HU224827B1 - Új antiangiogén peptidek, azokat kódoló polinukleotidok, és eljárások angiogenezis gátlására - Google Patents

Új antiangiogén peptidek, azokat kódoló polinukleotidok, és eljárások angiogenezis gátlására Download PDF

Info

Publication number
HU224827B1
HU224827B1 HU9903530A HUP9903530A HU224827B1 HU 224827 B1 HU224827 B1 HU 224827B1 HU 9903530 A HU9903530 A HU 9903530A HU P9903530 A HUP9903530 A HU P9903530A HU 224827 B1 HU224827 B1 HU 224827B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
amino acid
kringle
sequence
seq
vector
Prior art date
Application number
HU9903530A
Other languages
English (en)
Inventor
Donald J Davidson
Earl J Gubbins
Jieyi Wang
Original Assignee
Abbott Lab
Childrens Medical Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/643,219 external-priority patent/US5801146A/en
Application filed by Abbott Lab, Childrens Medical Center filed Critical Abbott Lab
Publication of HUP9903530A2 publication Critical patent/HUP9903530A2/hu
Publication of HUP9903530A3 publication Critical patent/HUP9903530A3/hu
Publication of HU224827B1 publication Critical patent/HU224827B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/18—Feminine contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

A találmány szerinti megoldás alkalmas angiosztatin kimutatására és mérésére, továbbá angiosztatinproteinekhez kapcsolt citotoxikus hatóanyagok, valamint angiogenezis által kiváltott vagy általa súlyosbított betegségek, így például ízületi gyulladás, sárgafolt-degeneráció vagy diabéteszes retinakárosodás, vagy rák kezelésére.
HU 224 827 Β1
A leírás terjedelme 46 oldal (ezen belül 10 lap ábra)
HU 224 827 Β1
A találmány peptidkémiai eljárásokra vonatkozik. Közelebbről, a találmány tárgyát olyan peptidek, továbbá előállításuk és alkalmazásaik képezik, amelyek emlősplazminogén kringle-5-régiójának megfelelő szekvenciáihoz lényegében hasonló aminosavszekvenciát tartalmaznak. A találmány tárgyát képezik továbbá az említett peptideket és az azokat kódoló nukleinsavakat tartalmazó készítmények, továbbá a nukleinsavakat tartalmazó vektorok, azokat hordozó gazdasejtek, valamint eljárások a peptidek előállítására.
A találmány szerinti megoldás alkalmas angiosztatin kimutatására és mérésére, továbbá angiosztatinproteinekhez kapcsolt citotoxikus hatóanyagok, valamint angiogenezis által kiváltott vagy általa súlyosbított betegségek, így például ízületi gyulladás, sárgafolt-degeneráció vagy diabéteszes retinakárosodás, vagy rák kezelésére.
Az angiogenezis - az új véredények képződéséhez vezető folyamat - elengedhetetlen a normális életfunkciókhoz, például szaporodáshoz, fejlődéshez és sebgyógyuláshoz. Bár a folyamat nem teljesen ismert, úgy tudjuk, hogy az endotélsejtek (kapilláris-véredények elsődleges sejtjei) szaporodását szabályozó molekulák összetett kölcsönhatásán alapul. Ezek a molekulák normális körülmények között hosszabb ideig - hetekig vagy akár évtizedekig - nyugvó állapotban tartják a mikro-véredényrendszert (azaz nincs kapillárisnövekedés). Amikor arra szükség van (például sebgyógyulás során), ugyanezek a sejtek gyors proliferációnak indulnak, és 5 nap alatt kicserélődhetnek („turnover”) [Folkman, J. és Shing, Y.: The Journal of Biological Chemistry 267(16), 10 931-10 934; Folkman, J. és Klagsbrun, M.: Science 235, 442-447 (1987)].
Bár az angiogenezis fiziológiás körülmények között szigorúan szabályozott folyamat, számos kórkép hátterében (melyeket angiogén kórképeknek nevezünk) perzisztáló, nem szabályozott angiogenezis áll. Más megfogalmazás szerint, a nem szabályozott angiogenezis egyrészt közvetlenül okozhat adott betegséget, másrészt súlyosbíthat már fennálló kóros állapotot. Például a szem neovaszkularizációja a vakság leggyakoribb oka, és körülbelül 20 szembetegségben domináló tünet. Bizonyos, már létrejött állapotokban, például Ízületi gyulladás (arthritis) során, az újonnan képződött kapilláris-véredények megtámadják az ízületet, és elpusztítják a porcszövetet. Cukorbetegség során a retinában képződött új kapillárisok behálózzák az üvegtestet, bevérzést és vakságot okoznak. Szolid tumorok és áttétek növekedése szintén angiogenezisfüggő jelenség [Folkman, J.: Cancer Research 46, 467-473 (1986); Folkman, J.: Journal of the National Cancer Institute 82, 4-6 (1989)]. Kimutatták például, hogy a 2 mm átmérőnél nagyobbra növekedő tumoroknak saját vérellátásra van szükségük, és ezt új kapilláris-véredények növekedésének indukálásával érik el. Miután ezek az új véredények beágyazódtak a tumorba, lehetővé teszik a tumorsejtek számára, hogy a keringésbe kerüljenek, és áttéteket képezzenek távoli helyeken, például májban, tüdőben vagy csontokban [Weidner, N. és munkatársai: The New England Journal of Medicine 324(1), 1-8 (1991)].
Napjainkig számos, természetben előforduló angiogén faktort ismertettek és jellemeztek [Fidler, J. I. és Ellis, L. M.: Cell. 79, 185-189 (1994)]. A közelmúltban O’Reilly és munkatársai tumort hordozó egerek szérumából és vizeletéből egy 38 kilodalton (továbbiakban: kDa) tömegű proteint izoláltak és tisztítottak, amely protein gátolta az endotélsejt-proliferációt [O’Reilly és munkatársai: Cell. 79, 315-328 (1994) és WO 95/29242 számú nemzetközi közzétételi irat, benyújtva 1995. november 2-án]. Ezen endotélsejteket gátló protein, mikroszekvenciaanalízis szerint, 98%-os szekvenciahomológiát mutat az egérplazminogén egy belső fragmensével. Az angiosztatin, amint az egéreredetű gátlófragmenst elnevezték, olyan peptid, amely tartalmazza az egérplazminogén első négy kringle-régióját. Humán plazminogén azonos régiójából (azaz 1-4. kringle-régiót tartalmazó szakaszából) származó peptidfragmens szintén erősen gátolta kapilláris-endotélsejtek proliferációját, in vitro és in vivő. Intakt plazminogén, amelyből ez a peptidfragmens származott, nem mutatott ilyen erős gátlóhatást.
Napjainkban számos, angiogén kórképek kezelésére alkalmas angiogenezisgátló anyag áll kifejlesztés alatt [Gasparini, G. és Harris, A. L.: J. Clin. Oncol 13(3), 765-782 (1995)], ezek a vegyületek azonban hátrányos tulajdonságokkal is rendelkeznek. Például a Suraminnak erős angiogenezisgátló hatása van, de emberben, tumorellenes hatás eléréséhez szükséges adagban alkalmazva, súlyos szisztémás toxikus tüneteket okoz. Például a retinoidok, interferonok és antiösztrogének biztonságosan alkalmazhatók humán célra, azonban gyenge antiangiogén hatással rendelkeznek. További vegyületeket nehéz vagy költséges előállítani.
Ennek megfelelően igény van olyan vegyületekre, amelyek alkalmasak emlősökben angiogén betegségek kezelésére. Közelebbről, igény van olyan angiogenezisgátló anyagokra, amelyek terápiás alkalmazása biztonságos, és amelyek a patológiás állapot tekintetében szelektív toxicitást mutatnak, például úgy, hogy szelektív módon gátolják az endotélsejtek proliferációját, míg a normál (azaz nem rákos) sejtekre nem, vagy csak kismértékben toxikusak. Az ilyen vegyületekkel szemben megkívántatik továbbá, hogy könnyen és olcsón előállíthatok legyenek.
Az alábbiakban összefoglaljuk a találmány szerinti megoldás lényegét. A találmány legáltalánosabb megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezik az A-B-C-X-Y (I) általános szerkezeti képlet szerinti kringle-5-peptid-vegyületek, valamint azok gyógyászatilag elfogadott sói, észterei vagy prodrugjai (elővegyületei), ahol A adott esetben hiányzik, vagy nitrogén-védőcsoportot jelent; Y adott esetben hiányzik, vagy karboxilsav-védőcsoportot jelent; B adott esetben hiányzik, vagy az az 1. azonosító számú szekvencia mintegy 334. aminosavpozíciójától az 530. aminosavpozícióig terjedő szekvenciának megfelelő szekvenciájú, mintegy 1-197-ig terjedő számú, természetben előforduló
HU 224 827 Β1 aminosav; C R1-R2-R3-R4 általános képletű csoportot jelent, ahol R1 lizilcsoport; R2 leucil- vagy arginilcsoport; R3 tirozil-, 3-l-tirozil- vagy fenil-alanil-csoport; R4 aszpartilcsoport; X adott esetben hiányzik, vagy az az 1. azonosító számú szekvencia 535. aminosavpozíciójától a mintegy 546. aminosavpozícióig terjedő szekvenciának megfelelő, mintegy 1-12-ig terjedő számú természetben előforduló aminosav; valamint azok homológjai és analógjai.
A találmány tárgyát képezi továbbá az A-B1-C1-X1-Y (II) általános szerkezeti képletű kringle-5-peptid-vegyületek, vagy azok gyógyászatilag elfogadott sói, észterei vagy prodrugjai, ahol A adott esetben hiányzik, vagy nitrogén-védőcsoportot jelent; Y adott esetben hiányzik, vagy karboxilsav-védőcsoportot jelent; Bt adott esetben hiányzik, vagy az 1. azonosító számú szekvencia 334. aminosavpozíciójától az 513. aminosavpozícióig terjedő szekvenciának megfelelő szekvenciájú, mintegy 1-176-ig terjedő számú, természetben előforduló aminosav; Ct az 1. azonosító számú szekvencia 514. aminosavpozíciójától az 523. aminosavpozícióig terjedő szekvencia; és Xt adott esetben hiányzik, vagy az az 1. azonosító számú szekvencia 524. aminosavpozíciójától az 533. aminosavpozícióig terjedő szekvenciának megfelelő, körülbelül 1-10-ig terjedő számú aminosav; valamint azok homológjai és analógjai.
A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások antiangiogenezisterápiára szoruló egyén kezelésére, amelyeket az jellemez, hogy az egyénnek kringle-5-peptid-fragmenst vagy kringle-5 fúziós proteint tartalmazó vegyületet adunk be.
A találmány tárgyát képezik továbbá antiangiogenezisterápiára szoruló egyén kezelésére alkalmas készítmények, amelyek kringle-5-peptid-fragmenst vagy kringle-5 fúziós proteint, kringle-5-antiszérumot, kringle-5-receptor-agonistákat vagy -antagonistákat, vagy citotoxikus hatóanyaghoz kapcsolt kringle-5-antagonistákat tartalmazó vegyületet tartalmaznak, önmagukban vagy gyógyászatilag elfogadott vivőanyaggal és/vagy adott estben - késleltetett felszívódást segítő vegyületekkel kombinálva, hogy azokkal terápiás hatású készítményt képezzenek.
A találmány tárgyát képezik továbbá kringle-5-peptid-fragmenst vagy kringle-5 fúziós proteint tartalmazó vegyületet tartalmazó készítmények, amelyek alkalmasak betegségek kezelésére, például rák, ízületi gyulladás, sárgafolt-degeneráció vagy diabéteszes retinopátia kezelésére.
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan készítmények, amelyek izolált, kringle-5-peptid-fragmenst vagy fúziós proteint kódoló egyszálú vagy kettős szálú polinukleotidszekvenciát tartalmaznak. Ilyen polinukleotidként előnyösen DNS-molekulát alkalmazunk. A találmány tárgyát képezik továbbá kringle-5-peptid-fragmenst vagy fúziós proteint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó vektorok, amelyek sejtekbe juttatva képesek kringle-5-peptid-fragmens vagy kringle-5 fúziós protein expresszálására. Ezenfelül a találmány tárgyát képezik készítmények, amelyek kringle-5-peptid-fragmenst vagy kringle-5 fúziós proteint kódoló DNS-t hordozó vektort tartalmazó sejtet tartalmaznak. A találmány tárgyát képezik továbbá génterápiás eljárások, amelyek szerint kringle-5-peptid-fragmenst vagy kringle-5 fúziós proteint vagy kringle-5-peptidfragmens-konjugátumot kódoló DNS-szekvenciát juttatunk egyénbe, hogy abban in vivő módosítsuk a kringle-5-peptidek szintjét.
A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás kringle-5-peptid-fragmens előállítására, amely szerint: (a) emlősplazminogént és humán vagy sertéseredetű elasztázt elegyítünk mintegy 1:100-1:300 arányban, és így a plazminogén és elasztáz elegyét kapjuk; (b) az elegyet inkubáljuk; majd az elegyből izoláljuk a kringle-5-peptid-fragmenseket.
A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás kringle-5-peptid-fragmens előállítására, amelyet az jellemez, hogy: (a) emlősplazminogént és humán vagy sertéseredetű elasztázt elegyítünk mintegy 1:100-1:300 elasztáz:plazminogén arányban, és így a plazminogén és elasztáz elegyét kapjuk; (b) az említett elegyet inkubáljuk, majd (c) az említett elegyből izoláljuk a kringle5-peptid-fragmens proteinkonjugátumát; (d) a kringle5-peptid-fragmens említett proteinkonjugátumát pepszinnel elegyítjük mintegy 1:0,2 arányban, hogy említett pepszin és említett plazminogén elegyét kapjuk, majd (e) az említett elegyből izoláljuk a kringle-5-peptid-fragmenseket. Másik lehetőségként kringle-5 fúziós protein kringle-5-peptid-fragmense előállítható az alábbi lépéseket tartalmazó eljárással is: (a) említett kringle-5-peptid-fragmenst vagy kringle-5 fúziós proteint kódoló polinukleotidot izolálunk; (b) a polinukleotidot expressziós vektorba klónozzuk; a vektort arra alkalmas gazdasejtbe transzformáljuk, majd (d) a gazdasejtet olyan körülmények mellett tenyésztjük, amelyek alkalmasak oldható kringle-5-peptid-fragmens vagy kringle-5 fúziós protein exresszáltatására.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.
Az 1. ábrán humán plazminogén aminosavszekvenciáját ismertetjük (1. azonosító számú szekvencia)
A 2. ábrán humán (34. azonosító számú szekvencia), egér- (35. azonosító számú szekvencia), rhesusmajom- (36. azonosító számú szekvencia), szarvasmarha(37. azonosító számú szekvencia) és sertéseredetű (38. azonosító számú szekvencia) kringle-5-régiók aminosavszekvenciái közti homológiát ábrázoltunk.
A 3. ábra humán eredetű plazminogén DNS-szekvenciáját (12. azonosító számú szekvencia) ismerteti.
A 4. ábrán látható oszlopgrafikonon különböző kringle-fragmensek egyetlen adagjának szarvasmarha kapilláris-endotélsejtjeire (BCE) gyakorolt antiproliferációs hatását szemléltetjük, in vitro sejtproliferációs vizsgálattal.
HU 224 827 Β1
Az 5. ábrán rekombináns protein szekretálását elősegítő vezetőszekvenciát tartalmazó pHil-D8 expressziós vektor térképét mutatjuk be.
A 6. ábrán kringle-5-peptid-fragmenst vagy fúziós proteint expresszáló Pichia pastoris sejtek tápfolyadék-felülúszói SDS-PAGE-vizsgálatának eredményét mutatjuk be. A fénykép Coomassie-Blue festékkel előhívott SDS-PAGE-gélt ábrázol. Az 1., 6. és 10. sáv negatív kontrollmintát tartalmazott; a 2., 3. és 4. sáv három különböző, K5A-proteint expresszáló klón felülúszóját, az 5. sáv K5F-proteint expresszáló klón felülúszóját, a 7. és 8. sáv K4-5A-proteint expresszáló klón felülúszóját, a 9. sáv K4-5F-proteint expresszáló klón felülúszóját tartalmazta. A nyilak K5A- (mintegy 11 kDa) és K4-5F- (mintegy 20 kDa) protein-csíkok helyzetét mutatják. Molekulatömeg-markereket az 1. és 10. sávokat megelőző sávokban futtattunk.
A 7. ábra kringle-5-peptid-fragmenst vagy fúziós proteint expresszáló E. co//-törzsek SDS-PAGE-vizsgálatának eredményét mutatja. A géleket Coomassie Blue festékkel hívtuk elő. Ha másképpen nem jelöltük, minden sáv 10 μΙ térfogatnyi, 10-es Agoo értéknek megfelelő sűrűségű tenyészetet tartalmazott. Az 1. sáv alacsony molekulatömeg-markereket, a 2. sáv K5A/pET32a teljes kultúrát, a 3. sáv K5A/pET32a teljes kultúrát (a 2. sávra felvitt mennyiség egytizedét), a 4. sáv K5A/pET32a oldható frakcióját, az
5. sáv K5A/pET32a oldhatatlan frakcióját, a 6. sáv K4-5A/pET32a teljes kultúrát, a 7. sáv K4-5A/pET32a teljes kultúrát (a 6. sávra felvitt mennyiség egytizedét), a 8. sáv K4-5A/pET32a oldható frakciót, a 9. sáv K4-5A/pET32a oldhatatlan frakciót, a 10. sáv K4-5A/pGEX-4T-2 teljes kultúrát, a 11. sáv K4-5A/pGEX-4T-2 oldható frakciót, a 12. sáv K4-5A/pGEX-4T-2 oldhatatlan frakciót, a 13. sáv kringle-5-standardot, a 14. sáv magas molekulatömeg-markereket tartalmazott.
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldás lényegét A leírásban a „kringle-5” régión (a továbbiakban K5) emlősplazminogén három diszulfidkötéssel rendelkező azon régióját értjük, amely diszulfidkötések hozzájárulnak az emlősplazminogén-molekula, annak ötödik kringle-régiója által meghatározott háromdimenziós konformációjának kialakulásához. Egy ilyen diszulfidkötés a 462. és 541. pozícióban található cisztein aminosavakat, egy második diszulfidkötés a 483. és 524.
pozícióban található aminosavakat, míg egy harmadik diszulfidkötés az 512. és 536. pozícióban található cisztein aminosavakat köti össze.
A leírásban a „kringle-5-peptid-fragmens” kifejezés egy 4 és 104 közötti számú aminosavból álló peptidet jelöl, amely lényeges szekvenciahomológiát mutat az emlősplazminogén megfelelő peptidfragmensével, amely peptidfragmens α-Ν-vége az intakt emlősplazminogén körülbelül 443. aminosavpozíciójának, α-C-vége annak körülbelül 546. aminosavpozíciójának felel meg. A kringle-5-peptid-fragmens teljes hossza változhat annak előállítási módjától függően, vagy annak szekvenciája bizonyos mértékben változhat aszerint, hogy azt mely fajból állítottuk elő. Például a kringle-5-peptid-fragmens bizonyos formáit előállíthatjuk glu-plazminogén, lys-plazminogén vagy miniplazminogén proteolitikus hasításával, humán vagy sertéseredetű elasztáz enzim alkalmazásával. Az így előállított peptid α-C-terminális vége az 1. azonosító számú szekvencia szerinti körülbelül 543. aminosavnak felel meg, de α-Ν-terminális vége kezdődhet a 443., 449. vagy 454. aminosavpozíciónál. Ennek megfelelően, ha glu-plazminogént, lys-plazminogént vagy miniplazminogént humán vagy sertéseredetű elasztázzal emésztünk, a képződött kringle-5-peptid-fragmens teljes hossza lehet 101, 95 vagy 90 aminosav. Ilyen kringle-5-peptid-fragmenseket soroltunk fel az 1. táblázatban. A fenti eljárást alkalmazva az említett három fragmens elegyét kapjuk, amelyben a fragmensek körülbelül 60%-a 95 aminosav, 35%-a 101 aminosav, míg körülbelül 5%-a 90 aminosav hosszú. Kívánt esetben a különböző fragmensek szakember számára jól ismert eljárásokkal, például HPLC-eljárással tovább tisztíthatok. A fragmensek hosszúságában kimutatható eltérésektől függetlenül a találmány szerinti K5-peptid-fragmens tartalmazza vagy a Lys-Leu-Tyr-Asp szekvenciát (azaz az 1. azonosító számú szekvencia szerinti 531. aminosavpozíciótól az 534. aminosavpozícióig terjedő szekvenciát), vagy az Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-GlyGly-Pro-Trp (azaz az 1. azonosító számú szekvencia szerinti 514. aminosavpozíciótól az 523. aminosavpozícióig terjedő szekvenciát); vagy azok analógjait.
A leírásban a „kringle-5 fúziós protein” kifejezés alatt olyan polipeptidet értünk, amely két vagy több egyedi protein aminosavszekvenciáját tartalmazza, és ezek közül az egyik protein K5-peptid-fragmens. Fúziós proteint úgy állítunk elő, hogy olyan polinukleotidot expresszáltatunk, amelyben a kringle-5-peptid-fragmenst kódoló szekvenciát összekapcsoljuk legalább egy, más polipeptidet kódoló szekvenciával oly módon, hogy a két (vagy több) leolvasási keret egy fázisba essen. Előnyösen olyan kringle-5 fúziós proteineket állítunk elő, amelyekben kringle-5-peptid-fragmenst fuzionáltatunk megfelelő humán plazminogénszekvenciával, például kringle-4 (K4), kringle-3-4 (K3-4), kringle-2-4 (K2-4) vagy kringle-1—4 (K1-4) szekvenciával. Előnyösen K5 fúziós proteinként a kringle-4-5- (K4-5) fragmenst tartalmazó proteint alkalmazunk. A találmány szerinti kringle-5 fúziós proteinek tartalmazhatnak továbbá K5-peptid-fragmenst vagy K4-5-pep4
HU 224 827 Β1 tid-fragmenst, egy további biológiai hatású toldalékhoz kapcsoltan. Az ilyen fúziós proteinek eredeti protein-alkotórészeikre hasíthatok, vagy azokra nem hasíthatok.
A leírásban a „K5-peptidfragmens-konjugátumon” olyan kringle-5-peptid-fragmenst értünk, amelyhez kémiai eljárással más proteint kapcsoltunk, hogy konjugátumot kapjunk. Kringle-5-peptidfragmens-konjugátum például albuminnal vagy emlősplazminogén más kringle-régiójából származó peptidfragmenssel összekapcsolt kringle-5-peptid-fragmens. Kringle-5-peptidfragmens-konjugátumok molekulatömege körülbelül 1000-25 000 kDa közötti érték lehet.
A leírásban a „lényegében homológ szekvencia” kifejezés alatt mintegy 60% aminosavazonosságot; előnyösen legalább mintegy 70% aminosavazonosságot; előnyösebben mintegy 80% aminosavazonosságot; még előnyösebben mintegy 95% aminosavazonosságot értünk, a humán plazminogén megfelelő peptidszekvenciájával. Azon szekvenciákat, amelyek humán plazminogénproteinnel lényegében homológ szekvenciával rendelkeznek, „homológoknak nevezzük. Azon felül, hogy lényegében homológ szekvenciával rendelkeznek, a találmány szerinti homológok az ismertetett K5-peptid-fragmensekhez hasonló biológiai aktivitást (azaz antiangiogén aktivitást) mutatnak. Mivel egy kringle-5-peptid aminosavszekvenciája vagy az azt alkotó aminosavak száma változhat aszerint, hogy mely fajból származik, vagy aszerint, hogy milyen eljárással állítottuk elő, valamely kringle-5-peptid-fragmenst alkotó aminosavak száma bizonyos esetekben nem határozható meg pontosan. Mivel ezek a szekvenciák legalább 73% aminosavazonosságot mutatnak, nyilvánvaló, hogy különböző fajokból származó kringle-5-peptid-fragmensek aminosavszekvenciája lényegében hasonló, és kringle-5-peptid-fragmensek előállítására alkalmas eljárások a humán plazminogén megfelelő aminosavszekvenciáihoz lényegében homológ szekvenciát eredményeznek. A 2. ábra 95 aminosavat tartalmazó humán kringle-5-peptid-fragmens (34. azonosító számú szekvencia) aminosavszekvenciáját mutatja, összehasonlítva azt egér- (35. azonosító számú szekvencia), rhesusmajom- (36. azonosító számú szekvencia), szarvasmarha- (37. azonosító számú szekvencia) és sertéseredetű (38. azonosító számú szekvencia) plazminogénből származó kringle-5-peptid-fragmensek szekvenciájával.
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan aminosavszekvenciák, amelyek analógok a leírásban feltárt szekvenciákkal, amennyiben ezek a szekvenciák (azaz analógok) a találmány szerinti kringle-5-peptid-fragmensekhez és azok fúziós proteinjeihez hasonló biológiai aktivitást mutatnak. A technika állása szerint jól ismert, hogy módosításokat és változtatásokat eszközölhetünk (valamely peptid szekvenciájában) anélkül, hogy lényegesen megváltozna a peptid biológiai tulajdonsága. Ilyen változtatásoknál hasonló aminosavak szubsztitúcióját végezhetjük el oldallánccsoportok relatív hasonlatossága alapján, például azok mérete, töltése, hidrofób vagy hidrofil sajátsága és hasonló tulajdonságai alapján. Az ismertetett típusú változtatásokat végezhetjük abból a célból, hogy fokozzuk a peptid aktivitását, növeljük stabilitását enzimatikus lebontással szemben, vagy farmakokinetikai megfontolásból. Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezik analóg szekvenciák, amelyeket aminosavszekvenciájukban történt aminosavcsere vagy aminosavtípus megváltoztatása jellemez, azonban a változás nem érinti a fenti K5-peptid-fragmensek és/vagy fúziós proteinek alapvető természetét és biológiai aktivitását.
A találmány szerinti K5-peptid-fragmens vagy K5 fúziós protein jellemezhető azon tulajdonsága alapján, hogy milyen mértékben képes gátolni szarvasmarha-kapillárissejtek (BCE-sejtek) növekedését in vitro. Az 1. táblázat és a 4. ábra azt mutatja, hogy az 1. azonosító számú szekvencia szerinti 443. aminosavpozíciótól az 543. aminosavpozícióig terjedő szekvenciával rendelkező K5-peptid-fragmens mintegy 300-szoros aktivitásnövekedést (azaz BCE-sejtnövekedés-gátlást) mutat ugyanezen azonosító számú szekvencia szerinti 443. aminosavpozíciótól az 546. aminosavpozícióig terjedő szekvenciával rendelkező K5-peptid-fragmens aktivitásához képest, és mintegy 800-szoros aktivitásnövekedést mutat kringle-1-4-peptid-fragmensek aktivitásához képest.
A leírásban az „izolált” kifejezés alatt azt értjük, hogy valamely anyagot eltávolítunk eredeti környezetéből (azaz természetes környezetéből, ha az a természetben előfordul). Például élő állatban természetben előforduló polinukleotid vagy polipeptid nem izolált, ha azonban ugyanezen polinukleotidot vagy DNS-t vagy polipeptidet elválasztjuk a természetes környezetében vele együtt található néhány vagy minden anyagtól, akkor az izolálttá válik. Az ilyen polinukleotid lehet vektor alkotórésze és/vagy az ilyen polinukleotid vagy polipeptid lehet készítmény összetevője, és mégis izolált abban az értelemben, hogy a vektor vagy készítmény nem része természetes környezetének.
A leírásban a „láncindító oligonukleotid” („primer”) kifejezés alatt valamely cél-nukleotidszekvenciával komplementer specifikus oligonukleotidszekvenciát értünk, amelyet cél-nukleotidszekvenciával hibridizáltatunk, miáltal az DNS-polimeráz, RNS-polimeráz vagy reverz transzkriptáz által katalizált nukleotidpolimerizáció kiindulási pontjául szolgál.
A leírásban a „próbán” meghatározott nukleinsavszegmenst (vagy nukleotidanalóg szegmenst, azaz PNA-t) értünk, amely mintában a komplementer szekvenciát hordozó specifikus DNS azonosítására alkalmazható.
A leírásban a „rekombináns polipeptid” kifejezés alatt legalább olyan polipeptidet értünk, amely eredeténél fogva, vagy manipulációk következtében nem azzal a polipeptiddel vagy annak részével van asszociálva, amellyel a természetben, és/vagy valamely más polipeptidhez van kapcsolva, mint amelyhez a természetben kapcsolódik. Egy rekombináns vagy származtatott polipeptid nem feltétlenül egy adott nukleinsavszekvenciáról transzlálódott. Azt bármely más eljárással előállíthatjuk, például kémiai szintézissel vagy rekombináns expressziós rendszerben történő expresszáltatással.
HU 224 827 Β1
A leírásban a „szintetikus peptid” kifejezés alatt aminosavak bármilyen hosszúságú polimer formáját értjük, amelyet szakember számára jól ismert kémiai eljárásokkal szintetizálhatunk. Ezeket a szintetikus peptideket különböző célokra alkalmazhatjuk.
A leírásban a „tisztított polinukleotid kifejezésen olyan adott polinukleotidot vagy annak fragmensét értjük, amely lényegében mentes attól a proteintől, amellyel a természetben asszociált (azaz abból kevesebb, mint mintegy 50%-ot, előnyösen kevesebb, mint mintegy 70%-ot, előnyösebben kevesebb, mint mintegy 90%-ot tartalmaz). Polinukleotidok tisztítására alkalmas eljárások jól ismertek, ilyen lehet például az adott polinukleotidot tartalmazó sejt kaotropikus hatású anyaggal történő feltárása, majd a polinukleotid(ok) és proteinek elválasztása ioncserélő kromatográfiával, affinitásos kromatográfiával vagy sűrűséggradiens-ülepítési eljárással. Ennek megfelelően a leírásban a „tisztított polipeptid” kifejezés alatt olyan polipeptidet vagy annak fragmensét értjük, amely lényegében mentes azon sejtösszetevőktől, amellyel a kérdéses polipeptid a természetben asszociált (azaz azokból kevesebb, mint mintegy 50%-ot, előnyösen kevesebb, mint mintegy 70%-ot, előnyösebben kevesebb, mint mintegy 90%-ot tartalmaz). Polipeptidek tisztítására alkalmas eljárások jól ismertek.
A leírásban a „polipeptid” kifejezés láncot alkotó aminosavakból álló molekulát jelöl, függetlenül annak hosszától. Ennek megfelelően a „polipeptid” meghatározás vonatkozik peptidekre, oligopeptidekre és proteinekre. Ez a kifejezés vonatkozik továbbá expressziét követő módosuláson, például glikozilezésen, acetilezésen, foszforilezésen és hasonló változáson átesett polipeptidekre.
A leírásban a „rekombináns gazdasejtek”, „gazdasejtek”, „sejtek”, „sejtvonalak”, „sejtkultúrák” és más, egysejtes formában tenyésztett mikroorganizmus vagy magasabb rendű eukarióta sejtvonalakat jelölő kifejezések alatt olyan sejteket értünk, amelyeket recipiensként (befogadóként) alkalmazhatunk vagy alkalmaztunk rekombináns vektor vagy más átvitt DNS befogadására, ezenfelül idetartoznak az eredeti transzfektált sejt eredeti utódai.
A leírásban a „replikon” kifejezés alatt olyan genetikai egységet, például plazmidot, kromoszómát vagy vírust értünk, amely a sejten belüli polinukleotidreplikáció önálló egységeként viselkedik.
A leírásban a „vektornak” olyan replikont nevezünk, amelyhez más polinukleotidszegmenst kapcsoltunk abból a célból, hogy a kapcsolt polinukleotid replikálódjék és/vagy expresszálódjék.
A leírásban a „kontrollszekvencia” kifejezés alatt olyan polinukleotidszekvenciákat értünk, amelyek a hozzájuk kapcsolódó kódolószekvenciák expressziójának szabályozásához szükségesek. Az ilyen kontroliszekvenciák természete gazdasejttől függő. Általánosságban, prokariótákban ilyen kontrollszekvenciák lehetnek promoterek, riboszómális kötőhelyek és terminátorszekvenciák; eukarióta sejtekben általában az ilyen kontrollszekvenciák lehetnek promoterek, terminátorok és bizonyos esetben segítő- („enhancer”) szekvenciák. „Kontrollszekvencia” kifejezés alatt tehát minimálisan az expresszálódáshoz szükséges genetikai elemeket értjük, ezenfelül beletartozhatnak olyan további elemek is, mint például vezetőszekvenciák („leader sequences”), amelyek jelenléte az expresszálódás szempontjából előnyös.
A leírásban a „működőképesen kapcsolt” („operably linked”) kifejezés alatt olyan állapotot értünk, amelyben az ismertetett összetevők olyan kapcsolatban állnak egymással, amely lehetővé teszi számukra, hogy a várt módon működjenek. Ennek megfelelően például kódolószekvenciához „működőképesen kapcsolt” kontroliszekvenciát oly módon ligálunk, hogy a kódolószekvencia expresszálódása a kontrollszekvenciákkal kompatibilis körülmények között történjék.
A leírásban a „nyitott olvasási keret” kifejezés alatt („open reading frame, ORF”) polinukleotidszekvencia-régiót értünk, amely polipeptidet kódol; ez a régió lehet kódolószekvencia egy része vagy teljes kódolószekvencia.
A leírásban a „kódolószekvencia kifejezés alatt („coding sequence”) polinukleotidszekvenciákat értünk, amelyek mRNS-sé íródnak át, és polipeptiddé transzlálódnak, amennyiben a megfelelő kontrollszekvenciák irányítása alá helyezzük azokat. Egy kódolószekvencia határait 5’-irányban transzlációs startkodon, 3'-irányban transzlációs stopkodon határozza meg. Kódolószekvencia lehet, anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk, mRNS, cDNS vagy rekombináns polinukleotidszekvencia.
A leírásban a „transzformáción” exogén polinukleotid gazdasejtbe történő bejuttatását értjük, függetlenül a bejuttatásra alkalmazott eljárástól. Alkalmazhatunk például közvetlen felvételt, transzdukciót vagy f-párosodást („f-mating”). Az exogén polinukleotid fennmaradhat mint nem integrált vektor, például plazmid, vagy integrálódhat a gazda genomjába.
A leírásban a „tisztított termék” kifejezés alatt termék előállítását értjük, amelyet olyan sejtösszetevők közül izoláltunk, amelyekkel természetes körülmények között általában asszociált; vagy annak más típusú sejtektől történő elválasztását értjük, amelyek a kérdéses mintában jelen lehetnek.
Minden peptidszekvenciát általánosan elfogadott konvenció szerint jelöltünk, amely szerint, az a-N-terminális aminosav balra, az α-C-terminális aminosav jobbra esik. A leírásban az „α-Ν-terminus” alatt valamely peptidben lévő aminosav szabad alfa-aminocsoportját értjük, és „α-C-terminus” alatt valamely peptidben lévő aminosav szabad alfa-karboxilsavcsoportját értjük.
A leírásban az „N-védőcsoport” kifejezés alatt olyan csoportokat értünk, amelyek alkalmasak aminosav vagy peptid α-Ν-terminusának védelmére, vagy más módon képesek megvédeni aminosav vagy peptid aminocsoportját nem kívánt reakcióktól, szintetikus eljárások során. Általánosan alkalmazott N-védőcsoportokat ismertet Greene a „Protective Groups In Organic Synthesis” [John Wiley & Sons, New York (1981)] szakiro6
