CZ342698A3

CZ342698A3 - Nové antiangiogenní peptidy, polynukleotidy je kódující a způsoby inhibice angiogeneze

Info

Publication number: CZ342698A3
Application number: CZ983426A
Authority: CZ
Inventors: Donald J. Davidson; Jieyi Wang; Earl J. Gubbins
Original assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1996-05-03
Filing date: 1997-05-05
Publication date: 1999-05-12
Also published as: BR9708911A; DK0910571T3; EP0910571B1; US6057122A; WO1997041824A2; EP0910571A2; DE69733756T2; CN1223690A; ES2246513T3; HUP9903530A2; AU724077B2; AU3060697A; NZ332319A; CZ298260B6; WO1997041824A3; EP1612272B1; CN1152962C; HK1021191A1; US6251867B1; EP1612272A3

Description

Oblast techniky

Vynález spadá do oblasti chemie peptidú. Vynález zvláště popisuje přípravu a použití peptidú, které obsahují aminokyselinové sekvence v podstatě podobné sekvencím odpovídajícím oblastí smyčky 5 savčího plazminogenu, dále se popisují farmaceutické kompozice, které obsahují peptidy, protilátky specifické pro receptor angiostatinu, způsoby detekce a měření angiostatinu, cytotoxická činidla spojená s proteiny angiostatinu a léčba onemocnění, které způsobuje’ nebo zesiluje angiogeneze. >

Dosavadní stav techniky

Angiogeneze je proces tvoření nových krevních cév. Tento proces je nezbytný pro normální tělní aktivity, jako je reprodukce, vývoj a hojení ran. Ačkoli tento proces není zcela objesněn, věří se, že zahrnuje vzájemné působení molekul, které regulují růst endoteliálních buněk (primární buňky krevních kapilár). Za normálních podmínek tyto molekuly udržují po dlouhou dobu mikrovaskularizaci ve stádiu klidu (to znamená netvoří se další kapiláry), což může trvat týdny nebo ve stejných případech dekády. Když je to nezbytné (např. během hojení ran, se tyto buňky začnou rychle množit, přičemž tato změna proběhne během 5 dnů (Folkman, J. and Shing, Y., The Journal of Biological Chemistry, 267 (16), 10931-10934, a Folkman, J. and Klagsbrun, M., Science, 235, 442-447 (1987).

Ačkoli angiogeneze je za normálních podmínek vysoce regulovaný proces, řada onemocnění (které jsou charakterizovány ‘jako angiogenní onemocnění) se řídí trvalou neregulovanou. angiogeneží. Jinak řečeno neregulovaná angiogeneze může buď způsobit určité onemocnění přímo nebo • * · • * · zhoršit existující patologické podmínky. Například oční neovaskularizace se uvádí, jako jeden z nejběžnějších důvodů slepoty a dominuje přibližně při 20 onemocnění očí. Při určitých onemocnění, jako je artritida, se v kloubech tvoří nové krevní kapiláry, jenž poškozují chrupavku. Při cukrovce se nové kapiláry tvoří v sítnici, prorůstají do sklivce, krvácejí a způsobují slepotu. Růst a metastázy pevných nádorů také závisí na angiogenezi (Folkman, J., Cancer research, 46, 467-473 (1986), Folkman, J., Journal of the National Cancer Institute, 82, 4-6 (1989). Ukázalo se například, že nádory, které dosahují velikosti větší než 2 mm, musí mít svůj vlastni přívod krve a proto indukují růst nových krevních kapilár. Jestliže uvedené nové krevní cévy jednou v nádoru vzniknou,. je to způsob jak nádorové buňky vstupují do krevního systému a metastázují ve vzdálených místech, jako jsou játra, plíce nebo kostí (Weidner, N., et al., The New England Journal of Medicíně, 324 (1): 1-8 (1991)).

Do dnešní doby se popsalo a charakterizovalo několik přirozeně se vyskytujících angiogenních faktorů (Fidler, J.I. and Ellís, L. M., Cell, 79: 185-189 (1994)). O'Reilly et al·., izoloval a čistil ze séra a moče myší, které nesou nádor, protein o molekulové hmotnosti 38 000, jenž inhibuje proliferaci endoteliálních buněk (O'Reilly, M., et al., Cell, 79: 315-328 (1994) a Mezinárodní přihláška WO 95/29242, zveřejněná 2. listopadu 1995). Mikrosekvenční analýza uvedeného endoteliálního inhibitoru vykazuje 98 % sekvenční homologii s interním fragmentem myšího plazminogenu. Angiostatin, jak se pojmenoval myší inhibiční fragment, je peptid, který zahrnuje první čtyři smyčkové oblasti myšího plazminogenu. Fragment peptidu ze stejné oblasti lidského plazminogenu (to znamená, že obsahuje smyčky 1 až 4) také silně inhibuje proliferaci endoteliálních buněk kapilár in vitro a in vivo. Neporušený plazminogen, ze kterého se * * .”· · · · ·· » . » »·· » · ·· ϊ · · * ·· · »· ·«· · · · ·* uvedený peptidový fragment získal, nevykazuje tak silný inhibiční účinek.

V současné době se vyvíjí několik inhibitorů angiogeneze za účelem použití při léčbě angiogenního onemocnění (Gasparini, G. and Harris, A. L., J. Clin. Oncol., 13 (3):

765-782, (1995)), ale existuje jedna ' nevýhoda, která je spjata s těmito látkami. Suramin je například silný inhibitor angiogeneze, ale způsobuje u lidí silnou systémovou toxicitu, když se aplikuje v dávkách, které jsou nutné při protinádorové aktivitě. Látky jako jsou retinoidy, interferony a antiestrogeny jsou pro lidi bezpečné, ale mají slabé angiogenní účinky. Příprava jiných látek je stále obtížná nebo drahá.

Proto ' je nutné získat látky pro léčbu angiogenních onemocnění u savců. Přesněji je nutné získat inhibitory angiogeneze, které jsou bezpečné při léčebném použití a které vykazují selektivní toxicitu s ohledem na patologické podmínky, jako je selektivní inhibice proliferace endoteliálních buněk,’ zatímco nevykazují žádný stupeň toxicity nebo nízkou toxicitu k normálním buňkám ( to znamená k nekarcinogenním buňkám). Příprava takových látek by měla být jednoduchá a laciná.

Podstata vynálezu

Ve svém základním provedení vynález popisuje látku obsahující smyčku 5 peptidu, která je reprezentována strukturálním vzorcem A-B-C-X-Y (I) nebo její farmaceuticky přijatelnou solí, esterem nebo proformou léku, kde není přítomna oblast A nebo jde o skupinu chránící dusík; symbol Y není přítomen nebo jde o skupinu chránící karboxylovou. kyselinu; symbol B není přítomen nebo jde o jeden ze 1 až přibližně 197 přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků, které odpovídají sekvenci z pozice aminokyseliny 334

Φ a do pozice 530 SEQ ID N0:l; C je R¹- R²- R³- R⁴, kde R¹ je lyzylová skupina; R² je leucylová skupina nebo arginylová skupina; R³ je tyrosylová skupina, 3-I-tyrosylová skupina nebo fenylalanylová; R⁴ je aspartylová skupina; a symbol X neni nepřítomen nebo jde o jeden ze 1 až přibližně 12 přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků, které odpovídají sekvenci z pozice aminokyseliny 535 až do přibližně pozice aminokyseliny 546 SEQ ID NO:1 a jejích homologů a analogů.

Vynález také popisuje smyčku 5 peptidové látky reprezentované strukturním vzorcem A-Bi-Ci-Xi-Y (II) nebo její farmaceuticky přijatelnou solí, esterem nebo proformou léku, kde není přítomna oblast A nebo jde o skupinu chránící dusík; symbol Y není přítomen nebo jde o skupinu chránící karboxylovou kyselinu; symbol Bi není přítomen nebo jde o jeden ze 1 až přibližně 176 přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků, které odpovídají sekvenci z pozice aminokyseliny 334 do pozice 513 SEQ ID N0:l; symbol Ch je sekvence od pozice aminokyseliny 514 do pozice aminokyseliny 523 SEQ ID NO: 1, a symbol Xi je nepřítomen nebo jde o jeden ze 1 až přibližně 10 přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků, které odpovídají sekvenci z pozice aminokyseliny 524 až do přibližně pozice aminokyseliny 533 SEQ ID NO:1 a jejích homologů a analogů.

Vynález také zahrnuje způsob léčby pacienta, jenž potřebuje antiangiogenní léčbu, který zahrnuje aplikaci látky obsahující fragment peptidu smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5.

Vynález také- zahrnuje kompozici pro léčbu pacienta, který potřebuje antiangiogenní léčbu. Tato kompozice zahrnuje látku obsahující peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5, receptorové agonisty a antagonisty smyčky 5 a antagonosty smyčky 5 spojené s cytotoxickýmí činidly, buď samotnými nebo v kombinaci s farmaceuticky přijatelným excipientem a/nebo s volitelně uvolňovanými látkami za vzniku terapeutické kompozice.

Vynález dále popisuje kompozici pro léčbu onemocnění vybraných ze skupiny zahrnující rakovinu, artritidu, maskulárni degeneraci a diabetickou retinopatii. Tato kompozice obsahuje peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5.

Vynález také zahrnuje kompozici obsahující izolovanou jednořetezcovou nebo dvouřetězcóvou polynukleotidovou sekvencí, která kóduje peptidový fragment nebo fúzní protein smyčky 5. Vynález také zahrnuje vektor obsahující sekvenci DNA kódující peptidový fragment nebo fúzní protein smyčky 5, kde vektor je schopný exprimovat peptidový fragment smyčky nebo fúzní protein smyčky 5, je-li přítomen v buňce, buňka obsahuje kompozici, jenž začleňuje vektor. Vektor obsahuje sekvenci DNA, kódující exprimovaný peptidový fragment smyčky nebo fúzní protein smyčky 5. Vynález dále zdůrazňuje způsoby genové terapie, přičemž se do pacienta za účelem modifikace in vivo zavede množství smyčky 5 sekvence DNA kódující peptidový fragment smyčky nebo fúzní protein smyčky 5 nebo konjugát peptidového fragmentu smyčky 5.

Vynález také zahrnuje způsob přípravy peptidového fragmentu smyčky 5 zahrnující kroky: (a) vystavení savčího plazminogenu lidské nebo prasečí elastáze v poměru přibližně 1 : 100 až přibližně 1 : 300 za vzniku směsi uvedeného plazminogenu a uvedené elastázy; (b) inkubace uvedené směsi a (c) izolace peptidového fragmentu smyčky 5 z uvedené směsi.

Vynález také zahrnuje způsob přípravy, peptidového fragmentu smyčky 5 obsahující kroky: (a) vystavení savčího plazminogenu lidské nebo prasečí elastáze v poměru elastáza : plazminogen přibližně 1 ; 100 až přibližně 1 : 300 za vzniku směsi uvedeného plazminogenu a uvedené elastázy; (b) inkubace

• ’· · · · *· · · ·«··· ·· · ·· ě · φ * · ·' · ♦ *· * » * b · a * ·« «· ·· ··· ·» uvedené směsi a (c) izolace peptidového fragmentu smyčky 5 z uvedené směsi; (d) vystavení uvedeného proteinového konjugátu peptidového fragmentu smyčky 5 pepsinu v poměru přibližně 1 : 0,2 za vzniku směsi uvedeného pepsinu a uvedeného plazminogenu a (d) izolace uvedeného peptidového fragmentu smyčky 5 ze směsi. V jiném případě peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5 se může připravit způsobem, který obsahuje kroky; (a) izolace polynukleotidu, který kóduje uvedený peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5; (b) klonování polynukleotidu do expresivního vektoru; (c) transformace vektoru do vhodné hostitelské buňky; a kultivace hostitelské buňky za podmínek vhodných pro expresí rozpustného peptidového . fragmentu smyčky 5 nebo fúzního proteinu smyčky 5.

Termín smyčka 5 (K5) znamená oblast savčího plazminogenu, která má tři disulfidové můstky, které se podílejí na specifické třídimenziální konformaci definované oblastí smyčky 5 molekuly savčího plazminogenu. Jeden takový disulfidový můstek se váže na cysteinové zbytky, které se nacházejí v pozicích aminokyselin 462 a 541, druhý můstek se váže na cysteinové zbytky umístěné v pozicích aminokyselin 483 a 524 a třetí se váže na cysteinové zbytky umístěné v pozicích aminokyselin^512 a 536. Na obr. č. 1 (SEQ ID NO: 1) je zobrazena aminokyselinová sekvence celé molekuly savčího plazminogenu (molekula lidského plazminogenu).

Termín fragment peptidů smyčky 5 znamená peptid mezi aminokyselinami 4 a 104 (včetně) s podstatnou sekvenční homologii s odpovídajícím peptidovým fragmentem savčího plazminogenu, jehož α-N-konec se nachází přibližně v aminokyselinové poloze 443 intakthího savčího plazminogenu a α-C-konec je v poloze 546. Celková délka peptidového fragmentu smyčky 5 může být různá v závislosti na způsobu, kterým se peptid smyčky 5 získal nebo se může lišit sekvencí v závislosti na specie, ze kterého se ziskal. Jisté formy peptidových fragmentů smyčky 5 se mohou produkovat proteolytickým štěpením glu-plazminogenu, lys-plazminogenu nebo miniplazminogenu za použití enzymů lidské nebo prasečí elastázy. Když se připravují uvedeným způsobem, a-C-konec peptidových zbytků se nachází okolo aminokyseliny 543 SEQ ID NO; 1, ale α-N-konec aminokyseliny může začínat v pozici aminokyseliny 443, 449 nebo 454. Fragment peptidu smyčky 5, jestliže je výsledek štěpení glu-piazminogenu, lysplazminogenu nebo miniplazminogenu lidskou nebo prasečí elastázou, může mít celkovou délku 101, 95 nebo 90 aminokyselin. Souhrn těchto fragmentů peptidu smyčky 5 je uveden v tabulce č. 1. Když se postupuje shora uvedeným způsobem, získá se směs těchto tří fragmentů, kde přibližně 60 % fragmentů má délku 95 aminokyselin, přibližně 35 % fragmentů má délku 101 aminokyselin a přibližně 5 % fragmentů má délku 90 aminokyselin. Je-li to nutné tyto různé fragmenty se mohou dále čistit na HPLC s obrácenou fází, což je metoda dobře známá v oboru. Nehledě na tyto odlišnosti délky, peptidový fragment K5 podle vynálezu zahrnuje buď sekvenci Lys-Leu-Tyr-Asp ( to znamená z pozice aminokyseliny 531 až do pozice aminokyseliny 534 sekvence SEQ ID NO: 1) nebo Asn-ProAsp-Gly-Asp-Val-Gly-Gly-Pró-Trp {to znamená z pozice aminokyseliny 523 sekvence SEQ ID NO: 1) nebo jeho analogy.

Termín fúzní protein smyčky 5 znamená polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci získanou ze dvou nebo více jednotlivých proteinů, přičemž jeden z nich je peptidový fragment K5. Fúzní protein se tvoří expresí polynukleotidu, jehož kódující sekvence fragmentu peptidu smyčky 5 je spojena s kódující sekvencí jednoho dalšího polypeptidu tak, že v rámci jsou dva (nebo více) čtecích rámců. Preferují se ty fúzní proteiny smyčky 5, kde fragment peptidu smyčky 5 se fúzoval s odpovídající sekvencí lidského plazminogenu, jako • « * ♦

V 4 ·

je smyčka 4 (K4) , smyčky 3 až 4 (K3-4), smyčky 2 až 4 (K2-4) a smyčky 1 až 4 (Kl-4). Preferovaný fúzní protein K5 je tvořen smyčkami 4 až 5 (K4-5). Jiné příklady fúzních proteinů smyčky 5 podle vynálezu zahrnují peptidový fragment K5 nebo K4-5 připojený k biologickému tag. Takové fúzní proteiny mohou nebo nemusí být štěpítelné na jednotlivé proteiny, z kterých se získaly.

Termín konjugát peptidového fragmentu K5 znamená fragment peptidu smyčky K5, který je chemickou cestou spojen s jiným proteinem a tvoří konjugát. Příklady konjugátů peptidových fragmentů smyčky 5 zahrnuje peptidový fragment smyčky 5 spojený s albuminem nebo s peptidovým fragmentem z jiné oblasti smyčky savčího plazminogenu. Molekulové hmotnosti konjugátů peptidových fragmentů smyčky 5 jsou v rozsahu přibližně od 1 000 a 25 000.

Termín podstatná sekvenční homologie znamená přibližně 60 % identitu aminokyselin, preferuje se nejméně přibližně 70 % identita aminokyselin, více se preferuje přibližně 80 % identita aminokyselin, nejvíce se preferuje přibližně 95 % identita aminokyselin odpovídající peptidové sekvence lidského plazminogenu. Sekvence, které vykazují podstatnou sekvenční homologii s lidským plazminogenem, jsou označovány jako homologní. Vedle podstatné sekvenční homologie homology podle vynálezu vykazují podobnou biologickou aktivitu (to znamená anti-angiogenní aktivitu) jako zde popsané fragmenty peptidů K5. Protože aminokyselinové sekvence nebo počet aminokyselin v peptidovém fragmentu smyčky 5 se může lišit v závislosti na specie nebo v závislosti na- metodě, která se použila při produkcí, je obtížné stanovit přesné celkové množství aminokyselin v peptidovém fragmentu smyčky 5. Je-li dáno, že tyto sekvence jsou svými aminokyselinami identické ze 73 %, rozumí se, že aminokyselinová sekvence peptidového fragmentu smyčky 5 je v

* « · · 0 0 ' · • « « · · · ·

0 V 0 «·· 00« «00 · * • 0 000 0« · * podstatě mezi specie podobná a ' že způsoby produkce peptidových fragmentů smyčky 5 poskytují peptidové fragmenty smyčky 5 s podstatnou sekvenční homologií k odpovídajícím aminokyselinovým sekvencím lidského plazminogenu. Obr. č. 2 zobrazuje srovnání aminokyselinové sekvence peptidového fragmentu lidské smyčky 5, která má 95 aminokyselin (SEQ ID NO; 34) se sekvencemi fragmentů smyčky 5 pocházející z plazminogenu myší (SEQ ID NO: 35), opice rhesus (SEQ ID NO; 36), hovězího dobytka (SEQ ID NO: 37) a prasete (SEQ ID NO: 38) .

Vynález dále uvádí sekvence aminokyselinových zbytků, které jsou analogy zde uvedených sekvencí tak, že tyto sekvence (analogy) demonstrují podobnou biologickou aktivitu peptidových fragmentů, smyčky 5-a jejich fúzních proteinů. Je dobře známo, že k modifikacím a změnám může dojít, aniž se podstatně změní biologické funkce takového peptidů. Při takových změnách se mohou provést substituce podobných aminokyselinových zbytků na základě relativní podobnosti substituentů vedlejšího řetězce, např. jejich velikost, náboj, hydrofobicita, hydrofilicita a podobně. Popsané změny se mohou provést zvýšením potence peptidů nebo jeho stability vzhledem k působení enzymů nebo farmakokinetiky. Uvažované sekvence podle vynálezu zahrnují ty analogové sekvence charakterizované změnou sekvence aminokyselinových zbytků nebo typ/ kde změna nemění základní podstatu a biologickou aktivitu dříve zmíněných peptidových fragmentů K5 a/nebo fúzních proteinů.

Peptidový fragment K5 nebo fúzní protein K5 podle vynálezu se může charakterizovat na základě potence,' kdy se testovala jeho schopnost inhibovat růst bovinních kapilárních buněk (BCE) in vitro. Data v tabulce č. 1 a na obr. č. 4 ukazují, že peptidový fragment K5 má sekvenci od pozice aminokyseliny 443 do pozice aminokyseliny 543 SEQ ID NO: 1, «· ··» ť/· což ukazuje na přibližně 300 násobné zvýšení aktivity (to znamená aktivity při inhibicí proliferace buněk BCE) ve srovnání s peptidovým fragmentem, který má sekvenci od pozice aminokyseliny 443 do pozice aminokyseliny 546 sekvence SEQ ID NO: 1 a přibližně 800 násobné zvýšení aktivity ve srovnání s peptidovými fragmenty 1 až 4.

Termín izolovaný znamená, že se materiál odstranil ze svého původního prostředí (např. jestliže jde o přirozeně se vyskytující materiál, pak se odstraňuje' Z přirozeného prostředí). Například přirozeně se vyskytující polynukleotid nebo polynukleotid přítomný v živých organizmech není izolován, ale stejný polynukleotid nebo DNA nebo polypeptid, který se separoval z některého nebo ze všech koexistujících materiálů v přirozeném systému, je izolován. Takový polynukleotid může být součástí vektoru- a/nebo takový polynukleotid nebo polypeptid může být součástí kompozice a stále se může izolovat I když vektor nebo kompozice není částí jeho přirozeného prostředí.

Termín- primer znamená specifickou oligonukleotidovou sekvenci komplementární s cílovou nukleotidovou sekvencí. Primer se používá při hybridizaci s cílovou nukleotidovou sekvencí a slouží jako počáteční bod polymerizace nukleotidů, která je katalyzována buď DNA polymerázou, RNA polymerázou nebo reverzní transkriptázou.

Termín sonda znamená definovaný segment nukleové kyseliny (nebo nukleotidový analogový segment, to znamená PNA), který se může použít k identifikaci specifické DNA přítomné ve vzorcích, které nesou komplementární sekvenci.

Termín rekombinantí polypeptid znamená nejméně polypeptid, který svým původem nebo manipulací není spjat se všemi ani s částí polypeptidů, se kterým je v přírodě spojován a/nebo je spojen jiným polypeptidem, než je ten, se kterým je spojen v přírodě. Není nezbytné, aby rekombinantí ♦ »

Φ · • · φ « φ φ ι»;

Φ Φ φ ··· nebo odvozený polypeptid byl překládán ze sekvence nukleové kyseliny. Toho lze také dosáhnout libovolným způsobem, který zahrnuje chemickou syntézu nebo expresi rekombinatního expresivního systému.

Termín syntetický peptid se zde užívá ve smyslu polymerní formy aminokyselin v libovolné délce, která může být syntetizována chemicky způsoby, které jsou dobře známy v oboru. Tyto syntetické peptidy se mohou použít při různých aplikacích,

Čištěný polynukleotid znamená polynukleotid nebo jeho fragment, který je v podstatě volný, to znamená, že obsahuje méně než 50 %, s výhodou méně než přibližně 70 % a upřednostňuje se méně než přibližně 90 % proteinu, se kterým je- polynukleotid -přirozeně spojen,. .Způsoby čištění polynukleotídů jsou dobře známy v oboru a zahrnují například distribuci buněk obsahujících polynukleotid s chaotropním činidlem a separaci polynukleotidu(ů) a proteinů chromatografií s výměnou iontů, afinitní chromatografií a sedimentaci s ohledem na hustotu. Termín čištěný polypeptid pak znamená polypeptid nebo jeho fragment, který je v podstatě volný, což znamená, že obsahuje méně než 50 %, s výhodou méně než přibližně 70 % a upřednostňuje se méně než přibližně 90 S buněčných komponentů, se kterým -je polynukleotid přirozeně spojen. Způsoby čištění polynukleotídů jsou dobře známy v oboru.

Termín polypeptid indikuje molekulový řetězec aminokyselin a neříká nic o specifické délce produktu. Peptidy, oligopeptidy a proteiny jsou zahrnuty v definici polypeptidu. Tento termín se také vztahuje na post-expresivní modifikace polypeptidu, například glykosylaci, acetylaci, fosforylaci a podobně.

Termín rekombinantí hostitelské buňky, hostitelské buňky, buňky, buněčné linie, buněčné kultury a jiné «9 • · * · ··* takové termíny označující mikroorganizmy nebo buněčné linie vyšších eukaryontů kultivované jako unicelulární entyty znamenají buňky, které mohou být nebo mohou mít nebo se mohou používat jako recipienty rekombinantního vektoru nebo jiné transferované DNA a zahrnují původní progen původní buňky, která se transfekovala.

Termín replikon znamená libovolný genetický element, jako je plazmid, chromozom nebo virus, který se v buňce chová jako autonomní jednotka replikace polynukleotidů.

Termín vektor je replikon, ve kterém se připojí jiný polynukleotidový segment tak, aby došlo k replikaci a/nebo expresi připojeného segmentu.

Termín řídící sekvence označuje polynukleotidové sekvence, které jsou nezbytné pro expresi kódujících sekvencí, sekterými se ligují. Podstata takových řídících sekvencí se liší v závislosti na hostitelském or^gnizmu. V případě prokaryont takové řídící sekvence obecně zahrnují promotory, terminátory a v některých případech zesilovače.

Termín řídící sekvence pak zahrnuje polynukleotidové sekvence, které jsou nezbytné při expresi kódujících sekvencí, do kterých jsou ligovány. Podstata takových řídících sekvencí se liší v závislosti· na hostitelském organizmu. U prokaryontů takové řídící sekvence obecně zahrnují promotor, ribozomální vazebné místo a terminátory; u eukaryontů takové kontrolní sekvence obecně zahrnují promotory, terminátory a v některých případech . zesilovače. Termín řídící sekvence zahrnuje minimálně všechny komponenty, jejichž přítomnost je nezbytná pří expresi a může také zahrnovat další komponenty, jejichž přítomnost je výhodná například vedoucí sekvence.

Termín operabilně spojená popisuje situaci, kde popsané komponenty jsou ve vztahu, který jim umožňuje fungovat zamýšleným způsobem. Tak například kontrolní « · · sekvence operabilně spojená s kódující sekvencí se ligovala tak, že exprese kódující sekvence je dosažena za podmínek kompatibilních s řídicími sekvencemi.

Termín otevřený čtecí rámec nebo ORF znamená oblast polynukleotidové sekvence, která kóduje polypeptid; tato oblast může reprezentovat část kódující sekvence nebo celou kódujícím sekvenci.

Termín kódující sekvence je polynukleotidová sekvence, která se, je-li řízena vhodnou regulační sekvencí, přepisuje na mRNA a překládá se do polypeptidu. Hranice kódující sekvence jsou určeny kodonem počátku translace na 5'-konci a translačním stop kodonem na 3'-konci. Kódující sekvence může zahrnovat, ale není omezena na mRNA, cDNA a rekombinantí polynukleotidové sekvence.

Termín transformace znamená začlenění exogenního polynukleotidu do hostitelské buňky bez ohledu na způsob začlenění inzertu. Transformace může být provedena přímým pohlcením, transdukcí nebo f-spojením. Exogenní polynukleotid se může udržet' jako neintégrovaný vektor, například plazmid, nebo v jiném případě se může integrovat do hostitelského genomu.

Termín čištěný produkt znamená přípravu produktu, který se separoval od buněčných konstituentů, se kterými je produkt normálně spojen a od jiných typů buněk, jenž se mohou vyskytovat ve vzorku.

Všechny peptidové sekvence jsou popsány podle obecně přijaté úmluvy, přičemž na levé straně je aminokyselinový zbytek α-N-konce a na pravé straně je aminokyselinový zbytek α-C-konce. Termín a-N-konec znamená volnou alfaaminoskupinu aminokyseliny v peptidu a termín a-C-konec znamená konec volné aífa-karboxylové kyseliny aminokyseliny peptidu.

