causa da presença de produtos de splicing alternativos (SEQ ID NOs: 16 a 21) reconhecidas na altura da clonagem genética, diferenças na modificação pós-tradução tal como adição de 6 cadeia de açúcar, ou degradação durante a purificação. Adicionalmente, esta protease pode ser parcialmente recuperada num estado activo após SDS-PAGE sob condições não redutoras. 5) Análise da sequência de aminoácidos A sequência de aminoácidos do fragmento de polipéptido isolado foi analisada. Esta apresentou um exemplo duma cadeia de polipéptido com uma sequência Leu-Leu-Val-Ala-Val como uma sequência de aminoácidos parcial e uma sequência Ala-Ala-Gly-Gly-Ile-Leu-His-Leu-Glu-Leu-Leu-Val-Ala-Val como uma sequência de aminoácidos N-terminal duma proteína madura. Adicionalmente, com a bioinformática actual (BIOINFORMATICS: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, edited by Andreas D. Baxevanis and B. F. Francis Ouellette), uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos foi identificada com grande precisão por pesquisa numa base de dados baseada na sequência parcial acima mencionada. Mais especificamente, foi pesquisada a base de dados do genoma com o programa tblastn. Este identificou um clone de cromossoma (AL158826) que deduz-se que codifica a protease da presente invenção. Além disso, os clones (AI346761 e AJ011374) que deduz-se que sejam uma parte da protease de interesse e uma parte do polipéptido a ser codificado pelo genoma acima mencionado foram identificados através emparelhamento com a base de dados da Sequência Expressa Tag (EST) . Com base nisso, na sequência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 3 ou 7 foi identificada como um sitio da protease de clivagem para vWF activo.

Foi obtida a GCT GCA GGC GGC ATC CTA CAC CTG GAG CTG CTG GTG GCC GTG, uma sequência deduzida a partir do genoma, e mais preferivelmente CTG CTG GTG GCC GTG, uma sua parte, o transcriptoma do qual foi confirmado por EST. A sequência de nucleótidos obtida foi analisada, e a análise de motivos foi realizada com base na sequência deduzida. Como 7 resultado, descobriu-se que tem um domínio de metaloprotease como candidato para a protease codificada pelos ADN da presente invenção. Com base nas descobertas acima, tornou-se possível revelar uma sequência duma cadeia de polipéptidos como o mais específico exemplo da protease. Além disso, as actividades das proteases são geralmente conhecidas como variantes dependendo de, por exemplo, substituição, delecção, inserção, ou introdução do ponto de mutação numa porção da sequência de aminoácidos (Soejima et al., Blood coagulation factor VII mutants, Publicação da Patente JP (Kokai) No. 2001-61479 A) . Do mesmo modo, a protease codificada pelos ADN da presente invenção pode ser modificada por, por exemplo, delecção, substituição, ou adição de um ou vários aminoácidos , para preparar proteases optimizadas.

As proteínas protease foram ainda produzidas em massa, e foram determinadas 29 sequências de aminoácidos a partir da extremidade N-terminal. Estas sequências de aminoácidos estão apresentadas na SEQ ID NO: 8. Este resultado é substancialmente o mesmo da sequência como apresentado na SEQ ID NO: 3 ou 7 deduzido por bioinformática. Apenas uma diferença, é que o 27° aminoácido na SEQ ID NO: 3 ou 7 era Glu enquanto que era Arg de acordo com a presente análise da sequência N-terminal. Isto foi considerado como sendo um polimorfismo genético. Assim, esta protease foi confirmada como estando compreendida por uma cadeia de polipéptido com a sequência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 3 ou 7 na sua extremidade N-terminal como uma unidade madura. Um fragmento de gene que codifica esta protease foi então clonado do seguinte modo.

Com base na sequência de ácidos nucleicos como mostrado em SEQ ID NO: 7, um primer sense (SEQ ID NO: 9) e um primer antisense (SEQ ID NO: 10) foram preparados com base na sequência de ácidos nucleicos sublinhados na Fig. 9, e um gene em sanduíche entre estes primers foi 8 amplificado. Este fragmento foi clonado, e a sequência de nucleótido foi então confirmada. Este fragmento foi usado como sonda para Northern blotting para analisar o sitio no qual o gene da protease foi expresso. Como resultado, este gene da protease foi descoberto como sendo expresso principalmente no figado. Assim, foi adquirida a biblioteca de cADN do figado humano, e um gene que codifica esta protease foi identificado usando uma técnica de amplificação rápida de terminações de cADN (RACE - rapid amplification of cDNA ends). Com base nestes resultados, no caso da maior sequência de aproximadamente 5 kb de mARN (cADN) a procura do sitio de adição de poli(A) como apresentado na SEQ ID NO: 15 foi identificado.

Com base na sequência de aminoácidos deduzida a partir desta sequência genética, esta protease foi deduzida como tendo uma preprosequência, e pertencente à familia da desintegrina e metaloprotease (ADAM) com um domínio semelhante ao da desintegrina, um domínio de metaloprotease, e similares, e particularmente à família ADAM-TS com um domínio de trombospondina Tipo-1 (TSP1). Finalmente, incluindo aqueles com inserção ou delecção numa parte da sequência de ácidos nucleicos, isoformas como apresentado nas SEQ ID NOs: 16 a 21 com sequências como apresentado nas SEQ ID NOs: 3 e 7 nos N-terminais após a preprosequência madura ter sido clivada, foram identificadas. Assim, a protease codificada pelos ADN da presente invenção deve clivar a vWF entre os resíduos Tyr 842 e Met 843 e deve ter a sequência Leu-Leu-val-Ala-Val como uma sequência de aminoácidos parcial. A protease de clivagem para vWF codificada pelos ADN da presente invenção pode ser preparada geralmente pelos seguintes processos.

De acordo com a presente invenção, um processo para análise da actividade da protease é caracterizado pela possibilidade de avaliação da actividade dentro de um curto 9 período de tempo. De acordo com o relatório de Furlan et al. (Blood, vol. 87, 4223-4234: 1996, Publicação da Patente JP (Kohyo) No. 2000-508918 A), a actividade é ensaiada por análise de padrões de clivagem de vWF por Western blotting usando o anticorpo anti-vWF e, assim, é demorado transferir a protease para um filtro. Mais especificamente, este processo requer aproximadamente pelo menos 45 horas no total, i.e., 24 horas para a reacção enzimática com um substrato vWF, 17 horas para a electrof orese, e 3 horas para transferir a protease para um filtro, seguindo-se a detecção usando o anticorpo antivWF. Pelo contrário, o ensaio de actividade dos presentes inventores fica completo em 18 horas no total, i.e., 16 horas para a reacção enzimática com um substrato vWF, e 2 horas para a electroforese e detecção. Isto indica que o tempo requerido para o ensaio pode ser reduzido num terço ou menos do que o necessário para o ensaio convencional. Isto também pode diminuir o tempo requerido para o processo de purificação, e por sua vez pode diminuir o grau da protease a ser inactivada. Assim, a eficiência de purificação é melhorada quando comparada com a conseguida pelo método de Furlan et al., e, como resultado, o grau de purificação também é melhorado.

Além disso, o material de partida foi examinado usando o sistema de ensaio acima mencionado. Como resultado, descobriu-se que a actividade da protease foi mais concentrada na pasta FI do que no crioprecipitado que foi relatado por Furlan et al. no passado. A pasta FI foi usada como material de partida, e foram combinados os sistemas de ensaio de actividade rápidos a acima mencionados. Isto permite o isolamento e identificação da protease de interesse. Numa modalidade específica, é empregue um processo de purificação que combina cromatografia de filtração em gel com cromatografia de troca iónica, e também é combinado o sistema de ensaio da actividade acima 10 mencionado .

Mais especificamente, a pasta FI é solubilizada com um tampão, e o resultante é fraccionado por cromatografia de filtração em gel. A actividade da protease é fraccionada na região de eluição com um peso molecular de 150 a 300 kDa deduzida a partir do marcador de tamanho da filtração em gel. De seguida, o resultante é precipitado e concentrado usando sulfato de amónio saturado a 33%. Este procedimento é repetido três vezes no total. A fracção activa obtida na terceira filtração em gel é misturada, e a resultante é sujeitada a diálise a 4 °C durante a noite com um tampão que compreende NaCl 50 mM adicionado a Tris-HCl 50 mM (pH 7,1) . De seguida, o produto de diálise é sujeito a cromatografia de troca aniónica (DEAE) e eluído por etapas com NaCl 0,25 M. Os presentes inventores têm conduzido os estudos intensos de modo a encontrar um processo para o isolamento e identificação da protease codificada pelos ADN da presente invenção. Como resultado, eles descobriram que, surpreendentemente, a protease foi recuperável como uma banda activa após SDS-PAGE não redutora. De modo a conseguir mais produção de massa, a fracção purificada e concentrada foi aplicada à Bioforese utilizando o principio de SDS-PAGE. Assim, uma fracção com a actividade de clivagem vWF foi isolada a partir da fracção da electroforese. De acordo com o cálculo aproximado da actividade especifica até esta fase, foi conseguida a purificação de cerca de 30000 a 100000 vezes. Este procedimento foi eficiente e rapidamente repetido várias vezes, e assim, foi obtido cerca de 0,5 pmole de amostra que é o limite corrente da análise da sequência de aminoácidos. Assim, a análise da sequência de aminoácidos torna-se viável. Mais especificamente, um passo final da separação e purificação (Bioforese) com base no principio da SDS-PAGE é importante, e é a base nas descobertas como resultado dos estudos intensos. 11

De acordo com o relato de Furlan et al., a actividade específica foi melhorada em mais de cerca de 10000 vezes, embora a protease não tenha sido substancialmente isolada ou identificada. Isto poderá ser por causa da desactivação durante a purificação ou a dificuldade de isolamento e identificação das moléculas, que são proteínas gigantescas capazes de interagir com várias outras proteínas tais como a protease codificada pelos ADN da presente invenção, por um método de separação que utiliza vários tipos de cromatografia líquida. Além disso, o conteúdo de protease no plasma foi deduzido como sendo muito pequeno, e assim, foi necessário esperar o estabelecimento do processo de acordo com a presente invenção. Além disso, o uso deste processo permite a purificação de genes recombinantes.

Com base nas descobertas da presente invenção, os péptidos ou proteínas preparados a partir das sequências obtidas são determinados como sendo antigénios. Com o seu uso, um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, ou um seu anticorpo humanizado podem ser preparados por técnicas de imunização gerais (Current Protocols in Molecular Biology, Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH, edited by J. McCAFFERTY et al. ou ANTIBODY ENGINEERING second edition, edited by Cari A. K. BORREBAECK). Alternativamente, um anticorpo que se liga à proteína acima mencionada pode ser preparado por técnicas de produção de anticorpos utilizando exibição por fagos (Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, edited by Brian K. Kay et al., Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH, edited by J. McCAFFERTY et al. ou ANTIBODY ENGINEERING second edition, edited by Cari A. K. BORREBAECK). Alternativamente, com base nestas técnicas, um anticorpo de neutralização que actua contra a actividade da protease ou um anticorpo de ligação simples podem ser isolados a partir duma espécie a partir dum paciente com TTP que tem uma autoanticorpo positivo contra 12 esta protease. Estes anticorpos podem ser aplicados ao diagnóstico e à terapia de doenças tais como TTP.

Com base no genoma obtido ou na sequência EST, o cADN ou um gene genómico que codifica a protease da presente invenção podem ser clonados através duma técnica comum (Molecular Cloning, 2nd edition). E ainda, técnicas de bioinformática (BIOINFORMATICS: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, edited by Andreas D. Baxevanis and B. F. Francis Ouellette) permitem a clonagem de proteínas de outras espécies animais diferentes daquelas que são homólogas, e o gene resultante é fracturado por uma técnica comum (por exemplo, Gene Targeting: A Practical Approach, First Edition, edited by A. L. Joyner. Teratocarcinomas and embryonic stem cell a practical approach) para produzir modelos animais semelhantes TTP. Em particular, a identificação da sequência gene que codifica a proteína derivada a partir dum rato permite a produção inesperada dum ratinho com este gene. Assim, um modelo de ratinho de doença congénita de TTP ou similares pode ser preparado.

De acordo com uma técnica comum (por exemplo, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd edition, ou CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY), estes genes são incorporados num vector de expressão adequado, o resultante é transformado numa célula hospedeira adequada, e o produto do gene recombinante da protease pode assim ser preparado. Neste caso, o gene a ser incorporado não é necessariamente aquele que codifica a região inteira da proteína. Também inclui uma expressão parcial da proteína como definido por um domínio que depende da sua utilização.

Por exemplo, o polinucleótido de acordo com a presente invenção é introduzido numa célula hospedeira usando uma técnica convencional tal como transdução, transfecção, ou transformação. 0 polinucleótido é introduzido sozinho ou em conjunto com outro polinucleótido. Outro polinucleótido é 13 introduzido independentemente, simultaneamente, ou em combinação com o polinucleótido da presente invenção.

Por exemplo, o polinucleótido da presente invenção é transfectado numa célula hospedeira, tal como uma célula animal de mamífero, através duma técnica padrão para transfecção simultânea e selecção usando outro polinucleótido que codifica um marcador de selecção. Neste caso, o polinucleótido será geralmente incorporado de modo estável no genoma da célula hospedeira. Alternativamente, o polinucleótido pode ser ligado a um vector que compreende um marcador de selecção para multiplicação num hospedeiro. Um vector de construção é introduzido numa célula hospedeira através de técnica acima mencionada. Geralmente, um vector plasmídeo é introduzido como ADN de um precipitado, tal como um precipitado de fosfato de cálcio, ou um complexo com um lípido carregado. A electroporação também é empregue para introdução do polinucleótido num hospedeiro. Quando o vector é um vírus, este vírus é empacotado in vitro ou introduzido numa célula de empacotamento, que introduz assim o vírus empacotado numa célula.

As técnicas exaustivas que são adequadas para a produção dum polinucleótido e introdução do polinucleótido resultante numa célula de acordo com esta modalidade da presente invenção são conhecidas e comuns na arte. Tais técnicas estão descritas em Sambrook et al. (acima mencionado), e este documento explica uma variedade de guias experimentais padrão que descrevem as técnicas acima mencionadas em detalhe. Com respeito a esta modalidade da presente invenção, o vector é, por exemplo, um vector plasmídico, um vector fágico de cadeia simples ou dupla, ou um vector virai de ARN ou ADN de cadeia simples ou dupla. Tal vector é introduzido numa célula como um polinucleótido, e preferivelmente como ADN através duma técnica comum para a introdução do ADN ou ARN numa célula. 14

Quando o vector é um fago ou vírus, o vector é preferivelmente introduzido na célula como um vírus empacotado ou selado através de técnica conhecida para infecção e transdução. Um vector virai pode ser do tipo defeituoso ou competente para replicação.

Um vector preferido é um vector que expressa o polinucleótido ou polipéptido da presente invenção em pontos. Geralmente, tal vector compreende uma região de controlo de acção cis que é eficaz para a expressão num hospedeiro ligado de modo operável ao polinucleótido a ser expresso. Quando um factor de acção trans adequado (por exemplo, um grupo de proteases envolvido com o processo pós-tradução tal como Furin ou peptidase de sinal) é introduzido numa célula hospedeira, é fornecido por um hospedeiro, um vector complementar, ou o próprio vector.

Numa modalidade preferida, um vector fornece uma expressão específica. Tal expressão especifica é uma induzivel ou realizada apenas em determinados tipos de células. Alternativamente, é uma expressão específica celular e induzivel. Um vector induzivel particularmente preferido pode induzir a expressão através dum factor ambiental facilmente operável tal como temperatura ou um aditivo nutricional. São conhecidos vários vectores adequados para esta modalidade que incluem uma construção para o uso em hospedeiros celulares procarióticos e eucarióticos e um vector de expressão induzivel, e os especialistas na arte podem usá-los normalmente.

Uma célula hospedeira geneticamente modificada pode ser posta em cultura num meio nutritivo geral, e é modificada para ser particularmente adequada para activação do promotor, selecção de transformantes, ou amplificação dum gene. Geralmente, deverá ser óbvio para os especialistas na arte que as condições cultura convencionais tais como a temperatura ou nível de pH para as células hospedeiras seleccionadas para a expressão são 15 as adequadas para a expressão do polipéptido codificado pelos ADN da invenção.

Uma larga variedade de vectores expressão pode ser usada para expressar o polipéptido codificado pelos ADN da presente invenção. Exemplos destes vectores incluem vectores derivados de cromossoma, epissoma, e vírus. Estes vectores são derivados a partir de plasmídeos bacterianos, bacteriofagos, epissoma de leveduras, elementos de cromossoma de leveduras, ou vírus tais como baculovirus, papovavírus tal como o vírus símio 40 (SV40), vírus vaccinia, adenovírus, vírus da varíola de aves, vírus pseudorabies, ou retrovírus. Um vector derivado duma combinação do acima mencionado, por exemplo, um vector derivado a partir do elemento genético de bacteriófago e plasmídeo, mais especificamente, um cosmídeo ou fagemídeo, também pode ser usado. São usados para a expressão de acordo com com esta modalidade da presente invenção.

Geralmente, uma vez que os polipéptidos foram expressos em hospedeiros, qualquer vector que seja adequado para manter, multiplicar, ou expressar um polinucleótido pode ser usado para a expressão de acordo com a modalidade acima mencionada. Uma sequência de ADN adequada é inserida num vector através de várias técnicas convencionais.

Geralmente, uma sequência de ADN para expressão é ligada a um vector de expressão por clivagem duma sequência de ADN e um vector expressão com 1 ou mais endonucleases de restrição, e um fragmento é então ligado usando a ligase de ADN T4. As técnicas de restrição e ligação que podem ser usadas para os fins acima são conhecidas e comuns para os especialistas na arte. Em relação a isto, Sambrook et al. (acima mencionado) descreve com muita precisão outro método adequado para a construção dum vector de expressão que utiliza outra técnica conhecida e comum para os especialistas na arte.

Uma sequência de ADN no vector de expressão é ligada 16 de modo operável a, por exemplo, uma sequência de regulação da expressão adequada que inclui um promotor para orientar a transcrição do mARN. Alguns exemplos de promotores representativos conhecidos são o promotor PL do fago lambda, promotores lac, trp, trc, e tac de E. coli, promotores SV40 precoces e tardios, e o promotor LTR de retrovírus. Muitos promotores que não estão descritos são adequados para o uso de acordo com a modalidade da presente invenção, conhecidos, e mais facilmente usados como descrito nos exemplos da presente invenção. Geralmente, uma construção de expressão compreende um sitio de ligação ao ribossoma para tradução num sítio de iniciação de transcrição ou de terminação ou um domínio transcrito. A região de codificação do transcrito maturo que foi expresso pela construção compreende a iniciação AUG nos codões de iniciação e terminação localizado substancialmente no término do polipéptido a ser traduzido. Adicionalmente, a construção compreende uma região reguladora que regula e induz a expressão. Geralmente, tal região é activada através da regulação do sítio de ligação do repressor, a transcrição de um intensificador, ou similar, de acordo com vários métodos convencionais.

Os vectores para a multiplicação e expressão incluem marcadores de selecção. Tais marcadores são adequados para multiplicação, ou compreendem marcadores adicionais para os objectivos acima estabelecidos. 0 vector de expressão compreende preferivelmente um ou mais genes marcadores de selecção para fornecer traços fenotipicos para o objectivo de selecção da célula hospedeira transformada. Um marcador preferido inclui dihidrofolato reductase ou resistência à neomicina com respeito à cultura de células eucarióticas. Tem resistência à tetraciclina ou ampicilina com respeito às culturas de E. coli e outras bactérias. Os vectores adequados que compreendem uma sequência de ADN e um promotor ou sequência reguladora adequados como aqui 17 descrito são introduzidos num hospedeiro adequado por várias técnicas conhecidas adequadas para a expressão do polipéptido de interesse.

Os exemplos representativos de hospedeiros adequados incluem: células bacterianas tais como E. coli, Strepromyces e Salmonella typhimurium; células fúngicas tal como uma célula de levedura; células de insectos tais como células de Drosophila S2 e Spodoptera Sf9; e células animais ou plantas adesivas ou flutuantes tais como CHO, COS, células do melanoma de Bowes, e SP2/0. São conhecidos vários hospedeiros para construções de expressão, e os especialistas na arte podem facilmente seleccionar um hospedeiro para expressar polipéptidos codificados pelos ADN de acordo com esta modalidade com base na revelação da presente invenção.

Mais especificamente, a presente invenção inclui uma construção recombinante, tal como uma construção de expressão que compreende uma ou mais sequências como mencionado acima. A construção é um vector, tal como um vector plasmidico ou virai que compreende a sequência da presente invenção aqui inserida. A sequência é inserida numa direcção positiva ou negativa. Num exemplo especifico preferido, a construção tem ainda uma sequência reguladora que compreende um promotor ou similar que é ligado de modo operável à sequência. São conhecidos vários vectores adequados e promotores pelos especialistas na arte, e existem muitos vectores disponíveis comercialmente que são adequadamente usados na presente invenção.

Os vectores comercialmente disponíveis estão exemplificados abaixo. Os vectores que são preferivelmente usados para bactérias são pQE70, pQE60, e pQE-9 (Qiagen); vector pBS, vector PhageScript, vector Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, e pNH46A (Stratagene); e ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, e pRIT5 (Pharmacia). Exemplos de vectores eucarióticos preferidos são pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl; e 18 pSG (Stratagene) e pSVK3, pBPV, pMSG, e pSVL (Pharmacia). Estes vectores estão disponíveis comercialmente para os especialistas na arte para serem usados de acordo com a modalidade da presente invenção, e são uma mera lista de vectores conhecidos. Por exemplo, também podem ser usados outros plasmídeos ou vectores adequados para introdução, manutenção, multiplicação, ou expressão do polinucleótido ou polipéptido codificado pelos ADN da presente invenção em hospedeiros de acordo com esta modalidade da presente invenção.

Uma região promotora pode ser seleccionada a partir dum gene de interesse usando um vector que compreende, por exemplo, um fragmento promotor candidato, i.e., uma unidade de transcrição repórter que não tem uma região promotora tal como uma unidade de transcrição da cloramfenicol acetil transferase (CAT) localizada a jusante dos sítios de restrição para a introdução de fragmentos que contêm o promotor. Como é do conhecido público, a introdução do fragmento que contém o promotor no vector no sítio de restrição localizado a montante do gene cat gera a actividade CAT que pode ser detectada por ensaio de CAT padrão. Um vector que é adequado para este propósito é conhecido e está prontamente disponível. Exemplos de tais vectores são pKK232-8 e pCM7. Assim, o promotor para expressar o polinucleótido da presente invenção inclui não apenas um promotor conhecido prontamente disponível mas também um promotor que pode ser prontamente obtido usando um gene repórter de acordo com a técnica acima mencionada.

Dentre eles, de acordo com a presente invenção, os exemplos de promotores bacterianos conhecidos que são adequadamente usados para expressar polinucleótidos e polipéptidos são promotores lacl e lacZ de E. coli, promotores T3 e T7, promotor gpt, promotores lambda PR e PL, e promotores trp e trc. Exemplos de promotores eucarióticos conhecidos adequados incluem o promotor 19 próximo de Cytomegalovirus (CMV), o promotor de timidina cinase de HSV, promotores precoce e tardio de SV40, um promotor de LTR de retrovirus tal como o promotor do vírus do sarcoma de Rous (RoSV) , e um promotor de metalotioneina tal como o promotor de metalotioneina-I. A selecção de um vector e um promotor adequados para a expressão numa célula hospedeira é uma técnica conhecida. As técnicas necessárias para a construção de vectores de expressão, introdução de um vector numa célula hospedeira, e expressão num hospedeiro são comuns na arte. A presente invenção também diz respeito a uma célula hospedeira com a construção acima mencionada. Uma célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica maior tal como uma célula animal de mamíferos, uma célula eucariótica menor tal como uma célula de levedura, ou uma célula procariótica tal como uma célula bacteriana. A construção pode ser introduzida numa célula hospedeira por transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lípido catiónico, electroporação, transducção, infecção, ou outros métodos. Estes métodos estão descritos numa variedade de manuais de laboratório padrão, tal como descrito em Sambrook et al. A construção numa célula hospedeira pode ser usada por um método convencional, e produz um produto genético codificado por uma sequência recombinante. Alternativamente, um polipéptido parcial codificado por um ADN da presente invenção pode ser sintetizado usando um sintetizador de péptidos geral. Uma proteína madura pode ser expressa sob o controlo de um promotor adequado numa célula animal mamífero, de levedura, bacteriana, ou outra célula. Também, tal proteína pode ser produzida num sistema de tradução livre de células com o uso de ARN derivado a partir doa construção de ADN da presente invenção. Os vectores de clonagem e expressão adequados para hospedeiros 20 procarióticos e eucarióticos estão descritos em Sambrook et al. (acima mencionado).

Geralmente, um vector de expressão recombinante compreende: uma origem de replicação; um promotor derivado a partir dum gene altamente expresso para orientar a transcrição duma sequência estrutural a jusante; e um marcador de selecção para trazer a célula para contactar com um vector e isolar a célula que contém o vector. Um promotor adequado pode ser induzido a partir dum gene que codifica enzimas glicoliticas tais como 3-fosfoglicerato cinase (PGK), α-factor, fosfatase ácida, e proteina de choque térmico. Um marcador de selecção inclui gene resistente à ampicilina de E. coli e gene trpl de 5. cerevisiae. A transcrição do ADN que codifica o polipéptido da presente invenção que usa uma célula eucariótica maior pode ser melhorada através da inserção duma sequência intensificadora num vector. O intensificador é geralmente um elemento de acção cis para o ADN para intensificar a actividade da transcrição do promotor na host célula hospedeira pré-determinada. Os exemplos de um intensificador incluem o intensificador SV40, o promotor/intensificador precoce de Cytomegalovirus, o intensificador polioma por trás da origem de replicação, o intensificador β-actina, e o intensificador de adenovirus. 0 polinucleótido da presente invenção que codifica uma sequência estrutural heteróloga do polipéptido da presente invenção é geralmente inserido num vector por técnicas padrão de um modo que é ligado de modo operável ao promotor de expressão. O sitio de iniciação de transcrição do polipéptido está localizado adequadamente no sitio 5' do sitio de ligação do ribossoma. O sitio de ligação do ribossoma é 5' relativo ao AUG que inicia a tradução dum polipéptido a ser expresso. Geralmente, um codão de iniciação começa a partir de AUG e outra grelha de leitura 21 aberta localizada entre o sítio de ligação do ribossoma e AUG de iniciação não está presente. 0 codão de terminação está geralmente presente no término do polipéptido, e o sinal de adenilação e o terminador estão adequadamente localizados na extremidade 3' da região de transcrição.

Com respeito à secreção da proteína traduzida no lúmen ER, no citoplasma, ou para o ambiente extracelular, um sinal de secreção adequado é incorporado no polipéptido expresso. 0 sinal pode ser endógeno ou heterólogo para o polipéptido.