HU 224 827 Β1 dalmi helyen, amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi. Alkalmazhatunk továbbá védőcsoportokat prodrug formájában, amelyek könnyen hasadnak in vivő, például enzimatikus hidrolízissel, miáltal a biológiailag aktív anyadrog felszabadul. N-védőcsoportként alkalmazhatunk alacsony molekulatömegű alkanoilcsoportot, például formil-, acetil- („Ac”), propionil-, pivaloil-, t-butil-acetil- és hasonló csoportokat; további acilcsoportokat, például 2-kloro-acetil-, 2-bromo-acetil-, trifluoro-acetil-, trikloro-acetil-, ftalil-, o-nitro-fenoxi-acetil-, α-kloro-butiril-, benzoil-, 4-kloro-benzoil-, 4-bromobenzoil-, 4-nitro-benzoil- és hasonló csoportokat; szulfonilcsoportokat, például benzénszulfonil-, p-toluénszulfonil- és hasonló csoportokat; karbamátképző csoportokat, például benzil-oxi-karbonil-, p-kloro-benziloxi-karbonil-, ρ-metoxi-benzil-oxi-karbonil-, p-nitrobenzil-oxi-karbonil-, 2-nitro-benzil-oxi-karbonil-, pbromo-benzil-oxi-karbonil-, 3,4-dimetoxi-benzil-oxikarbonil-, 3,5-dimetoxi-benzil-oxi-karbonil-, 2,4-dimetoxi-benzil-oxi-karbonil-, 4-metoxi-benzil-oxi-karbonil-, 2-nitro-4,5-dimetoxi-benzil-oxi-karbonil-, 3,4,5-trimetoxi-benzil-oxi-karbonil-, 1-(p-bifenil)-1-metil-etoxikarbonil-, a,a-dimetil-3,5-dimetoxi-benzil-oxi-karbonil-, benzhidril-oxi-karbonil-, t-butil-oxi-karbonil-, diizopropil-metoxi-karbonil-, izopropil-oxi-karbonil-, etoxi-karbonil-, metoxi-karbonil-, allil-oxi-karbonil-, 2,2,2-trikloro-etoxi-karbonil-, fenoxi-karbonil-, 4-nitro-fenoxi-karbonil-, fluorenil-9-metoxi-karbonil-, ciklopentil-oxi-karbonil-, adamantil-oxi-karbonil-, ciklohexil-oxi-karbonil-, fenil-tiokarbonil- és hasonló csoportokat; aril-alkil-csoportokat, például benzil-, trifenil-metil-, benzil-oxi-metil-, 9-fluorenil-metil-oxi-karbonil- (Fmoc) és hasonló csoportokat, valamint szililcsoportokat, például trimetil-szilil- és hasonló csoportokat. N-védőcsoportokként előnyösen, alkalmazhatunk formil-, acetil-, benzoil-, pivaloil-, t-butil-acetil-, fenil-szulfonil-, benzil-, t-csoportokat (Cbz). Például lizin α-Ν-terminusát védhetjük savérzékeny csoporttal (például Boc-csoporttal), ε-Ν-terminusát pedig egy lúgérzékeny csoporttal (például Fmoc-csoporttal), majd a védelmet szelektíven oldhatjuk a szintézis során.
A leírásban a „karboxivédő csoport” kifejezés alatt karboxilsavat védő észter- vagy amidcsoportot értünk, amely alkalmas karboxilsavfunkciók blokkolására vagy a fenti csoport védelmére úgy, hogy a vegyület más funkcionális csoportjait érintő reakciók végbemenjenek. Karboxivédő csoportokat ismertet Greene a „Protective Groups in Organic Synthesis” [152-186. oldal (1981)] című kézikönyvben, amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi. Karboxivédő csoportokat alkalmazhatunk továbbá prodrugokként, amelyben a karboxivédő csoport in vivő könnyen hasítható, például enzimatikus hidrolízis révén, hogy biológiai aktivitással rendelkező anyadrog („parent drug”) felszabaduljon. Ilyen karboxivédő csoportok szakember számára jól ismertek, mivel ezeket kiterjedten alkalmazzák karboxilcsoportok védelmére penicillinek és kefalosporinok előállítása során, amint azt a 3 840 556 és 3 719 667 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások ismertetik, amely leírások teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik. Karboxivédő csoportként alkalmazhatunk C-i-Cg alacsony szénatomszámú alkilcsoportot (például metil-, etil- vagy t-butil- és hasonló csoportokat); aril-alkil-csoportokat, például fenetil- vagy benzilcsoportokat, valamint azok szubsztituált származékait, például alkoxi-benzil- vagy nitro-benzil-csoportokat és hasonló csoportokat; aril-alkenil-csoportokat, például fenil-etenil-csoportot és hasonló csoportokat; arilcsoportot és annak szubsztituált származékait, például 5-indanil- és hasonló csoportokat; dialkil-amino-alkil-csoportot, például dimetil-amino-etil- és hasonló csoportokat; alkanoil-oxi-alkil-csoportokat, például acetoxi-metil-, butiril-oxi-metil-, valeril-oxi-metil, izobutiril-oxí-metil-, izovarelil-oxi-metil-, 1-(propionil-oxi)-1-etil-, l-(pivaloil-oxi)1 -etil-, 1 -metil-1 -(propionil-oxi)-1 -etil-, pivaloil-oxi-metil-, propionil-oxi-metil- és hasonló csoportokat; cikloalkanoil-oxi-alkil-csoportokat, például ciklopropil-karbonil-oxi-metil-, ciklobutil-karbonil-oxi-metil-, ciklopentil-karbonil-oxi-metil-, ciklohexil-karbonil-oxi-metil- és hasonló csoportokat; aroil-oxi-alkil-csoportokat, például benzoil-oxi-metil-, benzoil-oxi-etil- és hasonló csoportokat; aril-alkil-karbonil-oxi-alkil-csoportokat, például benzil-karbonil-oxi-metíl-, 2-benzil-karbonil-oxi-etil- és hasonló csoportokat; alkoxi-karbonil-alkil- vagy cikloalkoxi-karbonil-alkil-csoportokat, például metoxi-karbonil-metil-, ciklohexil-oxi-karbonil-metil-, 1 -metoxi-karbonil-1 -etil- és hasonló csoportokat; alkoxi-karbonil-oxi-alkil- vagy cikloalkoxi-karbonil-oxi-alkil-csoportokat, például metoxi-karbonil-oxi-metil-, t-butil-oxi-karboniloxi-metil-, 1-etoxi-karbonil-oxi-1-etil-, 1-ciklohexil-oxikarbonil-oxi-1-etil- és hasonló csoportokat; aril-oxikarbonil-oxi-alkil-csoportokat, például 2-(fenoxi-karbonil-oxi)-etil-, 2-(5-indanil-oxi-karbonil-oxi)-etil- és hasonló csoportokat; alkoxi-alkil-karbonil-oxi-alkil-csoportokat, például 2-(1-metoxi-2-metil-propan-2-oil-oxi)-etilés hasonló csoportokat; aril-alkil-oxi-karbonil-oxi-alkil-csoportokat, például 2-(benzil-oxi-karbonil)-etil- és hasonló csoportokat; aril-alkenil-oxi-karbonil-oxi-alkil-csoportokat, például 2-(3-fenil-propen-2-il-oxi-karbonil-oxi)-etil- és hasonló csoportokat; alkoxi-karbonilamino-alkil-csoportokat, például t-butil-oxi-karbonil-amino-metil- és hasonló csoportokat; alkil-amino-karbonilamino-alkil-csoportokat, például metil-amino-karbonilamino-metil- és hasonló csoportokat; alkanoil-amino-alkil-csoportokat, például acetil-amino-metil- és hasonló csoportokat; heterociklusos karbonil-oxi-alkil-csoportokat, például 4-metil-piperazinil-karbonil-oxi-metil- és hasonló csoportokat; dialkil-amino-karbonil-alkil-csoportokat, például dimetil-amino-karbonil-metil-, dietil-aminokarbonil-metil- és hasonló csoportokat; [5-(alacsony szénatomszámú alkil)]-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)-alkilcsoportokat, (5-t-butil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)-metil- és hasonló csoportokat; és (5-fenil-2-oxo-1,3-dioxolen-4il)-alkil-csoportokat, például (5-fenil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)-metil- és hasonló csoportokat.
Amidkötésű karboxivédő csoportokként alkalmazhatunk például amino-karbonil- és alacsony szénatomszámú alkil-amino-karbonil-csoportokat.
A találmány szerinti előnyös karboxivédett vegyületek olyan vegyületek, amelyekben a védett karboxicso7
HU 224 827 Β1 port alacsony szénatomszámú alkil-, cikloalkil- vagy aril-alkil-észter, például metil-észter, etil-észter, propil-észter, izopropil-észter, butil-észter, szekunder butil-észter, izobutil-észter, amil-észter, izoamil-észter, oktil-észter, ciklohexil-észter, fenil-etil-észter és hasonló észterek, vagy alkanoil-oxi-alkil-, cikloalkanoil-oxi-alkil-, aroil-oxi-alkil- vagy aril-alkil-karbonil-oxi-alkil-észter. Előnyös amid karboxivédő csoportok az alacsony szénatomszámú alkil-amino-karbonil-csoportok. Például aszparaginsavat α-C-terminusánál védhetjük savérzékeny csoporttal (például t-butil-csoporttal), és β-C-terminusánál védhetjük hidrogénezésre érzékeny csoporttal (például benzilcsoporttal), majd a védelmet szelektíven feloldhatjuk a szintézis során.
A leírásban az „alacsony szénatomszámú alkil-amino-karbonil-csoport kifejezés alatt -C(O)NHR10 csoportot értünk, amely szintetikus kringle-5-peptidfragmens α-C-terminusát fedi, ahol az R10 C1-C4 alkilt jelent.
A leírásban az „amino-karbonil-csoport” kifejezés alatt -C(O)NH2 csoportot értünk, amely szintetikus kringle-5-peptid-fragmens α-C-terminusát fedi.
A leírásban a „prodrug” kifejezés alatt („elővegyület”) olyan vegyületeket értünk, amelyek in vivő gyorsan átalakulnak anyadroggá, például vérben történő enzimatikus hidrolízis révén. E témakört részletesen ismertetik T. Higuchi és V. Stella [„Prodrugs as Növel Delivery Systems”, A.C.S. Symposium Series 14], valamint Edward B. Roche (szerk.) [„Bioreversible Carriers in Drug Design”, American Pharmaceutical Association and Permagon Press (1987)], amelyek teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik.
A leírásban a „gyógyászatilag elfogadott prodrug” kifejezés alatt a következőket értjük: (1) a találmány szerinti vegyületek olyan prodrugjait, amelyek racionális orvosi megítélés szerint alkalmasak arra, hogy érintkezésbe kerüljenek emberek és alacsonyabb rendű állatok szöveteivel, fölösleges toxicitás, irritáció, allergiás reakció és hasonló tünetek nélkül, megfelelnek az elfogadott előny-kockázat arány követelményeinek, és az alkalmazott célra hatásosak, valamint (2) amennyiben lehetséges, az anyadrog ikerionformáját („zwitterionic form”).
A leírásban az „aktivált észterszármazék” kifejezés alatt savhalidokat, például savkloridokat értünk, valamint aktivált észtereket, amelyek lehetnek például, de anélkül hogy igényünket azokra korlátoznánk, hangyasavból és ecetsavból származtatott anhidridek, alkoxi-karbonil-halidokból származtatott anhidridek, például izobutil-oxi-karbonil-klorid és hasonlók, N-hidroxi-szukcinimidből származtatott észterek, N-hidroxi-ftálimidből származtatott észterek, N-hidroxi-benzotriazolból származtatott észterek, N-hidroxi-5-norbornen-2,3-dikarboxamidból származtatott észterek, 2,4,5-trikloro-fenolból származtatott észterek és hasonlók.
Akkor mondjuk, hogy egy molekula „antiangiogenezisaktivitású”, ha az gátolni képes véredények növekedését.
A leírásban az „endoteliális gátlóaktivitás” kifejezés alatt egy molekula azon tulajdonságát értjük, hogy általában angiogenezist gátol, valamint, például sejtkultúrában gátolja szarvasmarha-kapillárisendotélsejtek szaporodását vagy migrációját, fibroblaszt növekedési faktor vagy más ismert növekedési faktorok jelenlétében.
A leírásban az „ED50” kifejezés egy rövidítés, amely kringle-5-peptid-fragmens vagy fúziós protein azon koncentrációját jelenti, amely hatékonyan gátolja véredények növekedését, vagy gátolja szarvasmarha-endotélsejtek kultúrában történő szaporodását fibroblaszt növekedési faktor vagy más ismert növekedési faktorok jelenlétében, vagy gátolja endotélsejtek migrációját úgy, hogy azt fele olyan mértékűre csökkenti, mint amely növekedés/szaporodás vagy migráció végbemenne a gátlóanyag jelenléte nélkül.
A leírásban általában a természetben előforduló aminosavak és amino-acil-csoportok megnevezésénél követtük a IUPAC Szerveskémiai Nómenklatúra Bizottság által, valamint a IUPAC-IUB Biokémiai Nómenklatúra Bizottság által ajánlott elnevezési konvenciót [,,Nomenclature of α-Amino Acids” (Recommendations, 1974) Biochemistry 14(2), (1975)]. Ennek megfelelően az „Alá”, „Arg”, „Asn”, „Asp”, „Cys”, „Gin”, „Glu”, „Gly”, „His”, „Ile”, „Leu, „Lys”, „Met”, „Phe”, „Pro”, „Ser”, „Thr”, „Trp”, „Tyr” és „Val” rövidítés alanin, arginin, aszparagin, aszparaginsav, cisztein, glutamin, glutaminsav, glicin, hisztidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenil-alanin, prolin, szerin, treonin, triptofán, tirozin és valin aminosavakra vonatkozik, valamint azok peptidekben előforduló megfelelő amino-acil-csoportjaira vonatkozik, azok L-, D- vagy D,L-konfigurációjában. Ahol az adott konfigurációt nem jelöltük, szakember számára világos, hogy aminosavak és amino-acil-csoportok α-szénatomjának sztereokémiái konfigurációja a természetben előforduló, vagyis L-konfigurációnak felel meg, kivéve az akirális glicinmolekulát, továbbá bármely akirális aminosavat, vagy amelyeket „D”-konfigurációjúként jelöltünk a leírásunk szerinti peptidek vonatkozásában és a csatolt igénypontokban.
A leírásban a „3-l-Tyr” kifejezés alatt L-, D- vagy D,L-tirozil-csoportot értünk, ahol a fenol-hidroxil-csoporthoz képest orto-helyzetben található hidrogénatomot jódatom helyettesíti. A jódatom lehet radioaktív vagy nem radioaktív.
A találmány tárgyát képezik továbbá természetben elő nem forduló oldallánccsoportokkal rendelkező aminosavcsoportok, például homofenil-alanin, fenil-glicin, norvalin, norleucin, ornitin, tiazoil-alanin (2-, 4- és 5-szubsztituált) és hasonló aminosavcsoportok.
Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezi kringle-5-peptid-fragmensek és kringle-5 fúziós proteinek minden olyan származéka, amely antiangiogén aktivitással rendelkezik, valamint a találmány tárgyát képezi a leírásban ismertetett kringle-5-peptid-fragmensek és fúziós proteinek teljes osztálya, továbbá ezen fragmensek és proteinek homológjai és analógjai. A találmány oltalmi köre független továbbá a kringle-5-peptid-fragmens vagy fúziós protein előállítási módjától, azaz attól, hogy (1) izolált emlősplazminogén proteolitikus hasításával, (2) kringle-5-peptid-fragmens vagy fú8
HU 224 827 Β1 ziós protein aminosavszekvenciáját kódoló polinukleotidot tartalmazó rekombináns molekula expresszáltatásával, vagy (3) szakember számára jól ismert szilárd fázisú szintetikus eljárással állítottuk azokat elő.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezik B-C-X általános képletű peptidek, ahol B egy 88 tagú peptidet jelent, amely az 1. azonosító számú szekvencia szerinti Val443 aminosavval kezdődik és az Arg530 aminosavval végződik; C egy 4 tagú peptid, ahol R1 és R4 jelentését fentebb ismertettük, R2 leucil-, R3 tirozilcsoportot jelent; és X egy 9 tagú peptidet jelent, amely az 1. azonosító számú szekvencia szerinti Tyr535 aminosavval kezdődik és Alá543 aminosavval végződik.
A találmány egy további megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezik B-C-X általános képletű peptidek, ahol B egy 82 tagú peptidet jelent, amely az 1. azonosító számú szekvencia szerinti Val449 aminosavval kezdődik és az Arg530 aminosavval végződik; C egy 4 tagú peptid, ahol R1 és R4 jelentését fentebb ismertettük, R2 leucil-, R3 tirozilcsoportot jelent; és X egy 9 tagú peptidet jelent, amely az 1. azonosító számú szekvencia szerinti Tyr535 aminosavval kezdődik és Alá543 aminosavval végződik.
A találmány további megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezik B-C-X általános képletű peptidek, ahol B egy 77 tagú peptidet jelent, amely az 1. azonosító számú szekvencia szerinti Val454 aminosavval kezdődik és Arg530 aminosavval végződik; C egy 4 tagú peptid, ahol R1 és R4 jelentését fentebb ismertettük, R2 leucil-, R3 tirozilcsoportot jelent; és X egy 9 tagú peptidet jelent, amely az 1. azonosító számú szekvencia szerinti Tyr535 aminosavval kezdődik és Alá543 aminosavval végződik.
A találmány további megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezik B-C-X általános képletű peptidek, ahol B egy 88 tagú peptidet jelent, amely az 1. azonosító számú szekvencia szerinti Val443 aminosavval kezdődik és Arg530 aminosavval végződik; C egy 4 tagú peptid, ahol R1 és R4 jelentését fentebb ismertettük, R2 leucil-, R3 tirozilcsoportot jelent; és X egy 12 tagú peptidet jelent, amely az 1. azonosító számú szekvencia szerinti Tyr535 aminosavval kezdődik és Phe546 aminosavval végződik.
A találmány további megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezik B-C-X általános képletű peptidek, ahol B egy 82 tagú peptidet jelent, amely az 1. azonosító számú szekvencia szerinti Val443 aminosavval kezdődik és Arg530 aminosavval végződik; C egy 4 tagú peptid, ahol R1 és R4 jelentését fentebb ismertettük, R2 leucil-, R3 tirozilcsoportot jelent; és X egy 12 tagú peptidet jelent, amely az 1. azonosító számú szekvencia szerinti Tyr535 aminosavval kezdődik és Phe546 aminosavval végződik.
A találmány további megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezik B-C-X általános képletű peptidek, ahol B egy 77 tagú peptidet jelent, amely az 1. azonosító számú szekvencia szerinti Val454 aminosavval kezdődik és Arg530 aminosavval végződik; C egy 4 tagú peptid, ahol R1 és R4 jelentését fentebb ismertettük, R2 leucil-, R3 tirozilcsoportot jelent; és X egy 12 tagú peptidet jelent, amely az 1. azonosító számú szekvencia szerinti Tyr535 aminosavval kezdődik és Phe546 aminosavval végződik.
A találmány további megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezik B-C-X általános képletű peptidek, ahol B egy 176 tagú peptidet jelent, amely az 1. azonosító számú szekvencia szerinti Val355 aminosavval kezdődik és Arg530 aminosavval végződik; C egy 4 tagú peptid, ahol R1 és R4 jelentését fentebb ismertettük, R2 leucil-, R3 tirozilcsoportot jelent; és X egy 12 tagú peptidet jelent, amely az 1. azonosító számú szekvencia szerinti Tyr535 aminosavval kezdődik és Alá543 aminosavval végződik.
A találmány további megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezik B-C-X általános képletű peptidek, ahol B egy 176 tagú peptidet jelent, amely az 1. azonosító számú szekvencia szerinti Val443 aminosavval kezdődik és Arg530 aminosavval végződik; C egy 4 tagú peptid, ahol R1 és R4 jelentését fentebb ismertettük, R2 leucil-, R3 tirozilcsoportot jelent; és X egy 12 tagú peptidet jelent, amely az 1. azonosító számú szekvencia szerinti Tyr535 aminosavval kezdődik és Phe546 aminosavval végződik.
A találmány további megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezik A-C-Y általános képletű peptidek, ahol A acetilcsoportot jelent; C egy 4 tagú peptid, ahol R1 és R4 jelentését fentebb ismertettük, R2 leucil-, R3 tirozilcsoportot jelent; és Y amino-karbonil-csoportot jelent.
A találmány további megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezik A-C-X-Y általános képletű peptidek, ahol A acetilcsoportot jelent; C egy 4 tagú peptid, ahol R1 és R4 jelentését fentebb ismertettük, R2 leucil-, R3 tirozilcsoportot jelent; X tirozilcsoportot jelent; és Y amino-karbonil-csoportot jelent.
A találmány további megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezik A-B-C-Y általános képletű peptidek, ahol A acetilcsoportot jelent; B dipeptidet jelent, amely az 1. azonosító számú szekvencia szerinti Pro529 aminosavnál kezdődik és Arg530 aminosavnál végződik; C egy 4 tagú peptid, ahol R1 és R4 jelentését fentebb ismertettük, R2 leucil-, R3 tirozilcsoportot jelent; és Y amino-karbonil-csoportot jelent.
A találmány további megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezik A-B-C-X-Y általános képletű peptidek, ahol A acetilcsoportot jelent; B hexapeptidet jelent, amely az 1. azonosító számú szekvencia szerinti Tyr525 aminosavnál kezdődik és Arg539 aminosavnál végződik; C egy 4 tagú peptid, ahol R1 és R4 jelentését fentebb ismertettük, R2 leucil-, R3 tirozilcsoportot jelent; X tirozilcsoportot jelent; és Y amino-karbonil-csoportot jelent.
A találmány további megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezik A-B-C-X-Y általános képletű peptidek, ahol A acetilcsoportot jelent; B arginilcsoportot jelent; C egy 4 tagú peptid, ahol R1 és R4 jelentését fentebb ismertettük, R2 leucil-, R3 tirozilcsoportot jelent; X tirozilcsoportot jelent; és Y amino-karbonil-csoportot jelent.
HU 224 827 Β1
A találmány további megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezik A-B-C-X-Y általános képletű peptidek, ahol A acetilcsoportot jelent; B dipeptidet jelent, amely az 1. azonosító számú szekvencia szerinti Pro529 aminosavnál kezdődik és Arg530 aminosavnál végződik; C egy 4 tagú peptid, ahol R1 és R4 jelentését fentebb ismertettük, R2 leucil-, R3 tirozilcsoportot jelent; X 3-l-tirozil-csoportot jelent; és Y amino-karbonil-csoportot jelent.
A találmány további megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezik A-B-C-X-Y általános képletű peptidek, ahol A acetilcsoportot jelent; B dipeptidet jelent, amely az 1. azonosító számú szekvencia szerinti Pro529 aminosavnál kezdődik és Arg530 aminosavnál végződik; C egy 4 tagú peptid, ahol R1 és R4 jelentését fentebb ismertettük, R2 leucil-, R3 tirozilcsoportot jelent; X tirozilcsoportot jelent; és Y amino-karbonil-csoportot jelent.
A találmány további megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezik A-B^C^X^Y általános képletű peptidek, ahol A acetilcsoportot jelent; B-] és X-, hiányzik; C-ι egy 10 tagú peptidet jelent, amely az 1. azonosító számú szekvencia szerinti Arg514 aminosavnál kezdődik és Trp523 aminosavnál végződik; és Y amino-karbonil-csoportot jelent.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti vegyületekben A hiányzik vagy jelentése nitrogén-védőcsoport, előnyösen acetilcsoport; Y adott esetben hiányzik vagy jelentése karboxil-védőcsoport, előnyösen amino-karbonil-csoport; B-C-X pedig a felsoroltak bármelyikét jelenti:
(a) az 1. azonosító számú szekvencia szerinti 355-543. aminosavaknak megfelelő szekvenciát;
(b) az 1. azonosító számú szekvencia szerinti 355-546. aminosavaknak megfelelő szekvenciát;
(c) az 1. azonosító számú szekvencia szerinti 443-543. aminosavaknak megfelelő szekvenciát;
(d) az 1. azonosító számú szekvencia szerinti 449-543. aminosavaknak megfelelő szekvenciát;
(e) az 1. azonosító számú szekvencia szerinti 454-543. aminosavaknak megfelelő szekvenciát;
(f) az 1. azonosító számú szekvencia szerinti 443-546. aminosavaknak megfelelő szekvenciát;
(g) az 1. azonosító számú szekvencia szerinti
449- 546. aminosavaknak megfelelő szekvenciát;
(h) az 1. azonosító számú szekvencia szerinti 454-546. aminosavaknak megfelelő szekvenciát;
(i) az 1. azonosító számú szekvencia szerinti 525-535. aminosavaknak megfelelő szekvenciát;
(j) az 1. azonosító számú szekvencia szerinti
529- 535. aminosavaknak megfelelő szekvenciát;
(k) az 1. azonosító számú szekvencia szerinti
530- 535. aminosavaknak megfelelő szekvenciát;
(l) az 1. azonosító számú szekvencia szerinti
529- 534. aminosavaknak megfelelő szekvenciát;
(m) az 1. azonosító számú szekvencia szerinti
530- 534. aminosavaknak megfelelő szekvenciát; vagy (n) az 1. azonosító számú szekvencia szerinti
450- 543. aminosavaknak megfelelő szekvenciát.
További előnyös vegyület egy olyan vegyület, ahol
A acetilcsoportot jelent; Y amino-karbonil-csoportot jelent; és B1-C1-X1 az 1. azonosító számú szekvencia szerinti 514-523. aminosavaknak megfelelő szekvenciát jelenti.
K5-fragmenseket vagy K5 fúziós proteineket előállíthatunk olyan rekombináns molekula expresszáltatásával, amely kringle-5-peptid-fragmenst magában foglaló proteint kódoló szekvenciát tartalmazó polinikleotidszekvenciát tartalmaz, majd az expresszáltatott terméket tisztítjuk [Menhart és munkatársai: Biochemistry 32, 8799-8806 (1993)]. A humán plazminogén DNS-szekvenciája ismert [Browne, M. J. és munkatársai: Fibrinolysis 5(4), 257-260 (1991)], azt a 3. (A-B) ábrán ismertetjük (lásd 12. azonosító számú szekvencia). Egy kringle-5-régiót kódoló polinukleotidszekvencia a 12. azonosító számú szekvencia szerinti mintegy 1421. nukleotidpozíciónál kezdődik és mintegy az 1723. nukleotidpozíciónál végződik.
K5-peptid-fragmenst vagy K5 fúziós proteint génjét, humán plazminogént vagy K5 fúziós proteineket nagy mennyiségben expresszáló sejtekből vagy szövetekből állíthatunk elő, oly módon, hogy: (1) a szövetből vagy sejtekből mRNS-t izolálunk, (2) reverz transzkriptáz alkalmazásával előállítjuk a megfelelő DNS-szekvenciát és (3) megfelelő láncindító oligonukleotidokat választva, polimeráz-láncreakciós eljárást (PCR, „polimerase Chain reaction”) alkalmazva, amplifikáljuk az aktív K5-aminosavszekvenciát vagy annak fúziós proteinjét kódoló DNS-szekvenciát. Ezen túl, K5-peptid-fragmenst vagy K5 fúziós proteint kódoló polinukleotidot klónozhatunk bármely, kereskedelemben hozzáférhető expressziós vektorba (például pBR322-, pUC-vektorokba és hasonlókba) vagy expressziós/purifikációs vektorba [például GST fúziós vektorba (Pharmacia®, Piscataway, NJ, USA)], majd megfelelő prokarióta, vírus- vagy eukarióta gazdában azt expresszáltathatjuk. A tisztítást végezhetjük szokásos eljárásokkal, vagy kereskedelmi forgalomban lévő expressziós/tisztítási rendszerben, a gyártó utasításai szerint eljárva.
K5-peptid-fragmenst vagy fúziós proteint szintetizálhatunk továbbá szakember számára ismert szilárd fázisú kémiai eljárásokkal. Például kringle-5-peptidfragmensek szintetizálhatók Steward és Young által ismertetett szilárd fázisú kémiai eljárások szerint [Steward, J. M. és Young, J. D.: „Solid Phase Peptide Synthesis, második kiadás, Pierce Chemical Company, Rockford, IL, USA (1984)], „Applied Biosystem” szintetizálóberendezés alkalmazásával. Hasonlóképp, eljárhatunk úgy is, hogy több kisméretű fragmenst szintetizálunk, majd azokat nagyobb fragmensekké kapcsoljuk össze. Ezeket a szintetikus peptideket előállíthatjuk továbbá úgy is, hogy adott helyeken aminosavhelyettesítéseket hozunk létre, és vizsgáljuk az antiangiogenezisaktivitást in vitro és in vivő. Szilárd fázisú peptidszintézisre alkalmas számos eljárást ismertet J. M. Stewart és J. D. Young [„Solid Phase Peptide Synthezis” W. H. Freeman Co., San Francisco, USA, (1963)] és J. Meinhofer [„Hormonal Proteins and Peptides” 2. kötet, 46. oldal, Academic Press, New York, USA (1973)]. Klasszikus, oldatban végezhető eljárásokat ismertet G. Schröder és K. Lupke [„The Peptides” 1. kötet, Acade10
HU 224 827 Β1 mic Press, New York, USA], Általánosságban, a fenti eljárások szerint, egy vagy több aminosavat vagy megfelelő védőcsoporttal ellátott aminosavat adunk egy növekedő peptidlánchoz. Szokásosan, az első aminosavnak vagy amino-, vagy karboxilcsoportját megfelelő védőcsoporttal látjuk el. A védett vagy derivatizált aminosavat ezután inért, szilárd hordozóhoz kapcsolva vagy oldatban, amidkötés létrejöttéhez kedvező körülmények mellett reagáltatjuk a szekvencia szerint következő aminosavval, amelynek komplementer (amino- vagy karboxil-) csoportját megfelelően védtük. Ezután a védőcsoportot eltávolítjuk az újonnan hozzáadott aminosavcsoportról, majd hozzáadjuk a következő (megfelelően védett) aminosavat és így tovább. Miután az összes kívánt aminosav a megfelelő sorrendben összekapcsolódott, a maradék védőcsoportokat (és szilárd hordozót) lépésenként vagy egyszerre eltávolítva, előállítjuk a végső polipeptidet. A fenti általános eljárás egyszerű módosításával a növekvő lánchoz hozzáadhatunk egyszerre több aminosavat, például úgy, hogy egy védett tripeptidet egy védett dipeptiddel kapcsolunk össze (olyan körülmények mellett, amelyek nem eredményezik a királis centrumok racemizációját), miáltal a védőcsoportok eltávolítását követően pentapeptidet kapunk.
Különösen előnyösen a találmány szerinti vegyületeket szilárd fázisú peptidszintézis alkalmazásával állítjuk elő úgy, hogy az aminosav α-Ν-terminusát savvagy lúgérzékeny csoporttal védjük. Az ilyen védőcsoportok közös jellemzője, hogy peptidkötések létrehozásánál alkalmazott körülmények mellett stabilak, míg könnyen eltávolíthatók anélkül, hogy sérülne a növekvő peptidlánc, vagy hogy a peptidlánc bármely királis centruma racemizálódna. Megfelelő védőcsoportokként alkalmazhatjuk például a következőket: 9-fluorenil-metil-oxi-karbonil- (Fmoc), t-butil-oxi-karbonil(Boc), benzil-oxi-karbonil- (Cbz), bifenil-izopropil-oxi-karbonil-, t-amil-oxi-karbonil-, izobornil-oxi-karbonil-, a,a-dimetil-3,5-dimetoxi-benzil-oxi-karbonil-, ο-nitro-fenil-szulfenil-, 2-ciano-t-butil-oxi-karbonil- és más hasonló csoportokat. Kringle-5-peptid-fragmensek szintézisekor különösen előnyösen alkalmazható védőcsoport a 9-fluorenil-metil-oxi-karbonil- (Fmoc) csoport. Oldallánccal rendelkező aminosavak, például lizin és arginin védelmére előnyösen alkalmazható oldalláncvédő csoport például a 2,2,5,7,8-pentametil-kroman6-szulfonii- (pmc), nitro-, ρ-toluénszulfonil-, 4-metoxibenzénszulfonil-, Cbz-, Boc- és adamantil-oxi-karbonil-csoport; tirozin védelmére alkalmas lehet benzil-, o-bromo-benzil-oxi-karbonil-, 2,6-dikloro-benzil-, izopropil-, t-butil- (t-Bu), ciklohexil-, ciklopentil- és acetil(Ac) csoport; szerin védelmére alkalmazhatunk például t-butil-, benzil- és tetrahidropiranilcsoportokat; hisztidin védelmére alkalmazhatunk például tritil-, benzil-, Cbz-, p-toluénszulfonil- és 2,4-dinitro-fenil-csoportokat; triptofán védelmére alkalmazhatunk például formilcsoportot; aszparaginsav és glutaminsav védelmére alkalmas lehet benzil- és t-butil-csoport; valamint cisztein védelmére alkalmas lehet trifenil-metil- (tritil) csoport. A szilárd fázisú peptidszintézis-eljárásban az a-C-temninális aminosavat megfelelő szilárd hordozóhoz vagy gyantához kapcsoljuk. A fenti szintéziseljáráshoz olyan anyagokat (védőcsoportokat) alkalmazhatunk, amelyek a lépcsőzetes kondenzálás és védőcsoport-eltávolítás („condensation/deprotection”) műveleteihez szükséges reagensekkel és reakciókörülményekkel szemben inertek, valamint nem oldhatók az alkalmazott közegben. α-C-terminális karboxipeptidek szintézisénél előnyösen alkalmazható szilárd hordozó például a 4-hidroxi-metil-fenol-oxi-metil-kopoli(sztirén-1 % divinilbenzén). α-C-terminális amidpeptidek szintézisénél előnyösen alkalmazható szilárd hordozó például a
4-(2',4’-dimetoxi-fenil-Fmoc-amino-metil)-fenoxí-acetamido-etil gyanta, amelyet az Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) forgalmaz. Az α-C-terminális aminosavat Ν,Ν’-diciklohexil-karbodiimid (DCC), N,N’-diizopropil-karbodiimid (DIC) vagy O-benzotriazol-1-ilΝ,Ν,Ν’,Ν’-tetrametil-urónium-hexafluoro-foszfát (HBTU) alkalmazásával kapcsoljuk a gyantához, 4-dimetil-amino-piridin (DMAP), 1-hidroxi-benzotriazol (HOBT), benzotriazol-1 -il-oxi-trisz(dimetil-amino)-foszfónium-hexafluoro-foszfát (BOP) vagy bisz(2-oxo-3oxazolidinil)-foszfát-klorid (BOPC1) hozzáadása mellett vagy anélkül, a kapcsolódás időtartama mintegy 124 óra, 10-50 °C közötti hőmérsékleten, például dikloro-metán vagy DMF-oldószerben. Ha szilárd hordozóként 4-(2’,4’-dimetoxi-fenil-Fmoc-amino-metil)-fenoxi-acetamido-etil gyantát alkalmazunk, az Fmoc-csoportot szekunder aminnal, előnyösen piperidinnel hasítjuk, mielőtt azt a fentiek szerint, a megfelelő a-C-terminális aminosavval összekapcsoljuk. A védelem alól feloldott 4-(2’, 4’-dimetoxi-fenil-Fmoc-amino-metil)-fenoxi-acetamido-etil gyantához történő (a-C-terminus) kapcsolását előnyösen DMF-ben oldott O-benzotriazol-1-il-N,N,N’,N’-tetrametil-urónium-hexafluoro-foszfát (HBTU, 1 ekvivalens) és 1-hidroxi-benzotriazol (HOBT, 1 ekvivalens) alkalmazásával végezzük. Védőcsoporttal ellátott aminosavak egymás után történő kapcsolása végezhető automatizált polipeptidszintetizáló berendezésben, amint az szakember számára jól ismert. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a növekvő peptidlánc α-N-terminális csoportjait Fmoccsoporttal védjük. A növekvő peptid α-Ν-terminális végéről az Fmoc-védőcsoportot szekunder amin, előnyösen piperidinkezeléssel távolítjuk el. Az egyes védett aminosavakat háromszoros moláris feleslegben adjuk az elegyhez, a kapcsolást előnyösen DMF-ben végezzük. A kapcsolóreagens általában O-benzotriazol1-il-N,N,N’,N’-tetrametil-urónium-hexafluoro-foszfát (HBTU, 1 ekvivalens) és 1-hidroxi-benzotriazol (HOBT, 1 ekvivalensnyi mennyiségben). A szilárd fázisú szintézis végén a polipeptidet eltávolítjuk a gyantáról, majd a védelmet vagy egymást követő lépésekben, vagy egy művelettel feloldjuk. A polipeptid eltávolítását és a védelem feloldását végezhetjük egy műveletben úgy, hogy a gyantához kötött pepiidet tianizolt, vizet, etánditiolt és trifluorsavat tartalmazó hasítóeleggyel kezeljük. Ha a polipeptid α-C-terminusa alkil-amid, a polipeptidet alkil-aminnal történő aminolízissel távolítjuk el a gyantáról. Más megoldás szerint a peptidet eltávolíthatjuk