I · · * ··· ··* • »

Termín N-chránící skupina znamená ty skupiny, které chrání α-N-terminální aminokyselinu nebo peptid nebo jiný způsob ochrany aminoskupiny aminokyseliny peptidu před nežádoucími reakcemi během syntetických postupů. Běžně používané N-chránící skupiny jsou doloženy v publikaci Greene, Protective Groups In Organic Synthesis, (John Wiley and Sons, New Yourk (1981), Chránící skupiny se mohou- navíc použít jako proformy léků, které se snadno štěpí in vivo například enzymatickou hydrolýzou, přičemž se uvolňuje biologicky aktivní rodič. N-chránící skupiny obsahují nižší alkanoylové skupiny, jako je formyl, acetyl (Ac), propionyl, pivaloyl, t-butylacetyl a podobně; jiné acylové 2-chloroacetyl, 2-bromoacetyl, trichloroacetyl, ftalyl, ' onitrofenoxyacetyl, α-chlorobutyryl, benzoyl, 4-bromobenzoyl, 4-nitrobenzoyl a podobně; sulfonylové skupiny, jako je benzensulfonyl, p-toluensulfonyl a podobně; skupiny tvořící skupiny zahrnují trif luoroace.tyl, karbamát, jako chlorobenzyloxykarbonyl, nitrobenzyloxykarbonyl, nitrobenzylkarbonyl, dimetoxybenzylkarbonyl, je

Pp23.42.4benzyloxykarbonyl, p-metoxybenzylkarbonyl,

2-nitrobenzylkarbonyl, p-bromobenzyloxykarbonyl,

3,5-dimetoxybenzylkarbonyl, dimetoxybenzyloxykarbonyl, 4- dimetoxybenzyloxykarbonyl, 2nitro-4,5- dimetoxybenzyloxykarbonyl, 3,4,5trimetoxybenzyloxykarbonyl, 1-(p-bifenylyl,-1metyletoxykarbony, a,a-dimetyl-3,5dimetoxybenzyloxykarbonyl, benzhydryloxykarbonyl, tbutyloxykarbonyl, diizopropylmetoxykarbony1, izopropyioxykarbonyl, etoxykarbonyl, metoxykarbonyl, allyloxykarbonyl, 2,2,2-trichloroetoxykarbonyl, fenoxykarbonyl, 4-nitrofenoxykarbonyl, fluorenyl-9metoxykarbonyl, cyklopentyloxyakrbonyl, adamantyloxykarbonyl, · » • · · • ·»· • · · • · · * · · • · · • · · » ·· · ft * fenylthiokarbonyl a podobně; arylalkýlové skupiny jako je benzyl, trifenylmetyl, benzyloxymetyl, 9fluorenylmetyloxykarbonyl (Fmoc) a podobně a silylové skupiny, jako je trimetylsilyl a podobně. Preferovanými Nchránícími skupinami jsou formyl, acetyl, benzoyl, pivaloyl, t-butylacetyl, fenylsulfonyl, benzyl, t-butyloxykarbonyl (Boc) a benzoyloxykarbonyl (Cbz) . Lyzirt může například být například chráněn na α-N-konci skupinou, která je labilní v kyselém prostředí (např. Boc) a na ε-Ν-konci skupinou labilní v zásaditém prostředí (např. Fmoc), pak se mohou tyto chránící skupiny odstranit selektivně během syntézy.

Termín karboxy-chránící skupina znamená esterová nebo amidová skupina chránící karboxylovou kyselinu. Tyto uvedené skupiny blokují nebo chrání funkčnost karboxylové kyseliny, zatímco se do reakce zapojují jiná funkční místa sloučeniny. Karboxy-chránící skupiny jsou doloženy v publikaci Greene, Protective Groups In Organic Synthesis, pp. 152-186 (1981). Skupiny chránící karboxylovou skupinu se mohou navíc použít jako proformy léků, které se snadno štěpí in vivo například enzymatickou . hydrolýzou, přičemž se uvolňuje biologicky aktivní rodič. Takové karboxy-chránící skupiny jsou dobře známy v oboru , používají se ve velkém rozsahu při ochraně karboxylových skupin u penicilinu' a cefalosporinu, jak se popisuje v publikacích U.S. patent č. 3,840,556 a 3,719,667. Reprezentativní karboxy-chránící skupiny jsou Ci-Cb nižší alkyl (např. metyl, etyl nebo t-butyl a podobně); arylalkyl, jako je fenetyl nebo benzyl a jejich substituované deriváty, jako je alkoxybenzylové nebo nitrobenzylové skupiny a podobně; arylalkenyl, jako je fěnyletenyl a podobně; aryl a substituované deriváty, jako je 5-indanyl a podobně; dialkylaminoalkyl, jako je dimetylaminoetyl a podobně; alkanoyloxyalkylové skupiny, jako je acetoxymetyl, butyryloxymetyl; valeryloxymetyl,

V · * ’ • · · * · · · ř

·* ««« • · ♦ ·♦· ·** • « ·· ·· izobutyryloxymetyl,izovaleryloxymetyl, 1-(propionyloxy)-1etyl, 1-(pivaloyloxyl)-1-etyl, 1-metyl-l-(propionyloxy)-1etyl, pivaloyloxymetyl, propionyloxymetyl a podobně; cykloalkanoyloxyalkylové skupiny, jako je cyklopropyl karbonyloxymetyl, cyklobutylkarbonyloxymetyl, cyklopentylkarbonyloxymetyl, cyklohexylkarbonyloxymetyl a podobně; aroyloxyalkyl, jako je benzoyloxymetyl, benzoyloxyetyl a podobně; arylalkylkarbonyloxyalkyl jako je benzylkarbonyloxymetyl, 2-benzylkarbonyloxyetyl a podobně; alkoxykarbonylalkyl nebo cykloalkyloxykarbonylalkyl, jako je metoxykarbonylmetyl, cyklohexyloxykarbonylmetyl, ' 1metoxykarbonyl-l-etyl a podobně; alkoxykarbonyl oxyalkyl nebo cykloalkyloxykarbonyloxyalkyl, jako metoxykarbonyloxymetyl, t-butyloxykarbonyloxymetyl, l-etoxykarbonyloxy-l-etyl.,... , 1-

cyklhexyloxykarbonyloxy-l-etyl	a	podobně;
aryloxykarbonyloxyalkyl, jako je	2-(fenoxykarbonyloxy)etyl,2-
(5-indanyloxykarbonyloxy)etyl	a	podobně;
alkoxyalkylkarbonyloxyalkyl,	jako je	2- (1-metoxy-2-
metylpropan-2-oyloxy)etyl	a	podobně;
arylalkyloxykarbonyloxyalkyl,	jako	je 2-
(benzyloxykarbonyloxy)etyl	a	podobně;
arylalkenyloxykarbonyloxyalkyl,	jako 2-	(3-fenylpropen-2-

yloxykařbonyloxy)ethyl a podobně; alkoxykarbonylaminoalkyl, jako je t-butyloxykarbonylaminometyl a podobně; alkylaminokarbonylaminoalkyl, jako je metylaminokarbinylaminometyl a podobně; alkanoylaminoalkyl, jako acetyl aminometyl a podobně; heterocyklický karbonyloxyalkyl, jako je 4-metylpiperazinylkarbonyloxymetyl a podobně; dialkylaminokarbonylalkyl, jako je dimetylaminokarbonylmetyl, dietylaminokarbonylmetyl a podobně; (5-(nižší alkyl)-2-oxo-l,3-dioolen-4-yl)alkyl, jako je 5-butyl-2-oxo-l,3-dioxolen-4-yl)metyl a podobně; a (59

999

9

9 9

-f 9 «9 999

9 99 • » » 999

99 fenyl-2-oxo-l,3-dioxolen~4-yl)alkyl, jako je (5-fenyl-2-oxo1,3-dioxolen-4-yl)metyl a podobně.

Reprezentativní amidové skupiny chránící karboxylovou skupinu jsou aminokarbonylové a nižší alkylaminokarbonylové skupiny.

Preferované sloučeniny s chráněnou karboxylovou skupinou podle vynálezu jsou sloučeniny, kde chráněná karboxylové skupina je nižší alkyl, cyklický alkyl nebo arylalkylester, např. metylester, etylester, propylester, izopropylester, butylester, sekundární butylester, izobutylester, amylester, izoamylester, oktylester, cyklohexylester, fenyletylester a podobně nebo alkanoyloxyalkyl, cykloalkanoyloxyalkyl, aroyloxyalkyl nebo arylalkylkarbonyloxyalkylester. Preferované amidové skupiny chránícíkarboxylovou skupinu jsou nižší alkylaminokarbonylové skupiny. Například a-C-konec kyseliny aspartové se může chránit skupinou, která je labilní v kyselém prostředí (t-butylová skupina), a β-C-konec je chráněn skupinou, která je selektivně odstranitelná hydrogenaci (např. benzylová skupina) během syntézy.

Termín nižší alkyiaminokarbonylová skupina znamená skupinu -C(O)NHR¹⁰, která kryje α-C-konec syntetického peptidového fragmentu smyčky 5, kde R¹⁰ je Ci až C₄ alkyl.

Termín aminokarbonylová skupina znamená skupinu C(O)NH₂, která kryje α-C-konec syntetického peptidového fragmentu smyčky 5.

Termín proforma léku znamená sloučeninu, která se rychle transformuje in vivo za vzniku rodičovské sloučeniny, např. enzymatickou hydrolýzou v krvi (T. Higuchi and V. Stella , Prodrugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 A.C.S. Symposium Series a Edward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers ín Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pernafoon Press, 1987) .

I Β Β *

I · · · ·«· ··* | · Β · · · * *

I 4 · · · · * «· ··· ·· ··· • » · Β · · kyseliny mravenčí alkoxykarbonilových

Termín farmaceuticky přijatelná proforma léku znamená (1) ty proformy sloučeniny podle vynálezu, které z hlediska medicíny mohou přijít do kontaktu s lidskou tkání a s tkání nižších zvířat, aniž mají, toxický, dráždivý, alergický účinek a podobně, vykazující vhodný poměr výhoda ku riziku a její použití je účinné a (2) zwiterionové formy rodičovské sloučeniny.

Termín aktivovaný esterový derivát znamená kyselé halidy, jako jsou kyselé chloridy a aktivované estery zahrnující, ale nejsou omezené na anhydridy odvozené od a octové, anhydridy odvozené' od halidů, jako je izobutyloxykarbonylchlorid a podobně, estery odvozené od Nhydroxysukcinimidu, estery odvozené, od N-hydroxybenzotrazolu, estery odvozené od N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboxamidu, estery odvozené od 2,4,5-trochlorofenolu a podobně.

Termín antiangiogenní aktivita znamení schopnost molekuly inhibovat růst krevních cév.

Termín endoteliální inhibující aktivita znamená obecně schopnost molekuly inhibovat angiogenezi, což znamená inhibice růstu nebo migrace bovinních kapilárních endoteliálnich buněk v kultuře v přítomnosti fibroblastového faktoru růstu nebo jiných známých faktorů růstu.

Termín ED50 je zkratka pro dávku peptidového fragmentu smyčky 5 nebo fúzního proteinu, která je účinná při inhibici růstu krevních cév nebo při inhibici růstu bovinních kapilárních endoteliálních buněk v kultuře v přítomnosti fibroblastového růstového faktoru nebo jiných' známých růstových faktorů.nebo inhibuje migraci endoteliálních buněk poloviční dávkou, než inhibuje růst, nebo migrace probíhá v nepřítomnosti inhibitoru.

Ve většině případech se používají ve vynálezu jména přirozeně se vyskytujících aminokyselin' nebo aminoacylových » » ·

9 ·

999 fl • · Β· t · « · · k · * v * *

99· zbytků ve shodě s pravidly IUPAC Coiranission on the Nomenclature of Organic Chemistry a IUPAC-IUB_ Coiranission on Biochemical Nomenclature , jak se uvádí v publikaci Nomenclature of α-Amino Acids (Recommendetions, 1974), Biochemistry, 14 (2), (1975). Termíny Ala, Arg, Asna, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, Ile Leu,.Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr a Val znamená aminokyseliny alanin, arginin, asparagin, kyselina aspartová, cystein, glutamin, kyselina glutamová, glycin, histidin, izoleucin, leucin, lyzin, metionin, fenylalanin, prolin, serin, treonin, tryptofan, tyrozin a valin, a jejich odpovídající aminoacylové zbytky v peptidech v jejich L-, Dnebo D, L- formách. V případě, že se indikovala nespecifická konfigurace, · pro odborníka ' to znamená, 'že' á-ůhlík aminokyselin a aminoacylových zbytků v peptidech popsaných ve specifikacích a v patentových nárocích se vyskytuje v přirozené formě nebo v L konfiguraci. Výjimku tvoří achirální molekula glycinu a libovolné aminokyseliny, které jsou achirální nebo označené jako D-.

Termín 3-I-Tyr znamená L-, D- nebo D,L-tyrosylový zbytek znamená, že ortohydrogenový radikál fenolického hydroxylu je nahrazen jodidovým radikálem. Jodidový radikál může být radioaktivní nebo neradioaktivní.

Vynález také popisuje aminokyselinové zbytky vedlejšími řetězci, které se nevyskytují přirozeně, jako je homofenylalanin, fenylglycin, norvalin, norleucin, ornitin, tiazoylalanin(který je substituovaný v poloze 2-,4-, a 5-) a podobně.

Rozumí se, že vynález zdůrazňuje libovolné deriváty peptidových fragmentů a fúzních proteinů smyčky 5, které mají antiangiogenní aktivitu a zahrnují celou třídu peptidových fragmentů smyčky 5 a zde popsané fúzní proteiny a homology nebo analogy těchto fragmentů a proteinů. Navíc vynález

	™. --- ~	ΐ ·· » * » · '· i I ϊ ··· · · » ·♦· ··! * * » -n- » « ’ ♦· ··· ·· ··· ·· ··
		20
	nezávisí na způsobu	produkce peptidového fragmentu nebo
	fúzního proteinu, to	znamená (1) proteolvtickým štěpením

izolovaného savčího plazminogenu, (2) expresí rekombinantí molekuly, která má polynukleotid kódující aminokyselinovou sekvenci peptidového fragmentu nebo fúzního proteinu smyčky 5 a (3) syntéza na pevné fázi. Tyto způsoby produkce jsou dobře známy v oboru.

V jednom provedení vynálezu se popisují peptidy, které mají obecnou strukturu B-C-X, kde B je 88-mérový peptid začínající aminokyselinou Val⁴⁴³ a končící aminokyselinou Arg⁵³⁰ sekvence SEQ ID NO: 1; C je 4-mérový peptid, kde R¹ a R⁴ odpovídá předchozí definici, R² je leucylová skupina a R³je tyrosylová skupina; a X je 9-mérový peptid začínající aminokyselinou. Tyr⁵³⁵ a . končící aminokyselinou Ala⁵⁴³- sekvence SEQ ID NO:1.

V jiném provedení vynálezu se. popisují peptidy s obecnou strukturou B-C-X, kde B je 82-mérový peptid začínající aminokyselinou Val⁴⁴⁹ a končící aminokyselinou Arg⁵³⁰ sekvence SEQ ID NO: 1, C je 4-mérový peptid, kde R a R⁴ jsou definované dříve v textu, R² je leucylová skupina a R³ je tyrosylová skupina; a X je 9-mérový peptid začínající aminokyselinou Tyr⁵³⁵ a končí aminokyselinou Ala⁵⁴³ sekvence SEQ ID NO: 1.

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou B-C-X, kde -B je 77-mérový peptid, který začíná aminokyselinou Val⁴⁵⁴ a končí aminokyselinou Arg⁵³⁰ sekvence SEQ ID NO: 1; C je 4-mérový peptid, kde R¹ a R⁴ se definují dříve v textu, R² je leucylová skupina a R³ je tyrosylová skupina; a X je -9-mérový peptid začínající aminokyselinou Tyr⁵³⁵ a končící aminokyselinou Ala⁵⁴³ sekvence SEQ ID NO:1,

V dalším provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou B-C-X, kde B je 88-mérový peptid začínajíci aminokyselinou Val⁴⁴³ a končící aminokyselinou • 1 • φφφ •

»·· · a · · • · 9 · ·

Φ Φ »·» Φ·*

Φ Φ ♦

ΦΦΦ Φ · · ·

Arg⁵³⁰ sekvence SEQ ID NO: 1; C je 4-mérový peptid, kde R¹ a R⁴ se definovaly dříve v textu, R² je leucylová skupina a R³je tyrosylová skupina; a X je 12-mérový peptid začínající aminokyselinou Tyr⁵³⁵ a končící aminokyselinou Phe⁵⁴⁶ sekvence SEQ ID NO: 1.

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou B-C-X, kde B je 82-mérový peptid začínající aminokyselinou Val⁴⁴⁹ a končící aminokyselinou Arg⁵³⁰ sekvence SEQ ID NO; 1; C je 4-mérový peptid, kde R¹ a R⁴ se definovaly dříve v textu, R² je leucylová skupina a R³ je tyrosylová skupina; a X je 12-mérový peptid začínající aminokyselinou Tyr⁵³⁵ a končící aminokyselinou Phe⁵⁴⁶ sekvence SEQ ID NO: 1.

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou B-C-X, kde. B je 77-:mérový peptid. .začínající aminokyselinou Val⁴⁵⁴ a končící aminokyselinou Arg⁵³⁰ sekvence SEQ ID NO: 1; C je 4-mérový peptid, kde R¹ a R’ se definovaly dříve v textu, R² je leucylová skupina a R³ je tyrosylová skupina; a X je 12-marní peptid začínající aminokyselinou Tyr⁵³⁵' a končící aminokyselinou Phe⁵⁴⁶ sekvence SEQ ID NO: 1.

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou B-C-X, kde B je 176-mérový peptid začínající aminokyselinou Val³⁵⁵ a končící aminokyselinou Arg⁵³⁰' sekvence SEQ ID NO: 1; C je 4-mérový peptid, kde R¹ a R⁴ se' definovaly dříve v textu, R² je leucylová skupina a R³ je tyrosylová skupina; a X je 12-mérový peptid začínající aminokyselinou Tyr⁵³⁵ a končící aminokyselinou Ala⁵⁴³ sekvence SEQ ID NO: 1.

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou B-C-X, kde B je 176-mérový peptid začínající aminokyselinou Val³³⁵ a končící aminokyselinou Arg⁵³⁰ sekvence SEQ ID NO: 1; C je 4-mérový peptid, kde R¹ a R⁴ se definovaly dříve v textu, R² je leucylová skupina a R³ je tyrosylová skupina; a X je 12-mérový peptid začínající aminokyselinou Tyr⁵³⁵ a končící aminokyselinou Phe⁵⁴⁶ sekvence SEQ ID NO: 1.

» · · • · · • * ·· «

» ··· • * é · ··· ♦ · · • 9 9 • · ·>* » « » » • » · ··' t

>·« ·«

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou A-C-Y, kde A je acetylová skupina; C je 4-mérový peptid, kde R¹ a R⁴ se definovaly dříve v textu, R² je leucylová skupina a R³ je tyrosylová skupina; a Y je aminokarbonylová skupina.

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou A-C-X-Y, kde A je acetylová skupina; C je 4mérový peptid, kde R¹ a R⁴ se definovaly dříve v textu, R² je leucylová skupina a R³ je tyrosylová skupina; X je tyrosylová skupina; a Y je aminokarbonylová skupina.

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou A-B-C-Y, kde A je acetylová skupina; B je dipeptid začínající aminokyselinou v pozici Pro⁵²⁹ a končící aminokyselinou v pozici Arg⁵³⁰ ; C .je 4-mérový peptid, kde R¹ a R⁴ se definovaly dříve v textu, R² je leucylová skupina.a R³je tyrosylová skupina; a Y je aminokarbonylová skupina.

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou A-B-c-Y, kde Á je acetylová skupina; B je dipeptid začínající aminokyselinou v pozici Pro⁵²⁹ a končící aminokyselinou v pozici Arg⁵³⁰ sekvence SEQ ID NO; 1; C je 4mérový peptid, kde R¹ a R⁴ se definovaly dříve v textu, R² je leucylová skupina a R³ je tyrosylová skupina; a Y je aminokarbonylová skupina.

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou A-B-C-X-Y, kde A je acetylová skupina; B je dipeptid začínající aminokyselinou v pozici Tyr⁵²⁵ a končící aminokyselinou v pozici Arg⁵³⁰; C je 4-mérový peptid, kde R¹ a R⁴ se definovaly dříve v textu, R² je leucylová skupina a R³je tyrosylová skupina; a Y je aminokarbonylová skupina.

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou A-B-C-X-Y, kde A je acetylová skupina; B je arginylová skupina; C je 4-mérový peptid, kde R¹ a R⁴ se definovaly dříve v textu, R² je leucylová skupina a R³ je

J Z ·*·—*·· · · — * - “ *· ··« Μ ·« tyrosylová skupina; X je tyrosylová skupina a Y je aminokarbonylová skupina.

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou A-B-C-X-Y, kde A je acetylová skupina; B je dipeptid začínající aminokyselinou v pozici Pro⁵²⁹ a končící aminokyselinou v pozici Arg⁵³⁰; C je 4-mérový peptid, kde R¹ a R⁴ se definovaly dříve v textu, R² je leucylová skupina a R³je tyrosylová skupina; X je 3-I-tyrosylová skupina; a Y je aminokarbonylová skupina.

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou A-B-C-X-Y, kde A je acetylová skupina; B je dipeptid začínající aminokyselinou v pozici Pro⁵²⁹ a končící aminokyselinou v pozici Arg⁵³⁰; C je 4-mérový peptid, kde R¹ a R⁴ se definovaly dříve v textu, R² je leucylová. skupina a R³je. tyrosylová skupina; X je tyrosylová skupina; a Y je aminokarbonylová skupina.

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou A-B1-C1-X1-Y, kde A je acetylová skupina; B_r a X_xnejsou přítomny, Ci je . 10-mérový peptid začínající aminokyselinou v pozici Arg⁵¹⁴ a končící aminokyselinou v pozici Trp⁵²³ a Y je aminokarbonylová skupina.

Reprezentativní sloučeniny podle vynálezu zahrnují sloučeniny, kde A je acetyl a Y je aminokarbony1 a B-C-X je (a) sekvence pocházející ze sekvence SEQ ID NO: 1- od pozice aminokyseliny 355 do pozice 543;

(b) sekvence pocházející ze sekvence SEQ ID NO: I od pozice aminokyseliny 355 do pozice 546;

(c) sekvence pocházející ze sekvence SEQ ID NO: 1 od pozice aminokyseliny 443 do pozice- 543;

(d) sekvence pocházející ze sekvence SEQ ID NO: 1 od pozice aminokyseliny 449 do pozice 543;

(e) sekvence pocházející ze sekvence SEQ ID NO: 1 od pozice aminokyseliny 454 do pozice 543;

(f) sekvence pocházející ze	sekvence	SEQ	ID	NO:	1	od
pozice aminokyseliny 443 do pozice	546;
(g) sekvence pocházející 'ze	sekvence	SEQ	ID	NO:	1	od
pozice aminokyseliny 449 do pozice	54 6;
(h) sekvence pocházející ze	sekvence	SEQ	ID	NO:	1	od
pozice aminokyseliny 454 do pozice	546;
(i) sekvence pocházející ze	sekvence	SEQ	ID	NO:	1	od
pozice aminokyseliny 525 do pozice	535;
(j) sekvence pocházející ze	sekvence	SEQ	ID	NO:	1	od
pozice aminokyseliny 529 do pozice'	535;
(k) sekvence pocházející ze	sekvence	SEQ	ID	NO:	1	od
pozice aminokyseliny 530 do pozice	535;
Jiná reprezentativní sloučenina je ta,	kde	A je	i acetyl	. a

Y je aminokarbonyl a B₁-C-_l-Xi ,j.e sekvence - pocházející ze' sekvence SEQ ID NO; 1 od pozice aminokyseliny 514 do pozice 523;

Fragmenty K5 nebo fúzní proteiny K5 se mohou získat expresí rekombínantí molekuly obsahující polynukleotid, jehož sekvence kóduje protein nesoucí peptidový fragment smyčky 5 a čištěním exprimovaného peptidového produktu (Menhart, N., et al., Biochemistry, 32: 8799-8806 (1993). Sekvence DNA lidského plazminogenu se publikovala (Browne, M. J. et al., Fibrinolysis, 5 (4): 257-260 (1991) a je zobrazena na obr. č.

(a až b) (sekvence SEQ ID NO:1 12). Polynukleotidová sekvence kódující smyčku 5 začíná přibližně v pozici nukleotidu 1221 sekvence SEQ ID NO: 12 a končí přibližně v pozici nukleotidu 1723.

Gen kódující peptidový fragment K5 nebo fúzní protein K5 se může izolovat z buněk nebo tkání/ které exprimují vysoké množství lidského plazminogenu nebo fúzních proteinů K5 (1) izolací mediátorové RNA z tkáně nebo buněk, (2) použitím reverzní transkriptázy za vzniku odpovídající sekvence DNA a (3) polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) s vhodnými primery pro amplifikaci sekvence DNA, která kóduje aktivní aminokyselinovou sekvenci K5 nebo její fúzní protein. Polynukleotid kódující peptidový fragment K5 nebo fúzní protein K5 se může klonovat do libovolného běžně dostupného expresivního vektoru ( jako je pBR322, pUC a podobně) nebo expresivních/čistících vektorů (jako je fúzní vektor GST (Pharmacia®, Piscataway, NJ)) a pak je exprimován ve vhodném prokaryontním, virovém nebo eukaryontním hostiteli. Čištění pak může proběhnout konvenčním způsobem nebo v případě běžného expresivního/Čistícího systému se postupuje podle instrukcí výrobce.

Peptidový fragment K5 nebo fúzní protein K5 se může syntetizovat standardními chemickými metodami na pevné fázi, které jsou v oboru dobře známy. Peptidové fragmenty smyčky 5 se například mohou syntetizovat postupem, který se'popisuje v publikaci stewarda and Younga (Steward, J. M. and Young,' J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2^nd Ed., Pierce Chemical Company, Rockford, IL, (1984) za použití syntetizéru (Applied Biosystem synthesizer). Podobně se může syntetizovat více fragmentů, které jsou spojeny dohromady a tvoří větší fragmenty. Tyto syntetické peptidové fragmenty se mohou také připravit substitucemi aminokyselin ve specifických lokacích za účelem testování anti-angiogenní aktivity in vitro a in vivo. Pro syntézu peptidú na pevné fázi se hodí řada metod, která se popisují v publikacích J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co. (San Francisco), 1963 a J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, vol. 2, p. 46, Academie Press (New York), 1973. Klasická syntéza v roztoku se popisuje v publikaci G. Schroder and K. Lupke, The Peptides, Vol. 1, Academie Press (New York). Tyto metody obecně zahrnují sekvenční adici jedné nebo více aminokyselin nebo vhodně chráněné aminokyseliny za účelem tvorby peptidového řetězce. V normálním případě je

Λ 0 ·

» · « ·

0ΤΗ-.* · « fr 0 . 000 «0 0 • · ·

99« 0· «9 chráněna amino nebo karboxylové skupina první aminokyseliny vhodnou chránící skupinou. Chráněná nebo derivatizovaná aminokyselina je pak buď připojena k inertní pevné podložce nebo je v roztoku a za podmínek vhodných pro vytvoření amidové vazby se k sekvenci aduje další aminokyselina, která má vhodně chráněnou komplementární (amino- nebo karboxylovou skupinu) skupinu. Chránící skupina se pak 2 nově připojeného aminokyselinového zbytku odstraní a přidá se další (vhodně chráněná) aminokyselina atd. Po té, co se z aminokyselin složí správná sekvence, odstraní se sekvenčně nebo konkurenčně libovolné zbývající chránící skupiny ( a také pevné podpory) za vzniku konečného peptidů. Jednoduchou modifikací tohoto obecného postupu je v jednom okamžiku možné přidat více jak jednu aminokyselinu. Například párováním (za podmínek, které neracemizují chirální centra) chráněného tripeptidu se správně chráněným dipeptidem za vzniku (po odstranění chránících skupin) pentapeptidu.