Além disso, uma prosequência subsequente à da sequência de sinal pode ser endógena ou heteróloga (por exemplo, uma preprosequência de outra metaloprotease). 0 polipéptido é expresso numa forma modificada tal como uma proteína de fusão, e isto inclui não apenas um sinal de secreção mas também uma região funcional heteróloga adicional. Assim, uma região de aminoácidos adicional, especialmente uma região de aminoácidos carregada, ou similar, é adicionada ao polipéptido para melhorar a estabilidade e estabilidade de armazenamento na célula hospedeira durante a purificação ou subsequente operação e armazenamento. Alternativamente, uma dada região pode ser adicionada ao polipéptido para acelerar a purificação. Este tipo de região pode ser removida antes da preparação final dos polipéptidos. A indução da secreção ou excreção, melhoria da estabilidade, ou facilidade da purificação com a adição duma parte do péptido ao polipéptido é uma técnica comum e conhecida na arte.

Os exemplos de hospedeiros procarióticos que são adequados para multiplicação, manutenção, ou expressão do polinucleótido ou polipéptido codificado pelos ADN da presente invenção incluem E. coli, Bacillus subtilis, e Salmonella typhimurium. Vários tipos de Pseudomonas, Streptomyces, e Staphylococcus são hospedeiros adequados para este fim. Além disso, vários outros tipos de 22 hospedeiros conhecidos para os especialistas na arte também podem ser usados. Exemplos representativos de vectores de expressão que são úteis para aplicações bacterianas incluem a, mas não estão limitados a, origem de replicação de bactérias derivada de plasmídeos disponíveis comercialmente incluindo um marcador seleccionável e um elemento genético dum vector de clonagem conhecido pBR322 (ATCC 37017). Os exemplos de tais vectores comercialmente disponíveis incluem pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) e GEMI (Promega Biotec, Madison, Wisconsin, USA) . Estas secções pBR322 (cadeia principal) são combinados com um promotor adequado e sequências estruturais a serem expressas.

As células hospedeiras são adequadamente transformadas e multiplicadas até à concentração celular óptima. A partir daí, o promotor seleccionado é induzido através de meios adequados (por exemplo, a alteração da temperatura ou indutor químico), e as células são ainda postas em cultura. Tipicamente, as células são recolhidas por centrifugação e fracturadas por meios físicos ou químicos. 0 extrato em bruto resultante é ainda purificado. As células microbianas usadas para a expressão da proteína podem ser fracturadas por qualquer meio conveniente seleccionado a partir dum ciclo de congelação-descongelação, ultrasonicação, fractura mecânica, e o uso de um agente citolítico. Estes métodos são conhecidos pelos especialistas na arte. Várias linhas celulares para cultura de células animais de mamíferos também podem ser usadas para a expressão. Um exemplo duma linha celular para expressão em animais mamíferos inclui uma célula COS-6 de fibroblasto de rim de macaco descrita em Gluzman et al., Cell 23: 175 (1981) . Exemplos de outras células que são capazes de expressar os vectores comparáveis incluem células C127, 3T3, CHO, HeLa, rim humano 293, e BHK. Além disso, uma linha celular de mieloma flutuante tal como SP2/0 também 23 pode ser usada. Um vector de expressão animal de mamífero compreende uma origem de replicação, um promotor adequado e intensificador, um sítio de ligação do ribossoma necessário, um sítio de poliadenilação, locais de receptor e dador de junção, uma sequência de terminação de transcrição, e uma sequência não traduzida 5' franqueada necessária para expressão. As sequências de ADN derivadas do sítio de junção de SV40 e o sítio de poliadenilação SV40 são usadas para o elemento genético transcrito ou não transformado de interesse. Um exemplo disso é um vector de expressão CAG (H. Niwa et al., Gene, 108, 193-199 (1991)).

Com base na sequência genética da protease acima, uma sonda, primer, ou antisense são concebidos através de técnicas comuns. A técnica antisense pode ser usada para controlar a expressão do gene pelo uso of ADN ou ARN antisense ou a formação duma hélice tripla. Esta técnica está descrita em, por exemplo, Okano, J. Neurochem., 56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Raton, FL (1988) . A formação da hélice tripla é examinada em, por exemplo, Lee et al. , Nucleic Acids Research 6: 3073 (1979); Cooney et al. , Science 241: 456 (1988); e Dervan et al., Science 251: 1360 (1991) . 0 método é baseado na ligação do polinucleótido com o ADN ou ARN complementar. Isto permite o diagnóstico genético ou terapia genética.

Por exemplo, as células obtidas a partir de pacientes são sujeitas a engenharia genética ex vivo usando um polinucleótido tal como ADN ou ARN que codificam um polipéptido. As células resultantes são então fornecidas aos pacientes que devem ser tratados com polipéptidos. Por exemplo, as células podem ser sujeitas a engenharia genética ex vivo usando um vector de plasmídeo de retrovírus que compreende ARN que codificam o polipéptido da presente invenção. Tal técnica é conhecida na arte, e o seu uso na presente invenção é óbvio de acordo com a descrição aqui dada. Do mesmo modo, as células são sujeitas a engenharia genética in vivo de acordo com um processo convencional com respeito à expressão do polipéptido in vivo. Por exemplo, o polinucleótido da presente invenção é geneticamente modificado para expressão no vector de retrovirus de replicação deficiente como mencionado acima. Subsequentemente, a construção de expressão de retrovirus é isolada, introduzida numa célula de empacotamento, e traduzida usando um vector de plasmideo de retrovirus que compreende ARN que codifica o polipéptido da presente invenção. Assim, a célula de empacotamento produz partículas virais infecciosas com um gene de controlo. Estas células produtoras são sujeitas a engenharia genética in vitro e depois administradas a pacientes para permitir que os polipéptidos sejam expressos in vivo. Este método de administração e outros métodos para a administração de polipéptidos codificados por ADN de acordo com a presente invenção serão claramente evidentes para os especialistas na arte com base nos ensinamentos da presente invenção.

Exemplos de retrovirus acima mencionados, a partir dos quais o vector de plasmideo de retrovirus é derivado, incluem, mas não se limitam a, vírus da leucemia murina de Moloney, vírus da necrose do baço, vírus do sarcoma de Rous, vírus do sarcoma de Harvey, vírus da leucose aviária, vírus da leucemia do gibão, vírus da imunodeficiência humana, vírus do sarcoma mieloproliferativo, e vírus do tumor mamário. Este tipo de vector compreende um ou mais promotores para expressar polipéptidos. Exemplos de promotores adequados que podem ser usados incluem, mas não se limitam a, LTR retrovirus, promotor SV40, promotor CMV descritos em Miller et al., Biotechniques 7: 980-990 (1989), e outros promotores (por exemplo, promotores celulares tais como promotor de células eucarióticas que inclui, mas não está limitado a, histona, ARN polimerase III, e promotor β-actina). Exemplos de outros promotores 25 virais que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a, promotor de adenovirus, promotor da timidina cinase (TK), e promotor de Parvovirus B 19. Os especialistas na arte podem prontamente seleccionar um promotor adequado baseado nos ensinamentos da presente invenção.

Uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o polipéptido da presente invenção está sob o controlo dum promotor adequado. Exemplos de promotores adequados que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a, promotor de adenovirus tal como o promotor tardio principal de adenovirus, promotor heterólogo tal como o promotor de CMV, promotor de virus sincicial respiratório (RSV), promotor indutivel tal como o promotor de MMT ou promotor de metalotioneina, promotor de choque térmico, promotor da albumina, promotor de ApoAI, promotor da globina humana, promotor da timidina cinase virai tal como o promotor da timidina cinase do herpes simplex, LTR retrovirus incluindo o acima mencionado LTR retrovirus modificado, promotor de β-actina, e promotor da hormona de crescimento humana. Um promotor pode ser de um tipo nativo que controla o gene que codifica os polipéptidos. É usado um vector de plasmideo de retrovirus para traduzir a linha celular de empacotamento para formar uma linha celular produtora.

Exemplos de células de empacotamento a serem transfectadas incluem, mas não estão limitados a, linhas celulares de PE501, PA317, Y-2, Y-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, YCRE, YCRIP, GP+E-86, GP+envAml2, e a DAN descritas em Miller, Human Gene Therapy 1: pp. 5-14 (1990) . ser

Um vector é transduzido numa célula de empacotamento através de meios conhecidos na arte. Exemplos de tais meios incluem, mas não estão limitados a, electroporação, o uso de um lipossoma, e precipitação por CaP04. Alternativamente, um vector de plasmideo de retrovirus é selado num lipossoma ou ligado a um lipido a 26 administrado a um hospedeiro. Uma linha celular produtora produz partículas de vector de retrovírus infecciosas que compreende sequências de ácidos nucleicos que codificam polipéptidos. Tais partículas de vector de retrovírus são usadas para transduzir as células eucarióticas in vitro ou in vivo.

As células eucarióticas transduzidas expressam sequências de ácidos nucleicos que codificam polipéptidos. Exemplos de células eucarióticas que podem ser transduzidas incluem, mas não estão limitadas a, células estaminais germinais, células de carcinoma embrionário, células estaminais hematopoiéticas, células hepáticas, fibroblastos, sarcoblastos, queratinócitos, células endoteliais, e células epiteliais brônquicas. A protease codificada pelos ADN da presente invenção, um anticorpo contra esta protease, um antagonista desta protease, em inibidor, um agonista, um modificador da actividade, ou similares, podem ser diluídos com solução salina fisiológica, tampão, ou similar para preparar uma formulação. Assim, pode ser obtida uma composição farmacêutica. 0 valor de pH da formulação está preferivelmente entre ácida e neutra: próximo ao nível de pH dos fluidos corporais. 0 seu limite inferior está preferivelmente entre 5,0 e 6,4, e o limite superior está preferivelmente entre 6,4 e 7,4. Alternativamente, a formulação pode ser fornecida num estado que permite o armazenamento durante um longo período de tempo, por exemplo, num estado liofilizado. Em tal caso, a formulação pode ser usada para ser dissolvida em água, solução salina fisiológica, tampão, ou similar num nível de concentração desejado durante o tempo de uso. A formulação da presente invenção pode compreender um aditivo farmacologicamente aceitável, tal como um transportador, excipiente, ou diluente que seja normalmente usado em fármacos, um estabilizador, ou ingredientes 27 farmaceuticamente necessários. Exemplos dum estabilizador incluem monossacáridos tais como glucose, dissacáridos tais como sacarose e maltose, açúcares alcoólicos tal como manitol e sorbitol, sais neutros tais como cloreto de sódio, aminoácidos tais como glicina, surfactantes não iónicos tais como copolimeros de polietilenoglicol, polioxietileno e polioxipropileno (Pluronic), éster de polioxietileno sorbitano de ácido gordo (Tween), e albumina humana. A sua adição em quantidades de cerca de 1 a 10% m/v é preferida.

Uma quantidade eficaz da composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada, por exemplo, por injecção intravenosa, injecção intramascular, ou injecção hipodérmica numa ou em várias doses separadas. A dosagem varia dependendo dos sintomas, idade, peso corporal, ou outros factores, e é preferivelmente 0,001 mg a 100 mg por dose.

Além disso, o ADN sense ou antisense que codifica a protease da presente invenção pode ser preparado de modo semelhante numa formulação para obter uma composição farmacêutica. Para além disso, a presente invenção inclui métodos para inibir a formação do rolhão plaquetário envolvido com o enfarte cardíaco ou enfarte cerebral, métodos para inibir arteriosclerose, métodos para prevenir restenose, reembolização, ou enfarte envolvido com PTCA, métodos para prevenir a reembolização envolvida com PTCR, e métodos para prevenir formação do rolhão plaquetário causado por HUS ou 0-157 através da administração do ADN da presente invenção. Para além disso, a presente invenção inclui métodos para inibir a formação do rolhão plaquetário envolvido com o enfarte cardíaco ou enfarte cerebral, métodos para inibir arteriosclerose, métodos para prevenir restenose, reembolização, ou enfarte envolvido com PTCA, métodos para prevenir a reembolização envolvida com PTCR, e métodos para prevenir formação do rolhão plaquetário 28 causado por HUS ou 0-157 através da administração do ADN da presente invenção. 0 péptido ou proteína codificada pelos ADN da presente invenção são usados como uma substância condutora para modificação de aminoácidos. Isto permite a preparação duma molécula com actividade que é diferente daquela da protease codificada pelos ADN da presente invenção. Um seu exemplo é uma molécula variante que pode ser obtida por preparação de um antagonista, que é obtido por preparação duma variante desactivada através da substituição de aminoácidos entre um resíduo de aminoácido localizado em torno do centro activo no domínio da metaloprotease e outro aminoácido, que separa um sítio de reconhecimento da molécula a partir dum sítio catalítico, ou variando um ou os dois destes sítios. 0 uso de um sistema de avaliação para a actividade de clivagem para vWF aqui descrita permite a produção de um antagonista/agonista. Por exemplo, um antagonista eficaz pode ser uma molécula orgânica pequena, um péptido ou um polipéptido. Um seu exemplo é um anticorpo que está ligado ao polipéptido codificado pelos ADN da presente invenção, desse modo inibindo ou eliminando a sua actividade.

Do mesmo modo, o uso do sistema de avaliação acima mencionado para a actividade de clivagem para vWF permite a verificação para um composto que é capaz de clivar o vWF. Nesse caso, a actividade de clivagem do composto de teste pode ser avaliada usando o sistema de avaliação acima mencionado.

Descrição Resumida das Figuras

Fig. 1 é um diagrama que mostra a estrutura do multimero de vWF e o ponto clivado pela protease de clivagem para vWF. Fig. 2 é uma fotografia que mostra o resultado da análise do multimero vWF (electroforese em agarose).

Fig. 3 é uma fotografia que mostra o resultado de SDS-PAGE 29 (gel 5%) para analisar a actividade de clivagem de vWF de cada fracção de plasma sob condições de redução.

Fig. 4 é uma fotografia que mostra o resultado de SDS-PAGE (gel 5%) para analisar a amostra solubilizada da pasta da fracção 1 sob condições não redutoras.

Fig. 5 é uma fotografia que mostra o resultado da análise das fracções da protease de clivagem para vWF após terem sido sujeitas a cromatografia de filtração por gel por três vezes usando a amostra solubilizada da pasta F1 como material de partida; Fig. 5A é um espectro que mostra a cromatografia de filtração por gel; Fig. 5B mostra o resultado de SDS-PAGE em fracções sob condições não redutoras; e Fig. 5C mostra os resultados de SDS-PAGE na actividade de clivagem para vWF sob condições de redução. Fig. 6 é uma fotografia que mostra os resultados da análise das fracções da protease de clivagem para vWF em que a fracção recolhida por cromatografia de filtração por gel é purificado por cromatografia de troca aniónica DEAE; Fig. 6A é um espectro que cromatograf ia de filtração por gel; Fig. 6B mostra o resultado de SDS-PAGE (gel 8%) em fracções de eluição sob condições não redutoras; e Fig. 6C mostra os resultados de SDS-PAGE na actividade de clivagem de vWF sob condições de redução. Na Fig. 6C, três bandas indicam uma molécula de vWF intacta (que permanece não clivada), um fragmento de clivagem de vWF, e um fragmento de clivagem de vWF, respectivamente, como na Fig. 5C.

Fig. 7 é uma fotografia que mostra um fragmento de electroforese obtido quando a fracção da protease de clivagem para vWF purificada e concentrada por cromatografia de troca aniónica DEAE é ainda purificada por Bioforese com base em SDSPAGE (condições não redutoras). Fig. 8 é uma fotografia que mostra o resultado da electroforese numa fracção obtida por outra purificação da fracção da protease de clivagem para vWF por Bioforese com base em SDSPAGE para analisar a actividade da protease de 30 clivagem para vWF e SDS-PAGE em fracções activas sob condições redutoras; Fig. 8A mostra os resultados de SDS-PAGE para analisar a actividade da protease de clivagem de vWF sob condições não redutoras; e Fig. 8B mostra os resultados de SDS-PAGE para analisar as fracções activas sob condições redutoras.

Fig. 9 refere-se à identificação do gene da protease de clivagem de vWF, que é um diagrama que mostra os primers usados para amplificar o fragmento do gene para uma sonda de Northern blot.

Fig. 10 refere-se à identificação do gene da protease de clivagem de vWF, que é uma fotografia que mostra a autoradiografia de Northern blot; Fig. 10A mostra os resultados obtidos quando o gene que codifica a protease é usado como uma sonda; e Fig. 10B mostra os resultados obtidos quando uma sonda de β-actina (controlo de ARN) é usada.

Fig. 11 refere-se à identificação do gene da protease de clivagem de vWF, e é um diagrama que mostra as localizações e as sequências dos primers usados nas experiências RACE. Fig. 12 é um diagrama que mostra as localizações dos primers designados para clonar o cADN de comprimento total. Fig. 13 é um diagrama que mostra um processo para a construção de um vector que contém o cADN de comprimento total.

Fig. 14 é uma fotografia que mostra a expressão em várias linhas celulares (Western blotting sob condições redutoras usando o anticorpo anti-FLAG, onde o mock é preparado por inserção inversa dum gene num vector de expressão). Na Fig. 14, cada pista mostra os resultados usando a amostra indicada.

Pista 1: Mock (hospedeiro: Célula 293)

Pista 2: protease de clivagem de vWF, cDNA+FLAG (hospedeiro: Célula 293) 31

Pista 3: Mock (hospedeiro: Célula HepG2)

Pista 4: protease de clivagem de vWF, cDNA+FLAG (hospedeiro: Célula HepG2)

Pista 5: Mock (hospedeiro: Célula Hela)

Pista 6: protease de clivagem de vWF, cDNA+FLAG (hospedeiro: Célula Hela)

Fig. 15 é uma fotografia que mostra o ensaio de actividade da expressão recombinante da protease (análise da clivagem de vWF por SDS-PAGE sob condições não redutoras, onde o mock é preparado por inserção inversa dum gene num vector de expressão). Na Fig. 15, cada pista mostra os resultados usando a amostra indicada.

Pista 1: Mock (hospedeiro: Célula Hela) Pista 2: Sobrenadante onde a protease de vWF foi expressa (hospedeiro: Célula Hela) Pista 3: Mock (hospedeiro: Célula HepG2) Pista 4: Sobrenadante onde a protease de vWF foi expressa (hospedeiro: Célula HepG2) Pista 5: Mock (hospedeiro: Célula 293) Pista 6 : Sobrenadante onde a protease de vWF foi expressa (hospedeiro: Célula 293) Pista 7: Mock (hospedeiro: Célula BHK) Pista 8: Sobrenadante onde a protease de vWF foi expressa (hospedeiro: Célula BHK) Pista 9: Mock (hospedeiro: Célula COS) Pista 10: Sobrenadante onde a protease de vWF foi expressa (hospedeiro: Célula COS) Pista 11: Mock (hospedeiro: Célula CHO) Pista 12: Sobrenadante onde a protease de vWF foi expressa (hospedeiro: Célula CHO) clivagem de clivagem de clivagem de clivagem de clivagem de clivagem de

Fig. 16 é uma fotografia que mostra o resultado de Western blotting que usa um anticorpo instituído contra a protease 32 codificada pelo ADN da presente invenção, em que o Western blotting é realizado para vários antisoros usando a célula 293 como um hospedeiro e uma protease de clivagem de vWF recombinante. Na Fig. 16, cada pista mostra os resultados obtidos com o uso da amostra indicada.

Pista 1: antisoro de ratinho (preparado por administração de proteína purificada)

Pista 2: antisoro de coelho (preparado por administração hipodérmica dum vector de expressão a um coelho)

Pista 3: Antisoro de coelho não tratado

Pista 4: Antisoro de Coelho (preparado por administração do péptido sintético parcial conjugado KLH)

Fig. 17 é uma fotografia que mostra o resultado do Western blotting que usa um anticorpo instituído contra a protease codificada pelos ADN da presente invenção, em que várias amostras derivadas de plasma humano e unidades de expressão recombinante são detectadas usando antisoro de coelho obtido pela administração de cADN de comprimento total da protease de clivagem de vWF. Na Fig. 17, cada pista mostra os resultados obtidos com o uso da amostra indicada.

Pista 1: Amostra parcialmente purificada derivada de plasma humano crioprecipitado

Pista 2: Protease de clivagem de vWF purificada derivada de plasma humano

Pista 3: Amostra de pasta FI filtrada por gel obtida a partir de mistura de plasmas humanos

Pista 4: Protease (hospedeiro: Célula 293) de clivagem de vWF recombinante Pista 5: Protease de clivagem de vWF recombinante (hospedeiro: Célula Hela) 33

Fig. 18 é uma fotografia que mostra o resultado do Western blotting que usa um anticorpo instituído contra a protease codificada pelos ADN da presente invenção, em que o antisoro de coelho obtido por imunização de um coelho com um péptido parcialmente sintesizado da protease de clivagem de vWF é usado para confirmar a protease de clivagem de vWF no plasma humano saudável e que está no plasma e protease de clivagem de vWF do gene recombinante de um paciente com TTP. Na Fig. 18, cada pista mostra os resultados obtidos com o uso da amostra indicada.

Pista 1: Amostra de pasta FI filtrada por gel obtida a partir de mistura de plasmas humanos Pista 2: Plasma humano normal 1 Pista 3: Plasma humano normal 2 Pista 4: Plasma humano normal 3 Pista 5: plasma de paciente com TTP 1 Pista 6: plasma de paciente com TTP 2

Pista 7: Protease de clivagem de vWF recombinante (hospedeiro: Célula 293) Pista 8: Protease de clivagem de vWF recombinante (hospedeiro: Célula Hela)

Fig. 19 é um diagrama que mostra o resultado de ELISA que usa um anticorpo preparado contra a protease de clivagem de vWF .

Fig. 20 é uma fotografia que mostra o resultado de SDS-PAGE (cloração de prata) para analisar cada fracção de afinidade da actividade da protease de clivagem de vWF purificada usando um anticorpo sob condições de redução. Na Fig. 20, cada pista mostra os resultados obtidos com o uso da amostra indicada.

Pista 1: Sobrenadante da cultura aplicado (diluído 10 vezes) 34

Pista 2: Fracção passada Pista 3: Fracção lavada Pista 4: Fracção de eluição

Fig. 21 é uma fotografia que mostra os resultados da avaliação da actividade de neutralização que usa um anticorpo (SDS-PAGE para analisar a actividade de clivagem de vWF sob condições não redutora). Na Fig. 21, cada pista mostra os resultados obtidos com o uso da amostra indicada.

Pista 1: solução da protease de clivagem de vWF: soro de coelho normal =1:1

Pista 2: solução da protease de clivagem de vWF: soro de coelho normal (diluído 5 vezes) =1:1

Pista 3: solução da protease de clivagem de vWF: péptido de soro de coelho imunizado =1:1

Pista 4: solução da protease de clivagem de vWF: péptido de soro de coelho imunizado (diluído 5 vezes) =1:1 Pista 5: solução da protease de clivagem de vWF: proteína recombinante de soro de coelho imunizado =1:1

Pista 6: solução da protease de clivagem de vWF: proteína recombinante de soro de coelho imunizado (diluído 5 vezes) =1:1

Pista 7: solução da protease de clivagem de vWF: EDTA lOmM =1:1

Pista 8: solução da protease de clivagem de vWF: apenas tampão = 1:1

Pista 9: tampão (sem protease de clivagem de vWF) : tampão = 1:1

Fig. 22 é um diagrama que mostra a construção de um vector expressão para espécies moleculares sem um domínio C-terminal. A presente invenção é descrita adiante em detalhe com 35 referência aos seguintes exemplos, embora nao esteja limitada a estes exemplos.

Exemplo 1 (Preparaçao de vWF)

Dissolveu-se uma crioprecipitação de plasma (2 g) em 20 ml de tampão (0,01% Tween-80/50 mM Tris-HCl/ NaCl 100 mM, pH 7,4), e o resultante foi submetido a uma filtração por gel usando uma coluna de Sephacryl S-500 HR (2,6 x 90 cm, Amersham Pharmacia) para preparar vWF. As fracções foram recuperadas a uma taxa de fluxo de 2 ml/min em quantidades de 6 ml cada. vWF foi analizado por Western blotting usando um anticorpo anti-vWF humano de coelho marcado com peroxidase (DAKO) , e as fracções de vWF com peso molecular elevado foram misturadas. As fracções misturadas foram sujeitas a análise de multimeros usando electroforese de agarose tal como descrito abaixo.

Como se mostra na Fig. 1, originalmente o vWF tem uma estrutura de multimero na qual as moléculas do monómero de vWF são polimerizadas umas com as outras nas suas extremidades N-terminais ou nas suas extremidades C-terminais, e vWF é submetido a uma hidrólise parcial pela protease especifica de clivagem para vWF. Como resultado da análise, como se mostra na Fig. 2, o vWF purificado exibiu um padrão de multimero baseado na electroforese de agarose aproximadamente equivalente ao do plasma de uma pessoa saudável (a escada no desenho mostra o padrão de electrof orese de vWF com uma estrutura em multimero e a parte superior indica vWF com polimerização avançada). Assim pode preparar-se vWF substancialmente livre de impurezas que o degradem e esta fracção foi usada como substrato no teste de actividade de clivagem de vWF tal como se descreve abaixo. 36

Exemplo 2 (reacçao de clivagem de vWF) A actividade de clivagem de vWF foi testada como se segue. Uma amostra que compreende cloreto de bário 10 mM (concentração final) foi pré-incubada a 37°C durante 5 minutos para activar a protease. Um tampão (15 a 20 ml, ureia 1,5 M / Tris-HCl 5 mM, pH 8,0) foi colocado num tubo Falcon de 50 ml. Subsequentemente, fez-se flutuar ai dentro um filtro de membrana (0,025 μπι, Millipore) , e adicionou-se 100 μΐ da amostra activada, preparados por mistura com 50 μΐ da solução de substrato de vWF. Deixou-se repousar o produto resultante numa incubadora (37°C) durante a noite e foi recuperado no dia seguinte a partir do filtro. A amostra recuperada foi avaliada com base no padrão de clivagem de vWF tal como se descreve abaixo na secção "SDS-PAGE".

SDS-PAGE

Preparou-se autologamente e foi utilizado um gel de poliacrilamida SDS a 5%. Adicionou-se um tampão de electrof orese SDS (2 μΐ, na presença ou ausência de um agente redutor, i.e., 2-mercaptoetanol) a 10 μΐ da amostra descrita na secção "teste de actividade de clivagem de vWF", e o resultante foi levado à ebulição por 3 minutos para preparar uma amostra de electrof orese. O gel foi submetido a electrof orese a 30 mA durante 1 hora e depois corado com Gel Code Blue Stain Reagent (PIERCE) utilizando o corante CBB. Como se mostra na Fig. 1, a actividade é avaliada com base no desenvolvimento de um fragmento de clivagem e na presença ou ausência de fragmentos não clivados em condições redutoras ou não redutoras. Tal é 37 descrito mais especif icamente no Exemplo 3 e na Fig. 3 abaixo.