HU 224 827 Β1 transzészterifikálással, például metanol alkalmazásával, amelyet aztán aminolízis vagy direkt transzamidálás követhet. A védett peptidet ennél a pontnál tisztíthatjuk, vagy közvetlenül alávethetjük a következő műveletnek. Az oldalláncokat védő csoportokat a fent ismertetett hasítóelegy alkalmazásával távolíthatjuk el. A védelem alól teljesen feloldott peptidet kromatográfiás lépések sorozatával tisztíthatjuk, például az alábbi típusú eljárások valamelyike szerint, vagy valamennyit alkalmazva: enyhén bázikus (acetát típusú) gyantán végzett ioncserélő kromatográfia; derivatizálatlan polisztirén-divinil-benzén (például Amberlite XAD) gyantán végzett hidrofób adszorbciós kromatográfia; szilikagél adszorbciós kromatográfia; karboxi-metil-cellulóz gyantán végzett ioncserélő kromatográfia; megoszlási kromatográfia, például Sephadex-G25-, LH-20-gélen, vagy ellenáramú megoszlás; nagy teljesítményű folyadékkromatográfia („High Performance Liquid Chromatography, HPLC), különösen oktil- vagy oktadecil-szilil-szilikához kötött fázisú oszloptölteten végzett reverz fázisú HPLC. A kringle-5-peptid-fragmensek molekulatömegét gyors atombombázásos („Fást Atom Bombardment”, FAB) tömegspektroszkópiás eljárással határoztuk meg. Kringle-5-peptid-fragmensek szilárd fázisú szintézisét szemléltetjük az 1-12. példákban.
Előállításuktól függően K5-peptid-fragmensek vagy K5 fúziós proteinek tartalmazhatják az emlőseredetű plazminogén kringle-5-régiójának már említett diszulfidkötéseit, vagy létezhetnek azokat nem tartalmazó formában; vagy más emlős kringle-régiókkal alkotott fúziós proteinek létezhetnek a megfelelő régiókra jellemző diszulfidkötéseket tartalmazó formában vagy anélkül; vagy létezhetnek olyan tercier struktúrát képező diszulfidkötéseket tartalmazó formában, amely struktúra eltér a natív emlősplazminogénre jellemző tercier struktúrától. Az olyan kringle-5-peptid-fragmensek, amelyeket Glu-, Lys- vagy miniplazminogén enzimatíkus hasításával állítottunk elő azok elasztázés/vagy pepszinemésztésével (ezek az enzimek ciszteinkötésekből eltávolított helyeknél hasítanak), tartalmazzák a natív tercier kringle-5-proteinstruktúrát; a szilárd fázisú peptidszintézissel előállított kringle-5-peptid-fragmensek vagy tartalmaznak cisztil-amino-acilcsoportokat, vagy nem tartalmaznak ilyeneket; és az expresszáltatással előállított kringle-5-peptid-fragmensek esetleg más pozícióban tartalmaznak diszulfidkötéseket, mint az enzimatikus hasítással nyert kringle-5-peptid-fragmensek.
A találmány szerinti vegyületek (például - de anélkül, hogy igényünket azokra korlátoznánk - a példákban ismertetett vegyületek) antiangiogén aktivitással rendelkeznek. Angiogenezisgátlókként ezek a vegyületek alkalmasak például a felsorolt elsődleges (primer) és áttétes (metasztatikus) szolid tumorok és karcinómák, valamint a felsorolt egyéb kórképek kezelésére: emlő; vastagbél; végbél; tüdő; középső garat; alsó garat; nyelőcső; gyomor; hasnyálmirigy; máj; epehólyag; epevezetékek és vékonybél tumorai és karcinómái; húgyutak, például vese, húgyhólyag és urothelium tumorai és karcinómái; női nemi utak, például méhnyak, méh, petefészkek, koriokarcinóma, gesztációs trofoblasztbetegség és férfi (hím) nemi utak, például prosztata, ondóhólyag, herék tumorai és karcinómái és csírasejtes tumorok; belső elválasztású mirigyek, például pajzsmirigy, mellékvese és agyalapi mirigy tumorai és karcinómái; bőrre jellemző kórképek, például hemangiómák, melanomák, csont- vagy lágyszövet-eredetű szarkómák és Kaposi-szarkóma; agy, idegek, szemek, valamint agyhártya daganatai, például asztrocitómák, gliomák, glioblasztómák, retinoblasztómák, neuromák, neuroblasztómák, schwannomák és meningiomák; vérképzőszervi rosszindulatú kórképekből, például leukémiákból, beleértve klorómákból, plazmacitómákból, mycosis fungoides és kután T-sejtes limfómából/leukémiából származó plakkokból és tumorokból eredő szolid tumorok; limfómák, például Hodgkin- és nem Hodgkin-limfómák; autoimmun betegségek, például reumatóid, immun- és degeneratív ízületi gyulladás megelőzése; szembetegségek, például diabéteszes retinopátia, koraszülöttkori retinopátia, beültetett szaruhártya kilökődése, lencse mögötti fibroplázia, neovaszkuláris glaukóma, rubeózis, hipoxia és makuláris degeneráció okozta retinaneovaszkularizáció; a szem abnormális neovaszkularizációjával járó esetek; bőrbetegségek, például pszoriázis; véredények betegségei, például hemangiómák és ateroszklerotikus plakkokon belüli kapillárisproliferáció; Osler-Webber-szindróma; miokardiális angiogenezis; plakkneovaszkularizáció; telangiektázia; hemofíliás ízületek; angiofibróma; sebgranuláció; endotélsejtek túlzott mértékű vagy abnormális stimulációjával járó betegségek, például bélletapadások, Crohn-féle betegség, ateroszklerózis, szkleroderma és hipertrofizáló sebhelyek (azaz keloidok), valamint olyan betegségek, amelyek kóros következménye angiogenezis, például macskakaparás-betegség (Rochele minalia quintosa) és fekélyek (Helicobacter pylori). Azok alkalmazhatók továbbá fogamzásgátló szerekként, az ovuláció és a méhlepény kialakulásának gátlására.
A találmány szerinti vegyületek alkalmasak lehetnek a fenti tumorokból származó áttétek (metasztázisok) megelőzésére önmagukban, vagy sugárkezeléssel és/vagy egyéb, például kemoterápiás kezeléssel kombinálva, amely kezeléseket szokásosan alkalmazunk angiogén betegségben szenvedő egyének esetében. Szolid tumorok kezelésére a találmány szerinti vegyületeket beadhatjuk olyan kemoterápiás hatású anyagokkal együtt, mint például alfa-interferon, COMP (ciklofoszfamid, vinkrisztin és prednizon), etopozid, mBACOD (metotrexát, bleomicin, doxorubicin, ciklofoszfamid, vinkrisztin és dexametazon), PRO-MACE/MOPP [prednizon, metotrexát (w/leukovin védelem; „leukovin rescue”), doxorubicin, ciklofoszfamid, taxol, etopozid/meklóretamin, vinkrisztin, prednizon és prokarbazin], vinkrisztin, vinblasztin, angioinhibinek, TNP-470, pentozán-poliszulfát, vérlemezke 4. faktor, angiosztatin, LM-609, SU-101, CM-101, Techgalan, talidomid, SP-PG és hasonlók, kemoterápiás hatású anyagok lehetnek alkilezőágensek, például nitrogénmustárok, mint például mekloetamin, melfan, klóram12
HU 224 827 Β1 bucii, ciklofoszfamid és ifoszfamid; nitrozo-urea-származékok, mint például karmusztin, lomusztin, szemusztin és sztreptozocin; alkil-szulfonátok, mint például buszulfán; triazinok, például dakarbazin; etieniminek, például tiotepa és hexametil-melamin; folsavanalógok, például metotrexát; pirimidinanalógok, például
5- fluoracil, citozin-arabinozid; purinanalógok, például
6- merkapto-purin és 6-tioguanin; tumorellenes antibiotikumok, például aktinomicin-D; antraciklinek, például doxorubicin, bleomicin, mitomicin-C és metramicin; hormonok és hormonantagonisták, például tamoxifen és kortikoszteroidok, valamint más különböző anyagok, például ciszplatin és brekvinar. Tumort kezelhetünk például szokásos sebészeti beavatkozással, besugárzással és/vagy kemoterápiával, valamint kringle-5 adagolásával, amelyet további kringle-5-adagolás követhet, hogy a mikroáttétek (mikrometasztázisok) nyugalmi idejét megnyújtsuk, és az esetleg visszamaradt primer tumort nyugalmi állapotban tartsuk, annak növekedését gátoljuk.
Kringle-5-peptid-fragmensekhez kapcsolhatunk citotoxikus hatóanyagokat, például ricint, így olyan eszközhöz jutunk, amellyel elpusztíthatjuk a kringle-5-peptidet megkötő sejteket. Citotoxikus hatóanyaghoz kapcsolt peptideket infundálhatunk oly módon, hogy optimalizáljuk a hatóanyag eljutását a kívánt helyre. Például ricinnel kapcsolt, nagy affinitású kringle-5-fragmenst kanül segítségével közvetlenül a célba (például primer tumorba vagy annak műtéti helyére) vagy a kívánt célhelyet ellátó véredénybe juttathatunk. Ilyen hatóanyagokat szabályozott módon is bejuttathatunk, infúziós kanülhöz csatlakoztatott ozmotikus pumpák alkalmazásával. Kringle-5-antagonisták kombinációját egyidejűleg alkalmazhatjuk angiogenezisstimulátorokkal, hogy javítsuk a szövetek vaszkularizációját. Az ilyen típusú terápiás eljárás hatékony módja lehet rákos áttétek elpusztításának.
A találmány szerinti vegyületek alkalmazhatók szervetlen vagy szerves savakból származtatott, gyógyászatilag elfogadható sók formájában. A leírásban a „gyógyászatilag elfogadott só” kifejezés alatt olyan sókat értünk, amelyek racionális orvosi megítélés szerint alkalmasak arra, hogy érintkezésbe kerüljenek emberek és alacsonyabb rendű állatok szöveteivel anélkül, hogy fölösleges toxicitást, irritációt, allergiás választ és hasonló tüneteket váltanának ki, valamint megfelelnek elfogadott előny-kockázat arány követelményeinek. Gyógyászatilag elfogadható sók szakember számára jól ismertek. Például S. M. Berge és munkatársai részletesen ismertetnek gyógyászatilag elfogadható sókat [J. Pharmaceutical Sciences 66, 1 ef seq. (1977)], amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi. A sókat előállíthatjuk in situ, a találmány szerinti vegyületek végső izolálásakor és tisztításakor, vagy külön műveletben úgy, hogy megfelelő szerves savat reagáltatunk szabad bázikus funkciós csoporttal. Savhozzáadással képzett sók, anélkül, hogy igényünket azokra korlátoznánk, lehet acetát, adipát, alginát, citrát, aszpartát, benzoát, benzénszulfonát, biszulfát, butirát, kámforát, kámforszulfonát, diglükonát, glicerofoszfát, hemiszulfát, heptanoát, hexanoát, fumarát, hidroklorid, hidrobromid, hidrojodid, 2-hidroxi-etánszulfonát (izetionát), laktát, maleát, metánszulfonát, nikotinét, 2-naftalénszulfonát, oxalát, pamoát, pektinát, perszulfát, 3-fenil-propionát, pikrát, pivalát, propionát, szukcinát, tartarát, tiocianát, foszfát, glutamát, bikarbónát, p-toluénszulfonát és undekanoát. Továbbá bázikus, nitrogéntartalmú csoportokat kvatemalizálhatjuk olyan reagensekkel, mint például alacsony szénatomszámú alkil-halidokkal, például metil-, etil, propil- és butil-klorid, -bromid és -jodid; dialkil-szulfátokkal, például dimetíl-, dietil-, dibutil- és diamil-szulfát; hosszú szénatomszámú halidokkal, például decil-, lauril-, misztril- és sztearil-kloridok, -bromidok és -jodidok; aril-alkil-halidok, például benzil- és fenetil-bromidok, és hasonlók. Ezáltal vízben vagy olajban oldható vagy diszpergálható terméket állíthatunk elő. Savhozzáadással előállított, gyógyászatilag elfogadható só készíthető olyan szervetlen savakból, mint például sósav, brómsav, kénsav és foszforsav, valamint olyan szerves savakból, mint például oxálsav, maleinsav, borostyánkősav és citromsav.
Lúghozzáadással képzett sókat előállíthatunk in situ, a kringle-5-peptid-fragmensek végső izolálásakor és tisztításakor úgy, hogy karboxilsavtartalmú csoportot reagáltatunk megfelelő bázikus csoporttal, például gyógyászatilag elfogadható fémkation hidroxidjával, karbonátjával vagy bikarbonátjával, vagy ammóniával, vagy egy szerves primer, szekunder vagy tercier aminnal. Gyógyászatilag elfogadható sók lehetnek például anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk alkálifém-kationok, vagy alkáliföldfém-kationok, például lítium, nátrium, kálium, kalcium, magnézium és alumínium által képezett sók és hasonlók, valamint nem mérgező kvaterner ammónia- és aminkationok, például ammónia, tetrametil-ammónia, tetraetil-ammónia, metil-amin, dimetil-amin, trimetil-amin, trietil-amin, dietilamin, etil-amin és hasonlók. Más, lúghozzáadással képzett, alkalmas szerves aminok például a következők: etilén-diamin, etanol-amin, dietanol-amin, piperidin, piperazin és hasonlók. Előnyösen a találmány szerinti vegyületek foszfát-, trisz- és acetátsóit alkalmazzuk.
Kringle-5-peptid-fragmenseket, kringle-5-peptid-fragmensek elleni antiszérumokat, kringle-5-receptor-agonistákat, kringle-5-receptor-antagonistákat vagy azok elegyét kombinálhatjuk gyógyászatilag elfogadható, a hatóanyagok elnyújtott adagolására alkalmas mátrix, például biológiai úton lebomló polimer alkalmazásával, hogy terápiás értékű készítményeket kapjunk. A leírásban „hatóanyagok elnyújtott adagolására alkalmas mátrix” alatt olyan anyagokból, általában polimerekből előállított mátrixot értünk, amely enzimatikus vagy savas-lúgos hidrolízis során, vagy feloldódással elbomlik. A kezelt egyén testébe helyezve a mátrixra enzimek és testnedvek hatnak. Hatóanyagok elnyújtott adagolására alkalmas mátrix anyaga előnyösen biokompatibilis anyag, például liposzóma, polilaktid (tejsavpolimer), poliglikolid (glikolsavpolimer), polilaktid-koglikolid (tejsav és glikolsav kopolimer) polianhidridek, poli(orto)észterek, polipeptidek, hialuronsav, kollagén, kondroitinszulfát, karboxilsavak, zsírsavak, foszfo13
HU 224 827 Β1 lipidek, poliszacharidok, nukleinsavak, poliaminosavak, aminosavak, például fenil-alanin, tírozin, izoleucin, polinukleotidok, poli(vinil-propilén), poli(vinil-pirrolidon) és szilikon. Biológiai úton lebomló mátrix anyaga előnyösen polilaktid, poliglikolid vagy polilaktid-koglikolid (tejsav és glikolsav kopolimer). Kringle-5-peptid-fragmenseket, kringle-5 fúziós proteineket, kringle-5-receptor-agonistákat, kringle-5-receptor-antagonistákat vagy azok elegyét kombinálhatjuk gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal vagy hordozóanyaggal, hogy terápiás értékű készítményeket kapjunk. Gyógyászatilag elfogadott hordozó- vagy vivőanyag alatt nem toxikus, szilárd, félszilárd vagy folyékony töltőanyagot, hígítóanyagot, kapszula-alkotóanyagot, vagy bármilyen, a kiszerelést segítő anyagot értünk. A készítmények beadhatók parenterálisan, szublingválisan (nyelv alá), intraciszternálisan, intravaginálisan (hüvelybe), intraperitoneálisan (hasüregbe), rektálisan (végbélbe), bukkálisan (ajakba vagy szájüreg-nyálkahártya alá), vagy alkalmazhatók helyileg (mint hintőpor, kenőcs, csepp, transzdermális tapasz vagy iontoforéziskészülékben).
A leírásban a „parenterális” kifejezés alatt olyan beadási módokat értünk, amely lehet intravénás, intramuszkuláris (izomba), intraperitoneális (hasüregbe), intraszternális (szegycsontvelőbe), szubkután (bőr alá) és intraartikuláris (ízületi üregbe történő) injekció, valamint infúzió. Parenterális injekció céljára előállított gyógyászati készítmény lehet gyógyászatilag elfogadható, steril, vizes vagy nemvizes oldat, diszperzió, szuszpenzió vagy emulzió, továbbá steril por, amelyeket közvetlenül felhasználás előtt steril, injektálható oldattá vagy diszperzióvá alakítunk. Megfelelő vizes és nemvizes hordozó-, hígító-, vivőanyagként vagy oldószerként alkalmazhatjuk például a következőket: víz, etanol, poliol (például glicerin, propilénglikol, polietilénglikol és hasonlók), karboxi-metil-cellulóz, valamint azok megfelelő elegye, növényi olajok (például olívaolaj) és injektálható szerves észterek, például etil-oleát. A megfelelő folyékony állapotot fenntarthatjuk bevonóanyag (például lecitin) alkalmazásával azáltal, hogy diszperziók esetében kívánt részecskeméretet érünk el, valamint felületaktív (felületi feszültség csökkentő) anyagot alkalmazunk. Ezek a készítmények tartalmazhatnak továbbá adjuvánsokat, például tartósító-, nedvesítő-, emulgeáló- és diszpergálóanyagot. Mikroorganizmusok hatását megakadályozhatjuk különféle antibakteriális és gombaellenes hatóanyag, például paraben, klór-butanol, fenol, szorbinsav és hasonlók alkalmazásával. Szükség lehet továbbá izotóniás anyagok, például cukrok, konyhasó és hasonlók hozzáadására. Injektálható gyógyászati készítmény elnyújtott felszívódását elérhetjük olyan anyagok hozzáadásával, mint például alumínium-monosztearát és zselatin alkalmazásával, amelyek késleltetik a felszívódást. Injektálható depóformát úgy állítunk elő, hogy előállítjuk a gyógyszer mikrokapszulázott mátrixát biodegradábilis (biológialilag lebomló) polimerben, amelyek lehetnek például polilaktid-poliglikolidok, poli(ortoészterek) és poli(anhidridek). A gyógyszer polimerhez viszonyított arányától függően, valamint az alkalmazott polimer tulajdonságai szerint a hatóanyag(ok) felszabadulása szabályozható. Injektálható depókészítmények előállíthatok továbbá úgy, hogy a gyógyszert szövetbarát liposzómákba vagy mikroemulzióba zárjuk. Injektálható készítményeket sterilizálhatunk például baktérium-visszatartó filteren keresztül történő szűréssel, vagy steril, szilárd formában előállított készítménybe sterilizálóágenst adunk, amelyet aztán steril vízben vagy más steril injektálható folyadékban oldunk vagy diszpergálunk, közvetlenül a felhasználás előtt.
Helyi (lokális) alkalmazási mód például a bőrre, nyálkahártyára, valamint a tüdő és a szem felületére történő alkalmazás. Helyi alkalmazásra szánt készítmények, beleértve az inhalációra alkalmas készítményeket, előállíthatok por alakban, amelyet kívánt esetben nyomás alá helyezhetünk. Nyomás alá nem helyezett por alakú készítményekben a finom szemcséjű aktív hatóanyagot elegyíthetjük nagyobb szemcseméretű, gyógyászatilag elfogadható inért hordozóval, amely 100 pm-ig terjedő átmérőjű részecskéket tartalmaz. Inért hordozóként előnyösen alkalmazhatunk cukrot, például laktózt. Előnyösen az aktív hatóanyag-részecskék tömeg szerinti 95%-ának részecskemérete gyakorlatilag 0,01-10 pm között van. Szemen történő lokális alkalmazás céljából a találmány szerinti vegyületeket gyógyászatilag elfogadható, szem kezelésére alkalmas vivőanyagban adagoljuk oly módon, hogy a vegyület elegendő ideig érintkezésben maradjon a szemgolyó felszínével ahhoz, hogy áthatoljon a szem szaruhártyaés belső régióin, amely lehet például elülső csarnok, hátulsó csarnok, üvegtest, csarnokvíz, üvegtestfolyadék, szaruhártya, írisz/sugártest, lencse, érhártya/retina és ínhártya. Gyógyászatilag elfogadható, szem kezelésére alkalmas vivőanyagként alkalmazhatunk például valamilyen kenőcsöt, növényi olajat vagy kapszulázóanyagot. Más megoldás szerint a találmány szerinti vegyületeket injektálhatjuk közvetlenül a csarnokvízbe vagy az üvegtestfolyadékba.
A készítményt nyomás alá helyezhetjük, és az tartalmazhat sűrített gázt, például nitrogént vagy folyékony gáz hajtóanyagot. A folyékony hajtóanyag - és gyakorlatilag az egész készítmény - előnyösen olyan, hogy abban az aktív hatóanyag lényeges mértékben nem oldódik. A nyomás alá helyezett készítmény tartalmazhat továbbá felületaktív anyagot, például folyékony vagy szilárd, nemionos felületaktív anyagot, vagy szilárd, anionos felületaktív anyagot. Előnyösen szilárd, anionos felületaktív anyag nátriumsóját alkalmazzuk.
Rektális vagy vaginális alkalmazásra szánt készítmények előnyösen kúpok, amelyeket úgy állíthatunk elő, hogy a találmány szerinti vegyületeket megfelelő, nem irritáló vivőanyaggal vagy hordozóval elegyítjük, amely lehet kakaóvaj, polietilénglikol vagy kúpviasz, és amely szobahőmérsékleten szilárd halmazállapotú, testhőmérsékleten azonban folyékonnyá válik, ennek megfelelően a végbélben vagy a hüvelyben megolvad, majd az aktív hatóanyag felszabadul.
A találmány szerinti vegyületek alkalmazhatók továbbá liposzómák formájában. Amint az a technika ál14
HU 224 827 Β1 lása szerint ismert, liposzómákat általában foszfolipidekből vagy más lipidanyagokból állíthatunk elő. A liposzómákat vizes közegben diszpergált, mono- vagy multilamelláris, hidratált folyadékkristályok alkotják. Bármely nem toxikus, fiziológiásán elfogadott és metabolizálható, liposzóma előállítására alkalmas lipid alkalmazható. A leírás szerinti, liposzóma formában előállított készítmények, a találmány szerinti vegyületeken kívül, tartalmazhatnak stabilizátor-, tartósító-, vivőanyagokat és hasonlókat. Előnyös lipidek lehetnek mind természetes, mind szintetikus foszfolipidek és foszfatidil-kolinok (lecitinek). Liposzómák előállítására alkalmazható eljárások a technika állása szerint jól ismertek. Lásd például Prescott (szerk.): Methods in Cell. Biology XIV, Academic Press, New York, N. Y. USA, 33 et seq. (1976) szakirodalmi helyet, amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi.
A fent említett vagy más kezelések során alkalmazva, a találmány szerinti bármely vegyület terápiásán hatásos adagja alkalmazható tiszta formában, vagy ha ilyen létezik, gyógyászatilag elfogadható só formájában, valamint gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal vagy anélkül. A leírásban a találmány szerinti vegyületek „terápiásán hatásos adagján” a vegyületek angiogén betegségek kezelésére elegendő mennyiségét értjük (például azok tumorok növekedésének korlátozásához vagy tumormetasztázisok keletkezésének lassításához vagy megakadályozásához elegendő mennyiségét), amely elfogadható előny-kockázat arányok mellett bármely orvosi kezelésnél alkalmazható. Nyilvánvaló azonban, hogy a vegyületek és készítmények teljes napi adagját a kezelőorvos fogja meghatározni, elfogadott orvosi megítélés szerint. Adott egyén terápiásán hatásos dózisszintje különböző tényezőktől függ, például a kezelendő rendellenességtől és annak súlyosságától; az alkalmazott vegyület aktivitásától; az alkalmazott készítménytől; a kezelt egyén korától, testtömegétől, általános állapotától, nemétől és étrendjétől; az alkalmazás idejétől; a beadás módjától; az alkalmazott vegyület kiválasztási ütemétől; a kezelés időtartamától; az adott vegyülettel kombinációban vagy egyidejűleg alkalmazott gyógyszerektől és hasonló, orvostudományban ismert tényezőktől. Például szakember számára ismert eljárás a vegyületek kezdőadagját alacsonyabban kezdeni, mint amely a kívánt terápiás hatáshoz szükséges, majd a dózist a kívánt hatás eléréséig fokozatosan emelni. Kringle-5-peptid-fragmensek vagy fúziós proteinek teljes adagja, amelyet helyileg vagy szisztémásán adunk be embernek vagy más emlősnek, egyetlen vagy elosztott dózisokban, lehet például 0,0001-200 mg/testtömeg-kilogramm naponta, általában 1-300 mg/testtömeg-kilogramm naponta. Kívánt esetben a beadandó napi hatásos adag több adagra osztható. Következésképp, egyetlen adagot tartalmazó kiszerelési forma tartalmazhatja a napi adagot vagy a napi adagot kitevő dózis törtrészét.
Nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti vegyületekkel angiogén betegségek gátlása, kezelése vagy megelőzése érdekében kombinálható szerek nem korlátozódnak a fent felsoroltakra; elvileg alkalmazhatunk bármely, angiogén betegség kezelésére vagy megelőzésére alkalmas anyagot.
A találmány tárgyát képezik továbbá izolált polinukleotidok, amelyek angiogenezist gátló aktivitással rendelkező emlős kringle-5-peptid-fragmenst vagy fúziós proteint kódolnak. Az ilyen polinukleotidokat rekombináns kringle-5-peptid-fragmensek expresszáltatására vagy génterápiás célra (amint azt lentebb ismertetjük) alkalmazhatjuk.
A találmány szerinti polinukleotid lehet mRNS vagy DNS. A találmány oltalmi körébe tartoznak DNS, cDNS, genomi DNS és szintetikus DNS alkotta polinukleotidok. A DNS lehet kettős szálú vagy egyszálú, amennyiben egyszálú, úgy lehet kódoló („szensz”)-szál vagy nemkódoló („antiszensz”) szál. A találmány szerinti polinukleotidok lehetnek módosítatlan formában, vagy tartalmazhatnak módosításokat, mint például metilezés vagy láncvégi védelem („capping”).
A polipeptideket kódoló szekvenciák lehetnek azonosak a találmány szerinti szekvenciákkal, vagy lehetnek eltérő kódolószekvenciák, amely eltérő kódolószekvenciák a genetikai kód redundáns mivolta vagy degeneráltsága miatt ugyanazt a polipeptidet kódolják, mint a találmány szerinti DNS. Ez a polinukleotid tartalmazhatja csupán a polipeptidet kódoló szekvenciát; vagy a polipeptidet kódoló szekvenciát és további kódolószekvenciákat, például vezető- vagy szekretoros szekvenciát, vagy proproteinszekvenciát; vagy az tartalmazhatja a polipeptidet kódoló szekvenciát (és adott esetben további kódolószekvenciákat) és nemkódoló szekvenciákat, például a polipeptid kódolószekvenciájától 5’- és/vagy 3’-irányban elhelyezkedő nemkódoló szekvenciákat.
A találmány tárgyát képezik továbbá polinukleotidvariánsok, amelyek olyan módosításokat, például polinukleotiddeléciót, -szubsztitúciót és -addíciót tartalmaznak; valamint minden, a variáns polinukleotidszekvencia által eredményezett polipeptidmódosulások. A találmány szerinti polinukleotidok tartalmazhatnak továbbá olyan kódolószekvenciát, amely a természetben előforduló szekvencia allélikus variánsa.
Továbbá a polipeptidet kódoló szekvenciát egyazon leolvasási keretbe fuzionálhatjuk olyan polinukleotidszekvenciával, amely elősegíti a polipeptid expresszióját és szekrécióját a gazdasejtből, például olyan vezetőszekvenciával, amely szekretoros szekvenciaként funkcionál, és szabályozza a polipeptid transzportját a sejtből. A vezetőszekvenciával megtoldott polipeptidet preproteinnek nevezzük; a vezetőszekvenciát a sejt lehasíthatja, ami a polipeptid keletkezését eredményezi. A polinukleotidok kódolhatnak továbbá proproteineket, ami azt jelenti, hogy a proteinszekvenciához további 5’-irányú aminosavak kapcsolódnak. A proszekvenciával toldott proteint proproteinnek nevezzük, amely adott esetben lehet a protein inaktív formája. A proszekvencia lehasításával megkapjuk az aktív proteint. Ennek megfelelően a találmány szerinti polinukleotidok kódolhatnak proteint, proszekvenciával toldott proteint, vagy mind preszekvenciával (vezetőszekvenciával), mind proszekvenciával toldott proteint.
HU 224 827 Β1
A találmány szerinti polinukleotidok tartalmazhatnak továbbá a kódolószekvenciához egyazon leolvasási keretbe fuzionált markerszekvenciákat, amelyek lehetővé teszik a találmány szerinti polipeptidek tisztítását. A markerszekvencia bakteriális gazdasejt alkalmazása esetén lehet pGEX-vektorból származó GST-toldalék, amely lehetővé teszi a markerhez fuzionált polipeptidek tisztítását, vagy például emlőssejt (például COS-7-sejtek) alkalmazása esetén lehet hemagglutinin (HA-) toldalék. A HA-toldalék megfelel egy, az influenza-hemagglutininproteinből származó epitópnak. Lásd például I. Wilson és munkatársai: Cell. 37, 767 (1984) szakirodalmi helyet.
A polinukleotidok bármely módon előállíthatok, például - de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - kémiai szintézissel, replikációval, reverz transzkripcióval vagy transzkripcióval, amely azon régióik) bázisszekvenciája nyújtotta információn alapul, ahonnan a polinukleotid származik; mint olyanok, azok megfelelhetnek az eredeti polinukleotid akár szensz-, akár antiszensz orientációjának. Polinukleotidok előállítására előnyösen alkalmazhatunk polimeráz-láncreakciós eljárást, amelyet a 4.683.195 és 4.683.202 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások ismertetnek, amely leírások teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik.
Akkor mondjuk, hogy egy polinukleotid hibridizálódik a találmány szerinti szekvenciával, ha a polinukleotid és az adott szekvencia közt legalább 50%, előnyösen legalább 70% azonosság mutatható ki.
A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti polinukleotidokat tartalmazó vektorok; a találmány szerinti vektorokkal genetikailag manipulált gazdasejtek; valamint eljárások, a találmány szerinti polipeptidek rekombináns módszerekkel történő előállítására. Ilyen eljárások szerint gazdasejteket tenyésztünk, kringle-5-eredetű polinukleotidok expresszálására alkalmas körülmények mellett, majd a kringle-5-eredetű polipeptideket kinyerjük a sejtkultúrából.
A találmány szerinti polinukleotidokat alkalmazhatjuk polipeptidek előállítására, rekombináns eljárásokkal. Ennek megfelelően a polinukleotidszekvenciákat beépíthetjük számos expressziós hordozó valamelyikébe, különösen polipeptidek expresszálására alkalmas vektorokba vagy plazmidokba. Ilyen vektorok lehetnek kromoszomális, nem kromoszomális és szintetikus DNS-szekvenciák, azaz SV40-származékok; bakteriális plazmidok; fág-DNS-ek; élesztőplazmidok; plazmidok és fág-DNS kombinációjából származtatott vektorok; vírus-DNS, például vakcínia, adenovírus, baromfihimlő-vírus és álveszettségvírus. Tulajdonképpen bármely más plazmid vagy vektor alkalmazható, amennyiben az replikálódni képes és életképes a gazdában. A megfelelő DNS-szekvenciát számos eljárás szerint bejuttathatjuk a vektorba. Általánosságban, DNS-szekvenciát a megfelelő restrikciós endonukleáz hasítási helyekre, a technika állása szerint jól ismert eljárásokkal inszertálunk. Ezek és más eljárások szakember számára ismeretesek. Az expressziós vektorban a DNS-szekvencia az mRNS-szintézist irányító megfelelő expressziós szabályozószekvenciával (szekvenciákkal) (promoterrel) működőképesen kapcsolt. Ilyen promoterek lehetnek, anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk, LTR- vagy SV40-promoter, E. coli lac vagy trp, lambdafág PL-promoter, valamint más olyan promoterek, amelyekről ismert, hogy prokarióta vagy eukarióta sejtekben, vagy azok vírusaiban található géneket szabályoznak. Az expressziós vektor tartalmaz továbbá riboszómakötő helyet, a transzláció megindításához, valamint transzkripciós terminátort. A vektor tartalmazhat továbbá megfelelő, az expressziót fokozó szekvenciákat. Ezen túl, az expressziós vektorok tartalmaznak olyan, fenotípusos tulajdonságot hordozó gént, amely alapján a transzformált sejtek szelektálhatok, ez eukarióta sejtkultúra esetén lehet dihidrofolát-reduktáz-gén vagy neomicinrezisztenciát kódoló gén, vagy E. coli esetében tetraciklin- vagy ampicillinrezisztencia-marker.
A fent ismertetett, megfelelő DNS-szekvenciát, valamint megfelelő promoter- vagy szabályozószekvenciát tartalmazó vektorral megfelelő gazdát transzformálhatunk, miáltal lehetővé tesszük a gazdában a protein expresszióját. Megfelelő gazda lehet baktériumsejt, például E. coli, Salmonella typhimurium; Streptomyces alfajok; gombasejtek, például élesztősejtek; rovarsejtek, például Drosophila (ecetmuslica) sejtek és Sf9-sejtek; állati sejtek, például CHO-, COS- vagy Bowes-sejtek és hasonlók. Szakember számára lehetővé válik a megfelelő gazda kiválasztása a leírás szerinti kitanítás alapján.
Közelebbről, a találmány tárgyát képezik rekombináns konstrukciók, amelyek a fent vázlatosan ismertetett szekvenciák közül egyet vagy többet tartalmaznak. A konstrukciók tartalmaznak egy vektort, például plazmidot vagy vírusvektort, amelybe egy, a találmány szerinti szekvenciát inszertáltunk, előre vagy visszafelé orientálva. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a konstrukció szabályozószekvenciákat is tartalmaz, például a találmány szerinti szekvenciához működőképesen kapcsolt promotert. Szakember számára számos megfelelő vektor és promoter ismert, és azok a kereskedelemben hozzáférhetők. Például az alábbi vektorok szerezhetők be: hozzáférhető bakteriális vektorok a pSPORTI- (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD), pQE70-, PQE60-, pQE9- (Qiagen), pBs-, phagescript-, psiX174-, pBluescript SK-, pBsKS-, pNH8a-, pNH16a-, pNH18a- (Stratagene®, La Jolla, CA, USA), pTrc99A-, ρΚΚ223-3-, pKK233-3-, pDR540-, pRIT5(Pharmacia®) vektorok; hozzáférhető eukarióta vektorok a pWLneo-, pSV2cat-, pOG44-, pXT1-, pSG- (Stratagene®), pSVK3-, pBPV-, pMSG-, pSVL- (Pharmacia®) vektorok. Bármely plazmid vagy vektor alkalmazható azonban, amennyiben az a gazdában replikálódni képes, valamint életképes.