Zvláště preferovaným způsobem přípravy sloučenin podle vynálezu je syntéza peptidů na pevné fázi, kde aminokyselina α-N-konce je chráněna skupinou citlivou na kyselinu nebo bázi. Taková chránící skupina by měla být stabilní za podmínek, kdy se tvoří peptidová vazba, přičemž by se měla dát snadno odstranit, aniž se poruší rostoucí peptidový řetězec nebo aniž dojde k racemizaci libovolného z obsažených chirálních center. Vhodné chránící skupiny jsou 9fluorenylmetyloxykarbonylová (Fraoc), t-butyloxykarbonylová (Boc), benzyloxykarbonylová (Cbz), bifenylizopropyloxykarbonylová, t-amyloxykarbonylové, izobornyloxykarbonylová, ' a,a-dimetyl-3,5dimetoxybenzyloxykarbonylová, o-nitrofenylsulfenylová, 2cyano-t-butylkarbonylová a podobně. Při syntéze peptidových fragmentů smyčky 5 se zvláště preferuje 9-fluorenylmetyloxykarbonylová (Fmoc) ochranná skupina. Jinými • φ φ φ φ « φφ · ··· φ φ φφ φφ preferovanými skupinami, které chrání aminoskupiny vedlejšího řetězce jako je lyzin a arginin, jsou 2,2,5,7,8pentámetylchroxnan-6-sulfonylová skupina (pmc), nitroskupina, p-toluensulfonylová skupina, Cbz, Boc případě tyrozínu bromobenzyloxykarbonylová izopropylová, t-butylová skupina, 4-metoxybenzensulfon.ylová. a adamantyloxykarbonylová skupina; v to je benzylová skupina, oskupina, 2,6-dichlorobenzylová, (t-Bu), cyklohexylová skupina, cykloperíýlová a acetylová skupina (Ac) ; v případě šeřinu to je t-butylová, benzylová a tetrahydropyranylová skupina, v případě histidinu to je tritylová, benzylová skupina, Cbz, ptoluensulfonylová a 2,4-dinitrofenylová skupina; v případě tryptofanu to je formylová skupina; v případě kyseliny aspartové a glutamové to je benzylová a t-butylová skupina a v případě cysteinu to je trifenylmetylová (tritylová) skupina. Při syntéze peptidu na pevné fázi je aminokyselina α-N-konce přichycena k vhodné pevné podložce nebo k pryskyřici. Vhodné pevné podklady použitelné při shora uvedené syntéze jsou ty materiály, které jsou inertní vůči činidlům a reakčním podmínkám reakcí zahrnujících stupně kondenzace a odstranění chránících skupin a které jsou nerozpustné v používaném médiu. Preferovaný pevný podklad pro syntézu peptidů s α-C-terminální karboxy-skupinou je 4hydroxymetylfenoxymetyl-kopoly(styren-l%divinýlbenzen). Preferovaný pevný podklad v případě peptidů, které obsahují α-C-terminální amidovou -skupinu, je 4-{2',4'-dimetoxyfenylFmoc-aminometyl)fenoxyacetamidoetylová pryskyřice dostupná u firmy Applied Biosystems (Foster City, CA) . a-C-terminální aminokyselina je spojena s pryskyřicí prostřednictvím N,N'dicyklohexylkarbodiimidu (DCC), N,N'-diizopropylkarbodiimidu (DIC) nebo O-benzotriazol-l-yl-N,N,Ν',N'-tetrametyluroniumhexafluorofosfátu (HBTU) s nebo bez 4-dtmetylaminopyridinu

* ·· *

0 0 0 •00 00· 0 · (DMAP), 1-hydroxybenzotriazolu (HOBT), benzotriazol-l-yloxytris (dime tyl amino) fosfonium.-h.exaf luorofosfát (BOP) nebo bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)fosfinchlorid (B0PC1). S těmito látkami se páruji po dobu 1 až 24 hodin při teplotě mezí 10 °C a 50 °C v prostředí rozpouštědla, kterým je dichlormetan nebo DMF. V případě, že pevným podkladem je 4-(2',4'~ dimetoxyfenyl-Fmoc-aminometyl)fenoxy-acetamidetylová pryskyřice, skupina Fmoc je před párováním s α-C-terminální aminokyselinou, jak se popisuje shora v textu, štěpena sekundárním aminem, upřednostňuje se piperidin. Preferovaným způsobem párování s 4-(24'-dimetoxyfenyl-Fmocaminometyl)fenoxy-acetamidetylovou pryskyřicí be2 ochrany je 0-benzotriazol-l~yl-N,N,N',N'tetrametyluroniumhexafluorofosfát (HBTU, ekvivalent 1) a 1hydroxybenzotriazol (HOBT, ekvivalent 1) v DMF. Párování úspěšně chráněných aminokyselin se provádí na automatizovaném syntetízéru polypeptidů, který je dobře znám v oboru. V preferovaném provedení α-N-konec, aminokyselin rostoucího peptidového řetězce je chráněn pomocí Fmoc. Odstranění chránící skupiny Fmoc z α-N-konce rostoucího peptidu je provedeno aplikací sekundárního aminu, upřednostňuje se piperidin. Každá chráněná aminokyselina se pak používá v třínásobném molárním přebytku a párování se provádí přednostně v DMF. Párovací činidlo je v normálním případě 0benzotriazol-l-yl-N,N,N',N-tetrametyluroniumhexafluorofosfát (HBTU, ekvivalent 1) . Na konci syntezi na pevné fázi je polypeptid odstraněn z pevného podkladu a zbaven ochrany buď operacemi, které po sobě následují, nebo jedinou operací. Odstranění polypeptidů a odstranění ochrany se může provést jednou operací tak, že se polypeptid vázaný na pryskyřici štěpí činidlem, které obsahuje thianizol, vodu, etanditiol a kyselinu trifiuoroctovou. V případech, kde a-C-konec • *·>·**^· · · · · · ·» ··· ·« ··· ·· ** polypeptidu je alkylamid, pryskyřice se štěpí lyží aminoskupin alkylaminem. V jiném případě se peptid . může odstranit transesterifikací, např. metanolem, po čemž následuje lyže aminoskupin, nebo přímou transamidací. Chráněný peptid se může v tento okamžik čistit a nebo může postoupit přímo do dalšího stupně. Odstranění skupin, které chrání vedlejší řetězce, se provede za použití shora popsaného koktejlu určeného pro štěpení. Peptid se zcela odstraněnou ochranou se čistí řadou chromátografických stupňů, kde se používají libovolné nebo všechny následující typy: výměna iontů na slabě bazické pryskyřici (acetátová forma); hydrofobní adsorpční chromatografie na nederivátizovaném polystyrendivínylbenzenu (např. Amberlite XAD); adsorpční chromatografie na křemičitém gelu, iontoměničové chromatografie na karboxymetylcelulóze + dělící chromatografie, např. na náplni Sephadex G-25, LH-20 nebo chromatografie v protiproudovém uspořádání; vysokovýkonné kapalinová chromatografie (HPLC), zvláště HPLC s obrácenou fází, na' fázi, která je vázaná na oktyl- nebo oktadecylsilylsilika, což tvoří náplň kolony. Molekulové hmotnosti těchto peptidových fragmentů smyčky 5 se určují za použití hmotnostní spektroskopie FAB (Fast Atom Bombardment Mass Spektroscopy). Syntéza peptidového fragmentu smyčky 5 na pevné fázi se popisuje v příkladu 1 až 12.

V závislosti na způsobu produkce se peptidový fragment nebo fúzní protein smyčky 5 může vyskytovat s nebo bez dříve uvedených disulfidových můstků oblasti smyčky 5 savčího plazminogenu nebo v případě fúzního proteinu s jinými oblastmi savčích smyček s nebo bez disulfidových vazeb těchto odpovídajících oblastí nebo mohou existovat s disulfidovými vazbami za vzniku terciální struktury, která se liší od terciální struktury nativního savčího plazminogenu. Peptidové fragmenty smyčky 5 vznikající enzymatickým Štěpením Glu-, • · · φ φ .·-·.·· · φ

Φ , · . . ΦΦΦ 9

Φ Φ ΦφΦ

ΦΦ ·Φ· Φ*

ΦΦ » Φ · Φ » ΦΦΦ Φ _{9 9} ΦΦΦ 999

Φ Φ

ΦΦΦ φφ φφ

Lys- nebo miniplazminogenu elastázou a/nebo pepsinem (enzymy, které štěpí místa spojení cysteinu) . obsahují nativní terciální strukturu proteinu smyčky 5; peptidové fragmenty smyčky 5 připravené syntézou na pevné fázi mohou nebo nemusí obsahovat cystylaminoacylové zbytky a peptidové fragmenty smyčky 5 připravené expresí mohou obsahovat disulfidové můstky v odlišných polohách, než v peptidových fragmentech, které vznikly enzymatickým štěpením.

Sloučeniny podle vynálezu zahrnující, ale nejsou omezeny na ty, které se popisují v příkladech, mají anti-angiogenní aktivitu. Jako inhibitory angiogeneze se tyto látky používají pro léčbu primárních a metastazovaných pevných nádorů a karcinomů prsu, tlustého střeva, rekta, orhofaryngu, esofagu, žaludku, pankreasu, jater, žlučníku, žlučovodu, tenkého střeva, močového systému včetně ledvin, močového měchýře a uroteiia, ženských genitálií včetně děložního čípku, dělohy, vaječníků, choriokarcinomu a gestacionálního trofoblastového onemocnění, mužských genitálií' včetně prostaty, chámovodů, varlat a nádorů zárodečných buněk; žláz z vnitřní sekrecí, které zahrnují štítnou žlázu, adrenální žlázu a podvěsek mozkový; sarkomů vznikajících v kostech nebo v měkkých tkáních a Kaposiho sarkomu; nádory mozku, nervů, očí a mozkových blan, které zahrnují astrocytomy, gliomy, glioblastomy, retinoblastomy, neuromy, neuroblastomy, Schwannomy a meningiomy; pevné nádory vznikající z hematopoietických maligních nádorů, jako jsou leukémie, zahrnující chloromy, plazmacytomy, plaky a nádory mukózy fungoides a kožní mykóza T-buněčného lymfomu/leukemie; lymfomy zahrnující Hodkinsův nebo jiný lymfom; při profylaxi autoimunitního onemocnění, jako je revmatitida, imunitní a degenerativní artritida; oční onemocnění, jako je diabetická retinopatie, retinopatie při předčasné dospělosti, odmítnutí implantátu rohovky, retrolentální fibroplazie, neovaskulární

I fl¹ fl fl > flfl fl • fl fl flflfl

I · * l · · flfl * fe 'fl^-* 1 ·« flflfl abnormální stimulací intestinální adheze, glaukoma, rubeosis, retinální neovaskularizace způsobená maskulární degenerací a hypoxie; abnormální neovaskularizace u očí; kožní onemocnění, jako je psoriáza; onemocnění krevních Žil, jako je hemagiomy a proliferace kapilár s arteosklerotickými plakami; Osler-Webberův syndrom; myokardiální angiogeneze; plaková neovaskularizace; telangiectasia; hemofiliální klouby; angiofibromy; granulace poranění; onemocnění charakterizované nadměrnou nebo endoteliálních buněk, jako je Crohnova nemoc, ateroskleróza;

skleroderma a hypertrofíe jizev (to je keloidy) a onemocnění, které má angiogenezi jako patologický rys, mezi něž patří onemocnění kočičího škrábnutí (Rochele minalia quantosa) a vředy (Helicobacter. pylori). Dále se mohou použít- jako' antikoncepce, která inhibuje ovulaci a vznik placenty.

Sloučeniny podle vynálezu se mohou použít při prevenci tvorby metastáz shora popsaných nádorů, buď když se používají samostatně nebo v kombinací s radioterapií a/nebo s jiným chemoterapeutickým ošetřením, které se běžně aplikuje u pacienta při léčbě angiogenního onemocnění. Když se uvedené látky podle vynálezu používají při léčbě pevných nádorů mohou se aplikovat s chemoterapeutickými činidly, jako je alfa interferon, COMP (cyklofosfamid, vinkristin, metotrexata a prednison), etoposid, mBACOD (metortrexát, bleomycin, doxorubikin, cyklofosfamid, vinkristin a déxametason), PROMACE/MOPP (prednison, metotraxát toxorubikin, cyklofosfamid, taxol, etoposid/mechloretamin, vinkristin, prednison a prokarbazin) vinkristin, vinblastin, angioinhibins, TNP-470, pentosanpolysulfát, faktor 4 krevních destiček, angiostaťin, LM-609, SU-101, CM-101, techgalan, talidomid, SP-PG a podobně. Mezi jiná chemoterapeutická činidla- patří alkylační činidla, jako jsou dusíkaté hořčice, které zahrnují mechloetamin, meifan, chlorambucil, cyklofosfamid a • <

9 ·

9 β·9 9 ·♦· ifosfamid; nitromočoviny, které zahrnují karmustin, lomustin, semustin a streptozokin; alkvlsulfonáty zahrnující busulfan; triaziny zahrnující dakarbazin; eth^leniminy, jako je tíotepa a hěxametylmelamin; analogy kyseliny listové, jako je metotrexat; analogy pyrimidinu, jako je 5-fluorouracil, cytozinarabinóza; analogy purinu, jako je 6-merkaptopurin a 6-tioguanin; protinádorová antibiotika, jako je aktinomycin D; antracykliny, jako je doxorubikin, bleomycin, mitomycin C a metramycin; hormony a antagonisty hormonů, jako je tamoxifen a kortikosteróidy a rozmanitá činidla, která zahrnují cisplatin a brequinar. Nádor se může léčit běžným způsobem chirurgicky, zářením nebo chemoterapií a aplikací smyčky 5 s následnou další aplikací smyčky 5, aby došlo k prodloužení _ stádia, latence mikrometastáz a stabilizaci a inhibicí růstu libovolného reziduálního primárního nádoru,

Cytotoxická činidla, jako je ricin se mohou vázat na peptidové fragmenty, přičemž poskytují nástroj pro destrukci buněk, které váží smyčku 5. Peptidy, které se váží na cytotoxická činidla, se mohou zavádět ínfuzí způsobem, který maximalizuje zavedení do požadované oblastí. Fragmenty smyčky 5 s vysokou afinitou, na které je navázán ricin, se mohou zavádět prostřednictvím kanyl přímo do cílové oblasti nebo do cév, které zásobují cílové místo. Taková činidla se mohou také zavádět řízeným způsobem prostřednictvím osmotických pump, které jsou připojeny na infúzní kanyly. Kombinace antagonistů smyčky 5 se může aplikovat se stimulátory angiogeneze, přičemž dochází ke zvýšení vaskularizace tkáně. Tato léčba může být úspěšným způsobem odstranění metastázované rakoviny.

Sloučeniny podle vynálezu se mohou použít ve formě farmaceuticky přijatelné sole odvozené od anorganických a organických kyselin. Termín farmaceuticky přijatelná sůl znamená ty sole, které jsou s ohledem na medicínu, vhodné pro

0 0 0 ·

0 · 0 • 0 000 000

0 ·

0·0 00 0·

ΙΛ

0 0 0

0 ··* * · • · _·—! * · · * • 0 · 0 0 •0 00· 00 kontakt s lidskou tkání a tkání nižších zvířat, aniž vyvolají toxickou, iritační, alergickou odezvu a podobně, .a vykazují přijatelný poměr pří/)../riziko. Farmaceuticky přijatelné sole jsou v oboru dobře známy. V publikaci S. M. Brege, et al., J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66: 1 et seq. se detailně popisují farmaceuticky přijatelné sole. Sole se mohou připravit in šitu během konečné izolace a čištění sloučenin podle vynálezu nebo odděleně reakcí volné báze s vhodnou organickou kyselinou. Reprezentativní adiční sole kyselin jsou například acetát, adipát, alginát, citrát, aspartát, benzoát, benzensulfonát, bisulfát, butyrát, kamforát, kamforsulfonát, diglukonát, glycerolfosfát, hemisulfát, heptanoát, hexanoát, fumarát, hydrochlorid, hydrobromid, hydrojodid, 2-hydroxyetansulfonát (isetionát), laktát, maleát, metansulfonát, nikotinát, 2-naftalensulfonát, oxalát, pamoát, pektinát, persulfát, 3-fenylpropionát, pikrát, pivalát, propionát, sukcinát, tartrát, tiokyanát, fosforečnan, glutamát, hydrogenuhličitan, p-toluensulfonát a undekanoát,' Základní skupiny obsahující dusík se mohou kvaternovat činidly, kterými jsou halidy nižších alkylů, jako je metyl, etyl, propyl a butylchloridy, bromidy a jodidy, dialkylsulfáty, jako jsou dimetyl, dietyl, dibutyl a diamylsulfáty; halidy s dlouhým řetězcem, jako jsou decyl, lauryl, myristyl a stearylchloridy, bromidy a jodidy; arylalkylhalidy, jako jsou benzyl a fenetylbromidy a jiné sole. Získaly se vodné nebo v oleji rozpustné nebo dispergované produkty. Příklady kyselin, které se mohou použít při tvorbě farmaceuticky přijatelných adičních solí kyselin, jsou anorganické kyseliny, jako jsou kyselina chlorovodíková, bromovodíková, sírová a fosforečná a organické kyseliny, jako jsou kyselina oxalová, maleinová, sukcinová a kyselina citrónová.

• ♦ · * * » · * ·· i φ-*-*- · φ φ φ ·· ··· φ« ··· *·

Bazické adiční sole se mohou připravit in šitu během konečné izolace a čištění peptidových fragmentů smyčky 5 reakcí látek, které obsahují karboxylovou kyselinu s vhodnou bází, jako je hydroxid, karbonát nebo bikarbonát farmaceuticky přijatelného kationtu kovu nebo amoniak nebo organický primární, sekundární nebo terciální amin. Farmaceuticky přijatelné sole zahrnují, ale nejsou omezeny na kationty omezené na alkalické kovy nebo kovy alkalických zemin, jako jsou sole litia, sodíku, draslíku, vápníku, hořčíku a hliníku a podobně a netoxického kvarterního amonia a aminových kationtů, které zahrnují amonium, tetrametylamonium, tetraetylamonium, metylamin, dimetylamin,trimetylamin, trietylamin, dietylamin, etylamin a podobně. Jiné reprezentativní organické aminy, které jsou použitelné při tvoření bazických adičních solí, zahrnují etylendiamin, etanolamin, dietanolamin, piperidin, piperazin a podobně. Preferované sole sloučenin podle vynálezu zahrnují fosforečnan, tris a acetát.

Peptidové fragmenty smyčky 5, antiséra smyčky 5, receptorové agonisty smyčky 5, receptorové antagonisty smyčky 5 nebo jejich kombinace se mohou použít společně s farmaceuticky přijatelnou nepřerušovaně vylučující matricí, jako jsou biodegradovatelné polymery, za vzniku terapeutických kompozic. Nepřerušovaně vylučující matrice je připravená z materiálů obvykle z polymérů, které jsou rozložitelné enzymy nebo hydrolýzou kyselina-báze nebo rozpuštěním. Když se matrice zavede do těla, působí ha ní enzymy a tělní tekutiny. Požaduje se, aby nepřerušovaně vylučující matrice byla vybrána z biokompatibilňích materiálů, jako jsou lipozomy, polylaktidy (kyselina mléčná), polyglykolid (polymer kyseliny glykolové), polyanhydridy polylaktid-ko-glykolidu (kopolymér kyseliny mléčné a kyseliny glykolové), póly(orto)estery, polypeptidy, kyselina • φφφ φ · »» » * · · • Β · i · · · φ · Φ · · Β Β « *·* ··.·

Φ Φ·^— Φ Φ Β Β · · ·- — II ·>· || «ΦΦ Βφ ΦΦ hyaluronová, kolagen, chondroitinsulfát, karboxylové kyseliny, mastné kyseliny, ' fosfolipidy, polysacharidy, nukleové kyseliny, polyaminokyseliny, aminokyseliny, jako je fenyialanin, tyrozin, izoleucin, polynukleotidy, polyvinylpropylen, polyvinylpyrolidon a silikon. Preferovaná biodegradovatelné matrice je matrice zhotovena buď z polylaktidu, polyglykolidu nebo z polylaktid-ko-glykolidu (kopolyméry kyseliny mléčné a kyseliny glykolové).

Peptidové fragmenty smyčky 5, fúzní proteiny smyčky 5, receptorové agonisty smyčky 5, receptorové antagonisty smyčky 5 nebo jejich kombinace se mohou aplikovat společně s farmaceuticky přijatelnými ekcipienty nebo nosiči za vzniku terapeutických kompozic. Farmaceuticky přijatelný nosič nebo ekcipient znamená netoxické, pevné, semi-pevné nebo .kapalné plnidlo, rozpouštědlo, materiál pro tvorbu kapsulí nebo pro tvorbu čípků libovolného typu. Kompozice se aplikují parenterálně, pod jazyk, intracisternálně, intravaginálně, intraperitonálně, rektálně, bukálně nebo povrchově (ve formě prášku, masti, kapek, transdermálních náplastí nebo pomocí iontoforézních přístrojů).

Termín parenterální znamená model aplikace, který zahrnuje intravenózní, intramuskulární, intraperitonální, intrasternální, podkožní a intraartikulární injekce a infuze. Farmaceutické kompozice vhodná pro parenterální injekci obsahuje farmaceuticky přijatelné sterilní vodné nebo nevodné roztoky, disperze, suspenze nebo emulze, stejně jako sterilní prášky, které se rekonstitují do injektovatelných roztoků nebo disperzí bezprostředně před použitím·. Příklady vhodných vodných a nevodných nosičů, rozpouštědel, ředidel zahrnují vodu, etanol, polyoly (jako je glycerol, propylenglykol, polyetylenglykol a podobně), karboxymetylcelulózu a jejích vhodné směsi, rostlinné oleje (jako je olivový olej) a injektovatelné organické estery, jako je etyloleát. Vhodná * φφ φφφ φ φ ·· «φφφφ φ φ φ φ ·....... φφφ φ φ φ φ φ φφφ φφ' φφφ «φ φφφ φ φ · φ φ φ φφφ φ φ φ φ ·Φ tekutost se udržuje například použitím vhodných potahových materiálů, jako je lecitin, udržováním požadované velikosti částic v případě disperzí a použitím povrchově aktivních látek. Tyto kompozice mohou také obsahovat adjuvans, jako jsou konzervační činidla, smáčecí činidla, emulgátory a disperzní činidla. Prevence proti působení mikroorganizmů se může zaručit inkluzí různých antibakteriálních a antihoubových činidel, jako je paraben, chlorobutanol, kyselina fenolsorbová a podobně. Může být také nutné zahrnout izotpnická činidla, jako je cukr, chlorid sodný a podobně. Prodloužené absorpce injektovatelné farmaceutické formy se může dosáhnout inkluzí činidel, jako je aluminium monosterát a želatina, což jsou látky, které zpožďují absorpci. Injektovatelné depotní formy se .připravují tvořením mikrokapsulových matric léčiv v biodegradovatelných polymerech, jako je polylaktidpolyglykolid, póly(ortoestery) a póly(anhydridy). Rychlost uvolňování léčiva se může řídit v závislosti na poměru léčiva a polymeru a podstatě použitého polymeru. Depotní injektovatelné formulace se připravují zachycením léčiva na lipozómy nebo mikroemulzích, které jsou kompatibilní s tělními tkáněmi. Injektovatelné formulace se sterilizují, například filtrací přes filtr zachycující bakterie nebo přidáním sterílizačního ' činidla ve formě sterilních pevných kompozic, které se rozpustily nebo dispergovaly ve sterilní vodě nebo v jiném sterilním injektovatelhém médiu těsně před použitím.

Povrchová aplikace zahrnuje aplikaci na kůži, sliznici a povrch plic a do očí. Kompozice, které jsou vhodné k povrchové aplikaci, zahrnují formy použitelné pro inhalaci,, které se připraví jako suchý stlačený nebo nestlačený prásek. V kompozicích, kde prášek není stlačen, se aktivní látka může použít ve formě směsi s farmaceuticky přijatelným inertním nosičem o větší velikosti, jenž zahrnuje partikule, jejichž t ·«· ···

I · <

·* ·· ·

I ·'· velikost je například až 100 mikrometrů v průměru. Vhodné inertní nosiče jsou cukry, jako je laktóza. Je nutné, aby nejméně '95 % hmotnosti částic aktivní látky mělo účinnou velikost partikul! v rozmezí 0,01 až 10 mikrometrů. Při povrchové aplikaci do očí se látka podle vynálezu zavede na farmaceuticky přijatelném očním vehiklu tak, že látka se udržuje v kontaktu s povrchem oka dostatečně dlouhou dobu, aby se umožnilo látce proniknout do vnitřních oblastí oka a rohovky, jako například přední komora oční, zadní komora, tělo sklivce, komorová voda, voda ve sklivci, rohovka, duhovka/řasy, čočka, choroidea/sítnice a oční bělmo. Farmaceuticky přijatelný oční vehikl je . například mast, rostlinný olej nebo kapsularizující materiál. V jiném případě se látky podle vynálezu mohou přímo zavést injekcí do komorové nebo sklivcové vody.

Kompozice se může uchovávat pod tlakem. Může tedy obsahovat stlačený plyn, jako je dusík nebo kapalný plynový propelent. Preferuje se zkapalněné rozprašovací médium a samozřejmě taková celková kompozice, kde aktivní látka není rozpuštěna v podstatném množství. Kompozice uchovávaná pod tlakem může také obsahovat povrchově aktivní činidlo, jako je kapalné nebo pevné neiontové povrchově aktivní činidlo nebo to může být aniontového povrchově aktivní činidlo. Preferuje se použití pevného aniontového povrchově aktivního činidla ve formě sodné sole.

Z kompozic vhodných pro rektální a vaginální aplikaci se preferují čípky, které se mohou připravovat smícháním látek podle vynálezu s vhodnými neiritujícími ekcipienty nebo nosiči, jako je kakaové máslo, polyetylenglykol nebo vosk, což jsou materiály, které jsou pevné při teplotě místnosti, ale kapalné při teplotě těla a proto tají v rektu nebo ve vaginální dutině a tím se uvolňuje se aktivní látka.