Análise de multimero usando electroforese de agarose Preparação do gel, electroforese

Adicionou-se agarose de baixa temperatura de gelificação (Tipo VII, Sigma) a Tris-HCl 375 mM (pH 6,8) até se atingir uma concentração de 1,4%, seguido de aquecimento num microondas para dissolver completamente o gel. Seguidamente, adicionou-se SDS a 0,1% e manteve-se o produto resultante a 56 °C. Fez-se passar o produto resultante para um molde de gel e solidificou por arrefecimento a 4 °C durante a noite (gel de passagem). No dia seguinte, misturou-se agarose de temperatura de gelificação elevada (SeaKem) com Tris-HCl 375 mM (pH 6,8) até atingir uma concentração de 0,8% e dissolveu-se levando à ebulição num microondas. Seguidamente, o produto resultante foi mantido a 56 °C (gel de coluna) . O gel preparado no dia anterior foi cortado, deixando uma fracção de 10 cm a partir da extremidade não cortada. Deitou-se o gel acima mencionado sobre a parte cortada e manteve-se o fluxo a 4 °C durante pelo menos 3 horas, seguido de solidificação. Adicionou-se Pironina Y à amostra descrita na secção "teste de actividade de clivagem de vWF" acima, e o gel foi preparado em condições não redutoras sem entrar em ebulição. 0 gel foi submetido a electrof orese a 10 mA durante pelo menos 24 horas usando um tampão SDS-PAGE.

Western blotting

Depois da electroforese, o gel foi imerso num tampão de transcrição (SDS a 0,005%, tampão fosfato 50 mM, pH 7,4) durante 10 minutos, e transferiu-se o produto resultante 38 para uma membrana de nitrocelulose usando um dispositivo de transcrição a 4°C e a 0,5 A, durante a noite. Levou-se a cabo o bloqueio usando uma solução de blotting (leite magro a 5%, PBS) durante 30 minutos, e deixou-se então o gel reagir durante pelo menos 6 horas com o anticorpo anti-vWF humano de coelho marcado com peroxidase (DAKO), o qual foi diluído 1000 vezes com a solução de blotting. Seguidamente, lavou-se três vezes o gel com a solução de blotting e uma vez com PBS, e desenvolveu-se a cor usando o Konica Immunostain HRP-1000 (Konica), que consistiu numa reacção da solução do substrato com a peroxidase. Verificou-se que o vWF purificado analisado neste teste não se encontrava degradado, mas era suficientemente utilizável como substrato na presente invenção (Fig. 2).

Exemplo 3 (Preparaçao da protease de clivagem de vWF)

Submeteu-se o plasma ao fraccionamento por etanol desenvolvido por Cohn. Selecionou-se uma protease com alta actividade de clivagem para vWF (uma com elevada actividade específica) quando os níveis de proteína em quatro fracções (i.e. plasma inicial, crioprecipitado, sobrenadante da fracção I (FI) e uma pasta) foram tornados equivalentes uns dos outros. Como se mostra na Fig. 3, a actividade da protease era maior na pasta FI. A sequência da extremidade N-terminal deste fragmento de clivagem foi analisada e verificou-se que a actividade derivada do crioprecipitado e da pasta de FI clivavam a ligação peptídica entre os resíduos Tir 842 e Met 843. Assim, determinou-se que a pasta FI seria o material de partida principal para a purificação subsequente.

Solubilização da pasta FI 39 A pasta FI foi fraccionada em fracções de 12 g cada e depois criopreservada. Deixou-se a pasta derreter a 4 °C no dia anterior à sua utilização. No dia seguinte, adicionaram-se 120 ml de tampão de solubilização (azida a 0,05%, Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 100 mM) a 10 mg/ml, e a mistura foi agitada a 37°C durante 2 horas. O produto foi centrifugado a 10000 rpm por 10 minutos, e o sobrenadante foi então recuperado, seguindo-se uma filtração com um pré-filtro, com um filtro 5,0 μιιι e um filtro 0,8 |lm, pela ordem indicada. Determinou-se que o resultante era uma amostra solubilizada. A fig. 4 mostra o resultado do SDS-PAGE da amostra solubilizada.

Filtração por cromatografia de gel da protease de clivagem de vWF A pasta F1 solubilizada foi aplicada a uma coluna de Sephacryl S-300 HR (5 x 90 cm, Amersham Pharmacia) para levar a cabo uma primeira filtração por gel. Utilizou-se um tampão que compreende azida a 0,05%, Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), e NaCl 100 mM (daqui em diante referido por "tampão de eluição"), que era o mesmo que o tampão de solubilização. A taxa de fluxo foi de 5 ml/min, sendo iniciado o fraccionamento 600 ml depois da introdução da amostra, e recolheram-se fracções de 10 ml cada. As fracções foram submetidas à reacção de clivagem de vWF, e as suas actividades foram então analisadas por SDS-PAGE. As fracções que exibiram actividade da protease foram misturadas e adicionou-se gradualmente uma pequena quantidade de sulfato de amónio saturado gota-a-gota até que se atingisse uma concentração final de 33% de saturação. Adicionalmente, deixou-se a mistura repousar a 4 °C durante a noite. No dia seguinte, o produto foi centrifugado a 10000 rpm durante 10 minutos, e a fracção 40 activa de interesse foi recolhida sob a forma de precipitado. Os procedimentos que compreendem solubilização, filtração por gel e precipitação por sulfato de amónio foram levados a cabo em 5 lotes e o produto resultante foi criopreservado a -20 °C.

Os precipitados de sulfato de amónio (2 a 3 lotes) obtidos pela primeira filtração por gel foram dissolvidos em 50 ml de tampão de eluição e passados pela coluna de Sephacryl S-300 HR (5 x 90 cm) da mesma maneira que na primeira filtração por gel para levar a cabo a segunda filtração por gel. O tampão de eluição, condições, operações, e similares foram os mesmo que os da primeira filtração por gel. As fracções foram submetidas à reacção de clivagem de vWF, e as suas actividades foram então analisadas por SDS-PAGE. As fracções com actividade foram misturadas e foi igualmente levada a cabo uma precipitação por sulfato de amónio. Estes procedimentos foram repetidos duas vezes.

Os precipitados de sulfato de amónio (2 lotes) obtidos pela segunda filtração por gel foram dissolvidos em 50 ml de tampão de eluição e passados pela coluna de Sephacryl S-300 HR (5 x 90 cm) da mesma maneira que na primeira e segunda filtração por gel para levar a cabo a terceira filtração por gel. O tampão de eluição, condições, operações, e similares foram os mesmo que os da primeira e segunda filtração por gel. As fracções foram submetidas à reacção de clivagem de vWF, e as suas actividades foram então analisadas por SDS-PAGE, seguido de mistura. A Fig. 5 mostra SDS-PAGE para analisar estas fracções e para análise da actividade de clivagem de vWF. Baseados nos padrões da filtração por gel e nos dados que mostram actividade, verificou-se que a protease da presente invenção foi eluida na região entre as fracções 37 e a 47. Baseado numa experiência independente de eluição conduzida separadamente, para um marcador de filtração por gel para 41 pesos moleculares elevados (Amersham Pharmacia), deduziu-se que este sítio de eluição tem um peso molecular equivalente a 150 a 300 kDa. Nesta fase, estavam presentes quantidades significativas de impurezas.

Cromatografia de permuta aniónica DEAE A fracção misturada obtida por três operações de filtração por gel foi submetida a diálise durante a noite com um tampão que compreende Tris-HCl 50 mM e NaCl 50 mM (pH 7,1). Depois da diálise, foi levada a cabo uma cromatografia de permuta aniónica usando uma coluna de fluxo rápido de 5 ml HiTrap DEAE-Sepharose (Pharmacia) para proceder a uma purificação e concentração adicionais. 0 equilíbrio e a lavagem foram levados a cabo usando um tampão compreendendo Tris-HCl 50 mM (pH 7,1), e a eluição foi levada a cabo usando NaCl 0,25 Μ. A taxa de fluxo foi de 5 ml/min, e recuperaram-se 5 fracções de 5 ml cada e misturadas. A Fig. 6 mostra os resultados da SDS-PAGE para a análise das fracções de eluição e para a análise da actividade de clivagem de vWF. Baseados na SDS PAGE para o teste de actividade, a protease codificada pelos ADN da presente invenção, com actividade de clivagem de vWF, foi considerável e efectivamente concentrada na fracção de eluição.

Fraccionamento utilizando SDS-PAGE A amostra (5 ml) purificada e concentrada por cromatografia de permuta aniónica DEAE foi ainda mais concentrada até 0,5 ml usando Centricon (corte de peso molecular: 10000 Da, Amicon). A protease codificada pelos ADN da presente invenção foi isolada por Bioforese III (Atto Corporation) utilizando SDS-PAGE. De acordo com o método de Laemmli (Nature, vol. 227, 680-685, 1970), foi 42 preparado um tampão para tanques de electroforese, e desenvolvido com gel de poliacrilamida 8% para recuperar a fracção de electroforese. A Fig. 7 mostra o resultado da SDS-PAGE para a análise das fracções recuperadas. 0 tampão usado para recuperação compreendeu Tris-HCl 50 mM e glicerol a 10% (pH 8,8) . Tal como é evidente na Fig. 7, este processo tem uma capacidade elevada para produzir a separação. A Fig. 8 mostra os resultados para a análise de actividade de uma fracção purificada adicionalmente por electroforese e os resultados da SDS-PAGE para a análise das fracções activas. A protease codificada pelo ADN da presente invenção pode ser recuperada como uma molécula activa mesmo após a SDS-PAGE. Quando a actividade desta protease no plasma é determinada como sendo 1 em termos de actividade especifica, deduziu-se que se atingiu um grau de purificação de 30000 a 100000 vezes baseado no teor médio em proteína no plasma (60 mg/ml).

Exemplo 4 (Sequenciaçao parcial de aminoácidos)

Determinou-se a sequência parcial de aminoácidos da protease isolada. Esta protease, a qual foi isolada utilizando Bioforese, foi transferida para uma membrana PVDF após SDS-PAGE por uma técnica convencional, secagem por ar, e foi então submetida a análise, utilizando o sequenciador de proteínas automático (modelo 492; PE Applied Biosystems). O resultado revelou que a protease de clivagem de vWF codificada pelos ADN da presente invenção, isolada nas condições acima, compreende uma cadeia polipépt idica com um peso molecular de 105 a 160 kDa em SDS-PAGE sob condições redutoras. Também se verificou que esta protease tem, como sequência parcial, Leu-Leu-Val-Ala-Val, e preferencialmente Ala-Ala-Gli-Gli-Ile-Leu-His-Leu- 43

Glu-Leu-Leu-Val-Ala-Val.

Dedução da protease isolada utilizando a bioinformática

Presentemente, a bioinformática permite a dedução de sequências completas de nucleótidos que codificam para um polipéptido sem que seja necessário uma clonagem de genes significativa, através da junção com a informação passada acumulada na base de dados (BIOINFORMATICS: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, edited by Andreas D. Baxevanis and B. F. Francis Ouellette). Baseado na sequenciação parcial de aminoácidos pelo processo acima mencionado, (Ala-Ala-Gly-Gly-Ile-Leu-His-Leu-Glu-Leu-Leu-Val-Ala-Val), pesquisou-se a base de dados com o programa tblastn. Como resultado, identificou-se um clone de cromossoma (AL158826) que se deduziu codificar para a protease da presente invenção por pesquisa na base de dados genómica. Adicionalmente, foram identificados uma parte da protease de interesse como a marca da sequência expressa (EST) e um clone que se deduziu fazer parte do polipéptido codificado pelo genoma acima mencionado (AI346761 e AJ011374). A sequência de aminoácidos, tal como mostrada na SEQ ID NO: 3 ou 7 foi deduzida com base no facto de ser um sitio da protease activo para a clivagem de vWF.

Exemplo 5 (Identificação do gene) A síntese de todos os primers sintéticos seguintes foi levada a cabo por Greiner Japan Co.Ltd. a pedido. Adicionalmente, os reagentes utilizados para a recombinação do gene foram fabricados por TAKARA, TOYOBO, e New England Biolabs, a não ser que especificado de outra forma. 44

Preparação de um fragmento de um gene como uma sonda de Northern blotting

Prepararam-se um impressor sense (Sense printer) (SEQ ID NO: 9) e um primer antisense (SEQ ID NO: 10). Levou-se a cabo PCR usando cADN Universal QUICK-Clone™ (Clontech) , o qual era uma mistura de cADN derivado do tecido humano normal, como modelo e TaKaRa LA Taq com tampão rico em GC. Um gene intercalado entre estes dois primers foi amplificado e o fragmento amplificado foi clonado usando um kit de clonagem TOPO TA™ (Invitrogen) . Os ADN contendo a sequência de nucleótidos como se mostra na SEQ ID NO: b foram isolados a partir de vários clones.

Removeu-se uma porção de um vector deste ADN clonado por digestão com EcoRI, e foi separada e purificada por electroforese de agarose, tendo-se verificado que o produto resultante era um modelo para a preparação de sondas para Northern blotting.

Northern blotting O fragmento de gene preparado acima foi usado como modelo para preparar uma sonda radioactiva usando [α- P] dCTP (Amersham Pharmacia) e um kit de marcação

BcaBEST™(TAKARA). A hibridação foi levada a cabo usando o filtro de Northern Blots de tecidos humanos múltiplos de 12 pistas™ (Clontech) de acordo com o método descrito em Molecular Cloning 2nd Edition, pp. 9.52-9.55. A detecção foi feita por autoradiografia. Como se mostra na Fig. 10, o mARN codificando para a protease foi expresso principalmente no fígado. Determinou-se que o tamanho deste mARN era superior a 4.4kb.

Isolamento e identificação do gene que codifica a protease 45

Como resultado do Northern blotting, verificou-se que 0 mARN era expresso principalmente no fígado. Assim, o gene da protease da presente invenção foi isolado e identificado de acordo com a técnica RACE usando ARN poly A+ derivado de fígado humano normal e cADN Marathon-Ready™ (Clontech).

Mais especificamente, o primeiro PCR foi levado a cabo como RACE 5' usando cADN Marathon-Ready™ derivado de fígado humano normal em concordância com o manual do produto e usando a sequência do primer AP-1 ligada ao kit e aos primers antisense (SEQ ID NOs: 11 a 13), seleccionados arbitrariamente a partir do grupo de primers específicos para genes (GSP - Gene Specific Primers) excluindo o primer 1 localizado na extremidade mais elevada, como se mostra na Fig. 11. Efectuou-se então um PCR Nested (o segundo PCR) usando o primer AP-2 localizado no seu interior e o primer antisense localizado no interior do primário usado para o primeiro PCR, como se mostra na Fig. 11. Seguidamente, fez-se uma clonagem TA. Os genes foram preparados a partir das colónias que se desenvolveram segundo uma técnica convencional (Molecular Cloning 2nd Edition, pp. 1.25-1.28), e as sequências de ácido nucleico foram descodificadas usando um sequenciador automático de ADN. 0 primer usado na sequenciação foi o primer utilizado no PCR ou um primer localizado no seu interior. Adicionalmente, o primer foi concebido com base na sequência determinada após a descodificação em série.

Iniciou-se a RACE 3’ a partir de ARN poly A+ derivado do figado humano normal usando o conjunto do núcleo complete de RACE 3' (TAKARA), e a transcrição reversa foi levada a cabo em concordância com o manual anexo, usando o primer oligo dT. A banda amplificada por PCR usando o primer sense (SEQ ID NO:14) localizado em "primer 2" na Fig. 11 e o primer dT oligo e o primer anexo foram separados por electroforese de agarose e extraídos, seguido de clonagem TA. Os genes foram preparados a partir das 46 colonias desenvolvidas, e as sequências de ácidos nucleicos foram descodificadas usando um sequenciador de ADN automático. Foi concebido um primer usado para a sequenciação com base na sequência determinada após a descodificação em série.

Exemplo 6 (Preparação de um vector que compreende cADN 1 de comprimento total) 0 cADN que codifica a proteína foi sujeito PCR de um estágio através de, por exemplo, o uso dum primer sense 1 (SEQ ID NO: 22) que compreende um local de restrição Xhol e um codão de iniciação e um primer antisense 2 (SEQ ID NO: 23) que compreende um local de restrição Sall e um codão de terminação (consultar a Fig. 12), usando o acima mencionado cADN Marathon-Ready™ derivado de fígado humano normal como modelo e TaKaRa LA Taq com tampão rico em GC, seguida pela acima mencionada clonagem TA. A partir daí, o comprimento completo do produto foi confirmado usando um sequenciador de ADN automático.

Exemplo 7 (Preparação de um vector que compreende cADN 2 de comprimento total)

Foram encontrados os locais de restrição Accl e Avrll que clivam o cADN apenas num o ponto da sequência interna de cADN (SEQ ID NO: 15) que codifica a proteína. Com o seu uso, o cADN de comprimento completo foi dividido em três fragmentos como mostrado na Fig. 12. Um fragmento 1 intercalado entre o primer sense 1 (SEQ ID NO: 22) e o primer antisense 3 (SEQ ID NO: 24), um fragmento 2 47 intercalado entre o primer sense 4 (SEQ ID NO: 25) e o primer antisense 5 (SEQ ID NO: 26) , e um fragmento 3 intercalado entre o primer sense 6 (SEQ ID NO: 27) e o primer antisense 2 (SEQ ID NO: 23) foram fornecidos, respectivamente, em cada um dos três fragmentos acima. Cada fragmento foi sujeito a PCR usando o acima mencionado cADN Marathon-Ready™ derivado de figado humano normal como modelo e TaKaRa LA Taq com tampão rico em GC, seguida pela acima mencionada clonagem TA. 0 comprimento completo do produto foi confirmado usando um sequenciador de ADN automático. Adicionalmente, o vector pCR 2.1 incluído no acima mencionado kit de clonagem TA foi sujeito a auto-ligação, o produto de ligação foi clivado com Xhol/HindIII, ligado a um linker (fragmento de ligação) que compreende Xhol/AccI/AvrIl/HindIII (preparado por cosimento do ADN sintético como mostra a SEQ ID NO: 28 ou 29), e os acima mencionados três fragmentos foram sequencialmente ligados duma maneira convencional que os ligue. Assim, foi preparado o cADN que compreende região inteira (consultar a Fig. 13).

Exemplo 8 (Preparação de um vector de expressão que compreende cADN de comprimento total: um hospedeiro de célula animal) 0 ADN obtido no Exemplo 6 ou 7 foi digerido com as enzimas de restrição Xhol/Sall, ligado a, por exemplo, o local Sall no vector pCAG (Niwa, H. et al. , Gene, vol. 108,193-199), e a direcção da inserção e a sequência de comprimento completo foram confirmados usando um sequenciador de ADN automático.

Exemplo 9 48 (Transfecção de um vector de expressão que compreende cADN de comprimento completo numa célula animal) 0 vector de expressão de célula animal preparado no Example 8 foi transfectado na seguinte maneira usando a célula 293 (linha celular de rim embrionário humano), a célula Hela, e a célula HepG2. Inicialmente, as células foram disseminadas de 1 a 3 x 105 células por disco de 35 mm 24 horas antes da transfecção. No dia seguinte, foram adicionados 2 μΐ de reagente de transfecção de poliamina, TransIT (TAKARA), por μρ do vector de expressão, a 100 μΐ de um meio livre de soro tal como Opti-MEM para preparar um complexo com ADN de acordo com as instruções incluídas com o reagente. A partir daí, o complexo foi adicionado gota-a-gota aos vários tipos de células preparadas previamente, e os resultantes foram incubados durante 2 a 8 horas, seguido por troca de meio. 0 meio foi ainda trocado três dias mais tarde com o meio selectivo ao qual foi adicionado G418. A partir daí, o meio foi trocado a cada três dias para produzir uma estirpe expressa estavelmente. Um seu exemplo é mostrado na Fig. 14 como uma estirpe temporariamente expressa que compreende um epítopo FLAG tag na sua extremidade C-terminal. A detecção foi realizada por Western blotting usando o anticorpo anti-FLAG-M2 (Kodack) e corada com sistema de anticorpo anti-Ig de ratinho marcado com fosfatase alcalina. A estirpe recombinante expressa usando cADN como mostrado neste exemplo exibiu um tamanho molecular de cerca de 250 kDa sob condições redutoras. Este tamanho molecular também foi encontrado no plasma dum humano saudável (Fig. 18, Exemplo 14 abaixo). Foram encontradas várias espécies moleculares diferentes desta protease como estando presentes no plasma humano, o que pode ser causado pela presença de produtos de junção alternativos (SEQ ID NOs: 6 a 21) observados no momento da clonagem do gene, diferença na modificação pós-tradução tal 49 como adição de cadeia de açúcar, ou degradação durante a purificação (descrita no Exemplo 14 e na Fig. 17 da presente invenção e Gerritsen et al., Blood, vol. 98, 1654-1661 (2001)) .

Subsequentemente, a actividade de clivagem de vWF da estirpe recombinante foi confirmada pelo método descrito no Exemplo 2 (Fig. 15) . Como resultado, descobriu-se que a protease derivada de plasma humano e o produto do gene recombinante codificado pelos ADN da presente invenção apresentam as mesmas actividades de clivagem de vWF.

Exemplo 10 (Preparação de um vector de expressão que compreende cADN parcial: um hospedeiro de E. coli) O cADN parcial que codifica o domínio da metaloprotease da proteína foi sujeito a PCR usando um primer sense que compreende um local de restrição Ncol e um codão de iniciação (SEQ ID NO: 30) e um primer antisense que compreende um local de restrição HindIII e um codão de terminação (SEQ ID NO: 31), o acima mencionado cADN Marathon-Ready™ derivado de fígado humano normal ou o cADN obtido no Exemplo 6 ou 7 como modelo, e o TaKaRa LA Taq com tampão rico em GC. O produto de PCR foi então digerido com NcoI/HindIII, ligado ao NcoI/HindIII digerido de um vector de expressão de E. coli tal como pUTl (Soejima et al. , J. Biochem. Tokyo, vol. 130, 269-277 (2001)), e transformado para a célula competente de E. coli JM 109 por uma técnica convencional. Foram recolhidos vários clones a partir do grupo de colónia formado, e os genes foram preparados a partir daí. De seguida, os genes resultantes foram confirmados como sendo genes que codificam o polipéptido, em que a sequência de ácidos nucleicos do local de inserção do vector de plasmídeo foi equivalente a SEQ ID NO: 32 ou 50 substancialmente representados por SEQ ID NO: 33, usando um sequenciador de ADN automático.

Exemplo 11 (Expressão de vector de expressão com cADN parcial em E. coli)

Um hospedeiro de E. coli com o vector de expressão construído no Exemplo 10 aqui introduzido foi pré-cultivado em 200 ml de meio LB que compreende ampicilina 5 0 μρ/πιΐ a 30 °C durante a noite. O resultante foi introduzido num fermentador que compreende 8 litros de meio LB, e a cultura foi conduzida a 30°C até a turvação a 600 nm alcançar 0.2 a 0.5. De seguida, foi adicionado isopropil-l-tio-h-D-galactopiranósido numa concentração final de 1 mM, e a mistura foi posta novamente em cultura durante a noite para induzir o domínio da metaloprotease da proteína a ser expressa. A E. coli da cultura foi recolhida usando uma centrífuga (4 °C durante 30 minutos).

Subsequentemente, o aglomerado (pellet) recolhido da E. coli foi ressuspendido em água destilada, e foi adicionada a lisozima (concentração final: 0.6 mg/ml) ao mesmo. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos, deixada a repousar a 4 °C durante a noite, e as células foram então destruídas. Após a ultrassonicação, foi realizada a centrifugação usando uma centrífuga (4 °C durante 20 minutos), e o aglomerado foi recuperado. 0 aglomerado recuperado foi ressuspendido num tampão que compreende Tris 50 mM, EDTA 10 mM, e Triton X-100 a 1% (pH 8.0). Estes procedimentos de centrifugação, ultrassonicação, e ressuspensão foram repetidos várias vezes, e o aglomerado foi então ressuspendido em água destilada. Do mesmo modo, os procedimentos de centrifugação, ultrassonicação, e ressuspensão foram 51 repetidos várias vezes para recuperar um corpo de inclusão. Este corpo de inclusão foi usado como um antigénio quando se produziu um anticorpo.

Exemplo 12 (Isolamento do gene homólogo de outras espécies animais) A sequência de ácidos nucleicos, tal como mostrada na SEQ ID NO: 15 foi usada como uma sonda, e foi conduzida uma pesquisa da homologia usando o programa BLASTN no servidor GenomeNet WWW (http://www.genome.ad.jp/). Como resultado, foram obtidos os clones de cromossoma AC091762 e AC090008 que foram mapeados no cromossoma 10 de ratinho. Com base nestas sequências, um homólogo de ratinho da protease codificada pelos ADN da presente invenção como mostrado na SEQ ID NO: 34 foi deduzida. Um novo primer foi designado a partir desta sequência, e foi conduzida uma análise por Northern blot pela técnica usada no isolamento e identificação do gene que codifica a protease de clivagem de vWF humana. Assim, foi observada a ocorrência da expressão especifica no figado como no caso dos seres humanos. Adicionalmente, foram usados ARN poly A+ derivado de figado humano normal e cADN Marathon-Ready™ (Clontech) para isolar e identificar o gene da protease da presente invenção pela técnica RACE como no caso dos seres humanos. Como resultado, as sequências de gene homólogas de ratinho da protease como mostrado na SEQ ID NOs: 35 e 36 foram determinadas.

Com base na sequência parcial homóloga assim determinada, foi determinada a estrutura Exon/Intron no lado 5' side do acima mencionado cromossoma de ratinho 10. De acordo com uma técnica convencional (por exemplo, Gene Targeting: A Practial Approach First Edition, edited by A. L. Joyner, Teratocarcinomas and embryonic stem cell a 52 practical approach), um vector alvo para ratinhos knock-out (knock-in) pode ser preparado com base nisso. Isto permite a produção de ratinhos mutados. Adicionalmente, esta proteína pode ser sujeita a expressão recombinante por uma técnica convencional.

Exemplo 13 (Produção de um anticorpo e construção de um sistema de detenção para a presente protease usando o anticorpo)

De acordo com a técnica convencional (por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology: Chapter 11 immunology, Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH, edited by J. McCAFFERTY et al. ou ANTIBODY ENGINEERING second edition, edited by Cari A. K. BORREBAECK) foi administrado um vector de expressão num ratinho ou rato. Este vector de expressão compreende uma substância preparada por ligação opcional duma proteína de antigénio parcialmente purificada a partir dum plasma humano ou por um péptido sintético com uma sua sequência de aminoácidos parcial (por exemplo, sequência de péptido C-terminal (SEQ ID NO: 37) Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Gln-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Glu-Asn-Ser-Val-Gln-Ser-Ser, que foi uma isoforma da protease codificada pelos ADN da presente invenção) para uma susbtância transportadora óptima tal como KLH ( foi adicionada Cys a, por exemplo, a extremidade N- ou C-terminal para facilitar a adição de KLH) , a acima mencionada proteína de gene recombinante, ou um gene que codifica esta proteína. Assim, foi estabelecido o anticorpo monoclonal que expressa um hibridoma e foi produzido o anticorpo policlonal (antisoro).