Promoterrégiót választhatunk bármely kívánt génből, CAT- (klóramfenikol-transzferáz) vektorok vagy más szelektálható markerekkel rendelkező vektorok alkalmazásával. Két ilyen vektor például a pKK232-8- és pCM7-vektorok. Egyedi elnevezéssel ellátott bakteriális promoterek például a lacl-, lacZ-, T3-, SP6-, T7-,
HU 224 827 Β1 gpt-, lambda PR-, PL- és frp-promoterek. Eukarióta promoterként alkalmazhatunk például citomegalovírus (CMV) azonnali korai, herpes simplex vírus (HSV), timidin-kináz, SV40 korai és késői promotereket, retrovírusból származó LTR-ek promotereit, valamint egérmetallotionein-l. promotereket. Megfelelő vektor és promoter kiválasztása szakember számára nem okoz nehézséget.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezik a fenti konstrukciót tartalmazó gazdasejtek. Gazdasejtként alkalmazhatunk magasabb rendű eukarióta sejtet, például emlőssejtet; vagy alacsonyabb rendű eukarióta sejteket, például élesztősejtet; vagy azok lehetnek prokarióta sejtek, például baktériumsejtek. A konstrukciót bejuttathatjuk a gazdasejtbe például kalcium-foszfátos transzfekcióval, DEAE-dextrán közvetítette transzfekcióval vagy elektroporációval [Davis L. és munkatársai: „Basic Methods in Molecular Biology”, 2. kiadás, Appleton and Láng, Paramount Publishing, East Norwalk, CT (1994)].
A gazdasejtekbe juttatott konstrukciókat szokásos módon alkalmazhatjuk a rekombináns szekvencia által kódolt géntermék előállítására. Más megoldás szerint a találmány szerinti polipeptidek előállíthatók szintetikus úton, peptidszintetizáló berendezéssel.
Proteineket expresszáltathatunk emlőssejtekben, élesztőben, baktériumokban vagy más sejtekben, megfelelő promoterek irányítása alatt. Ilyen proteinek előállítására alkalmazhatunk továbbá sejtmentes transzlációs rendszereket, a találmány szerinti DNSkonstrukciókból származtatott RNS-molekulák alkalmazásával. Megfelelő, prokarióta és eukarióta gazdában alkalmazható klónozó- és exressziós vektorokat ismertetnek Sambrook és munkatársai [„Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor, N. Y., USA (1989); amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi].
A találmány szerinti polipeptideket kódoló DNS magasabb rendű emlőssejtekben történő transzkripcióját fokozhatjuk a vektorba inszertált enhanszer- („enhancer”, segítő, fokozó) szekvenciák segítségével. Az enhanszerek a DNS c/sz-hatású elemei, általában 10-300 bp méretűek, amelyek valamely promoterre hatva fokozzák annak transzkripciós aktivitását. Ilyen enhanszerszekvenciák például az SV40 replikációs origó késői oldalán található enhanszer (100-270 bp közötti szakasz), a citomegalovírus korai promoterenhanszer, a poliomaenhanszer, a replikációs origó késői oldalán, valamint adenovírusenhanszerek.
Általánosságban, rekombináns expressziós vektorok replikációs origót és szelektálható markereket tartalmaznak, amelyek lehetővé teszik a gazdasejtek transzformációját - ilyen szekvenciák például az E. coli ampicillinrezisztencia-gén és a S. cerevisiae TRP1-gén ezenfelül tartalmaznak egy magas szinten expresszálódó génből származó promotert, valamely 3’-irányú strukturális szekvencia transzkripciójának irányítására. Ilyen promoterek származhatnak glikolitikus enzimeket kódoló operonokból, például a felsoroltakat kódoló operonokból: 3-foszfoglicerát-kináz (PGK), alfa-faktor, savas foszfatáz vagy hősokkproteinek és mások. A heterológ strukturális szekvenciákat a transzlációs kezdőés terminációs szekvenciákkal, és előnyösen a transzlálódott polipeptid periplazmatikus térbe vagy extracelluláris közegbe történő szekrécióját irányítani képes vezetőszekvenciával úgy kapcsoljuk össze, hogy azok egyazon olvasási fázisba kerüljenek. Más megoldás szerint a heterológ szekvencia kódolhat fúziós proteint, amely kívánt tulajdonságot, például az expresszált rekombináns termék stabilizálását vagy egyszerű tisztítását elősegítő tulajdonságot hordozó N-terminális-azonosító peptidet tartalmaz.
Baktériumokban alkalmazható expressziós vektorokat úgy állítunk elő, hogy kívánt proteint kódoló strukturális DNS-szekvenciát megfelelő, transzlációs kezdőés befejezőszignálokkal együtt inszertálunk úgy, hogy azok egy funkcionális promoternek megfelelő leolvasási keretbe kerüljenek. A vektornak tartalmaznia kell egy vagy több fenotípusos szelekciós markért, továbbá replikációs origót, hogy biztosítsuk a vektor fennmaradását, valamint - kívánt esetben - annak gazdasejten belül történő amplifikációját. Transzformációra alkalmas prokarióta gazdasejtként alkalmazhatjuk például a következőket: E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium és Pseudomonas, Streptomyces és Staphylococcus nemzetségekbe tartozó különböző fajokat, bár más fajok szintén alkalmazhatók.
Baktériumokban alkalmazható vektorok szelektálható markért és a jól ismert pBR322 klónozóvektor (ATCC 37 017) genetikai elemeit tartalmazó plazmidokból származtatott bakteriális replikációs origót tartalmaznak. További vektorok - anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - például a PKK223-3(Pharmacia® Fine Chemicals, Uppsala, Svédország) és GEM1-vektorok (Promega Biotec, Madison, Wl, USA). Ezeket a pBR322 „váz”-szekvenciákat megfelelő promoterrel, valamint az expresszálandó strukturális szekvenciával kombináljuk.
Az alkalmas expressziós vektorok tartalmazhatnak továbbá fúziós partnert, a találmány szerinti kívánt polipeptid tisztításának megkönnyítésére, vagy azért, hogy oldható polipeptidet nyerjünk. Kereskedelemben hozzáférhető fúziós vektorok például - de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - a következők: pET32a- (Novagen, Madison, Wl, USA), pGEX-4T-2(Pharmacia®) és pCYB3-vektorok (New England Biolabs, Beverly, MA, USA). Előállíthatunk továbbá olyan expressziós vektorokat, amelyekben elkerüljük fúziós partner alkalmazását, különösen akkor, ha kringle-5-peptid-fragmensek vagy fúziós proteinek magas szintű expresszióját kívánjuk elérni baktériumsejtekben. Előállíthatunk például vektorokat a transzlációs kapcsolódás optimalizálására, például Pilot-Matias T. J. és munkatársai eljárása szerint [Gene 128, 219 (1993)], amely közlemény teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi. Más eljárás szerint a találmány szerinti polinukleotid együtt expresszáltatható egy másik kiegészítő plazmiddal, amely az első protein szolubilizálódását elősegítő proteint vagy peptidet kódol
HU 224 827 Β1 [lásd például Mekrides S. C.: Microbiological Reviews 60, 512 (1996)]. Például bizonyos kringle-5-peptid-fragmensek [amelyekről kimutattuk, hogy tioredoxinnal szolubilis fúziós proteinekként állíthatók elő (lásd
20. példa)], nem fúziós vektorról is expresszáltathatók, párhuzamosan (azaz ugyanabban a gazdasejtben) egy második, tioredoxint expresszáló vektor expresszáltatásával.
Alkalmas gazdatörzshöz tartozó sejtek transzformációját és a gazdatörzs sejtjeinek megfelelő sejtdenzitás eléréséig történő felszaporítását követően a kiválasztott promotert megfelelő módszerekkel (például hőmérséklet-eltolódás előidézésével vagy kémiai indukcióval) derepresszáljuk, és a sejteket meghatározott ideig tovább tenyésztjük. A sejteket - tipikusan centrifugálással - összegyűjtjük, fizikai vagy kémiai módszerekkel roncsoljuk, és az így kapott nyersextraktumot további tisztítás céljára félrerakjuk. Proteinek expresszálására alkalmazott mikrobiális sejteket bármely szokásos módszerrel roncsolhatunk, például fagyasztás-olvasztás ciklusos ismétlésével, ultrahangkezeléssel, mechanikai roncsolással vagy sejtek lizálódását eredményező szerek alkalmazásával; ilyen módszerek szakember számára jól ismertek.
Rekombináns proteinek expresszáltatására különböző emlős-sejttenyészeti rendszerek is alkalmazhatók. Emlős expressziós rendszerekként alkalmazhatjuk például a majomvesefibroblaszt-eredetű COS-7-sejtvonalat [Gluzman: Cell. 23, 175 (1981)]; vagy más, kompatibilis vektor expressziójára képes sejtvonalakat, például a C127-, 3T3-, CHO-, HeLa- és BHK-sejtvonalakat. Emlős expressziós vektorok tipikusan a következőket tartalmazzák: replikációs origót, megfelelő promotert és enhanszert, valamint a szükséges riboszómakötő helyeket, poliadenilezési helyet, „splicing” (mRNS érése) során szerepet játszó donor- és akceptorhelyeket, transzkripciós terminációs szekvenciákat, valamint 5’-végi határoló, át nem íródó szekvenciákat. A kívánt, át nem íródó genetikai elemekként alkalmazhatunk például SV40-vírusgenomból származó DNS-szekvenciákat, például ilyen SV40 replikációs origót, korai promotert, enhanszert, „splice” és poliadenilezési helyeket. Vektorokként alkalmazhatjuk például a pRc/CMV vagy pcDNA3-vektorokat (amely hozzáférhető az Invitrogen cégtől; San Diego, CA, USA).
A találmány tárgyát képezik továbbá génterápiás eljárások, amelyek szerint kringle-5-peptid-fragmenseket vagy kringle-5-peptidfragmens-konjugátumokat kódoló gén expresszálódását szabályozzuk betegben. Proteingéntermék expresszáltatása céljából DNS sejtekhez történő juttatására vagy azokhoz történő szállítására alkalmas különböző módszerek, más néven génterápiás módszerek leírását találjuk az alábbi szakirodalmi helyen: „Gene Transfer intő Mammalian Somatic Cells in vivő”, Yang N.: Crit. Rév. Biotechn. 12(4), 335 (1992)], amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi. Az úgynevezett génterápiás eljárások szerint polinukleotidszekvenciákat juttatunk szomatikussejt- vagy ivarsejt-eredetű sejtvonalakba, ex vivő vagy in vivő génterápia céljából. A génterápiával helyettesíthetünk géneket, fokozhatjuk azok normális vagy rendellenes működését; vagy felvehetjük a harcot fertőző betegségek és más kóros állapotok kialakulásával.
Gyógyászati problémák génterápiával történő megoldására irányuló stratégiák egyrészt lehetnek terápiás stratégiák, amelyek szerint például azonosítjuk a kóros gént, és funkcionális gént juttatunk be, amely pótolhatja a kóros gén működését, vagy fokozhatja valamely alacsony szinten működő gén működését; másrészt lehetnek profilaktikus (megelőző célzatú) stratégiák, amelyek szerint olyan gént juttatunk be, amely az adott állapot kezelésére szolgál; vagy amely a szövetet vagy szervet fogékonyabbá teszi az alkalmazott kezelésre. Egy ilyen profilaktikus stratégia szerint például kringle-5-peptidfragmenst vagy kringle-5-peptidfragmens-konjugátumot kódoló gént juttatunk betegbe, ezáltal megelőzzük az angiogenezist; vagy olyan gént inszertálunk, amely a tumorsejteket érzékenyebbé teszi a sugárhatással szemben úgy, hogy a tumor besugárzása a tumorsejtek fokozott pusztulását eredményezze.
A találmány szerinti megoldásban alkalmazható számos, kringle-5-peptid-fragmenst vagy kringle-5 fúziós proteint kódoló DNS bejuttatására alkalmas módszer; vagy kringle-5-peptid-fragmens (vagy a fúziós partner) szabályozószekvenciáit kódoló DNS bejuttatására alkalmas módszer. Génterápiás eljárások közé tartozónak tekintjük kringle-5-peptid-fragmenssel természetben kapcsolódó promoterszekvenciától eltérő promoterszekvenciák vagy egyéb, kringle-5-peptid-fragmens termelődését fokozó szekvenciák transzfekcióját. Ilyen technológia alkalmazásának példáját találjuk az alábbi helyen: „TranskaryoticTherapies, Inc. of Cambridge, Massachusetts, amely szerint homológ rekombinációt alkalmaznak egy eritropoetingén működésének sejtekben történő bekapcsolódását előidéző „genetikai kapcsoló” („genetic switch”) inszertálására, amint azt az alábbi szakirodalmi helyen ismertetik: Genetic Engineering News, 1994. április 15., amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi. Ilyen „génkapcsolók” alkalmazhatók kringle-5-peptid-fragmens (vagy kringle-5-receptor) aktiválására olyan sejtekben, amelyek eredetileg nem expresszálják ezeket a proteineket.
A génterápiára alkalmazható géntranszfereljárások három nagy csoportra oszthatók: (1) fizikai módszereken alapuló eljárások (például elektroporáció, közvetlen géntranszfer és részecskebombázás); (2) kémiai módszereken alapuló eljárások (például lipidbázisú hordozók vagy más nem virális vektorok alkalmazása); (3) biológiai eljárások (például víruseredetű vektorok alkalmazása). Például nem virális vektorok, például DNS-burokkal ellátott liposzómák intravénásán közvetlenül injektálhatok betegbe. A liposzóma/DNS komplexek feltehetően a májban koncentrálódnak, ahol azok a DNS-t makrofágoknak és Kupfer-sejteknek adják át. Vektorok vagy a génnek megfelelő „csupasz” DNS szintén injektálható közvetlenül a kívánt szervbe, szövetbe vagy tumorba, a terápiás DNS célzott bejuttatására.
A génterápiás eljárásokat jellemezhetjük továbbá a bejuttatás helyének megfelelően. Géneket alapvetően
HU 224 827 Β1 bejuttathatunk ex vivő, in vivő vagy in vitro géntranszferrel. Ex vivő géntranszfer esetén a sejteket a kezelt egyénből eltávolítjuk, majd azokat sejtkultúrában tenyésztjük. A DNS-t a sejtekbe transzfektáljuk, a transzfektált sejteket felszaporítjuk, majd a betegbe visszajuttatjuk. In vitro géntranszfer esetén transzformált sejtekként sejtkultúrában szaporodó sejteket alkalmazunk, például szövettenyészeti sejteket, és nem adott betegtől származó meghatározott sejteket. Ezeket a „laboratóriumi” sejteket transzfektáljuk, a transzfektált sejteket szelektáljuk, felszaporítjuk, majd betegnek történő beadásra vagy más célra alkalmazzuk. In vivő géntranszfer eljárás szerint a DNS-t beteg sejtjeibe juttatjuk úgy, hogy a sejtek a betegben maradnak. Mindhárom fenti tágabban értelmezett kategóriát alkalmazhatjuk in vivő, ex vivő vagy in vitro géntranszfer előidézésére.
Mechanikai úton történő DNS-bejuttatást végezhetünk a DNS ivarsejtekbe vagy szomatikus sejtekbe történő mikroinjektálásával; DNS-burokkal ellátott részecskéket, például a „gene gun” (génpuska) eljárásban alkalmazott aranyrészecskéket bejuttathatjuk pneumatikus úton; és alkalmazhatunk szervetlen kémiai megközelítési módokat, például kalcium-foszfát-transzfekciót. Kiderült, hogy plazmid-DNS fizikai úton történő injektálása izomsejtekbe nagy arányban eredményezi olyan sejtek keletkezését, amelyek transzfektáltak, és tartósan képesek markergének expressziójára. A plazmid-DNS beépülhet a sejt genomjába, vagy kívül maradhat azon. A transzfektált DNS genomon kívül maradása lehetővé teszi a géntermékproteinek tartós expresszióját véglegesen differenciálódott, nem proliferatív szövetekben anélkül, hogy a celluláris vagy mitokondriális genomban mutációt eredményező inszerció vagy deléció vagy más változások kockázatával kellene számolnunk. Terápiás hatású gének hosszú távú, de nem feltétlenül permanens transzferje specifikus sejtekbe alkalmas lehet genetikai betegségek kezelésére; vagy az alkalmazható megelőzésre. A DNS-t időközönként ismételten injektálhatjuk, hogy fenntartsuk a géntermék szintjét anélkül, hogy mutációk jöjjenek létre a recipiens sejtek genomjában. Exogén DNS-ek kívül maradása a genomon lehetővé teheti azt, hogy egy sejtben egyidejűleg több különböző exogén DNS-konstrukció legyen jelen, amelyek mindegyike különböző génterméket expresszál.
DNS sejtekbe, szövetekbe vagy szervekbe történő injektálására alkalmazhatunk továbbá részecske közvetítette géntranszfert. Részecskebombázó készülékkel vagy „génpuskával” hajtóerőt hozunk létre, amely a DNS-burokkal ellátott nagy denzitású részecskéket (például arany- vagy volfrámrészecskéket) nagy sebességre felgyorsítja, lehetővé téve azok bejutását a célszervekbe vagy szövetekbe vagy sejtekbe. Géntranszfer-előidézésre irányuló elektroporációs eljárás elektromos áram alkalmazásán alapul, amellyel sejteket vagy szöveteket érzékennyé tehetünk elektroporáció közvetítette géntranszferre. Meghatározott feszültségű rövid elektromos impulzust alkalmazunk a membránpermeabilitás fokozására úgy, hogy DNS-molekulák képesek legyenek bejutni a sejtekbe. A részecske közvetítette géntranszfer és elektroporációs eljárások szakember számára jól ismertek.
Génterápiára alkalmazott kémiai eljárás például a fuziogén lipidvezikulumok, például liposzómák vagy más membránfúzió létrehozására képes vezikulumok alkalmazásán alapuló hordozó közvetítette géntranszfer. A kérdéses DNS-t szállító hordozót egyszerűen bejuttathatjuk testfolyadékokba vagy a vérkeringésbe, majd a testben azokat specifikus módon a célszervhez vagy célszövethez irányíthatjuk. Kifejleszthetők például sejt- vagy szervspecifikus DNS-hordozó liposzómák úgy, hogy a liposzómák által hordozott idegen DNS-t az említett specifikus sejtek felvegyék. Meghatározott sejteken található specifikus receptorokat célzó immunliposzómák injektálása egyszerűen kivitelezhető eljárás a DNS-nek az adott receptort hordozó sejtekbe történő bejuttatására. További hordozórendszer az aszialoglikoprotein/polilizin konjugátumrendszer, amelyet DNS májsejtekhez történő eljuttatására alkalmaztak, in vivő géntranszfer céljából.
A transzfektált DNS-t más típusú hordozókkal alkotott komplexként is alkalmazhatjuk úgy, hogy a DNS eljusson a recipiens sejtekhez, majd elraktározódjon a citoplazmában vagy a nukleoplazmában. DNS-t kapcsolhatunk hordozó nukleáris proteinekhez, specifikusan manipulált vezikulumkomplexekben, és azokat közvetlenül a sejtmagba juttathatjuk.
Hordozó közvetítette géntranszfert végezhetünk lipidalapú vegyületekkel, amelyek nem liposzómák. Például a lipofektinek és a citofektinek lipidalapú pozitív ionok, amelyek kötődnek a negatív töltésű DNS-hez, és olyan komplexet képeznek, amely képes átjuttatni a DNS-t a sejtmembránon. Hordozó közvetítette géntranszfer másik módja lehet receptoron alapuló endocitózis. Ennél az eljárásnál sejtfelszíni receptorra specifikus ligandumból, valamint a kívánt génből komplexet képezünk, majd azt a véráramba injektáljuk. A sejtfelszíni receptorral rendelkező célsejtek specifikusan megkötik a ligandumot, majd a ligandum-DNS komplexet a sejtbe juttatják.
Biológiai génterápiás eljárások során vírusvektorokat vagy nem víruseredetű vektorokat (például a fent ismertetett ligandum-DNS konjugátum, liposzómák és lipid-DNS komplexek) alkalmazunk gének sejtekbe történő inszertálására. A transzfektált sejtek származhatnak a kezelendő egyén normálszövetéből, beteg szövetéből, vagy azok lehetnek nem az egyénből származó sejtek.
Célszerű lehet, hogy kringle-5-peptid-fragmenst kódoló DNS-szekvenciát vagy kringle-5 fúziós proteint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó rekombináns DNS-molekulát valamely expressziós irányítószekvenciához működőképesen kapcsoljuk, miáltal olyan expressziós vektort kapunk, amely képes kringle-5-peptid-fragmens vagy fúziós protein expresszálására. Másik lehetőségként kringle-5-peptid-fragmensek vagy kringle-5 fúziós proteinek génregulációja megoldható olyan vegyületek alkalmazásával, amelyek kötődnek a kringle-5-génhez, a fúziós partner génhez, vagy a kringle-5-génnel vagy a fúziós partner génnel asszo19
HU 224 827 Β1 ciált szabályozórégióhoz, vagy azok megfelelő RNStranszkriptumához (bármelyikéhez), hogy módosuljon a transzkripció vagy transzláció üteme.
Génterápiás eljárásokra alkalmazott vírusok, anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk, lehetnek retrovírusok, más RNS-vírusok, mint például poliovírus vagy Sindbis vírus, adenovírusok, adenoasszocíált vírusok, herpeszvírusok, SV40-, vakcíniavírusok és más DNS-vírusok. önálló replikációra képtelen egéreredetű retrovírusvektorok a legszélesebb körben alkalmazott géntranszfervektorok.
Az egér-leukémiaretrovírusok egyszálú RNS-t tartalmaznak, amely nukleoproteinekkel („core proteinekkel) és polimeráz (po!) enzimekkel alkot komplexet, ezek belső proteinburokba (gag) vannak zárva, és az egészet a gazdaspektrumot meghatározó külső glikoprotein burok (env) veszi körül. A retrovírusok genomi struktúrája a következőket tartalmazza: gag-, pol- és env-géneket, amelyeket az 5’- és 3’-végi hosszú terminális ismétlődő egységek („long terminál repeats”; LTR) fognak közre. A retrovírusvektor-rendszerek alkalmazásával azt a tényt használjuk ki, hogy csupán az 5’- és 3’-végi LTR-szekvenciákat és a becsomagolószignált („packaging signal”) tartalmazó minimális vektor elegendő a vektor becsomagolódásához, a célsejtek fertőzéséhez és az azokba történő beépüléshez, azzal a feltétellel, hogy a becsomagoló sejtvonalban in trans (egy másik nukleotidszekvenciáról) biztosítjuk a vírus strukturális proteinjeinek jelenlétét. Retrovírusvektorok alkalmazása géntranszferre a következő lényeges előnyökkel jár: a legtöbb sejtvonalban hatékonyan idéznek elő fertőzést és génexpressziót; a vektorok a célsejtek kromoszóma-DNS-ébe pontosan, egyetlen kópiában épülnek be; és a retrovírusgenomot könnyű kezelni. Például módosított retrovírusvektorokat alkalmaztak ex vivő eljárásokban arra a célra, hogy géneket juttassanak perifériás és tumorinfiltráló limfocitákba, májsejtekbe, epidermális sejtekbe, izomsejtekbe vagy más szomatikus sejtekbe (amelyeket ezután a betegbe juttathatunk, hogy abban az inszertált DNS alapján keletkező géntermék jelenlétét biztosítsuk).
Az adenovírusok lineáris, kettős szálú DNS-t tartalmaznak, amely belső proteinekkel („core”) alkot komplexet, és kapszidproteinek vesznek körül. A molekuláris virológia területén elért eredmények vezettek el oda, hogy ki tudjuk használni a fenti organizmusok biológiai sajátságait olyan vektorok előállítására, amelyek alkalmazásával in vivő, új genetikai szekvenciákat juttathatunk célsejtekbe. Adenovírusalapú vektorok géntermékpeptidek magas szintű expressziójára képesek. Adenovírusvektorok nagy hatékonysággal fertőznek sejteket, még alacsony vírustiterek alkalmazása mellett is. Ezenfelül a vírus sejtmentes virionként is megtartja teljes fertőzőképességét, tehát nincs szükség termelősejtvonal injektálására. Adenovírusvektorok alkalmazásának további előnye, hogy azokkal heterológ gének tartós expressziója érhető el, in vivő.
Vírusvektorokat alkalmaztak továbbá gének sejtekbe történő inszertálására, in vivő eljárások szerint. Idegen gének szövetspecifikus expresszáltatására c/'szhatású szabályozóelemeket vagy szövetspecifikus promotereket alkalmazhatunk. Más eljárás szerint a fenti célt elérhetjük úgy, hogy a DNS-t vagy vírusvektort in situ, meghatározott anatómiai helyekre juttatjuk, in vivő. Például vérerekbe történő in vivő géntranszfert úgy valósítottak meg, hogy in vitro transzdukált endotélsejteket ültettek be artériafalak meghatározott helyeire. A vírussal fertőzött környező sejteket ugyancsak expresszálták a génterméket. Vírusvektorokat eljuttathatunk közvetlenül az in vivő helyre (például katéterrel), biztosítva ezáltal, hogy a vírus csak bizonyos területeken idézzen elő fertőzést, és azt, hogy tartós, helyspecifikus génexpresszió jöjjön létre. Ugyancsak retrovírusvektorok alkalmazásán alapuló in vivő géntranszfert idéztek elő emlősszövetekben és májszövetben oly módon, hogy a módosított vírusokat a szervekhez vezető véredényekbe injektálták.
Továbbá előállíthatunk kringle-5-peptid-fragmenseket, és azokat különböző célokra alkalmazhatjuk. Például kringle-5-peptid különböző fragmenseit alkalmazhatjuk a következőkként: (1) kringle-5-kötő helyeken aktív agonistákként vagy antagonistákként; (2) antigénekként, specifikus antiszérum termelődésének kiváltására; (3) peptidekként, diagnosztikus reagenskészletben történő alkalmazásra; vagy (4) citotoxikus hatóanyagokhoz kapcsolt vagy azokkal kombinációban alkalmazott peptidekként, kringle-5-peptid-fragmenseket megkötő sejtek célzott elpusztítására. A fenti peptidfragmenseket tartalmazó aminosavszekvenciák kiválasztásánál figyelembe veendő szempontok, hogy azok a molekula olyan, külső felszíni régióiban legyenek, amelyek antiszérumhoz történő kötődés számára hozzáférhetők; vagy az, hogy a peptidfragmens-angiogenezis következtében kialakuló folyamatokat vagy angiogenezis által súlyosbított folyamatokat gátló képességgel bírjon. Ezenfelül a fenti peptidszekvenciákat ismert szekvenciákkal hasonlíthatjuk össze, proteinszekvencia-adatbázis alkalmazásával, például a „GenBank”, „Brookhaven Protein”, „SWISS-PROT” vagy „PÍR” ilyen adatbázisának alkalmazásával, hogy potenciális szekvenciahomológiákat találjunk. Az így kapott információ segítségünkre van abban, hogy kiküszöböljük az egyéb molekulákkal nagyfokú szekvenciahomológiát mutató szekvenciákat, és növeli nagyfokú specifitású antiszérumok, agonisták és antagonisták kifejlesztésének esélyét.
Kringle-5-peptid-fragmensek vagy fúziós proteinek alkalmazhatók továbbá kringle-5-receptor izolálására oly módon, hogy a kringle-5-peptid-fragmenst vagy fúziós proteint szilárd hordozón, például affinitásos oszlopon immobilizáljuk, majd azon tenyésztett endotélsejtek extraktumát vagy membránextratumot engedünk át. Amint az a technika állása szerint ismert, kringle-5-receptor izolálását és tisztítását követően aminosavszekvenálást végezhetünk, majd ennek alapján a kringle-5-receptort kódoló izolált polinukleotidokat azonosíthatjuk. Ezután az ilyen polinukleotidokat megfelelő expressziós vektorba klónozhatjuk, és tumorsejtekbe transzfektálhatjuk. A receptor expressziója a transzfektált tumorsejtekben fokozza az említett sejtek érzé20
HU 224 827 Β1 kenységét endogén vagy exogén kringle-5-peptid-fragmensekkel szemben, miáltal csökken a metasztázisok növekedésének sebessége. Továbbá a fenti receptor rekombináns expressziója lehetővé teszi, hogy azt nagyobb mennyiségben állítsuk elő, például azt, hogy azokat nagy teljesítményű szűrővizsgálatokban történő alkalmazásra elegendő mennyiségben állítsuk elő, miáltal kringle-5 hatását utánzó kisebb antagonistákat azonosíthatunk.
A fenti szintetizált peptidekben az aminosavak szisztematikus helyettesítésével a kringle-5-receptor nagy affinitású peptidagonistáit és -antagonistáit azonosíthatjuk, amelyek fokozzák vagy megakadályozzák a kringle-5-peptid-fragmens kötődését annak receptorával. Ilyen antagonistákat alkalmazhatunk mikroáttétek növekedésének gátlására, ezáltal pedig a tumor terjedésének korlátozására. Nem megfelelő vaszkularizáció esetén kringle-5-peptid-fragmensek antagonistái alkalmazhatók kringle-5-peptid-fragmensek gátlóhatásának blokkolására és az angiogenezis elősegítésére. Ilyen típusú kezelés például terápiás hatású lehet sebgyógyulás elősegítésére cukorbetegekben.
A találmány szerinti kringle-5-peptid-fragmensek vagy fúziós proteinek, vagy konjugátumok alkalmazhatók továbbá antigénekként, a kringle-5-inhibitorra specifikus poliklonális vagy monoklonális ellenanyagok előállítására. Ilyen ellenanyagok egyrészt alkalmazhatók diagnosztikus eljárásokban és reagenskészletekben, kringle-5-peptid-fragmensek kimutatására vagy azok kvantitatív meghatározására testfolyadékokban vagy szövetekben. A fenti tesztek eredményei felhasználhatók kringle-5-peptid-fragmensek prognosztikai jelentőségének kimutatására vagy meghatározására.
Kringle-5-peptid-fragmensek vagy kringle-5 fúziós proteinek jelölhetők radioaktív izotópokkal (lásd 13. példa), vagy kémiai úton proteinekhez kapcsolhatók, miáltal konjugátumokat kapunk. Konjugátumok tartalmazhatnak enzimeket, hordozóproteineket, citotoxikus hatóanyagokat; fluoreszcens, kemilumineszcens vagy biolumineszcens molekulákat; amelyek megkönnyítik a kringle-5-peptid-fragmenst tartalmazó vegyületek azon tulajdonságának tesztelését, hogy azok mennyiben képesek kringle-5-antiszérumhoz kötődni; megkönnyítik kringle-5-peptidfragmens-receptort hordozó sejttípusok kimutatását; vagy elősegítik kringle-5-peptid-fragmensek tisztítását. Az összekapcsolódást előidéző eljárás megválasztását a kringle-5-peptidfragmensszekvencia aminosavain rendelkezésre álló funkcionális csoportok határozzák meg; ilyen csoportok például de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - alkil-, amino-, szulfhidril-, karboxil-, amid-, fenol-, indolil- és imidazolcsoportok. összekapcsolásra különböző reagenseket alkalmazhatunk - többek között-, glutáraldehidet, diazotized-benzidint, karbodiimideket vagy p-benzokinolint. Az összekapcsoló reakció hatékonyságát az adott reakciónak megfelelően, különböző módszerekkel határozhatjuk meg. Például kringle-5-peptidet vagy annak biológiailag aktív fragmensét radioaktív módon jelölhetjük l125-izotóppal, kloramin-T és magas specifikus aktivitású Nal125 alkalmazásával. A reakciót nátrium-metabiszulfit hozzáadásával állítjuk le, majd az elegyből a sókat egyszer használatos oszlop alkalmazásával eltávolítjuk. A jelölt peptidet az oszlopról eluáljuk, és a frakciókat összegyűjtjük. Mindegyik frakcióból mintát veszünk, és azok radioaktivitását gamma-számlálóban meghatározzuk. A fenti eljárással radioaktívan jelölt, nem reagált Nal125-tól mentes kringle-5-peptid-fragmenst kapunk. Más eljárás szerint kringle-4-fragmenshez kapcsolt kringle-5-peptid-fragmenst tartalmazó vért vagy szövetextraktumot polilizinaffinitásos oszlopon tisztíthatunk, amely esetben a kringle-4-kringle-5 peptidfragmens kötődését a töltethez a kringle-4-peptid-fragmens lizin iránt mutatott affinitása biztosítja. A kötődött protein elúciójával tisztított kringle-4-kringle-5 peptidfragmenst kapunk.
Peptidkonjugációt alkalmazhatunk továbbá poliklonális antiszérumok előállításakor. Kringle-5-peptidfragmenssel, kringle-5-peptidfragmens-analógokkal vagy kringle-5-receptorral szemben irányuló antiszérumot szakember számára jól ismert, elfogadott eljárások szerint állíthatunk elő. Például lizin aminosavakat tartalmazó kringle-5-peptid-fragmenseket tisztított szarvasmarha-szérumalbuminhoz („bovine serum albumin”; BSA) kapcsolhatunk, glutáraldehid alkalmazásával. A fenti reakció hatékonyságát radioaktívan jelölt peptid beépülése alapján határozhatjuk meg. A nem reagált glutáraldehidet és peptidet dialízissel távolítjuk el, és a konjugátumot nyulakban, birkákban, kecskékben vagy más állatokban poliklonális antiszérum termelődésének kiváltására alkalmazhatjuk. Hordozómolekulával, például BSA-val konjugált kringle-5-peptidfragmensek adjuváns eleggyel kombinálhatok, emulgeálhatók, és megfelelő gazdának több helyen, például a háton, nyakon, combokon - és esetenként - a talpakon, szubkután (bőr alá) injektálhatok. Általánosságban, szabályos időközönként, például 2-4 hetenként emlékeztető oltásokat adunk. Az egyes injekciókat követően mintegy 7-10 nappal vénapunkcióval vérmintákat veszünk, például értágulat előidézését követően, a marginális fülvénából. A vérmintákat egy éjszakán át, 4 °C-on hagyjuk megalvadni, majd azokat mintegy 2400 g-n, 4 °C-on, mintegy 30 percig centrifugáljuk. A szérumot eltávolítjuk, szétmérjük, és közvetlen felhasználás esetén 4 °C-on, későbbi analízis céljára -20 és -90 °C között tároljuk.