444 » 4 444 * Β · 4 4 4 4 ® ® *w· 4 β a •4 44· · 4

444 • « 4 44

Látky podle. vynálezu se mohou také aplikovat ve formě Iipozómů. Jak je známo v oboru lipozómy se obecně odvozuji z fosfolipidů nebo jiných lipidóvých látek.’ Lipozómy se tvoří mono- nebo multi-lamelárními hydratovanými kapalnými krystaly, které se dispergovaly ve vodném roztoku. Může se použít libovolný netoxický fyziologicky přijatelný a metabolizovatelný lipid schopný tvořit lipozómy. Kompozice v lipozomové formě mohou obsahovat vedle látek podle vynálezu stabilizátory, konzervační činidla, ekcipienty a podobně. Preferovaným.! lipidy jsou fosfolipidy a fosfatidylcholiny (lecitiny), jak přirozené tak syntetické. Metody pro tvorbu iipozómů jsou dobře známy v oboru (Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academie Press, New Yourk, N.Y. (1976), p. 33 et seq.).

Při shora uvedené léčbě nebo při jiném druhu léčby se použije terapeuticky účinné množství jedné z kompozic podle vynálezu v čisté formě nebo v případě, že takové formy existují, ve formě farmaceuticky přijatelné sole a s nebo bez farmaceuticky přijatelného nosiče. Terapeuticky přijatelné množství látky podle vynálezu znamená dostatečné množství látky pro. léčbu angiogenního onemocnění (např. omezení růstu nádoru, zablokování nebo zpomalení vzniku metastáz nádoru) r i při přijatelném poměru phi/riziko, který se dá aplikovat na libovolný způsob léčby. Rozumí se však, že mód aplikace by měl určit lékař. Specifická terapeuticky účinná dávka pro libovolného pacienta závisí na různých faktorech, které zahrnují druh léčené poruchy a stádium poruchy; aktivitu použité specifické látky; použitou specifickou látku; věk; tělesnou hmotnost, obecný zdravotní stav, pohlaví a dúatetické návyky pacienta; čas aplikace; způsob aplikace; rychlost exkrece specifické použité látky; trvání léčby; kombinace použitých medikamentů a specifikách látek podle vynálezu a podobných faktorů, které jsou dobře známy v oboru.

• * • · ··· • f «4 ί· .4 -9 ·· ·«»

Odborníkovi je známo,: že, aby se dosáhlo požadovaného terapeutického účinku, je vhodné začit s nižší dávkou, která se postupně zvyšuje, až se dosáhne požadovaného účinku. Celková denní dávka peptidových fragmentů smyčky 5 nebo fúzních proteinů, které se lidem nebo jinému savčímu hostiteli aplikují lokálně nébo systematicky v jedné nebo v rozdělených dávkách, je například od 0,000 1 do 200 mg/kg tělesné hmotnosti a nebo více obvyklé je dávka 1 až 300 mg/kg tělesné váhy. Je-li to nutné účinná denní dávka se může rozdělit do více dávek. Kompozice podávaná v jedné dávce může obsahovat takové množství nebo jeho násobek menší než jedna, aby -se dala aplikovat denní dávka.

Rozumí se, že činidla, která se mohou kombinovat s látkou podle vynálezu vhodnou pro inhibici, léčbu nebo profylaxi angiogenních onemocnění nejsou omezena na látky uvedené shora v textu, ale v principu zahrnují libovolná činidla pro léčbu nebo profylaxi angiogenních onemocnění.

Vynález také popisuje izolované polynukleotidy, které kódují savčí peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein, který vykazuje aktivitu inhibující angiogenezi. Takové polynukleotidy se mohou použít při expresi rekombinantních peptidových fragmentů smyčky 5 nebo při genové terapii (jak se popisuje dále v textu).

Polynukleotid podle vynálezu se může vyskytovat ve formě mRNA nebo DNA. V tomto vynálezu, se také popisují polynukleotidy ve formě DNA, cDNA, genomové DNA a syntetické DNA. DNA může být dvouřetězcová nebo jednořetězcová a jestliže je jednořetězcová může se jednat o kódující (sense) řetězec nebo. nekódující (anti-sense) řetězec. Polynukleotid podle vynálezu může být v nemodifikované formě nebo zahrnuje modifikace jako je metylace nebo úprava čepičkou.

Kódující sekvence, která kóduje polypeptid může být stejná jako zde popisovaná kódující sekvence nebo se může » « · « * · · · v · ·* lišit, jako výsledek redundance a degenerace genetického kódu, přičemž kóduje stejný polypeptid jako zde popsaná DNA. Tento 'polynukleotid může zahrnovat' pouze kódující sekvenci pro polypeptid nebo kódující sekvenci pro polypeptid a další kódující sekvenci, jako je vedoucí nebo sekreční · sekvence nebo pro-proteinová sekvence nebo kódující sekvence polypeptidu (a další kódující sekvenci) a nekódující sekvenci, jako je nekódující sekvence 5'a/nebo 3'kódující sekvence polypeptidu.

Navíc vynález zahrnuje různé polynukleotidy obsahující modifikace, jako jsou delece polynukleótidů, substituce nebo adice; a libovolné modifikace polypeptidu, které vznikají z různých polynukleotidových sekvencí. Polynukleotid podle vynálezu může mít kódující sekvenci, která je přirozeně se vyskytující alelová varianta zde popsané kódující sekvence.

Navíc kódující sekvence polypeptidu se může fúzovat ve stejném čtecím rámci s polynukleotidovou sekvencí, z kterého se exprimuje a sekretuje polypeptid v hostitelské buňce. Je to například vedoucí sekvence, která funguje jako sekreční sekvence řídící transport polypeptidu z buňky. Polypeptid mající vedoucí sekvenci je pre-protein a může mít vedoucí sekvenci štěpenou hostitelskou buňkou za vzniku polypeptidu. Polynukleotidy mohou také kódovat pro-protein, který je tvořen proteinem plus dalšími 5' aminokyselinovém! zbytky. Protein, který má pro-sekvenci je pro-protein a může v některých případech být neaktivní formou proteinu. Jestliže je pro-sekvence štěpena, zůstává- aktivní protein. Polynukleotid podle vynálezu může kódovat protein nebo protein, který má pro-sekvenci, nebo protein, který má presekvenci (vedoucí sekvenci) a pro-sekvenci.

Polynukleotidy podle vynálezu mohou také mít kódující sekvenci fúzovanou v rámci s markerovou sekvencí, která umožňuje čištění polypeptidu podle vynálezu. Markerová •9 ♦

999 999 • 9 ·**9·*·· 9

9· 999 sekvence může být sekvencí GST tag doplněná vektorem pGEX, přičemž v případě bakteriálního hostitele vzniká za účelem čištění polypeptidu fúzovaný polypeptid s markrem. Markerová sekvence může být například hemaglutinin (HA)tag, v případě, že se používá savčí hostitel, např. buňky COS-7. Sekvence HA tag koresponduje s epitopem odvozeným od hemaglutininového proteinu viru influenza (I.· Wilson, et al., Cell 37: 767 (1984)).

Polynukleotid se může generovat libovolným způsobem, jako například chemická syntéza, replikace, reverzní transkripce nebo transkripce, která je založena na informací poskytovanou sekvencí baží v oblasti (oblastech), ze kterých je odvozen polynukleotid; což může být reprezentant buď sense nebo antisense orientace původního polynukleotidu. Preferovanou metodou vzniku polynukleotidu je polymerázová řetězcové reakce, která se popisuje v U.S. patentu 4,683,195 a 4,683,202.

Předpokládá se, že polynukleotidy hybridizují se zde popsanými sekvencemi, jestliže vykazují -nejméně 50%, s výhodou 70% shody mezi polynukleotidem a sekvencí.

Vynález také zahrnuje vektory, které obsahují polynukleotidy podle vynálezu, hostitelské buňky, do kterých se vnáší vektory podle vynálezu a způsoby rekombinantí produkce polypeptidů -podle vynálezu. Takové metody zahrnují kultivaci hostitelských buněk za podmínek vhodných pro expresi polynukleotidu odvozeného od smyčky 5 a izolaci z kultury polypeptidu odvozeného od smyčky 5.

Polynukleotidy podle vynálezu se mohou použít při produkci polypeptidu postupy genového inženýrství. Polynukleotidová sekvence může pak zahrnovat jeden z expresívních vehiklů, zvláště vektorů nebo plazmidů pro expresi polypeptidu. Takové vektory zahrnují chromozomální, nechromozomální a syntetické sekvence DNA, například deriváty •ΒΒ 999 • 9 99

999 _t * ΒΒΒ Β « • Β 9 9 9 * β -9 · * · «9 999 Β9

SV40; bakteriální plazmidy, fágovou DNA; kvasinkové plazmidy, ? ί C Váná <4 J, k-?

r>l o Γττη i ÁIii £Z -k CA- íj ALL-L S-4 U.

o rrr\Trc« . v? v O

ΠΜ7\

Vlli l· f

DNA, jako je vakcinie, adenoviry, virus spalniček a virus planých neštovic. Může se však použít libovolný jiný vektor nebo plazmid, který se replikuje v hostiteli a je pro něj vhodný.

Vhodná sekvence DNA se může začlenit do vektoru různými způsoby. Sekvence DNA se začlení do vhodného restrikčního místa postupem, který je dobře znám v oboru. Takové a jiné postupy jsou dobře známy v oboru. Sekvence DNA je v expresivním vektoru operabilně spojena s vhodnou expresivní řídící sekvencí (sekvencemi) (jako je promotor), aby řídila syntézu mRNA. Reprezentativní příklady takových promotorů zahrnují, ale nejsou limitovány na promotor LTR nebo SV40, promotor lac nebo trp bakterie E.coli, promotor fága lambda P sub L a jiné promotory, které kontrolují expresi genů v prokaryontních a eukaryontních buňkách nebo jejich virech.. Expresivní vektor také obsahuje ribozómové vazebné místo pro iniciaci translace a terminátor transkripce. Vektor může také zahrnovat vhodné sekvence pro amplifikaci exprese. Expresivní vektory navíc obsahují gen, který poskytuje fenotyp vhodný pro selekci transformovaných hostitelských buněk, jako je dihydrofolátová reduktáza nebo v případě kultury eukaryontních buněk jde o rezistenci na neomycin nebo u bakterií E.coli je to rezistence na tetracyklin nebo ampicilin.

Vektor obsahující vhodnou sekvenci DNA, která je stejně dobře popsaná jako shora uvedený vektor a řídící sekvence, se může použít pro transformaci vhodného hostitele, přičemž umožní hostiteli exprimovat protein. Jako reprezentativní vzorky vhodných hostitelů se uvádějí bakteriální buňky, jako je E. coli, Salmonella typhimurium; Streptomyces spp.; buňky hub, jako jsou kvasinky; hmyzí buňky, jako je Drosophila a

Sf9; a zvířecí buňky, jako je CHO, COS nebo Bowes atd, ereomélsuí vynalezu je také selekce vnodneho hostitele.

Vynález také zvláště zahrnuje rekombinantí konstrukce obsahující jednu nebo více 2de popsaných sekvencí. Konstrukce obsahují vektor, jako je virový vektor, do kterého se sekvence začlení, buď v přímé nebo obrácené orientaci. V preferovaném provedení vynálezu konstrukce dále obsahuje regulační sekvence například promotor operabilně spojený se sekvencí. V oboru je známo velké množství vhodných vektorů a promotorů a jsou běžně dostupné. Následující vektory se popisují způsobem příkladů. Bakteriální vektory jsou: pSPORTl (GIBCO BRL, Gaithesburg, MD), pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen) pBS, phagescript, psiX174, pBluescript SK, pBsKS·, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene®, La Jolla, CA) ; pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia®) . Eukaryontní vektory: pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene®) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia®). Může se použít libovolný jiný vektor nebo plazmid, pokud je replikovatelný v hostiteli a pokud je pro něj také vhodný.

Promotorové oblasti se mohou vybrat z libovolného požadovaného genu za použití vektorů CAT (chloramfenikolová transferáza) a jiných vektorů se selektovatelnými markéry. Dva vhodné vektory jsou pKK232-8 a pCM7. Zvláště jmenované bakteriální promotory zahrnují láci, lacZ, T3, SP6, T7, gpt, lambda P sub R, P sub L, P sub L a trp. Eukaryontní promotory zahrnují časný promotor cytomegaloviru (CMV), tymidinovou kinázu viru herpes simplex (HSV), časný a pozdní promotor SV 40, promotor LTR z retroviru a myší metallothionein-I. Způsob selekce vhodného vektoru a promotoru je pro odborníka zřejmý.

V dalším provedení vynálezu se popisují hostitelské buňky obsahující shora popsanou konstrukci. Hostitelskou buňkou může být buňka vyššího eukaryonta, jako je savčí buňka, nebo buňka nižšího eukaryonta, jako je kvasinková

* · ·

0»« buňka, nebo hostitelskou buňkou může být prokaryontní buňka, jako je bakteriální buňka. Zavedení konstrukce do hostitelské buňky se může ovlivnit transfekcí s fosforečnanem vápenatým, transfekcí zprostředkovanou DEAE-Dextran nebo elektroporací (L. Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 2^ndedition, Appleton and Lang, Pramount Publishing, East Norwalk, CT (1994)).

Konstrukce v hostitelských buňkách se mohou použít běžným způsobem za účelem produkce genového produktu rekombinantí sekvencí. V jiném případě polypeptidy podle vynálezu se mohou produkovat syntetickou cestou na běžných peptidových syntetizérech.

Proteiny se mohou exprimovat v savčích buňkách, v kvasinkách, bakteriích nebo v jiných buňkách za řízení vhodných promotorů. Bezbuněčné translacní systémy se mohou také použít při produkci takových proteinů za použití RNA pro konstrukci DNA podle vynálezu. Vhodné klónovací a expresivní vektory, které se mohou použít u prokaryontních a eukaryontních hostitelů, jak se popisuje v publikaci Sambrůok et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989).

Transkripce DNA, která kóduje polypeptidy podle vynálezu, ve vyšších eukaryontech se zesiluje inzercí sekvence zesilovače do vektoru. Zesilovače jsou cis-působící elementy DNA, jejichž obvyklá velikost je od 10 do 300 bp. Zesilovač působí na promotor, aby zesílil svojí transkripci. Příklady zahrnují zesilovač SV40 na pozdní straně počátku replikace (bp 70 až 270), zesilovač časného promotoru cytomegaloviru, zesilovač na pozdní' straně počátku replikace viru polyoma a adenovirové zesilovače.

Rekombinantí expresivní vektory budou zahrnovat počátky replikace a selekční markéry, které umožňují transformaci hostitelské buňky, například gen rezistence na ampicilin φ φ · φ·· φφφ bakterie Ε. coli a gen TRPÍ S.cerevisiae a promotor ze silně exprimovaného genu, aby řídil transkripci dcwnstreamstrukturní sekvence. Takové promotory se mohou odvodit z operonů, . které kódují glykolytické enzymy, jako je mezi jinými 3-fosfoglycerátkináza (PGK), faktor alfa, kyselou fosfatázu nebo proteiny teplotního šoku. Heterogenní strukturní sekvence je uspořádána ve vhodné fázi s iniciačními a terminačními sekvencemi translace a je výhodné, aby vedoucí sekvence byla schopna řídit sekreci přeloženého proteinu do periplazmatického prostoru nebo do extracelulárního média. Heterogenní sekvence 'může kódovat fúzní protein, který zahrnuje N-terminální identifikační peptid, jenž propůjčuje fúznímu proteinu požadované charakteristiky, např. stabilizaci nebo zjednodušené čištění exprimovaného rekombinantního produktu.

Expresní vektory použitelné u bakterií se konstruují inzercí strukturní sekvence DNA, která kóduje požadovaný s vhodnými iniciačními a terminačními v operabiině čtecí fázi bude obsahovat jeden fenotypických selektovatelných markérů a původ replikace, aby se zaručilo udržení vektoru a, jestliže je to nutné, vektor umožní amplifikaci v hostiteli. Mezi vhodné prokaryontní hostitele pro transformaci patří E.coli, Bacillus subtilis, Salmonellatyphimurin a různé . specie rodu Pseudomonas, Streptomyces a Staphylococcus. V prakci se mohou také použít j iné druhy

Použitelné expresivní vektory v případě bakterii obsahují selekční markér a bakteriální počátek replikace, který je odvozen od plazmidů obsahujících genetické elementy dobře známého klónovacího vektoru pBR322 (ATCC37017). Jiné vektory zahrnují, ale nejsou omezeny na PKK223-3 (Pharmacia® Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) a GEMI (Promega Biotec, protein dohromady signály translace promotorem. Vektor s funkčním nebo více • · ·

Madison, WI). Tyto základní sekce plazmidu pBR322 se kombinují s vhodným promotorem a strukturní sekvencí, která se má exprimovat. .

Použitelné expresivní vektory mohou také obsahovat fúzního partnera, který umožňuje jednoduché čištění žádaných polypeptidů. Příklady dostupných fúzních vektorů zahrnují, ale nejsou omezeny na vektor pET32a (Novagen, Madison, WI), pGEX-4T-2 (Pharmacia®) a pCYB3 (New England Biolabs, Beverly, MA) . Za účelem dosáhnout vysokého stupně exprese peptidových fragmentů smyčky 5 nebo fúzních proteinů v bakteriálních buňkách se mohou konstruovat expresivní vektory, které brání použití fúzních partnerů. Vektory se například mohou připravit tak, aby se optimalizovalo translační párování, jak popisuje Pilot-Matias, T. J., et al., in Gene, 128: 219-225 (1993). V jiném případě polynukleotid podle vynálezu se může exprimovat dohromady se separovaným připojeným plazmidem, který kóduje protein nebo peptid napomáhající rozpustnosti prvního peptidu (Makrides, S. C., Microbiological Reviews, 60: 512 (1996))). Jisté peptidové fragmenty smyčky 5 (které vykazují produkci rozpustných fúzních proteinů s tioredoxinem (příklad 20) ) se například mohou exprimovat z nefúzního vektoru současně (to znamená ve stejné hostitelské buňce) jako druhý vektor, jenž exprimuje tioredoxin.

Následuje transformace vhodného hostitelského kmene a jeho kultivace až do dosažení vhodné optické hustoty buněk, přičemž vybraný promotor se potlačuje vhodným způsobem (např. posunem teploty nebo chemickou indukcí) a kultivace buněk pokračuje. Buňky se v typickém případě shromáždí centrifugací, buněčná stěna se poruší fyzikálním nebo chemickým způsobem. Vzniká surový extrakt, který se podrobí dalšímu čištění. Mikrobiální buňky, které se používají při expresi proteinů se mohou porušit libovolnou z běžných metod. Mezi tyto metody patří cyklus rozmražení a zmrazení, ·· · ·*· • · αβ φ *

Μ · · · sonikace, mechanické rozrušení nebo použití lyžujícího činidla; takové metody jsou dobře známy v oboru. Při expresi rekombinantního proteinu se také mohou použít různé kultivační systémy savčích buněk. Příklady savčích expresivních systémů zahrnují buněčné linie COS-7, což jsou fibroblasty opičích ledvin popsané v publikaci Gluzman, Cell 23: 175 (1981) a jiné buněčné linie schopné exprímovat kompatibilní vektor, jako je C127, 3T3, CHO, HeLa a BHK. Savčí expresivní vektory obsahují počátek replikace, vhodný promotor a zesilovač a také, je-li to nezbytné, ribozomální vazebná místa, polyadenylační místo, donorová a akceptorová místa sestřihu, terminační sekvence transkripce a nepřepisované sekvence lemující 5'-konec. Za účelem získání požadované nepřepisovaných genetických elementů se mohou použít sekvence DNA odvozené z virového genomu SV40. Je to například počátek replikace SV40, časný promotor, zesilovač, polyadenylační místa a místa sestřihu. Mezi reprezentanty použitelných vektorů patří pRc/CMV , a pcDNA3 (které jsou dostupné u firmy Invitrogen, San Diego, CA) .

Vynález dále popisuje genovou terapii, přičemž u pacienta se reguluje gen kódující peptidové fragmenty smyčky 5 nebo peptidové fragmentové konjugáty smyčky 5. Různé metody, které umožňují transfer nebo zavádění DNA do buněk za účelem exprese proteinového produktu genu, což se označuje jako genová terapie, se. popisují v publikaci Gene Transfer into Mammalian Samatic Cells in vivo, N. Yang, Crit. Rev. Biotechn. 12(4): 335-356 (1992). Genová terapie zdůrazňuje inkorporaci polynukleotidových sekvencí do somatických buněk nebo do linie zárodečných buněk, což se dále využívá buď při terapii ex vivo nebo in vivo. Při genové terapii dochází k výměně genů, aby se dosáhlo normální nebo abnormální genové funkce a dalo se vzdorovat infekčnímu onemocnění a jiným infekčním agents.

« · • * ·· • · · »«· ·*·

Strategie léčby zdravotních problémů pomocí genové terapie zahrnuje terapeutické strategie,- jako je identifikace defektivního genu a pak přidání funkčního genu, který buď nahradí funkci defektního genu nebo posílí slabě fungující gen. Nebo jsou to profylaktické strategie, jako je adice genu, který kóduje proteinový produkt. Tento proteinový produkt se použije při léčbě patologických stavů nebo umožní, aby tkáně a orgány byly citlivější na režim léčby. Příkladem profylaktické strategie je, že se gen kódující peptidový fragment smyčky 5 nebo konjugát peptidových' fragmentů smyčky 5 zavede do pacienta, čímž se předchází výskytu angíogeneze, nebo se do pacienta může zavést gen, čímž se nádorové buňky mohou stát citlivější k záření, což znamená, že při ozáření nádoru odumře více nádorových buněk.

V tomto vynálezu se popisuje řada protokolů, jenž se používají při transferu DNA kódující smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5 regulačních sekvencí DNA peptidového fragmentu smyčky 5 (nebo regulačních sekvencí fúzních partnerů). Genová terapie podle vynálezu také zahrnuje transfekci promotorových sekvencí jiných než jsou ty spojené s peptidovým fragmentem smyčky 5 nebo jiných sekvencí, které zvýší produkci peptidových fragmentů smyčky 5. Příklad tato technologie se popisuje v publikaci Transkaryotic Therapies, lne., of Cambridge, Massachusetts. Pro inzerci genového přepínače se používá metoda homologní rekombinace, která umožňuje přepínání genu erytropoitinu v buňkách, jak se popisuje v publikaci Genetíc Engineering News, April 15, 1994. Takové genové přepínače se mohou použit při aktivaci peptidového fragmentu smyčky 5 (nebo receptoru smyčky 5) v buňkách, které normálně uvedené proteiny neexprimují.

Metody transferu genů při genové terapii se dělí do tří kategorií: (1) fyzikální (např. elektroporace a bombardování peptidový fragment nebo při transferu

444 44*

4

1« *0 φ 4 4 44 4 4 4 «4 4 4 » ·

4 4 4 4 4 · «·» 44 44 částicemi) (2) chemické (např. nosiče založené na lipidech a jiné nevirové vektory) a (3) biologické (např, vektory odvozené od virů). Například nevirové vektory, jako jsou lipozomy potažené DNA, se mohou do pacienta zavést přímo intravenózní injekcí. Věří se, že komplexy lipozom/DNA se koncentrují v játrech, kde DNA vstupuje do makrofágů a Kupfférových buněk. Vektory nebo jiná nahé genová DNA se může také přímo zavést injekcí do požadovaného orgánu, tkáně nebo nádoru za účelem cíleného zavádění terapeutické 'DNA.

Metodologie genové terapie se také popisuje místem zavedení. Základní způsob zavedení genů zahrnuje transfer genu ex vivo, transfer genu in vivo a transfer genu in vitro. Při transferu genu ex vivo se buňky odeberou z pacienta a kultivují se v kultuře. Buňky se transfekují DNA a transfekované buňky se pomnoží a implantují se zpět do pacienta. Při genovém transferu in vivo transformované buňky jsou buňky rostoucí v kultuře, jako jsou buňky tkáňových kultur, a ne určité buňky z určitého pacienta. Tyto laboratorní buňky se transfekují,. izolují se transfekované buňky, pomnoží se a implantují se zpět do pacienta nebo se použijí pro jiné účely. Transfer genu in vivo zahrnuje zavedení DNA do buněk pacienta, kdy buňky neopouštějí tělo pacienta. Všechny tři shora popsané kategorie se mohou použít při transferu genu in vivo, ex vivo a ín vitro.

Mechanické (to je fyzikální) metody zavedení DNA jsou mikroinjekce DNA do zárodečných nebo somatických buněk, pneumatické zavedení partikulí potažených DNA, jako jsou částice zlata, které se používají v tzv. genových zbraních přístupy z anorganické chemie, jako je například transfekce. fosforečnanem vápenatým. Zjistilo se, že pomocí fyzikální injekce plazmidové DNA do svalových buněk dochází k transfekci velkého procenta buněk a uvedené buňky vykazují stálou expresi markerového genu. Plazmidová DNA se může nebo * ··· nemusí integrovat do genomu buněk. Jestliže nedojde k začlenění transfekované DNA, umožňuje to transfekci a expresi genových proteinových produktů v terminálně diferenciovaných, neproliterovaných tkáních po prodlouženou dobu. bez nebezpečí mutovaných inzercí, delecí nebo změn v buněčném nebo mitochondriálním genomu. Dlouhodobý, ale ne nezbytně trvalý transfer terapeutických genů do specifických buněk, umožňuje léčbu genového onemocnění nebo použití při profylaxi. DNA se může zavádět injekcí periodicky, aby se udrželo množství genového produktu, aniž se v genomech recipientních buněk objeví mutace. Jestliže se exogenní DNA nezačlení, je možná přítomnost několika konstrukcí exogenní DNA v jedné buňce s tím, že všechny konstrukce exprimují různé genové produkty.

Transfer genu zprostředkovaný částicemi se může použít pro zavedení DNA do buněk, tkáně a orgánů pomocí injekce. Jestliže se používají přístroje pro bombardování částicemi nebo tzv. genové zbraně, generuje se rychlost, aby se partikulím s vysokou hustotou, potaženým DNA (vhodným materiálem pro partikule jsou zlato a wolfram) udělila vysoká rychlost, která jim umožní vstoupit do cílových orgánů, tkání a buněk. Elektorporace, která je vhodná při transferu genu, používá elektrický proud, aby se buňky nebo tkáně staly přístupné transferu genu. Používá se krátký elektrický impuls s daným silovým polem, aby se zvýšila permeabilita membrány takovým způsobem, že molekuly DNA mohou vniknout do buněk. Způsoby transferu genu prostřednictvím partikul! a elektroporace jsou dobře známy v oboru.

Chemické metody genové terapie zahrnují transfer genu zprostředkovaný nosičem za použití fúzogenních partikul!, jako jsou lipozomy nebo jiné vehikiy pro membránovou fúzi. Nosič nesoucí DNA může být vhodně začleněn do tělních tekutin nebo do krevního řečiště a pak je místně specificky řízen do cílového orgánu nebo tkáně v těle. Může se například vyvinout « · ·

44· «44 buněčně nebo orgánově specifická DNA, kterou nesou lipozomy a která je absorbovaná těmito specifickými buňkami. Injekce imunolipozomů, které jsou cílené na specifický receptor na určitých buňkách se může použít jako vhodná metoda inzerce DNA do buněk nesoucích receptor. Jiným použitelným nosičovým systémem je asialoglykoprotein/polylyzin konjugační systém, který je vhodný pro zavedení DNA do hepocytů při transferu genu in vivo,

Transfekovaná DNA může být také v komplexu s jinými druhy nosičů tak, že DNA se zavede do recipientní buňky, a pak se uloží do cytoplazmy nebo nukleoplazmy. DNA se může párovat s nosičovými jadernými proteiny ve specificky připravených komplexech a vnáší se tak přímo do jádra.