Subsequentemente, os anticorpos preparados pelas técnicas acima mencionados foram usados para detectar a protease codificada pelos ADN da presente invenção por 53

Western blotting de acordo com a técnica convencional (por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology: Chapter 10 analysis of proteins, Chapter 11 immunology). Mais especificamente, o sobrenadante da cultura de expressão da célula 293 da unidade recombinação obtida no procedimento como descrito no Exemplo 9 foi sujeita a SDS-PAGE sob condições não redutoras, transferido para uma membrana PVDF e confirmado usando o antisoro de ratinho ou coelho para confirmar a expressão da unidade de recombinação genética (Fig. 16) . Como resultado, a banda que foi deduzida como derivada da protease codificada pelos ADN da presente invenção foi encontrada num intervalo de tamanho molecular de 160 a 250 kDa. Subsequentemente, a protease codificada pelos ADN da presente invenção foi detectada usando plasma de partida ou similar e uma unidade recombinante sob condições não redutoras. Como resultado, a banda foi encontrada em 105 a 160 KDa ou 160 a 250 kDa (Fig. 17) . Também a banda derivada da unidade recombinante similar foi detectada no anticorpo monoclonal estabelecido por imunização duma proteína recombinante (clone No. CPHSWH-10) .

Posteriormente, a sequência do péptido da extremidade C-terminal Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Gln-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Glu-Asn-Ser-Val-Gln-Ser-Ser (SEQ ID NO: 37), que era uma isoforma da protease codificada pelos ADN da presente invenção foi ligado a KLH. O resultado foi usado como um imunogénio para obter um anticorpo do péptido. Com o uso do mesmo, a protease codificada pelos ADN da presente invenção foi detectada através do plasma em pessoas saudáveis, plasma de pacientes com TTP, ou um sobrenadante da cultura da unidade recombinante sob condições redutoras. Como resultado, foi descoberta uma banda de aproximadamente 250 kDa que foi deduzida para ser um sinal derivado da protease codificada pelos ADN da presente invenção, embora não não seja claro com base no plasma derivado de alguns 54 pacientes com TTP (Fig. 18).

Além disso, o imunoensaio enzimático (ELISA) construído pela combinação dos anticorpos obtidos permitiu a preparação da curva de calibração que é dependente da concentração ao nível do sobrenadante da cultura da proteína recombinada (Fig. 19) . Um exemplo de (ELISA) é como se segue. 0 anticorpo da protease de clivagem anti-vWF de ratinho obtido foi imobilizado na placa Maxisorp (Nunc), e diluições 1/1, 1/2, e 1/4 do sobrenadante da cultura da protease de clivagem de vWF que expressa temporariamente células 293 foram deixadas a reagir em quantidades de 100 μΐ/poço (sobrenadante Mock como "0"). A placa foi sujeita a reacção, por exemplo, a 37 °C durante 1 hora, e depois lavada com Tween 20/TBS a 0,05%. De seguida, o anticorpo da protease de clivagem de anti-vWF de coelho diluída 100 vezes foi deixada a reagir em quantidades de 100 μΐ/poço, por exemplo, a 37 °C durante 1 hora, e a placa foi lavada com Tween 20/TBS a 0,05%. O anticorpo anti- Ig de coelho marcado com peroxidase (BioRad) diluída 1000 vezes foi deixado a reagir em quantidades de 100 μΐ/poço, por exemplo, a 37 °C durante 1 hora, e a placa foi lavada com Tween 20/TBS a 0,05%. De seguida, foi desenvolvida a cor durante um dado período de tempo usando um substrato de coloração TMBZ, a reacção foi terminada usando ácido sulfúrico 1M como um líquido de terminação, e a absorvância a 450 nm foi determinada. A aplicação disso permitiu a quantificação da protease codificada pelos ADN da presente invenção numa variedade de espécies.

Exemplo 14 (Purificação da protease usando um anticorpo) O anticorpo obtido foi ligado a um transportador de imobilização adequado para preparar uma coluna de 55 afinidade, e a coluna resultante foi usada para purificar a protease codificada pelos ADN da presente invenção. A coluna de afinidade foi preparada por imobilização dum anticorpo usando Cellulofine para a activação de NHS (Chisso Corporation) de acordo com as instruções do fabricante. 0 transportador dilatado assim preparado (cerca de 1 ml) foi usado para aplicar o sobrenadante da cultura na qual o gene recombinante foi expresso em células 293 da protease como descrito no Exemplo 9. De seguida, a coluna foi lavada com Tris-HCl 50 mM e NaCl 0,1M (pH 7,5, daqui em diante referido como "TBS"), e a eluição foi realizada usando uma ureia com tampão de glicina 0.1M (pH 3) . A fracção eluida foi neutralizada com Tris-HCl 1M (pH 8,5) e depois dialisada contra TBS. Fig. 20 mostra os resultados da análise por SDS-PAGE da protease purificada resultante. Além disso, foi descoberto o resultado da fracção purificada como tendo uma actividade de clivagem para vWF. 0 ponto de clivagem do vWF fregmentado por esta protease recombinante foi descoberto como sendo a posição entre Tyr 842 e Met 843 com base na análise da sequência de aminoácidos N-terminal do fragmento. Também foram estabelecidos clones (por exemplo, Clone Nos. CPHSWH-7,2 and 10) que podem ser similarmente sujeitos a purificação com o uso do anticorpo monoclonal preparado pelo método que foi descrito no Exemplo 13.

Subsequentemente, determinou-se a sequência parcial de aminoácidos da protease purificada. De acordo com uma técnica convencional, a protease foi sujeita a SDS-PAGE, transferida para uma membrana PVDF, foi seca com ar, e depois sujeita a análise usando um sequenciador de proteínas automático (modelo 492; PE Applied Biosystems) . Como resultado, descobriu-se que a protease compreende Ala-Ala-Gly-Gly-Ile- como sequência N-terminal parcial. Esta sequência foi coerente com a sequência N-terminal da unidade madura da protease codificada pelos ADN da presente 56 invenção que foi deduzida da construção genética. Exemplo 15 (Neutralização da actividade da protease usando um anticorpo)

Foi avaliada a actividade do anticorpo policlonal de coelho acima mencionado para neutralizar a protease de clivagem para vWF. 0 soro e anti-soro de coelho normal, que compreende a sequência do péptido C-terminal (SEQ ID NO: 37), Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Gln-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Glu-Asn-Ser-Val-Gln-Ser-Ser que se liga ao KLH como um imunogénio, e antisoro, a imunidade da qual foi induzida pela proteína expressa pelo vector de expressão como apresentado no Exemplo 7 ou 8, foram, respectivamente, deixados a pré-reagir a 37 °C durante 1 hora com 1 a 10 μg/ml da protease de clivagem vWF do gene recombinante (aproximado pela técnica de Bradford) numa razão de volume de 1:1. Alternativamente, um anti-soro diluído 5 vezes foi deixado a pré-reagir sob as condições acima com a protease numa razão de volume de 1:1. De seguida, a actividade de clivagem de vWF foi avaliada pelo método descrito acima. Como resultado, foi descoberto que o anti-soro, que tinha a actividade de inibir a protease codificada pelos ADN da presente invenção, foi preparado por imunização da proteína (Fig. 21). (actividade antagonista) (um inibidor de metaloprotease, i.e., EDTA, foi determinado como sendo um controlo). Isto indica a possibilidade de construir um modelo adquirido semelhante ao dum paciente com TTP que tenha um auto-anticorpo positivo contra a protease de clivagem para vWF bem como a simples possibilidade de produzir um anticorpo de neutralização.

Exemplo 16 57 (Construção da unidade de modificação da extremidade C-terminal deletada)

Com base na estratégia mostrada na Fig.22, o vector de clonagem do gene da protease de clivagem de vWF de comprimento completo (pCR 2.1 vWFCP) obtido no Exemplo 6 ou 7 foi usado para adicionar uma variante sem dominios localizada numa posição após a extremidade C-terminal (T1135stop, W1016stop, W897stop, T581stop, e Q449stop: cada valor numérico indica o número de resíduos de aminoácidos entre Met codificada pelo codão de iniciação AGT e o codão de terminação, e indica o sítio que compreende o epítopo FLAG (sequência de ADN: gactacaaggacgatgacgataagtga (SEQ ID NO: 47) e a sequência de aminoácidos: Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys (SEQ ID NO: 48)) . Os primers aqui usados são como se segue. "S" indica um primer sense, e "AS" indica um primer antisense. Genes Stu I-S (SEQ ID NO: 38), Acc I-S (SEQ ID NO: 39), Avr II-S (SEQ ID NO: 40), Q449stop-AS (SEQ ID NO: 41), T581stop-AS (SEQ ID NO: 42), W897stop-AS (SEQ ID NO: 43), W1016stop-AS (SEQ ID NO: 44), T1135stop-AS (SEQ ID NO: 45), e AS de comprimento completo (SEQ ID NO: 46) foram preparados e incorporados no vector da expressão pCAG de acordo com o método usado nos Exemplos 8 e 9 . Este vector da expressão foi introduzido na célula Hela. O par de primers mostrado no fundo do mapa de restrição na parte superior da Fig. 22 foi usado para obter os fragmentos de PCR (A) a (F) . Cada fragmento de PCR foi ligado a pCR 2.1 vWFCP. Adicionalmente, o resultante foi digerido com Stul/Sall e os fragmentos (A) e (B) foram digeridos com Stul/Sall e depois ligados. Estes fragmentos foram ainda digeridos com Accl, e o fragmento (C) foi também digeridos com Accl, seguido por ligação. O produto de ligação foi digerido com Avrll/Sall, e os fragmentos (D), (E), e (F) também foram digeridos com Avrll/Sall seguido por ligação. 58

Como resultado, foi descoberto que uma variante sem uma região entre a extremidade C-terminal e a posição W897 tem actividade, embora isto tenha sido resultado de análise qualitativa. Tal forma de abordagem permite a identificação de vários domínios funcionais. Considera-se que a concepção de moléculas que compreendem estes domínios e que não têm actividade de protease realiza a concepção de antagonistas ou agonistas.

Aplicabilidade Industrial

As descobertas da presente invenção conduziram à possibilidade de uma terapia de substituição para pacientes que tenham doenças resultantes da deficiência de uma protease, tal como a púrpura trombocitopénica trombótica. Isto também concretiza o estabelecimento de métodos para a clonagem de genes e purificação eficiente a partir de soro ou plasma. Em particular, a informação fornecida pela presente invenção permite a recombinação de genes com base na sequência de nucleótidos obtidos e produção estável e fornecimento da protease codificada pelos ADN de acordo com a presente invenção, o que tem sido até agora difícil de conseguir. Além disso, estes também podem ser aplicados na terapia de substituição para pacientes com TTP, a inibição da formação do rolhão plaquetário envolvido no enfarte do miocárdio, enfarte cerebral agudo, inibição da aterosclerose, prevenção da restenose, reembolização, ou enfarte envolvido com PTCA, prevenção da reembolização envolvida com PTCR, e prevenção da formação do rolhão plaquetário causado por HUS ou 0-157. 0 diagnóstico e terapia que utilizam o gene que codifica a protease da presente invenção ou um anticorpo contra esta, podem ser realizados. 59

LISTA DE SEQUÊNCIAS

<110> JURIDICAL FOUNDATION THE CHEMO-SERO-THERAPEUTIC

RESEARCH INSTITUTE

<120> protease que cliva vWF

<130> PH1553-PCT <160> 48 <210> 1 <211> 5

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Leu Lei: Vai A;a Vai 1 5

<210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Ala Ala G!v Giy 11 e Le:i His Leu Gíu Leu Leu Vai Ala Vai i ío

<210> 3 <211> 161 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 60

Ala Ala Gly Gly Ile Leu His Leu Glu Leu Leu Vai Ala Vai Gly 1 5 10 15

Pro Asp Vai Phe Gin Ala His Gin Lys Asp Thr Glu Arg Tyr Vai 20 25 30

Leu Thr Asn Leu Asn Ile Gly Ala Glu Leu Leu Arg Asp Pro Ser 35 40 45

Leu Gly Ala Gin Phe Arg Vai His Leu Vai Lys Meí Vai Ile Leu 50 55 60

Thr Glu Pro Glu Gly Ala Pro Asn lie Thr Ala Asn Leu Thr Ser 65 70 75

Ser Leu Leu Ser Vai Cys Gly Trp Ser Gin Thr Ile Asn Pro Glu S0 85 90

Asp Asp Thr Asp Pro Gly His Ala Asp Leu Va! Leu Tyr Ile Thr 95 100 105

Arg Phe Asp Leu Glu Leu Pro Asp Gly Asn Arg Gin Vai Arg Gly 110 115 120

Vai Thr Gin Leu Gly Gly Ala Cys Ser Pro Thr Trp Ser Cys Leu 125 130 135

Ile Thr Glu Asp Thr Gly Phe Asp Leu Gly Vai Thr Ue Ala His 140 145 150

Glu Ile Gly His Ser Phe Gly Leu Glu His Asp 155 160

<210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 61 ctgctggtgg ccgtg 15

<210> 5 <211> 42 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 gctgcaggcg gcatcctaca cctggagctg ctggtggccg tg 42

<210> 6 <211> 483 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 6 gctíreaggcg gcatcctaca cctggagctg ctggtggccg tgggccccga tgtcttccag 60 gctcaccaga aggacacaga gcgctalgtg ctcaccaacc tcaacatcgg ggcagaactg 120 c:tcgggacc cgtccctggg ggctcagttt cgggtgcacc iggtgaagat ggtcattctg 180 aoigagccíg agggtgctcc. aaatatcaca gcaaacctca ccícgtccct gctgagcgtc 240 tgtgggígga gccagaccat caacccígag gacgacacgg atcclggcca tgctgacctg 300 glcctciaU ícactaggtt tgacctggag ítgcctgatg giaaccggca ggtgcggggc 360 glcacccagc tgggcggtgc ctgcícccca acctggagct gcctcattac cgaggacact 420 ggcttcgace tgggagtcac cattgcccat gagattgggc acagct.tcgg cctggagcac 480 gac 483

<210> 7 <211> 161 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 62 gct gca ggc ggc ate cta cac ctg gag ctg ctg gtg gee gtg ggc 45 A] a Ala Gly Gly Ile Leu His Leu Glu Leu Leu Val Ala Val Gly 1 5 10 15 ccc gat gtc ttc cag gct cac cag aag gac aca gag ege tat gtg 90 Pro Asp Vai Phe Gin Ala His Gin Lys Asp Thr Glu Arg Tyr Val 20 25 30 ctc acc aac ctc aac ate ggg gca gaa ctg ctt cgg gac ccg tcc 135 Leu Thr Asn Leu Asn lie Gly Ala Glu Leu Leu Arg Asp Pro Ser 35 40 45 ctg σσσ gct cag ttt ρσσ σ ftr o l-c cac ctg gtg aag atg gtc att ctg ISO Leu Gly Ala Gin Phe Arg Val His Leu Val Lys Met Val Ile Leu 50 55 60 aca gag CCl gag sgt gct cca aat ate aca gca aac ctc acc teg 225 Thr Glu Pro Glu Gly Ala Pro Asn Ile Thr Ala Asn LeU Thr Ser 65 70 75 tcc ctg ctg age gtc tgt ggg tgg age cag acc ate aac cct gag 270 Ser Leu Leu Ser Vai Cvs Gly Trp Ser Gin Thr Ile Asn Pro Glu 80 85 90 gac gac acg gat cct ggc cal gct gac ctg gtc ctc tat ate act 315 Asp Asp Thr Asp Pro Gly His Ala Asp Leu Vai Leu Tyr Ile Thr 95 100 105 agg ttt gac ctg gag ttg ccí gat ggt aac cgg cag gtg Cgg ggc 360 Arg Phe Asp Leu Glu Leu Pro Asp Gly Asn Arg Gin Val Arg Gly 110 115 120 gtc acc cag ctg ggc σσί gee tgc tcc cca acc tgg age tgc cíc 405 63

Vai Thr Gin Leu Gly Gly Ala Cys Ser Pro Thr Trp Ser Cys Leu 125 130 135 aí t acc gag gac ací ggc ttc gac ctg gga gtc acc att gee cat 450 1 le Thr Glu Asp Thr Gly Phe Asp Leu Gly Vai Thr I le Ala His 140 145 150 gag att ggg cac age ttc ggc ctg gag cac gac 483 Glu lie Gly His Ser Phe Gly Leu Glu His Asp 155 160

<210> 8 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Ala Ala G)y Gly lie Leu His Leu Glu Leu Leu Vai Ala Vai Gly i 5 10 15

Pro Asp Vai Phe Gin AU His Gin Lys Asp Thr Arg Arg Tyr 20 25

<210> 9 <211> 30 <212> ADN <213> Homo <400> 9 gctgcaggcg <210> 10 <211> 21 <212> ADN sapiens gcatcctaca cctggagctg 30 <213> Homo sapiens <400> 10

cccaatctca tgggcaatgg t <210> 11 <211> 21 <212> ADN 21 64 <213> Homo sapiens <400> 11 cccaatctca tgggcaatgg t 21

<210> 2 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 12 30 ccgatgttga ggttggtgag cacatagcgc

<210> 13 <211> 20 <212> ADN 20

<213> Homo <400> 13 gtgtcgtcct <210> 14 <211> 21 <212> ADN sapiens cagggttgat <213> Homo sapiens <400> 14 accattgccc atgagattgg g 21

<210> 15 <211> 4950 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 15 65 aaccacgatg tctttggcac agccíclcat ctgtcagatg ggagcgggga ccccggagag 60 ggagtcagcc gaggtcctgg cattccttgt gaacccccgt ctgtgggttt ctggtccagt 120 gtcccttcíc cagaitagat ggcttaggcc tcctctaagg gggígggcgt gcacatccgg ISO agagctgtct ggígtgcagg actgggcígc aggttaccct gaacígcaac caícttagag 240 caaggcccag cttgcagcag gaggagctgc aggccgccca ccctagccac ggcccctgcc 300 ctggcaggaa gcttccaaga gtaaacactg cctaatcgtc ccgcccagía gtgagcaggc 360 ctgtcccatt ccatactgac cagaitccca gtcaccaagg ccccctclca ciccgctcca 420 ctcctcgggc iggcictcct gaggaigcac cagcgtcacc cccgggcaag atgccctccc 480 ctcigtgtgg ccggaaLccí tgcctgtggc tttctcctgg gctgctgggg acccícccat 540 itccagcaga gttgtcttca ggctltggag ccacaggccg tgtctictta cítgagccct 600 ggtgctccct taaaaggccg ccctccttcc cctggcttcc agaggcagag gcagaggcag 660 aggcgggcig caggcggcat cctacacctg gagctgcigg tggccgtggg ccccgaígtc .720 ttccaggctc accaggagga cacagagcgc tatgtgctca ccaacctcaa catcggggca 780 gaactgcitc gggacccgíc cctgggggcí cagíttcggg tgcacctggt gaagatggtc 840 attctgacag agcctgaggg tgctccaaat atcacagcca acctcacctc gtccctgctg 900 agcgtclgig ggtggagcca gaccatcaac cctgaggacg acacggatcc tggccatgct 960 gacctggtcc tctatatcac taggtitgac ctggagttgc cígatggíaa ccggcaggtg 1020 cggggcgíca cccagctggg cggtgcctgc tccccaacct ggagctgcct catUccgag 1080 66 gacaciggcí tcgacctggg agtcaccatl gcccalgaga Ugggcacag cttcggcctg Π40 gagcacgacg gcgcgcccgg cagcggctgc ggccccagcg gacacgtgat ggcticggac 1200 ggcgccgcgc cccscgccgg ccícgcctgg lececeigca gccgcçggca gctgcígagc 1260 ctgcícagcg caggacgggc gcgctgcgtg ígggacccgc cgcggcctca acccgggicc 1320 gcggggcacc cçncggalgc gcagcclggc c tctactaca gcgccaacga gcagtgccgc 1380 gtggccticg grccraaggc igtcgcclgc accíícgcca gggagcaccí ggatatgtgc 1440 caggcccíct cfifccacaL- agacccgctg gaccaaagca gctgcagccg cctcctcgtí 1500 cctctccígc atgggacaga atgtggcgtg gagaaglggí gcíccaaggg tcgctgccgc 1560 tccctggígg agcigacccc catagcagca gtgcaigggc gctggtctag ctggggíccc 1620 cgaagtccn gcUTCgcic cígcggagga ggtgiggfca ccaggaggcg gcagtgcaac 1680 aaccccagac e;cccn:s£ ggggcgtgca tgigtlggtg ctgacctcca ggccgagatg 1740 Igcaacacíe aggíx-grga gaagacccag ciggagtlca tgícgcaaca gtgcgccagg 1800 accgacggcr agcrpcíccg cicctcccct ggcggcgcci ccttctacca ctggggtgct 1860 gctgiacxac acaixraagí ggatgctctg tgcagacaca ígtgccgggc cattggcgag 1920 ageíicaíea UaagopigÇ agacagcttc ccccgggagg acçggaccct gagcctgtgt gatgglagga UTaetccca gcaggtaígg agcacgigca gccenrggaa gggclctUc tttcígacng r.arrcccaa cctgaccagt acacaciigg cgviuaggai cggagggcgc cctaacacca cctacccric cctcctggag accgaggacc gixiírccicg cctggaggag gctgaca-cc aggiiucag gcggtatggc alcarciice t:c‘.acU"ca scciaagcca gggccctgn c.çg:?agc:g tggggcaggg caggccagga asgag::"?· ggagacigic tggccagagg cTtgcglSC; cgaaccctgc ccatgcagcg cctccisis? 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<210> 16 <211> 1353 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 4500 4560 4020 4680 4740 4800 4860 4920 4950 gct gca A1 a Λ»a i ccc ga! l'ro Asp cte ate Leu Ttr c!g ggg Leu Uly ggc ggc Gly Giy gtc ttc Vai Phe aac ele Asn Leu gct cag Ala Gin aca gag cct gag ate cta Ile Leu 5 cag gcí Gin Ala 20 aac ate Asn Ile 35 tit cgg Phe Arg 50 ggt gct cac clg His Leu cac cag His Gin ggg gea Gly Ala gtg cac Vai His cca aaí OU& VtQ GIu Leu 10 gag gac Glu Asp 2b gaa ctg GIu Leu 40 ctg gtg Leu Vai 55 ate aca ctg gtg gee Leu Vai Ala aca gag cgc Thr Glu Arg ctt cgg gac Leu Arg Asp aag atg ?lc Lys Met Vai gee aac etc gíg ggc Vai Gly 15 tat gtg Tyr Vai 30 ccg tcc Pro Ser 45 att ctg Ile Leu 60 acc teg 45 90 135 180 225 69

Thr Glu Pro G3u Gly Ala Pro Asn Ile Thr Ala Asn ieu Thr Ser 65 70 75 icc ctg ctg age gíc tgi ggg tgg age cag acc ate aac cct gag 270

Ser Leu Leu Ser Vai Cys Gly Trp Ser Gin Thr Ile Asn Pro Glu 80 . 85 90 gac gac acg gat cct ggc cat gct gac ctg gtc etc tat ate act 315

Asp Asp Thr Asp Pro Giy His Ala Asp Leu Vai Leu Tyr lie Thr 95 100 105 agg ttt gac cíg gag ttg ccí gat ggt aac cgg cag gtg cgg ggc 360

Arg Phe Asp Leu Glu Leu Pro Asp Gly Asn Arg Glu Vai Arg Gly 110 115 120 gtc acc cag ctg ggc ggí gee tgc tcc cca acc tgg age tgc etc 405

Vai Thr Gin Leu Gly Gly Ala Cys Ser Pro Thr Trp Ser Cys Leu 125 130 135 att acc gag gac act ggc ttc gac ctg gga gtc acc att gee cat 450

Ile Thr Glu Asp Thr Gly Phe Asp Leu Giy Vai Thr Ile Ala His 140 145 150 gag att ggg cac age ttc ggc ctg gag cac gac ggc gcg ccc ggc 495

Glu ile Gly His Ser Phe Gly Leu Glu His Asp Gly Ala Pro Gly 155 160 165 age ggc tgc ggc ccc age gga cac gtg alg gct [cg gac ggc gee 540

Ser Gly Cys Gly Pro Ser Gly His Vai Met Ala Ser Asp Gly Ala 170 175 180 gcg ccc ege gee ggc etc gee tgg tcc ccc tgc age ege cgg cag 585

Ala Pro Arg Ala Gly Leu Ala Trp Ser Pro Cys Ser Arg Arg Gin 185 190 195 ctg ctg age ctg etc age gea gga cgg gcg ege tgc gtg Igg gac 630

Leu Leu Ser Leu Leu Ser Ala Gly Arg Ala Arg Cys Vai Trp Asp 70

ZOO ccg ccg cgg ccí caa ccc ggg tcc gcg Pro Pro Arg Pro Gin Pro Gly Ser Ala 215 cag cct ggc cíc tac tac age gee aac Gin Pro Gly Leu Tyr Tyr Ser Ala Asn 230 ítc ggc ccc aag gct gte gee tgc acc Phe Giy Pro Lys A!a Vai Aia Cys Thr 245 gat atg tgc cag gee etc tcc tgc cac Asp Met Cys Gin Ala Leu Ser Cys His 260 age age tgc age ege etc etc gtt cct Ser Ser Cys Ser Arg Leu Leu Vai Pro 2T5 tgt ggc gtg gag aag tgg tgc tcc aag Cys Gly Vai Glu Lys Trp Cys Ser Lys 290 gtg gag ctg acc ccc ata gea gea gtg Vai Glu Leu Thr Pro Ile Ala Ala Vai 305 tgg ggt ccc cga agt cct tgc tcc ege Trp Gly Pro Arg Ser Pro Cys Ser Arg 320 gtc acc agg agg cgg cag tgc aac aac Vai Thr Arg Arg Arg Gin Cys Asn Asn 335 210 cac ccg ccg gat gcg 675

His Pro Pro Asp Ala 225 cag tgc ege gtg gee 720

Gin Cys Arg Vai Ala 240 gee agg gag cac ctg 765

Ala Arg Glu His Leu 255 gac ccg ctg gac caa 810

Asp Pro Leu Asp Gin 270 ctg gat ggg aca gaa 855

Leu Asp Gly Thr Glu 285 ege tgc ege tcc ctg 900

Arg Cys Arg Ser Leu 300 ggg ege tgg tet age 945

Gly Arg Trp Ser Ser 315 tgc gga gga ggt gtg 990

Cys Gly Gly Gly Vai 330 aga cct gee ttt ggg 1035

Arg Pro Aia Phe Gly 345 1080 71 ggg cgi gca tgt gtt ggt gct gac ctc cag gcc gag atg tgc aac