Az előállított poliklonális antiszérum mintáit, vagy monoklonális antiszérum előállítása esetén a tenyésztő tápfolyadék mintáit ellenanyagtiterre nézve analizáljuk; és különösen magas titerű antiszérum kimutatására nézve vizsgáljuk. Ezután a kringle-5-peptid-fragmenssel szemben irányuló legmagasabb titerű antiszérumokat a következőkre nézve teszteljük: a) meghatározzuk azt az optimális antiszérumhígítást, amelynek alkalmazásával a legnagyobb mértékű specifikus antigénkötés mellett a legalacsonyabb fokú nemspecifikus kötődés érhető el; b) standard leszorítás! görbe („displacement curve”) felvételével, növekvő mennyiségű kringle-5peptid-fragmens alkalmazása mellett, meghatározzuk az ellenanyagok kötőképességét; c) meghatározzuk,
HU 224 827 Β1 hogy azok keresztreaktivitást mutatnak-e hasonló peptidekkel és proteinekkel, ezen belül plazminogénnel és rokon fajokból származó kringle-5-peptid-fragmensekkel; d) teszteljük az ellenanyagok azon tulajdonságát, hogy alkalmazásukkal kimutathatók-e kringle-5-peptid-fragmensek sejttenyészet-felülúszójában, plazmaextraktumokban, vizeletben és szövetekben. A litereket a technika állása szerint ismert különböző módszerekkel határozhatjuk meg, például „dot-blot- vagy denzitásanalízissel; vagy radioaktívan jelölt peptid-ellenanyag komplexek precipitációjával, amely szerint a komplexeket például protein-A, másodlagos antiszérum, hideg etanol vagy aktív szén-dextrán alkalmazásával precipitáljuk, majd az aktivitást gamma-számlálóval meghatározzuk. Kívánt esetben a legmagasabb titerű antiszérumot affinitásos oszlopon tisztíthatjuk. Például kringle-5-peptid-fragmenseket kapcsolhatunk kereskedelemben hozzáférhető töltethez, és azt alkalmazhatjuk affinitásos kromatográfiás oszlop előállítására. Ezután antiszérummintákat engedhetünk át az oszlopon, miáltal a kringle-5-ellenanyagok (a kringle-5-peptid-fragmenseken keresztül) az oszlophoz kötődnek. Ezeket a kötődött ellenanyagokat ezután eluáljuk, összegyűjtjük, és azokat titerre és specifitásra nézve analizáljuk.
Az említetteken felül a találmány tárgyát képezik kringle-5-peptid-fragmensek és kringle-5-receptorok meghatározására alkalmas reagenskészletek. A legmagasabb titerű, specifitású és plazmaextraktumokban, vizeletben, szövetekben és sejttenyészet felülúszójában kringle-5-peptid-fragmensek kimutatására képes antiszérumokat alkalmazhatjuk kringle-5-peptid-fragmensek gyors, megbízható, szenzitív (érzékeny) és specifikus meghatározására és lokalizálására alkalmas reagenskészletek kifejlesztésére. Ilyen reagenskészletek például - de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - alapulhatnak a következő módszereken; kompetitív vagy nem kompetitív vizsgálati eljárásokon; radioimmun vizsgálati eljárásokon; biolumineszcens és kemilumineszcens vizsgálati eljárásokon; fluorometriás vizsgálati eljárásokon; szendvics típusú vizsgálati eljárásokon; immunoradiometriás vizsgálati eljárásokon; „dot-blot” vizsgálati eljárásokon; enzimmel jelölt reagens kötődésén alapuló vizsgálati eljárásokon, például ELISA-eljáráson; mikrotitrálólemezek alkalmazásán; immunocitokémiai eljárásokon; és vizelet vagy vér gyors vizsgálatára alkalmas, ellenanyaggal fedett csíkok vagy bemártható pálcák („dipsticks”) alkalmazásán. Mindegyik reagenskészlet esetében szakember számára jól ismert módszerekkel meghatározzuk a vizsgálat alkalmazhatóságának tartományát, annak szenzitivitását, pontosságát, megbízhatóságát, specifitását és az eredmények reprodukálhatóságát.
Egy, a kutatásban és klinikai gyakorlatban általánosan alkalmazott reagenskészlet például a radioimmun vizsgálati eljáráson (RIA) alapuló reagenskészlet. Kringle-5-peptid-fragmensek kimutatására alkalmas RIA-t kifejleszthetünk a következő módon: kringle-5-peptid-fragmensek radioaktív jóddal történő sikeres jelölését és tisztítását követően viszonylag állandó mennyiségű radioaktivitást, például 10 000 cpm-et tartalmazó csövekhez a legmagasabb titerű antikringle-5-peptid-fragmens ellenanyagokat tartalmazó antiszérumot adunk, különböző hígításokban, megfelelő pufferrendszerben. (Más csövekhez puffért vagy preimmunszérumot adunk a nemspecifikus kötődés meghatározására.) Négy (4) °C-on, 24 óráig tartó inkubálást követően valamennyi csőhöz protein-A-t adunk, a csövek tartalmát vortexkészülékkel megkeverjük, 90 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk, és mintegy 2000-2500 g mellett 4 °C-on centrifugáljuk, hogy a jelölt antigénhez kötődött ellenanyag alkotta komplexeket precipitáljuk. A felülúszókat leszívással eltávolítjuk, és az üledék radioaktivitását gamma-számlálóban meghatározzuk. Azt az antiszérumhígítást választjuk további vizsgálatok céljára, amely a fenti teszt szerint, a nemspecifikus kötődés levonását követően, a jelölt peptid mintegy 10-40%-át kötötte meg.
Ezután az antiszérum előállítására alkalmazott kringle-5-peptid-fragmens hígltási sorát (mintegy 0,1 pg-10 ng peptidfragmenst tartalmazó sort) vizsgáljuk úgy, hogy radioaktívan jelölt peptidet és antiszérumot tartalmazó csövekhez ismert mennyiségű peptidet adunk. Megfelelő inkubációs időt (például 24-48 órát) követően a csövekhez protein-A-t adunk, a csöveket centrifugáljuk, a felülúszókat eltávolítjuk, majd az üledékben maradt radioaktivitást meghatározzuk. A radioaktívan jelölt kringle-5-peptid-fragmens kötődésből történő leszorítását a jelöletlen kringle-5-peptid-fragmens (standard) által görbén ábrázolva standardgörbét kapunk. Továbbá a tesztcsövekhez más kringle-5-peptid-fragmensek, plazminogén, más fajokból származó kringle-5-peptid-fragmensek vagy homológ peptidek különböző koncentrációjú hígításait adhatjuk, hogy a kringle-5-peptid-fragmenssel szemben irányuló antiszérum specifitását jellemezzük.
Ezután extraktumokat készítünk különböző szövetekből, például - de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - elsődleges és másodlagos tumorokból, Lewis-féle tüdőkarcinómából, kringle-5-peptidfragmenst termelő sejtek tenyészeteiből, méhlepényből, méhből és más szövetekből, például agyból, májból és bélből, kringle-5-peptid-fragmensek extrahálására sikeresen alkalmazott extrakciós módszerek szerint. A szövetextraktumok előállítását követően azokhoz tesztpuffert adunk, és különböző mennyiségű mintákat RIA-csövekbe mérünk. Ismert, kringle-5-peptid-fragmenst termelő sejtek extraktumai a standardgörbével párhuzamos leszorítás! görbét eredményeznek, míg kringle-5-peptid-fragmenst nem termelő szövetek extraktumai nem eredményezik a radioaktívan jelölt kringle-5-peptid-fragmensek leszorítását a kringle-5-peptidfragmenssel szemben irányuló antiszérumról. Ilyen leszorítás! görbék szerint a kringle-5-peptid-fragmens vizsgálati eljárás alkalmazható kringle-5-peptid-fragmensek meghatározására szövetekben és testfolyadékokban.
Kringle-5-peptid-fragmenseket tartalmazó szövetextraktumok jellemezhetők továbbá oly módon, hogy annak mintáit reverz fázisú HPLC-eljárásnak vetjük
HU 224 827 Β1 alá. Eluált frakciókat gyűjtünk, azokat „SpeedVac” készülékben szárítjuk, RIA-pufferben felvesszük, majd kringle-5-RIA-eljárással analizáljuk. Ebben az esetben legnagyobb mennyiségű kringle-5-peptid-fragmens immunreaktivitás a kringle-5-peptid-fragmens elúciójának megfelelő frakciókban található.
A fent ismertetett vizsgálati reagenskészlet a következőket tartalmazza: az eljárás kivitelezését leíró utasításokat, antiszérumot, kringle-5-peptid-fragmens és esetleg radioaktívan jelölt kringle-5-peptid-fragmenst és/vagy reagenseket a kötődött kringle-5-peptid-fragmens/kringle-5-ellenanyag komplexek precipitálására. Ilyen reagenskészletek alkalmazhatók kringle-5-peptid-fragmensek mennyiségének meghatározására tumort hordozó vagy azt nem hordozó állatok és emberek biológiai nedveiben és szövetextraktumaiban.
További reagenskészletek alkalmasak lehetnek kringle-5-peptid-fragmensek vizuális kimutatására vagy lokalizálására szövetekben és sejtekben. Például ilyen eljárásokon alapuló immunhisztokémiai módszerek és reagenskészletek szakember számára jól ismertek. Amint az a technika állása szerint ismert, immunhisztokémiai reagenskészleteknek tartalmazniuk kell kringle-5-peptid-fragmenssel szemben irányuló antiszérumot, és - adott esetben - blokkoló antiszérumot, valamint fluoreszcens molekulához, például fluoreszcein-izotiocianáthoz vagy más, az elsődleges antiszérum kimutatására alkalmas reagenshez kötött másodlagos antiszérumot. A fenti eljárások szerint tumorbiopsziás mintákat vizsgálhatunk kringle-5-peptid-fragmens termelődésének helyére vagy kringle-5-peptid-fragmens receptorhelyére nézve. Ezenfelül a reagenskészlet tartalmazhat radioaktívan jelölt nukleinsavakat, kringle-5-peptid-fragmenst kódoló hírvivő RNS-sel történő in situ hibridizációra alkalmas próbaként.
A találmány szerinti vegyületek előállíthatok szakember számára jól ismert eljárásokkal [lásd például Sottrup-Jensen és munkatársai: Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis”, 3. kötet, szerk.: Davidson J. F., Rowan R. M., Samama Μ. M, és Desnoyers P. C., Raven Press, New York (1878)]. Kringle-5-peptid-fragmenseket előállíthatunk például a natív protein (g/u-plazminogén) enzimatikus hasításával; vagy annak valamely variánsa (például a teljes hosszúságú protein csonkított formáinak, amelyek enzimatikusan hasíthatok, és a fenti meghatározás szerint legalább egy kringle-5-szekvenciát tartalmaznak, például lys-plazminogén vagy miniplazminogén) enzimatikus hasításával. Ehhez először humán plazmából izolálnunk kell a proteint, plazmininhibitoroktól mentes formában, és elő kell segítenünk a g/u-plazminogén átalakulását /ys-plazminogénné [lásd Novokhatny V. és Kudinov S. A.: J. Mól. Bioi. 179, 215 (984)]. Ezt követően a csonkított molekulát proteolitikus enzimmel kezeljük, amelyet megfelelő koncentrációban alkalmazunk ahhoz, hogy kringle-5-peptid-fragmenseket hasítson le a polipeptidről, majd azokat szakember számára ismert eljárásokkal a többi fragmenstől megtisztítjuk. Proteolitikus enzimként előnyösen alkalmazhatunk humán vagy sertéselasztázt, amely hasítja a plazminogént, és annak csonkított formáit a 3-4. és 4-5. kringle-régiók közt hasítja (miáltal az kringle-1-3, kringle-1-4 vagy csak kringle-4- és kringle-5-peptid-fragmensek keletkezését eredményezi). Például /ys-plazminogént vagy g/u-plazminogént sertés vagy humán neutrofil elasztázzal kezelhetünk, mintegy 1:100-1:300 /ys-plazminogén:elasztáz arány alkalmazása mellett (előnyösen 1:150-1:250, és legelőnyösebben 1:150 /ys-plazminogén:elasztáz arány alkalmazása mellett), pufferoldatban (például Trisz-HCI, NaCI, nátrium-foszfát vagy hasonló összetevőket tartalmazó oldatban). Más eljárás szerint az elasztázt először immobilizáljuk (például valamilyen tölteten), a hasítási termék tisztítását megkönnyítendő. A /ys-plazminogén vagy g/u-plazminogén humán vagy sertéselasztázzal történő kezelését általában mintegy 10-40 °C közti hőmérsékleten végezzük, 4-től mintegy 24 óráig terjedő ideig, a hasítás elérni kívánt mértékétől függően. Ahhoz, hogy /ys-plazminogént, g/u-plazminogént vagy miniplazminogént humán vagy sertéselasztázzal teljesen emésszük, a fenti polipeptideket legalább mintegy 12 órán át kell szobahőmérsékleten érintkeztetnünk az enzimmel. A pH és az enzimmel történő inkubáció idejének változtatásával az érzékeny hasítási helyek egyikén vagy több ilyen helyen kisebb mértékű vagy részleges hasítás következik be. Ezután a hasítási termékeket a technika állása szerint ismert bármely eljárás szerint (például oszlopkromatográfiával) tisztíthatjuk. Előnyösen alkalmazható tisztítási eljárás menetét - amely szerint a hasítási termékeket lizin-Sepharose oszlopra visszük fel - a 14. példában ismertetjük.
Kríngle-5-peptid-fragmensek szilárd fázisú szintézise
A találmány szerinti vegyületek előállítását az alábbi példákkal szemléltetjük.
1. példa
N-Ac- Val-Leu-Leu-Pro-Asp- Val-Glu- Thr-Pro-SerGlu-Glu-Asp-NH2-peptid előállítása
Amidpeptidszintézis-oszlopot (Applied Biosystems) helyeztünk egy Perkin-Elmer Applied Biosynthesis „Synergy” típusú peptidszintetizáló berendezés peptidszintézisoszlop-tartó helyére, majd szintézist végeztünk az alábbi sorrend szerint:
1. A gyantát 5 percen át DMF-oldószerrel mostuk;
2. Az Fmoc-csoportot eltávolítottuk a gyantához kötött aminosav α-Ν-terminusáról úgy, hogy azt 15 percen át, 20%-os, DMF-oldószerben oldott piperidinnek érintkeztettük;
3. A gyantát 5 percen át DMF-fel mostuk;
4. Az 1. számú aminosav α-C-terminusát [FmocAsp (β-0'Bu); 25 pmol], DMSO-NMP (N-metil-pirrolidon) oldószerben oldott 0,2 mol/l HBTU (25 pmol), HOBT (25 pmol) és DMSO-NMP oldószerben oldott 0,4 mol/l diizopropil-etil-amin (25 pmol) oldatával aktiváltuk, majd az aktivált aminosavat a gyantához kötöttük;
5. Az aktivált, Fmoc-védőcsoporttal ellátott aminosavat (amelyet az 5. lépésben állítottunk elő) hozzá23
HU 224 827 Β1
kapcsoltuk a gyantához kötött aminosavhoz (amelyet a 2. példa
2. lépésben állítottunk elő), DMF-oldószerben, mintegy Az N-Ac-Met-Phe-Gly-Asn-Gly-Lys-
30 percen át; Gly-Tyr-Arg-Gly-Lys-Arg-Ala-Thr-Thr-Val-Thr-
6. Mosást végeztünk DMF-oldószerre, 5 percen át; Gly-Thr-Pro-NH2-peptid előállítása
7. A 3-6. lépéseket megismételtük, az alábbi ami- 5 A cím szerinti vegyületet az 1. példában leírt szinté-
nosavak alkalmazásával: zissorrend szerint állítottuk elő, első aminosavként
Sorszám Aminosav Fmoc-Pro-csoportot alkalmazva. Az alábbi aminosava-
2. Fmoc-Glu (y-O‘Bu) kat alkalmaztuk, a már említett körülmények mellett:
3. Fmoc-Glu (γ-O’Bu) Sorszám Aminosav
4. Fmoc-Ser (‘Bu) 10 2. Fmoc-Thr (‘Bu)
5. Fmoc-Pro 3. Fmoc-Gly
6. Fmoc-Thr (‘Bu) 4. Fmoc-Thr (*Bu)
7. Fmoc-Glu (γ-O’Bu) 5. Fmoc-Val
8. Fmoc-Val 6. Fmoc-Thr (‘Bu)
9. Fmoc-Asp (3-O‘Bu) 15 7. Fmoc-Thr (‘Bu)
10. Fmoc-Pro 8. Fmoc-Ala
11. Fmoc-Leu 9. Fmoc-Arg (Pmc)
12. Fmoc-Leu 10. Fmoc-Lys (Boc)
13. Fmoc-Val 11. Fmoc-Gly
8. A gyantához kötött peptid a-N-terminusához 20 12. Fmoc-Arg (Pmc)
ecetsavat kapcsoltunk, a 4. és 5. lépésben alkalmazott 13. Fmoc-Thr (‘Bu)
körülmények mellett; 14. Fmoc-Gly
9. A gyantát mintegy 5 percen át THF-fel mostuk, 15. Fmoc-Lys (Boc)
hogy a DMF-et eltávolítsuk, és zsugorítsuk a gyantát, 16. Fmoc-Gly
majd azt 10 percen át argonnal, 10 percen át nitrogén- 25 17. Fmoc-Asn (Trt)
nel szárítottuk, hogy tiszta, gyantához kötött peptidet 18. Fmoc-Gly
kapjunk; 19. Fmoc-Phe
10. Hasítóreagensben [frissen készített tioanizol 20. Fmoc-Met,
(100 μΙ), víz (50 μΙ), etándiol (50 μΙ) trifluor-ecetsav (1,8 ml) oldattal, amelyet ebben a sorrendben elegyítettünk] történő keveréssel lehasítottuk a peptidet a gyantáról, egyidejűleg megszüntetve az aminosav-oldalláncok védelmét. A keverést -5 -10 °C között, 10-15 percen át, majd szobahőmérsékleten további 1,75 órán át végeztük [minden egyes Arg(Pmc) csoportra - ha ilyen előfordul - további 0,5 órát számolva], A hasítóreagens mennyiségét az alábbi képlet szerint határoztuk meg:
Gyantához kötött peptid (mg) Hasítóreagens (μΙ)
0-10 100
10-25 200
25-50 400
50-100 700
100-200 1200
11. A terméket szűrtük, és tömény trifluor-ecetsavval öblítettük, a filtrátumot 0,5 ml-es adagokban, 8 ml hideg dietil-étert tartalmazó centrifugacsövekbe osztottuk, centrifugáltuk és dekantáltuk, addig ismételve ezt a műveletet, amíg az összes peptid precipitálódott. Amennyiben a peptid éterhozzáadásra nem precípitálódott, az elegyet 30%-os vizes ecetsavval extraháltuk (3*1 ml), majd az összegyűjtött vizes kivonatot liofileztük, hogy megkapjuk a kész terméket;
12. A peptidet nyers formában alkalmaztuk, vagy „7 pm Symmetry Prep C18” oszlopon HPLC-eljárással, 5-100% acetonitril- (víz, 0,1% TFA) gradiens alkalmazásával, 50 perc alatt tisztítottuk, majd a kész terméket liofileztük; a fenti eljárással 35 mg N-Ac-Val-Leu-LeuPro-Asp-ValGlu-Thr-Pro-Ser-Glu-Glu-Asp-NH2-peptidet kaptunk.
hogy 35 mg N-Ac-Met-Phe-Gly-Asn-Gly-Lys-Gly-
30 Tyr-Arg-Gly-Lys-Arg-Ala-Thr-Thr-Val-Thr-Gly-Thr-ProNH2-peptidet kapjunk.
3. példa
N-Ac-GIn-Asp-Trp-Ala-Ala-GIn-Glu-Pro-His-Arg-His-
35 Ser-lle-Phe-Thr-Pro-Glu-Thr-Asn-Pro-Arg-Ala-Gly-
Leu-Glu-Lys-Asn-Tyr-NHrpeptidelőállítása
A cím szerinti vegyületet az 1. példában leírt szinté-
zissorrend szerint állítottuk elő, első aminosavként
Fmoc-Tyr (‘Bu)-csoportot alkalmazva. Az alábbi amino-
40 savakat alkalmaztuk, a már említett körülmények mellett;
Sorszám Aminosav
2. Fmoc-Asn (Trt)
3. Fmoc-Lys (Boc)
4. Fmoc-Glu (γ-O’Bu)
45 5. Fmoc-Leu
6. Fmoc-Gly
7. Fmoc-Ala
8. Fmoc-Arg (Pmc)
9. Fmoc-Pro
50 10. Fmoc-Asn (Trt)
11. Fmoc-Thr (‘BU)
12. Fmoc-Glu (γ-0'Bu)
13. Fmoc-Pro
14. Fmoc-Thr (’BU)
55 15. Fmoc-Phe
16. Fmoc-lle
17. Fmoc-Ser (‘BU)
18. Fmoc-His (Trt)
19. Fmoc-Arg (Pmc)
60 20. Fmoc-His (Trt)
HU 224 827 Β1
Sorszám Aminosav Fmoc-Tyr (‘Bu)-csoportot alkalmazva. Az alábbi amino-
21. Fmoc-Pro savakat alkalmaztuk, a már említett körülmények mellett:
22. Fmoc-Glu (y-O‘Bu) Sorszám Aminosav
23. Fmoc-GIn (Trt) 2. Fmoc-Asp (β-0'Bu)
24. Fmoc-Ala 5 3. Fmoc-Tyr (‘BU)
25. Fmoc-Ala 4. Fmoc-Leu
26. Fmoc-Trp 5. Fmoc-Lys (Boc)
27. Fmoc-Asp (8-O*Bu) 6. Fmoc-Arg (Pmc)
28. Fmoc-GIn (Trt), 7. Fmoc-Pro,
hogy 40 mg N-Ac-GIn-Asp-Trp-Ala-Ala-GIn-Glu-Pro- 10 hogy 4 mg N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-
His-Arg-His-Ser-lle-Phe-Thr-Pro-Glu-Thr-Asn-Pro-ArgAla-Gly-Leu-Glu-Lys-Asn-Tyr-NH2-peptidet kapjunk.
Tyr-NH2-peptidet kapjunk. MS (FAB) m/z 995 (M+H)+.
7. példa
4. példa N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-NH2-peptid előállí-
N-Ac-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gly-Pro- 15 tása
Trp-NH2-peptid előállítása A cím szerinti vegyületet az 1. példában leírt szinté-
A cím szerinti vegyületet az 1. példában leírt szinté- zissorrend szerint állítottuk elő. Az alábbi aminosava-
zissorrend szerint állítottuk elő, első aminosavként kat alkalmaztuk, a már említett körülmények mellett:
Fmoc-Trp-csoportot alkalmazva. Az alábbi aminosava- Sorszám Aminosav
kat alkalmaztuk, a már említett körülmények mellett: 20 2. Fmoc-Tyr (‘Bu)
Sorszám Aminosav 3. Fmoc-Leu
2. Fmoc-Pro 4. Fmoc-Lys (Boc)
3. Fmoc-Gly 5. Fmoc-Arg (Pmc)
4. Fmoc-Gly 6. Fmoc-Leu,
5. Fmoc-Val 25 hogy 6 mg N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-NH2-
6. Fmoc-Asp (p-OlBu) peptidet kapjunk. MS (ESI) m/z 832 (M+H)+.
7. Fmoc-Gly
8. Fmoc-Asp (p-OlBu) 8. példa
9. Fmoc-Pro N-Ac-Pro-Glu-Lys-Arg- Tyr-Asp- Tyr-NH2 előállítása
10. Fmoc-Asn (Trt) 30 A cím szerinti vegyületet az 1. példában leírt szinté-
11. Fmoc-Arg (Pmt); zissorrend szerint állítottuk elő, első aminosavként
a fenti eljárás szerint 20 mg N-Ac-Arg-Asn-Pro-Asp- Fmoc-Tyr (’Bu)-csoportot alkalmazva. Az alábbi ami-
Gly-Asp-Val-Gly-Gly-Pro-T rp-N H2-peptidet kaptunk. nosavakat alkalmaztuk, a már említett körülmények
mellett:
5. példa 35 Sorszám Aminosav
N-Ac-Tyr-Thr-Thr-Asn-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp- 2. Fmoc-Asp (β-0'Bu)
Tyr-NH2-peptid előállítása 3. Fmoc-Tyr (‘Bu)
A cím szerinti vegyületet az 1. példában leírt szinté- 4. Fmoc-Arg (Pmc)
zissorrend szerint állítottuk elő, első aminosavként 5. Fmoc-Lys (Boc)
Fmoc-Tyr (‘Bu)-csoportot alkalmazva. Az alábbi amino- 40 6. Fmoc-Glu
savakat alkalmaztuk, a már említett körülmények mellett: 7. Fmoc-Pro,
Sorszám Aminosav hogy 6 mg N-Ac-Pro-Glu-Lys-Arg-Tyr-Asp-
2. Fmoc-Asp (β-Ο*Βυ) Tyr-NH2-peptidet kapjunk. MS (FAB) m/z (1101)
3. Fmoc-Tyr (‘BU) (M+H)+.
4. Fmoc-Leu 45
5. Fmoc-Lys (Boc) 9. példa
6. Fmoc-Arg (Pmc) N-Ac-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH2-peptid előállí-
7. Fmoc-Pro tása
8. Fmoc-Asn (Trt) A cím szerinti vegyületet az 1. példában leírt szinté-
9. Fmoc-Thr (‘BU) 50 zissorrend szerint állítottuk elő, első aminosavként
10. Fmoc-Thr (‘BU) Fmoc-Tyr (‘Bu)-csoportot alkalmazva. Az alábbi amino-
11. Fmoc-Tyr (‘BU), savakat alkalmaztuk, a már említett körülmények mellett:
hogy 10 mg N-Ac-Tyr-Thr-Thr-Asn-Pro-Arg- Sorszám Aminosav
Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH2-peptidet kapjunk. 2. Fmoc-Asp (8-O‘Bu)
55 3. Fmoc-Tyr (‘Bu)
6. példa 4. Fmoc-Leu
N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH2-peptid elő- 5. Fmoc-Lys (Boc)
állítása 6. Fmoc-Arg (Pmc),
A cím szerinti vegyületet az 1. példában leírt szintézissorrend szerint állítottuk elő, első aminosavként 60 hogy 8 mg N-Ac-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH2peptidet kapjunk. MS (ESI) m/z 898 (M+H)+.
HU 224 827 Β1
10. példa
N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-Ι-Tyr-Asp-Tyr-NH2- (13. azonosító számú szekvencia) peptid előállítása A cím szerinti vegyületet az 1. példában leírt szintézissorrend szerint állítottuk elő, első aminosavként Fmoc-Tyr (lBu)-csoportot alkalmazva. Az alábbi aminosavakat alkalmaztuk, a már említett körülmények mellett:
Sorszám Aminosav
2. Fmoc-Asp (β-O’Bu)
3. Fmoc-3-l-Tyr (*Bu)
4. Fmoc-Leu
5. Fmoc-Lys (Boc)
6. Fmoc-Arg (Pmc)
7. Fmoc-Pro, hogy 2 mg N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-l-TyrAsp-Tyr-NH2-peptidet kapjunk. MS (ESI) m/z (1121) (M+H)+.
11. példa
N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-l-Tyr-NH2- (14. azonosító számú szekvencia) peptid előállítása A cím szerinti vegyületet az 1. példában leírt szintézissorrend szerint állítottuk elő, első aminosavként Fmoc-3-l-Tyr (‘Buj-csoportot alkalmazva. Az alábbi aminosavakat alkalmaztuk, a már említett körülmények mellett:
Sorszám Aminosav
2. Fmoc-Asp (β-ΟιΒυ)
3. Fmoc-Tyr (*Bu)
4. Fmoc-Leu
5. Fmoc-Lys (Boc)
6. Fmoc-Arg (Pmc)
7. Fmoc-Pro, hogy 2,5 mg N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3l-Tyr-NH2-peptidet kapjunk. MS (ESI) m/z 1121 (M+H)+.
12. példa
N-Ac-Lys-Leu-Tyr-Asp-NH2-peptid előállítása
A cím szerinti vegyületet az 1. példában leírt szintézissorrend szerint állítottuk elő, első aminosavként Fmoc-Asp ^-CXBuXcsoportot alkalmazva. Az alábbi aminosavakat alkalmaztuk, a már említett körülmények mellett:
Sorszám Aminosav
2. Fmoc-Tyr (’Bu)
3. Fmoc-Leu
4. Fmoc-Lys, hogy 2 mg N-Ac-Lys-Leu-Tyr-Asp-NH2-peptidet nyerjünk.
13. példa
N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-l125-Tyr535-NH2 (13. azonosító számú szekvencia) és
N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-l125-Tyr633-Asp-Tyr-NH2 (14. azonosító számú szekvencia) elegyének előállítása és szétválasztása
Foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldat (PBS) 80 μΙ-ében oldott, 30 pg N-acetil-prolil-arginil-lizilleucil-tirozil-aszpertil-tirozil-amid-peptid oldatához egy „lodobead” gyöngyöt (Pierce, Rockford, IL, USA) és 100 pCi aktivitású Nal125-izotópot adtunk. Tíz perc múlva a Nal125-felesleget úgy távolítottuk el, hogy a reakcióelegyet „Waters C18-Light SepPack” oszlopra vittük, vízzel, majd 0,1% TFA-t tartalmazó, 1:1 arányban elegyített CH3CN/víz oldattal eluáltuk, és 3x200 μΙ térfogatú frakciókat gyűjtöttünk, hogy Tyr533 és Tyr535 pozícióban izotóppal jelölt peptidek elegyét kapjuk.
A meleg (izotóppal jelölt) peptidelegyet N-AcPro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-l-Tyr-NH2 és N-Ac-ProArg-Lys-Leu-3-l-Tyr-Asp-Tyr-NH2 hideg (izotóppal nem jelölt) peptidek ekvimoláris mennyiségével együtt C18-HPLC-oszlopra injektáltuk; a hideg peptidek elúciós idejét 36, illetve 38 percben határoztuk meg. Az 1. példában ismertetett oldószerekkel történő ismételt eluálás, majd az elegyített megfelelő frakciók liofilezését követően megkaptuk a kívánt N-Ac-Pro-ArgLys-Leu-Tyr-Asp-3-1125-Tyr535-NH2-peptidet, minimális N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-l125-Tyr533-Asp-Tyr-NH2szennyezéssel.
14. példa
Kringle-5-peptid-fragmensek izolálása és tisztítása
Kringle-5-peptid-fragmenseket Lys-plazminogén (Lys-HPg, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA) sertéseredetű elasztázzal (SIGMA, St. Louis, MO, USA) történő emésztésével állítottunk elő, Powell és munkatársai [Arch. Bíochem. Biophys. 248, 390-400 (1986)] által leírt eljárás módosításával, amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi. Sertéseredetű elasztázt (1,5 mg) inkubáltunk 200 mg Lys-HPg proteinnel 50 mmol/l Trisz-HCI (pH 8,0) pufferben, éjszakán át rázatva, szobahőmérsékleten. A reakciót DPF (diizopropil-fluoro-foszfát, SIGMA) 1 mmol/l végkoncentrációig történő hozzáadásával állítottuk le. Az elegyet további 30 percen át rázattuk, éjszakán át 50 mmol/l Trisz-pufferrel (pH 8,0) szemben dializáltuk, majd koncentráltuk. A hasított plazminogént 2,5x15 cm-es lizin-Sepharose 4B-oszlopra vittük [Brockway, W. J. és Castellino, F. J.: Arch. Bíochem. Biophys. 151, 194-199 (1972), amely közlemény teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi], és 50 mmol/l Trisz-pufferrel (pH 8,0) ekvilibráltuk, amíg a 280 nm-en mért 0,05 abszorbciós (OD) értéket el nem értük. Ezt a műveletet azért végeztük, hogy eltávolítsuk a kringle-1- és/vagy kringle-4-régiókat tartalmazó fragmenseket (mindkét fragmenstípus kötődik lizinhez). A nem kötődő kringle-5-peptid-fragmenseket 50 mmol/l Na2PO4-pufferrel (pH=5) szemben dializáltuk, majd ugyanezzel a pufferrel ekvilibrált „BioRad Mono-S” oszlopra vittük. A hasított kringle-5-részt, a hasítatlan mini-HPg-t és a maradék proteáz-domén frakciót 20 mmol/l foszfát/1 mol/l KCI (pH=5) oldat 0-20%, 20-50% és 50-70% lépcsőzetes gradiensével eluáltuk. Gélelektroforézis-vizsgálat szerint a kringle-5-peptid-fragmensek az 50%-os elúciós lépésnél eluálódtak. Az elúciós csúcshoz tartozó peptideket összegyűjtöttük, és éjszakán át 20 mmol/l Trisz-pufferrel (pH=8,0) szemben dializáltuk.
FPLC kromatográfiás vizsgálat és SDS-PAGE-vizsgálatot követő ezüstfestés szerint (Coomassie Blue) a
HU 224 827 Β1 tisztított kringle-5-peptid-fragmensek legalább 95% tisztítottsági fokot mutattak. A tisztított fragmensek aminoterminális részének szekvenciaanalízis-vizsgálata három polipeptid jelenlétét mutatta ki, amelyek a-N-terminális szekvenciája VLLPDVETPS, VAPPPWLL és VETPSEED volt, és amelyek megfelelnek az 1. azonosító számú szekvencia szerinti Val^-Ser458, Val^-Leu450 és Val454-Asp461 aminosavpozícióknak.
15. példa
Endotélsejt-proliferációs vizsgálatok Endotélsejtek in vitro proliferációját Lingen és munkatársai által ismertetett eljárás szerint végeztük [Laboratory Investigation 74, 476-483 (1996), amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi] „Cell. Titer 96 Aqueous Non Radioactive Cell. Proliferation Assay” reagenskészlet (Promega Corp. Madison, Wl, USA) alkalmazásával. Szarvasmarhamellékvese-eredetű kapilláris-endotélsejteket 1000 sejt/mélyület denzitásban 96 mélyületű lemezre helyeztünk „Dulbecco’s Modified Eagle Médium” (továbbiakban: DMEM) tápfolyadékban, amely 10% donor borjúszérumot és 1% BSA-t (szarvasmarha-szérumalbumin, GIBCO BRL, Gaithersburg, MD, USA) tartalmazott. A sejteket 8 órán át inkubáltuk, majd éjszakán át éheztettük 0,1% BSA-t tartalmazó DMEM-tápfolyadékban. Másnap kicseréltük a tápfolyadékot a gátlóanyag adott koncentrációját, valamint 5 ng/ml bFGF-et („basic fibroblast growth faktor”, alap fibroblaszt növekedési faktor) tartalmazó tápfolyadékra. A vizsgálat eredményeit korrigáltuk egyrészt a nem stimulált (azaz bFGF-mentes) sejtek proliferációs értékére, mint alsó értékre, másrészt a csak bFGF által stimulált (azaz gátlóanyagmentes) sejtek proliferációs értékére, mint maximális proliferációs értékre. Amikor több vizsgálat eredményét hasonlítottuk össze, az eredményeket a csak bFGF által stimulált kultúrákéhoz viszonyított sejtszámváltozás százalékában fejeztük ki.
16. példa
In vitro endotélsejt-migrációs vizsgálat Endotélsejt-migrációs vizsgálatokat lényegében
Polverini és munkatársai által leírt eljárás szerint végeztünk [Methods Enzymol. 198, 440-450 (1991), amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi]. Összefoglalva, szarvasmarhamellékvese-eredetű kapilláris-endotélsejteket (BCE, Judah Folkman, Harvard University Medical School) éjszakán át éheztettünk 1% BSA-t tartalmazó DMEM-tápfolyadékban. A sejteket tripszinkezelést követően összegyűjtöttük, és 0,1% BSA-t tartalmazó DMEM-tápfolyadékban reszuszpendáltuk 1,5*106 sejt/ml denzitásban. A sejteket 48 mélyületű módosított Boyden-kamrába (Nukleopore Corp., Cabin John, MD, USA) osztottuk. A kamrát összeállítottuk, megfordítottuk, és a sejteket 2 órán át 37 °C-on hagytuk letapadni 5 pm pórusméretű polikarbonát kemotaxismembránokhoz, amelyeket zselatinban áztattunk éjszakán át, majd megszárítottunk. A kamrát ezután visszafordítottuk, és a felső kamra mélyületeihez vizsgálati anyagokat adtunk (50 pl végtérfogatban). A készüléket ezután 4 órán át 37 °C-on inkubáltuk. A membránokat eltávolítottuk, fixáltuk és megfestettük (DiffQuick, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA), majd a felső kamrába vándorolt 10, nagy nagyítás (400*) mellett vizsgált látótérbe eső sejteket megszámoltuk. A DMEM+0,1% BSA tápfolyadékra eső háttérmigrációs értéket kivontuk, és mérési eredménynek 10, nagy nagyítás (400*) mellett vizsgált látótérbe vándorolt sejtek számát, vagy ha több vizsgálat eredményét hasonlítottuk össze, a pozitív kontrolihoz viszonyított migrációgátlás százalékos értékét tekintettük.
17. példa
Kringle-5-peptid-fragmensek hatása in vitro endotélsejt-proliferációra
Kringle-5-peptid-fragmensek endotélsejt-proliferációra kifejtett hatását in vitro eljárással határoztuk meg, a fent ismertetett endotélsejt-proliferációs vizsgálattal. Ezekhez a vizsgálatokhoz a kringle-5-peptid-fragmenseket az 1-14. példákban szemléltetettek szerint állítottuk elő, és azokat mintegy 100-1000 pmol/l koncentrációtartományban vizsgáltuk, maximum proliferációs kontrollként bFGF-et alkalmazva. A 3. azonosító számú szekvencia szerinti kringle-5-peptid-fragmens hatékonyan, dózisfüggően gátolta a BCE-sejt-proliferációt. A 3. azonosító számú szekvencia szerinti kringle-5-peptid-fragmens azon koncentrációját, amely 50%-os gátlás eléréséhez (ED50) szükséges, mintegy 300 pmol/l értéknek határoztuk meg. Ezzel szemben a kringle-1-4-peptidek ED50-értéke 135 nmol/l volt.
Az 1. táblázat összefoglalja más kringle-peptid-fragmensek BCE-sejtekre gyakorolt proliferációgátló hatását. Kringle-3-peptid-fragmens gátolta legkevésbé a BCE-sejt-proliferációt (ED50=460 nmol/l), ezt követi a kringle-1-peptid-fragmens (ED50=320 nmol/l), kringle-1-kringle-4 peptidfragmens (ED50=135 nmol/l) és kringle-1-kringle-3 peptidfragmens (ED50=75 nmol/l). Kringle-5-peptid-fragmens bizonyult a leghatásosabbnak BCE-sejtek proliferációjának gátlására 0,3 nmol/l ED50-értékkel.
18. példa
Kringle-5-peptid-fragmensek hatása endotélsejtek migrációjára in vitro körülmények mellett Meghatároztuk továbbá kringle-5-peptid-fragmensek endotélsejtek migrációjára kifejtett hatását in vitro, a fent ismertetett endotélsejt-migrációs vizsgálatban. Kringle-5-peptid-fragmensek dózisfüggő módon gátolták BCE-sejtek migrációját, mintegy 300 pmol/l ED50-értékkel. Annál a koncentrációnál, amelynél kringle-5-peptid-fragmensek maximálisan gátolták a BCE-sejtek migrációját, PC-3-sejteket és MDA 486-sejteket is gátoltak. Ez az eredmény összevetve a 2. példa szerinti eredményekkel azt mutatja, hogy BCE-sejtek stimulált proliferációjának és migrációjának kringle-5-peptid-fragmensek által történő gátlása egyfelől erőteljes, másfelől endotélsejtekre specifikus, és nem vonatkozik normál- vagy tumorsejtekre.
Az eddig leírtak csupán szemléltetik a találmányi gondolatot, és nem korlátozzák a találmány oltalmi körét a találmány szerinti vegyületekre. A szakember szá27
HU 224 827 Β1 mára nyilvánvaló variációk és változtatások beletartoznak a találmány oltalmi körébe, amelyeket az igénypontok határoznak meg.