Transfer genu zprostředkovaný nosičem může také zahrnovat použití sloučenin na bázi lipidů, které nejsou lipozomy. Lipofektiny a cytofektiny jsou pozitivní ionty na bázi lipidů, které se váží na negativně nabitou DNA, a tvoří komplex umožňující přenést DNA skrz buněčnou membránu. Jiným způsobem transferu genu zprostředkovaným nosičem je endocytóza založená na receptoru. Při této metodě se vytvoří komplex ligand (který je specifický pro buněčný povrchový receptor) s genem a ten se pak injekcí zavede do krevního řečiště. Cílové buňky, které pak mají buněčný povrchový receptor, se budou specificky vázat na ligand a dochází ke transportu komplexu DNA-ligand do buňky.

Biologické metody genové terapie používají pro zavedení genů do buněk virové nebo nevirové vektory (jako konjugáty ligand-DNA, lipozomy a shora uvedené komplexy ligand-DNA). Transfekované buňky mohou být buňky získané z normální tkáně pacientů, pacientovi nemocné tkáně nebo z buněk, které nepocházejí z pacienta.

Může být nutné, že rekombínantí molekula DNA obsahující sekvenci DNA peptidového fragmentu smyčky 5 nebo sekvenci DNA « « fúzního proteinu smyčky 5 je operabilně spojena s expresivní kontrolní sekvencí za vzniku expresivního vektoru schopného exprimovat peptidový fragment - smyčky 5 nebo fúzní protein. V jiném případě genová regulace peptidového fragmentu smyčky 5 nebo fúzního proteinu smyčky 5 se může uskutečnit aplikací látek, které se váží na gen smyčky 5, fúzním partnerským genem nebo kontrolními oblastmi spojenými s genem smyčky 5 nebo genem jeho fúzního partnera nebo se váží na odpovídající transkript RNA za účelem modifikace rychlosti transkripce nebo translace.

Virové vektory, které se používaly podle protokolů metod genové terapie, zahrnují, ale nejsou omezeny na retroviry, jiné RNA viry, jako jsou poliovirus nebo virus Sindbis, adenovirus, adeno-asociované viry, herpes virus, SV 40, virus vakcinie a jiné DNA viry. Jako transferové vektory genů se mohou také využívat replikačně defektní myší retrovirové vektory. Retroviry myší leukemie tvoří jednořetězcová RNA, která je. v komplexu s proteinem jaderného core a polymerázovými (pol) enzymy. Komplex je opouzdřen proteinovým core (gag) a je obklopený glykoproteinovým obalem (env), který určuje rozmezí hostitelů. Genomová struktura retrovirů zahrnuje geny gag, pol a env, které sousedí s 5'a 3'dlouhými terminálnimi repeticemi (LTR). Retrovirové vektorové systémy využívají skutečnost, že minimální vektor obsahující 5'a 3'LTR a balící signál je dostatečný, aby umožnil balení vektoru a infekci a integraci do cílových buněk, přičemž virové strukturální proteiny se dostávají iň trans do balicí se buněčné linie. Základními výhodami retrovirových vektorů při' transferu genů je účinná infekce a exprese genu ve většině buněčných typů, integrace vektoru do chromozomální DNA cílové buňky s přesnou jedinou kopií a jednoduchá manipulace retrovirového genomu. Změněné retrovirové vektory se například používají při metodách ex vivo při zavedení genů »»» ♦ · · ·

9 · «· .999-*

99* »9 do periferních a nádor infiltrujících lymfocytů, hepatocytů, epidermálních buněk, myocytů nebo jiných .somatických buněk (které se pak mohou zavést do pacienta, aby vznikl genový produkt z inzerované DNA).

Adenovirus tvoří lineární dvouřetězcová DNA, která je v komplexu s proteiny core a je obklopen kapsidovými proteiny. Výhody molekulární biologie spočívají ve schopnosti využít biologii těchto organizmů pro vznik vektorů schopných transdukovat- nové genetické sekvence do cílových buněk ín vivo. Vektory založené na adenovirech vykazují silnou expresi genových peptidových produktů. Adenovirové vektory mají vysoce účinnou infekčnost, dokonce při nízkém titru viru. Navíc virus je plně infekční ve formě bezbuněčných'virionů, proto není nezbytné injektovat producenta buněčné linie. Jinou , potencionální výhodou adenovirových vektorů je schopnost dosáhnout dlouhodobé exprese heterogenních genů ín vivo.

Virové vektory se také používají pro inzerci genů do buněk za použití protokolů in vivo. Při řízení tkáňové specifické exprese cizích genů se mohou používat cis-působící regulační elementy nebo promotory, o kterých se ví, že jsou tkáňově specifické. V jiném případě toho lze dosáhnout použitím in sítu zavedením DNA nebo virových vektorů do specifických anatomických míst in vivo. Přenosu genu do krevních cév in vivo se například dosahuje implantací ín vitro transdukovaných endoteliálních buněk- do vybraných míst na arteriálních stěnách. Okolní buňky infikované virem také exprimují produkt genu. Virový vektor se může zavést přímo do místa in vivo (například použitím katetru), což umožňuje virem infikovat pouze určité oblasti a dlouhotrvající místně specifickou genovou expresi. Také se demonstroval transfer genu in vivo za použití retrovirových vektorů do savčí tkáně • · φφφ φ φφ* φ

4 *Φ· *

φφβ • φ » φ φ » φ · φφφ • 4 Φφφ— φφ a hepatické tkánětak, že se do krevních cév, které prokrvují orgány, zavede pozměněný virus injekcí

Peptidové fragmenty smyčky 5 se mohou také produkovat a použít při různých aplikacích. Například různé peptidové fragmenty smyčky 5 se mohou použít (1) jako agonisty a antagonisty aktivní ve vazebných místech smyčky 5, (2) jako antigeny pro vývoj specifického antiséra, (3) jako peptidy při použití jako diagnostické kity a (4) jako peptidy spojené s cytotoxickýmí činidly nebo používané společně s cytotoxickýmí činidly za účelem cíleného usmrcování buněk, které vážou peptidové fragmenty smyčky 5. Na základě polohy v externích oblastech molekuly se aminokyselinové sekvence, které obsahují uvedené peptidové fragmenty, mohou vybrat na základě pozic baží v externích oblastech molekuly, která je náchylná pro navázání antiséra nebo má potenci inhibovat procesy vznikající angiogenezí. Dále tyto peptidové sekvence se mohou srovnat se známými sekvencemi za použití databáze proteinových sekvencí, jako je GenBank, Brookhaven Protein, SWISS-PROT a PIR za účelem stanovení potencionální sekvenční homologie. Tyto informace umožňují eliminovat sekvence, které vykazují vysoký stupeň homologie s jinými molekulami, čímž se zvyšuje potenciál pro vysokou specifitu při vývoji antiséra, agonistů a antagonistú se smyčkou 5.

Peptidové fragmenty smyčky 5 a fúzní proteiny se také ' mohou použít za účelem izolace receptoru smyčky 5 imobilizací peptidového fragmentu smyčky 5 nebo fúzního proteinu na pevném povrchu například v afinitních kolonách, kterými kultivované endoteliální buňky nebo membránové extrakty procházejí. Jak je známo v oboru izolace a čištění receptoru smyčky 5 může být následováno sekvenováním aminokyselin za účelem identifikace a izolace polynukleotidů, které kódují receptor smyčky 5. Takové polynukleotidy se pak mohou klonovat do vhodného expresivního vektoru a transfekovat do > 000 nádorových buněk. Exprese receptoru transfekovanými nádorovými buňkami může zvýšit odezvu těchto buněk na endogenní nebo exogenní peptidové fragmenty smyčky 5, přičemž se snižuje rychlost růstu metastáz. Rekombinantí exprese tohoto receptoru dále umožňuje, aby se produkovalo větší množství receptoru, například, aby se produkovalo dostatečné množství pro test s vysokou propustností za účelem identifikace menších antagonistů, které napodobují působení smyčky 5.

Systematická substituce aminokyselin těmito syntetizovanými peptidy vede ke vzniku agonistů peptidů se silnou afinitou a antagonistů receptoru smyčky 5, které podporují nebo zeslabují navázání peptidového fragmentu smyčky 5 na jeho receptor. Takových agonistů se může použít při potlačení růstu mikrometastáz a tím omezit rozšíření rakoviny. V případech neadekvátní vaskularizace, antagonisty peptidových fragmentů smyčky 5 se mohou aplikovat za účelem zablokování inhibíčních účinků peptidových fragmentů smyčky 5 a podpořeni angiogeneze. Tento typ léčby může mít například terapeutické účinky při podpoře hojení ran u diabetiků.

Peptidové fragmenty smyčky 5 nebo fúzní proteiny nebo konjugáty podle vynálezu se mohou také použít jako antigeny za účelem vzniku polyklonálních nebo monoklonálních protilátek, které jsou specifické pro inhibitor smyčky 5. Takové protilátky se mohou použít při diagnostických metodách a v kitech pro detekci nebo kvantifikaci peptidových fragmentů smyčky 5 v tělních tekutinách nebo tkáni. Výsledky těchto testů se mohou použít pro diagnostiku nebo stanovení prognostické relevance peptidových fragmentů smyčky 5.

Peptidové fragmenty smyčky 5 nebo fúzní proteiny smyčky 5 se mohou značit radioaktivními izotopy (příklad 13) nebo se mohou párovat s proteiny za vzniku konjugátů. Konjugáty zahrnují enzymy, nosičové proteiny, cytotoxická činidla, « · * · · · • * flfl flfl

Λ β O * w ’V V « · « · · · fl v * · · • β · 9 β o flfl fluorescenční, chemoluminiscenční a bioluminiscenční molekuly, které se používají při provedení testu schopnosti látek, jenž obsahují peptidové fragmenty smyčky 5, vázat antiséra smyčky 5, detekovat buněčné typy vykazující receptor peptidového fragmentu smyčky 5 nebo napomáhat čištění peptidových fragmentů smyčky 5. Metoda párování se vybrala na základě funkčních skupin dostupných na aminoskupinách sekvence peptidového fragmentu smyčky 5, které zahrnují, ale nejsou omezeny na alkylovou skupinu, aminoskupinu, sulfhydrylovou, karboxylovou, amidovou, fenolovou, indolylovou a imidazoylovou skupinu. Různá činidla, která se používají, aby ovlivnila párování, zahrnují mezi jinými glutaraldehyd, diazotizovaný benzidin, karbodíimidy a p~ benzochinon. Účinnost pérovací reakce se stanovila použitím různých metod vhodných pro specifickou reakci. Radioaktivní značení peptidu smyčky 5 nebo jeho biologicky aktivního fragmentu například s I¹²⁵ se může provést použitím chloraminu T a Nal¹²⁵ s vysokou specifickou aktivitou. Reakce se ukončí metabísiřičitanem a ze směsi se odstraní sole na kolonách na jedno použití. Značený peptid je eluován z kolony a shromáždí se frakce. Z každé frakce se odeberou alikvoty a radioaktivita se měří na gama počítači. Tento postup poskytuje radioaktivně značený peptidový fragment smyčky 5 bez nezreagovaného Nal¹²⁵. V jiném provedení vynálezu se krevní nebo tkáňový extrakt obsahující peptidový fragment smyčky 5 spojený se smyčkou 4 může čistit na afinitní koloně s polylyzinovou pryskyřicí, přičemž peptidový fragment smyčky 4 - smyčky 5 se váže na pryskyřici prostřednictvím afinity peptidového fragmentu smyčky 4 pro lyzin. Eluce vázaného proteinu poskytne čištěný fragment smyčky 4 - smyčky 5.

Jiná aplikace peptidového konjugátu je produkce polyklonálníno antiséra. Produkce antiséra proti peptidovým fragmentům smyčky 5, analogům peptidových fragmentů smyčky 5

I ·« • . · · * * · • · » I ft · ··· ··· • b » « · · *· ··· ·· ·· a receptoru smyčky 5 se může provést za použití zavedené metody dobře známé v oboru. Peptidové fragmenty smyčky 5 obsahující lyzinové zbytky se mohou spojit k čištěnému bovinnímu sérovému albuminu (BSA) za použití glutaraldehydu. Účinnost této reakce se může určit měřením inkorporace radioaktivně značeného peptidů. Nezreagovaný glutaraldehyd a peptid se může separovat dialýzou a konjugát se může použít pro přípravu polyklonálního antiséra v králících, v ovcích, v kozách nebo v jiných zvířatech. Peptidové fragmenty smyčky 5 konjugované s molekulou nosiče, jako je BSA, se může kombinovat se směsí adjuvans, emulgovat a zavést podkožní injekcí do několika míst na zádech, krku, boku a někdy do plosek vhodného hostitele. Opakované injekce se aplikují v pravidelných intervalech, každé 2 až 4 týdny. Přibližně 7 až 10 dnů po každé injekci. Vzorky se získávají z cév například po dilataci marginálních cév. Vzorky krve se nechávají srážet přes noc při. teplotě 4 °C a centrifugují se přibližně při 2 400 x g při teplotě 4 °C po dobu 30 minut. Sérum se izoluje , rozdělí se do alikvotů a skladuje se při teplotě 4 °C, jestliže se má použít bezprostředně pro následnou analýzu nebo při teplotě -20 °C až -90 °C.

Vzorky séra, které vznikly při přípravě polyklonálního antiséra, nebo vzorky média odebrané při produkci monoklonálního antiséra se mohou analyzovat' za účelem stanovení titru protilátek, zvláště pří stanovení vysokého titru protilátek. Pak se testuje nejvyšší titr antiséra peptidového fragmentu smyčky 5, aby se zjistilo následující hodnoty: a) optimální ředění, při kterém dochází největšímu specifickému navázání antigenu a také k jeho nejmenšímu nespecifickému navázání, b) schopnost vázat zvýšené množství peptidových fragmentů smyčky 5 na standardní substituční křivce, c) potenciální zkřížená reaktivita s příbuznými peptidy a proteiny, které zahrnují plazminogen a peptidové b fe · ♦ · · i

t · · i · · ·· ·* fragmenty příbuzných specie a d) schopnost detekovat peptidové fragmenty smyčky 5 v buněčném kultivačním médiu a v extraktech plazmy, moče a tkáně. Titr se může stanovit několika způsoby, které jsou dobře známy v oboru, je to například dot blot a analýza hustoty a také precipitací radioaktivně značeného komplexu peptid-protilátka za použití proteinu A, sekundárního protiséra, chlazeného etanolu nebo aktivní uhlí-dextran. Pak následuje měření aktivity na gama počítači. Je-li to nutné antisérum s nej vyšším titrem se může dále čistit na afinitních kolonách. Peptidové fragmenty smyčky 5 se například mohou spojovat s běžně dostupnými pryskyřicemi a mohou se použít při tvorbě afinitních kolon. Vzorky antiséra pak mohou procházet přes kolonu tak, že protilátky smyčky 5 se vázou {prostřednictvím peptidových fragmentů smyčky 5) na kolonu. Tyto navázané protilátky se následně eluují, izolójí a stanovuje se hodnota titru a specifita.

Vynález dále popisuje kity pro měření peptidových fragmentů smyčky 5 a receptor smyčky 5. Antiséra, která mají nejvyšší titr a specifitu a mohou detekovat peptidové fragmenty smyčky 5 v extraktech plazmy, moče, tkání a buněčného kultivačního média, se mohou použít jako testovací kity pro rychlé, vhodné, citlivé a specifické měření a lokalizaci peptidových fragmentů smyčky 5. Uvedené testovací kity se mohou použít, ale nejsou omezeny na následující metody: kompetitivní a nekompetitivní testy, radioimunologické testy, bioluminiscenční a chemoluminiscenční testy, fluorometrické testy, sendvičové testy, dot bloty, testy navázaných enzymů, mezi něž patří ELISA, testy na mikrotitračních destičkách, imunocytochemické testy a stripy potažené protilátkami nebo papírky pro rychlé vyšetření moče nebo krve. V případě každého kitu je nutné stanovit rozmezí, citlivost, přesnost, vhodnost, specifitu a

9 9 94

4

9 9 9 b

«*» reprodukovatelnost stanoveni způsoby, které jsou dobře známy v oboru.

Příkladem testovacího kitu, který se běžně užívá ve výzkumu a při klinické praxi je kit pro radioimunologický test (RIA) . RIA s peptidovým fragmentem smyčky 5 se může stanovit následujícím způsobem: Po úspěšné radioionizaci a čištění peptidového fragmentu smyčky 5 se přidají do zkumavek obsahujících relativně konstantní množství radioaktivity, jako je 10 000 cpm, ve vhodném sytému pufrů v několika ředěních protilátky proti peptidovému fragmentu smyčky 5. (Pufr nebo preimunitní sérum se přidá do jiných zkumavek za účelem stanovení nespecifického navázání.) Po inkubaci při teplotě 4 °C po dobu 24 hodin se do všech zkumavek přidá protein A a zkumavky se míchají na vortexu, inkubují se při teplotě místnosti po dobu 90 minut a centrifugují se přibližně při 2 000 až 2 500 x g při teplotě 4 °C, aby se izolovala sraženina komplexů protilátka navázaná na značeném antigenu. Supernatant se odsál a radioaktivita peletů se stanovila na gama počítači. Za účelem další charakterizace se vybralo ředění antiséra, které váže přibližně 10 až 40 % značeného peptidu po.odečtení nespecifického navázání.

Dále rozmezí ředění (přibližně 0,1 pg až 10 ng) peptidového fragmentu smyčky 5, které se používá při přípravě antiséra, se hodnotí přidáním známého množství peptidu do zkumavek, které obsahují radioaktivně značený peptid a antisérum. Po inkubační době (např. 24 nebo 48 hodin) se přidá protein A a zkumavky se centrifugují. Dále se odstraní supernatant a určí se radioaktivita peletu. Substituce navázání radioaktivně značeného peptidového fragmentu smyčky 4 za neznačený peptidový fragment smyčky 5 vykazuje standardní křivku. Navíc se do testovacích zkumavek může přidat několik koncentrací peptidových fragmentů smyčky 5, plazminogenů, peptidových fragmentů smyčky 5 z různých specií • * » · *-—-r 9 * κ>·« v « i fr fr fr • fr fr fr · « a · a fr i« a homologní peptidy za účelem charakterizace specifity antiséra proti peptidovému fragmentu smyčky 5.

Extrakty různých tkáni zahrnují, ale nejsou omezeny na primární a sekundární nádory, Lewisův karcinom plic, kultury buněk produkujících peptidový fragment smyčky 5, placentu, dělohu a jiné tkáně, jako je mozek, játra a střeva, které se připraví způsobem, jenž se úspěšně použil při extrakci peptidových fragmentů smyčky 5. Po přípravě extraktů tkáně se přidá testovací pufr a různé alikvoty se dají do zkumavek určených pro test RIA. Extrakty buněk produkujících peptidový fragment smyčky 5 vykazuje substituční křivky, které jsou paralelní ke standardní křivce, zatímco extrakty tkání, které neprodukují peptidové fragmenty smyčky 5, nesubstituuji radioaktivně značené peptidové fragmenty smyčky 5 z antiséra proti peptidovému fragmentu smyčky 5. Takové substituční křivky indikují využití testu peptidového fragmentu smyčky 5 pro měření množství peptidových fragmentů myčky 5 v tkáních a tělních tekutinách.

Tkáňové extrakty, které obsahuji peptidové fragmenty smyčky 5, se mohou také charakterizovat na HPLC s reverzní fází. Shromáždily se eluované frakce, sušily se na zařízení Speed Vac, rekonstituovaly se v pufru RIA a analyzovaly se v testu RIA pro smyčku 5 V tomto případě se maximální množství imunoreaktivity peptidového fragmentu smyčky 5 nachází ve frakcích, které odpovídají pozici eluce peptidového fragmentu smyčky 5.

Shora popsaný testovací kit obsahuje instrukce, antisérum, peptidový fragment smyčky 5 a je možné, aby obsahoval radioaktivně značený peptidový fragment smyčky 5 a/nebo činidla pro precipitaci komplexů peptidový fragment smyčky 5/protilátka smyčky 5. Takový kit se může použít pro měření peptidových fragmentů smyčky 5 v biologických • ·«· • ’· * · · t · * ··· β β β ⁹ «· a·· · * tekutinách a tkáňových extraktech zvířat a lidí s nebo bez nádorů.

Jiný kit se může použít pro vizualizací nebo lokalizaci peptidových fragmentů smyčky 5 v tkáních a buňkách. Imunohistochemické metody a kity, ve kterých se používají takové metody, jsou dobře známy v oboru. V oboru je také známo, že imunohistochemické kity obsahují antisérum proti peptidovému fragmentu smyčky 5 a pravděpodobně blokovací sérum a sekundární antisérum spojené s fluorescenční molekulou, jako je fluorescinizothiokyanát nebo s jiným činidlem, které se používá při vizualizací primárního antiséra. Za použití této metody se mohou u biopsií nádorů testovat místa, která produkují peptidový fragment smyčky 5 nebo místa receptoru peptidového fragmentu smyčky 5. V jiném případě kit obsahuje radioaktivně značené nukleové kyseliny, které se používají při in šitu hybridizaci jako sondy pro mediátorovou RNA peptidového fragmentu smyčky 5.

Látky podle vynálezu se mohou připravovat za použití postupu dobře známého v oboru (např. Sottrup-Jensen et al., Progress in Chemical Fíbrinolysis and Thrombolysis, Vol. 3, Davidson, j. F., Rowan, R. M., Samama, M.M. and Desnoyers, P.C. editors, Raven Press, New Yourk, 1978). Jedním způsobem jak připravit peptidové fragmenty smyčky 5 je enzymatické štěpení nativního proteinu (glu-plazminogen) nebo jeho variant (což znamená zkrácená forma proteinu v plné délce, který je schopný být štěpen enzymy a který obsahuje nejméně sekvenci smyčky 5, jak se definuje shora v textu, jako je lys-plazminogen nebo miniplazminogen). Tato metoda nejdříve vyžaduje izolaci proteinu z lidské plazmy, aniž jsou přítomny inhibitory plazminu, přičemž se podporuje konverze gluplazminogenu na lys-plazminogen (Novokhatny, V and Kudinov,

S.A., J. Mol. Biol. 179: 215-232 (1984). Následně je zkrácená molekula ošetřena proteolytickým enzymem v koncentraci, která • * · * je dostatečná pro štěpení peptidových fragmentů smyčky 5 z polypeptidu, a pak se čistí od zbývajících fragmentů způsobem, jenž je dobře znám v oboru. Preferovaným proteolytickým enzymem je lidská nebo prasečí elastáza, která štěpí plazminogen a jeho zkrácené varianty mezi oblastmi smyčky 3 až 4 a 4 až 5 (a tím je schopná tvořit peptidové fragmenty, které obsahují smyčky 1 až 3 a 1 až 4 nebo samotné smyčky 4 nebo 5) . Lys-plazminogen nebo glu-plazminogen se může například ošetřit prasečí nebo lidskou neutrofylelastázou v poměru okolo 1 : 100 až 1 : 300 lysplazminogenu : elastáze (upřednostňuje se poměr 1 : 150 až 1 : 250 a více se upřednostňuje poměr 1 : 150 v roztoku pufru, jako je Tris-HCl, NaCI, fosforečnan sodný a podobně). V jiném případě se může nejdříve imobilizovat (například na pryskyřici), aby proběhla izolace štěpeného produktu. Gluplazminogen nebo lys-plazminogen se obecně ošetřuje lidskou nebo prasečí elastázou při teplotách, které leží v rozmezí od' přibližně 10 °C do přibližně 40 °C a po dobu od přibližně 4 do přibližně 24 hodin v závislosti na požadovaném rozsahu štěpení. Za účelem dosažení celkového štěpení gluplazminogenu, lys-plazminogenu nebo miniplazminogenu lidskou nebo prasečí elastázou je nutné, aby enzym na polypeptidy působil nejméně okolo 12 hodin ' při teplotě místnosti. Kolísavé pH a doba expozice vede k minimálnímu nebo částečnému štěpení jednoho nebo více přístupných štěpících míst. Produkty štěpení se pak čistí libovolným způsobem, jenž je dobře znám v oboru (jako je . například kolonová chromatografie) . Preferované schéma čištění zahrnuje aplikaci produktů štěpení na kolonu s lyzin-sefározou, jak se popisuje v příkladu 14.

Přehled obrázků na výkrese • ·· • « ··· » · « · · * · » • · α o ·· ·»· ·· • · · · • *«« ··· β

• 9 ··

Obr. č. 1 zobrazuje aminokyselinovou sekvenci lidského plazminogenu (SEQ ID NO: 1).

Obr. č. 2 zobrazuje kc^^rativní homologii aminokyselinových sekvencí lidské (SEQ ID NO: 34), myší (SEQ ID NO: 35) , opice rhesus (SEQ ID NO: 36), hovězí (SEQ ID NO:37) a prasečí (SEQ ID NO: 38) smyčky 5.

Obr. č. 3 zobrazuje sekvenci DNA (SEQ ID NO: 12) lidského plazminogenu.

Obr. č. 4 zobrazuje graf anti-proliferační aktivity jedné dávky různých fragmentů smyčky na bovinní kapilární endoteliální buňky (BCE), které se testovaly in vitro v testu proliferece buněk.

Obr. č. 5 zobrazuje mapu expresivního vektoru pHil-D8, která obsahuje vedoucí sekvenci pro sekreci rekombinantního proteinu.

Obr. č. 6 zobrazuje fotografii SDS-PSGE gel obarveného Coomassieovou modří supernatantů (do jedné dráhy se naneslo 10 μΐ) kultury Pichia pasborís exprimující peptidový fragment nebo fúzní protein smyčky 5- Dráhy 1, 6 a 10 obsahují negativní kontroly, dráhy 2, 3 a 4 obsahují tři odlišné klony exprimující K5A; dráha 5 obsahuje klon exprimující K5F; dráhy 7 a 8 obsahují klony exprimující K4-5A; dráha 9 obsahuje klon exprimující K4-5F. Šipky indikují pruhy proteinů K5A (přibližná molekulová hmotnost je 11 000) a K4-5F (přibližná molekulová hmotnost je 20 000). Markéry molekulových hmotností jsou naneseny v drahách, které předcházejí drahám 1 a 10,

Obr. č. 7 zobrazuje SDS-PAGE gel kmenů E. coli exprimující peptidový fragment a fúzní protein smyčky 5. Není-li jinak uvedeno každá dráha obsahuje 10 μΐ kultury, který je ekvivalentní hodnotě 10 absorbance při vlnové délce 600 nm. Dráha 1 obsahuje markéry nízkých molekulových hmotností. Dráha 2 obsahuje celkovou kulturu K5A/pET32a;

v » * 4 4 44 4444

4 444 4 4 4 4 4 4 4

4 4444 44 444 4*4

4 ιι 3 » 4 4 4 4

4« 444 ·4 444 44 44 dráha 3 obsahuje celkovou kulturu K5A/pET32a (nanesla se 1/10 množství, které je obsaženo v dráze 2); dráha 4 obsahuje rozpustnou frakci K5A/pET32a; dráha 5 obsahuje nerozpustnou frakci K5A/pET32a; dráha 6 obsahuje celkovou kulturu .K45A/pET32a;' dráha 7 obsahuje celkovou kulturu K4-5A/pEŤ32a (nanesla se 1/10 množství, které je obsaženo v dráze 6); dráha 8 obsahuje rozpustnou frakci K4-5A/pET32a; dráha 9 obsahuje nerozpustnou frakci K4-5A/pET32a; dráha 10 obsahuje celou kulturu K4-5A/pGEX-4T-2; dráha 11 obsahuje rozpustnou frakci K4-5A/pGEX-4T-2; dráha 12 obsahuje nerozpustnou frakci K4-5A/pGEX-4T-2; dráha 13 standard smyčky ' 5; dráha 14 obsahuje markéry vysokých molekulových hmotností.

Příklady provedeni vynálezu

Syntéza peptidových fragmentů smyčky 5 na· pevné fázi.

Příklad 1:

N - Ac - Val - Leu - Leu - Pro - Asp - Val - Glu - Thr Pro -Ser - Glu - Glu - Asp - NH₂

Kolona pro.syntézu amidu peptidu (Applied Biosystems) se umístila do Perkin Elmer/Applied Biosynthesis Synergy* syntetizéru peptidu a použily se následující syntetické stupně:

1. Solvatace pryskyřice s DMF po dobu 5 minut;

2. Odblokování skupiny Fmoc z α-N-konce aminokyseliny vázané na pryskyřici za použití 20 % piperidinu v DMF po dobu okolo 15 minut;

3. Promývání pryskyřice s DMF po dobu okolo 15 minut;

4. Aktivace α-C-konce aminokyseliny č. 1 (Fmóc-Asp(β-CŮBu) , 25 μπιοί) za použití 0,2 M roztoku HBTU (25 μπιοί) v DMSONMP (N-metylpyrrolidin) a 0,4 M roztoku φ φ φ -φ φ » « φ φφφ φφφ • φ φ · φφ φφφ φ φ ·· φ · φφφ φφφ φ φ_φφφ φ φ φ φ' ¹ φφφφ • Φ ·*· φφ φφ diizopropylethylaminu (25 μπιοί) v DMSO- ΝΜΡ a spojení aktivované aminokyseliny s pryskyřicí;

5. Spojení aktivované aminokyseliny chráněné skupinou Fmoc (připravené v kroku 5) s aminokyselinou vázanou na pryskyřici (připravenou v kroku 2) v roztoku DMF po dobu přibližně 30 minut;

6. Promývání s DMF po dobu 5 minut;

7. Opakování kroku 3 až 6 s následujícími aminokyselinami:

Č. aminokyselina

2. Fmoc-Glu (y-O^tBu)

3. Fmoc-Glu (y-O^u)

4. Fmoc-Ser (^bBu)

5. Fmoc-Pro

6. Fmoc-Thr (^tBu)

7. Fmoc-Glu (y-O^Bu)

8. Fmoc-Val

9. Fmoc-Asp (P-O^u)

10. Fmoc-Pro

11. Fmoc-Leu

12. Fmoc-Leu

13. Fmoc-Val

8. Spojení kyseliny octové s a-N-koncem peptidů vázaného na pryskyřicí za podmínek uvedených v kroku 4 a 5.

9. Promývání pryskyřice s THF po dobu okolo 5 minut, aby se odstranilo DMF, sražení pryskyřice, sušení pryskyřice v atmosféře argonu po dobu 10 minut a v atmosféře dusíku po dobu dalších 10 minut za vzniku čistého peptidů vázaného na pryskyřici.

10. Odštěpení peptidů z pryskyřice, přičemž dochází k odstranění ochrany z vedlejšího řetězce aminokyseliny

—- -	66	_ - - » w ^w ” 0 ··· 0 0 · 0 0 0 « · «000 «0 0«· » 0______ « 3 9 0 * ·« 0»· 90 «00 0«
smícháním	se	štěpícím	činidlem	(čerstvě	připravený
thioanisol	(100	μΐ), voda	(50 μΐ),	atandithiol	(50 μΐ) a

kyselina trifluorooctová (1,8 ml) při teplotě -5 °C až -10 °C) při teplotě 0 ’C po dobu 10 až 15 minut a pak při teplotě okolí po dalších 1,75 hodiny (plus další půl hodiny pro každý Arg(Pmc), je-li přítomen). Množství použitého štěpícího činidla se stanoví podle následujícího vzorce:

hmotnost pryskyřice s vázaným peptidem (mg)	množství Štěpícího činidla (μΐ)
0 až 10	100
10 až 25	200
25 až 50	400
50 až 100	700
100 až 200	1 200

11. Filtrace a promytí produktu s neředěnou kyselinou trifluoroctovou, do centrifugační zkumavky, která obsahuje přibližně 8 ml chladného dietyleteru se přidá 0,5 ml filtrátu, centrifuguje se a dekantuje. Proces se opakuj.e až se vysráží všechny peptidy (jestliže se všechny peptidy po přidání éteru nevysrážely, směs se extrahuje 30 % vodnou kyselinou octovou (3 x 1 ml) a spojené vodné extrakty se lyofilizovaly za vzniku produktu).

Použití surového peptidů nebo čištěného peptidů na HPLC (za použití 7 pm Symmetry Prep C18 kolony (7, 8 x 300 mm) se směsí rozpouštědel s gradientem od 5 % do 100 % acetonitril(voda, 0,1 % TFA) po dobu 50 minut), pak následuje lyofilizace za' vzniku 35 mg N - Ac - Val - Leu - Leu - Pro Asp - Val - Glu - Thr - Pro - Ser - Glu - Glu - Asp - NH₂, '

Příklad 2:

• <*J « « « ·' · · «·* ··· •ι · · * · ** * i · *♦* « · · • E · , —* * · i · · · » v » * · · ·« ·**. «· ··· ·· ·

N - Ac - Met - Phe - Gly - Asn - Gly - Lys - Gly -Tyr - Arg Gly -Lys - Arg - Ala - Thr - Thr - Val - Thr - Gly - Thr -Pro - nh₂

Látka syntetické č. 1 se přidaly za

Č.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19. '

20.

uvedená v názvu příkladu se připravila za použití sekvence popsané v příkladu 1 a jako aminokyselina použila Fmoc-Pro. Následující aminokyseliny se určených podmínek:

aminokyselina

Fmoc-Thr (^ĚBu)

Fmoc-Gly

Etioc-Thr (^fcBu)

Fmoc-Val

Fmoc-Thr (^tBu)

Fmoc-Thr (^fcBu)

Fmoc-Ala

Fmoc-Arg(Pmc)

Fmoc-Lys(Boc)

Fmoc-Gly

Fmoc-Arg(Pmc)

Fmoc-Tyr ^Bu)

Fmoc-Gly

Fmoc-Lys(Boc)

Fmoc-Gly

Fmoc-Asn(Trt)

Elnoc-Gly

Fmoc-Phe

Fmoc-Met za vzniku 35 mg N. - Ac - Met - Phe - Gly - Asn - Gly - Lys- Gly -Tyr - Arg - Gly -Lys - Arg - Ala - Thr - Thr - Val - Thr - Gly - Thr -Pro - NH₂

Příklad 3:

• 0 000 a 0 *·** »· 0*0 000 _ _TJ 0· ·00 00 ·*· ·♦ ··

Ac - Gin - Asp - Trp - Ala - Ala - Gin - Glu - Pro - His Arg - His - Ser - Ile - Phe - Thr - Pro - Glu - Thr - Asn Pro - Arg - Ala - Gly - Leu - Glu - Lys - Asn - Tyr - NH₂

Sloučenina uvedená v názvu příkladu se připravila za použití syntetické sekvence popsané v příkladu 1 a za použití Fmoc-Tyr(^eBu) jako aminokyseliny č. 1. Následující aminokyseliny se přidaly za určených podmínek:

Č. aminokyselina

2. Fmoc-Asn(Trt)

3. Fmoc-Lys(Boc)

4. Fmoc-Glu ty-C^Bu)

5. Fmoc-Val

6. Fmoc-Gly

7. Fmoc-Ala

8. Fmoc-Arg(Pmc)

9. Fmoc-Pro

10. Fmoc-Asn(Trt)

11. Fmoc-Thr(^fcBu)

12. Fmoc-Glu (y-CŮBu)

13. Fmoc-Pro

14. Fmoc-Thr (^tBu)

15. Fmoc-Phe

16. Fmoc-Ile

17. Fmoc-Ser (^cBu)

18. Fmoc-His(Trt)

19. Fmoc-Arg(Pmc)

20. Fmoc- His (Trt)

21. Fmoc-Pro

22. Fmoc-Glu (y-C/Bu)

23. Fmoc-Gln (Trt) • ·

999 * 9 • ·';« · 4 9 9 9 9 9 « « _9 9 φ · ,. · · 9 · 9 · 9 • 9 ' 9 9 9 9 · · • 4 ·· ·* ·«· 49 ··

24. 25. 26. 27. 28.	Fmoc-Ala Fmoc-Ala Fmoc-Trp Fmoc-Asp (β-CČBu) Fmoc-Gln(Trt)
za vzniku	40 mg Ac - Gin - Asp - Trp - Ala - Ala - Gin - Glu
- Pro - His - Arg - His - Ser - Ile - Phe - Thr - Pro - Glu -
Thr - Asn	- Pro - Arg - Ala - Gly - Leu - Glu - Lys - Asn -
Tyr - NH₂.
Přiklad 4:
N - Ac - Arg - Arsn - Pro - Asp - Val - Gly - Gly - Pro - Trp
-nh₂
Látka	uvedená v názvu příkladu se připravila za použití
syntetické	sekvence popsané v příkladu 1 a jako aminokyselina
č. 1 se	použila Fmoc-Trp. Následující aminokyseliny se
přidaly za	určených podmínek:
Č.	aminokyselina
2.	Fmoc-Pro
3.	Fmoc-Gly
4.	Fraoc-Gly
5.	Fmoc-Val
6.	Fmoc-Asp (3~0^tBu)
7.	Fmoc-Gly
8.	Fmoc-Asp (p-O^fcBu)
9.	Fmoc-Pro
10.	Fmoc-Asn (Trt)
11.	Fmoc-Arg(Pmt)
za vzniku	20 mg N - Ac - Arg - Asn - Pro - Asp - Val - Gly -
Gly - Pro	- Trp -NH₂.

φ · · 4 * V w «9 » • 9 · * • »·« ··· « · • ·· »♦

Příklad 5; _ N - Ac - Tyr - Thr - Thr - Asn - Pro - Arg - Lys - Leu -Tyr Asp - Tyr - NH_Z

Látka uvedená v názvu příkladu se připravila za použití syntetické sekvence popsané v příkladu č. 1 a jako aminokyselina č. 1 se použila Fmoc-Tyr(^£Bu) . Následující aminokyseliny se přidaly za určených podmínek:

Č. aminokyselina

2. Fmoc-Asp (β-Ο^υ)

3. Fmoc-Tyr (^ťBu)

4. Fmoc-Leu

5. Fmoc-Lys(Boc)

6. Fmoc-Arg(Pmc)

7. Fmoc-Pro

8. Fmoc-Asn (Trt)

9. Fmoc-Thr (^eBu)

10. Fmoc-Thr (^tBu)

11. Fmoc-Tyr (^fcBu) za vzniku 10 mg N - Ac - Arg - Asn - Pro - Asp - Val - Gly Gly - Pro - Trp -NH₂.

Příklad 6:

N - Ac - Pro - Arg - Lys - Leu - Tyr - Asp - NH₂'

Látka uvedená v názvu příkladu se připravila za použití syntetické sekvence popsané v příkladu č. 1 a jako aminokyselina č. 1 se použila Fmoc-Tyr (^fcBu) . Následující aminokyseliny se přidaly za určených podmínek:

Č. aminokyselina

2. Fmoc-Asp (β-CřBu)

3. Fmoc-Tyr ^Bu) • · · · ·*« » * ς_·.

9 · · *♦* , « 9 4 9 fc ♦ · · f ··· ··*

4

4. Fmoc-Leu

5.. Fmoc-Lys(Boc)

6. Fmoc-Arg(Pmc)

7. Fmoc-Pro

Za vzniku 4 mg N - Ac - Pro NH₂. MS (FAB) m/z 995 (M+H)⁺.

- Arg - Lys - Leu - Tyr - Asp Příklad 7;

N - Ac - Pro - Arg - Lys - Leu - Tyr - Asp - NH₂.

Látka uvedená v názvu příkladu se připravila za použití syntetické sekvence popsané v příkladu č. 1. Následující aminokyseliny se přidaly za určených podmínek:

Č, aminokyselina

2. Fmoc-Tyr(^fcBu)

3. Fmoc-Leu

4. Fmoc-Lys(Boc)

5. Fmoc-Arg(Pmc)

6. Fmoc-Leu za vzniku 6 mg N - Ac - Pro - Arg - Lys - Leu - Tyr - Asp NH₂. MS (ESI) m/z 832 (M+H)⁺.

Příklad 8:

N - Ac - Pro - Glu - Lys - Arg - Tyr - Asp - Tyr - NH₂.

Látka uvedená v názvu příkladu se připravila za použití syntetické sekvence popsané v příkladu č. 1. Jako aminokyselina č. 1 se použila Fmoc-Tyr (^ťBu) . Následující aminokyseliny se přidaly za určených podmínek:

Č. aminokyselina ,2. Fmoc-Asp (p-O^?Bu)

3. Fmoc-Tyr (^Bu)

4. Fmoc-Arg (Pmc)

5. Fmoc-Lys(Boc)

6. Fmoc-Glu »· · · · • · · · ♦ · ·· • · · «·· φφ ·Φ • β *

« ·· • · · • · «·· • ·_· « * ” · ·· Φ··

Ί. Fmoc-Pro za vzniku 6 mg N - Ac - Pro - Glu - Lys - Arg. - Tyr - Asp Tyr - NH₂. MS (FAB) m/z (1101) (M+H)\

Příklad 9:

N - Ac -Arg - Lys - Leu - Tyr -Asp - Tyr -NH₂

Látka uvedená v názvu příkladu se připravila za použití syntetické sekvence popsané v příkladu č. 1. Jako aminokyselina č. 1 se použila Fmoc-Tyr(^fcBu) . Následující aminokyseliny se přidaly za určených podmínek:

Č. aminokyselina

2. Fmoc-Asp (p-CŮBu)

3. Fmoc-Tyr (^ťBu)

4. Fmoc-Leu

5. Fmoc-Lys(Boc)

6. Fmoc-Arg(Pmc) za vzniku 8 mg N - Ac -Arg - Lys - Leu - Tyr -Asp - Tyr -NH₂. MS (ESI) m/z (898) (M+H)⁺.

Příklad 10:

N - Ac -Pro -Arg -Lys -Leu -3-1 -Tyr -NH₂ (SEQ ID NO: 13) Látka uvedená v názvu příkladu se připravila za použití syntetické sekvence popsané v příkladu č. 1. Jako aminokyselina č. 1 se použila Fmoc-Tyr (^cBu) . Následující aminokyseliny se přidaly za určených podmínek:

Č. aminokyselina . Fmoc-Asp (P-O^fcBu)

3. Fmoc-3-I-Tyr (^fcBu)

4. Fmoc-Leu

5. Fmoc-Lys(Boc) ·· · « « « v · • 9··· 9 · • 9 · · 9 · to A • 9 99* 9* ·« · 9 • 9 9 9 • 9 ··· · ·

99« 99 9·

6. Fmoc-Arg (Pmc)

7. Fmoc-Pro za vzniku 2 mg N - Ac -Pro -Arg -Lys -Leu -3 -I -Tyr -NH₂. MS (ESI) m/z (1121) (M+H) ⁺ .

Příklad 11:

N - Ac -Pro -Arg -Lys -Leu - Tyr -3 -I -Tyr -NH₂ (SEQ ID NO: 14)

Látka uvedená v názvu příkladu se připravila za použití syntetické sekvence popsané v příkladu č. 1. Jako aminokyselina č. 1 se použila Fmoc-3-I-Tyr(^fcBu) . Následující aminokyseliny se přidaly za určených podmínek:

Č. ' aminokyselina

2. Fmoc-Asp (β-Ο^ϋΒη)

3. Fmoc-Tyr (^tBu)

4. Fmoc-Leu

5. Fmoc-Lys(Boc)

6. Fmoc-Arg(Pmc)

7. Fmoc-Pro za vzniku 2,5 mg N - Ac -Pro -Arg -Lys -Leu - Tyr -3 -NH₂ MS (ESI) m/z 1121 (M+H) ⁺ .

-I -Tyr

Příklad 12:

N - Ac - Lys - Leu - Tyr - Asp - NH₂

Látka uvedená v názvu příkladu se připravila za použití syntetické sekvence popsané v příkladu č. 1. Jako aminokyselina č. 1 se použila Fmoc-Asp (0-O^tBu) . Následující aminokyseliny se přidaly za určených podmínek:

aminokyselina Fmoc-Tyr (^tBu) Fmoc-Leu Fmoc-Lys

C.

2,

3, za vzniku 2 mg N - Ac - Lys - Leu - Tyr - Asp - NH₂.

« « » • * · • · « · β

• ·«·

Příklad 13:

Příprava a separace směsi Ň - Ac - Pro - Arg - Lys -Leu

- Tyr- - Asp -3 - I¹²⁵ - Tyr⁵³⁵-NH2 a N - Ac - Pro - Arg - Lys Leu - 3 - I¹²⁵ - Tyr⁵³⁵-NH2 (SEQ ID NO: 13) a SEQ ID NO: 14.

Do roztoku s 30 pg N- acetyl -prolyl - arginyl - lysyl leucyl - tyrosyl - aspartyl - tyrosylamid v 80 ml fyziologického roztoku (PBS.) pufrovaného fosforečnanem se přidá jedno lože s jódem (Pierce, Rockford, IL) a 100 pCi Nal¹²⁵. Po 10 minutách se odstranil nadbytek Nal¹²⁵ tím, že se reakční směs nanesla na kolonu Water C18-Light SepPack a eluovala se vodou pak 0,1 % TFA v 1:1 %CH₃CN/voda a sebraly· se frakce 3 x 200 μΐ, aby vznikla směs radioaktivně značených peptidů Tyr⁰'“' a Tyr⁵³⁵.

Radioaktivní směs peptidů se nanesla injekcí na kolonu C18 HPLC s ekvimolárním roztokem chlazených nosičů N - Ac Pro - Arg - Lys - Leu - Tyr - Asp -3-1 -Tyr - NH₂ a N - Ac

- Pro -.Arg - Lys - Leu - 3 - I - Tyr - Asp -3-1 -Tyr NH₂, eluční časy se předem určily na 36 minut a 38 minut. Kombinovaly se opakované eluce se systémem rozpouštědel z příkladu 1 a lyofilizace: v relevantních frakcích byla požadovaná látka N - Ac - Pro - Arg - Lys - Leu - Tyr - Asp 3 -I -Tyr - NH₂ s minimálním znečištěním s N - Ac - Pro - Arg

- Lys - Leu - 3 - I - Tyr - Asp -3-1 -Tyr - NH₂.

Obecné metody

Příklad 14: Izolace a čištěni peptidových fragmentů smyčky 5.

Peptidové fragmenty smyčky 5 se připravily z produktu štěpení Lys-plazminogenu (Lys-HPg, Abott Laboratories, Abbott Park, IL) prasečí elastázou (SIGMA, St. Louis, MO) modifikovanou metodou podle Powell et al·. (Arch Biochem.

· ♦ 444 • 4 · 4 · · · • 4 4 4 4 4 . -....... 4·4 ··· , . « “~4 ' 4 ·· · ·_Λ*

4« 444 4* *44 44 4·

Biophys. 248 (1); 390-400 (1986). 1,5 mg prasečí elastázy se inkubovalo s 200 mg Lys-HPg v 50 mM Tris-HCl pH 8,0 a směs se míchala za stálého houpání přes noc při teplotě místnosti. Reakce se ukončila přidáním DPF (diizopropylfluorofosforečnanu, SIGma ) tak, aby konečná koncentrace byla 1 mM. Směs se míchala na houpací míchačce po dalších 30 minut, dialyzovala se proti 50 mM Tris pH 8,0 přes noc a zakoncentrovala se. Štěpený plazminogen se nanesl na 2,5 cm x 15 cm velkou kolonu lyzin-Sepharose 4B (Brockway, W.

J. and Castellino, F. J., Arch. Biochem, Biophys. 151: 194199 (1972) a kolona se přivedla do rovnovážného stavu 50 mM Tris pH 8,0 až se dosáhla hodnota absorbance 0,05 (při vlnové délce 280 nm) . Tento krok se uskutečnil, aby se odstranily libovolné fragmenty, které obsahuji' oblast smyčky 1 a/nebo oblast smyčky 4 (obě oblasti vážou lyzin)). Neabsorbované peptidové fragmenty smyčky 5 se dialyzovaly proti 50 mM pufru Na₂POo pH 5,0 a pák se nanesly na kolonu BíoRad Mono-S, která se uvedla do rovnovážného stavu stejným pufrem. Dominantní frakce obsahující štěpenou část .smyčky 5, ’ neštěpený mini-HPg a zbývající proteázu se eluovala 0 % až 20 %, 20 % až 50 % a 50 % až 70 % postupným gradientem roztoku 20 mM fosforečnanu/1 M KC1 pH 5,0. Elektroforézou na gelu se zjistilo, že peptidové fragmenty smyčky 5 se eluovaly při gradientu 50 %. Sebrané frakce s koncentračním pikem se dialyzovaly přes noc proti 20 mM Tris pH 8,0.

Pomocí chromatografie FPLC a DodSO4/PAGE s barvením stříbrem (Coomassieovou modří) se stanovilo, že separované fragmenty smyčky 5 dosahují přinejmenším 95 % čistoty.

Sekvenční analýza aminoterminální části purifikovaných fragmentů ukázala na přítomnost třech polypeptidů, jenž mají α-N-terminační sekvence VLLPDVETPS, VAPPPWLL a VETPSEED, které korespondují s aminokyselinami v pozicích Val⁴⁴⁹ až Ser⁴⁵³, Val ^{44 3} až Leu⁴⁵⁰ a Val⁴⁵⁴ až Asp^4S1 sekvence SEQ ID NO: 1.

• · · 0 »0 ·

0*0 0·« ·

• · » 0 0 0

0 0 0 0 0 · · » 0 · 0 · · * * — 0·**. 0 · 0 ·

0·· 0* 0 « ·

Příklad 15: Endoteliální proliferační test.

Proliferace endoteliálních buněk in vitro se stanovala jak se popisuje v publikaci Lingen, et al., Laboratory Investiga.tion, 74; 476-483 ¢1996) za použití kitu Cell Titer 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferatíon Assay kit (Promega Corporation, Madison, WI) . Bovinní kapilární (adrenální) endoteliální buňky se nanesly na destičky s 96 prohlubněmi v hustotě 1 000 buněk na prohlubeň destičky v Dulbecco modifikovaném Eagle médiu (DMEM), které obsahuje 10 % donorové telecí sérum a 1 % BSA (bovinní sérový albumin, GIBCO BRL, Gaithesburg, MD). Po 8 hodinách se buňky nechaly vyhladovět přes noc v DMEM, které obsahuje 0,1 % BSA, pak se znovu nakrmily : médiem, které obsahuje specifikované koncentrace inhibitoru a 5 ng/ml bFGF (základní fibroblastový růstový faktor). Výsledky testu se upravily jak pro nestimulované buňky (to znamená, že se nepřidalo bFGF), což •se 'používá jako základní hodnota, a pro buňky stimulované samotným bFGF (to znamená, že se nepřidal inhibitor) jako maximální proliferace. Když se zkombinovaly výsledky více pokusů, výsledky se prezentovaly jako procento změny v počtu buněk ve srovnání se samotným bFGF.

Přiklad 16: Migrační test endoteliálních buněk.

Test migrace endoteliálních buněk se provedl v podstatě jak se popisuje v publikaci Polverini et al., Methods Enzymol, 198: 440-450 (1991) . Bovinní kapilární (adrenální) endoteliální buňky (BCE, které se získaly od Judah Folkman, Harvard University Medical School) se nechaly přes noc vyhladovět v médiu DMEM, které obsahuje 0,1 % bovinní sérový albumin (BSA), Buňky se pak uvolnily z podkladu trypsinem, shromáždily se a resuspendovaly se v DMEM s 0,1 % BSA v koncentraci 1,5 χ 10⁶ buněk na ml. Buňky se daly na dno • * modifikované Boydenovy komory s 48 prohlubněmi (Nukleopore Corporation, Cabin John, MD). Komora se sestavila obrátila a buňky se nechaly přichytit po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C na polykarbonátové membrány pro chemotaxi (velikost pórů 5 gm), pak se přes noc namočily do 0,1 % želatiny a nechaly se uschnout. Komora se pak znovu obrátila a do každé prohlubně horní komory se přidaly testovací látky (přičemž celkový objem je 50' gl); přístroj se pak inkuboval po dobu 4 hodin při teplotě 37 °C. Membrány se pak fixovaly a barvily (Diffquick, Fisher Scientific, Pittsburg, PA) a spočítal se počet buněk,, které migrovaly do horní komory přes 10 silných silových polí. Odečetla se zpětná migrace do DMEM + 0,1 % BSA a data se označila jako počet buněk migrujících přes 10 vysokých silových polí (400x) nebo v případě, že se zkombinovaly výsledky z více experimentů, vyjadřují se jako procento inhibice migrace ve srovnání s pozitivní kontrolou. Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 1.

Příklad 17: Účinek peptidových fragmentů smyčky 5 na proliferaci endoteliálních buněk in vitro.

Stanovil se účinek peptidových fragmentů smyčky 5 na proliferaci endoteliálních buněk in vitro za použití shora popsaného testu proliferace endoteliálních buněk. Při těchto experimentech se připravily peptidové fragmenty smyčky 5, jak se popisuje v příkladu 1 až 14 a testovaly se různé koncentrace v rozmezí přibližně 100 až 1 000 pM , Jako kontrola maximální proliferace se použilo bFGF. Peptidový fragment smyčky 5 se sekvencí SEQ ID NO: 3 byl účinný při. inhibici proliferace buněk BCE v závislosti na dávce. Koncentrace peptidového fragmentu se sekvencí SEQ ID NO: 3, při které se dosáhne 50 % inhibice (ED₅₀) je přibližně 300 pM. Naopak EDs₀ u smyček 1 až 4 je 135 nM.

• * v « » » fr · » * fr · ·· · fr · ·«·· φ · ···· · · ··· fr·· ft fr fr fr · «1 · ·· ♦ · fr*

Účinek peptidových fragmentů jiné smyčky na inhibici proliferace buněk BCE se uvádí v tabulce č. 1. Peptidový fragment smyčky 3 vykazuje nejnižší účinek při inhibici proliferace buněk BCE ( hodnota ED₅₀ je 460 nM), pak následuje peptidový fragment smyčky 1 (hodnota ED_So je 320 nM), peptidové fragmenty smyček 1 -.4 (hodnota ED₅₀ je 135 nM) a peptidové fragmenty smyček 1-3 (hodnota ED₅₀ je 75 nM). Nej účinnější při inhibici proliferace buněk BCE je peptidový fragment smyčky 5 s hodnotou ED₅₀ 0,3 nM.

Příklad 18: Účinek peptidových fragmentů smyčky 5 na migraci endoteliálních buněk in vivo.