Gly Arg Ala Cys Vaj GJy Ala Asp Leu Gin AI» OJu Met Cys Asn 350 3S5 360 act cag gcc tgc gag aag acc cag ctg gag ttc aig tcg caa cag

Thr Gin Ala Cys Glu LyS Tlir Gin Leu Glu Phe Meí Ser Gin Gin 365 370 375 tgc gcc agg acc gac ggc cag ccg ctg cgc tcc tcc cct ggc ggc

Cys Ala Arg Thr Asp Gly Gin Pro Leu Arg Ser Ser Pro Gly Gly 380 385 390 gcc tcc tíc tac cac tgg ggt gct gct gta cca cac age caa ggg,

Ala Ser Phe Tyr His Trp Gly Ala Ala Vai Pro His Ser Gin Gly 395 400 405 gat gct ctg tgc aga cac atg tgc cgg gcc ati ggc gag age ttc

Asp Ala Leu Cys Arg His Met Cys Arg Ala Ile Gly Glu Ser Phe 410 415 420 ate atg aag cgt gga gac age ttc ctc gat ggg acc cgg tgt atg lie Met Lys Arg Gly Asp Ser Phe Leu Asp Gly Thr Arg Cys Met 425 430 435 cca agi ggc ccc cgg gag gac ggg acc ctg age ctg tgt gtg teg

Pro Ser Gly pro Arg Glu Asp Gly Thr Leu Ser Leu Cys Vai Ser 440 445 450 g&c age tgc agg aca itt ggc tgt gat ggt agg atg gac tcc cag

Gly Ser Cvs Arg Thr Phe Gly Cys Asp Gly Arg Met Asp Ser Gin 455 460 465 cag gta tgg gac agg tgc cag gtg tgt ggt ggg gac aac age acg

Gin Vai Trp Asp Arg Cys Gin Vai Cys Gly Giy Asp Asn Ser Thr 470 475 480 tgc age cca cgg aag ggc tet ttc aca gct ggc aga gcg aga gaa 1125 1170 1215 1260 1305 1350 1395 1440 1485 72

Cys Ser Pro Arg Lys Gly Ser Phe Thr Ala Gly Arg Ala Arg Cl li 485 490 495 tat gtc acg ttt ctg aca gtfacc ccc aac clg acc agi gtc tac 1530

Tyr Vai Thr Phe Leu Thr Vai Thr Pro Asn Leu Thr Ser Vai Tyr 500 505 510 att gcc aac cac agg cct ctc Etc aca cac ttg gcg gíg agg ate 1575 11 e Ala Asn His Arg Pro Leu Phe Thr His Leu Ala Vai Arg IΪe 515 520 525 ' gga ggg ege tat gtc gtg gct ggg aag aig age ate tcc cct aac 1620

Gly Gly Arg Tyr Vai Vai Ala Gly Lys Met Ser lie Ser Pro Asa 530 535 540 acc acc tac ccc tcc ctc ctg gag gat ggt cgt gtc gag tac aga 1665

Thr Thr Tyr Pro Ser Leu Leu Glu Asp Gly Arg Vai Glu Tyr Arg 545 550 555 gtg gcc ctc acc gag gac cgg ctg ccc ege cíg gag gag ate ege 1710

Vai Ala Leu Thr Glu Asp Arg Leu Pro Arg Leu Glu Glu Ile Arg 560 ' 565 570 ate igg gga ccc ctc cag gaa gaí gct gac ate cag gtt tac agg 1755

Ile Trp Gly Pro Leu Gin Glu Asp Ala Asp I1e Gin Vai Tyr Arg 575 580 585 cgg tat ggc gag gag tat ggc aac ctc acc ege cca gac ate acc 1800

Arg Tyr Gly Glu Glu Tyr Gly Asn Leu Thr Arg Pro Asp lie Thr 590 595 600 ttc acc tac ttc cag cct aag cca cgg cag gcc tgg gtg tgg gcc 1845

Phe Thr Tyr Phe Gin Pro Lys Pro Arg Gin Ala Trp Vai Trp Ala 605 610 615 gct gtg cgt ggg ccc tgc teg gtg age tgt ggg gea ggg ctg ege 1890

Ala Vai Arg Gly Pro Cys Ser Vai Ser Cys Gly Ala Gly Leu Arg 73 620 62S 630 tgg gtaaac tac age tgc ctg gac cag gee agg aag gag tíg gtg Trp yai Asa Tyr Ser Cys Leu Asd Gin Ala Arg Lys Glu Leu Vai 636 640 645 8ag act g‘c cag tgc caa ggg age cag cag cca cca gcg tgg cea

Glu Tlir Vai Gin Cys Gin Gly Ser Gin Gin Pro Pro Ala Trp Pro 650 655 660 gag gee tgc kip cie gaa ccc tgc cct ccc tac tgg gcg gtg gga

Glu Ala Cys va! Leu Glu Pro Cys Pro Pro Tyr Trp Ala Vai Gly 665 670 675 gac tte ggc cca tgc age gee tcc ígt ggg ggc ggc ctg cgg gag

Asp Phe Gly Pro Cys Ser Ala Ser Cys Gly Gly Gly Leu Arg Glu fiSO 685 690 cgg cca gtg ege tgc g:g gag gee cag ggc age etc ctg aag aca Arg Pro Va! Arg Cys Vai Glu Ala Gin Gly Ser Leu Leu Lys Thr 6P5 700 705 ug ccc cca gee cgg igc aga gea ggg gee cag cag cca gct gtg

Leu Pru Pru Ala Arg Cys Arg Ala Gly Ala Gin Gin Pro Ala Vai 710 715 720 gcg ctg gaa aec tgc tac ccc cag ccc tgc cct gee agg tgg gag Λ1 a Leu Glu Tlir fvs Asn Pro Gin Pro Cys Pro Ala Arg Trp Glu 725 730 735 g>g íca gag ccc age :ca tgc aca lca gct ggt gga gea ggc ctg

Vai Ser Glu Pro' Ser Ser Cys Thr Ser Ala Gly Gly Ala Gly Leu 7-10 745 750 gee tíg gag uuc gag acc. igi gtg cca ggg gea gat ggc ctg gag

Ala Leu Glu Asn Cisi Thr Cys Vai Pro Gly Ala Asp Gly Leu Glu 1935 1980 2025 2070 2115 2160 2205 2250 2295 i «•'ví 760 765 74 gct cca gLg aet gag ggg cct ggc Loc gta gat gag aag ctg cct 2340

Ala Pro Vai Thr Glu Giy Pro Glv Ser Vai Asp Clu Lys Leu Pro 770 775 780 gcc cct gag ccc tgt gtc ggg atg tca tgt cct cca ggc tgg ggc 2385

Ala Pro Glu Pro Cys Vai Giy Met Ser Cys Pro Pro Gly Trp Gly 785 790 795 cat ctg gat gcc acc tct gca ggg gag aag gct ccc tcc cca tgg 2430

His Leu Asp Ala Thr Ser Ala Gly Glu Lys Ala Pro Ser Pro Trp 800 805 810 ggc age ate agg acg ggg gct caa gct gca cac gtg tgg acc cct 2475

Gly Ser Ile Arg Thr Gly Ala Glu Ala Ala His Vai Trp Thr Pro 815 820 825 gcg gca ggg teg tgc tcc gtc tcc tgc ggg cga ggt ctg atg gag 2520

Ala Ala Gly Ser Cys Ser Vai Ser Cys Gly Arg Gly Leu Met Glu 830 835 840 ctg cgt ttc ctg tgc atg gac tct gcc ctc agg gtg cct gtc cag 2565

Leu Arg Phe Leu Cys Met Asp Ser Ala Leu Arg Vai Pro Vai Glu 845 850 855 gaa gag ctg tgt ggc ctg gca age aag cct ggg age cgg cgg gag 2610

Glu Glu Leu Cys Gly Leu Ala Ser Lys Pro Gly Ser Arg Arg Glu 860 865 870 gtc tgc cag gct gtc ccg tgc cct gct cgg tgg cag tac aag ctg 2655

Vai Cys Gin Ala Vai Pro Cys Pro Ala Arg Trp Gin Tyr Lys Leu 8T5 880 885 gcg gcc tgc age gtg age tgt ggg aga ggg gtc gtg cgg agg ate 2700

Ala Ala Cys Ser Vai Ser Cys Gly Arg Gly Vai Vai Arg Arg Ile 890 895 900 ctg tat tgt gcc cgg gcc cat ggg gag gac gat ggt gag gag ate 2745 75

Leu Tyr Cys Ala Arg· Ala His Gly Glu Asp Asp Gly GIu Glu Ile 905 910 915 dg ug gac acc cag igc cag ggg ctg cct cgc ccg gaa ccc cag 2790

Lei; Leu Asp Thr Gin Cys Gin Gly Leu Pro Arg Pro Glu Pro Gin 920 925 930 gag gcc igc age cig gag ccc tgc cca cct agg tgg aaa gtc atg 2835

Glu Ah Cys Ser Leu Glu Pro Cys Pro Pro Arg Trp Lys Vai Met 935 940 945 icc c:: ggc cca Igt teg gee age tgt ggc ctt ggc act gct aga 2880

Ser Leu Gly Pro Cys Ser Ala Ser Cys Gly Leu Gly Thr Ala Arg 950 955 ' 960 cgc les gtg gee tgt glg cag etc gac caa ggc cag gac gtg gag 2925

Arg Ser Vai Ala Cys Vai Gin Leu Asp Gin Gly Gin Asp Vai Glu 965 970 975 glg gac gag gcg gee ígt gcg gcg ctg gtg cgg ccc gag gee agi 2970 \a) Asp Glu Ala Ala Cys Ala Ala Leu Vai Arg Pro Glu Ala Ser 980 985 990 gtc ccc íei etc aít gee gac Igc acc tac cgc tgg cat gtt ggc 3015

Vai Pro Cys Leu I1e Ala Asp Cys Thr Tyr Arg Trp His Vai Gly 995 1000 1005 acc igg aig gag tgc íct gtt ícc tgt ggg gat ggc ate cag cgc 3060

Thr Trp Met Glu Cys Ser Vai Ser Cys Gly Asp Gly I1e Gin Arg 1010 1015 1020 cgg eg( gac acc tgc etc gga ccc cag gee cag gcg cct gtg cca 3105

Arg Arg Asp Thr Cys Leu Gly Pro Gin Ala Gin Ala Pro Vai Pro 1025 1030 1035 gei gat tte tgc cag cac ttg ccc aag ccg gtg ací gtg cgt ggc 3150

Ala Asp Phe Cys Gin His Leu Pro Lys Pro Vai Thr Vai Arg Gly 76 1040 1045 1050 ígc tgg gct ggg ccc tgt gtg gga cag ggt acg ccc age ctg gtg 3195 Cys Trp Ala Gly Pro Cys Vai Gly Gin Gly Thr Pro Ser Leu Vai 1055 1060 1065 ccc ca c gaa gaa gcc gct gct cca gga cgg acc aca gcc acc cct 3240 Pro His Glu Glu Ala Ala Ala Pro Gly Arg Thr Thr Ala Thr Pro 1070 1075 1080 gct ggt gcc tcc ctg gag tgg tcc cag gcc cgg ggc ctg ctc ttc 3285 Ala Gly Ala Ser Leu Glu Trp Ser GJn Ala Arg Gly Leu Leu Phe 1085 1090 1095 tcc ccg gct ccc cag cct Cgg cgg ctc ctg ccc ggg ccc cag gaa 3330 Ser Pro Ala Pro Gin Pro Arg Arg Leu Leu Pro Gly Pro Gin Glu 1100 1105 1Π0 aac tca gtg cag tcc agt gcc tgt ggc agg cag cac ctt gag cca 3375 Asn Ser Vai Gin Ser Ser Ala Cys Gly Arg Gin His Leu Glu Pro 1115 1120 1125 aca gga acc att gac atg cga ggc cca ggg cag gca gac tgt gca 3420 Thr Gly Thr Ile Asp Me t Arg Gly Pro Gly Gin Ala Asp Cys Ala 1130 1135 1140 gtg gcc att OÍTC OOO cgg ccc ctc ggg gag gtg gtg acc ctc ege gtc 3465 Vai Ala Ile Gly Arg Pro Leu Gly Glu Vai Vai Thr Leu Arg Vai 1145 1150 1155 ctt gag agt tct ctc aac ígc agt gcg ggg gac atg ttg ctg ctt 3510 Leu Giu Ser Ser Leu Asn Cys Ser Ala Gly Asp Met Leu Leu Leu 1160 1165 3170 tgg ggc cgg ctc acc tgg agg aag atg tgc agg aag ctg ttg gac 3555 Trp Gly Arg Leu Thr Trp Arg Lys Me t Cys Arg Lys Leu Leu Asp 1178 1180 1185 77 77 atg act L tC age tcc aag acc aac acg Meí Thr Phe Ser Ser Lys Thr Asn Thr 1190 tgc ggg cgg cca gga ggt ggg gig cíg Cys Gly Arg Pro Gly Gly Gly Vai Leu 1205 ctt gct cct gaa acc ttc tac aga gaa Leu Ala Pro Glu Thr Phe Tyr Arg Glu 1220 ggg ccc tgg ggt gaa ate gtg age ccc Gly Pro Trp Gly Glu Ile Vai Ser Pro 1235 agt aaí gea ggg ggc tgc cgg ele ttc Ser Asn Ala Gly Gly Cys Arg Leu Phe 1250 gea cgg ai t gee ate cat gee cig gee Ala Arg 11 e Ala Ile His Ala Leu Ala 1265 acc gag gga gee aat gee age tac ate Thr Glu Gly Ala Asn Ala Ser Tyr Ile 1280 age ttg agg acc aca gcg ttc cat ggg Ser Leu Arg Thr Thr Ala Phe His Gly 1295 gag tea gag age age cag gct gag atg Glu Ser Glu Ser Ser Gin Ala Glu Met 1310 ctg aag gct cag gee age ctg cgg ggc cίε gtg gtg agg cag cgc 3600

Leu Vai Vai Arg Gin Arg 1)95 1200 cíg cgg taí ggg age cag 3645

Leu Arg Tyr GJy Ser Gin 1210 1215 tgt gac atg cag cic ítí 3690

Cys Asp Met Gin Leu Phe 1225 1230 teg ctg agt cca gee acg 3735

Ser Leu Ser Pro Ala Thr 1240 1245 . aíí aat gtg gct ccg cac 3780 I1e Asn Vai Ala Pro His 1255 1260 acc aac atg ggc gct ggg 3825

Thr Asn Met Gly Ala Gty 1270 1275

Etg ate cgg gac acc cac 3870

Leu lie Arg Asp Thr His 1285 1290 cag cag gtg etc tac tgg 3915

Gin Gin Vai Leu Tyr Trp 1300 1305 gag ttc age gag ggc ítc 3960

Glu Phe Ser Gin Gly Phe 1315 1320 cag tac tgg acc etc caa 4005 78

Leu Lys Ala Gin Ala Ser ieu Arg Gly Gin Tyr Trp Thr Leu Gin 1325 1330 1335 tca.tgg gta ccg gag atg cag gac cct cag lcc tgg aag gga aag 4050

Ser Trp Vai Pro Glu Met Gin Asp Pro Gin Ser Trp Lys Gly Lys 1340 1345 1350 gaa gga acc 4059

Glu Gly Thr

<210> 17 <211> 1297 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 gcí gca ggc ggc ate cta cac ctg gag ctg ctg gtg gee gtg ggc 45 Ala Ala Gly Gly Ile Leu His Leu Glu Leu Leu Vai Ala Vai Gly 1 5 10 15 ccc gat gtc t tc cag gct cac cag gag gac aca gag ege tat gtg 90 Pro Asp Vai Phe Gin Ala His Gin Glu Asp Thr Glu Arg Tyr Vai 20 25 30 ctc acc aac cíc aac aíc ggg gca gaa ctg ctt cgg gac ccg tcc 135 Leu Thr Asn Leu Asn Ile Gly Ala Glu Leu Leu Arg Asp Pro Ser 35 40 45 ctg ggg gct cag m cgg gtg cac ctg gtg aag atg gtc att Ctg m Leu Gly Ala Gin Phe Arg Vai His Leu Vai Lys «et Vai Ile Leu 50 55 60 aca gag CC 1 gag ggt gct cca aat ate aca gee aac ctc acc teg 225 Thr Glu Pro Glu Gly Ala Pro Asn Ile Thr Ala Asn Leu Thr Ser 65 70 75 270 79 270 79 tcc ctg ctg age gtc tgt ggg Igg age cag acc ate aac cct gag Ser Leu Leu Ser Vai Cys Gly Trp Ser Gin Thr lie Asn Pro Glu 80 85 90 gac gac acg gat cct ggc cat gct gac ctg gtc etc tat ate act Asp Asp Thr Asp Pro Gly His AJa Asp Leu Vai Leu Tyr He Thr 95 100 105 agg tu gac ctg gag ttg cct gat ggt aac cgg cag gtg cgg ggc Arg Phe Asp Leu Glu Leu Pro Asp Gly Asn Arg Gin Vai Arg Gly 110 115 120 gtc acc cag ctg ggc ggt gee tgc tcc cca acc tgg age tgc etc Vai ThT Gin Leu Gly Gly Ala Cys Ser Pro Thr Trp Ser Cys Leu 125 130 135 att acc gag gac act ggc t te gac ctg gga gtc acc aít gee cat He Thr Glu Asp Thr Gly Phe Asp Leu Gly Vai Thr I1e Ala His 140 145 150 gag att ggg cac age t te ggc ctg gag cac gac ggc gcg ccc ggc Glu lie Gly His Ser Phe Gly Leu Glu His Asp Gly Ala Pro Gly 155 160 165 age ggc ígc ggc ccc age sga cac glg atg gct teg gac ggc gee Ser Gty Cys Gly Pro Ser Gly His Vai Me t Ala Ser Asp Gly Ala 170 175 180 gcg ccc ege gee ggc etc gee tgg tcc ccc tgc age ege cgg cag Ala Pro Arg Ala Gly leu Ala Trp Ser Pro Cys Ser Arg Arg Gin 185 190 195 ctg ctg age ctg etc age gea gga cgg gcg ege tgc gtg tgg gac Leu Leu Ser Leu Leu Ser Ala Gly Arg Ala Arg Cys Vai Trp ASP 200 205 210 ccg ccg cgg cct caa ccc ggg tcc gcg ggg cac ccg ccg gat gcg 316 360 405 450 49δ 540 585 630 675

Pro Pro Arg Pro Gin Pro Gly Ser Aia Gly His Pro Pro Asp Ala 215 220 225 cag ccí ggc cic iac íac age gee aac gag cag tgc ege gtg gee

Gin Pro Gly Leu Tyr Tyr Ser Aia Asn Glu Gin Cys Arg Vai Ala 230 235 240 ttc ggc ccc aag gcí gic gee tgc acc í te gee agg gag cac ctg

Phe Gly Pro Lys Ala Vai Ala Cys Thr Phe Ala Arg Glu His Leu 2-15 250 255 gat atg tgc cag gee cic tcc ígc cac aca gac ccg ctg gac caa

Asp Mer L'yr- Gin Ala Leu Ser Cys His Thr Asp Pro Leu Asp Gin 250 265 270 age age (pc age ege etc etc gtí cct cíc ctg gat ggg aca gaa

Ser Ser Cys Ser Arg Leu Leu Vai Pro Leu Leu Asp Gly Thr Glu 273 280 285 tgl ggc gig gag aag tgg tgc tcc aag ggt ege tgc ege tcc ctg

Cys Gly Vai Glu Lys Trp Cys Ser Lys Gly Arg Cys Arg Ser Leu 200 293 300 gtg gag et? acc ccc ata gea gea gtg ca! ggg ege tgg Ict age

Vai Glt: Leu Thr Pro Ile Ala Aía Vai His Gly Arg Trp Ser Ser 305 310 315 tgg ggt ccc cga agi cct tgc tcc ege tcc tgc gga gga ggt gtg

Trp Gly Pro Are Ser Pro Cys Ser Arg Ser Cys Gly Gly Gly Vai 320 325 330 etc acc agg agg cg? cag tgc aac aac ccc aga cct gee ttt ggg

Vai Thr Arg Ar? Arg Gin Cys Asn Asn Pro Arg Pro Ala Phe Gly 335 340 345 ggg cgt gea iet gtí ggi gel gac etc cag gee gag àtg tgc aac

Gly Arg Ala Cys Vol Gly Aia Asp Leu Gin Ala Glu Met Cys Asn 81 350 355 360 ací cag gcc tgc gag aag acc cag ctg gag ttc atg teg caa cag 1125 Thr Gin Ala Cys GIu Lys Thr Gin Leu Glu Phe Met Ser Gin Gin 365 3 TO 375 ígc gcc agg acc gac ggc cag ccg ctg ege tcc tcc cet ggc ggc 1170 Cys Ala Arg Thr Asp Gly Gin Pro Leu Arg Ser Ser Pro Giy Gly 380 385 390 gcc tcc ttc tac cac tgg ggt gct gct gta cca cac age caa ggg 1215 Ala Ser Phe Tyr His Trp Gly Ala Ala Vai Pro His Ser Gin Gly 395 400 405 gat gcí ctg tgc aga cac atg tgc cgg gcc att ggc gag age ttc 1260 Asp Ala Leu Cys Arg His Met Cys Arg Ala Ile Gly Glu Ser Phe 410 415 420 ate .atg aag cgt gga gac age ttc ctc gat ggg acc cgg tgt atg 1305 Ile Met Lys Arg Gly Asp Ser Phe Leu Asp Gly Thr Arg Cys Met 425 430 435 cca agt ggc ccc cgg gag gac ggg acc ctg age ctg tgt gtg ícg 1350 Pro Ser Gly Pro Arg Glu Asp Gly Thr Leu Ser Leu Cys Vai Ser 440 445 450 ggc age tgc agg aca tít ggc tgt gat ggt agg atg gac tcc cag 1395 Gly Ser Cys Arg Thr Phe Giy Cys Asp Gly Arg Met Asp Ser Gin 455 460 465 cag gta tgg gac agg tgc cag gtg tgt ggt ggg gac aac age acg 1440 Gin Vai Trp Asp Arg Cys Gin Vai Cys Gly Gly Asp Ásn Ser Thr 470 475 4S0 tgc age cca cgg aag ggc tet ttc aca gct ggc aga gcg aga gaa 1485 Cys Ser Pro Arg Lys Gly Ser Phe Thr Ala Gly Arg Ala Arg Glu 485 490 495 82 tat gtc acg tu ctg aca gtt acc ccc Ty: Vai Thr Phe Leu Thr Va! Thr Pro 500 att gee aac cac agg cct cíc tíc aca lie Ala Ase His Arg Pro Leu Phe Thr 515 gga ggg ege iat gíc gíg gct ggg aag Gly Gly Arg Tyr Vai Vai Ala Gly Lys 530 acc acc tac ccc tcc cíc ctg gag gat Thr Thr Tyr Pro Ser Leu Leu Glu Asp 545 gtg gee etc acc gag gac cgg ctg ccc Vai Ala Leu Thr Glu Asp Arg Leu Pro 560 a i c tgg gga ccc etc cag gaa gat gct Ile Trp Gly Pro Leu Gin Glu Asp Ala 575 Cgg tat ggc gag gag tat ggc aac etc Arg Tyr Gly Glu Glu Tyr Gly Asn Leu 590 t te acc tac lie cag cct aag cca cgg Phe Thr Tyr Phe Gin Pro Lys Pro Arg 605 gci gtg cgt ggg ccc tgc teg gtg age Ala Vai Arg Gly Pro Cys Ser Vai Ser 620 tgg gla aac tac age tgc ctg gac cag ctg acc agt gtc íac 1530

Leu Thr Ser Vai Tyr 510 ttg gcg gtg agg aíc 1575

Leu Ala Vai Arg lie 525 age ate tcc cot aac 1620

Ser Γ1e Ser Pro Asn 540 cgt gtc gag íac aga 1665

Arg Vai Glu Tyr Arg 555 ctg gag gag aic ege 1710

Leu Gíu Glu I1e Arg 570 ate cag gtt tac agg 1755 13e Gin Vai Tyr Arg 585 ege cca gac ate acc 1800

Arg Pro Asp Ile Thr 600 gee ígg gtg tgg gee 1845

Ala Trp Vai Trp Ala 615 ggg gea ggg ctg ege 1890

Gly Ala Gly Leu Arg 630 agg aag gag ttg gtg 1935 83 83 Trp Vai Asn Tyr Ser Cys Leu Asp 635 gag act gic cag tgc caa ggg age Glu Thr Vai Gin Cys Gin Gly Ser 650 gag gee tgc gtg ctc gaa ccc tgc Glu Ala Cys Yal Leu Glu Pro Cys 665 gac ttc ggc cca tgc age gee tcc Asp Phe Gly Pro Cys Ser Ala Ser 680 cgg cca gtg ege tgc gtg gag gee Arg Pro Ya] Arg Cys Vai Glu Ala 695 Ug ccc cca gee cgg tgc aga gea Leu Pro Pro Ala Arg Cys Arg Ala 710 gcg ctg gaa acc igc aac ccc cag Ala Leu GI u Thr Cys Asn Pro Gin 725 gtg íca gag ccc age tea tgc aca Vai Ser Glu Pro Ser Ser Cys Thr 740 gee ttg gag aac gag acc tgt gtg Ala Leu Glu Asn Glu Thr Cys Vai 755 gct cca gtg acl gag ggg cct ggc Ala Pro Vai Thr Glu Gly Pro Gly

Gin Ala Arg Lys Glu Leu Vai 640 645 cag cag cca cca gcg tgg cca Gin Gin Pro Pro Ala Trp Pro 655 660 cct ccc tac tgg gcg gtg gga

Pro Pro Tyr Trp Ala Vai Gly 670 675 tgt ggg ggc ggc ctg cgg gag

Cys Gly Gly Gly Leu Arg GIu 685 690 cag ggc age ctc ctg aag aca

Gin Gly Ser Leu Leu Lys Thr 700 705 ggg gee cag cag cca gct gtg

Gly Ala CIn Gin Pro Ala Vai 715 . 720 ccc tgc cct gee agg tgg gag Pro Cys Pro Ala Arg Trp Glu 730 735 tea gct ggi gga gea ggc ctg

Ser Ala Gly Gly Ala Gly Leu 745 750 cca ggg gea gat ggc ctg gag

Pro Gly Ala Asp Gly Leu Glu 760 765 ícc gta gat gag aag ctg cct

Ser Vai Asp Glu Lys Leu Pro 1980 2025 Ξ070 2115 2160 2205 2250 2295 2340 84 770 gcc cct gag ccc 'tgt gLc ggg atg