Az 1. táblázat különböző kringle-peptid-fragmensek in vitro BCE-sejt-proliferáció- és migrációgátlásának 5 ED50-értékeit mutatja. A táblázatban a kringle-peptíd-fragmenseket az 1. azonosító számú szekvenciával egyező szekvenciahomológia alapján jelöltük. A jelölés Marti és munkatársaitól származó adatokat jelöl [Eur. J. Biochem., 219, 455-462 (1994), amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi], a jelölés adatok hiányát jelenti.
1. táblázat
Az 1. azonosító számú szekvenciából származó prateinfragmens BCE-sejtekre kifejtett antiproliferatív aktivitás (ED50) HMVEC-sejtekre kifejtett migrációgátlás (EDS0)
Kringle-1-kringle-4 (angiosztatin)* 135 nM 160 nM
Kringle-1 (Tyr80-Glu163)* 320 nM -
Kringle-2 (Glu161-Thr243)* nincs aktivitás -
Kringle-3 (Thr253-Ser335)* 460 nM -
Kringle-4 (Val354-Val443)* nincs aktivitás -
Kringle-1 -kringle-3 (Tyr80-Pro353)* 75 nM 60 nM
Kringle-2-kringle-3 (Glu161-Ser335)* - -
Kringle-5 (Val443-Ala543) 250 pM 200 pM
Kringle-5 (Val449-Ala543) - 240 pM
Kringle-5 (Val434-Ala543) - 220 pM
Kringle-5 (Val443-Phe546) 60 nM 55 pM
Kringle-5 (Val449-Phe546) - -
Kringle-5 (Val454-Phe546) - -
Kringle-4-kringle-5 (VaPSS-Ala543) - 280 pM
Kringle-4-kringle-5 (Val355-Phe546) - -
N-Ac-Val449-Asp461-NH2 - >1 mM
N-Ac-Met463-Pro482-NH2 - >1 mM
N-Ac-Gln484-Tyr511-NH2 - >100 μΜ
N-Ac-Arg513-Trp523-NH2 - 500 pM
N-Ac-Tyr525-Tyr535-NH2 - 200 pM
N-Ac-Pro529-Ty r535-N H2 - 120 pM
N-Ac-Arg529-Asp534-NH2 - 123 pM
N-Ac-Pro150-Tyr156-NH2 - 160 pM
N-Ac-Arg530-Tyr535-NH2 - 80 pM
N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-l-Tyr-NH2 - >100 nM
N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-l-Tyr-NH2 - 400 pM
N-Ac-Lys531-Tyr534-NH2 - -
19. példa 50
Kringle-5-fragmensek rekombináns expresszálása
Pichia pastoris organizmusban
A) Kríngle-5-fragmenseket kódoló cDNS-molekulák előállítása PCR-eljárással
PCR-eljárást alkalmaztunk (1) az 1. azonosító szá- 55 mú szekvencia szerinti 450-543. aminosavszekvenciával (továbbiakban: K5A), (2) az 1. azonosító számú szekvencia szerinti 450-546. aminosavszekvenciával (továbbiakban: K5F), (3) az 1. azonosító számú szekvencia szerinti 355-543. aminosavszekvenciával (továb- 60 biakban: K4-5A), valamint az 1. azonosító számú szekvencia szerinti 355-546. aminosavszekvenciával (továbbiakban: K4-5F) rendelkező kringle-5-peptid-fragmenseket kódoló cDNS-fragmensek előállítására, eukarióta és prokarióta sejtekben történő klónozásra és expresszálásra. A DNS-fragmenseket templátként humán plazminogént kódoló cDNS (Dr. E. Reich, State University of New York, Stony Brook, NY, USA), valamint az alábbi előre- („forward”) és hátrairányuló („reverz’') láncindító olígonukleotidok (Operon Technologies Inc., Alameda, CA, USA) alkalmazásával állítottuk elő:
HU 224 827 Β1
5’-ATTAATGGATCCTTGGACAAGAGGCTGCTTCCAGATGTAGAGACT-3' 2. azonosító számú szekvencia
5’-ATTAATGGATCCTTGGACAAGAGGGTCCAGGACTGCTACCATGGT-3' 3. azonosító számú szekvencia
5’-ATTAATCTCGAGGCATGCTTAGGCCGCACACTGATGGACA-3’ 4. azonosító számú szekvencia
5’-ATTAATCTCGAGGCATGCTTAAAATGAAGGGGCCGCACACT-3’ 5. azonosító számú szekvencia
PCR-amplifikációt a 2. azonosító számú szekvencia és a 4. azonosító számú szekvencia szerinti láncindító oligonukleotidok alkalmazásával (K5A), 2. azono- 10 sító számú szekvencia és 5. azonosító számú szekvencia szerinti láncindító oligonukleotidok alkalmazásával (K5F), 3. azonosító számú szekvencia és 8. azonosító számú szekvencia szerinti láncindító oligonukleotidok alkalmazásával (K4-5A), valamint a 3. azono- 15 sító számú szekvencia és 5. azonosító számú szekvencia szerinti primerek alkalmazásával (K45A) állítottunk elő, standard PCR-körülmények mellett, azaz 100 pl össztérfogatú reakcióelegyben, amely az egyes dNTP-ket - ahol N jelentése A, T, G és C - 200 pmol/l 20 végkoncentrációban; az egyes láncindító oiigonukleotidokat 0,2 pmol/l végkoncentrációban tartalmazta, továbbá mintegy 10 ng templát-DNS-t és 1 egység Vént® DNS-polimerázt (New England Biolabs) tartalmazott.
Az amplifikációt összesen 25 cikluson át végeztük 25 (1-1 ciklus során a következő paramétereket alkalmaztuk: 94 °C-on 1 perc; 48 °C-on két perc; 72 °C-on 1 perc), az amplifikációt „Thermal Cycler 480” típusú automatizált fűtőblokkban végeztük (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA). Az amplifikációt követően a 30 PCR-termékeket gélen tisztítottuk, BamHI- és Xhol-enzimekkel emésztettük (New England Biolabs), az említett enzimekkel hasított módosított Pichia expressziós vektorba ligáltuk (pHil-D8, lásd az alábbiakban), majd elektroporációs módszerrel azokkal HB101-sejteket 35 transzformáltunk (Bio Rád). Különálló kiónokból DNS-t izoláltunk, azokat restrikciós enzimekkel hasítottuk, szekvenálással analizáltuk, miáltal a helyes szekvenciát megfelelő orientációban tartalmazó inszertet tartalmazó kiónokat azonosítottunk. Ezután pozitívként azo- 40 nosított kiónokból nyert plazmid-DNS-t Pichia pastoris GS115-törzsbe transzformáltunk (Invitrogen, Carlsbad,
CA, USA), a gyártó utasításai szerint eljárva. Pozitív Pichia kiónokat úgy azonosítottunk, hogy sejteket egy éjszakán át, 29 °C-on, 5 ml BMGY-tápfolyadékban tenyésztettünk (Invitrogen), majd azokat centrifugálással összegyűjtöttük, és 0,5 ml BMMY-tápfolyadékban szuszpendáltuk (Invitrogen) expresszáltatás céljából. Miután az inkubációt két napig, 29 °C-on folytattuk, a tenyészetek felülúszóit összegyűjtöttük, és azokból vett mintákat SDS-PAGE-, valamint Western-blot-analízisnek vetettünk alá, ismert módszerek szerint. Tipikus SDS-PAGE-gélt mutatunk be a 6. ábrán.
B) A pHil-D8 expressziós vektor előállítása
A pHil-D8 jelzésű expressziós vektort a pHil-D2vektor (Invitrogen) módosításával kaptuk úgy, hogy az utóbbiba rekombináns proteinek szekrécióját irányító szintetikus vezetőszekvenciát építettünk be (lásd
5. ábra). A vezetőszekvencia Í5’-ATGTTCTCTCCAATTTTGTCCTTG-GAAATTATTTTAGCTTT- GGCTACTTTGCAATCTGTCTTCGCTCAGCCAGTTATCTGCACTACCGTTGGTTCCGCTGCCGAGGGATCC-3’ (9. azonosító számú szekvencia)] PHO1 szekréciós szignált kódol (a szekvenciában aláhúzással jelölve) egy KEX2-hasítás számára hozzáférhető propeptidszekvenciához működőképesen kapcsolva (a szekvenciában vastag betűvel kiemelve). A pHil-D8-vektor előállításához a következőket alkalmaztuk: a pHil-S1-vektort (Invitrogen) templátként, mivel ez a vektor tartalmazza a PHO-szignált kódoló szekvenciát; a pHII-S1 -vektor 509-530. nukleotidjainak megfelelő előre („forward”) láncindító oligonukleotidot (lásd 7. azonosító számú szekvencia); és a PHO1 szekréciós szignál későbbi részét (a 9. azonosító számú szekvencia szerinti 45-66. nukleotidokat) és a propeptidszekvenciát (a 9. azonosító számú szekvencia szerinti 67-108. nukleotidokat) kódoló nukleotidszekvenciájú reverz láncindító oligonukleotidot (lásd 8. azonosító számú szekvencia).
A következő [az Operon Technologies, Inc. cégtől (Alameda, CA) származó] láncindító oligonukleotidszekvenciákat alkalmaztuk:
5’-GAAACTTCCAAAAGTCGCCATA-3’ 7. azonosító számú szekvencia
5’-ATTAATGAATTCCTCGAGCGGTCCGGGATCCCTCGGCAGCGGAACCAACGG -TAGTGCAGATAACTGGCTGAGCGAAGACAGATTGCAAAGTA-3' 8. azonosító számú szekvencia
Az amplifikációt 25 cikluson át végeztük a 19. példában ismertetettek szerint. A PCR-terméket (amely mintegy 500 bázispárból állt), gélen tisztítottuk, Blpl- és EcoRl-enzimekkel hasítottuk, majd ugyanezen enzimekkel 55 hasított pHil-D2-vektorba ligáltuk. A DNS-sel E. coli HB101-törzshöz tartozó sejteket transzformáltunk, pozitív kiónokat restrikciós enzim emésztéssel és szekvenciaanalízissel azonosítottunk. Egy helyes szekvenciát tartalmazó kiónt pHil-D8-klónnak neveztünk. 60
20. példa
Kringle-5-peptid-fragmensek rekombináns expressziója baktériumokban Valamennyi alkalmazott restrikciós enzimet, egyéb módosítóenzimet és más reagenst kereskedelemben hozzáférhető forrásból szereztünk be. A láncindító oligonukleotidokat az Abbott Laboratories szintetizálta számunkra, automatikus szintetizálókészüléken, a technika állása szerint ismert eljárások szerint.
HU 224 827 Β1
Bakteriális gazdasejtekbe (E. co/z'-sejtekbe) történő klónozásra és azokban történő expresszáltatásra szánt kringle-5-peptid-fragmenseket kódoló DNS-eket ugyancsak PCR-amplifikációs eljárással állítottunk elő.
Azt az általános megközelítési módot követtük, hogy a 5 kívánt kódolórégióknak megfelelő PCR-fragmenseket állítottunk elő, terminációs kodonnal együtt vagy anélkül, a fragmensek végeit kinázzal kezeltük, majd a fragmenseket közvetlenül a kiválasztott vektorba klónoztuk. Ezután a vektorkonstrukciókkal megfelelő gaz- 10 dasejteket transzformáltunk, és telepeket PCR-eljárással, vektorra specifikus láncindító oligonukleotídok alkalmazásával szűrtünk, az inszert jelenlétének igazolására. Az inszert orientációját oly módon határoztuk meg, hogy PCR-reakció szerint inszertet tartalmazó kiónokat irányított PCR-eljárásnak („directional PCR”) vetettünk alá, egy vektorra specifikus láncindító oligonukleotid és egy inszertre specifikus láncindító oligonukleotid alkalmazásával.
A) Tompa végű, foszfatázkezelt vektorok előállítása
Kringle-5-peptid-fragmensek bakteriális előállítására alkalmas expressziós vektorokat ismertetünk a 2. táblázatban.
2. táblázat
Vektor Forrás Restrikciós enzim Fúzió
EpET Abbott-módosított pET21d Sápi Nincs
EpET-HTh Abbott-módosított pET21d Sápi N-terminális His6-trombin felismerő hely
EpET-Ubi Abbott-módosított pET21d Sápi N-terminális His6-ubicuitin felismerő hely
pET32a Novagen Ncol+Xhol Tioredoxin, enterokináz felismerő hely
PGEX-4T-2 Pharmacia® EcoRI+Wofl GST
pCYB3 New England Biolabs Ncol+Sapl C-terminális intein
Először valamennyi vektort Qiagen-oszlopok alkal- 30 mazásával tisztítottunk, a gyártó utasításai szerint eljárva (QIAGEN, Inc. Santa Clarita, CA, USA). Vektor-DNS-t (1 pg) megfelelő restrikciós enzimekkel emésztettünk (lásd 2. táblázat), 20 pl, 100 pg/ml szarvasmarha-szérumalbumint (BSA-t) tartalmazó NEB4- 35 pufferben (New England Biolabs). A reakciót röviden centrifugáltuk, ahhoz 20 pl desztillált vizet, 0,4 pl dNTP-elegyet (Pharmacia®; amely az egyes dNTP-k 20 mmol/l mennyiségét tartalmazta); és 0,25 pl klónozott pfu DNS-polimerázt (Stratagene®; 2,5 egység/pl) 40 adtunk, majd a reakcióelegyet 20 percig, 65 °C-on inkubáltuk a vektor végeinek feltöltéséhez. Ezután a reakcióelegyet ismételten röviden centrifugáltuk, és ahhoz 4 pl hígított borjúbélfoszfatázt (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD; összesen 5 egység enzimet) ad- 45 tünk. Ezt követően az elegyet egy órán át, 50 “C-on inkubáltuk. Ezután ez elegyhez a következőket adtuk: 5 pl 10%-os SDS-t, 2 pl 5 mol/l NaCI-ot, 2 pl 0,5 mol/l EDTA-t és 45 pl H2O-ot; majd a reakcióelegyet röviden centrifugáltuk, majd 20 percig, 65 °C-on inkubáltuk. A reakcióelegyet pufferrel szaturált fenol-kloroform eleggyel (GIBCO BRL) háromszor, és kloroformmal egyszer extraháltuk. A vizes fázist „CHROMA SPIN™1000TE” oszlopon tisztítottuk (Clontech, Palo Alto, CA USA).
B) DNS-fragmensek előállítása PCR-eljárással PCR láncindltó oligonukleotidokat humán plazminogén szakirodalomban közölt szekvenciája (lásd 12. azonosító számú szekvencia) alapján terveztünk és rendeltünk meg; azok szekvenciáját az alábbiakban ismertetjük:
5’-GTCCAGGACTGCTACCAT-3’ 10. azonosító számú szekvencia
5’-CTGCTTCCAGATGTAGAGA-3’ 11. azonosító számú szekvencia
5’-TTATTAGGCCGCACACTGAGGGA-3’ 13. azonosító számú szekvencia
Hacsak kifejezetten másképp nem kötöttük ki, valamennyi PCR-reakciót pfu DNS-polimeráz alkalmazásával és annak megfelelő pufferben végeztük (Stratagene®), az egyes dNTP-k 200 pmol, az egyes láncindító 55 oligonukleotídok 1 pmol/l koncentrációjának alkalmazása mellett. Az alábbi láncindító oligonukleotid kombinációkat alkalmaztuk: a 11. és 13. azonosító számú szekvencia szerinti láncindító oligonukleotidokat (a K5A-fragmens előállítására); a 10. és 13. azonosító 60 számú szekvencia szerinti láncindító oligonukleotidokat (a K4-5A-fragmens előállítására). Templátként a K4-K5A-fragmenst tartalmazó pHil-D8-vektort alkalmaztuk (leírását lásd a 19. példában). Ezt a DNS-t, templátként történő alkalmazását megelőzően Dral-enzimmel emésztettük (amely enzim többszörös hasítást eredményez a kringle-régiókon kívül eső szekvenciákban), hogy a későbbi transzformációk során kiküszöböljük a pHil-D8-vektor alkalmazásából eredő hátteret.
HU 224 827 Β1
Mintegy 10 ng templátot alkalmaztunk 50 μΙ össztérfogatú PCR-reakciókban. A PCR-reakciókat a következő paraméterek szerint végeztük: 94 °C 2 percig; majd 15 cikluson át, 94 °C 30 másodpercig; 49 °C 1 percig;
°C 4 percig; végül 72 °C 7 percig. A PCR-reakciót 5 követően a reakcióelegyekhez 0,5 μ1100 mmol/l ATP-t és 5 egység T4-kinázt adtunk, majd azokat 20 percig, °C-on inkubáltuk a végek kinázkezelése céljából. Ezután a reakciókat 15 percig 68 °C-on hevítettük, S400-HR típusú centrifugálható oszlopon (Pharma- 10 cia®) tisztítottuk, majd ligálásra alkalmaztuk.
C) PCR-fragmensek ligálása expressziós vektorokba
Hat rekombináns konstrukciót [közelebbről, (i) az UpET-PS3-vektorba klónozott K5A-fragmenst tártál- 15 mazó konstrukciót; (ii) a pET32a-vektorba klónozott K5A-fragmenst tartalmazó konstrukciót; (iii) az UpET-PS3-vektorba klónozott K4-5A-fragmenst tartalmazó konstrukciót; (iv) az UpET-Ubi-vektorba klónozott K4-5A-fragmenst tartalmazó konstrukciót; (v) a pET3- 20 2a-vektorba klónozott K4-5A-fragmenst tartalmazó konstrukciót, valamint (vi) a pGEX-4T-2-vektorba klónozott K4-5A-fragmenst tartalmazó konstrukciót] állítottunk elő, a következőkben ismertetettek szerint: tompa végűvé alakított, foszfatázzal kezelt vektort [1 μΙ a 25 fenti A) lépésből] és PCR-fragmenst [1 μΙ a fenti B) lépésből] 5,5 μΙ össztérfogatú reakcióelegyben ligáltunk, a „Rapid Ligation Kit” alkalmazásával, a gyártó (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN, USA) utasításai szerint eljárva. A ligációs eleggyel (’μΙ) 20 μΙ kom- 30 petens sejtet transzformáltunk [,,XL1-Blue Supercompetent” sejteket vagy „XL2-Blue Ultracompetent” sejteket; Stratagene®], a gyártó utasításai szerint eljárva. Rekombináns sejteket LB-Amp agarlemezeken szelektáltunk (MicroDiagnostics, Lombard, IL). 35
D) Expressziós vizsgálatok pGEX-vektorokat E. coli „XL1-Blue” vagy „XL2-Blue” sejtekben expresszáltattunk. Valamennyi egyéb vektort izoláltuk, és azokat transzformációval E. coli BL21(DE3)-(Novagen) sejtekbe juttattuk, a gyártó utasításai szerint eljárva. Különálló telepeket 2,5 ml LB/Amp táptalajba oltottunk, és a tenyészeteket 225 fordulat/perc mellett, 37 °C-on, egy éjszakán át rázattuk. Az egyéjszakás tenyészetekkel (0,5 ml) 250 ml térfogatú tenyésztőlombikokban 50 ml LB/Amp táptalajt oltottunk be, és azokat 225 fordulat/perc mellett, 37 °C-on rázattuk, 600 nm-en mérve OD=0,5-0,6 eléréséig. A tenyészetekhez izopropil-1-tio-3-D-galaktopiranozidot (IPTG, 100 mmol/l) adtunk 1 mmol/l végkoncentrációig. A tenyészetet 225 fordulat/perc mellett, 30 °C-on, 3 óráig rázattuk, majd centrifugáltuk. Mintákat készítettünk SDS-PAGE-analízis céljára, ismert módszerek szerint. Előzetes kísérletek szerint a K5A/pET32a, K4-5A/pET32a és K4-5A/pGEX konstrukciót tartalmazó sejtek termelték a legtöbb rekombináns proteint. Ezen kiónok tenyészeteit SDS-PAGE-gélen analizáltuk, arra nézve, hogy azok szolúbilis vagy nem szolúbilis terméket expresszálnak. A 7. ábrán látható, hogy K5A/pET32a konstrukciót tartalmazó klón csaknem teljes mértékben szolúbilis rekombináns proteint termelt (lásd az S és P jelzésű csíkokat a Trx-K5A-nak megfelelően), míg a K4-5A/pET32a és K4-5A/pGEX konstrukciót tartalmazó sejtek mintegy 75%-ban szolúbilis proteineket termeltek.
E) Abbott-módosított vektorok előállítása
i) VB1, VB2, VB3 és VB4 kazetták előállítása VB1, VB2, VB3 és VB4 kazettákat szintetikus
DNS-ekként állítottunk elő, szakember számára jól ismert eljárások szerint. A synVBI, synVB2, synVB3 és synVB4 szekvenciáját az alábbiakban ismertetjük:
synVBI 5’-AGCGTCTCATGAAGAGCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGC GCCTTGGCGCGCCAACCTTAATTAACCGGGAGCCCGCCTAATGAGCGG GCTTTTTTTTGCTCTTCATAGTGACTGAGACGTCG-3' 14. azonosító számú szekvencia
synVB2 5'-AGCGTCTCAGGTGGTGGTCATCACCATCACCATCACGGTGGTGGT CTGGTGCCGCGCGGCAGCTGAAGAGCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCT TTCTGCGCCTTGGCGCGCCAACCTTAATTAACCGGGAGCCCGCCTAAT GAGCGGGCTTTTTTTGCTCTTACGAGACGTCG-3’ 15. azonosító számú szekvencia
synVB3 5’-AGCGTCTCAGGTGGTGGTCATCACCATCACCATCACGGTGGTGGT TGAAGAGCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGCCTTGGCGCGC CAACCTTAATTAACCGGGAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGC TCTTCACGAGACGTC-3' 16. azonosító számú szekvencia
synVB4 5’-AGCGTCTCAGGTGGTGGTCATCACCATCACCATCACGGTGGTGGT GATGACGATGACAAGTGAAGAGCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTC TGCGCCTTGGCGCGCCAACCTTAATTAACCGGGAGCCCGCCTAATGAG CGGGCTTTTTTTTGCTCTTCACGAGACGTCG-3’ 17. azonosító számú szekvencia
Mindegyik szintetikus szekvenciát kettős szálúvá alakítottuk, és pCR-SriptCam™-vektorba klónoztunk (Stratagene), a gyártó utasításai szerint eljárva; a he- 55 lyes szekvenciát tartalmazó kiónokat ismert módszerekkel izoláltuk, öt (5) pg tisztított DNS-t 8 egység BsmBI-enzimmel emésztettünk, 55 °C-on, 20 μΙ reakcióelegyben, 100 pg/ml BSA-t tartalmazó 1xNEB4-pufferben. A reakcióelegyeket röviden centrifugáltuk, 60 azokhoz 20 pl desztillált H2O-ot, 0,4 pl dNTP-elegyet (Pharmacia®; amely az egyes dNTP-k 20 mmol/l koncentrációjú oldatát tartalmazta) és 0,25 pl klónozott pfu DNS-polimerázt (Stratagene®; 2,5 egység/μΙ) adtunk, majd a reakcióelegyet 20 percig, 65 °C-on inkubáltuk, a végek feltöltése céljából. A DNS-t ezután 3%-os „MetaPhor”™ agarózgéleken futtattuk (FMC, Rockland, Maine), 0,5xTrisz-acetát-EDTA- (TAE-) pufferben.
HU 224 827 Β1
A kazettának megfelelő csíkokat kivágtuk, és a DNS-t oly módon eluáltuk, hogy a gélt fagyasztottuk, és abból a puffért „Ultrafree™Probind” (Millipore Corp., Bedford, MA, USA) cserélhető betéten keresztül történő centrifugálással eltávolítottuk, majd „Pellet Paint”™ (Novagen) hordozóként történő alkalmazásával a DNS-t izopropanollal precipitáltuk. A DNS-t (cfVB1, cfVB2, cfVB3 és cfVB4) 70%-os etanollal mostuk, rövid ideig szárítottuk, és 25 μΙ Trisz-EDTA- (TE-) pufferben szuszpendáltuk.
ii) Az UpET-vektor előállítása
A pET21d-vektort (Novagen) Spal-enzimmel emésztettük, dGTP jelenlétében T4-DNS-polimerázzal kezeltük, majd szójabab-nukleázzal, DNS-polimeráz I Klenow-fragmensével kezeltük, végül újból ligáltuk. Különálló telepeket szűrtünk olyan plazmidok jelenlétére, amelyekben az eredetileg megtalálható Sapl-helyet megszüntettük. Ezt a DNS-t ezután Ncol- és BamHl-enzimekkel emésztettük, majd 5’-CATGTGAAGAGC-3’ (19. azonosító számú szekvencia) és 5’-GATCGCTCTTCA-3' (20. azonosító számú szekvencia) oligonukleotidokkal ligáltuk, hogy a vektorban egyedi Sapl-helyet hozzunk létre. Tisztított, igazoltan helyesen klónozott DNS-t Sápi- és Hindlll-enzimekkel hasítottunk, tompa végűvé alakítottunk, és foszfatázzal kezeltünk, a fent leírtak szerint, majd azt cfVB1-kazettával ligáltuk, transzformációval E. coli-sejtekbe juttattuk, és a sejteket LB-Amp lemezekre oltottuk. Az LB-Amp agarlemezekről steril pipettaheggyel telepeket csíptünk fel, és azokat „Coster Thermowell” lemezekre vittük át, 20 μΙ olyan „AmpliTaq®PCR” elegybe (Perkin-Elmer), amely az alábbi vektorspecifikus láncindító oligonukleotidok 1-1 pmol/l koncentrációjú oldatát tartalmazta: 5’-AGATCTCGATCCCGCGAA-3’ (előre láncindító oligonukleotid; 21. azonosító számú szekvencia) és 5'-ATCCGGATATAGTTCCTC-3’ vektorspecifikus láncindító oligonukleotid (22. azonosító számú szekvencia). A reakciókat 5 percig 94 °C-on hevítettük, majd „GeneAmp 9600” típusú automatizált fűtőblokkban amplifikáltuk, 30 cikluson át, a következő paraméterek szerint: 30 másodperc 94 °C-on; 1 perc 40 °C-on; és 2 perc 72 °C-on. Mindegyik reakció 10-10 μΙ térfogatú mintáját agarózgélen futtattuk. A kazetta orientációjának meghatározására 0,25 μΙ, megfelelő méretű PCR-terméket tartalmazó mintát, a vektorspecifikus reverz láncindító oligonukleotidot és a következő szekvenciájú kazettaspecifikus láncinditó oligonukleotidot tartalmazó friss reakcióelegyhez adtunk: 5-CGGGCTTTTTTTTGCTCTTCA-3’ (23. azonosító számú szekvencia). A reakciókat további 10 cikluson át amplifikáltuk, a fenti ismertetettek szerint eljárva. Az így kapott vektort ismert eljárásokkal szekvenáltuk, és azok egyikét UpET-klónnak neveztük el.
iii) UpET-HTh-vektor előállítása
Az UpET-vektort Sapl-enzimmel emésztettük, majd tompa végűvé alakítottuk, és a klónozást elősegítendő foszfatázzal kezeltük. Azt cfVB2-kazettával ligáltuk, transzformációval sejtekbe juttattuk, a kapott telepeket szűrtük, és a kiónokat szekvenáltuk, a cfVB1 -ligálásánál előzőekben már ismertetettek szerint.
iv) Az UpET-H-vektor előállítása
Az UpET-vektort Sapl-enzimmel emésztettük, majd tompa végűvé alakítottuk, és a klónozást elősegítendő foszfatázzal kezeltük. Azt cfVB3-kazettával ligáltuk, transzformációval sejtekbe juttattuk, a kapott telepeket szűrtük, és a kiónokat szekvenáltuk, a cfVB1-ligálásánál előzőekben már ismertetettek szerint.
v) Az UpET-Ubi-vektor előállítása
S. cerevisiae ubiquitint kódoló DNS-fragmenst „Ultma DNA polymerase” és megfelelő puffer (Perkin-EImer) alkalmazásával állítottunk elő, a következő összetételű reakcióelegyben: az egyes dNTP-k 40 pmol/l koncentrációja; az egyes láncindító oligonukleotidok pmol/l koncentrációja; [5’-CAGATTTTCGTCAAGACTT-3’ (Ubi-5p; 24. azonosító számú szekvencia) és 5’-ACCACCTCTTAGCCTTAG-3’ (Ubi-3p; 25. azonosító számú szekvencia)]; valamint 1,75 pg élesztő-DNS; a reakciót az alábbi paraméterek szerint végeztük: 2 perc 94 °C-on; majd 25 cikluson át, 1 perc 94 °C-on; 1 perc 40 °C-on; és 2 perc 72 °C-on; végül 7 perc 72 °C-on. PCR-fragmenst állítottunk elő 20 ng pET 15b-vektor (Novagen) alapján, a következő láncindító oligonukleotidok alkalmazásával: 5'-CATGGTATATCTCCTTCTT-3’ (pET3p-ATG; 26. azonosító számú szekvencia) és 5-TGAGCAATAACTAGCATAAC-3' (T7-RevTerm; 27. azonosító számú szekvencia); a reakciót az alábbi paraméterek szerint végeztük: 2 perc 94 °C-on; majd 10 cikluson át, 45 másodperc 94 °C-on; 1 perc 42 °C-on; és 15 perc 72 °C-on; végül 7 perc 72 °C-on. Az ubiquitin és pET15b-eredetű PCR-fragmenseket gélen tisztítottuk, majd azokat BRL T4-ligáz és megfelelő ligázpuffer alkalmazásával egymással ligáltuk. Ezt követően T7-promoter-ubiquitin (T7-ubiquitin) PCR-fragmenst állítottunk elő a fenti ligációs termék terápiáiként történő alkalmazásával, továbbá „Ultma DNA polymerase” enzim és az 5’-AGATCTCGATCCCGCGAA-3’ (pET5p; 28. azonosító számú szekvencia) és 25. azonosító számú szekvencia szerinti láncindító oligonukleotidok alkalmazásával, az alábbi paraméterek szerint: 2 perc 94 °C-on; majd 25 cikluson át, 30 másodperc 94 °C-on; 1 perc 42 °C-on; és 3 perc 72 °C-on; végül 7 perc 72 °C-on. A T7-promoter-ubiquitin PCR-fragmenst gélen tisztítottuk.
Érett humán stomelizint kódoló PCR-fragmenst állítottunk elő „Ultma DNA polymerase” enzim (lásd fent), az 5'-TTAGGTCTCAGGGGAGT-3’ láncindító oligonukleotid (Stom-3p; 29. azonosító számú szekvencia), az 5'-TTCAGAACCTTTCCTGGCA-3’ kinázkezelt láncindító oligonukleotid, valamint mintegy 20 ng templát [azaz pET3b-vektorba klónozott stomelizin (Novagen)] alkalmazásával, a következő paraméterek szerint:
perc 94 °C-on; majd 15 cikluson át, 1 perc 94 °C-on; 1 perc 44 °C-on; és 2 perc 72 °C-on; végül 7 perc 72 °C-on. A stomelizin PCR-reakció-elegyet (10 μΙ) 100 pmol/l, alábbi hibridizáltatott oligonukleotidokkal ligáltuk: 5’-AGCGGCGACGACGACAAG-3’ (Ek-Cut-5p;
31. azonosító számú szekvencia) és 5’-CTTGTCGTCGTCGTCGCCGCT-3’ (Ek-Cut-3p, amely egy enterokináz hasítási helyet kódol; 32. azonosító számú szekvencia), 40 μΙ, BRL-ligázt tartalmazó pufferben. Enterokináz felismerő helyet tartalmazó érett stomeli32
HU 224 827 Β1 zint (Ek-Stomelizint) kódoló PCR-fragmenst állítottunk elő a fenti ligációs elegy templátként történő alkalmazásával, a 29. azonosító számú szekvencia szerinti láncindító oligonukleotid és a 31. azonosító számú szekvencia szerinti kinázkezelt láncindító oligonukleotid jelenlétében, „Ultma DNA polymerase” enzim és megfelelő puffer alkalmazásával, a következő paraméterek szerint: 2 perc 94 °C-on; majd 10 cikluson át, 1 perc 94 °C-on; 1 perc 44 °C-on; és 1 perc 72 °C-on; végül 7 perc 72 °C-on. Az Ek-Stomelizin PCR-fragmenst gélen tisztítottuk.
A T7-ubiquitin és Ek-Stomelizin PCR-fragmenseket BRL-ligáz és megfelelő puffer alkalmazásával ligáltuk. Ezt követően T7-ubiquitin-Ek-Stomelizin PCR-fragmenseket állítottunk elő a fenti ligációs termék templátként történő alkalmazásával, „Ultma DNA polymerase” enzim és megfelelő puffer hozzáadásával, a 28. és 29. azonosító számú szekvencia szerinti láncindító oligonukleotidok jelenlétében, a következő paraméterek szerint: 2 perc 94 °C-on; majd 25 cikluson át, 30 másodperc 94 °C-on; 1 perc 42 °C-on; 6 perc 72 °C-on; végül 7 perc 72 °C-on.
PCR-fragmenseket állítottunk elő a stomelizin-pET3b-plazmidtemplát alapján, a 26. és 30. azonosító számú szekvencia szerinti láncindító oligonukleotidok felhasználásával, KlenTaq- (AB Peptides, St Louis, MO, USA) és pfu-DNS-polimerázok alkalmazásával, az alábbi paraméterek szerint: 2 perc 94 °C-on; majd 15 cikluson át, 30 másodperc 94 °C-on; 2 perc 42 °C-on; 20 perc 68 °C-on. Ezt a PCR-fragmenst T7-ubiquitin-Ek-Stomelizin PCR-fragmensekkel elegyítettük, és transzformációval BRL-DH5a jelzésű maximális mértékben kompetens sejtekbe („DH5a maximum efficiency competent cells) juttattuk. A megfelelő kiónokat úgy azonosítottuk, hogy plazmid-DNS-t izoláltunk, és azokat transzformációval BL21(DE3) jelzésű sejtekbe juttattuk, majd az expressziót a fent leírtak szerint vizsgáltuk.
A helyes szekvenciát tartalmazó T7-ubiquitin-Ek-Stomelizin expressziós plazmid alapján ubiquitin-Ek-t kódoló PCR-fragmenst állítottunk elő, a 24. és
32. azonosító számú szekvenciák szerinti láncindító oligonukleotidok és pfu-DNS-polimeráz alkalmazásával, a következő paraméterek szerint: 2 perc 94 °C-on; majd 20 cikluson át, 30 másodperc 94 °C-on; 1 perc 40 °C-on; 3 perc 72 °C-on; végül 7 perc 72 °C-on. A fragmenseket „Pharmacia S-400-HR” típusú centrifugálható oszlopon tisztítottuk, majd „Rapid DNA Ligation” reagenskészlet alkalmazásával a VBC1-kazettával ligáltuk. PCRfragmenst állítottunk elő a ligációs termék templátként történő alkalmazásával, a 24. azonosító számú szekvencia szerinti és az 5'-TGAAGAGCAAAAAAAAGCCCG-3’ szekvenciájú (33. azonosító számú szekvencia szerinti) láncindító oligonukleotid felhasználásával, pfu-DNS-polimeráz enzim alkalmazásával, a következő paraméterek szerint: 2 perc 94 °C-on; majd 20 cikluson át, 30 másodperc 94 °C-on; 1 perc 40 °C-on; 2 perc 72 °C-on; végül 7 perc 72 °C-on. A PCR-fragmenseket kinázzal kezeltük, és tompa végűvé alakított, a klónozást elősegítendő foszfatázzal kezelt Upet-H-fragmenssel ligáltuk.
A ligációs eleggyel kompetens sejteket transzformáltuk, majd telepeket a fent ismertetettek szerint,
PCR-eljárással szűrtünk. Plazmid-DNS-t szekvenáltunk, és helyes UpET-Ubi-klónokat azonosítottunk.
A szekvenciák rövid ismertetése:
1. azonosító számú szekvencia: a humán plazminogén aminosavszekvenciája,
2. azonosító számú szekvencia: „előre láncindító kringle-5-fragmenst kódoló cDNS-molekulák előállításához,
3. azonosító számú szekvencia: „előre” láncindító kringle-5-fragmenst kódoló cDNS-molekulák előállításához,
4. azonosító számú szekvencia: „hátra” láncindító kringle-5-fragmenst kódoló cDNS-molekulák előállításához,
5. azonosító számú szekvencia: „hátra” láncindító kringle-5-fragmenst kódoló cDNS-molekulák előállításához,
7. azonosító számú szekvencia: pHil-S1-vektor 509-530. nukleotidjainak megfelelő „előre” láncindító oligonukleotid pHil-D8-vektor előállításához,
8. azonosító számú szekvencia: propeptidszekvenciát (a 9. azonosító számú szekvencia szerinti 67-108. nukleotidok) kódoló nukleotidszekvenciájú „hátra” láncindító oligonukleotid pHil-D8-vektor előállításához,
9. azonosító számú szekvencia: szintetikus vezetőszekvencia a pHil-D8 jelzésű expressziós vektornak a pHil-D2-vektorból (Invitrogen) történő előállításához,
10. azonosító számú szekvencia: „előre” láncindító oligonukleotid a K4-5A-fragmens előállításához,
11. azonosító számú szekvencia: „előre” láncindító oligonukleotid a K5A-fragmens előállításához,
12. azonosító számú szekvencia: humán eredetű plazminogén DNS-szekvenciája,
13. azonosító számú szekvencia: „hátra” láncindító oligonukleotid a K4-5A-fragmens és a K5A-fragmens előállításához,
14. azonosító számú szekvencia: a synVBI szekvenciája,
15. azonosító számú szekvencia: a synVB2 szekvenciája,
16. azonosító számú szekvencia: a synVB3 szekvenciája,
17. azonosító számú szekvencia: a synVB4 szekvenciája,
19. azonosító számú szekvencia: oligonukleotid Sapl-hely kialakításához ligálással,
20. azonosító számú szekvencia: oligonukleotid Sapl-hely kialakításához ligálással,
21. azonosító számú szekvencia: vektorspecifikus előre láncindító oligonukleotid UpET-vektor előállításához,
22. azonosító számú szekvencia: vektorspecifikus „hátra” láncindító oligonukleotid UpET-vektor előállításához,
23. azonosító számú szekvencia: kazettaspecifikus „előre” láncindító oligonukleotid UpET-vektor előállításához,
HU 224 827 Β1
24. azonosító számú szekvencia: Ubi-5p láncindító oligonukleotid S. cerevisiae ubiquitint kódoló DNS-fragmens előállításához,
25. azonosító számú szekvencia: Ubi-3p láncindító oligonukleotid S. cerevisiae ubiquitint kódoló DNS-fragmens előállításához,
26. azonosító számú szekvencia: pET3p-ATG láncindító oligonukleotid pET15b-vektor- (Novagen) eredetű PCR-fragmens előállításához,
27. azonosító számú szekvencia: T7-RevTerm láncindító oligonukleotid pET15b-vektor- (Novagen) eredetű PCR-fragmens előállításához,
28. azonosító számú szekvencia: pET5p láncindító oligonukleotid T7-promoter-ubiquitin PCR-fragmens előállításához UpET-Ubi-vektor előállítása során,
29. azonosító számú szekvencia: Stom-3p oligonukleotid érett humán stomelizint kódoló PCR-fragmens előállításához, pET3b-vektorba klónozott stomelizinből kiindulva (Novagen),
30. azonosító számú szekvencia: kinázkezelt láncindító oligonukleotid érett humán stomelizint kódoló PCR-fragmens előállításához,
31. azonosító számú szekvencia: Ek-Cut-5p oligonukleotid Ek-Stomelizin PCR-fragmens előállításához ligálással,
32. azonosító számú szekvencia: Ek-Cut-3p oligonukleotid, amely egy enterokináz hasítási helyet kódol, Ek-Stomelizin PCR-fragmens előállításához ligálással,
33. azonosító számú szekvencia: láncindító oligonukleotid PCR-fragmens állításához a 24. azonosító számú szekvencia felhasználásával, Upet-H-fragmenssel történő ligáláshoz a UpET-Ubi-vektor előállítása érdekében,
34. azonosító számú szekvencia: humán kringle-5régió aminosavszekvenciája,
35. azonosító számú szekvencia: egéreredetű kringle-5-régió aminosavszekvenciája,
36. azonosító számú szekvencia: rhesusmajomeredetű kringle-5-régió aminosavszekvenciája,
37. azonosító számú szekvencia: szarvasmarhaeredetű kringle-5-régió aminosavszekvenciája,
38. azonosító számú szekvencia: sertéseredetű kringle-5-régió aminosavszekvenciája.