Za použití popsaného testu migrace endoteliálních buněk se také stanovil účinek peptidových fragmentů smyčky 5 na in vitro migraci endoteliálních buněk. Peptidové fragmenty smyčky 5 inhibovaly migraci buněk BCE v závislosti na dávce, přičemž hodnota ED₅₀ je přibližně 300 pM. Koncentrace peptidových fragmentů smyčky 5 nutná pro maximální inhibici buněk BCE , také inhibovala buňky PC-3 a MDA 486. Tento výsledek, když se spojí dohromady s výsledkem s příkladu 2, ukazuje, že inhibice stimulace proliferace a migrace buněk BCE peptidovými fragmenty smyčky 5 je pro endoteliální buňky silná a specifická. To však neplatí v případě normálních a nádorových buněk.

Následující příklady jsou pouze ilustrativní a neomezují vynález na doložené látky.

V tabulce č. 1 jsou uvedeny hodnoty ED₅₀, které se získaly při inhibici proliferace buněk CBE fragmenty různých smyček in vitro. Peptidové fragmenty uvedené v tabulce se značí vzhledem k jejich odpovídající frekvenční homologii se sekvencí SEQ ID NO: 1. Symbol označuje data převzatá 2 publikace Marti et al., Eur. J. Biochem., 219: 455-462 (1994) a symbol označuje případy, kde data neexistují.

• 4 • *

I «·* ·

* ’ • 4 • 4 444

Tabulka č. 1

Proteinový fragment z SEQ ID NO: 1	Antiproliferační aktivita buněk BCE (ED₅₀)	Inhibice migrace buněk HMVEC (ED_S0)
smyčky 1-4 (angiostatin)*	135 nM	160 nM
smyčka 1 (Tyr^auGlu¹⁶³) *	320 nM
smyčka 2 (Glu^iblThr²⁴⁵) *	nemá aktivitu
smyčka 3 (Thr^i3JSer³³⁵) *	460 nM
smyčka 4 (Valíval⁴⁴³) *	bez aktivity
smyčky 1-3 (Iyr^auPro³⁵³) *	75 nM	60 nM
smyčky 2-3 (Glu^ibiSer³³⁵) *
smyčka 5 (Val·⁴⁴³Ala⁵⁴³) *	250 pM	200 pM
smyčka 5 (Val^44aAla⁵⁴³) *		240 pM
smyčka 5 (Var³⁴Ala⁵⁴³) *		220 pM
smyčka 5 (Val⁴⁴³Phe⁵⁴⁶) *	60 nM	55 nM
smyčka 5 (Vai⁴⁴^Phe⁵⁴⁶) *
smyčka 5 (Val⁴⁵⁴Phe⁵⁴⁶) *
smyčky 4-5 (Val^3bbAla⁵⁴³) *		280 pM
smyčky 4-5 (Val³³³Phe⁵⁴⁶) *
~N-Ac-Val^44s~Asp^4binh₂		> 1 mM
N-Ac-Met^4(,3-Pro^mNH₂	—r	> 1 mM
N-Ac-Gln^4iJ4-Tyr^iHnh₂	*	> 100 JIM
N-Ac“Arg³ⁱⁱ-Trp^:,z·nh₂		500 pM
N-Ac-Tyr^b3:-Tyr^jJi3nh₂		200 pM

Φ Μ • · ♦ ♦ « «· • ♦ * • · · ···“— ·“· ·

N-Ac-Pro^-Tyr³³’nh₂		120 pM
N-Ac-Pro^-Asp⁵'“’nh₂		123 pM
N-Ac-Pro^l3°-Tyr^I5ůnh₂		160 nM
N-Ac-Arg^^Tyr³*⁵NH₂		80 pM
N-Ac-Pro -Arg-LysLeu-3-I-Tyr-AspTyr-NHj		> 100 nM
N-Ac-Pro -Arg-LysLeu-Tyr-Asp-3“ITyr-NH₂		400.pM
N“Ac-Lys^3jl-Tyr^3J*nh₂

Příklad 19: Rekombinantní exprese fragmentů smyčky 5 v Pichia pastoris.

A. Produkce cDNA kódující fragmenty smyčky 5 PCR:

PCR se použilo pro generaci cDNA fragmentů, které kódují peptidové fragmenty smyčky 5, jejichž aminokyselinová sekvence leží (1) mezi aminokyselinami. sekvence SEQ ID NO: 1 v pozicích 450 až 543 (K5A), (2) jejichž aminokyselinová sekvence leží (1) mezi aminokyselinami sekvence SEQ ID NO: 1 v pozicích 450 až 546 (K5F), (3) jejichž aminokyselinová sekvence leží (1) mezi aminokyselinami sekvence SEQ ID NO: 1 v pozicích 355 až 546 (K4-5F) a které se používají pro klonování a expresi v eukaryontních a prokaryontních hostitelích. Fragmenty DNA se generovaly za použití cDNA, které kóduje lidský plazminogen (získaly se od Dr. E. Reich, State University of New York, Stony Brook, NY) a která se používá jako templátová DNA, a forvard a reverzních primerů (získaly se od firmy Operon Technologies, lne. Alameda, CA), jak je. uvedeno dále v textu:

5' “ATTAATGGATCCTTGGACAAGAGGCTGCTTCCAGATGTAGACACT-3 '	SEQ ID NO;2
5'-ATTAATGCATCCTTGGACAAGAGGGTCCAGGACTGCTACCATGGT-3'	SEQ ID NO;3
5'-ATTAATCTCGACGCATGCTTAGGCCGCACACTGATGGACA-3'	SEQ ID NO:4
5'-ATTAATCTCGAGGCATGCTTAAAATGAAGGGGCCGCACACT-3’	SEQ ID NO:5

Amplifikace PCR se provedla za použití primerů se sekvencemi SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 4 (pro fragment K5A), SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 5 (K5F), SEQ ID NO:3 a SEQ ID No: 8 (K4-5A) a SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO:5 (K4-5A) za standardních podmínek pro PCR. To znamená že reakční směs při celkovém reakčním objemu 100 μΐ obsahuje 200 μΜ. každý dNTP, kde N je A, T, G a C, 0,2 μΜ každého primeru, přibližně 10 ng templářové DNA a 1 jednotku Vent® DNA polymerázy (New England Biolabs). Amplifikace proběhla celkem v 25 cyklech (1 cyklus - 94 °C po dobu jedné minuty, 48 °C po dobu dvou minut, 72 °C po dobu 1 minuty) na přístroji DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) . Po amplifikaci se produkty PCR čistily na gelu, štěpily restrikčními endonukleázami BainH I a Xho I (New England Biolabs), ligovaly se do modifikovaného expresívního vektoru Pichia {pHil-D8, uvedeno dále v textu), který je štěpen stejnými enzymy a transformuje se elektroporací do buněk HB101 (BioRad). Z individuálních klónů se připravila DNA a štěpila se restrikčními enzymy a podrobila se sekvenční analýze za účelem identifikace klónů, které obsahují inzerty se správnou sekvencí a ve správné orientaci, Plazmidy z pozitivních klónů se transformovaly do kmene GS 115 Pichia pastoriš (Invitrogen, Carlsbad, CA) s ohledem na instrukce výrobce. Za účelem identifikace pozitivních klónů v Pichia se buňky kultivovaly v 5 ml média BMGY (Invitrogen) při teplotě 29 °C, buňky se shromáždily centrifugací a resušpendovaly se za účelem exprese v médiu « · ·*· · · * * Μ · * » » » · « * · ··· ··· « · · · · · . ·

........... * ·*”·♦· *· ··· ·* ··

BMMY (Invitrogen) ο objemu 0,5 ml. Po inkubaci při teplotě 29 °0 po dobu 2 dní se supernatanty kultury shromáždily a alikvoty se analyzovaly na SDS-PAGE a westernovým blotem podle metod, které jsou dobře známy v oboru. SDS-PAGE gel je na obr. č, 6»

B. Konstrukce expresivního vektoru pHil-D8;

Expresivní vektor Pichia pHil-D8 se konstruoval modifikací vektoru pHil-D2 (Invitrogen), aby zahrnoval syntetickou vedoucí sekvenci za účelem sekrece rekombinantního proteinu (obr. č 5). Vedoucí sekvence 5'ATGTTCTCTCCAATTTTGTCCTTGGAAATTATTTTAGCTTTGGCTTTGCAATCTGTCTTCG

CTCAGCCAGTTATCTGCACTACCGTTGGTTCCGCTGCCGAGGGATCC-3' (SEQ ID NO: 9) kóduje sekreční signál PHO1 (podtrženo jednoduchou čarou) operativně spojený s . pro-peptidovou sekvencí (vyznačeno tučným písmem) pro štěpení KEX2. Aby vznikla konstrukce pHil-D8 použilo se PCR, kde se jako· templét použil pHil-Sl (Invitrogen), protože tento vektor obsahuje sekvence kódující PHO1, forvard primer (SEQ · ID NO: 7) odpovídá nukleotidům 509 až 530 pHil-Sl a reverznímu primeru (SEQ ID NO: 8), jehož nukleotidová sekvence kóduje pozdní část sekrečního signálu PHO1 (nukleotidy 45 až 66 sekvence SEQ ID NO: 9) a pro-peptidovou sekvenci (nukleotidy 67 až 108 sekvence SEQ ID NO:-9). Sekvence primeru (získaného z firmy Operon Technologies, Inc. Alamede, CA) jsou uvedeny dále v textu:

5'-GAAACTTCCAAAAGTCGCCATA-3'	SEQ ID NO: 7
5'ATTAATGAATTCCTCGAGCGGTCCGGGATCCCTCGGCAGCGGAAC CAACGGTAGTGCAGATAACTGGCTGAGCGAAGATTGCAAAGTA3'	SEQ ID NO: 8

9*0«« 0 0 * 9»0·

9·«0 * * ·«· ··* ·9·0 · · ♦r^-“*·#· 0· 0·· 0.0 ··

Amplifikacé se uskutečnila v 25 cyklech, jak se popisuje v přikladu 19. Produkt PCR (přibližně 500 bp) se čistil na gelu, štěpil se restrikčními endonukleázami BlpI a EcoRI a ligoval se do vektoru pHil-D2, který se štěpil stejnými enzymy. DNA se transformovala do buněk bakterií E. colí HB 101 a štěpením restrikčními enzymy a sekvenční analýzou se identifikovaly pozitivní klóny. Jeden klon, který vykazuje správnou sekvenci se označil pHil-D8.

Příklad 20: Rekombinantí exprese peptidových fragmentů .smyčky 5 v bakterii.

Restrikční a jiné modifikující enzymy stejně jako jiná činidla se získala z komerčních zdrojů. Primery se syntetizovaly v Abbott Laboratories na automatickém syntetizéru podle standardního postupu, který je dobře znám v oboru.

DNA peptidových fragmentů smyčky 5 se také generovaly PCR amplifikací za účelem klonování a exprese do bakteriálních buněk (£. coli). Základní přístup byl vytvořit fragmenty PCR požadovaných kódujících sekvencí s nebo bez terminačnich kodonů, kinázových konců a klonováni fragmentů přímo do zvolených vektorů. Vektorové konstrukce se pak transformovaly do vhodných hostitelských buněk a kolonií, které se testovaly PCR s primery vektoru za účelem potvrzení přítomnosti inzertu. Za účelem stanovení orientace inzertu se v reakcích PCR vykazující přítomnost inzertu v klónech provedla přímá PCR za použití jednoho vektorového primeru a jednoho primeru inzertu.

A. Příprava fosfatizovaných vektorů s tupými konci:

Popis expresivních vektorů, které jsou použitelné při bakteriální produkci peptidových fragmentů smyčky 5, se uvádí ' v tabulce č. 2.

• 9 ♦ · *·* · ·9 * · ««« · 4 ·

I · 9 · 9 · ** β—- 9 9 · * « «9 **« «· ··· ··

Tabulka č. 2

vektor	zdroj	restrikční enzymy	fúze
UpET	modifikovaný pET21d podle Abbotta	Sapl	není
UpET-HTh	modifikovaný pET21d podle Abbotta	Sapl .	rozeznává Nterminální His6-trombin
UpET-Ubi	modifikovaný pET21d podle Abbotta	Sapl	rozeznává Nterminální His6ubiguitinenterokinázu
pET32a	Novagen	Ncol + Xhol	rozeznává thioredoxin, a enterokinázu·
pGEX-4T-2	Pharmacia®	EcoRI + Not I	GST
pCYB3	New England Biolabs	Ncol + Sapl	C-terminální intein

Všechny vektory se nejdříve izolovaly na kolonách Qiagen v souladu a instrukcemi výrobce (QIAgen, Inc., Santa Clarita, CA) . Vektorová DNA (1 gg) se štěpil vhodnými restríkčnimi enzymy (tabulka č. 2) ve 20 μΐ pufru NEB4 (New Éngland Biolabs), který obsahuje 100 gg/ml bovinního sérového albuminu (BSA)Reakce, se rychle centrifugovala a do směsi se' přidalo 20 μΐ .deionizované vody, 0,4 μΐ směsi dNTP (Pharmacia®; 20 mM každého dNTP) a 0,25 μΐ klonované DNA polymerázy pfu (Stratagene®; 2,5 jednotek/μΐ) a vše se inkubovalo při teplotě 65 °C po dobu 20 minut, přičemž dojde k zaplnění konců vektoru. Reakčni směs se znovu krátce centrifugovala a přidalo se 4 μΐ ředěné telecí intenstinální fosfatázi (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD; celkem 5 jednotek). Směs se pak inkubovala při teplotě 50 °C po dobu jedné hodiny. Do reakce se přidalo 5 μΐ 10 %SDS, 2 μΐ 5 M NaCl, 2 » » · t ··· *«· » · ·· ·· •«»· · » · • · ♦ » · · • · φ · · **»·'· ·· ·· μΐ 0,5 Μ EDTA a 45 μΐ vody a vše se krátce centrifugovalo a pak se inkubovalo při teplotě 65 °C po dobu 20 minut. Reakce se extrahovala třikrát pufrem saturovanou směsí fenolchloroform (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD;) a jednou chloroformem. Vodná fáze se čistila na koloně CHROMÁ SPIN™ 1 000 TE (CLONTECH, Palo AltO, CA) .

B. Tvorba DNA fragmentů PCR:

Připravily se primery PCR na základě publikované sekvence pro lidský plazminogen (SEQ ID NO: 12) a jejich sekvence je uvedena dále v textu:

5'- GTCCAGGACTGCTAC’ČAT-3'	SEQ ID NO: 10
5'- CTGCTTCCAGATGTAGAGA-3'	SEQ ID NO: 11
5' - TTATTAGGCCGCACACTGAGGGA-3 '	SEQ ID NO: 13

Jestliže není uvedeno jinak všechny PCR se provedly DNA polymerázou pfu a v pufru (Stratagene®, za použití 200 μΜ každého dNTP a 1 μΜ každého primeru. Používaná sada primerů má sekvence SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 13 (v případě K5A) a SEQ ID NO: 10 a SEQ ID NO:13 (v případě K4-5A). Jako templát se použil vektor pHil-D8, který obsahuje K4-K5A (popisuje se v příkladu 19). Před tím než se použil jako templát, uvedená DNA' se štěpila restrikčním enzymem Dral (který štěpí DNA na několika místech vně smyčkových oblastí) za účelem eliminovat pozadí způsobené vektorem pHil-D8 při transformacích. Do reakce PCR o objemu 50 μΐ se použilo přibližně 10 ng templářů. Reakce PCR proběhly při teplotě 94 °C po dobu 2 minut; pak 15 cyklů při teplotě 94 °C po dobu 30 sekund; 49 °C, 1 min,; 72 °C 4 minuty; a 72 °C po dobu 7 minut. Po PCR reakci se přidalo 0,5 μΐ 100 mM ATP a 5 jednotek T4 kinázy a reakce se inkubovala při teplotě 37 °C po dobu 20 minut za. účelem upravit konce kinázou. Směs se pak zahřála na teplotu

Β Β 9 • 99

Β • 9 999 9 9 9 • 9 9 9 9 9 ·

9 9 9 9 * φ·“···· 9 9 9 9* °C po dobu 15 minut a čistila se na koloně S400-HR (Pharmacia®) za účelem ligace.

C. Ligace fragmentů PCR do expresivních vektorů:

Šest rekombinantních konstrukcí (specificky (i) K5A v UpET-PS3, (ii) K5A v pET32a, (iii) K4-5A v UpET-PS3, (iv) K45A v UpET-Dbi, (v) K4-5A v pET32a a (vi) K4-5A v pGEX-4Ť-2) se připravilo následovně: vektor upravený fosfatázou s tupými konci (1 μΐ z kroku A shora v textu) a fragment PCR (1 μΐ z kroku. B shora v textu) se ligoval do celkového objemu 5,5 μΐ pomocí kitu Rapid Ligation kit, přičemž se postupovalo podle instrukcí výrobce (Boehringer-Mannheim Corp., Indianapolis, IN) . Ligační směs (1 μΐ) se pak transformovala do 20 μΐ kompetentních buněk (XLl-Blue superkompetentní buňky nebo XL2-Blue Ultrakompetentní buňky (Stratagene®)) podle instrukcí výrobce. Rekombinantí buňky se selektovaly na plotnách s LBAmp agarem (MicroĎiagnostics, Lombard, IL).

D. Studie exprese:

Vektory pGEX se exprimovaly v bakteriích E, coli XLlBlue nebo XL2-Blue. Všechny ostatní vektory se izolovaly a retransformovaly do bakterií E. coli BL21(DE3) (Novagen) podle instrukcí výrobce. Jednotlivé kolonie se inokulovaly do 2,5 ml LB/Amp a míchaly se při 225 ot/min.; při teplotě 37 °C, přes noc. Kulturou kultivovanou přes noc (0,5 ml) se pak inokulovalo 50 ml LB/Amp ve kultivačních nádobách o objemu 250 ml a míchalo se při 225 ot./min při teplotě 37 °C až hodnota OD600 byla mezi 0,5 až 0,6. Pak se přidal izopropyll-thio-p-D-galaktopyranozid (IPTG, 100 mM) tak, aby konečná koncentrace byla 1 mM. Kultura se míchala při 225 ot./min. při teplotě 37 °C po dobu 3 hodin a pak se buňky centrifugovaly na dno kultivační nádoby. Vzorky se připravily

W w w Φ »» » * » ^w • 9 9 « 9 9 · · · · 9 · • * 9 · 9 9 · · 999999 + e t- a · · 9- · · • 9 ··· 9* ··· ·« »· pro účely testu SDS-PAGE za použiti známých metod. Předchozí experimenty ukazují, že buňky nesoucí K5A/pET32a, K45A/pET32a a K4-5A/pGEX produkují většinu rekombinantního proteinu. Kultury těchto klónů se pak analyzovaly SDS-PAGE za účelem zjistit, zda produkt exprese je rozpustný nebo nerozpustný. Jak je zobrazeno na obr. č. 7 konstrukce K5A/pET32a produkuje rekombinantní protein , který je skoro zcela rozpustný (porovnej dráhy S a P Trx-K5A), zatímco konstrukce K4-5A/pGEX produkuje protein, který je rozpustný pouze ze 75 %.

E. Konstrukce vektorů modifikovaného podle Abbota:

<

i. Příprava kazet VB1, VB2, VB3 a VB4:

Kazety VB1, VB2, VB3 a VB4 se připravily jako syntetické

DNA za použití metod, které jsou dobře známy v oboru. Sekvence synVBl, synVB2, synVB3 a synVB'4 se uvádí dále v textu:

synVBl	5' -AGCGTCTCATGAAGAGCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGC GCCTTGGCCCGCCAACCTTAATTAACCGGGAGCCCGCCTAATGAGCGG GCTTTTTTTTGCTCTTCATAGTGACTGAGACGTCG-3'	SEQ ID NO:14
svnVB2	5' -AGCGTCTCAGGTGGTGGTCATCACCATCACCATCACGGTGGTGGT CTGGTGCCGCGCGGCAGCTGAAGAGCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCT TTCTGCGCCTTCGCGCGCCAACCTTAATTAACCGGGAGCCCGCCTAAT GAGCGGGCTTTTTTTTGCTCTTCACGAGACGTCG-3'	SEQ ID NO: 15
synVB3	5' -AGCGTCTCAGGTGGTGGTCATCACCATCACCATCACGGTGGTGGT TGAAGAGCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGCCTTGGCGCGC CAACCTTAATTAACCGGGAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGC TCTTCACGAGACGTC-3'	SEQ ID NO:16
synVB4	5' -AGCGTCTCAGGTGGTGGTCATCACCATCACCATCACCGTGGTGGT GATGACGATGACAAGTGAAGAGCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTC TGCGCCTTGGCGCGCCAACCTTAATTAACCGGGAGCCCGCCTAATGAG CGGGCTTTTTTTTGCTCTTCACGAGACGTCG-3 ’	SEQ ID NO:17

• »«*

444 444 • ♦ · ·

4 · 4 4 · · · • · 4 4 4 ·

II» -·· »·'-·’ »4 4 44 ···

Každá syntetická sekvence se připravila jako dvouřetězcová a klonovala se do vektoru PCR-Script Cam™ (Stratagene®) podle instrukcí výrobce; klony se správnou sekvencí se pak izolovaly podle standardních postupů. 5 μς čištěné DNA se štěpilo 8 jednotkami restrikčního enzymu BsmBI při teplotě 55 °C při reakci o objemu 20 μΐ v pufru Ix NEB4 obsahujícím 100 gg/ml BSA. Reakce se krátce centrifugovala a přidalo se 20 μΐ deionizované vody , 0,4 μΐ směsi dNTP (Pharmacia®; 20 mM každého dNTP) a 0,25 μΐ klonované pfu DNA polymerázy (Stratagene®; 2,5 jednotky na jeden mikrolitr) a reakce se inkubovala při teplotě 65 °C po dobu 20 minut, přičemž se zaplnily konce. DNA se pak podrobila elektroforéze na 3 % agarózových gelech 3% MetaPhor™ (EMC, Rockland, Maine) v pufru 0,5 x Tris-acetát-EDTA (TAE). Pruh DNA kazety se pak vyřízl z gelu a DNA se eluovala zmrazením gelu a centrifugací pufru přes náplň Ultrafree™ Probind (MILLIPORE Corp., Bedford, MA) . Pak následuje srážením izopropanolem, přičemž se jako nosič použil Pellet Paint™ (Novagen) . DNA (cfVBl., cfVB2, cfVB3 a cfVB4) se promyla 70 % etanolem, krátce se sušila a resuspendovala se v 25 μΐ pufru Tris-EDTA (TE).

ii) Konstrukce UpET:

Vektor pET21d (Novagen) se Štěpil restrikčním enzymem Sapl, dále se aplikovala T4 DNA polymeráza +dGTP, nukleáza fazole mungo, pak DNA polymeráza I Klenow fragment a vektor se znovu ligoval. Testovaly se jednotlivé kolonie za účelem selekce plazmidu, ve kterém se eliminovalo existující restrikční místo Sapl. Uvedená DNA' se pak štěpila restrikčním! enzymy Ncol + BamHI a ligovala se do sekvencí 5' -CATGTGAAGAGC-3 ' (SEQ ID NO: 19) + 5'-GATCGCTCTTCA-3' (SEQ ID NO: 20) za účelem zavedení jediného restrikčního místa Sapl, Čištěná a ověřená klonovaná DNA se štěpila restrikčními v v * fr · »» frfrW· * · fr «· · * · · * * · • fr fr · · · · · ····· ___ .*.· fr fr 9 · * ♦· · · ”'· ·— ’ ****« »< frfrfr _at t₉₉ ·« »· enzymy Sapl + HindlII, upravily se tupé konce a aplikovala se fosfatáza, jak se popisuje shora v textu. DNA se ligovala do kazety cfVBl, transformovala se do bakterií E.coli a ty se nanesly na plotnu s LB-amp. Kolonie se přenesly sterilní špičkou pipety na plotny s LB-Amp agarem a do 20 μΐ AmpliTaq®

PCR směsi (Perkin Elmer) v destičkách Costar Thermowell, které obsahují 1 μΜ každého vektorového prímeru o sekvenci 5'-AGATCTCGATCCCGCGAA-3' (forvard primer, sekvence SEQ ID NO:

21} a 5'-ATCCGGATATAGTTCCTC-3' (SEQ ID NO: 22). Reakce se zahřály na teplotu 94 °C po dobu 30 sekund; a pak se zpracovávaly na termálním cykleru GeneAmp 9600 při 30 jednotlivých cyklech: při teplotě 94 °C po dobu 30 sekund; 40 °C po dobu 1 minuty; 72 °C po dobu 2 minut. 10 μΐ z každé reakce se elektr Oforezovalo na agarózových gelech. Za účelem stanovení orientace kazety se 0,25 μΐ testu PCR reakce o správné velikosti se přidalo do čerstvé reakce , která obsahuje reverzní vektorový primere a primer kazety 5'CGGGCTTTTTTTTGCTCTTA-3' (SEQ ID NO: 23). Reakce se amplifikovaly v dalších deseti stejných cyklech, jako je uvedeno shora v textu. Konečné vektory se sekvenovaly za použití standardního postupu a jeden klón se označil jako UpET.

iii. Konstrukce- UpET-HTh:

UpET se štěpil restrikčním enzymem Sapl a upravily se tupé konce, aplikovala se fosfatáza za účelem klonování. Fragment se ligoval do kazety cfVB2, ta se transformovala a jednotlivé kolonie se testovaly a provedla se sekvenční analýza za účelem stanovení shora popsané ligace cfVBl.

iv. Konstrukce UpET-H:

fl w fl flflflfl fl * · fl α» β ·« flflfl

V v V-* ▼ fl fl fl flfl · flflflfl • fl » · * flflfl flflfl flflfl flfl • fl flflfl fl* ·>

UpET se štěpil restrikčním enzymem Sapl a upravily se tupé konce, aplikovala se fosfatáza za účelem klonování. Fragment se ligoval do kazety cfVB3, ta se transformovala a jednotlivé kolonie se testovaly a provedla se sekvenční analýza za účelem stanovení shora popsané ligace cfVBl.

v. Konstrukce UpET-Ubi:

Fragment PCR kódující ubiquitin S. cerevisiae se generoval za použití Ultma DNA polymerázy a pufru (Perkin Elmer), 40 μί·Ι každého dNTP, 1 μΜ každého z primerů o sekvenci 5'-CAGATTTTCGTCAAGACTT-3' (Ubi-5p, SEQ ID NO: 24) a 5'~ ACCACCTCTTAGCCTTAG-3' (Ubi-3p, SEQ ID NO: 25) a 1,75 pg kvasinkové DNA při teplotě 94 °C po dobu 2 minut, pak proběhlo 25 jednotlivých cyklů pří teplotě 94 °C po dobu 1 minuty; 40 °C, po dobu 1 minuty; 72 °C po dobu 2 minut; pak 72 °C po dobu 7 minut. Fragment PCR vznikl z 20 ng pETISb (Novagen) za použití primerů se sekvencí 5'CA7GGTATATCTCCTTCTT-3' (pET3p-ATG, SEQ ID NO: 26) a 5'- - .