Ala Pro Glu Pro Cys Vai Gly Mel 785 cat cíg gat gcc acc tct gca ggg

His Leu Asp Ala Thr Ser Ah Gly 800 ggc age ate agg acg ggg gel caa

Gly Ser lie Arg Thr Gly Àía Gin 815 gcg gca ggg ícg tgc tcc gtc tcc

Ala Ala Gly Ser Cys Ser Vai Ser 830 ctg cgt ttc ctg tgc atg gac tct

Leu Arg Phe Leu Cys Met Asp Ser 845 gaa gag cíg tgt ggc ctg gca age

Glu Giu Leu Cys Gly Leu Ala Ser 860 gtc tgc cag gct gtc ccg tgc cct

Vai Cys Gin Ala Vai Pro Cys Pro 875 gcg gcc tgc age gtg age tgt ggg

Ala Ala Cys Ser Vai Ser Cys Gly 890 ctg tat tgt gcc cgg gcc cat ggg

Leu Tyr Cys Ala Arg Ala His Gly 905 775 780 tea tgt cct cca ggc tgg ggc Ser Cys Pro Pro Gly Trp Gly 790 795 gag aag gct ccc tcc cca tgg Glu Lys Ala Pro Ser Pro Trp 805 810 gct gca cac gtg tgg acc ccl Ala Ala His Vai Trp Thr Pro 820 825 tgc ggg cga ggt ctg atg gag Cys Gly Arg Gly Leu Met Glu 835 840 gcc ctc agg gtg cct gtc cag Ala Leu Arg Vai Pro Vai Gin 850 855 aag cct ggg age cgg cgg gag Lys Pro Gly Ser Arg Arg Glu 865 870 gct cgg tgg cag tac aag ctg Ala Arg Trp Gin Tyr Lys Leu 880 885 aga ggg gtc gtg cgg agg ate Arg Gly Vai Vai Arg Arg lie 895 900 gag gac gat ggt gag gag ate Glu Asp Asp Gly Glu Glu Ile 915 2385 2430 2475 2520 2565 2610 2655 2700 2745 910 85 ctg ttg gac acc cag tgc cag ggg ctg cct cgc ccg gaa ccc cag 2790 Leu Leu Asp Tbr Gin Cys Gin Gly Leu Pro Arg Pro Glu Pro Gin 920 925 930 gag gcc tgc age ctg gag ccc tgc cca cct agg tgg aaa gtc atg 2835 Gin AJa Cys Ser Leu Glu Pro Cys Pro Pro Arg Trp Lys Vai Met 935 940 945 tcc ctí ggc cca tgt tcg gcc age tgt ggc cti ggc act gct aga 2880 Ser Leu Gly Pro Cys Ser Ala Ser Cys Gly Leu Gly Thr Ala Arg 950 955 960 Cgc tcg glg gcc tgt gíg cag ctc gac caa ggc cag gac gtg gag 2925 Arg Ser Vai Ala Cys Yal Gin Leu Asp Gin Gly G3n Asp Vai Glu 965 970 975 gtg gae gag gcg gcc tgt gcg gcg ctg gtg cgg ccc gag gcc agt 2970 Vai Asp Glu Ala Ala Cys Ala Ala Leu Vai Arg Pro Glu Ala Ser 9B0 985 990 gtc ccc tgt ctc att gcc gac tgc acc tac cgc tgg cat gtt ggc 3015 Vai Pro Cys Leu Ile Ala Asp Cys Thr Tyr Arg Trp His Vai Gly 995 1000 1005 acc tgg atg gag tgc tei gtt tcc tgt ggg gat ggc ate cag cgc 3060 Thr Trp Met Glu Cys Ser Vai Ser Cys Gly Asp Gly ile Gin Arg 1010 1015 1020 cgg cgt gac acc tgc ctc gga ccc cag gcc cag gcg cct gtg cca 3105 Arg Arg Asp Thr Cys Leu Gly Pro Gin Ala Gin Ala Pro Vai Pro 1025 1030 1035 gct gat ttc tgc cag cac ttg ccc aag ccg gtg act gtg cgt ggc 3150 Ala Asp Phe Cys Gin His Leu Pro Lys Pro Vai Thr Vai Arg Gly 1040 1045 1050 tgc tgg gct ggg ccc tgt gtg gga cag ggt gcc tgt ggc agg cag 3195 86

Cys Trp Ala G!y Pro C-ys Vai Gly Gin Gly Ala Cys Gly Arg Gin 1055 1060 1065 cac cít gag cca aca gga acc att gac aíg cga ggc cca ggg cag 3240

His Leu Gin Pro Thr Gly Thr lie Asp Met Arg Gly Pro Gly Gin 1070 1075 1080 gca gac igt gca gig gcc att ggg cgg ccc ctc ggg gag gig gtg 3285

Ala Asp Cys Ala Vai Ala Ile Gly Arg Pro Leu Gly Glu Vai Vai 1085 1090 1095 acc ctc cgc gtc cti gag agt tct ctc aac tgc agt gcg ggg gac 3330

Thr Leu Arg Vai Leu Glu Ser Ser Leu Asn Cys Ser Ala Gly Asp 1100 1105 1110 aíg itg cíg ctt tgg ggc cgg ctc acc tgg agg aag atg tgc agg 3375

Met Leu Leu Leu Trp Gly Arg Leu Thr Trp Arg Lys Mei Cys Arg 1115 1120 1125 aag ctg ttg gac atg act tic age tcc aag acc aac acg ctg gtg 3420

Lys Leu Leu Asp Met Thr.Phe Ser Ser Lys Thr Asn Thr Leu Vai 1130 1135 1140 gtg agg cag cgc tgc ggg cgg cca gga ggt ggg gtg ctg ctg cgg 3465

Vai Arg Gin Arg Cys Gly Arg Pro Gly Gly Gly Vai Leu Leu Arg 1145 1150 1155 tat ggg age cag ctt gct cct gaa acc ttc tac aga gaa ígt gac 3510

Tyr Gly Ser Gin Leu Ala Pro Glu Thr Phe Tyr Arg Glu Cys Asp 1160 1165 1170 atg cag ctc ttt ggg ccc tgg ggt gaa ate gtg age ccc teg ctg 3555

Met Gin Leu Phe Gly Pro Trp Gly Glu Ile Vai Ser Pro Ser Leu 1175 1180 1185 agt cca gcc acg agt aat gca ggg ggc tgc cgg ctc ttc att aat 3600

Ser Pro Ala Thr Ser Asn Ala Gly Gly Cys Arg Leu Phe Ile Asn 87 1190 gíg gei ccg cac gca cgg atí Vai Ala Pro His Ala Arg lie 1205 atg gsc gci gg? acc gag gga Met Gly Ala Gly Ihr Glu Gly 1220 cgg gac acc car age ug agg Arg Asp Thr His Ser Leu Arg 1235 gtg ctc tac gag íca gag Vai Leu Tyr Trp GU; Scr G!u 1250 age gag ggc t ic cig aag gei Ser Glu Gly Phe Leu Lys Ala i «vt1 tgg acc ctc caa íca igg gta Trp Thr Leu Gin Ser Trp Vai 1280 tgg aag gua aag íísu gga acc Trp Ly$ Gly Lys Glu Gly Thr 1295 1195 1200 gee ate cat gee ctg gee acc aac Aia 3Le His Ala Leu Ala Thr Asn 1210 1215 gee aat gee age tac ate ttg aíc Ala Asn Ala Ser Tyr Ile Leu lie 1225 1230 acc aca gcg ttc cat ggg cag cag Thr Thr Aia Phe His Gly Gin Gin 1240 1245 age age cag gct gag atg gag ttc Ser Ser Gin Ala Glu Mel Glu Phe 1255 1260 cag gee age ctg cgg ggc cag tac Gin Aia Ser Leu Arg Gly Glu Tyr 1270 1275 ccg gag atg cag gac cct cag tec Pro Glu Met Gin Asp Pro Gin Ser 12S5 1290 3645 3690 3735 37S0 3825 3870 3891 <210> 18 <211> 1378 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 88 set gea ggc ggc ate cta cac ctg gag ctg ctg gtg gee gtg ggc 45 Ala Ala Gly Gly Iíe Leu His Leu Glu Leu Leu Vai Ala Vai Gly 1 5 10 15 ccc gat gtc ttc cag gct cac cag gag gac aca gag ege tat gtg 90 Pro Asp Vai Phe Gin Ala His Gin Glu Asp Thr Glu Arg Tyr Vai 20 25 30 etc acc aac etc aac ate ggg gea gaa ctg ctt cgg gac ccg tcc . 135 Leu Thr Asa Leu Asn Ile Gly Ala Glu Leu Leu Arg Asp Pro Ser 35 40 45 ctg gg z gct cag ttt cgg gtg cac ctg gtg aag atg gtc att ctg 180 leu Gly Ala Gin Phe Arg Vai His Leu Vai Lys Meí Vai Ile Leu 50 55 60 aca gag cct gag ggt gct cca aat ate aca gee aac etc acc teg 225 Thr Glu Pro Glu Gly Ala Pro Asn Ile Thr Ala Asn Leu Thr Ser 65 70 75 tcc ctg ctg age gtc ígt ggg tgg age cag acc ate aac cct gag 270 Ser Leu Leu Ser Vai Cys Gly Trp Ser Gin Thr Ile Asn Pro Glu SO 85 90 gac gac acg gat cct ggc cat gct gac ctg gtc etc tat ate act 315 Asp Asp Thr Asp Pro Gly His Ala Asp Leu Vai Leu Tyr Ile Thr 95 100 105 agg ttt gac ctg gag ttg cct gat ggt aac cgg cag gtg cgg ggc 360 Arg Phe Asp Leu Glu Leu Pro Asp Gly Asn Arg Gin Vai Arg Gly 110 115 120 gtc acc cag. ctg ggc ggt gee tgc tcc cca acc tgg age tgc CÍC 405 Vai Thr Gin Leu Gly Gly Ala Cys Ser Pro Thr Trp Ser Cys Leu 125 130 135 att acc gag gac act ggc ttc gac ctg gga gtc acc att gee cat 450 89

Jle Thr Glu Asp Thr Gly Phe Asp Leu Gly Vai Thr lie Aía His 140 145 150 gag a:‘ ggg cac age ttc ggc ctg gag cac gac ggc gcg ccc ggc 495

Glu I1e Gly His Ser Phe Gly Leu Glu His Asp Gly Ala Pro Gly 155 '160 165 age ggc tgc ggc ccc age gga cac gtg atg gct teg gac ggc gee 540

Ser Giy Cys Gly Pro Ser Gly His Vai Met Ala Ser Asp Gly Ala 170 175 180 gcg ccc ege gee ggc etc gee tgg tcc ccc tgc age ege cgg cag 585

Ala Pro Arg Ala Gly Leu Ala Trp Ser Pro Cys Ser Arg Arg Glu 185 190 195 ctg ctg age ctg etc agg acg ggc gcg ctg cgt gtg gga ccc gee 630

Leu Leu Ser Leu Leu Arg Thr Gly À1a Leu Arg Vai Gly Pro Ala . 200 205 . 210 gcg gee tea acc cgg gtc ege ggg gea ccc gee gga tgc gea gee 675

Ala AU Ser Thr Arg Vai Arg Gly Ala Pro Ala Gly Cys Ala Ala 215 220 225 tgg cci cta cta cag ege caa cga gea gtg ccg cgt ggc ctt cgg 720

Trp Pro Leu Leu Gin Arg Glu Arg Ala Vai Pro Arg Gly Leu Arg 230 235 240 ccc caa ggc ígt ege ctg cac ctt ege cag gga gea cct ggt gag 765

Pro Glu Gly Cys Arg Leu His Leu Arg G!n Gly Ala Pro Giy Glu 245 250 255 íct gee ggc ggt ggc ctg gga ttg gct gtg agg tcc etc ege ate 810

Ser Ala Gly Gly Gly Leu Gly Leu Ala Vai Arg Ser Leu Arg íle 260 265 270 acc cag etc acg tcc ccc caa acg tgc atg gat atg tgc cag gee 855

Thr Gin Leu Thr Ser Pro Gin Thr Cys Met Asp Met Cys Gin Ala 900 90 275 280 285 cíc tcc Ígc cac aca gac ccg ctg gac caa age age tgc age ege Leu Ser Cys His Thr Asp Pro Leu Asp Gin Ser Ser Cys Ser Arg 290 295 300 céc de gtt-cct etc ctg gat ggg aca gaa tgt ggc gtg gag aag Leu Leu Vai Pro Leu Leu Asp Gly Thr Glu Cys Gly Vai G1u Lys 305 310 3j5 tgg tgc tcc aag ggt ege tgc ege tcc ctg gtg gag ctg acc ccc Trp Cys Ser Lys Gly Arg Cys Arg Ser Leu Vai Glu Leu Thr Pro 320 325 330 aia gea gea gtg cat ggg ege tgg tet age tgg ggt Ccc cga agt lie Ala Ala Vai His Gly Arg Trp Ser Ser Trp Gly Pro Arg Ser 335 340 cct tgc tcc ege tcc tgc gga gga ggt gtg gtc acc agg agg cgg Pro Cys Ser Arg Ser Cys Gly Gly Gly Vai Vai Thr Arg Arg Arg 350 355 cag tgc aac aac ccc aga cct gee ttt ggg ggg Cgt gca tgt gtt Gin Cys Asn Asn Pro Arg Pro Ala Phe Gly Gly Arg Ala Cys Vai 365 370 375 ggt gct gac etc cag gee gag atg tgc aac act cag gee tgc gag Gly Ala Asp Leu Gin Ala Glu Met Cys Asn Thr Gin Ala Cys Glu 380 385 390 aag acc cag ctg gag tte atg teg caa cag tgc gcc agg acc gac Lys Thr Gin Leu Glu Phe Met Ser Gin Gin Cys Ala Arg Thr Asp 395 400 405 945 990 1035 1080 1125 1170 1215 ggc cag ccg ctg ege tcc tcc cct ggc ggc gee tcc ttc tac cac Gly Gin Pro Leu Arg Ser Ser Pro Gly Gly Ala Ser Phe Tyr His 410 415 420 1260 1305 91 ígg ggt gct gct gia cca cac age caa ggg gat gct ctg tgc aga Trp GJy Ala Ala Vai Pro His Ser Gin Gly Asp Ala Leu Cvs Arg 425 430 435 cac atg tgc cgg gee att ggc gag age ttc ate atg aag cgt gga His Met Cys Arg Ala lie Gly Glu Ser Phe Ile Met Lys Arg Gly 440 445 450 gac age ttc etc gat ggg acc cgg igt atg cca agt ggc ccc cgg

Asp Ser Phe Leu Asp Gly Thr Arg Cys Met Pro Ser Gly Pro Arg 455 460 465 gag gac ggg acc cig age ctg tgt gtg teg ggc age tgc agg aca

Glu Asp Gly Thr Leu Ser Leu Cys Vai Ser Gly Ser Cys Arg Thr 470 475 4S0 ttt ggc tgt gat ggt agg atg gac tcc cag cag gta tgg gac agg

Phe Gly Cys Asp Gly Arg Met Asp Ser Gin Glu Vai Trp Asp Arg HQC ΛΛΛ Anc Ίυιj *+^0 tgc cag gtg tgt ggt ggg gac aac age acg tgc age cca cgg aag Cys Gin Vai Cys Gly Gly Asp Asn Ser Thr Cys Ser Pro Arg Lys 500 505 510 ggc tei ttc aca gct ggc aga gcg aga gaa tat gtc acg ttt ctg

Gly Ser Phe Thr Ala Gly Arg Ala Arg Glu Tyr Vai Thr Phe Leu 515 520 525 aca gtt acc ccc aac ctg acc agt gtc tac att gee aac cac agg

Thr Vai Thr Pro Asn Leu Thr Ser Vai Tyr Ile Ala Asn His Arg 530 535 540 cct etc ttc aca cac ttg gcg gtg agg ate gga ggg ege tat gtc

Pro Leu Phe Thr His Leu Ala Vai Arg Ile Gly Gly Arg Tyr Vai 545 550 555 gtg gct ggg aag atg age ate tcc cct aac acc acc tac ccc tcc 1350 1395 1440 1485 1530 1575 1620 1665 1710 92

Vai Ala Gly Lys Met Ser IIe Ser Pro Asn Thr Thr Tyr Pro Ser 560 565 570 ctc ctg gag gaí ggt cgt gíc ga? íac aga stE gcc cíc acc gag

Leu Leu Glu Asp Gly Arg Vai Glu ^yr ^rg '^a ^eu Thr ^lu 575 580 585 gac cgg ctg ccc cgc ctg gag gag ale c§c aíc *Sg gga ccc ctc

Asp Arg Leu Pro Arg Leu Glu Glu He Arg I3e Trp Gly Pro Leu 590 595 600 cag gaa gat gct gac ate cag gtt íac a*8 cgg tat ggc gag gag

Gin Glu Asp Ala Asp Iie Gin Vai Tyr Arg Arg Tyr Gly Glu Glu 605 610 615 tat ggc aac ctc acc cgc cca gac ate acc ttc acc tac tic cag

Tyr Gly Asn Leu Thr Arg Pro Asp He Thr Phe Thr Tyr Phe Gin 620 625 630 cct aag cca cgg cag gee tgg glg tgggcc gct gtg cgt ggg ccc

Pro Lys Pro Arg Gin Ala Trp Vai Trp Ala Ala Vai Arg Gly Pro 635 640 645 tgc teg gtg age tgt ggg gea ggg ctg cgc tgg gta aac tac age

Cys Ser Vai Ser Cys Gly Ala Gly Leu Arg Trp Vai Asn Tyr Ser 650 655 660 tgc ctg gac cag gee agg aag gag ttg gtg gag act gtc cag tgc

Cys Leu Asp Gin Ala Arg Lys Glu Leu Vai Glu Thr Vai Glu Cys 665 670 675 caa ggg age cag cag cca cca gcg tgg cca gag gee tgc gtg ctc

Gin Gly Ser Gin Gin Pro Pro Ala Trp Pro Glu Ala Cys Vai Leu 680 685 690 gaa ccc tgc cct ccc tac tgg gcg gtg gga gac ttc ggc cca tgc

Glu Pro Cys ?ro Pro Tyr Trp Ala Vai Gly Asp Phe Gly Pro Cys 1755 1800 1845 1890 1935 1980 2025 2070 2115 93 695 700 705 age gee tcc tgt ggg ggc ggc ctg cgg gag cgg cca gtg ege tgc 2160 Ser Ala Ser Cys Gly Gly Gly Leu Arg Glu Arg Pro Vai Arg Cys 710 715 720 gtg gag gee cag ggc age etc ctg aag aca ttg ccc cca gee cgg 2205 Vai Glu Ala Gin Gly Ser Leu Leu Lys Thr Leu Pro Pro Ala Arg 725 730 735 tgc aga gea ggg gee cag cag cca gct gtg gcg ctg gaa acc tgc 2250 Cys Arg Ala Gly Ala Gin Gin Pro Ala Vai Ala Leu Glu Thr Cys 740 745 750 aac ccc cag ccc tgc cct gee agg tgg gag gtg tea gag ccc age 2295 Asn Pro Gin Pro Cys Pro Ala Arg Trp Glu Vai Ser Glu Pro Ser 755 760 765 tea tgc aca tea gct ggt gga gea ggc ctg gee ttg gag aac gag 2340 Ser Cys Thr Ser Ala Gly Gly Ala Gly Leu Ala Leu Glu Asn Glu 770 775 780 acc tgt gtg cca ggg gea gat ggc ctg gag gct cca gtg act gag 2385 Thr Cys Vai Pro Gly Ala Asp Gly Leu Glu Ala Pro Vai Tiir Glu 785 790 795 ggg ccl ggc tcc gta gat gag aag ctg cct gee cct gag ccc tgt 2430 Gly Pro Gly Ser Vai Asp Glu Lys Leu Pro Ala Pro Glu Pro Cys 800 805 810 gtc ggg atg tea tgt cct cca ggc tgg ggc cat ctg gat gee acc 2475 Vai Gly Mel Ser Cys Pro Pro Gly Trp Gly Hls Leu Asp Ala Thr 815 820 825 tet gea ggg gag aag gct ccc tcc cca tgg ggc age ate agg acg 2520 Ser Ala Gly Glu Lys Ala Pro Ser Pro Irp Gly Ser líe Arg Thr 830 835 840 94 94 ggg gct caa gel gea cac gtg tgg acc Gly Ala Gin Ala Ala His Vai Trp Thr 845 tcc gtc tcc tgc ggg cga ggt ctg atg Ser Vai Ser Cys Gly Arg Gly Leu Met 360 atg gac tc! gcc etc agg σ f a o L o cct gtc Met Asp Ser Ala Leu Arg Val Pro Val S75 ctg gea age aag cct ggg age cgg cgg Leu Ala Ser Lys Pro Gly Ser Arg Arg 890 ccg tgc cct ge: cgg tgg cag tac aag Pro Cys Pro Ala Arg Trp Gin Tyr Lvs 905 age Igt ggg aga ggg gtc gtg cgg agg Ser Cys Gly Arg Gly Vai Val Arg Arg 920 gcc ca! fif*n ee b gag par gat ggí gag gag Ala His Gly Gic Asp Asp Gly Glu Glu 935 tgc cag nnrr ctg cct CPC ccg gaa ccc Cys Gin Gly Leu Γγο Arg Pro Glu Pro 950 gag ccc tgc cca cc! asg tgg aaa gtc Glu Pro Cys Pro Pro Arg Trp Lys Val 965 tcg gcc age tgt ?SC cl i ggc act gct cct gcg gca ggg tcg tgc 2565

Pto Ala Ala Gly Ser Cys 850 855 gag ctg cgt ttc cíg tgc 2610

Glu Leu Arg Phe Leu Cys 865 870 cag gaa gag ctg tgt ggc 2655

Gin Glu Glu Leu Cys Gly 880 885 gag gtc tgc cag gcí gtc 2700

Glu Vai Cys Gin Ala Vai 895 900 cíg gcg gcc tgc age gíg 2745

Leu Ala Ala Cys Ser Vai 910 915 ate ctg lat tgt gcc cgg 2790 lie Leu Tyr Cys Ala Arg 925 930 aic ctg itg gac acc cag 2835

Jle Leu Leu Asp Thr Gin 940 945 cag gag gcc tgc age ctg 2880

Gin Glu Ala Cys Ser Leu 955 960 atg tcc c11 ggc cca tgt 2925

Mel Ser Leu Gly Pro Cys 970 975 aga ege tcg gtg gcc tgt 2970 95

Ser Ala Ser Cys Gly Leu Gly Thr Ala Arg Arg Ser Vai Ala Cys 9S0 985 990 glg cag cic gac caa ggc cag gac gtg gag gtg gac gag gcg gcc 3015 Vai Gin Leu Asp Gin Gly Gin Asp Vai Glu Vai Asp Glu Ala Ala 995 1000 1005 tgt gcg gcg cíg gtg cgg ccc gag gcc agt gtc ccc tgt ctc att 3060 Cys Ala Ala Leu Vai Arg Pro Glu Ala Ser Vai Pro Cys Leu Ile 1010 1015 1020 gcc gac tgc acc tac cgc tgg cat gtt ggc acc tgg atg gag tgc 3105 Ala Asp Cys Thr Tyr Arg Trp His Vai Gly Thr Trp Me t Glu Cys 3025 · 1030 1035 íct gtt icc tgt ggg gaí ggc ate cag cgc cgg cgt gac acc tgc 3150 Ser Vai Ser Cys Gly Asp, Gly Ile Gin Arg Arg Arg Asp Thr Cys 1040 1045 1050 ctc gga ccc cag gcc cag gcg cct gtg cca gct gat ttc tgc cag 3195 Leu Gly Pro Gin Ala Gin Ala Pro Vai Pro Ala Asp Phe Cys Gin 1055 1060 1065 cac ttg ccc aag ccg gtg ací gtg cgt ggc tgc tgg gct ggg ccc 3240 His teu Pro Lys Pro Vai Thr Vai Arg Gly Cys Trp Ai a Gly Pro 1070 1075 1080 tgt gtg gga cag ggt acg ccc age ctg gtg ccc cac gaa gaa gcc 3285 Cys Vai Gly Gin Gly Thr Pro Ser Leu Vai Pro His Glu Glu Ala 1085 1090 1095 gct gct cca gga cgg acc aca gcc acc ccí gct ggt gcc tcc ctg 3330 Ala Ala Pro Gly Arg Thr Thr Ala Thr Pro Ala Gly Ala Ser Leu 1100 1105 1110 gag tgg tcc cag gcc cgg ggc ctg ctc tíc tcc ccg gct ccc cag 3375 Glu Trp Ser Gin Ala Arg Gly Leu Leu Phe Ser Pro Ala Pro Gin 96 ] 115 1120 1125 cci cgg cgg ctc ctg ccc ggg ccc

Pro Arg Arg leu Leu Pro Gly Pro 1130 ag; gce tgt ggc agg cag cac ctt

Ser Ala Cys Gly Arg Gin His leu 1145 ate ega ggc cca ggg cag gca gac

Met Arg Gly Pro Gly Gin Ala Asp 1160 ccc cIc ggg gag gtg gtg acc cíc

Fro leu Gly Glu Vai Vai Thr Leu 1175 cag gaa aac tca gtg cag tcc

Gin Glu Asn Ser Vai Gin Ser 1135 1140 gag cca aca gga acc att gac

Glu Pro Thr Gly Thr Ile Asp 1150 1155 tgt gca gtg gcc att ggg cgg

Cys Aja Vai Ala Ile Gly Arg 1165 Π70 cgc gíc ctt gag agt íct ctc

Arg Vai Leu Glu Ser Ser Leu USO 1185 3420 3465 3510 3555 flíic tgc agi gcg ggg gac atg fíg cíg cíí ígg ggc cgg crc acc Asa Cys Ser Ala Gly Asp Met Leu Leu Leu Trp Gly Arg Leu Thr 1190 1195 1200 3645 tgg agg aag aíg tgc agg aag ctg ttg gac atg act ttc age tcc Trp Arg Lys Met Cys Arg Lys Leu Leu Asp Met Thr Phe Ser Ser 1205 1210 1235 3690 aag acc aac acg ctg gtg gtg agg cag cgc tgc ggg cgg cca gga Lys Thr Asn Thr Leu Vai Vai Arg Gin Arg Cys Gly Arg Pro Gíy 1220 1225 1230 3735 ggt ggg gtg ctg ctg cgg tat ggg age cag ctt gcí cct gaa acc Gly Giy Vai Leu Leu Arg Tyr Gly Ser Gin Leu Ala Pro Glu Thr 1235 1240 1245 37S0 ttc tac aga gaa tgt gac atg cag ctc ttt ggg ccc tgg ggt gaa Phe Tyr Arg Glu Cys Asp Met Gin Leu Phe Gly Pro Trp Gly Glu 1250 1255 1260 97 97 acg agt aat gea ggg ggc 3825 Thr Ser Asn Ala Gly Gly 1270 1275 cac gea cgg att gee ate 3870 His Ala Arg Ile Ala Ile 1285 1290 ggg acc gag gga gee aat 3915 Gly Thr Glu Gly Ala Asn 1300 1305 cac age ítg agg acc aca 3960 His Ser Leu Arg Thr Thr 1315 1320 tgg gag tea gag age age 4005 Trp Glu Ser Giu Ser Ser 1330 1335 ttc ctg aag gct cag gee 4050 Phe Leu Lys Ala Gin Ala 1345 1350 caa tea tgg gta ccg gag 4095 Gin Ser Trp Vai Pro Glu 1360 1365 aag gaa gga acc 4134 lys Glu Gly Thr 1375 ate gtg age ccc icg ctg agt cca gee I1e VaJ Ser Pro Ser Leu Ser Pro Ala 1265 tgc cgg etc ttc atí aat gtg gct ccg