Claims (27)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Az (I) általános képletű vegyület
    A-B-C-X-Y (I) vagy annak gyógyászatilag elfogadható sója vagy észtere, ahol a képletben:
    A hiányzik vagy jelentése nitrogén-védőcsoport;
    Y adott esetben hiányzik vagy jelentése karboxilsav-védőcsoport; és
    B-C-X jelentése az alábbi, 1. azonosító számú szekvencia alábbi elhelyezkedésű aminosavai által meghatározott szekvenciák bármelyike:
    az 1. azonosító számú szekvencia (a) 355-543. aminosavainak szekvenciájával megegyező szekvencia;
    (b) 355-546. aminosavainak szekvenciájával megegyező szekvencia;
    (c) 443-543. aminosavainak szekvenciájával megegyező szekvencia;
    (d) 449-543. aminosavainak szekvenciájával megegyező szekvencia;
    (e) 454-543. aminosavainak szekvenciájával megegyező szekvencia;
    (f) 443-546. aminosavainak szekvenciájával megegyező szekvencia;
    (g) 449-546. aminosavainak szekvenciájával megegyező szekvencia;
    (h) 454-546. aminosavainak szekvenciájával megegyező szekvencia;
    (i) 525-535. aminosavainak szekvenciájával megegyező szekvencia;
    (j) 529-535. aminosavainak szekvenciájával megegyező szekvencia;
    (k) 530-535. aminosavainak szekvenciájával megegyező szekvencia;
    (l) 529-534. aminosavainak szekvenciájával megegyező szekvencia;
    (m) 530-534. aminosavainak szekvenciájával megegyező szekvencia; vagy (n) 450-543. aminosavainak szekvenciájával megegyező szekvencia.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti vegyület, amelynek képletében A jelentése NAc, Y jelentése pedig -NH2.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti vegyület, amelynek endotélsejtmigráció-gátlási ED50-értéke 100 és 500 pmol/l között van.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti vegyület, amelynek endotélsejtproliferáció-gátlási ED50-értéke 100 és 500 pmol/l között van.
  5. 5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti vegyület alkalmazása antiangiogenezisterápiára szoruló beteg kóros állapotának kezelésére alkalmas gyógyszer előállítására.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti alkalmazás, kóros állapotként rák, ízületi gyulladás, sárgafolt-degeneráció vagy diabéteszes retinakárosodás kezelésére alkalmas gyógyszer előállítására.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti alkalmazás, kóros állapotként rák kezelésére alkalmas gyógyszer előállítására.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti alkalmazás, rákos állapotként elsődleges vagy metasztázisos szolid tumor, karcinóma, szarkóma, limfóma, pszoriázis vagy hemangióma kezelésére.
  9. 9. Készítmény, amely 1. igénypont szerinti vegyületet és gyógyászatilag elfogadható kötőanyagot tartalmaz.
  10. 10. Készítmény, amely 1. igénypont szerinti vegyületet kódoló, izolált egyes vagy kettős szálú polinukleotidszekvenciát tartalmaz.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti készítmény, amelyben a nukleotidszekvencia DNS-szekvencia.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti készítmény, amelyben a DNS-szekvencia az alábbi aminosavszekvenciák bármelyikét kódolja:
    (a) az 1. azonosító számú szekvencia 443-543. aminosavainak szekvenciájával megegyező szekvencia;
    HU 224 827 Β1 (b) az 1. azonosító számú szekvencia 449-543. aminosavainak szekvenciájával megegyező szekvencia;
    (c) az 1. azonosító számú szekvencia 454-543. aminosavainak szekvenciájával megegyező szekvencia;
    (d) az 1. azonosító számú szekvencia 355-543. aminosavainak szekvenciájával megegyező szekvencia.
  13. 13. A 10. igénypont szerinti készítmény, amely 34., 35., 36. vagy 37. azonosító számú aminosavszekvenciát kódoló polinukleotidszekvenciát tartalmaz.
  14. 14. Emberbe vagy embertől különböző állatban beültethető sejt, amely 1. igénypont szerinti vegyületet kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó vektort tartalmaz.
  15. 15. Eljárás 1. igénypont szerinti vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) emlősplazminogént elasztázzal érintkeztetünk, ezáltal plazminogén és elasztáz mintegy 1:100-1:300 arányú elegyét hozzuk létre;
    (b) a fenti elegyet inkubáljuk; és (c) a vegyületet izoláljuk az elegyből.
  16. 16. Izolált egyes vagy kettős szálú polinukleotid, amely 1. igénypont szerinti vegyületet kódol, angiogenezisinhibitorként való alkalmazásra.
  17. 17. A 16. igénypont szerinti polinukleotid, amely DNS-molekula.
  18. 18. A 16. igénypont szerinti polinukleotid, amely RNS-molekula.
  19. 19. Vektor, amely 1. igénypont szerinti vegyületet kódoló polinukleotidot tartalmaz, angiogenezisinhibitorként való alkalmazásra.
  20. 20. A 19. igénypont szerinti vektor, amely expressziós vektor.
  21. 21. A 20. igénypont szerinti vektor, amely pHil-D8vektor, pET32a-vektor, pGEX-4T-2-vektor, Up-ETvektor vagy pCYB3-vektor.
  22. 22. Gazdasejt, amely a 20. igénypont szerinti vektorral transzformált.
  23. 23. A 22. igénypont szerinti vektor, amellyel eukarióta sejt lett transzformálva.
  24. 24. A 23. igénypont szerinti vektor, amellyel Pichia pastoris fajhoz tartozó eukarióta sejt lett transzformálva.
  25. 25. A 22. igénypont szerinti vektor, amellyel E. coli prokarióta gazdasejt lett transzformálva.
  26. 26. Eljárás 1. igénypont szerinti, oldható vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) a vegyületet kódoló polinukleotidot izolálunk, (b) a polinukleotidot expressziós vektorba klónozzuk, (c) a vektort megfelelő gazdasejtbe transzformáljuk, (d) a gazdasejtet szaporítjuk, miáltal a vegyületet expresszáltatjuk.
  27. 27. Vegyület, amelynek képlete:
    (a) A-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-Ι-Τyr-Y;
    (b) A-Pro-Arg-Lys-Leu-3-l-Tyr-Asp-Tyr-Y;
    (c) A-Pro-Glu-Lys-Arg-Tyr-Asp-Tyr-Y; vagy (d) A-GIn-Asp-Trp-Ala-Ala-GIn-Glu-Pro-His-ArgHis-Ser-lle-Phe-Thr-Pro-Glu-Thr-Asn-Pro-ArgAla-Gly-Leu-Glu-Lys-Asn-Tyr-Y, ahol
    A hiányzik vagy jelentése nitrogén-védőcsoport, és Y hiányzik vagy jelentése karboxilsav-védőcsoport.
HU9903530A 1996-05-03 1997-05-05 Új antiangiogén peptidek, azokat kódoló polinukleotidok, és eljárások angiogenezis gátlására HU224827B1 (hu)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/643,219 US5801146A (en) 1996-05-03 1996-05-03 Compound and method for inhibiting angiogenesis
US08/832,087 US5981484A (en) 1996-05-03 1997-04-03 Antiangiogenic peptides and methods for inhibiting angiogenesis
PCT/US1997/007700 WO1997041824A2 (en) 1996-05-03 1997-05-05 Antiangiogenic peptides derived from plasminogen