TGAGCAATAACTAGCATAAC-3' (T7RevTerm, SEQ ID NO: 27) při teplotě 94 °C po dobu 2 minut, pak proběhlo 10 cyklů při režimu 94 °C po dobu 45 vteřin; 42 °C po dobu 1 minuty; 72 °C po dobu 15 minut; pak 72 °C po dobu 7 minutu. PCR fragmenty pro ubiquitin a odvozený od pET15b se čistily na gelu a ligovaly se za použití BRL T4 ligázy a ligačního pufru. Fragment PCR T7 promotor-ubiquitin (T7-ubiquitin) se vytvořil PCR reakcí, kde ligační směs sloužila jako templát a přidaly se Ultma DNA polymeráza a primery se sekvencemi 5'AGATCTCGATCCCGCGAA-3' (pET5p, SEQ ID NO: 28) a SEQ ID NO: 25 při teplotě 94 °C po dobu 2 minut a pak proběhlo 25 cyklů v režimu; teplota 94 °C po dobu 30 sekund; teplota 42 °C po dobu 1 minuty; teplota 72 °C po dobu 3 minut; pak teplota 72 °C po dobu 7 minut. PCR fragment T7-ubiquitinu se čistil na gelu.

* « · · ·· · ·· f • · ···

PCR fragment přirozeného lidského stromelyzinu se připravil za použiti Ultma DNA polymerázy (jak je uvedeno shora) s primerem se sekvencí 5'-TTAGGTCTCAGGGGAGT-3 (Strom3p, SEQ ID NO: 29) a primerem upraveným kinázou o sekvenci 5'-TTCAGAACCTTTCCTGGCA-3' {Strom-5p, SEQ ID NO: 30) a za použití přibližně 20 ng templátu (to je stromelyzin klónovaný do pET3b (Novagen)) pří teplotě 94 °C po dobu 2 minut, pak proběhlo 15 cyklů při režimu teplota 94 °C po dobu 2 minut; teplota 44 °C po dobu 1 minuty; 72 °C po dobu 2 minut; pak 72 °C po dobu 7 minut. PCR reakce s fragmentem stromelyzinu (10 μΐ) se ligovala s 100 pMol denaturovaných oligonukleotidů se sekvencemi 5'-AGCGGCGACGACGACGACAAG-3'(Ek-Cut-5p, SEQ ID NO: 31) a 5'-CTTGTCGTCGTCGTCGCCGCT-3'(Ek-Cut-3p, SEQ ID NO:32, kóduje štěpící místo enterokinázy) ve 40 μΐ BRL ligázy a ligačního pufru. PCR fragment nesoucí místo pro štěpení enterokinázou-přirozený stromelyzin (Ek-stromelyzin) se připravil reakcí PCR, kde se jako templát použil 1 μΐ ligační směsi, primery SEQ ID NO; 29 a primer upravený kinázou o sekvenci SEQ ID NO: 31, Ultma DNA polymeráza a pufr. PCR začala při teplotě 94 °C po dobu 2 minut; pak proběhlo 10 cyklů v režimu: teplota 94 °C po dobu 1 minuty; teplota 44 °C po dobu 1 minuty; 72 °C po dobu 2 minut; pak 72 °C po dobu 7 minut, PCR fragment Ek-stromelyzin se čistil na gelu.

Fragmenty T7-ubiquitin a Ek-stromelyzin se ligovaly dohromady BRL ligázou v ligačním- pufru. PCR fragmenty T7ubiquitinu-Ek-stromelyzinu se pak připravily reakcí PCR, kde se jako templát použila ligační směs a Ultma DNA polymeráza a primery se sekvencemi SEQ ID NO: 28 a SEQ ID NO: 29. PCR reakce začala při teplotě 94 °C po dobu 2 minut; pak proběhlo 25 cyklů v režimu: teplota 94 °C po dobu 30 vteřin; teplota 42 °C po dobu 1 minuty; 72 °C po dobu 6 minut; pak 72 °C po dobu 7 minut.

• ··

0 0 0 0 0 • * · * ······ • ••000 «0 · * * —«· ι « · »0« 00 000 0· 00

PCR fragment vznikl PCR reakcí, kde se použil jako templát plazmid stromelyzin-pET3b, dále se použily primery se sekvencemi SEQ ID NO: 26 a SEQ ID NO: 30, KlenTaq (AB Peptides, St. Louis, MO) a pfu. DNA polymerázy. PCR reakce začala při teplotě 94 °C po dobu 2 minut; pak proběhlo 15 cyklů v režimu: teplota 94 °C po dobu 30 vteřin; teplota 42 °C po dobu 2 minut; 68 °C po dobu 20 minut. Tento PCR fragment se smísil s PCR fragmentem T7-ubiquitin-Ekstromelyzin a směs se .transformovala do kompetentních buněk ERL DH5a s maximální účinností. Správné klony se identifikovaly izolací plazmidové DNA. Transfekce do BL21(DE3) a studovaná exprese se popisuje, shora v textu.

PCR fragment z konstrukce ubiquitin-Ek se vytvořil ze správného expresivního plazmidu T7-ubiquitin-Ek-stromelyzin použitím PCR reakce s primery se sekvencemi SEQ ID NO: 24 a SEQ ID NO: 32 a s pfv DNA polymerázou. PCR reakce začala při teplotě 94 °C po dobu 2 minut; pak proběhlo 20 cyklů v režimu: teplota 94 °C po dobu 30 vteřin; teplota 40 °C po dobu 1 minuty; 72 °C po dobu 3 minut; pak 72 °C po dobu 7 minut. Fragment se čistil pomocí kolony Pharmacia S-400 HR Spin a ligoval se do kazety VBC1 za použití kitu Rapid DNA Ligation. PCR fragment vznikl reakcí PCR, kde se jako templát použila ligační směs a primery se ,sekvencemi SEQ ID NO: 24 a 5'-TGAAGAGCAAAAAAAAGCCCG-3' (SEQ ID NO: 33} a pfv DNA polymeráza. PCR reakce začala při teplotě 94 °C po dobu 2 minut; pak proběhlo 20 cyklů v režimu: teplota 94 °C po dobu 30 vteřin; teplota 40 °C po dobu 1 minuty; 72 °C po dobu 2 minut; pak 72 °C po dobu 7 minut. PCR fragment se upravil kinázou a ligoval se do vektoru Upet-H, který se za účelem klonování upravil na fragment s tupými konci a aplikovala se fosfatáza. Ligační směs' se transformovala do kompetentních buněk a kolonie se testovaly pomocí PCR, jak se popisuje shora v textu. Za účelem stanovení správných klónů UpET-Ubi se plazmidová DNA sekvenovala.

ij/ť'

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Sloučenina vzorce

A-B-C-X-Y (I) nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, ester nebo proléčivo, kde symbol A není přítomen nebo představuje skupinu chránící dusík;

symbol· Y není přítomen nebo představuje skupinu chránící karboxylovou kyselinu;

symbol B není přítomen nebo je ze skupiny zahrnující 1 až přibližně 197 přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků, které odpovídají sekvenci SEQ ID NO: 1 od přibližně pozice aminokyseliny 334 do pozice aminokyseliny 530;

symbol C znamená R¹-R²-R³~R'¹, kde symbol R¹ představuje lyzylovou skupinu;

symbol R² představuje leucylovou nebo arginylovou skupinu;

symbol R³ představuje tyrosylovou, 3-I-tyrosylovou nebo fenylalanylovou skupinu;

symbol R⁴ představuje aspartylovou skupinu; a symbol X není přítomen nebo je ze skupiny zahrnující 1 až přibližně 12 přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků, které odpovídají sekvenci SEQ ID NO: 1 od přibližně pozice aminokyseliny 535 do pozice aminokyseliny 546 a jejím homologům a analogům.

2. Sloučenina podle nároku 1, kde symbol B je přítomen a symboly A, C, X a Y představují to, co je tam definováno.

3. Sloučenina podle nároku 2, kde symbol X je přítomen a symboly A, B, C, a Y představují to, co je tam definováno.

4 4 4 4 «4 ·» ··

• 4 4

444 *44 .4 «4 4

108 * * • 4 4 4 4 ·

4 · ·· · 4*4 • 4·· • · * · ···

106 symbol X není přítomen nebo je ze skupiny zahrnující 1 až přibližně 12 přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků, které odpovídají sekvenci SEQ ID NO: 1 od přibližně pozice aminokyseliny 535 do přibližně pozice aminokyseliny 54 6;

symbol B-_ není přítomen nebo je ze skupiny zahrnující 1 až přibližně 176 přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků, které odpovídají sekvenci SEQ ID NO: 1 od přibližně pozice aminokyseliny 334 do pozice aminokyseliny 513;

symbol C-_ je sekvence SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 514 do pozice aminokyseliny 523; a symbol X; není přítomen nebo je ze skupiny zahrnující 1 až přibližně 10 přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků, které odpovídají sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 524 do pozice aminokyseliny 533 a jejím doplňkům.

4. Sloučenina, podle nároku 3,- kde symboly A a γ jsou přítomny a symboly B, C, a X představují to, co je tam definováno.

4 4 4 4

444 4«

4 4 44 4 4 * 4 · 4 4

4 44 « *· ·

• 4 4

5.

5. Sloučenina podle nároku 3, kde symboly A a Y představují to, co je tam definováno a symboly B-C-X jsou vybrány ze skupiny zahrnující:

(a) sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 355 do pozice 543; (b) sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 355 do pozice 546; (c) sekvenci SEQ ID NO: I z pozice· aminokyseliny 443 do pozice 543; (d) sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 449 do pozice 543; (e) sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 454 do pozice 543; (f) sekvenci SEQ ID NO: í z pozice aminokyseliny 443 do pozice 546; (g) sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 449 do pozice 546; (h) sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 454 do pozice 546; (i) sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 525 do pozice 535; (j) sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 529 do pozice 535; (k) sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 530 do

pozice 535.

6. Sloučenina podle nároku 5, kde symbol A znamená skupinu N-Ac a symbol Y znamená skupinu -NH₂.

φ φφφφ φ · · ·. · · · · ί t φ · φ · φ» ·*· ·♦· _ · φ _· φ φ · .. · · —·,—* * -- ·· Φ·Φ φφ ··« «· ··

7. Sloučeninu podle nároku 1,- kde symbol X není přítomen a symboly A, B, C a Y představují to, co je tam definováno,

8. Sloučenina podle nároku 7, kde symboly X, A a Y představují to, co je tam definováno a B-C je sekvence SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 529 do pozice 534.

9 9 9 4 9 4 φ Φ φ · ΦΦ*ΦΦν φ φ · ·

ΦΦ ··· · · ··

9· 99

• · 9 • •9 «9 9

999

999 • 9

103

999

9. Sloučenina podle nároku 1, kde symboly B a X nejsou přítomny a symboly A, C a Y představují to, co je tam definováno.

10. Sloučenina podle nároku 9, kde symbol C představuje sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 531 do pozice 534.

11. Sloučenina podle nároku 1, jejíž molekulová hmotnost /

je mezi 0,5 a 25 000 kilodaltonů, což se stanovilo redukující polyakrylamidovou gelovou elektroforézou nebo analýzou hmotnostní spektrometrií, a její aminokyselinová sekvence je v podstatě podobná odpovídající aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO: 1.

12. Sloučenina podle nároku 1, kde hodnota ED₅₀ pro inhibicí migrace endoteliálních buněk je přibližně 100 až přibližně 500 pM.

13. Sloučenina podle nároku 1, kde hodnota ED₅o pro inhibicí proliferace endoteliálních buněk je přibližně 1Ů0 až přibližně 500 pM.

14. Sloučenina vzorce • * » · • * to · to · • to to· ·· • « · · • 9 pxjLjatelna síil/ coucT ncuO prO ^— moV-tr-b ~ι o·η i ‘lOW j ‘w j -t(II)

F O O r· Λ'¹ R ¹ <*iVir + Lv+iUU^ČU léčivo, kde symbol A není přítomen nebo představuje skupinu chránící dusík;

symbol Y není přítomen nebo představuje skupinu chránící karboxylovou kyselinu;

symbol B-. není přítomen nebo je ze skupiny zahrnující 1 až přibližně 176 přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků, které odpovídají sekvenci SEQ ID NO: 1 od přibližně pozice aminokyseliny 334 do pozice aminokyseliny 513;

symbol C-_ je sekvence SEQ ID NO: 1 od pozice aminokyseliny 514 do pozice aminokyseliny 523; a symbol X-. není přítomen nebo je ze skupiny zahrnující 1 až přibližně 10 přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků, které odpovídají sekvenci SEQ ID NO: 1 od pozice aminokyseliny 524 do pozice aminokyseliny 533 a jejím homologům a analogům.

15. Sloučenina podle nároku 14, kde symboly Bi a X_xnejsou přítomny a symboly A, Ci, a Y představují to, co je tam definováno.

16. Sloučenina podle nároku 8 nebo 10 nebo 15, kde symbol A znamená skupinu N-Ac a symbol Y znamená skupinu NH₂.

17. Peptidový fragment smyčky 5 vykazující podstatnou sekvenční'homologii s fragmentem plazminogenu vybraným ze skupiny zahrnující lidský, myší, bovinní, prasečí plazminogen a plazminogen opice Rhesus.

φ φ φ φφ φ ♦ φ φ φ · φ φ φ φ » φ. · φφ φφφ φφ φφφ φφ* φφ φφ

18. Peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5, které vykazují podstatnou sekvenční homologii s lidským plazminogenem.

19. Způsob léčby onemocnění pacienta, který potřebuje antiangiogenní terapii, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci terapeuticky účinného množství savčího peptidového fragmentu nebo fúzního proteinu smyčky 5 člověku nebo zvířeti.

20. Způsob podle nároku 19, vyznačuj ící se tím, že uvedený savčí peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5 se vybral ze skupiny zahrnující lidský, myší, bovinní, prasečí peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein a peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein opice Rhesus.

21. Způsob podle nároku 20, vyznačuj ící se tím, že uvedený peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5 je lidský peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5.

22. Způsob podle nároku 19, vyznačuj íc.í se tím, že uvedený savčí peptidový fragment smyčky 5nebo fúzní protein smyčky 5 je sloučenina vzorce

A-B-C-X-Y (I) nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, ester nebo proteč! vo, kde symbol A není přítomen nebo představuje skupinu chránící dusík;

symbol Ϋ není přítomen nebo představuje skupinu chránící karboxylovou kyselinu;

« 0 •90 009 * · «00 909

0 ' 0 · 9 0 0

0« symbol B není přítomen nebo je ze skupiny zahrnující 1 až přibližně 197 přirozeně se vyskytuj ící.ch aminokyselinových zbytků, které odpovídají sekvenci SEQ ID NO: 1 od přibližně pozice aminokyseliny 334 do pozice aminokyseliny 530;

symbol C znamená R¹-R²-R³-R⁴, kde symbol R¹ představuje lyzylovou skupinu;

symbol R² představuje leucylovou nebo arginylovou skupinu symbol R³ představuje tyrosylovou, 3-I-tyrosylovou.

nebo fenylalanylovou skupinu;

symbol R⁴ představuje aspartylovou skupinu; a symbol X není přítomen nebo je ze skupiny zahrnující 1 až přibližně 12 přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků, které odpovídají sekvenci SEQ ID NO: 1 od pozice aminokyseliny 535 do pozice aminokyseliny 546 a jejím homologům a analogům.

23. Způsob podle nároku 22, vyznaču.j ící se tím, že uvedený savčí fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5 je uvedená sloučenina, kde symboly A a Y představují to, co je tam definováno a symbol B-C-X je vybrán ze skupiny zahrnující:

(a) sekvence pozice 543; SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 355 do (b) sekvence pozice 54 6; SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 355 do (c) sekvence pozice 543; SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 443 do (d) sekvence pozice 54 3; SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 449 do (e) sekvence SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 454 do

pozice 543;

« · ·« · * t « · · · * • A · · «· A·*'¹·· Φ ·

A A «

(f) sekvence SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 443 do pozice 546; (g) sekvence SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 449 do pozice 546; (h) sekvence SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 454 do pozice 546; (i) sekvence SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 525 do pozice 535; (j) sekvence SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 529 do pozice 535; (k) sekvence SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 530 do

pozice 535.

24. Způsob podle nároku 22, kde uvedená sloučenina je uvedený savčí fragment smyčky 5, vyznačující se tím, že symbol X není přítomen, symboly A a Y představují to, co je tam definováno a symbol B-C je sekvence SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 529 do pozice 534.

25. Způsob podle nároku 22, kde uvedená sloučenina je uvedený savčí fragment smyčky 5, vyznačuj ící se tím, že symboly X a B nejsou přítomny a symboly A, C a Y představují to, co je tam definováno.

26. Způsob podle nároku 23 nebo 24 nebo 25, vyznačující se tím, že symbol A představuje skupinu N-Ac a symbol Y je skupina -NH₂.

27. Způsob podle nároku 19, vyznačuj ící se tím, že uvedené onemocnění se vybralo ze skupiny zahrnující zhoubné bujení, artritidu, makulární degeneraci a diabetickou retinopatii.

» «· ·

100

28. Způsob podle nároku 27, vyznačuj ící se tím., že uvedené onemocnění je zhoubné bujení.

29. Způsob podle nároku 28, vyznačuj ící s é tím, že uvedené onemocnění se vybralo ze skupiny zahrnující primární a metastatické pevné,nádory, karcinomy, sarkomy, lymfomy, lupénku a hemagiomy.

30. Způsob podle nároku 19, vyznačuj ící se tím, že uvedený peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5 je sloučenina vzorce

A-Bí-C^Xí-Y (II) nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, ester nebo proléčivo, kde symbol A není přítomen nebo představuje skupinu chránící dusík;

symbol B; není přítomen nebo je ze skupiny zahrnující 1 až přibližně 176 přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků, které odpovídají sekvenci SEQ ID NO: 1 od přibližně pozice aminokyseliny 334 do pozice aminokyseliny 513;

symbol Ci je sekvence SEQ ID NO: 1 od pozice aminokyseliny 514 do pozice aminokyseliny 523; a symbol X-, není přítomen nebo je ze skupiny zahrnující 1 až přibližně' 10 přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků, které odpovídají sekvenci SEQ ID NO: 1 od pozice aminokyseliny 524 do pozice aminokyseliny 533 a jejím homologům- a analogům.

31. Způsob podle nároku 30, vyznačuj ící se tím, že uvedená sloučenina je uvedený savčí peptidový fragment smyčky 5, kde symboly Βχ a Xi nejsou « Φι · ·· · « · » · «

101 přítomny a symboly A, Ci, a Y představují to, co je tam

32. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje izolovanou jednořetezcovou nebo dvouřetězcovou polynukleotidovou sekvenci, která kóduje peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5 vykazující inhibiční aktivitu angiogeneze.

33. Kompozice podle nároku 32, vyznačuj ící se tím, že polynukleotidová sekvence je sekvence DNA.

34. Kompozice podle nároku 33, vyznačuj ící se tím, že uvedená sekvence DNA kóduje aminokyselinovou

sekvenci (a) vybranou sekvenci ze skupiny SEQ ID NO: zahrnující: 1 z pozice aminokyseliny 443 do pozice 543; (b) sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 449 do

pozice 543;

(c) sekvenci SEQ. ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 454 do pozice 543; (d) sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 355 do

pozice 543;

35. Kompozice podle nároku 33, vyznačuj ící se tím, že uvedená polynukleotidová sekvence kóduje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 a SEQ ID NO: 37.

36.. Kompozice, vyznačující še tím, že obsahuje peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5 a farmaceuticky přijatelný ekcipient.

* φ φ · φφφ ♦·· φ φ φφφ

102 • φ · ·♦ • φ • ΦΦΦ φφ φφφ

37. Způsob zahrnující implantaci lidské nebo zvířecí buňky obsahující vektor, vyznačuj ící se tím, že obsahuje sekvenci DNA kódující peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5 a je schopný exprimovat uvedený peptidový fragment smyčky 5 a fúzní protein smyčky 5, je-li přítomen v uvedené buňce.

38. Způsob přípravy peptidového fragmentu smyčky 5, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(a) vystavení savčího piazminogenu účinkům elastázy v poměru přibližně 1:100 až přibližně 1:300 za vzniku směsi uvedeného piazminogenu a uvedené elastázy;

(b) inkubace uvedené směsi; a (c) izolace uvedené smyčky 5 z uvedené směsi.

39. Izolovaný jednořetězcový nebo dvouřetězcový polynukleotid, který kóduje savčí peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5 vykazující inhibiční aktivitu angiogeneze.

40. Polynukleotid podle nároku 39, kde uvedený savčí peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5 kódovaný uvedeným polynukleotidem je vybrán ze skupiny zahrnující lidský, bovinní, myší a prasečí peptidový fragment smyčky 5 nebo .fúzní protein a peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein opice Rhesus.

41. Polynukleotid podle nároku 40, kde uvedený savčí peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5' je lidský peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky

42. Polynukleotid podle nároku 39, kde uvedený savčí peptidový fragment smyčky 5 nebo .fúzní protein smyčky 5 je sloučenina, která má vzorec B-C-X nebo Bi-C_x-Xi, kde symbol B není přítomen nebo je ze skupiny zahrnující 1 až přibližně 197 přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků, které odpovídají sekvenci SEQ ID NO: 1 od přibližně, pozice aminokyseliny 334 do pozice aminokyseliny 530;

symbol C znamená íV-F^-R³-!^, kde symbol R¹ představuje lyzylovou skupinu;

symbol R² představuje leucylovou- nebo arginylovou skupinu symbol R³ představuje tyrosylovou nebo fenylalanylovou skupinu;

symbol R⁴ představuje aspartýlovou skupinu; a symbol X není přítomen nebo je ze skupiny zahrnující 1 až přibližně 12 přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků, které odpovídají sekvenci SEQ ID NO: 1 od pozice aminokyseliny 535 do přibližně pozice aminokyseliny 546;

symbol B_x není přítomen nebo je ze skupiny zahrnující 1 až přibližně 176 přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků, které odpovídají sekvenci SEQ ID NO: 1 od přibližně pozice aminokyseliny 334 do pozice aminokyseliny 513;

symbol C_x je sekvence SEQ ID NO: 1 od přibližně pozice aminokyseliny 514 do pozice aminokyseliny 523; a symbol X_x není přítomen nebo je ze skupiny zahrnující 1 až přibližně 10 přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků, které odpovídají sekvenci SEQ ID NO: 1 od pozice aminokyseliny 524 do pozice aminokyseliny 533 a jejím doplňkům.

43. Polynukleotid podle nároku 42, kde uvedený savčí peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5 je φ φ φ φ φφφ φφφ • · • φ · ·· φ φ φφφ

104 φφφ φ » 9 ΦΦΦ • Φ ΦΦΦ *·

ΦΦ sloučenina, kde symbol Β je přítomen a představují to, co je tam definováno.· symboly C a X

44. Polynukleotid podle nároku 42, kde uvedený savčí peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5 je sloučenina, kde symbol X je přítomen a symboly B a C představují to, co je tam definováno.

45. Polynukleotid podle nároku 42, kde uvedený savčí peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5 je fragment, kde symboly B a X jsou přítomny a symbol C představuje to, co je tam definováno.

46. Polynukleotid podle nároku 39, kde uvedený savčí peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5 je

vybrán ze skupiny (a) sekvenci zahr SEQ nuj ící: ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 355 do pozice 543; (b) sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 355 do pozice 546; (cj sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 443 do pozice 543; (d) sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 449 do pozice 543; (e) sekvenci SEQ ID NO: I z pozice aminokyseliny 454 do pozice 543; (f) sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 443 do pozice 546; (g) sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 449 do pozice 546; (h) sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 454 do

pozice 546.

• 444

105

47. Polynukleotid podle nároku 42, kde uvedený savčí peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5 je fragment, kde symbol X není přítomen a symboly B a C představují to, co je tam definováno.

48. Polynukleotid podle nároku 39,. který je molekula

DNA.

49. Polynukleotid podle nároku 39, který je molekula

RNA.

50. Vektor obsahující polynukleotid, který kóduje savčí peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5 vykazující inhibiční aktivitu angiogeneze.

51. Vektor podle nároku 50, který je expresivním vektorem.

52. Vektor podle nároku 51, kde uvedený savčí peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5 kódovaný uvedeným polynukleotidem je sloučenina se vzorcem B-C-X nebo Bi-Ci-Xi, kde symbol B není přítomen nebo je ze skupiny zahrnující 1 až přibližně 197 přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků, které odpovídají sekvenci SEQ ID NO: 1 od přibližně pozice aminokyseliny 334 do pozice aminokyseliny 530;

symbol R² představuje léucylovou nebo arginylovou skupinu symbol R³ představuje tyrosylovou nebo fenylalanylovou skupinu; a symbol R'¹ představuje aspartylovou skupinu;

53. Vektor podle nároku 52, kde uvedený savčí peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5 je sloučenina, kde symboly B a X jsou přítomny a symbol C představuje to, co je tam definováno.

54. Vektor podle nároku 52, kde uvedený savčí peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5 je sloučenina, kde symbol X není přítomen a symboly B a C představují to, co je tam definováno.

55. Vektor podle nároku 52, kde uvedený savčí peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5 je vybrán ze skupiny zahrnující:

(a) sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice aminokyseliny 355 do pozice 543;

— • * · · » > * * 0» 0 · · · · 0» « 0 · · 00 ··· 00 000 0 0 * 0 0 • · · * · · * a a aa 107 (b) sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice pozice 546; aminokyseliny 355 do (c) sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice pozice 543; aminokyseliny 443 do (d) sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice pozice 543; aminokyseliny 449 do (e) sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice pozice 543; aminokyseliny 454 do (f) sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice pozice 546; aminokyseliny 443 do (g) sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice pozice 546; aminokyseliny 449 do (h) sekvenci SEQ ID NO: 1 z pozice pozice 546. aminokyseliny 454 do

56. Vektor podle nároku 52, který je vybrán ze skupiny zahrnující pHil-D8, pET32a, pGEX-4T-2, Up-ET, UpET-Ubi a pCYB3.

57, kde uvedená hostitelská kterou je E. coli.

57, kde uvedená hostitelská

57. Vektor podle nároku 52 dále obsahující hostitelskou buňku transformovanou uvedeným vektorem.

58, kde uvedená éukaryontní

58. Vektor podle nároku buňka je éukaryontní buňka.

59. Vektor podle nároku buňka je Pichia pastořis.

60. Vektor podle nároku' buňka je prokaryontní buňka,

61. Způsob přípravy rozpustného peptidového fragmentu smyčky 5 nebo fúzního proteinu smyčky 5,vyzn.ačující se tím, že zahrnuje:

(a) izolaci polynukleotidu, který kóduje uvedený peptidový fragmentsmyčky 5;

(b) klonování uvedeného polynukleotidu do expresivního vektoru;

(c) transformaci uvedeného vektoru do vhodné hostitelské buňky; a (d) kultivaci uvedené hostitelské buňky za podmínek vhodných pro expresi uvedeného rozpustného peptidového fragmentu smyčky 5 nebo fúzního proteinu smyčky 5.

62. Sloučenina vybraná ze skupiny zahrnující (a) A-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I-Tyr-Y;

(b) A-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I-Tyr-Asp-Tyr-Y;

(c) A-Pro-Glu-Lys-Arg-Tyr-Asp-Tyr-Y; a (d) A-Glr-Asp-Trp-Ala-Ala-Gln-Glu-Pro-His-Arg-Hís-SerIle-Phe-Thr-Pro-Glu-Thr-Pro-Glu-Thr-Asn-Pro-Arg-AlaGly-Leu-Glu-Lys-Asn-Tyr-Y.

• ··