Cys Arg leu PUe Ile Asn Vai Ala Pro 1280 cat gee ctg gee acc aac atg ggc gct

His Ala Leu Ala Thr Asn Met Gly Ala 1295 gee age tac ate ttg ate cgg gac acc

Ala Ser Tyr He Leu lie Axg Asp Tlir 1310 gcg ttc cat ggg cag cag gtg etc tac

Ala Phe Pis Gly Gin GIb Vai Leu Tyr 1325 cag gct gag atg gag ttc age gag ggc

Gin Ala Giu Met GJu Phe Ser Glu Gly 1340 age clg cgg ggc cag tac tgg acc etc

Ser Leu Arg Gly Gin Tyr Trp Thr Leu 1355 atg cag gac cct cag tcc tgg aag gga

Met Gin Asp Pro Gin Ser Trp Lys Gly 1370

<210> 19 <211> 1322 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 98 gct gca ggc ggc ate cta cac ctg gag ctg ctg gtg gee gtg ggc 45 Ala Ala Gly Gly Ile Leu Hi s Leu Glu Leu Leu Vai Ala Vai Gly 1 5 10 15 ccc gat gtc ttc cag gct cac cag gag gac aca gag ege tat gtg 90 Pro Asp Vai Phe Gla Ala His Gin Glu Asp Thr Glu Arg Tyr Vai 20 25 30 c tc acc aac ctc aac ate ggg gca gaa ctg ctt cgg gac ccg tcc 135 Leu Thr Asn Leu Asn lie Gly Ala Glu Leu Leu Arg Asp Pro Ser 35 40 45 ctg ggg gct cag ttt cgg gtg cac ctg gtg aag arg gtc att ctg 180 Leu Giy Ala Gin Phe Arg Vai His Leu Vai Lys Me t Vai Ile Leu 50 55 60 aca gag cct gag ggi gct cta aat ate aca gee aac ctc acc teg 225 Thr Glu Pro Glu Gly Ala Pro Asn Ile Thr Ala Asn Leu Thr Ser 65 70 75 tcc ctg ctg age gtc tgt ggg tgg age cag acc ate aac cct gag 270 Ser Leu Leu Ser Vai Cys Gly Trp Ser Gin Thr Ile Asn Pro Glu 80 85 90 gac gac acg gat cct ggc cat gct gac ctg gtc ctc tat ate act 315 Asp Asp Thr Asp Pro Gly His Ala Asp Leu Vai Leu Tyr Ile Thr 95 100 105 agg ttt gac ctg gag tíg cct gat ggt aac cgg cag gtg cgg ggc 360 Arg Phe Asp Leu Glu Leu Pro Asp Gly Asn Arg Gin Vai Arg Gly 110 115 120 gtc acc cag ctg ggc ggt gee tgc tcc cca acc tgg age tgc ctc 405 Vai Thr Gin Leu GIv Gly Ala Cys Ser Pro Thr Trp Ser Cys Leu 99 99 265 125 att acc gag gac act ggc ítc gac ctg He Thr Glu Asp Thr Gly Phe Asp Leu 140

Sag att ggg cac age ítc ggc ctg gag Glu 11e Gly His Ser Phe Gly Leu Glu 155 age ggc tgc ggc ccc age gga cac gtg Ser Gly Cys Gly Pro Ser Gly His Vai 170 seg ccc ege gee ggc etc gee tgg tcc Ala Pro Arg Ala Gly Leu Ala Trp Ser 185 ctg ctg age ctg etc agg acg ggc gcg Leu Leu Ser Leu Leu Arg Thr Gly Ala 200 gcg gee tea acc cgg gtc ege ggg gea Ala Ala Ser Thr Arg Vai Arg Gly Ala 215 tgg cct ela cta cag ege caa cga gea Trp Pro Leu Leu Gin Arg Gin Arg Ala 230 ccc caa ggc tgt ege ctg cac ctt ege Pro Gin Gly Cys Arg Leu His Leu Arg 245

Ict gee ggc ggt ggc ctg gga ttg gct Ser Ala Gly Gly Gly Leu Gly Leu Ala 260 135 ®tc acc att gee caí 450

Vai Thr Ile Ala His 150 gac Seg ccc ggc 495

Asp Gly A)a Pro Gly 165 gct teg gaC ggC gCC 540

Ala Ser Asp Gly Ala 180 tgc age ege cgg cag 585

Cys Ser Arg Arg Glu 195

est gtg gga ccc gee 63Q

Arg Vai Gly Pro Ala 210 gee gga tgc gea gee Ala Gly Cys Ala Ala 225 ccg cgt ggc ctt cgg Pro Arg Gly Leu Arg 240 gga gea cct ggt gag Gly Ala Pro Gly Glu 255 agg tcc ele ege ate Arg Ser Leu Arg Ile 270 855 100 acc cag cíc Thr Gin Leu ctc tcc tgc Leu Ser Cys ctc clc gtt Leu Leu Vai tgg tgc tcc Trp Cys Ser ata gca gca I1e Ala Ala cct tgc tcc Pro Cys Ser cag tgc aac Gin Cys A$n ggt gct gac Gly Ala Asp aag acc cag Lys Thr Gin ggc cag ccg acg tcc ccc Thr Ser Pro 275 cac aca gac His Thr Asp 290 cct cíc ctg Pro Leu Leu 305 aag ggí cgc Lys Gly Arg 320 gtg cat ggg Vai His Gly 335 cgc tcc tgc Arg Ser Cys 350 aac ccc aga A$n Pto Arg 365 ctc cag gcc Leu Gin Ala 380 ctg gag ttc Leu Glu Phe 395 ctg cgc tcc caa acg tgc Gin Thr Cys ccg ctg gac Pro Leu Asp gat ggg aca Asp Gly Thr tgc cgc tcc Cys Arg Ser cgc tgg tct Arg Trp Ser gsa gga ggt Gly Gly Gly cci gcc ttt Pro Ala Phe gag atg tgc Glu Meí Cys atg ícg caa Met Ser Gin tcc cct ggc atg gatMet Asp 280 caa age Gin Ser 295 gaa tgt Glu Cys 310 ctg gtg Leu Vai 325 age tgg Ser Trp 340 gtg gtc Vai Vai 355 ggg ggg Gly Gly 370 aac act Asn Thr 385 cag tgc Gin Cys 400 ggc gcc atg tgc Met Cys age tgc Ser Cys ggc gtg Gly Vai gag ctg Glu Leu ggt ccc Gly Pro acc agg Thr Arg cgt gca Arg Ala cag gcc Gin Ala gcc agg Ala Arg tcc ítc cag gcc Gin Ala 285 age cgc Ser Arg 300 gag aag Glu Lys 315 acc ccc Thr Pro 330 cga agt Arg Ser 345 agg cgg Arg Arg 360 tgt gtt Cys Vai 375 tgc gag Cys Glu 390 acc gac Thr Asp 405 cac cac 900 945 990 1035

10SO {125 1170 1215 1200 101

Gly Gin Pro Leu Arg Ser Ser Pro Gly Gly Ala Ser Phe Tyr His 410 415 .420 tgg ggt gei gel gia cca cac age caa ggg gat gct ctg tgc aga 1305 Trp Gly Ala Ala V?J Pro His Ser Gin Gly Asp Ala Leu Cys Arg 425 430 435 cac atg ígc cgg gee ati ggc gag age ttc. ate atg aag cgt gga 1350 His Met Cys Arg Ai a lie Giy Glu Ser Phe Ile Met Lys Arg Gly Π0 445 450 gac age íle c:c gat figg acc cgg tgt atg cca agt ggc ccc cgg 1395 Asp Ser Phe Leu Asp Gly Thr Arg Cys Met Pro Ser Gly Pro Arg 455 460 465 gag gac ggg acc ctp age clg tgi glg teg ggc age Igc agg aca 1440 Glu Asp Gly Thr Leu Ser Leu Cys Va! Ser Gly Ser Cys Arg Thr 4 iO 475 480 tu ggc tgl pai ggt atg gac tcc cag cag gta tgg gac agg ι λ rt - Phe Gly Cys Asp Gly Arg Met Asp Ser Gin Gin Vai Trp Asp Arg 4 ST 490 495 Igc cag gtg ;Sl roí C*C« t ggg gac aac age acs tsc age cca cgg aag 1530 Cys Gín Vai Cys Gly Giy Asp Asn Ser Thr Cys Ser Pro Arg Lys 500 505 530 ggc t c I lie aca gel ggc aga gcg aga gaa ta! gíc acg itt ctg 1575 Gly Ser Phe Thr Ala Giy Arg Ala Arg Giu Tyr Vai Thr Phe Leu 515 520 525 aca g!.! acc cc: tl lC c:g acc agt gíc lac att gee aac cac agg 1620 Thr Vai Thr Pro Asn Leu Thr Ser Vai Tyr íle Ala Asn His Arg 53 C 535 540 cct ctc ítc aca cac Mg gcg gtg agg ate gga ggg ege tat gtc 1665 Pro Leu Plie Thr His Leu Ala Vai Arg Ϊ le Gly Giy Arg Tyr Vai 102 545 550 555 gtg gci ggg aag atg age ate tcc ccí aac acc acc tac ccc tcc 1710

Vai Ala Gly Lys Met Ser lie Ser Pro Asn Thr Thr Tyr Pro Ser 560 565 570 ctc ctg gag gat ggt cgt gtc gag tac aga gtg gee etc acc gag 1755

Leu Leu Glu Asp Gly Arg Vai Glu Tyr Arg Vai Ala Leu Thr Giu 575 580 585 gac cgg ctg ccc ege ctg gag gag ate ege aíc tgg gga ccc ctc 1800

Asp Arg Leu Pro Arg Leu Glu Glu ile Arg lie Trp Gly Pro Leu 590 595 600 cag gaa gat gct gac ate cag gtt tac agg cgg tat ggc gag gag 1845

Gin Glu Asp Ala Asp Ile Gin Vai Tyr Arg. Arg Tyr Gly Glu Glu 605 610 615 tat ggc aac ctc acc ege cca gac ate acc ttc acc tac ttc cag 1890

Tyr Gly Asn Leu Thr Arg Pro Asp Ile Thr Phe Thr Tyr Phe Gin 620 625 630 cct aag cca cgg cag gee tgg gtg tgg gee gct gtg cgt ggg ccc 1935

Pro Lys Pro Arg Gin Ala Trp Vai Trp Ala Aia Vai Arg Gly Pro 635 640 645 tgc teg gtg age tgt ggg gea ggg ctg ege tgg gia aac tac age 1980

Cys Ser Vai Ser Cys Gly Ala Gly Leu Arg Trp Vai Asn Tyr Ser 650 655 660 tgc ctg gac cag gee agg aag gag tíg gtg gag act gtc cag tgc 2025

Cys Leu Asp Gin Ala Arg Lys Giu Leu Vai Glu Thr Vai Gin Cys 665 670 675 caa ggg age cag cag cca cca gcg tgg cca gag gee tgc gtg ctc 2070

Gin Gly Ser Gin Gin Pro Pro Ala Trp Pro Glu Ala Cys Vai Leu 680 685 690 103 gaa ccc tgc cct ccc tac tgg gcg gtg gga gac ttc ggc cca tgc U1 l; Pro Cys Pro Pro Tyr Trp Ala Vai Glv Asp Phe Gly Pro Cys 695 700 705 age gee lec tgt ggg ggc ggc ctg cgg gag cgg cca gtg ege tgc

Ser Ala Ser Cys Gly Gly Gly Leu Ârg Glu Arg Pro Va] Arg Cys 710 715 720 gtg gag gee cag ggc age c!c ctg aag aca ítg ccc cca gee cgg Vai Glu Ala Gin Gly Ser Leu Leu Lys Thr Leu Pro Pro Ala Arg 725 730 735 igc aga gea ggg gee cag cag cca gct gtg gcg ctg gaa acc tgc Cys Arg Aía Gly Ala Gin Gin Pro Ala Vai Ala Leu Glu Thr Cys 740 745 750 aac ccc. cag ccc tgc cct gee agg tgg gag gtg íca gag ccc age

Asn Pro Gin Pro Cys Pro Ala Arg Trp Glu Vai Ser Glu Pro Ser 755 760 765 tea tgc aca tea gct ggt gga gea ggc ctg gee tig gag aac gag

Ser Cys Thr Ser Ala Gly Gly Ala Gly Leu Ala Leu Glu Asn Glu 770 775 780 acc tgt gtg cca ggg gea gat ggc ctg gag gct cca gtg act gag

Thr Cys Vai Pro Gly Ala Asp Gly Leu Glu Ala Pro Vai Thr Glu 785 790 795 ggg cct ggc tcc gta gat gag aag ctg cct gee cct gag ccc tgt

Gly Pro Gly Ser Vai Asp Glu Lys Leu Pro Ala Pro Glu Pro Cys 800 £05 810 gíe ggg atg tea tgt cct cca ggc tgg ggc cat ctg gat gee acc

Vai Gly Mei Ser Cys Pro Pro Gly Trp Gly His Leu Asp Ala Thr 815 820 825 tet gea ggg gag aag gct ccc tcc cca tgg ggc age ate agg acg 2115 2160 2205 2250 2295 2340 2385 2430 2475 2520 104

Ser Ala Gly Glu Lys Ala Pro 830 ggg gct caa gct gca cac gtg

Gly Ala Gin Ala Ala His Vai 845 tcc gtc tcc tgc ggg cga ggt

Ser Vai Ser Cys Gly Arg Gly 860 atg gac tct gcc ctc agg gtg

Met Asp Ser Ala Leu Arg Vai 875 ctg gca age aag cct ggg age Leu Ala Ser Lys Pro Gly Ser 890 λλπ Inn λιπ + rr#i + λt-rrr t <-rft rtnrr l£l ul, í ^¾¾

Pro Cys Pro Ala Arg Trp Gin 905 age tgt ggg aga ggg gtc gtg Ser Cys Gly Arg Gly Vai Vai 920 gcc caí ggg gag gac gat ggt Ala His Gly Glu Asp Asp Gly 935 tgc cag ggg ctg cct ege ccg Cys Gin Gly Leu Pro Arg Pro 950 gag ccc tgc cca cct agg tgg Glu Pro Cys Pro Pro Arg Trp

Ser Pro Trp Gly Ser 835 tgg acc cct gcg gca Trp Tíir Pro Ala Ala 850 ctg atg gag ctg cgt Leu Met Glu Leu Arg 865 cct gtc cag gaa gag Pro Vai Gin Glu Glu 880 cgg cgg gag gtc tgc Arg Arg Glu Vai Cys 895 t ΛΛ riflíT ή t ÍT ΙΤΛ fT ιΤΛ Λ lql ang 1.1¾. Tyr Lys Leu Ala Ala 910 cgg agg ate ctg tat Arg Arg Ile Leu Tyr 925 gag gag aíc ctg ttg Glu Glu Ile Leu Leu 940 gaa ccc cag gag gcc Glu Pro Gin Glu Ala 955 aaa gtc atg tcc ctt Lys Vai Met Ser Leu I le Arg Thr 840 ggg teg tgc 2565 Gly Ser Cys S55 ttc ctg tgc 2610 Phe Leu Cys 870 ctg tgt ggc 2655 Leu Cys Gly 885 cag gct gtc 2700 Gin Ala Vai 900 tgc dgC gtg 0 7 A r L\ΗΌ Cys Ser Vai 915 tgt gcc cgg 2790 Cys Ala Arg 93.0 gac acc cag 2835 Asp Thr Gin 945 tgc age ctg 2880 Cys Ser Leu 960 ÉsEC cca tgt 2925 Gly Pro Cys 965 105 965 105 tcg gcc age tgt ggc clt ggc act Ser Ala Ser Cys Gly Leu Gly Thr 930 gtg cag ctc gac caa ggc cag gac Vai Gin Leu Asp Gin Gly Gin Asp 995 tgt gcg gcg ctg gtg cgg ccc gag Cys Ala Ala Leu Vai Arg Pro Glu 1010 gcc gac ígc acc tac ege tgg cat Ala Asp Cys Thr Tyr Arg Trp His 1025 tct gtt tc.c tgt ggg gat ggc ate Ser Vai Ser Cys Gly Asp Gly Ile 1040 ctc gga ccc cag gcc cag gcg cct Leu Gly Pro Gin Ala Gin Ala Pro 1055 cac ttg ccc aag ccg gtg act gtg His Leu Pro Lys Pro Vai Thr Vai 1070 tgt gtg gga cag ggt gcc tgt ggc Cys Vai Gly Gin Gly Ala Cys Gly 1085 gga acc at t gac atg cga ggc cca GJy Thr Ile Asp Met Arg Gly Pro 970 975 gct aga ege Ecg gtg gcc tgt Ala Arg Arg Ser Val Ala Cys 985 990 gtg gag gtg gac gag gcg gcc Vai Glu Val Asp Glu Ala Ala 1000 1005 gcc agt gtc ccc tgt ctc att Ala Ser Val Pro Cys Leu lie 1015 1020 glt ggc acc tgg atg gag tgc Val Gly Thr IrD Met Glu Cys 1030 3035 cag ege cgg cgt gac acc tgc Gin Arg Arg Arg Asp Thr Cys 1045 1050 gíg cca gct gat tlc tgc cag Val Pro Ala Asp Phe Cys Gin 1060 1065 cgt ggc tgc tgg gct ggg ccc Arg Gly Cys Trp Ala Gly Pro 1075 1080 agg cag cac ctt gag cca aca Arg Gin His Leu Glu Pro Thr 1090 1095 ggg cag gea gac tgt gea gtg Gly Gin Ala Asp Cys Ala Val 1105 1110 3235 2970 3015 3060 3105 3150 3195 3240 3330 1100 106 gcc att ggg cgg ccc ctc ggg gag gíg gtg acc ctc cgc gtc ctt

Ala líe Gly Arg Pro Leu Gly G]u Vai Vai Thr Leu Arg Vai Leu 1115 1120 1125 gag agt tcí ctc aac tgc agt gcg ggg gac alg ttg ctg ctt igg

Glu Ser Ser Leu Asn Cys Ser Ala Gly Asp Met Leu Leu Leu Trp 1130 1135 1140 ggc cgg ctc acc tgg agg aag atg tgc agg aag ctg ttg gac atg

Gly Arg Leu Thr Trp Arg Lys Met Cys Arg Lys Leu Leu Asp Met 1145 1150 1155 act ttc age tcc aag acc aac acg ctg gíg gtg agg cag cgc tgc

Thr Phe Ser Ser Lys Thr Ase Thr Leu Vai Vai Arg Gin Arg Cys 1160 1165 1170 ggg cgg cca gga ggt ggg gtg ctg ctg cgg tat ggg age cag ctt

Gly Arg Pro Gly Gly Gly Vai Leu Leu Arg Tyr Gly Ser Gin Leu 1175 1180 1185 gct cct gaa acc ttc tac aga gaa tgt gac atg cag ctc ttt ggg Ala Pro Glu Thr Phe Tyr Arg Glu Cys Asp Met Gin Leu Phe Gly 1190 1195 1200 ccc tgg ggt gaa ate gtg age ccc teg ctg agt cca gcc acg agt

Pro Trp Gly Glu Ile Vai Ser Pro Ser Leu Ser Pro Ala Thr Ser 1205 1210 1215 aat gea ggg ggc tgc cgg ctc ttc att aat gtg gct ccg cac gea

Asn Ala Gly Gly Cys Arg Leu Phe Ile Asn Vai Ala Pro His Ala 1220 1225 1230 cgg att gcc ate cat gcc ctg gcc acc aac atg ggc gct ggg acc

Arg Ile Ala Ile His Ala Leu Ala Thr Asn Met Gly Ala Gly Thr 1235 1240 1245 gag gga gcc aat gcc age tac ate ttg ate cgg gac acc cac age 3375 3420 3465 3510 3555 3600 3645 3690 3735 3780 107

Glu Gly Ala Asn Ala Ser Tyr lie Leu 1250 ttg agg acc aca gcg ttc cat ggg cag Leu Arg Thr Thr Ala Phe His Gly Gin 1265 tea gag age age cag gct gag atg gag Ser Glu Ser Ser Gin Ala Glu Met Glu 1280 aag gct cag gee age ctg cgg ggc cag Lys Ala Gin Ala Ser Leu Arg Gly G3n 1295 tgg gta ccg gag atg cag gac cct cag Trp Vai Pro Glu íiet Gin Asp Pro Gin 1310 lie Arg Asp Thr His Ser 3 255 1260 cag gtg etc tac tgg gag 3825 Gin Vai Leu Tyr Trp Glu 1270 1275 ttc age gag ggc ttc ctg 3870 Phe Ser Glu Gly Phe Leu 3285 1290 tac tgg acc etc caa tea 3915 Tyr Trp Thr Leu Gin Ser 1300 1305 ícc tgg aag gga aag gaa 3960 Ser Trp Lys Gly Lys Glu 1315 1320 3966 gga acc Gly Thr

<210> 20 <211> 312 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 ctg gag ctg ctg gtg gee gtg ggc 45 Leu Glu Leu Leu Vai Ala Yal Gly 10 15 cag gag gac aca gag ege tat gtg 90 Gin Glu Asp Thr Glu Arg Tyr Vai 25 30 gct gca ggc ggc ate cta cac Ala Ala Gly Gly He Leu His 1 5 ccc gat gtc ttc cag gct cac Fro Asp Vai Phe Gin Ala His 20 108 cíc acc aac ele ciíiC ate ggg gea gaa ctg cit ê3C cc© tcc 135 Leu Thr Asn Leu ;\$!J lie Gly Ala Glu Leu Leu Arg Asp Pro Ser 35 40 45 ctg ggg gct cag LU cgg gtg cac ctg gtg aag atg gtc att ctg Leu Gly Ala Gin Phe Arg Vai His Leu Vai Lys Uet Vai Ile Leu 180 50 55 60 aca gag CCl gag hfll set cca aat ate aca gee aac ctc acc teg Thr Glu Pro Glu Gly Ala Pro Asn Ile Thr Ala Asn Leu Thr Ser 225 65 70 75 tcc ctg ctg agr gtc tgt ggg tgg age cag acc ate aac cct gag 270 Ser Leu Lei Ser Vai Cys Gly Trp Ser Gin Thr lie Asn Pro Glu 80 85 90 gac gac acg sa: cct ggc cat gct gac ctg gtc ctc íâi ate act 315 Asp Asp Tlir Asp Pr:. Gly His Ala Asp leu Val Leu Tyr Ile Thr í*õ 100 105 agg tit gac Ctç gag ttg cct gat ggt aac cgg cag gtg cgg ggc <ϊβΛ Arg Phc Asp Leu Glu Leu Pro Asp Gly Asn Arg Gin Val Arg Gly nu 115 120 gtc acc cag ctg ggc ggí gee tgc tcc cca acc tgg age tgc ctc 405 Vai Thr (.In Lee Gly Gly Ala Cys Ser Pro Thr Trp Ser Cys Leu 125 130 135 ait acc ÇJg gac ac: ggc lie gac ctg gga gtc acc att gee cat 450 íle Thr Glu Asp Thr Gly Phe Asp Leu Gly Val Thr Ile Ala His 140 145 150 gag atí oho cac cgC t :r ggc ctg gag cac gac ggc gcg ccc ggc 495 Glu rie Gly His Ser l'he Gly Leu Glu His Asp Gly Aía Pro Gly !55 160 165 age ggc ígc ggc ccc ESC gga cac gtg aíg gct teg gac ggc gee 540 585 109 585 109 Ser Gly Cvs GIv Pro Ser Gly His Vai Met Ala Ser Asp Gly Aia 170 175 180 gcg ccc cgc gcc ggc ctc gcc tgg tcc ccc tgc age cgc cgg cag Ala Pro Arg Ala Giv Leu Ala Trp Ser Pro Cys Ser Arg Arg Gin 185 190 195 ctg ctg age ctg ctc agg acg ggc gcg ctg cgt gtg gga ccc gcc Leu Leu Ser Leu Leu Arg Thr Gly Ala Leu Arg Vai Gly Pro Ala 200 205 210 gcg gcc tea acc cgg gtc cgc ggg gea ccc gcc gga tgc gea gcc Ala Ala Ser Thr Arg Vai Arg Gly Ala Pro Ala Gly Cys Ala Ala 215 220 225 tgg cct cta cta cag cgc caa cga gea gtg ccg cgt ggc ctt cgg Trp Pro Leu Leu Gin Arg Gin Arg Aia Vai Pro Arg Gly Leu Arg 230 235 240 ccc caa ggc igt cgc ctg cac cít cgc cag gga gea cct gga tat Pro Gb Gly Cys Arg Leu His Leu Arg Gin Gly Ala Pro Gly Tyr 245 250 2u5 gtg cca ggc cct ctc ctg cca cac aga ccc gct gga cca aag cag Vai Pro Gly Pro Leu Leu Pro His Arg Pro Ala Gly Pro Lys Gin 260 265 270 ctg cag ceg cct cct cgt tcc tei cct gga tgg gac aga atg tgg Leu Gin Pro Pro Pro Arg Ser Ser Pro Gly Trp Asp Arg Met Trp 275 280 285 cgt gga gaa gtg gtg ctc caa ggg teg ctg ccg ctc cct ggt gga Arg Gly GIu Vai Vai Leu Gin Gly Ser Leu Pro Leu Pro Gly Gly 290 295 300 gct gac ccc cat age age agt gea tgg gcg ctg gtc Ala Asp Pro His Ser Ser Ser Ala TrP Ala Leu Vai 305 310 675 630 ?20 765 810 855 900 <210> 21 936 110 110 100

<211> 270 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 gel gca ggc ggc ate ela cac ctg gag

Ala Aia Gly Gly 11e Leu His Leu Glu 1 5 ccc gai gtc ttc cag gct cac cag gag

Pro Asp Vai Phe Gin Ala His Gin Glu 20 cic acc aac ctc aac ate ggg gca gaa

Leu Thr Asn Leu Asn I1e Gly Ala Glu Λ r 00 cig ggg gel cag ttt cgg gtg cac ctg

Leu Giy Ala Gin Phe Arg Vai His Leu 50 aca gag cct gag ggt gct cca aal ate

Thr Glu Pro Glu Gly Ala Pro Asn I1e 65 :cc ctg ctg age gtc tgt ggg Egg age

Ser Leu leu Ser Vai Cys Gly Trp Ser 80 sac gac acg gat cct ggc cat gct gac

Asp Asp Thr Asp Pro Gly His Ala Asp 95 ctg gtg gee gtg ggc 45

Leu Vai Ala Vai Gly 15 aca gag ege tat gtg 90

Thr Glu Arg Tyr Vai 30 cít cgg gac ccg tcc 135

Leu Arg Asp Pro Ser 45 aag atg gtc att ctg 180

Lys Met Vai ITe Leu 60 gee aac ctc acc teg 225

Ala Asn Leu Thr Ser 75 acc ate aac cct gag 270

Thr Ile Asn Pro Glu 90 gtc ctc tat ate act 315

Vai Leu Tyr Ile Thr 105 111 agg ttt gac ctg gag ttg cct gat ggt aac cgg cag gtg cgg ggc 360 Arg Phe Asp Leu Glu Leu Pro Asp Gly Asn Arg Gin Vai Arg Gly 110 115 120 gtc acc cag ctg ggc ggt gee tgc tcc cca acc tgg age tgc de 405 Vai Thr Gin Leu Gly Gly Ala Cys Ser Pro Thr Trp Ser Cys Leu 135 130 135 att acc gag gac act ggc ttc gac ctg gga gtc acc att gee cat 450 Ile Thr Glu Asp Thr Gly Phe Asp Leu Gly Vai Thr Ile Ala His 340 145 150 gag att ggg cac age ttc ggc ctg gag cac gac ggc gcg ccc ggc 495 Glu Ile Gly His Ser Phe Gly Leu Glu His Asp Gly Ala Pro Gly 155 160 165 age ggc tgc ggc ccc age gga cac gtg atg gct teg gac ggc gee 540 Ser Gly Cys Gly Pro Ser Gly His Vai Me t Ala Ser Asp Gly Ala 170 175 180 C^O ccc ege gee ggc etc gee tgg tcc ccc tgc age ege cgg cag 585 Ala Pro Arg Ala Gly Leu Ala Trp Ser Pro Cys Ser Arg Arg Gin 185 190 195 ctg ctg age ctg etc aga ccc gtc cct ccg teg ccg etc cct ctg 630 Leu Leu Ser Leu Leu Arg Pro Vai Pro Pro Ser Pro Leu Pro Leu 200 205 210 ctg gee acc cac etc tgc gee ggc agg age ctt agt ctt ggt ccc 675 Leu Ala Thr His Leu Cys Ala Gly Arg Ser Leu Ser Leu Gly Pro 215 220 225 age caa gag ccg gct cet ggt ggg ggg ege ggg ccg aga act CCt 720 Ser Gin Glu Pro Ala Pro Gly Gly Gly Arg Gly Pro Arg Thr Pro 230 235 240 gtt ccc act cac aaa agg cca ege ttc caa acg ctt cca tcc teg 765 810 112

VaJ Pro Thr His Lys Arg Pro Arg Pbe Gin Thr Leu Pro Ser Ser * 245 250 255 tgc cca cíc cíc cgt ccc gcc tcc tcc cgg tgí aca ccc cgg gac

Cys Pro Leu Leu Arg Pro Ala Ser Ser Arg Cys Tlir Pro Arg Asp 260 265 270

<210> 22 <211> 43 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 22 43

ggactcgagc caccaatgca ccagcgtcac ccccgggcaa gat <210> 23 <211> 45 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 23 45

tccgtcgact cattatcagg ttccttcctt tcccttccag gactg <210> 24 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 24 ggttggcaat gtagacactg gtcaggttgg 30

<210> 25 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 25 ccaacctgac cagtgtctac attgccaacc 30

<210> 26 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 26 113 113 ctttccacct aggtgggcag <210> 27 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 27 gcctggagcc ctgcccacct <210> 28 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 28 tcgagaaaaa gtctacgggg <210> 29 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 29 agcttaaaaa cctaggcccc <210> 30 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 30 tcggccatgg ccgcaggcgg <210> 31 <211> 28 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 31 ggcaagctta tcagcggggc <210> 32 <211> 564 <212> RN A <213> Homo sapiens gcctaggttt tta 33 cgtagacttt ttc 33 ggctccaggc 30 aggtggaaag 30 catcctacac 30 gcggcgcc 28 114 <400> 32 ccaíggccgc aggcggcatc ctacacctgg agctgctggt ggccgtgggc cccgatgtct 60 iccaggctca ccaggaggac acagagcgct atgígctcac caacctcaac aícggggcag 120 aactgcítcg ggacccgtcc ctgggggclc agttlcgggt gcaccíggtg aagatggica 180 ítctgacaga gcctgagggt gctccaaata tcacagccaa cctcacctcg tccctgcíga 240 gcgíctgtgg gtggagccag accatcaacc ctgaggacga cacggatcct ggccatgctg 300 acctggtcct ctaiatcact aggtttgacc tggagttgcc tgalggtaac cggcaggígc 360 ggggcgtcac coagct-gggc ggígcctgct ccccaacctg gagctgcctc attaccgagg 420 acactggclt cgacctggga gtcaccattg cccatgagat tgggcacagc ttcggcctgg 480 agcacgacgg cgCRCccggc agcggctgcg gccccagcgg acacgtgatg gcttcggacg 540 gcgccgcgcc ccscigaiaa gctt S64

<210> 33 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 115

Mct Ala Ala Gly (i]y Me Leu His Leu Glu Leu Leu Vai Ala Vai 1 5 10 .15

Giy Pro Asp Vai Lhe Gin Ala His Gin GJu Asp Thr Glu Arg Tyr 20 25 30

Vai Leu Thr Asn Leu Asn lie Gív Ala Glu Leu Leu Arg Asp Pro c.r, 40 45

Ser Leu Gly Ala Gin Plie Arg Vai His Leu Vai Lys Met Vai Ile 50 55 60

Leu Thr Glu Pro Glu Gly Ala Pro Asn Ile Thr Ala Asn Leu Thr fo 70 75

Ser Ser Leu Leu Ser Vai Cys Gly Trp Ser Gin Thr Ile Asn Pro S0 85 90

Glu Asp Asp Thr Asp Pro Gly His Ala Asp Leu Vai Leu Tyr Ile 95 100 105

Thr Arg Phc Asp Leu Glu Leu Pro Asp Gly Asn Arg Gin Vai Arg 110 115 120 116

Gly Vai Thr Gin Leu Gly Gly Ala Cys Ser Pro Thr Trp Ser Cys 125 130 135 Leu Ile Thr Glu Asp Thr Gly Phe Asp Leu Gly Vai Thr Ile Ala 140 145 150 His Glu Ile Gly His Ser Phe Gly Leu Glu His Asp Gly Ala Pro 155 160 165 Gly Ser Gly Cys Gly Pro Ser Gly His Vai Meí Ala Ser Asp Gly 170 175 180

Ala Ala Pro Arg 185

<210> 34 <211> 2529 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 34 atgagccagc tttgcctgtg gttgacgtgc cagcctígtt atgcigtcag 50 tgtcagagga atcctcactg gtgccatctt cattcígggc tgcígggggc 100 íctcigactt ccagaagagt cttctícaag atctggagcc caaggatgtg 150 tcttcttact ítggccacca tgclgctcca ttcacaggcc atcctcccíc 200 ícficcíccag agactgagac ggagaaggac tttggaggac attctgcacc 250 tggaactcct ggtagctgtg ggccccgatg tttcccgggc tcatcaggag 300 gacacagaac gctacglgct caclaatctc aatatcgggt cagaactgtt 350 gagaaaccca tcccígggag tccagtícca ggígcacctg gtgaagctaa 400 tcaccctctc tgacícagag agtactccga atatcacggc caacaícacc 450 tcatcctiga tgagcgtcíg cgagtggagc cagacgatca acccccacga 500 tgacagggai. ccaagtcacg ctgacctgat tctctataíc accagcaacg 550 tggctggígc cactgtcctí gtgattcatt ttctcttate aaggtttgac 600 117 ciggagttgc ctgarggcaa ccagcaggtí cggggtgtca cccagctggg agfitgcctgc tccctttcct ggagttgcct tatcactgag gaíactggct Ligacciggg ggtcaccaíc gcccatgaga ítgggcacag cttcgggctg gaccatgatg gtgctccagg tagtggcagc acctgcaagg ccagtggcca cglgalggcg gctgatggcg caacacctac tggagggacc ctggagtggt ctsccificag ccaaaggcag ttgcagcacc tactcagcac agggcaaatg caciECttcc aggacccacc tgggctgcag tcaggactta cacggcacca gctgaiggca cagcctggcc íctactacag tgcagaígat cagígccgtg tggc:ttcgg ttctggggct gtcgccigca ccttctccag ggagggtctg aacnragcac Lcagiggtcc ttccaccttg atccigtccg cagaccccíg ccagaagicc tggaiggctc ctgaagctct caaaitcícc ííctccacca aaiccgacat ciggictctg ggctgcatca ttctagacaí ggccacttgc tccilcctga acgacacaga agccatgcaa cígcggaagg ccatccgcca Icaiccaggc agcctgaagc ccatcctgaa aaccatggag gagaagcaaa tcceíggíac agaígtctac tatttgcítc tgcccttcat gtlgcatatc aacrcctccg atcgacíggc aatcaaggat gtgaígcaag tcaccttcat gagcaucicc ttcaaaagct cctctgttgc gctgaatatg cagcggcaga aggtccccat cttcatcací gacgtgctgc ttgaaggcaa catggccaac aicitaggtg atggcagctg gctgtgtgct tcctttgtga acgacagcag gcactgtgac tcagggattg gctcgcagag acttgggttt gattttcagt cagiclctlg gacagagcac cctctgaaag aígtcatgca gaatttctcc agtcgaccag aggíccagct cagagccaít aacaagttgt tgacaaígcc agaggaixag ctagcactgg caaaggaccc agaagctgag atcccaagga geagttigaí catctccttc ctgatggata ccttgcggag ccatcctaac íctgaaaggc llgtíaatgt ggtctacaac gtgcttgcca ttatttccag ccaagsacag atctcagaag agciggaaga ggaggggttg ttícagcttg cccaagagaa ccíggagcac ttccaagagg acagggacat ctgccíctct aicctgagcc tgctctggtc cctcctggta gatgtígtca ctgtggacaa 117 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400 1450 1500 1550 1600 1650 1700 1750 1800 1850 1900 1950 2000 118 agagcccttg gagcagcict ctggcatggt caccígggtg ctggciacÈc 2050 atccggagga cgtggaaata gcagaggcíg gctgtgcggt gctctggctg 2100 ctgtccttgt tgggctgcat aaaggagagt cagítlgagc aggtggíagt 2150 gcígcíccíg agaagcatcc agctgtgccc tggcagagía ctgctggtga 2200 acaatgcatí ccgtggcttg gccagcctcg caaaggtgtc cggcccaccc 2250 tcacagtíag agccaaatga ctgggtatcc agccccagcc cccítttgtg 2300 gaatcagaga cttcactatg igaacaagca aaagctgttc atgcctclgt 2350 gggígctgag gcaagagcac cctcattaci gcígígciaa ígaccctaca 2400 tcagagcaca tccaggcagí actaagtgga cíaaaígggt ttgaaaagaa 2450 gcacagtígt gtggaatctt gtgtggaatg íggctgcagg cagcaggaga 2500 agaatagagg aggagcccca gggatitga 2529

<210> 35 <211> 2514 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 35 aggaagctcc caagagtaaa cactgcctga tgaacaitgc acactaacca gaatcccagt catcaactgc ctíttciaaa gatgagccag ccagccitgt tatgcigtca gtgtcagagg tcaitclggg ctgclggggg ctctctgact gatctggagc ccaaggatgt gtctícttac attcacaggc catccíccct ctcacctcca ctttggagga cattctgcac cíggaacícc gttlcccggg ctcatcagga ggacacagaa caatatcggg tcagaactgi tgagaaaccc agglgcacct ggígaagcta atcacccíct tgtcccgccc agccagcaag 50 l cactagggct cctgtccggc 100 ctttgccigt ggttgacgtg 250 aatcctcact ggtgccatct 200 tccagaagag tcttcttcaa 250 tttggccacc atgcígctcc 300 gagaetgaga cggagaagga 350 tggtagctgt gggccccgai 400 cgctacglgc tcactaaíct 450 atcccíggga gíccagttcc 500 ctgactcaga gagtaclccg 550 119 aatatcacgg ccaacaícac ctcatccitg atgagcgtct gcgagtggag 600 ccagacgaic aacccccacg atgacaggga tccaagicac gcigacctga 650 ítctctatat caccaggítt gaccíggagt tgcctgatgg caaccagoag 700 gtícggggtg tcacccagct gggagglgcc ígctcccttt cctggagttg 750 ccítaicact. gaggatactg gctttgacct gggggtcacc atcgcccatg 800 agaítgggca cagcttcggg ctggaccatg aíggtgcícc aggíagtggc 850 agcacctgca aggccagtgg ccacgtgatg gcggctgatg gcgcaacacc 900 tactggaggg accctggagt ggícígcctg cagccaaagg cagtígcagc 950 acctactcag cacagggcag atgcactgct tccaggaccc accígggctg 1000 cagtcaggac ttacacggca ccagctgatg gcacagcctg gcctctacta 1050 cagtgcagat gaícagtgcc gtgíggctít cggttctggg gctgtcgcct 1100 gcaccttctc cagggagggt ctggatgtat gccaggccct gtcctgccac 1150 acagaccccc tggaccaaag cagctgcagc cgccfcctig ttcctctcct 1200 ggatgggaca ggatgíggtg tggagaagtg gtgctccaag gctcgcígtc 1250 gcícccíage ígagctggcí cctgtggcíg cagíacatgg acactggteí 1300 agcíggggcc cccatagtcc ctgctcccga tcctgtggag gaggtgtgat 1350 taccaggagg cggtggtgca acaaccccag gcctgcattt gggggacgtg 1400 caígtgtggg tgaagacctc caggctaaga tgtgcaacac gcaggcttgt 3450 gagaagactc agclggagít catgtccgag cagígtgccc agacagacag 1500 acaaccactg caactttccc aaggcactgc ctccítctac cactgggatg 1550 ctgctgtgca gtatagtcaa ggagataccc tgtgcagaca catgtgctgg 1600 gctgttggag aaagct tcat tgicagccgt ggggacaggí tcctagatgg 1650 gacccgítgt gtgccaagtg gtccccagga tgatgggacc ctaagcctct 1700 git.fgtrggg cagctgcagg accíitggct gtgatggcag gaíggacícc 1750 cagaaggttt gggatgcgtg ccaggtgtgt ggaggagaca acagcaccig 1800 cagctcacgg aatggttctt ícacagctgg gagagccaga gaaíatgíca 1850 cgttcctgat tgtiactccc aacatgacca acgcacacat tgtcaaccgc 1900 aggcctctci tcacacacU ggcggtgagg atccagggcc actacaitgt 1950 120 ggcagggaag actagcatct cacccaacac aggactaccg tgtggaatac agagígactc cacttagagg agattcacat ccggggaccc tcaggígtac agacgaíatg gaggagaata acatcacctt ttcctactti caactgaagc accgciaagc gtggacccig ctcagigagc ggtgacctac agcígccagg atcaagcíca cccagtgcca agggagccca cagccacctg tctgccccct gcíccccata ttgggtagct cgtgtctígt ggcgggggcc ttcgggagcg cccaagatgg cttcttaaag acactgccac gcccagcagc cagc

<210> 36 <211> 3512 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 36 aggaagctcc oaagagtaaa cactgcctga tgaacatígc acactaacca gaatcccagt caícaactgc cíítíctaaa gatgagccag ccagcctrgt taígctgtca gtgtcagagg Icattctggg ctgctggggg ctctctgact gaíctggagc ccaaggaígí gtcttcttac attcacaggc catcctccct cícacctcca ctttggagga cattctgcac ctggaactcc gtttcccggg ctcatcagga ggacacagaa cacc t accc t tcccttctgg 2000 tcactgagga ccagctgccc. 2050 gtccgggatg acaítgagat 2100 tggggatctt acacacccag 2150 agcaggcagc ctgggtaigg 2200 tgiggggcag ggctgcgctg 2250 agacaagtgg gíaaagaacg 2300 catggcaaga gcctigígtc 2350 ggggactíca gcccatgiag 2400 gtcactgcgc tgigtagaga 2450 ctgcccggtg cagagcagta 2500 2514 tgtcccgccc agccagcaag 50 cactagggct cctgtccggc 100 ctttgcctgt ggítgacgtg 150 aaícctcact ggtgccalct 200 tccagaagag tcUcttcaa 250 tltggccacc atgctgcícc 300 gagactgaga cggagaagga 350 íggtagctgt gggecccgat 400 cgctacgígc tcactaatct 450 121 caatatcggg tcsgaaclgt tgagaaaccc atccctggga gtccagttcc 500 aggtgcacct ggtgaagcta atcaccctct cígactcaga gagtactccg 550 aatatcacgg ccaacatcac ctcatccttg atgagcgtct gcgagtggag 600 ccagacgatc aacccccacg atgacaggga tccaagtcac gctgaccíga 650 ttctcUtat caccaggttt gacctggagt tgccígaígg caaccagcag 700 gticggggtg ícacccagct gggaggígcc tgctccctil cctggagitg 750 ccttatcact gaggatactg gctttgaccí gggggtcacc atcgcccaíg SOO agatlgggca cagcttcggg ctggaccatg atggigctcc aggtagtggc 850 agcacctgca aggccagtgg ccacgtgatg gcggcígacg gcgcaacacc 900 cactggaggg accctggagt ggtctgcctg cagccaaagg cagttgcagc 950 acctactcag cacagggcaa atgcactgct tccaggaccc acctgggctg 1000 cagtcaggac ttacacggca ccagctgatg gcacagcctg gcctctacta 1050 cagígcagat gatcagtgcc gtgtggcttt cggttctggg gctgtcgcct Π00 gcacçttctc cagggagggt ctggatgtat gccaggccct gtccígccac 1150 acagacceci iggaccaaag cagctgcagc cgcctcclíg ttccíctect 1200 ggatgggaca gaatgtggtg tggagaagtg gtgctccaag gcicgctgtc 1250 gctccctagc tgagctggct cctgtggctg cagtacatgg acacíggíct 1300 agcíggggcc cccatagtcc ctgctcccga tcctgtggag gaggígígat 1350 taccaggagg cggiggtgca acaaccccag gcctgcattí gggggacgtg 1400 catgtgtggg tgaagacctc caggctaaga tgtgcaacac gcaggcttgt 1450 gagaagactc agctggagtt catgtccgag cagigtgccc agacagacag 1500 acaaccactg caactttccc aaggcactgc ctccttctac cactgggaíg 1550 ctgctgtgca gíatagtcaa ggagaiaccc íglgcagaca catgígctgg 1600 gctgítggag aaagctical tgtcagccgt ggggacaggt tcctagatgg 1650 gacccgttgt gtgccaagtg glcctcagga tgatgggacc ctaagcctct 1700 gtttgttggg cagctgcagg acctttggct gtgatggcag gatggactcc 1750 cagaaggttt gggatgcgtg ccaggtgtgt ggaggagaca acagcacctg 1800 cagctcacgg aatggtíctt tcacagctgg gagagccaga gaatatgtca 1850 122 cgttcctgat igttacíccc aacatgacca acgcacacat tgtcaaccgc 1900 aggcctcícL Icacacaclt ggcggigagg atccagggcc actacattgt 1950 ggcagggaag acíagcaict cacccaacac caccíacccí ícccttctgg 2000 aggaclaccg igiegaatac agagígactc tcaclgagga ccagctgccc 2050 cacttagagg agaucacat ccggggaccc giccgggatg acattgagat 2100 tcaggtgtac agacgaiatg gaggagaaía tggggatctí acacacccag 2150 acatcacci: i:cciac:li caactgaagc agcaggcagc cígggíatgg 2200 accgciaagc gigçaccclg ctcagtgagc tgiggggcag ggctgcgctg 2250 ggtgacc.ac agcigccagg atcaagctca agacaagtgg gtaaagaacg 2300 cccagigccá agggagccca cagccaccíg catggcaaga gccttgiglc 2350 tcigcecccí gciccrcaia Ugggíagcl ggggacltca gcccatgtag 2400 cgigictig; ggrgçgggcc ttcgggagcg gtcacigcgc tgtgtagaga 2450 cccaagaiRg ciuiiaaag acacígccac cígcccggtg cagagcagía 2500 gcctagcagc caçeagcaga agtggaaaac ígcaaciccc agccctgtcc 2550 caccaggigc gaggigícag acccíggccc ttgcaígcca tctgcctgtg 2600 aggcaggicl ggaiícaagg aatgtgacai gtgigiccag ggcgggtgac 2650 ccggagaasc c.igaaaclgc aggcccctgc cgcaccgacg agatgtcagc 2700 iaígclggag rrcigcicca ggagcctgíg ttciccaggc ttgggtcagg 2750 iggnraacac catgictctg ggcgaggagg ciccaícccc ggtgggcagt 2800 gacaae::ca« g«gc:cnçgc tgagcatgtg tggaccccít tggtggggct 2850 glgciccaic irtí?:ggsa gaggtcígaa gsaactgtaí ttcctgtgca 2900 tggalictv:: cctcaaaaíg cctgtccagg aagagclatg cggcttggct 2950 agíaaecccc raa.occssle S&aggtctgc agggctcgcc cclgtcclgc 3000 icggigpgEp a-"tcaagict tggcaccgtg cccggtgacc tglggtgggg 3050 ggcgagigL-c ac:?;c‘.gtt cgítglgtgc agcíagaccg tggccacccg 3100 alatctg-ae cicaciccaa gigctcgcca gigcctaagc caggctcctt 3150 cgaggactgc agcrcigagc cítgtcctgc iagggcacta gtglgggaag 3200 ccgcccccar. aticgccgic acaagatggc gctgacatcc tgtgitctaa 3250 123 gtíggiaaac aaataatctg cgcatgagec aagggtaíít acgactactt 3300 gtactctgtt tttcccgtga acgícagctc ggccatgggc tgcagccaat 3350 cagggagtga tgcglcctag gcaattgítg ttctctítta aatagaaggg 3400 gtíícgtttt tctctitttc ttgcitctta caclctggcc ccaaaaagat 3450 gtaagcaata aagciíígcc gtaggaaaaa aaaaaaaaaa ggatccggta 3500 cctctagatc ag 3512

<210> 37 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37

Phe Ser Pro Ala Pro Gin Pro Arg Arg Leu Leu Pro Gíy Pro Gin 15 10 15 GIu Asn Ser Vai Gin Ser Ser 20

<210> 38 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 38 30

atgtgcaaca ctcaggcctg cgagaagacc <210> 39 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 39 ccaacctgac <210> 40 <211> 21 <212> ADN <213> Homo <400> 40 cagtgtctac attgccaacc 30 sapiens 124 ctggagccct gcccacctag 21

<210> 41 <211> 62 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 41 gccgtcgaci cltatcactt atcgtcatcg tccttgtagt cttgcgacat gaactccagc 60 * c Q 62 <210> 42 <211> 62 <212> ADN <213> Homo <400> 42 sapiens gccgtcgaci cttatcactí atcgtcatcg tccttgtagt ccaggítggg ggtaactgtc 60 ag 62 <210> 43 <211> 62 <212> ADN <213> Homo <400> 43 sapiens gccgtcgaci cttatcactí atcgtcatcg tccttgtagt ccacgtgtgc agcttgagcc 60 cc 62 <210> 44 <211> 62 <212> ADN <213> Homo <400> 44 sapiens gccgtcgaci cttatcactt atcgtcatcg tccttgtagt ccctaggtgg gcagggctcc 60 ag 62

<210> 45 <211> 62 <212> ADN 125 <213> Homo sapiens <400> 45 gccgtcgact ctiaicactt alcgtcatcg tccttgtagt caccctgtdc cacacagggc 60 cc 62

<210> 46 <211> 60 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 46 tccaagcttg tcgactctta tcacttatcg tcatcgtcct tgtagtcggt tccttccttt 60

<210> 47 <211> 27 <212> ADN <213> Sequencia artificial <220>

<223> Descrição da Sequência artificial: Sintética: AND

Sintético <400> 47 gactacaagg acgatgacga taagtga 27

<210> 48 <211> 8 <212> RPT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da Sequência artificial: Sintética <400> 47

Asp Tyr Lys Αερ Asp Asp Asp Lys ! 5 126

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente citados na descrição • JP 2000508918 A [0005][0007[0020] • JP 2001061479 A, Soejima [0005][

Literatura não relacionada com patentes citada na descrição • Furlan et al. Blood, 1996, vol. 87, 4223-4234 [0005] [0007] [0020] • Tsai et al. Blood, 1996, vol. 87, 4235-4244 [0005] [0007] • Current Protocols in Molecular Biology, Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH [0024] • ANTIBODY ENGINEERING [0024] [0104] • Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual [0024] • Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH [0024] • ANTIBODY ENGINEERING second [0024] • Gluzman et al. Cell, 1981, vol. 23, 175 [0053] • H. Niwa et al. Gene, 1991, vol. 108, 193-199 [0054] • Okano. J. Neurochem., 1991, vol. 56, 560 [0055] • OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION. CRC Press [0055] • Lee et al. Nucleic Acids Research, 1979, vol. 6, 3073 [0055]· Cooney et al. Science, 1988, vol. 241, 456 [0055] • Dervan et al. Science, 1991, vol. 251, 1360 [0055] 127 • Miller et al. Biotechniques, 1989, vol. 7, 980-990 [0057] • Miller. Human Gene Therapy, 1990, vol. 1, 5-14 [0059] • Nature, 1970, vol. 227, 680-685 [0084] • Molecular Cloning. 9.52-9.55 [0090] • Molecular Cloning. 1.25-1.28 [0092] • Niwa, H. et al. Gene, vol. 108, 193-199 [0096] • Gerritsen et al. Blood, 2001, vol. 98, 1654-1661 [0097] • Soejima et al. J. Biochem. Tokyo, 2001, vol. 130, 269-277 [0099]

• Current Protocols in Molecular Biology. immunology, Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH

[0104]

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um ADN que codifica uma protease que é capaz de clivar uma ligação entre os resíduos Tyr-842 e Met-843 do factor de von Willebrand (vWF), que compreende uma sequência de nucleótidos como mostrado na SEQ ID NO: 6.

2. Um ADN que codifica uma protease que é capaz de clivagem de uma ligação entre os resíduos Tyr-842 e Met-843 do vWF, que compreende uma sequência de nucleótidos como mostrado na SEQ ID NO: 15.

3. Um ADN que codifica uma protease que é capaz de clivagem de uma ligação entre os resíduos Tyr-842 e Met-843 do vWF, que compreende uma sequência de nucleótidos como mostrado na SEQ ID NO: 7.

4. Um vector que compreende o ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5. Uma célula transformada ou transfectada com o vector de acordo com a reivindicação 4.

6. Uma célula hospedeira transformada ou transfectada com o vector de acordo com a reivindicação 4.

7. Uma composição farmacêutica que compreende o ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

8. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, para uso em terapêutica genética para o tratamento da púrpura trombocitopénica trombótica (PTT).

9. Um agente de diagnóstico que compreende o ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3.