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP9903530A2 HUP9903530A2 (hu) 2000-02-28
HUP9903530A3 HUP9903530A3 (en) 2001-12-28
HU224827B1 true HU224827B1 (hu) 2006-02-28

Family

ID=27094211

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9903530A HU224827B1 (hu) 1996-05-03 1997-05-05 Új antiangiogén peptidek, azokat kódoló polinukleotidok, és eljárások angiogenezis gátlására

Country Status (16)

Country Link
US (3) US6057122A (hu)
EP (2) EP0910571B1 (hu)
JP (1) JP4426650B2 (hu)
CN (1) CN1152962C (hu)
AT (1) ATE299888T1 (hu)
AU (1) AU724077B2 (hu)
BR (1) BR9708911A (hu)
CZ (1) CZ298260B6 (hu)
DE (1) DE69733756T2 (hu)
DK (1) DK0910571T3 (hu)
ES (1) ES2246513T3 (hu)
HK (1) HK1021191A1 (hu)
HU (1) HU224827B1 (hu)
IL (1) IL126626A0 (hu)
NZ (1) NZ332319A (hu)
WO (1) WO1997041824A2 (hu)

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5837682A (en) 1996-03-08 1998-11-17 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
US5945403A (en) * 1997-05-30 1999-08-31 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
US6346510B1 (en) 1995-10-23 2002-02-12 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic endostatin compositions
US5801012A (en) 1996-09-17 1998-09-01 Northwestern University Methods and compositions for generating angiostatin
EP1001985A1 (en) * 1997-06-26 2000-05-24 Karolinska Innovations AB Kringle domains 1-5 of plasminogen, capable of modulating angiogenesis in vivo
AU1598599A (en) * 1997-11-20 1999-06-15 Genetix Pharmaceuticals, Inc. Anti-angiogenic gene therapy vectors and their use in treating angiogenesis-related diseases
US6797488B1 (en) * 1997-12-08 2004-09-28 Beth Israel Deaconess Medical Center Methods of producing anti-angiogenic proteins
PT1047771E (pt) * 1998-01-12 2003-08-29 Searle & Co Metodo para renaturacao de angiostatina
NZ507912A (en) * 1998-05-22 2002-10-25 Abbott Lab Nonapeptide antiangiogenic drugs
US6632961B1 (en) 1998-05-22 2003-10-14 Abbott Laboratories Antiangiogenic drug to treat cancer, arthritis and retinopathy
CA2332772A1 (en) * 1998-05-22 1999-12-02 Jack Henkin Antiangiogenic drug to treat cancer, arthritis and retinopathy
US6774211B1 (en) 1998-05-22 2004-08-10 Abbott Laboratories Peptide antiangiogenic drugs
US6716963B1 (en) 1998-05-22 2004-04-06 Abbott Laboratories Peptide antiangiogenic drugs
AU3959499A (en) 1998-05-28 1999-12-13 Korea Green Cross Corporation Process of purifying angiogenesis inhibitors
CA2337231A1 (en) * 1998-07-14 2000-01-27 Bristol-Myers Squibb Company Lysine binding fragments of angiostatin
US7317003B2 (en) 1998-09-04 2008-01-08 National University Of Singapore Small peptides having anti-angiogenic and endothelial cell inhibition activity
KR20000018933A (ko) * 1998-09-07 2000-04-06 김승수 내피세포 성장억제 활성을 가지는 사람 프로트롬빈 크링글단백질 및 이를 암호하는 유전자
US9669113B1 (en) 1998-12-24 2017-06-06 Devicor Medical Products, Inc. Device and method for safe location and marking of a biopsy cavity
US6356782B1 (en) 1998-12-24 2002-03-12 Vivant Medical, Inc. Subcutaneous cavity marking device and method
US6371904B1 (en) * 1998-12-24 2002-04-16 Vivant Medical, Inc. Subcutaneous cavity marking device and method
US6465424B1 (en) * 1999-02-17 2002-10-15 Bristol-Myers Squibb Company Anti-angiogenic agent and method for inhibiting angiogenesis
US7144854B1 (en) * 1999-09-10 2006-12-05 Conjuchem, Inc. Long lasting anti-angiogenic peptides
CA2373252C (en) * 1999-05-17 2007-08-07 Conjuchem Inc. Long lasting anti-angiogenic peptides
DK1180121T3 (da) * 1999-05-17 2004-03-01 Conjuchem Inc Langtidsvirkende insulinotrope peptider
SG87828A1 (en) * 1999-09-03 2002-04-16 Univ Singapore Small peptides having potent anti-angiogenic activity
US6576610B1 (en) * 1999-10-04 2003-06-10 Nuvas, Llc Use of a context-dependent functional entity to enhance the efficacy of an agent
US6777535B1 (en) 1999-11-22 2004-08-17 Abbott Laboratories N-alkylated peptides having antiangiogenic activity
US6753408B1 (en) 1999-11-22 2004-06-22 Fortuna Haviv Peptides having antiangiogenic activity
CO5261544A1 (es) * 1999-11-22 2003-03-31 Abbott Lab Peptidos n-alquilados que tienen actividad antiangiogenica
US6485740B1 (en) * 2000-03-14 2002-11-26 Yutoku Pharmaceutical Ind., Co., Ltd. Transdermal methotrexate preparations
DE60138465D1 (de) 2000-07-12 2009-06-04 Agensys Inc Neues tumor antigen das für diagnose und therapie von blasen-, eierstock-, lungen- und nierenkrebs verwendet werden kann
AU8591901A (en) 2000-09-05 2002-03-22 Karolinska Innovations Ab Materials and methods relating to endothelial cell growth inhibitors
AR030631A1 (es) * 2000-09-29 2003-08-27 Abbott Lab Polipeptidos antiangiogenicos y metodos para inhibir la angiogenesis
US20020159992A1 (en) * 2000-09-29 2002-10-31 Jack Henkin Antiangiogenic polypeptides and methods for inhibiting angiogenesis
US7420036B2 (en) 2000-11-28 2008-09-02 Waisman David M Anti-angiogenic polypeptides
JP4280496B2 (ja) * 2000-12-19 2009-06-17 リサーチ ディベロップメント ファンデーション レンチウイルス・ベクター媒介遺伝子導入及びその使用
AR038957A1 (es) * 2001-08-15 2005-02-02 Pharmacia Corp Terapia de combinacion para el tratamiento del cancer
US20030050273A1 (en) * 2001-08-29 2003-03-13 Keiya Ozawa Compositions and methods for treating neurodegenerative diseases
US20040132644A1 (en) * 2001-10-16 2004-07-08 The Procter & Gamble Company Composition and method for treating diabetes
WO2004054517A2 (en) * 2002-12-13 2004-07-01 Mediomics, Llc Compositions and methods for inhibiting tumor growth and metastasis
US20050053993A1 (en) * 2002-12-18 2005-03-10 Davidson Donald J. Uses of an endothelial cell receptor
AU2004261459B2 (en) 2003-07-22 2008-06-26 Astex Therapeutics Limited 3, 4-disubstituted 1H-pyrazole compounds and their use as cyclin dependent kinases (CDK) and glycogen synthase kinase-3 (GSK-3) modulators
US20050250694A1 (en) * 2003-10-10 2005-11-10 Ma Jian-Xing Compounds useful in inhibiting vascular leakage, inflammation and fibrosis and methods of making and using same
MXPA04005080A (es) * 2004-05-27 2005-11-30 Aspid S A De C V Una composicion moduladora de la inflamacion articular cronica a base de colagena-polivinilpirrolidona.
TWI285647B (en) * 2004-08-20 2007-08-21 Univ Nat Chunghsing Prevention, treatment and detection of porcine progressive atrophic rhinitis
US8404718B2 (en) 2005-01-21 2013-03-26 Astex Therapeutics Limited Combinations of pyrazole kinase inhibitors
AR054425A1 (es) 2005-01-21 2007-06-27 Astex Therapeutics Ltd Sales de adicion de piperidin 4-il- amida de acido 4-(2,6-dicloro-benzoilamino) 1h-pirazol-3-carboxilico.
AU2006207325B2 (en) * 2005-01-21 2012-08-16 Astex Therapeutics Limited Pharmaceutical compounds
AU2006350707A1 (en) 2006-11-08 2008-05-15 Chongxi Yu Transdermal delivery systems of peptides and related compounds
US20080287341A1 (en) * 2007-05-18 2008-11-20 Danyang Chen Treatment of vascular abnormalities using nanoparticles
US8933031B2 (en) 2008-02-04 2015-01-13 Shanghai First People's Hospital Polypeptide inhibiting angiogenesis and application thereof
EP2427475B1 (en) 2009-05-08 2020-11-04 Techfields Biochem Co., Ltd. High penetration prodrug compositions of peptides and peptide-related compounds
EP2435562A1 (en) 2009-05-26 2012-04-04 Biolex Therapeutics, Inc. Compositions and methods for production of aglycosylated plasminogen
CN102482338B (zh) * 2009-07-10 2016-09-28 斯路姆基因公司 纤溶酶原和纤溶酶的变体
KR20140015289A (ko) 2011-01-05 2014-02-06 쓰롬보제닉스 엔.브이. 플라스미노겐 및 플라스민 변이체
CN103764163A (zh) 2011-08-12 2014-04-30 斯路姆基因公司 纤溶酶原和纤溶酶变体
KR101676690B1 (ko) 2015-08-04 2016-11-16 (주) 에빅스젠 Vegf 유도-혈관신생 억제효과를 갖는 테트라펩티드 및 이의 용도
KR101644440B1 (ko) * 2015-12-10 2016-08-01 (주) 에빅스젠 개선된 혈관신생 억제용 펩티드와 이를 유효성분으로 함유하는 혈관신생과 관련된 질환의 예방 및 치료용 조성물
US10874721B2 (en) 2015-12-18 2020-12-29 Talengen International Limited Method for preventing and treating cervical erosion
CN108463236A (zh) * 2015-12-18 2018-08-28 泰伦基国际有限公司 一种预防或治疗放射性和化学性损伤的方法
JP7313058B2 (ja) 2016-12-15 2023-07-24 タレンゲン インターナショナル リミテッド 組織器官の繊維化を予防及び治療するための方法
CN111344004A (zh) 2017-06-19 2020-06-26 泰伦基国际有限公司 一种调控glp-1/glp-1r 的方法和药物
JP6651493B2 (ja) * 2017-12-05 2020-02-19 チョンシー ユー ペプチド及び関連化合物の経皮送達システム

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3719667A (en) 1970-08-24 1973-03-06 Lilly Co Eli Epimerization of 6-acylamido and 6-imido penicillin sulfoxide esters
US3840556A (en) 1971-05-28 1974-10-08 Lilly Co Eli Penicillin conversion by halogen electrophiles and anti-bacterials derived thereby
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
GB9019120D0 (en) * 1990-09-01 1990-10-17 Beecham Group Plc Novel compounds
US5288489A (en) * 1991-08-28 1994-02-22 Orion Therapeutic Systems, Inc. Fibrinolysis and fibrinogenolysis treatment
US5512591A (en) * 1993-02-18 1996-04-30 President And Fellows Of Harvard College Treatments for diseases characterized by neovascularization
AU2355895A (en) * 1994-04-26 1995-11-16 Pharmacia & Upjohn Company Mac-1 i-domain protein useful in blocking adhesion and migration of neutrophils
CN1636594B (zh) * 1994-04-26 2012-08-29 儿童医学中心公司 血管生成抑制素和用于抑制血管生成的方法
US5854221A (en) * 1996-12-12 1998-12-29 The Children's Medical Center Corporation Endothelial cell proliferation inhibitor and method of use
CZ298612B6 (cs) * 1995-12-13 2007-11-21 The Children's Medical Center Corporation Inhibitor proliferace endothelových bunek a jeho použití

Also Published As

Publication number Publication date
BR9708911A (pt) 1999-08-03
DK0910571T3 (da) 2005-10-31
EP0910571B1 (en) 2005-07-20
US6057122A (en) 2000-05-02
WO1997041824A2 (en) 1997-11-13
EP0910571A2 (en) 1999-04-28
DE69733756T2 (de) 2006-06-01
CN1223690A (zh) 1999-07-21
ES2246513T3 (es) 2006-02-16
HUP9903530A2 (hu) 2000-02-28
AU724077B2 (en) 2000-09-14
AU3060697A (en) 1997-11-26
NZ332319A (en) 2000-09-29
CZ298260B6 (cs) 2007-08-08
WO1997041824A3 (en) 1998-01-08
EP1612272B1 (en) 2011-06-22
CN1152962C (zh) 2004-06-09
HK1021191A1 (en) 2000-06-02
US6251867B1 (en) 2001-06-26
EP1612272A3 (en) 2007-05-02
JP2002502235A (ja) 2002-01-22
JP4426650B2 (ja) 2010-03-03
US5972896A (en) 1999-10-26
IL126626A0 (en) 1999-08-17
CZ342698A3 (cs) 1999-05-12
ATE299888T1 (de) 2005-08-15
DE69733756D1 (de) 2005-08-25
HUP9903530A3 (en) 2001-12-28
EP1612272A2 (en) 2006-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU224827B1 (hu) Új antiangiogén peptidek, azokat kódoló polinukleotidok, és eljárások angiogenezis gátlására
JP4722989B2 (ja) 新規な抗血管形成ペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、および血管形成を阻害する方法
JPH11503901A (ja) インターロイキン−１β転換酵素様アポトーシスプロテアーゼ−３および４
US6617145B2 (en) DNA molecules encoding fibrinolytically active polypeptide
JPH1169981A (ja) Ａｓｐ１
US6350448B1 (en) Human prostate-associated protease
US7495068B2 (en) Antiangiogenic peptides, polypeptides encoding same and methods for inhibiting angiogenesis
CA2255661C (en) Antiangiogenic drug to treat cancer, arthritis and retinopathy
US5948669A (en) Rat cathepsin K polynucleotide and polypeptide sequence
CA2343720A1 (en) Novel antibodies, drugs containing these antibodies and methods for screening compounds by using these antibodies
KR100506571B1 (ko) 플라스미노겐으로부터유래된맥관형성억제펩타이드
EP1069188A1 (en) Three neprilysin-like membrane metallopeptidases
JP2002186492A (ja) ヒトｒｃｅ１
EP0881294A2 (en) HOEFCC11, a HAS2 splicing variant
US6030791A (en) Antibody for a homolog of rat elastase IV derived from human pancreas

Legal Events

Date Code Title Description
GB9A Succession in title

Owner name: THE CHILDREN'S MEDICAL CENTER CORPORATION, US

Free format text: FORMER OWNER(S): ABBOTT LABORATORIES, US; ABBOTT LABORATORIES, US

Owner name: ABBVIE INC., US

Free format text: FORMER OWNER(S): ABBOTT LABORATORIES, US; ABBOTT LABORATORIES, US

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees