ES2203668T3 - Variantes de glicosilacion del activador de plasminogeno de tejido con propiedades terapeuticas mejoradas. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A VARIANTES (T-PA) DEL ACTIVADOR DE PLASMINOGENO DE TEJIDO QUE SE GLICOSILATAN EN CUALQUIERA DE LAS POSICIONES 103-105, Y SE DESPOJAN DE LA ESTRUCTURA DE CARBOHIDRATO FUNCIONAL EN LA POSICION 117 DE LA SECUENCIA DE ACIDO AMINO T-PA HUMANO DE TIPO NATURAL. LAS VARIANTES TIENEN UNA VIDA MEDIA PROLONGADA EN LA CIRCULACION Y MANTIENEN BASICAMENTE EL ENLACE DE FIBRINA, O UNA MEJOR POTENCIA FIBRINOLITICA IN VIVO, EN COMPARACION CON EL T-PA HUMANO DE TIPO NATURAL.

Description

Variantes de glicosilación del activador de plasminógeno de tejido con propiedades terapéuticas mejoradas.

Antecedentes de la invención I. Campo de la invención

La presente invención se refiere a variantes del activador de plasminógeno de tejidos (t-PA) que tienen una vida media en circulación prolongada, en comparación con la t-PA humano tipo salvaje, a la vez que mantienen su afinidad de unión a la fibrina. Algunas variantes muestran además una mejora de la potencia fibrinolítica in vivo. La invención también se refiere a procedimientos y medios para la preparación de estas variantes y a composiciones farmacéuticas que las comprenden.

II. Descripción de los antecedentes y materias relacionadas

El activador del plasminógeno de tejidos (t-PA) es una serina proteasa de dominio múltiple cuyo papel fisiológico es convertir el plasminógeno en plasmina y así iniciar o acelerar el proceso de fibrinolisis.

Inicialmente, el interés clínico del t-PA era debido a su alta actividad relativa en presencia, en comparación con la ausencia, de fibrina. El t-PA tipo salvaje es una enzima pobre en ausencia de fibrina, pero la presencia de fibrina aumenta extraordinariamente su capacidad para activar el plasminógeno. Sin estimulación, la eficiencia catalítica (constante de velocidad catalítica (K_{cat}) / constante de Michaelis (k_{m}) del t-PA de melanoma o recombinante humano (Activasa® t-PA) para la activación de plasminógeno es de aproximadamente 1 nM^{-1}sec^{-1}, mientras que en presencia de fibrina o de productos de degradación de la fibrina, esta eficiencia (constante de pseudo-velocidad) aumenta varios cientos de veces. Se considera que esta inusual propiedad bioquímica del t-PA se traduce clínicamente en un producto trombolítico que tiene una probabilidad menor que los trombolíticos no específicos de fibrina (estreptoquinasa o uroquinasa) de inducir una activación de plasminógeno sistémica [Sobel B. E. y col; Circulation 69, 983-990 (1984)]. El t-PA humano recombinante se utiliza terapéuticamente como agente fibrinolítico en el tratamiento de infarto de miocardio agudo y de la embolia pulmonar, afecciones que se suelen dar como consecuencia de la obstrucción de un vaso sanguíneo con un trombo que contiene fibrina.

Además de su notable especificidad por la fibrina, el t-PA muestra varias características distintivas:

a) El t-PA se distingue de la mayoría de las serina proteasas en que la forma de cadena sencilla de la molécula tiene una actividad enzimática apreciable. El t-PA de dos cadenas tiene una actividad mayor que el de una cadena cuando se dirige hacia algunos substratos pequeños y hacia plasminógeno en ausencia de fibrina. Sin embargo, en presencia de fibrina las dos formas del t-PA son igualmente activas [Rijken y col; J. Biol Chem. 257, 2920-5 (1982); Lijnen y col; Thromb. Haemost. 64, 61-8 (1990); Bennett y col.; J. Biol. Chem. 266, 5191-5201 (1991)]. La mayoría de las otras serina proteasas existen como zimógenos y requieren un corte proteolítico en la forma de dos cadenas para alcanzar una actividad enzimática total.

b) La serpina PAI-1 puede inhibir la acción del t-PA in vivo e in vitro [Vaughan, D. E. y col; J. Clin. Invest. 84, 586-591 (1989); Wiman, B. y col; J. Biol. Chem. 259, 3644-3647 (1984)].

c) El t-PA se une a la fibrina in vitro con una Kd en el rango \muM.

d) El t-PA tiene una eliminación in vivo rápida la cual es mediada por uno o más receptores en el hígado [Nilsson, S y col; Thromb. Res. 39, 511-521 (1985); Bugelski, P. J. y col; Throm. Res, 53, 287-303 (1989); Morton, P. A. y col; J. Biol. Chem, 264, 7228-7235 (1989)].

Collen y col. fueron los que obtuvieron por primera vez una forma del t-PA substancialmente pura a partir de una fuente natural y la probaron para determinar su actividad in vivo; la patente de los EE.UU número 4.752.603 publicada el 21 de junio de 1988 (véase también Rijken y col; J. Biol. Chem; 256: 7035 [1981]). Pennica y col. (Nature, 301: 214 [1983]) determinaron la secuencia de ADN del t-PA y dedujeron la secuencia de aminoácidos a partir de esta secuencia de ADN (ver la patente de los EE.UU número 4.766.075 publicada el 23 de agosto de 1988).

El t-PA humano tipo salvaje tiene sitios de glicosilación potenciales asociados a N en las posiciones de aminoácidos 117, 184, 218 y 448. Se ha documentado que el t-PA humano recombinante (Activase® t-PA) producido mediante su expresión en células CHO contenía aproximadamente un 7% en peso de carbohidratos, consistentes en un oligosacárido rico en manosa en la posición 117 y oligosacáridos complejos en Asn-184 y Asn-448 [Vehar, G. A. y col; " Estudio de caracterización del activador del plasminógeno de tejido humano producido mediante la tecnología del ADN recombinante" Simposio de Cold Spring Harbor en Biología Cuantitativa, 1986; LI: 551-562]. En el t-PA nativo, la posición 218 no se encuentra glicosilada. Los sitios 117 y 448 parecen estar siempre glicosilados, mientras que se considera que el sitio 184 está glicosilado en un cincuenta por ciento de las moléculas. Las moléculas de t-PA que están glicosiladas en la posición 184 se denominan t-PA de Tipo I y las moléculas que no están glicosiladas en la posición 184 se denominan t-PA de Tipo II. Spellman y col; J. Biol. Chem. 264 (24) 14100-14111 (1989), realizaron el análisis más exhaustivo de las estructuras de los carbohidratos del t-PA humano derivado de las células CHO, mostrando que en una proteína se podían detectar al menos 17 estructuras de carbohidratos diferentes asociadas a Asn. Éstas comprenden desde estructuras ricas en manosa en la posición 117 hasta estructuras del tipo de la di, tri y tetra-antenari N-acetilactosamina en las posiciones 184 y 448. Se ha documentado que los t-PAs tipo I y II estaban N-glicosilados de idéntico modo en las posiciones Asn-117 y Asn-448 cuando provenían de la misma línea celular. Para obtener más detalles ver también Parekh, Raj. B. y col; Biochemistry 28, 7644-7662 (1989).

Mediante el análisis de la secuencia del t-PA se han identificado cinco dominios en la molécula. Cada dominio ha sido definido en referencia a regiones homólogas, estructurales o funcionales, de otras proteínas tales como la tripsina, quimiotripsina, plasminógeno, protrombina, fibronectina y factor de crecimiento epidérmico (EGF). Estos dominios han sido designados, empezando por el extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos del t-PA, como el dominio en dedo (F) que va desde el aminoácido 1 hasta el 44, el dominio del factor de crecimiento (G) que va, aproximadamente, desde el aminoácido 45 al 91 (basado en la homología con EGF), el dominio kringle-1 (K1) que abarca, más o menos, desde el aminoácido 92 al 173, el dominio kringle-2 (K2) que abarca, aproximadamente, desde el aminoácido 180 al 261 y el dominio serina proteasa (P) que abarca desde el aminoácido 264 hasta el extremo carboxiterminal en el aminoácido 527. Estos dominios se encuentran situados básicamente unos junto a otros y están conectados por regiones "de unión" cortas. Estas regiones de unión completan el número total de aminoácidos del polipéptido maduro, 527, aunque se suelen encontrar en el extremo aminoterminal tres residuos adicionales (Gly-Ala-Arg). En general, se piensa que este triplete adicional es el resultado de un procesamiento incompleto del precursor y no se le conoce ninguna función. El t-PA puede ser cortado entre las posiciones 275 y 276 (situadas en el dominio serina proteasa) para generar la forma en dos cadenas de la molécula.

Cada dominio contribuye de un modo diferente al conjunto de las propiedades biológicamente significativas de la molécula del t-PA. Estudios de eliminación de dominios muestran que la pérdida del dominio en dedo, del dominio del factor de crecimiento o del dominio kringle-2 da lugar a una disminución de la afinidad de unión del variante del t-PA por la fibrina [Van Zonneveld, A. J. y col; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4670-4677 (1986); Verheijen, J. H. y col; EMBO J. 5, 3525-30 (1986), sin embargo, resultados más recientes obtenidos con mutantes de substitución indican que el dominio kringle-2 está menos implicado en la unión a fibrina de lo que se creía anteriormente [Bennett, W.F. y col; J. Biol. Chem. 266 5191-5201 (1991)]. Los estudios de eliminación de dominios han implicado al dominio en dedo y al dominio del factor de crecimiento epidérmico en la eliminación llevada a cabo por el hígado [Collen y col; Blood 71, 216-219 (1988); Kalyan y col; J. Biol. Chem. 263, 3971-3978 (1988); Fu y col; Thromb. es. 50, 33-41 (1988); Refino y col; Fibrinolysis 2, 30 (1988); Larsen y col; Blood 73 1842-1850 (1989); Browne y col; J. Biol. Chem. 263, 1599-1602 (1988)]. El dominio kringle-2 es el responsable de la unión a la lisina. El dominio serina proteasa es responsable de la actividad enzimática del t-PA y contiene regiones específicas en donde las mutaciones afectan a la unión a la fibrina y a la especificidad por la fibrina (posiblemente a las interacciones directas con la fibrina) (Bennett y col; 1991, más arriba). Estudios con mutantes que son resultado de alteraciones dirigidas a puntos indican la implicación de la glicosilación del t-PA en la eliminación [Lau y col; Bio/Technology 5, 953-958 (1987); Lau y col; Bio/Technology 6, 734 (1988)].

La eliminación relativamente rápida del t-PA humano del plasma, mientras que es una ventaja en pacientes que necesitan una intervención de emergencia después de una trombólisis, requiere una continua administración intravenosa para mantener los niveles terapéuticos de t-PA en sangre. La dosis total recomendada de Activase® t-PA en adultos sometidos a terapia trombolítica por embólisis pulmonar aguda es de 100 mg administrados en infusión intravenosa continua durante 2 horas. Los derivados del t-PA con una vida media en plasma más larga (una eliminación más lenta) podrían ser administrados mediante una inyección de bolo y darían concentraciones en plasma mayores de las que pueden obtenerse con una infusión continua del t-PA tipo salvaje, lo que podría dar lugar a la reducción de la dosis efectiva. Los mutantes de t-PA con una eliminación más lenta ofrecerían ventajas en el tratamiento de afecciones tales como trombosis venosa profunda, en el tratamiento que sigue a la reperfusión en una víctima de infarto, en el tratamiento de una embolia pulmonar o en el tratamiento de una embolia arterial periférica (enfermedad vascular periférica).

La necesidad de variantes de t-PA que se puedan administrar en forma de bolo está subrayada por el reciente interés en la administración de bolos del t-PA humano tipo salvaje (especialmente en la forma de cadena sencilla) con el propósito de prevenir dolencias tempranas en la arteria coronaria relacionadas con infarto y mejorar la recuperación del miocardio [Verstraete y col; Lancet 14, 1566-1569 (1989); Neuhaus, JACC 14, 1566-1569 (1989); Khan y col; Am. J. Cardiol. 65, 1051-1056 (1990); Purvis, J. A. y col; Am. J. Cardiology 68, 1570-1574 (1991)]. Los resultados de estudios clínicos recientes indican que la administración intravenosa en forma de bolo del t-PA humano tipo salvaje no sólo acelera el inicio de la terapia trombolítica sino que también el rápido alcance de una concentración relativamente alta del t-PA aumenta la trombólisis [Neuhaus, K. L; más arriba, Topol, E. J; J. Am. Coll. Cardiol. 15, 922-924 (1990)].

Se han preparado variantes del t-PA que presentan una reducción de la eliminación mediante la supresión de determinados aminoácidos, dominios parciales o dominios completos de la molécula. Las siguientes publicaciones son representativas de los intentos de reducir la velocidad de eliminación del t-PA tipo salvaje mediante la supresión de parte o de todo el dominio en dedo y/o el dominio del factor de crecimiento, opcionalmente combinada con otras mutaciones: Browne y col; 1988, Supra; Johannessen y col; Thromb. Haemostas. 63, 54-59 (1990); Collen y col; 1988, Supra; Kalyan y col; 1988, Supra; Sobel y col; Circulation 81, 1362-73 (1990); Cambier y col. J. Cardiovasc. Pharmacol; 11: 468 (1988); Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol; 30: 91 (1990); Trill y col; Fibrinolysis 4, 131-140 (1990); patente de los EE.UU número 4.935.237 publicada el 19 de junio de 1990); EP-A 241.208 (publicada el 14 de octubre de 1987); EP-A 240.334 (publicada el 7 de octubre de 1987). Collen y col. en Thromb. Haemost. 65, 174-180 (1991) presentaron una variante del t-PA con un dominio kringle-2 duplicado y una eliminación del plasma reducida.

Se han evaluado varias variantes del t-PA con substituciones de aminoácidos según su capacidad para disminuir la velocidad de eliminación y/o aumentar la vida media del t-PA. Se ha informado que substituciones en las regiones que abarcan del aminoácido 63 al 72 (y especialmente en las posiciones 67 y 68) y del 42 al 49, aumentan la vida media en plasma del t-PA humano tipo salvaje [ver el documento WO 89/12681, publicado el 28 de diciembre de 1989 y Ahern y col; J. Biol. Chem. 265, 5540 (1990)]. Se ha descrito que la substitución de la arginina de la posición 275 del t-PA nativo maduro con ácido glutámico resulta en una velocidad de eliminación dos veces más lenta que la del t-PA humano tipo salvaje [Hotchkiss y col; Thromb. Haemost. 58: 491 (1987)].

Otra forma de disminuir la velocidad de eliminación y/o extender la vida media del t-PA ha sido el formar un complejo entre la molécula del t-PA y una segunda molécula. Por ejemplo, como se ha informado en el documento EP-A 304.311 (publicado el 22 de febrero de 1989), un conjugado t-PA-polietilenglicol reduce la velocidad de eliminación del t-PA. Se ha informado que un anticuerpo monoclonal contra t-PA aumenta la vida media funcional del t-PA in vivo sin disminuir su actividad (ver el documento EP-A 339.505 publicado el 2 de noviembre de 1989).

También se ha estudiado la implicación de los carbohidratos en la eliminación del t-PA. Se han hecho y probado variantes del t-PA con un perfil de carbohidratos diferente a los del t-PA humano tipo salvaje.

Como ejemplo de esta tentativa, se han substituido con aminoácidos apropiados una o más de las posiciones 60, 64, 65, 66, 67, 78, 79, 80, 81, 82, 103, 105, 107 y 250 para crear moléculas con sitios de glicosilación en o cerca de estos residuos (ver el documento WO 89/11531, publicado el 30 de noviembre de 1989). Por ejemplo, de entre estas variantes del t-PA, el mutante t-PA T103N con extraglicosilación tenía una eliminación unas cinco veces más lenta que la del t-PA nativo.

Otro trabajo se enfocó en la conversión de sitios de glicosilación del t-PA tipo salvaje en sitios no glicosilados. Se ha descrito una variante no glicosilada del t-PA, consistente en los dominios kringle-2 y proteasa, que tiene una eliminación en plasma más lenta que el t-PA tipo salvaje [Martin y col; Fibrinolysis 4 (supl. 3): 9 (resumen 26) (1990)]. Hotchkiss y col., Thromb. Haemost; 60: 255 (1988)], que elimina residuos oligosacáridos de manera selectiva de la molécula t-PA y que demuestra que la eliminación de dichos residuos disminuye la velocidad de eliminación del t-PA. Estos investigadores junto con Lau y col. [(1987), Supra; (1988), Supra] también generaron la variante del N117Q t-PA (en la que la asparagina de la posición 117 del t-PA humano tipo salvaje fue substituida por glutamina) para prevenir la glicosilación en la posición 117. Esta variante, de forma similar a la obtenida mediante la eliminación enzimática del oligosacárido rico en manosa en esta posición, exhibía una velocidad de eliminación unas dos veces menor que la del t-PA humano tipo salvaje. Véase también el documento EP-A 238.304 publicado el 23 de septiembre de 1987 y el documento EP-A 227.462 publicado el 1 de julio de 1987.

En las siguientes publicaciones se describieron otras variantes de glicosilación del t-PA humano y se informó de que tenían velocidades de eliminación reducidas: Ahern y col; Supra (Q42N, H44E, N117Q t-PA); Collen y col; (1988), Supra [t-PA del(C6-186)N117Q y del (t-PAC6-186)N117Q, N184Q, N448Q]; Haigwood y col; Prot. Engineer. 2, 611 (1989) (t-PA N117Q, N184Q).

Nosotros hemos determinado que la prolongación de la vida media circulante del t-PA humano tipo salvaje mediante la adición de extraglicosilación en los aminoácidos de las posiciones 103-105 estaba también acompañada de la pérdida de afinidad de unión a la fibrina y/o de la actividad de lisis en la coagulación del plasma. Por ejemplo, la substitución de treonina por asparagina en la posición del aminoácido 103 del t-PA humano tipo salvaje reducía la velocidad de eliminación unas cinco veces, pero también conducía a una pérdida de funcionalidad del t-PA ya que la afinidad de unión a la fibrina y la actividad del t-PA se vieron reducidas de forma significativa. Como resultado, aunque debido a su menor velocidad de eliminación, las concentraciones en plasma de esta variante de glicosilación eran del orden de unas 4-5 veces mayores que para una dosis equivalente de Activase® t-PA, no obstante, dada su actividad reducida, la mejora obtenida en la eficacia o en la potencia fibrinolítica in vivo fue pequeña.

La presente invención está basada, entre otras cosas, en el éxito de una investigación específica que demuestra que la pérdida de unión a fibrina del t-PA, resultante de una alteración cuya función primaria es mejorar las propiedades farmacocinéticas (reduce la eliminación en plasma y prolonga la vida media en circulación) del t-PA tipo salvaje, puede restaurarse con una alteración adicional sin comprometer la obtención de una menor velocidad de eliminación o de una vida media más larga. Además, la presente invención está basada en pruebas experimentales que demuestran que la potencia de lisis (fibrinolítica) de coágulos in vivo de dichas variantes del t-PA puede ser mejorada significativamente respecto a la del t-PA humano tipo salvaje, concretamente si los cambios en el patrón de glicosilación del t-PA van acompañados de alteraciones específicas adicionales en el dominio proteasa del t-PA. El resultado son moléculas con una potencia fibrinolítica mejorada con respecto a la del t-PA tipo salvaje que, además, son capaces de realizar una lisis más rápida de los coágulos del plasma que el t-PA tipo salvaje y adicionalmente podrían haber mejorado su especificidad por la fibrina.

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Descripción resumida de la invención

Sorprendentemente, hemos encontrado que la pérdida de unión a fibrina observada en las variantes del t-PA que experimentan una lenta eliminación y que tienen un sitio de glicosilación extra en las posiciones de los aminoácidos 103-105 del t-PA humano tipo salvaje, puede ser recuperada mediante la eliminación de la estructura de carbohidrato en la posición del aminoácido 117. Estas alteraciones, cuando se combinan, permiten la extensión de la vida media en circulación sin comprometer la afinidad de unión a fibrina de la variante del t-PA. También se puede mejorar la potencia fibrinolítica in vivo (lisis de coágulos por unidad de dosis) del t-PA tipo salvaje, especialmente cuando se introduce en la molécula una alteración adicional que mejora la especificidad por la fibrina.

En consecuencia, la invención se refiere a variantes del t-PA que están glicosiladas en cualquiera de las posiciones que van del 103 al 105 y están exentas de la estructura de carbohidrato funcional en la posición del aminoácido 117 de la secuencia de aminoácidos del t-PA humano tipo salvaje y a) exhiben una vida media en circulación más larga mientras que retienen substancialmente la afinidad de unión a la fibrina del t-PA humano tipo salvaje, o b) tienen una potencia fibrinolítica in vivo mejorada en comparación con la del t-PA humano tipo salvaje.

En una realización preferida, dichas variantes del t-PA exhiben una unión a fibrina al menos similar a la del t-PA humano tipo salvaje.

En otra realización preferida, dichas variantes del t-PA tienen una potencia fibrinolítica in vivo mayor en comparación a la del t-PA humano tipo salvaje.

Aparte del carbohidrato en el residuo aminoácido 117 de la molécula nativa del t-PA, las variantes del t-PA de la presente invención conservan preferiblemente la estructura funcional del carbohidrato en las posiciones glicosiladas del t-PA humano tipo salvaje.

El sitio de glicosilación extra se encuentra preferiblemente en la posición del aminoácido 103 ó 105 del t-PA humano tipo salvaje.

En una realización preferida, la glicosilación extra está ligada a N y las variantes resultantes contienen una asparagina en cualquiera de las posiciones de los aminoácidos 103-105 como parte de una secuencia tripeptidil Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, la cual evita la glicosilación.

En otra realización preferida, el sitio de glicosilación extra ligado a N está en las posiciones de aminoácidos 103 ó 105 del t-PA humano tipo salvaje.

En una realización preferida adicional, la eliminación de la estructura funcional del carbohidrato en el aminoácido 117 se realiza por mutagénesis dirigida de sitio del ADN subyacente a la señal de glicosilación Asn-X-Ser/Thr (donde X es como se describe anteriormente). En las variantes del t-PA resultantes, la asparagina de la posición 117 de la secuencia de aminoácidos del t-PA tipo salvaje es substituida por otro aminoácido, el cual es preferiblemente glutamina.

En otra realización más, las variantes de la presente invención han mejorado su especificidad por la fibrina según se comparan con el t-PA humano tipo salvaje.

Por ejemplo, la especificidad de la fibrina se podría mejorar mediante la introducción de una alteración adicional dentro de la región que abarcan los aminoácidos 296-302 ó 274-277 de la secuencia de aminoácidos del t-PA humano tipo salvaje. Preferiblemente, la alteración es la substitución por alanina de cada uno de los aminoácidos en las posiciones 296-299, o la substitución de aminoácidos presentes en las posiciones 274-277 del t-PA tipo salvaje (fenilalanina, arginina, isoleucina, lisina) por leucina, histidina, serina y treonina, respectivamente.

En otras realizaciones, la invención se refiere a las secuencias de ADN que codifican para las variantes descritas anteriormente, vectores de expresión replicables capaces de expresar dichas secuencias de ADN en una célula huésped transformada, células huésped transformadas y el proceso que comprende el cultivo de las células huésped necesarias para expresar los ADNs que codifican para los variantes del t-PA.

En otra realización más, la invención se refiere a una composición para el tratamiento de una afección o enfermedad vascular que comprende una cantidad de variantes del t-PA efectiva terapéuticamente mezclada con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otra realización más, la invención proporciona un procedimiento para el tratamiento de enfermedades o afecciones vasculares en un mamífero que comprende la administración de una cantidad efectiva de variantes del t-PA al mamífero.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un procedimiento para recuperar substancialmente la pérdida de la afinidad de unión a fibrina, causada por la adición de una glicosilación extra en cualquiera de las posiciones 103-105 de la secuencia del t-PA humano tipo salvaje, mediante la eliminación adicional de la estructura funcional del carbohidrato en la posición del aminoácido 117.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1 y 2 muestran el efecto de las mutaciones de la presente invención en la unión de la fibrina a las variantes del t-PA resultantes. La pérdida de unión a fibrina debida a una glicosilación extra en la posición del aminoácido 103 del t-PA humano tipo salvaje podría ser recuperada mediante la eliminación de la estructura del carbohidrato en la posición 117 de la molécula t-PA humano tipo salvaje.

Las figuras 3, 4, 5 y 6 muestran los resultados del ensayo de lisis de coágulos in vivo realizado en un modelo de trombólisis en conejo con desviación arterio-venosa.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

Los términos "t-PA", "t-PA humano" y "activador del plasminógeno de tejido humano" se refieren al activador del plasminógeno extrínseco (tipo tejido) humano el cual tiene actividad fibrinolítica y tiene una estructura típica de cinco dominios (en dedo, factor de crecimiento, kringle-1, kringle-2 y proteasa), aunque alguno puede tener menos dominios o podría tener alguno de sus dominios repetidos si aún actuara como agente trombolítico. Como mínimo, el t-PA consiste en un dominio proteasa que es capaz de convertir plasminógeno en plasmina y en una región N-terminal que se cree que es al menos parcialmente responsable de la unión a la fibrina. Así, estos términos incluyen polipéptidos que contienen estos dominios funcionales formando parte de la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Las formas biológicamente activas del t-PA pueden ser producidas por sistemas de cultivo de células recombinantes en formas que comprenden las dos regiones funcionales de la molécula y cualquier otra porción del t-PA que por lo demás sea nativa de la fuente del t-PA. Se entenderá que existen variaciones alélicas naturales y se pueden dar entre individuos, como demuestran uno o más aminoácidos diferentes en la secuencia de aminoácidos del t-PA de cada individuo.

Los términos "t-PA tipo salvaje", "t-PA nativo", "t-PA humano tipo salvaje" y "t-PA humano nativo" se refieren a la secuencia nativa del t-PA humano, es decir, la codificada en la secuencia del ADNc descrita en la patente de los EE.UU número 4.766.075, publicada el 23 de agosto de 1988. Los números o posiciones de los sitios de los aminoácidos están marcados de acuerdo con la patente de los EE.UU número 74.766.075. El t-PA puede provenir de cualquier fuente nativa. Además, el t-PA podría obtenerse por cualquier sistema de expresión recombinante, incluyendo, por ejemplo, células del ovario de hámster chino (CHO) o células del riñón de embrión humano 293.

Los términos "unión a fibrina" y "afinidad de unión a fibrina" se refieren a la capacidad de la molécula t-PA de unirse a coágulos de fibrina en ensayos patrón de unión a fibrina, como el procedimiento descrito por Rijken y col; J. Biol. Chem. 257, 2920-2925 (1982) o su versión modificada presentada en el Ejemplo 2.

Los términos "actividad biológica (t-PA)", "biológicamente activo", "actividad" y "activo" se refieren a la capacidad de la molécula t-PA de convertir plasminógeno en plasmina como se mide en el ensayo S-2251 en presencia de un coágulo de plasma o en presencia de fibrina, ensayo S-2288, el ensayo de lisis del coágulo de plasma u otros ensayos apropiados. Los ensayos podrían ser realizados en presencia o ausencia de moduladores potenciales de la actividad como la fibrina, fibrinógeno, plasma y/o coágulos de plasma.

Las expresiones "actividad fibrinolítica", "actividad trombolítica" y "actividad de lisis de coágulos" se usan de forma intercambiable y se refieren a la capacidad de una molécula de t-PA de romper un coágulo, tanto si se deriva de fibrina purificada como de plasma, utilizando cualquiera de los ensayos de lisis de coágulos in vitro conocidos, como el ensayo de lisis de coágulos purificados de Carlson, R. H. y col; Anal. Biochem. 168, 428-435 (1988) y su forma modificada descrita por Bennett, W. F. y col; 1991, Supra.

Las expresiones "actividad fibrinolítica específica", "actividad trombolítica específica" y "actividad de lisis de coágulos específica" se refieren a la lisis de coágulos por unidad del nivel de plasma en estado estacionario como se determina por cualquiera de los ensayos con coágulos in vitro conocidos por los expertos en la materia, tales como los que nos hemos referido anteriormente.

Las expresiones "potencia fibrinolítica in vivo", "potencia trombolítica in vivo" y "potencia de lisis de coágulos in vivo" se utilizan de manera intercambiable y se refieren a la lisis de coágulos por unidad de dosis de t-PA. La "potencia fibrinolítica" está determinada en cualquier modelo animal aceptado para el ensayo de lisis de coágulos, incluyendo el modelo de hámster de embolia pulmonar (Collen, D. y col., (1991), Supra) y el modelo en conejo de trombosis en la vena yugular [Collen, D. y col., J. Clin. Invest. 71, 368 (1983)]. Una versión más concreta del último modelo está descrita en el Ejemplo de más adelante.

La expresión "retiene substancialmente (la afinidad) de unión a la fibrina", (comparada con el t-PA humano tipo salvaje) y las variantes gramaticales de la misma, tal y como se han utilizado aquí, significan que la afinidad de unión a fibrina (valor Kd aparente) de la molécula de la variante del t-PA es dos veces mayor que la afinidad de unión a fibrina (valor Kd) del t-PA humano tipo salvaje, como se determina en el mismo ensayo. La expresión "unión a fibrina substancialmente mejorada" se refiere a un aumento de la afinidad de unión a fibrina (valor K_{d} aparente) cuatro veces mayor que la de una variante del t-PA generado por la inclusión de una mutación o grupo de mutaciones adicionales. El término "potencia fibrinolítica in vivo mejorada" en comparación con el t-PA tipo salvaje, se refiere a una lisis de coágulos in vivo comparable, a la obtenida mediante la administración de una dosis de un variante del t-PA que es un tercio o incluso menor que la dosis del t-PA tipo salvaje.

Los términos "velocidad de eliminación" y "eliminación" se refieren a la velocidad a la que la molécula t-PA es retirada del torrente sanguíneo. (La velocidad de) eliminación se mide en relación al t-PA nativo, de modo que una (velocidad) eliminación disminuida indica que la variante del t-PA es eliminada más despacio que el t-PA nativo y una (velocidad) eliminación aumentada indica que la variante del t-PA es eliminada más rápidamente que el t-PA nativo.

La expresión "especificidad por la fibrina" se refiere a la actividad de un mutante que exhibe una relación de actividad específica dependiente de fibrina partido por actividad específica dependiente de fibrinógeno, mayor que la del rt-PA humano tipo salvaje en un ensayo S-2251 y preferiblemente una relación con un valor de al menos 1,5.

La expresión "especificidad de coagulación del plasma" se refiere a la actividad de un mutante que exhibe una relación de actividad específica dependiente de coagulación en plasma partido por actividad específica dependiente de plasma, mayor que la del rt-PA tipo salvaje en un ensayo S-2251 y preferiblemente una relación con un valor de al menos 1,5.

Los términos "zimógeno", "zimogénico" y "actividad zimogénica" se han utilizado aquí tal y como se definen en el documento WO 90/02798 publicado el 22 de marzo de 1990. De acuerdo con esta definición, la ausencia total de actividad enzimática no es un requerimiento.

La expresión "falta de la estructura funcional del carbohidrato en la posición del aminoácido 117 del t-PA humano tipo salvaje" significa una eliminación completa del carbohidrato en el residuo aminoácido 117, en donde la señal de glicosilación es destruida por mutagénesis dirigida de sitio como se describe infra, o substancialmente retirada, como por ejemplo por tratamiento con endoglicosidasa, la cual podría dejar un residuo intacto de N-acetilglucosamina asociado al Asn 117.

Los términos "aminoácido" y "aminoácidos" se refieren a todos los L-\alpha-aminoácidos que se dan de manera natural. Esta definición incluye norleucina, ornitina y homocisteína. Los aminoácidos se pueden identificar mediante una designación de una letra o de tres letras:

1

Estos aminoácidos pueden ser clasificados de acuerdo con su composición química y con las propiedades de sus cadenas laterales. Están clasificados en dos grupos amplios: con carga y sin carga. Cada uno de estos grupos está dividido en subgrupos para así clasificar a los aminoácidos de una forma más específica:

I. Aminoácidos con carga

Residuos acídicos: ácido aspártico y ácido glutámico

Residuos básicos: lisina, arginina e histidina.

II. Aminoácidos sin carga

Residuos hidrofílicos: serina, treonina, asparagina y glutamina.

Residuos alifáticos: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina.

Residuos no polares: cisteina, metionina y prolina.

Residuos aromáticos: fenilalanina, tirosina y triptófano.

Los términos "alteración", "alteración de la secuencia de aminoácidos", "variante" y "variante de la secuencia de aminoácidos" se refieren a las moléculas de t-PA con alguna diferencia en sus secuencias de aminoácidos según se comparan con la del t-PA nativo. Normalmente, las variantes mantendrán al menos un 80% de homología con los dominios del t-PA nativo que se conservan en su estructura y preferiblemente, mantendrán una homología de al menos un 90% con dichos dominios. Las variantes de glicosilación del t-PA que caen dentro del campo de esta invención, opcionalmente, también contienen substituciones, supresiones y/o inserciones además de aquéllos que resultan de los cambios especificados en el patrón de glicosilación del t-PA.

Las variantes de substitución del t-PA son aquéllas a las que se les ha eliminado al menos un residuo aminoácido de la secuencia del t-PA nativo y en su lugar se ha insertado otro aminoácido en la misma posición. Las substituciones pueden ser puntuales, cuando sólo se ha substituido un aminoácido de la molécula, o pueden ser múltiples, cuando dos o más aminoácidos han sido substituidos en la misma molécula.

Se pueden obtener cambios substanciales en la actividad de la molécula t-PA mediante la substitución de un aminoácido por otro con una cadena lateral que es significativamente diferente en carga y/o estructura a la del aminoácido nativo. Cabe esperar que este tipo de substitución afecte al esqueleto del polipéptido y/o a la carga o hidrofobicidad de la molécula en el área de la substitución.

Caben esperar cambios moderados en la actividad de la molécula t-PA cuando se substituye un aminoácido de la molécula nativa por otro con una cadena lateral de carga y/o estructura similar. En este tipo de substitución, al que nos referiremos como substitución conservativa, no se espera que se altere la estructura del esqueleto del polipéptido o la carga o hidrofobicidad de la molécula en el área de la substitución.

Variantes de inserción del t-PA son aquellas en las que se han insertado uno o dos aminoácidos inmediatamente adyacentes a un aminoácido en una posición determinada de la molécula nativa de t-PA. Inmediatamente adyacente a un aminoácido significa que está conectado al grupo funcional \alpha-carboxi o al \alpha-amino del aminoácido. La inserción puede ser de uno o más aminoácidos. Normalmente, la inserción consistirá en uno o dos aminoácidos conservativos. Los aminoácidos similares en carga y/o estructura a los aminoácidos adyacentes al sitio de inserción se definen como conservativos. Alternativamente, esta invención incluye la inserción de un aminoácido con una carga y/o estructura que es substancialmente diferente a la de los aminoácidos adyacentes al sitio de inserción.

Las variantes de supresión son aquellas en las que se han eliminado dos o más aminoácidos de la molécula nativa de t-PA. Normalmente, las variantes de supresión tendrán uno o dos aminoácidos suprimidos en una región determinada de la molécula t-PA.

Más abajo se describen las notaciones utilizadas a lo largo de esta solicitud para describir a las variantes de secuencia de aminoácidos del t-PA. La localización de un aminoácido particular en una cadena polipeptídica de t-PA se identifica con un número. El número se refiere a la posición del aminoácido en la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro t-PA humano tipo salvaje, como se expone en la patente de los EE.UU número 4.766.075, publicada el 23 de agosto de 1988. En la presente solicitud, los residuos situados de manera similar en las variantes del t-PA son designados con estos números aunque el número real del residuo no sea este debido a supresiones o inserciones en la molécula. Esto ocurrirá, por ejemplo, con variantes con inserciones o supresiones dirigidas de sitio. Los aminoácidos son identificados utilizando el código de una letra. Los aminoácidos substituidos son designados mediante la identificación del aminoácido del tipo salvaje en el lado izquierdo del número que denota la posición en la cadena polipeptídica de ese aminoácido e identificando el aminoácido substituido en el lado derecho del número.

Por ejemplo, el reemplazo del aminoácido treonina (T) por el aminoácido asparagina (N) en la posición del aminoácido 103 de la molécula t-PA humano tipo salvaje da una variante del t-PA designado T103N t-PA. De manera similar, la variante del t-PA obtenida mediante la substitución adicional por glutamina (Q) de la asparagina (N) en la posición del aminoácido 117 de la molécula t-PA humano tipo salvaje se designa como T103N, N117Q t-PA.

Las variantes de supresión se identifican mediante la indicación del residuo aminoácido y la posición en cualquiera de los extremos de la supresión, inclusive, y situando la letra griega delta, "\Delta", a la izquierda de los aminoácidos indicados. Por ejemplo, una variante de t-PA que contenga una supresión de los aminoácidos 296-299 se indicaría como \DeltaK296-H297-R298-R299 t-PA, donde K, H y R representan a los aminoácidos lisina, histidina y arginina respectivamente. Por ejemplo, la supresión de un único aminoácido K296, se indicaría como \DeltaK296. Las variantes de inserción del t-PA se designan con corchetes "[ ]" alrededor de los aminoácidos insertados y la localización de la inserción se denota indicando la posición del aminoácido en cualquiera de los lados de la inserción. Por ejemplo, la inserción del aminoácido alanina (A) entre el ácido glutámico en la posición 94 y el ácido aspártico en la posición 95 se indicaría como E94[A]D95. Para facilitar la lectura, se utiliza una coma "," para separar mutaciones múltiples que se dan en una única molécula y se utiliza un punto y coma ";" para separar moléculas individuales de variantes del t-PA que han sido compuestas, donde varias moléculas de variantes del t-PA se relacionan conjuntamente.

Los términos "Codificado en la secuencia de ADN", "codificado por el ADN" y "codificado por el ácido nucleico" se refieren al orden de secuencia de los desoxirribonucleótidos a lo largo de una cadena de ácido desoxirribonucleico. El orden de estos desoxirribonucleótidos determina el orden de aminoácidos a lo largo de una cadena polipeptídica. De este modo, la secuencia de ADN codifica para la secuencia de aminoácidos.

Los términos "vector de expresión replicable" y "vector de expresión" se refieren a un trozo de ADN, normalmente de cadena doble, que podría tener insertado dentro de sí un trozo de ADN ajeno. El ADN ajeno se define como ADN heterólogo, el cual es un ADN que no se encuentra naturalmente en la célula huésped. El vector se utiliza para transportar el ADN ajeno o heterólogo dentro de una célula huésped apropiada. Una vez en la célula huésped, el vector se puede replicar independientemente del ADN cromosómico del huésped y así se pueden generar varias copias del vector y del ADN insertado (ajeno) en el mismo. Además, el vector contiene los elementos necesarios para permitir la traducción del ADN ajeno en un polipéptido. De este modo, se pueden sintetizar rápidamente muchas moléculas del polipéptido codificado por el ADN ajeno.

El ácido nucleico está "unido operativamente" cuando está situado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder de secreción está operativamente unido a un ADN que codifica para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o amplificador está operativamente ligado a una secuencia codificadora si está situado de tal forma que facilita la traducción. Generalmente, "ligado operativamente" significa que las secuencias de ADN que están ligadas son contiguas y, en el caso de un líder de secreción, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los amplificadores no tienen que ser contiguos. La unión se consigue mediante un ligamiento en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, entonces se utilizan, según las prácticas convencionales, adaptadores o ligadores oligonucleotídicos sintéticos.

Dentro del contexto de la presente invención, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan de manera intercambiable y todas estas designaciones incluyen progenie.

Los términos "célula (del huésped) transformada", "transformante" y "transformado" se refieren a la introducción de ADN en una célula. La célula se denomina "célula huésped". El ADN introducido normalmente lo hace en forma de vector conteniendo un fragmento de ADN insertado. La secuencia de ADN introducida puede ser de la misma especie que la célula huésped o de diferente especie que la célula huésped, o puede ser una secuencia de ADN híbrida, con parte del ADN ajeno y parte del ADN homólogo. Las palabras transformantes y células (huésped) transformadas incluyen la célula sujeto primaria y a los cultivos derivados de la misma, sin considerar el número de pases. También se da por entendido que toda la progenie podría no ser totalmente idéntica en su contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. También se incluye la progenie de mutantes que tienen la misma función o propiedad biológica que la que se buscaba en la célula transformada originalmente.

Los "plásmidos" están designados por una p en subíndice seguida de una designación alfabetonumérica. Los primeros plásmidos utilizados en esta invención bien están disponibles comercialmente o están disponibles públicamente en bases no restrictivas, o pueden ser construidos a partir de dichos plásmidos disponibles utilizando procedimientos publicados. Además, se conocen otros plásmidos equivalentes y resultan conocidos para el técnico especialista en la materia.

II. Procedimientos generales A. Selección de variantes

La glicosolación de los polipéptidos está típicamente ligada a N o ligada a O. Ligada a N se refiere a la unión del carbohidrato a la cadena lateral del residuo asparagina. Las secuencias tripeptídicas, asparagina-X-serina y asparagin-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del carbohidrato a la cadena lateral de la asparagina. La glicosilación ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares, N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa, a un hidroxiaminoácido, normalmente serina o treonina, aunque también podrían estar implicadas en glicosilación ligada a O la 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

Los patrones de glicosilación de proteínas producidas por mamíferos están descritos en detalle en The Plasma Proteins: Structure, Function, and Genetic Control, Putnam, F. W; de; 2nd edition, Vol. 4, Academic Press, New York, 1984, especialmente las páginas 271-315. Este capítulo trata sobre los oligosacáridos asociados a asparagina, incluyendo su subdivisión en al menos tres grupos referidos como estructuras complejas, estructuras ricas en manosa y estructuras híbridas, así como sobre oligosacáridos ligados glicosídicamente.

Los patrones de glicosilación para proteínas producidas por levaduras están descritos en detalle por Tanner y Lehle, Biochim. Biophys. Acta, 906 (1), 915-944 (1987).

Los patrones típicos de glicosilación ligada a N en proteínas producidas por mamíferos y por levaduras aparecen comparados en la figura 1 del documento WO 89/11531 publicado el 30 de noviembre de 1989.

Los estudios preliminares de las estructuras de los carbohidratos del t-PA purificado a partir de células del melanoma de Bowes (melanoma t-PA o mt-PA) demostraron la presencia de oligosacáridos ricos en manosa en la posición 117, con oligosacáridos tipo complejo en las posiciones Asn 184 y Asn 448 [Pohl y col; Eur. J. Biochem. 170, 69-75 (1987)]. El t-PA tipo I tiene sus tres posiciones ligadas a N substituidas con carbohidratos, mientras que el t-PA tipo II no tiene carbohidrato unido a la posición 184, en consonancia con el hecho de que esta posición está glicosilada en tan sólo un 50% de las moléculas de t-PA nativas. Un informe detallado [Parekh y col; Biochemistry 28, 7644-7662 (1989)] confirma estas atribuciones y adicionalmente mostró que el 30% de los oligosacáridos estaban sulfatados.

También se han determinado los oligosacáridos del t-PA tipo salvaje purificado a partir de células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas (rt-PA o Activase® t-PA) [Spellman y col; J. Biol. Chem. 264, 14100-14111 (1989)] y se encontró que seguían un patrón similar de glicosilación: oligosacáridos ricos en manosa en la posición Asn 117, oligosacáridos complejos en Asn 184 y Asn 448, con el sitio Asn 184 glicosilado en sólo el 50% de las moléculas.

Las variantes de esta invención deben contener al menos una secuencia de aminoácidos que tenga el potencial de proveer glicosilación a través de una unión N u O en cualquiera de las posiciones de aminoácidos 103, 104 y 105 del t-PA humano tipo salvaje.

Si se contempla la glicosilación ligada a N, el sitio de glicosilación en la variante es una secuencia tripeptídica de fórmula: asparagina-X-serina o asparagina-X-treonina, en donde la asparagina en el aceptor y X es cualquiera de los veinte aminoácidos codificados genéticamente excepto prolina, de la que se sabe que evita la glicosilación. Ver Struck, D. K. y Lennarz, W. J. en The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans, W. J. Lennarz ed; Plenum Press, 1980, p. 35; Marshall, R. D. Biochem. Soc. Symp. 40, 17 (1974); y Winzler, R. J. en Hormonal Proteins and Peptides, Li, C. I. ed., Academic Press, New York, 1973, pp. 1-15. La secuencia de aminoácidos de las variantes es modificada mediante la inserción del aminoácido(s) apropiado(s) en el sitio(s) adecuado para efectuar la glicosilación (como por adición del tripéptido de asparagina-X-serina/treonina detrás de la posición 103 para que el bucle de superficie sea mayor y más expuesto) o mediante la substitución del aminoácido(s) en el sitio(s) apropiado(s) por otro aminoácido(s) para efectuar la glicosilación.

Si se va a emplear una glicosilación ligada a O, la unión O-glicosídica se da en células animales entre N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa y uno de los varios hidroxiaminoácidos, más comúnmente serina y treonina, pero también en algunos casos un residuo 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina situado en la región apropiada de la molécula.

En una realización preferida, se añade un sitio de glicosilación ligado a N en las posiciones de los aminoácidos 103-105 del t-PA humano nativo. Para una glicosilación ligada a O, se substituyen o suplementan uno o más aminoácidos en estas regiones con los residuos serina, treonina o 5-hidroxilisina.

Dichas variantes del t-PA están descritos en el documento WO 89/11531, supra.

Las variantes del t-PA descritas en la presente invención se caracterizan de forma adicional por la falta de estructura funcional del carbohidrato en el residuo aminoácido 117. De acuerdo con un modo de realización preferida, la estructura funcional del carbohidrato se mantiene en todas las otras posiciones de aminoácidos glicosiladas en la molécula del t-PA nativo. Preferiblemente, dicha eliminación selectiva de la estructura funcional del carbohidrato en la posición 117 es obtenida mediante la substitución aminoacídica de al menos un residuo en la señal de glicosilación Asn-Ser-Ser en las posiciones 117-119 de la secuencia aminoacídica del t-PA humano tipo salvaje. En una variante particularmente preferida, la asparagina (N) en la posición del aminoácido 117 es substituida por otro aminoácido, el substituyente preferencial es la glutamina (Q) (ver, EP 238.304, supra y en el documento WO 89/04368.

Las variantes preferidas de la presente invención tienen asparagina en la posición 103 substituyendo a treonina, o a serina en la posición 105, en conjunción con substituciones por serina de alanina en la posición 107 del t-PA humano nativo y tienen la asparagina (N) de la posición 117 substituida por cualquier otro aminoácido, siendo la glutamina (Q) el substituyente preferencial.

Los activadores de plasminógeno aquí descritos, además de las modificaciones anteriormente mencionadas en el patrón de glicosilación del t-PA nativo, también contienen de manera opcional substituciones, deleciones o inserciones de residuos en otras regiones de la secuencia del t-PA nativo para mejorar ciertas propiedades de la molécula. Dichas modificaciones son bien conocidas por los expertos en el tema. Se puede encontrar una revisión general de los activadores de plasminógeno y derivados de segunda generación en Harris, Protein Engineering, 1: 449-458 (1987) y Lijnen, H. R. y Collen, D., Thromb. Haemost. 66 (1) 88-110 (1991). Otras revisiones de las variantes del t-PA incluyen Pannekoek y col., Fibrinolysis, 2: 123-132 (1988), Ross y col., en Annual Reports in Medicinal Chemistry, Vol. 23, capítulo 12 (1988) y Higgins y Bennett, 1990 supra.

Por ejemplo, un medio para obtener una mejora adicional en la velocidad de eliminación y/o vida media es la eliminación total o parcial del dominio en dedo y/o del dominio del factor de crecimiento de las variantes del t-PA de la presente invención. Alternativa o adicionalmente, las variantes aquí descritas podrían ofrecer resistencia a la rotura proteolítica en, o en torno a, los aminoácidos 275 y 276 y/o tener modificaciones en los aminoácidos del sitio putativo de unión a lisina del dominio kringle-2 del t-PA.

Se consideró que sería particularmente deseable obtener variantes del t-PA que, además de presentar una eliminación del plasma más lento, presentaran mayor especificidad por la fibrina que el t-PA tipo salvaje. Dichas variantes del t-PA actuarán con mayor preferencia en el sitio del coágulo de fibrina que los t-PA sin modificar y, por esta razón, se espera que causen menores efectos secundarios asociados a la activación del plasminógeno circulante, p.e., complicaciones de hemorragias menos frecuentes y menos severas.

La especificidad por la fibrina de las variantes del t-PA de la presente invención puede mejorarse mediante cualquier alteración adicional conocida dentro de la materia.

Con el fin de mejorar su especificidad por la fibrina, una variante del t-PA de la presente invención puede, por ejemplo, estar mutado en las posiciones de los aminoácidos 296-302, preferiblemente 296-299 del dominio serina proteinasa. En una variante preferida, cada uno de los aminoácidos lisina (K), histidina (H), arginina (R), arginina (R) de las posiciones 296-299 del t-PA tipo salvaje es substituido por alanina. En una variante preferida adicional, ambas argininas en las posiciones 298 y 299 están substituidas por ácido glutámico. En otra variante preferida, la lisina(K), histidina (H) y prolina (P) en las posiciones de aminoácidos 296, 297 y 301 del t-PA tipo salvaje son substituidas adicionalmente por glutamina (Q), asparagina (N) y serina (S), respectivamente. En un modo de realización preferido adicional, la especificidad por la fibrina de las variantes del t-PA de la presente invención es mejorada mediante el reemplazamiento de la fenilalanina (F), arginina (R), isoleucina (I) y lisina (K) en las posiciones de los aminoácidos 274, 275, 276 y 277 de la secuencia de aminoácidos del t-PA humano tipo salvaje por los aminoácidos leucina (L), histidina (H), serina (S) y treonina(T), respectivamente. Las últimas alteraciones resultan en la pérdida de un sitio de corte de la plasmina; por esto, las variantes se encuentran substancialmente en forma de cadena simple.

Además, las moléculas de esta invención pueden ser substituidas o pueden contener deleciones en ciertas posiciones para conferir propiedades adicionales deseables, incluyendo el carácter zimogénico. Estas posiciones en el t-PA humano incluyen, por ejemplo, la substitución por alanina de la lisina, histidina y ácido glutámico de las posiciones 416-418, respectivamente, y la substitución por alanina del ácido glutámico, arginina, lisina y ácido glutámico de las posiciones 426, 427, 429 y 430, respectivamente, como se describe, p. e., en el documento WO 90/02798 publicado el 22 de marzo del 1990.

Ejemplos de mutantes múltiples apropiados son: T103N, N117Z t-PA; S105N, A107S, N117Z t-PA; T103N, N117Z, KHRR(296-299)AAAA t-PA; S105N, A107S, N117Z, KHRR(296-299) AAAA t-PA; T103N, N117Z, R298E, R299E t-PA; S105N, A107S, N117Z, R298E, R299E t-PA; T103N, N117Z, K296Q, H297N, P301S t-PA; S105N, A107S, N117Z, K296Q, H297N, P301S t-PA; T103N, N117Z, FRIK(274-277)LHST t-PA; S105, A107S, N117Z, FRIK(274-277)LHST t-PA, en donde Z indica cualquiera de los 20 aminoácidos que se dan de manera natural, excepto asparagina (N). En concreto, las variantes del t-PA preferidas son aquéllas en las que la asparagina de la posición 117 (N) es substituida por glutamina (Q).

B. Construcción de las variantes

La adición de una glicosilación extra a la molécula t-PA nativa y la eliminación de la estructura funcional del carbohidrato del residuo aminoácido 117 pueden ser obtenidas por cualquier procedimiento conocido por los expertos en el tema.

La unión química y enzimática de glicósidos a proteínas puede ser obtenida mediante la utilización de diferentes grupos activos, como describen Alpin y Wriston en CRC crit. Rev. Biochem. pp. 259-306 (1981). Las ventajas de las técnicas de unión química son que resultan relativamente simples y no necesitan la complicada maquinaria enzimática requerida para una glicosilación natural ligada a O o ligada a N. Dependiendo del modo de unión empleado, el azúcar(es) podría unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilos libres como los del ácido aspártico o glutámico, (c) grupos sulfhidrilos libres, como los de la cisteína, (d) grupos hidroxilo libres como los de la serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos como los de la fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos procedimientos están descritos en el documento WO 87/05330 (publicado el 11 de septiembre de 1987).

La estructura del carbohidrato en el aminoácido de la posición 117 del t-PA humano nativo puede, por ejemplo, ser eliminado substancialmente mediante el uso de una endoglicosidasa, como la Endoglicosidasa H (Endo-H). Endo-H es solamente capaz de retirar (parcialmente) oligosacáridos ricos en manosa e híbridos. De acuerdo con esto, bajo condiciones apropiadas, Endo-H es capaz de eliminar (substancialmente) la estructura del carbohidrato rica en manosa en el residuo aminoácido de la posición 117 (Asn) del t-PA nativo sin afectar funcionalmente a las estructuras complejas de los residuos aminoácidos 184 y 448. Este tratamiento es realizado vía técnicas que se conocen per se, por ejemplo, de acuerdo al procedimiento de Tarentino y col., J. Biol. Chem. 249, 811 (1974), Trimble y col., Anal. Biochem. 141, 515 (1984) y Little y col., Biochem. 23, 6191 (1984).

Las variantes del t-PA de esta invención están construidas preferiblemente mediante mutación de la secuencia del ADN que codifica para el t-PA tipo salvaje y expresan la secuencia mutada del ADN en una célula huésped apropiada.

La modificación para insertar o cambiar el aminoácido(s) apropiado en la molécula nativa para dar la variación de secuencia deseada es obtenida por cualquier medio conocido por los expertos en el tema, como p. e. la mutagénesis dirigida de sitio o ligado de la secuencia apropiada en el ADN que codifica para la proteína en cuestión, tal y como se describe más abajo.

Mientras que cualquier técnica conocida por los expertos en el tema puede ser empleada para realizar mutagénesis dirigida de sitio, como p. e. la publicada por Sambrook y col. [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)], el procedimiento preferido para preparar los mutantes del t-PA en esta invención es la mutagénesis dirigida a oligonucleótido. Este procedimiento, que es bien conocido por los expertos en el tema [Adelman y col. ADN, 2: 183 (1983), Sambrook y col., Supra], es particularmente útil para hacer mutantes de substitución, y también puede ser utilizado para hacer variantes de supresión o inserción.

Los oligonucleótidos son sintetizados fácilmente utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en el tema como las descritas por Crea y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 5765 [1978]).

Los mutantes que tienen más de un aminoácido substituido pueden ser generados por uno de entre varios procedimientos. Si los aminoácidos están situados cerca unos de otros dentro de la cadena polipeptídica, podrían ser mutados simultáneamente utilizando un oligonucleótido que codifica para todas las substituciones de aminoácidos deseadas. Sin embargo, si los aminoácidos están situados a cierta distancia unos de otros (como por ejemplo, separados por más de diez aminoácidos) es más difícil generar un único oligonucleótido que codifique para todos los cambios deseados. En su lugar, se podrían emplear uno de los dos procedimientos alternativos. En el primer procedimiento, se genera un oligonucleótido diferente para cada aminoácido que se va a sustituir. Entonces, los oligonucleótidos son anillados a la cadena simple del ADN molde de modo simultáneo y de esta manera la segunda cadena de ADN, que se sintetiza a partir del molde, contendrá todas las substituciones de aminoácidos deseadas. El procedimiento alternativo implica dos o más vueltas de mutagénesis para producir el mutante deseado.

Otro procedimiento para generar mutaciones en la secuencia del ADN que codifica para el t-PA tipo salvaje o para una molécula variante conocida por los expertos en el tema, como por ejemplo la introducción de un nuevo sitio de glicosilación de acuerdo con la presente invención, implica cortar la secuencia del ADN que codifica para la molécula t-PA inicial en la posición apropiada mediante la digestión con enzimas de restrición, recuperar el ADN adecuadamente cortado, sintetizar un oligonucleótido que codifica para la secuencia aminoacídica de glicosilación deseada y para las regiones flanqueantes tales como poliligadores con extremos romos (o, en lugar de los poliligadores, digiriendo el oligonucleótido sintético con las enzimas de restricción utilizadas también para cortar el ADN que codifica para el t-PA, creando de este modo extremos cohesivos) y ligando el ADN sintético en el gen estructural que codifica para el t-PA restante.

La mutagénesis por PCR también es adecuada para hacer variantes del t-PA en la presente invención, por ejemplo, como se describe en la patente de los EE.UU número 4.683.195 publicada el 28 de julio de 1987 y en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., eds. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, Volumen 2, capítulo 15, 1991.

El ADNc que codifica para las variantes del t-PA de la presente invención es insertado en un vector de replicación para una clonación o expresión posterior.

Los vectores adecuados se preparan mediante procedimientos convencionales de ADN recombinante. Los plásmidos aislados y fragmentos de ADN son cortados, retocados y ligados en un orden específico para generar los vectores deseados.

Después de haber sido ligado, el vector con el gen extraño insertado es transformado dentro de una célula huésped apropiada. Las células transformadas son seleccionadas mediante crecimiento en presencia de antibiótico, generalmente tetraciclina (tet) o ampicilina (amp), al cual son resistentes gracias a la presencia de los genes de resistencia a tet y/o amp en el vector. Si la mezcla de ligación ha sido transformada dentro de una célula huésped eucariota, las células transformadas pueden ser seleccionadas por el sistema DHFR/MTX. Las células transformadas son cultivadas y entonces se aísla el ADN plasmídico (por plásmido nos referimos al vector ligado al gen extraño que nos interesa). Después este ADN plasmídico es analizado mediante un mapa de restricción y/o secuenciación del ADN. La secuenciación del ADN se realiza generalmente por cualquiera de los procedimientos de Messing y col., Nucleic Acids., Res 9: 309 (1981) o Maxan y col., Methods of Enzymology, 65: 499 (1980).

Las células huésped preferidas en los primeros pasos del proceso de clonación en esta invención son las procariotas. Estas son particularmente útiles para producir grandes cantidades de ADN, para la producción de ADN patrón de cadena simple utilizado en la mutagénesis dirigida de sitio, para cribar varios mutantes al mismo tiempo y para la secuenciación del ADN generado. Las células huésped procariotas más apropiadas incluyen a E. coli K12 cepa 294 (ATCC número 31, 446), E. coli cepa W3110 (ATCC número 27.325), E. coli X1776 (ATCC número 31.537) y E. coli B; sin embargo, también se pueden utilizar otras muchas cepas de E. coli, como HB101, JM101, NM522, NM538, NM539, así como otras muchas especies y géneros de procariotas. Estas tratan, por supuesto, de ser ilustrativas en vez de limitantes.

Con estos huéspedes se utilizan vectores plasmídicos que contienen los replicones y las secuencias control que derivan de especies compatibles con la célula huésped. El vector normalmente tiene un sitio de replicación, genes marcadores que permiten una selección fenotípica de las células transformadas, uno o más promotores y una región de poliligación que contiene varios sitios de restricción para la inserción del ADN ajeno. Los plásmidos usados típicamente para transformar E. coli incluyen al pBR322, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 y Bluescript M13, los cuales están descritos en la sección 1.12-1.20 de Sambrook y col., supra. Sin embargo, también están disponibles muchos otros vectores que son adecuados. Estos vectores contienen genes que codifican para resistencia a ampicilina y/o tetraciclina lo que permite a las células transformadas con dichos vectores crecer en presencia de estos antibióticos.

Los promotores más comúnmente usados en vectores procarióticos incluyen a los sistemas promotores de la \beta-lactamasa (penicilinasa) y de la lactosa (Chang y col. Nature, 375: 615 [1978]; Itakura y col., Science, 198: 1056 [1977]; Goeddel y col., Nature, 281: 544 [1979]) y un sistema promotor de triptófano (trp) (Goedddel y col.,, Nucl. Acids. Res., 8: 4057 [1980]; EPO Appl. Publ. Nº 36.776) y el sistema de la fosfatasa alkalina. Mientras que estos son los más comúnmente usados, también se han utilizado otros promotores microbianos y se han publicado detalles concernientes a sus secuencias nucleotídicas, permitiendo a un trabajador especializado ligarlos funcionalmente en vectores plasmídicos (ver Siebenlist y col., Cell, 20: 269 [1980]).

Para la expresión de las variantes de t-PA de la presente invención se han usado huéspedes eucariotas, tales como microbios eucariotas (levaduras) y organismos multicelulares (cultivos de células de mamíferos).

Saccharomyes cerevisiae, o levadura común, es el huésped más comúnmente usado entre los microorganismos eucariotas inferiores que se utilizan como huéspedes. Sin embargo, existe cierto número de otras especies, géneros y cepas que se encuentran comúnmente disponibles y que son útiles aquí, como Schizosaccharomyces pombe [Beach y Nurse, Nature, 290: 140 (1981); EP 139,389 publicado el 2 de Mayo de 1985]; Kluyveromices hosts (U.S. 4,943,529; Feer et al., supra) como por ejemplo K. Lactis [MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 (1983)], K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramili (ATCC 24,178); K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., supra), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia [EP 402,226]; Pichia pastoris [EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 (1999)]; Candida; Trichoderma reesia [EP 244,234]; Neurospora crassa [Case et al., Prac. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 (1979)]; Schwanniomyces como Schwanniomyces occidentalis [EP 394,538 publicado el 31 de octubre de 1990]; y hongos filamentosos como por ejemplo Neurospora, Penicilinium, Tolypocladium [WO 91/00357 publicado el 10 de Enero de 1991], y Aspergilus huéspedes como A. nidulans [Biochem Biophis. Res. Commun., 122: 284-289 (1983); Tilbum et al., Gene, 26: 205-221 (1983); Yelton et al, Proc. Nalt. Acad Scl, USA, 81: 1470-1474 (1984)] y A. niger [Kelly y Hynes, EMBO J., 4: 475-479 (1985).

Secuencias promotoras adecuadas en vectores de levaduras incluyen a los promotores de la 3-fosfogliceratoquinasa (Hitzerman y col., J. Biol. Chem., 255: 2073 [1980] u otras enzimas glucolíticas (Hess y col., J. Adv. Enzyme. Req., 7: 149 [1968]; Holland y col., Biochemistry, 17: 4900 [1978]), como la enolasa, la gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfofructoquinasa, la glucosa 6-fosfato isomerasa, la 3-fosfoglicerato mutasa, la piruvatoquinasa, la triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la glucoquinasa. En la construcción de plásmidos de expresión adecuados, las secuencias de terminación asociadas con estos genes también están ligadas al vector de expresión 3' de la secuencia que se desea expresar para proporcionar poliadenilación del ARNm y terminación. Otros promotores que tienen la ventaja adicional de una transcripción controlada por las condiciones de crecimiento son las regiones promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la fosfatasa ácida, las enzimas degradativas asociadas al metabolismo del nitrógeno, la susodicha gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa y las enzimas responsables de la utilización de la maltosa y la galactosa. Cualquier vector plasmídico que contenga un promotor compatible con levaduras, un origen de replicación y una secuencia de terminación es adecuado.

Los cultivos celulares derivados de organismos multicelulares pueden ser utilizados como huéspedes para practicar esta invención. Así que aunque los cultivos de células de vertebrados y de células de invertebrados son aceptables, resultan preferibles los cultivos de células de vertebrados, concretamente células de mamíferos. Ejemplos de líneas celulares adecuadas incluyen las de riñón de mono CVI transformadas con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); las de riñón de embrión humano línea 293S (Graham y col., J. Gen. Virol., 36: 59 [1977]); las células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); las células de ovario de hámster chino (CHO) (Urlab y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci., 77: 4216 [1980]); las células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243 [1980]); las células de riñón de mono (CVI-76, ATCC CCL 70); las células de riñón del mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); las células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); las células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); las células de riñón de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442), las células de pulmón humano (W138M ATCC CCL 75); las células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); las células de tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL 51); las células del hepatoma de rata (HTC, MI.54, Baumann y col., J. Cell. Biol., 85: 1 [1980]); y las células TRI (Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44 [1982]). Los vectores de expresión para estas células normalmente incluyen (si es necesaria) las secuencias de ADN de un origen de replicación, un promotor situado delante del gen que debe expresarse, un sitio de unión a ribosoma, un sitio de empalme de ARN, un sitio de poliadenilación y un sitio de terminación de la transcripción.

Los promotores utilizados en vectores de expresión de mamíferos son normalmente de origen viral. Estos promotores virales derivan normalmente del virus del polioma, Adenovirus 2, y más frecuentemente del virus de simio 40 (SV40). El virus SV40 contiene dos promotores denominados promotor temprano y promotor tardío. Estos promotores son particularmente útiles porque se obtienen fácilmente a partir del virus como un único fragmento de ADN que también contiene el origen de replicación viral (Fiers y col., Nature, 273: 113 [1978]). También se pueden utilizar fragmentos mayores o menores del ADN de SV40, siempre que contengan la secuencia de aproximadamente 250 pb. que va desde el sitio HindIII hasta el sitio BgII localizado en el origen de replicación viral.

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Alternativamente, los promotores que están asociados de manera natural con el gen extraño (promotores homólogos) podrían ser utilizados siempre que sean compatibles con la línea celular del huésped seleccionado para la transformación.

Un origen de replicación podría obtenerse de una fuente externa, tal como SV40 u otro virus (p. e. Polioma, Adeno, SVS, BPV) e insertarse en el vector de clonación. Alternativamente, el origen de replicación podría ser provisto por el mecanismo de replicación cromosómico de la célula huésped. Si el vector que contiene el gen extraño es integrado en el cromosoma de la célula huésped, este último es normalmente suficiente.

Los cultivos de células transformadas producen cantidades satisfactorias de t-PA humano. Sin embargo, la utilización de una secuencia codificadora de ADN secundaria podría aumentar los niveles de producción. La secuencia codificante secundaria típicamente comprende a la enzima hidrofolato reductasa (DHFR). La forma salvaje de la DHFR es normalmente inhibida por el compuesto químico metotrexano (MTX). El nivel de expresión de DHFR en una célula variará dependiendo de la cantidad de MTX añadido al cultivo de las células huésped. Una propiedad adicional del DHFR que lo hace especialmente útil como secuencia secundaria es que puede ser utilizado como marcador de selección para identificar células transformadas.

Hay dos formas disponibles de DHFR para utilizar como secuencias secundarias, DHFR tipo salvaje y DHFR resistente a MIX. El tipo de DHFR que se utiliza en una célula huésped concreta depende de si la célula huésped es deficiente en DHFR (como las que producen un nivel muy bajo de DHFR endógena o las que no producen nada de DHFR funcional). Las líneas celulares deficientes en DHFR, como la línea celular del CHO descrita por Urlaub y Chasin (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 4216 [1980]), son transformadas con secuencias que codifican para el DHFR tipo salvaje. Después de la transformación, estas líneas celulares deficientes en DHFR expresan DHFR funcional y son capaces de crecer en un medio de cultivo que carece de los nutrientes hipoxantina, glicina y timidina. Las células no transformadas no sobrevivirán en ese medio.

La forma resistente al MTX de la DHFR puede ser utilizada como medio para seleccionar células huésped transformadas que endógenamente producen cantidades normales de DHFR funcional que es sensible al MTX. La línea celular CHO-K1 (ATCC número CL 61) posee estas características y por lo tanto es una línea celular útil para este propósito. La adición de MTX al medio de cultivo celular sólo permitirá crecer a las células transformadas con el ADN que codifica para la DHFR resistente a MIX. Las células no transformadas serán incapaces de crecer en este medio.

Las células huésped de mamífero utilizadas para producir las variantes de esta invención pueden ser cultivadas en varios medios. Los medios disponibles comercialmente como el F10 Ham (Sigma), Medio mínimo esencial ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y Medio Eagle modificado de Dulbecco ([DMEM], Sigma) son adecuados para cultivar células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y Wallace (Meth. Enz., 58: 44 [1979]), Barnes y Sato (Anal. Biochem., 102: 255 [1980]) patentes de los EE.UU números 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762 ó 4.560.655; el documento WO 90/03430; el documento WO 87/00195; patente de los EE.UU Re. 30.985; pueden ser utilizados como medios de cultivo de las células huésped. Cada uno de estos medios puede ser suplementado según se necesite con hormonas y/u otros factores de crecimiento (como insulina, transferina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), soluciones tamponadas (como HEPES), nucleósidos (como adenosina y timidina), antibióticos (como la Gentamicina), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos presentes normalmente en un rango micromolar en las concentraciones finales) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario puede ser incluido en concentraciones apropiadas conocidas por aquellos especialistas en la materia.

Muchas de las proteínas eucarióticas que secreta la célula normalmente contienen una secuencia señal endógena que forma parte de la secuencia de aminoácidos. Esta secuencia marca a la proteína para ser exportada de la célula vía retículo endoplásmico y aparato de Golgi. La secuencia señal está típicamente situada en el extremo amino de la proteína y tiene una longitud dentro del rango que va de 13 a 36 aminoácidos. A pesar de que dicha secuencia varía de unas proteínas a otras, todas las secuencias señal eucariotas contienen al menos un residuo cargado positivamente y una extensión altamente hidrofóbica de 10-15 aminoácidos (normalmente ricas en los aminoácidos leucina, isoleucina, alanina, valina y fenilalanina) cerca del centro de la secuencia señal. La secuencia señal está normalmente ausente de la forma secretada de la proteína, ya que es cortada por una peptidasa de señal situada en el retículo endoplásmico durante el transporte al interior del retículo endoplásmico. Generalmente, nos referimos a la proteína con su secuencia señal todavía unida como "preproteína" o como la forma inmadura de la proteína.

Sin embargo, no todas las proteínas secretadas contienen una secuencia señal aminoterminal que es cortada. Algunas proteínas, como la ovoalbúmina, contienen una secuencia señal que está situada en una región interna de la proteína. Esta secuencia, normalmente, no es cortada durante la circulación.

Las proteínas que se encuentran normalmente en el citoplasma pueden ser marcadas para secreción mediante la unión de una secuencia señal a la proteína. Esto se consigue fácilmente uniendo ADN que codifica para la secuencia señal al extremo 5' del ADN que codifica para la proteína y expresando esta proteína de fusión en una célula huésped apropiada. El ADN que codifica para la secuencia señal puede obtenerse como un fragmento de restricción a partir de cualquier gen que codifique para una proteína con secuencia señal. De esta manera, las secuencias señal procariotas, de levaduras o eucariotas pueden ser utilizadas aquí, dependiendo del tipo de célula huésped utilizada para realizar la invención. La porción de ADN que codifica para la secuencia señal es escindida utilizando endonucleasas de restricción apropiadas y luego se une al ADN que codifica para la proteína que ha de ser secretada, es decir, la t-PA.

La selección de una secuencia señal funcional requiere que la secuencia señal sea reconocida por la peptidasa de señal de la célula huésped de modo que la corte y la proteína pueda ser secretada. Se conocen las secuencias de ADN y aminoácidos que codifican para la porción de la secuencia señal de varios genes eucariotas incluyendo, por ejemplo, a la hormona de crecimiento humano, a la proinsulina y a la proalbúmina (ver Stryer, Biochemistry, W.H. Freeeman and Company, New York [1988], p. 769) y pueden ser utilizadas como secuencias señal en células huésped eucariotas adecuadas. Las secuencias de señal de levaduras, como por ejemplo la fosfatasa ácida (Arima y col., Nuc. Acids. Res., 11: 1657 [1983]), factor alfa, fosfatasa alcalina e invertasa, pueden ser utilizadas para dirigir la secreción en células huésped de levadura. Las secuencias de señal procariotas de genes que codifican, por ejemplo, LamB o OmpF (Wong y col., Gene 68: 193 [1988]), MaIE, PhoA o beta-lactamasa, así como otros genes, pueden ser utilizadas para dirigir proteínas de células procariotas al medio de cultivo.

Una técnica alternativa para proporcionar a una proteína de interés una secuencia señal para que pueda ser secretada es sintetizar químicamente el ADN que codifica para la secuencia señal. En este procedimiento, se sintetizan químicamente ambas cadenas de un oligonucleótido que codifica para la secuencia señal seleccionada y posteriormente se anillan la una con la otra para formar un duplex. Entonces, el oligonucleótido de cadena doble se une al extremo 5' del ADN que codifica para la proteína.

La construcción que contiene el ADN que codifica para la proteína con la secuencia señal unida ahora puede unirse a un vector de expresión adecuado. Este vector de expresión es transformado dentro de una célula huésped adecuada y la proteína de interés es expresada y secretada.

Los cultivos de células huésped de mamíferos y otras células huésped que no tienen la barrera de una membrana celular rígida son normalmente transformadas utilizando el procedimiento del fosfato cálcico como lo describieron en un principio Graham y Van der Eb (Virology, 52: 546 [1978]) y modificado como se describe en las secciones 16.32-16.37 de Sambrook y col. supra. Sin embargo, también se pueden utilizar otros procedimientos para introducir ADN en células como el Polibreno (Kawai y Nishizawa, Mol. Cell. Biol., 4: 1172 [1984]), fusión protoplasmática (Schaffner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 2163 [1980]), electroporación (Neumann y col., EMBO J., 1: 841 [1982]) y microinyección directa en el nucleo (Capecchi, Cell, 22: 479 [1980]).

Normalmente, las células huésped de levaduras son transformadas utilizando el procedimiento del polietileno glicol, como es descrito por Hinnen (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75: 1929 [1978]).

Las células huésped procariotas u otras células huésped con pared celular rígida se transforman preferiblemente mediante el procedimiento del cloruro de calcio como se describe en la sección 1.82 de Sambrook y col., supra. Alternativamente, se puede usar electroporación para transformar estas células.

La variante del t-PA se recupera a partir del medio de cultivo preferiblemente como proteína de secreción, aunque también puede ser recuperada de los lisados de las células huésped cuando se expresan directamente sin señal de secreción. Cuando la variante es expresada en una célula recombinante que no sea de origen humano, la variante estará libre de proteínas de origen humano. Sin embargo, es necesario purificar la variante de las proteínas de la célula recombinante para obtener preparaciones que sean substancialmente homogéneas en proteínas. En un primer paso, se centrifuga el medio de cultivo o lisado para retirar las partículas de restos celulares.

Posteriormente, la variante es purificada de proteínas solubles contaminantes, por ejemplo, por fraccionamiento por inmunoafinidad o por columnas de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase reversa, cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico como la DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico o electroforesis en gel. También, para inhibir la degradación proteolítica durante el proceso de purificación, se puede utilizar un inhibidor de proteasa, como el fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), que no interfiere en la actividad del t-PA y se pueden incluir antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios. Un especialista en la materia apreciará que los procedimientos de purificación adecuados para el t-PA nativo podrían requerir modificaciones debido a cambios en el carácter del t-PA o de sus variantes relacionados con su expresión en un cultivo de células recombinantes.

En una realización más específica, la variante del t-PA es secretada, el fluido del cultivo celular sedimentado es diafiltrado y la variante del t-PA es purificada utilizando cromatografía de afinidad con lisina. Alternativamente, se puede pasar el sobrenadante del cultivo celular por una columna de bolitas de vidrio preacondicionada con PBS y acoplada al anticuerpo policlonal A6 anti-t-PA de cabra, seguido de un equilibrado de la columna con solución tamponada y elución del variante t-PA.

Los compuestos de la presente invención pueden ser formulados según procedimientos conocidos para preparar compuestos farmacéuticos útiles, de manera que el producto t-PA es combinado en una mezcla con un soporte farmacéuticamente aceptable. Los soportes adecuados y sus formulaciones están descritos en Remington's Pharmaceutical Science, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co., publicado por Oslo y col. Estos compuestos típicamente contendrán una cantidad efectiva de la variante t-PA, por ejemplo, en un orden que va desde unos 0,5 a unos 5 mg/ml, junto con una cantidad adecuada de soporte dando un compuesto farmacéuticamente aceptable, apropiado para una efectiva administración al paciente. La variante del t-PA puede ser administrada parenteralmente a pacientes que sufren enfermedades o afecciones cardiovasculares, o por otros procedimientos que aseguran su liberación en el torrente sanguíneo de una forma efectiva.

Las composiciones favorables para la administración clínica de las variantes del t-PA utilizadas para la práctica de esta invención incluyen soluciones acuosas estériles o polvos hidratables estériles como son las proteínas liofilizadas. Típicamente, también se puede utilizar una cantidad adecuada de una sal farmacéuticamente aceptable en la formulación para rendir una fórmula isotónica. Una solución tamponada como la de la base arginina en combinación con ácido fosfórico también se incluye en determinadas concentraciones para mantener un pH adecuado, generalmente entre 5,5 y 7,5. Además o alternativamente, se puede incluir un compuesto como la glicerina en la formulación para ayudar a mantener la estabilidad durante el almacenamiento.

Las dosis y las concentraciones deseadas de los compuestos farmacéuticos de esta invención pueden variar dependiendo de la variante en particular y del uso particular que se le quiera dar. La determinación de la dosis adecuada se dejará a elección de un médico con experiencia especialmente con una extensa experiencia en la administración de t-PA humano recombinante tipo salvaje. Debido a su prolongada vida media en plasma, las variantes del t-PA de la presente invención son particularmente adecuadas para la administración en bolos. De acuerdo con el modo de administración preferido, las variantes del t-PA de la presente invención son administradas inicialmente en una dosis en forma de bolo intravenoso que satura substancialmente el mecanismo de eliminación del t-PA, opcionalmente seguido de una administración posterior en forma de bolo y/o administración endovenosa continua. Para las variantes con una actividad biológica comparable a la del t-PA tipo salvaje, la dosis total es preferiblemente de 100 mg. Las variantes más activas provocan el mismo efecto con dosis más bajas. Las variantes con una mejor especificidad por la fibrina pueden ser administradas en dosis superiores sin aumentar significativamente el riesgo de complicaciones de hemorragia.

Como regla general, la dosis y el ritmo de dosificación pueden ser paralelos o superiores a los usados actualmente en las investigaciones clínicas de otros agentes trombolíticos, cardiovasculares, p. e., unos 1-2 mg/Kg de peso corporal en dosis intravenosas o intraarteriales a lo largo de 1,5 a 12 horas en pacientes humanos que sufren infarto de miocardio, embolia pulmonar, etc.

Por ejemplo, en el tratamiento de una trombosis venosa profunda o de una enfermedad vascular periférica, se proferirá una dosis en "bolo", en un orden de 0,05 a 0,2 mg/Kg, con administraciones subsecuentes en un orden de unos 0,1 a 0,2 mg/Kg, administrada para mantener un nivel sanguíneo bastante constante, preferiblemente en un orden de 3\mug/ml.

Como ejemplo de una forma de dosis apropiada, se reconstituye una inyección a partir de un vial que contiene 50 mg de t-PA, arginina, ácido fosfórico y polisorbato 80 con 50 ml de agua estéril para inyección y se mezcla con un volumen adecuado de cloruro sódico al 0,9 por ciento.

Las variantes del t-PA de esta invención son también útiles para prevenir el depósito de la fibrina, o la formación o reformación de adhesiones. Una realización de esta utilización está descrita en el documento EP 0297.860 publicado el 4 de enero de 1989. Generalmente, este tipo de tratamiento implica una administración tópica de una composición en un sitio donde se pueden formar potencialmente fibrina o adhesiones y en la que la composición comprende una cantidad de la variante de t-PA terapéuticamente efectiva en una forma escasamente soluble que se libera de manera continua en ese sitio durante un periodo de tiempo que comprende entre tres días y dos semanas. Típicamente, la variante del t-PA es administrada en una dosis suficiente para prevenir el depósito de fibrina o la formación de adhesiones que se dan tras una intervención quirúrgica, infección, trauma o inflamación. Normalmente, esta cantidad va desde 0,02 mg/g de gel a 25 mg/g de gel, preferentemente con cantidades de 0,25 mg/g de gel a 1,0 mg/g de gel. Cada variante de t-PA utilizada para prevenir la formación de adhesiones y/o el depósito de fibrina está formulada con un vehículo semisólido, mucilaginoso y farmacológicamente inerte para situar a la enzima en el sitio de la formación potencial de la adhesión. El vehículo incluye hidrocarburos de cadena larga o aceites vegetales y ceras compuestas por mezclas de glicéridos de ácidos grasos saturados e insaturados modificados o mezclas de glicéridos de ácidos grasos saturados e insaturados modificados. Algunos ejemplos incluyen vehículos semisólidos como jalea de petróleo o glicéridos semisintéticos, solventes polihidroxilos como la glicerina, hidrocarburos de cadena larga, polímeros biodegradables o liposomas.

Los ejemplos siguientes simplemente ilustran el mejor modo actualmente contemplado para la práctica de la invención, pero no deben ser considerados como limitantes de la invención.

Ejemplo 1 Producción recombinante de las variantes t-PA I. Construcción del vector y mutagénesis

Las nuevas variantes del t-PA de la presente invención fueron construidas en el vector pRK7-t-PA de expresión de la t-PA (ver p. e. el documento WO 90/02798, publicado el 22 de marzo de 1990 y el documento WO 92/02612 publicado el 20 de febrero de 1992). Este vector conteniendo el mutante o el t-PA tipo salvaje fue utilizado para transfección o expresión en células de riñón de embrión humano (293c).

La mutagénesis dirigida de sitio del ADNc del t-PA se realizó según el procedimiento de Tayler y col., Nucl. Acids. Res., 13: 8765 (1985) utilizando un juego de reactivos de la casa Amersham (número de catálogo RPN 1253). Para la generación de los mutantes deseados, se sintetizaron oligonucleótidos con secuencias que codificaban para las substituciones de aminoácidos deseadas y se utilizaron como iniciadores. Estos oligonucleótidos fueron anillados al pRK7-t-PA de cadena simple que se ha preparado por el procedimiento tipo [Viera y col., Meth. Enz., 143: 3 (1987)].

Algunas de las variantes del t-PA fueron generadas utilizando la mutagénesis de Kunkel [Kunkel, T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492 (1985) y Kunkel, T.A. y col., Meth. Enz. 154, 367-382 (1987) ].

Se combinó una mezcla de tres desoxirribonucleótidos, desoxiadenoribosina (dATP), desoxirriboguanosina (dGTP) y desoxirribotimidina (dTTP) con una tio-desoxirribocitosina modificada llamada dCTP (aS), proporcionada en un juego de reactivos por el fabricante de tales reactivos, y se añadió al pRK7-t-PA de cadena simple al que se anilló el oligonucleótido.

Debido a la adición de ADN polimerasa a esta mezcla, se generó una cadena de ADN idéntica al pRK7-t-PA excepto en las bases mutadas. Además, esta nueva cadena de ADN contenía dCTP(aS) en lugar de dCTP, lo que le sirve para protegerse de la digestión por endonucleasas de restricción. Después de que la cadena molde del heterodúplex de cadena doble fue cortada en diferentes puntos con una enzima de restricción adecuada, la cadena molde fue digerida con nucleasa Exoll más allá de la región que contiene el oligómero mutagénico. Posteriormente se paró la reacción para liberar una molécula que era parcialmente de cadena simple. Posteriormente, se formó el ADN de cadena doble homoduplex completo con la ADN polimerasa en presencia de los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato, ATP y ADN ligasa.

En la siguiente tabla se muestran los oligonucleótidos utilizados como iniciadores para generar las moléculas de pRK7-t-PA:

TABLA 1

Mutación (locus simple) a	Secuencia del oligonucleótido
(leyendo de 5' a 3')
T103N	TGTGCTCCAATTGCCCCTGTAGCT
	(SEC. ID. Nº: 1)
S105N, A107S	GCCACTCTCGGATGTATTCCACGTGCCCCT
	(SEC. ID. Nº: 2)
N117Q	CGCGCTGCTTTGCCAGTTGGTGCA
	(SEC. ID. Nº: 3)
KHRR (296-299) AAAA	CGCTCTCCGGGCGACGCCGCGGCCGCGGCAAAGAT
	(SEC. ID. Nº: 4)

a: un mutante de locus simple es un término que describe a las variantes del t-PA que fueron hechas mediante mutagénesis con un único oligonucleótido utilizando t-PA tipo salvaje como molde.

A pesar de que las variantes S105N, A107S t-PA y KHRR (296-299)AAAA t-PA son mutantes múltiples, ya que tienen más de un aminoácido substituido, cada una fue generada utilizando un único oligonucleótido. Esto fue posible ya que los aminoácidos substituidos estaban situados muy cerca unos de otros en la cadena polipeptídica.

Una ligera variación en el procedimiento descrito anteriormente se empleó para preparar mutantes múltiples adicionales. Para los mutantes descritos más abajo, el ADN molde no fue t-PA tipo salvaje (pRK7-t-PA). En su lugar, las cadenas molde usadas fueron aquéllas que tenían al menos una mutación, es decir, el ADN producido en la construcción de los mutantes de la Tabla 1. En la Tabla 2 mostrada más abajo, se da un listado del ADN utilizado como molde y el oligonucleótido utilizado para generar mutaciones adicionales en cada uno de los mutantes de "loci doble". La secuencia de ADN de cada oligonucleótido se presenta en la Tabla 1 de más arriba. El asterisco indica variantes que son ilustrativas de esta invención.

TABLA 2

Mutantes (de doble loci) b	Cadena molde	Oligonucleótido
T103N, N117Q*	T103N	N117Q
S105N, A107S, N117Q*	S105N, A107S	N117Q
T103N, KHRR(296-299)AAAA	KHRR(296-299)AAAA	T103N
S105N, A107S, KHRR(296-299)AAAA	KHRR(296-299)AAAA	S105N,A107S
N117Q, KHRR(296-299)AAAA	KHRR(296-299)AAAA	N117Q

b: Los mutantes de doble loci fueron producidos con ADN que codifica para un mutante de locus simple del t-PA como cadena molde de mutagénesis.

Los siguientes mutantes múltiples ("loci triple") fueron generados esencialmente siguiendo el procedimiento anterior, utilizando los mutantes múltiples indicados en la columna de las cadenas molde como cadenas molde. La secuencia de cada oligonucleótido está expuesta en la Tabla 1 anterior. El asterisco indica variantes que son ilustrativos de esta invención.

TABLA 3

Mutantes (loci triple) c	Cadena molde	Oligonucleótido
T103N, N117Q, KHRR(296-299)AAAA*	N117Q,KHRR(296-299)AAAA	T103N
S105N, A107S, N117Q, KHRR(296-299)AAAA*	S105N, A107S, N117Q, KHRR	N117Q

c: Los mutantes de loci triple c fueron producidos con ADN que codifica para un mutante de loci doble del t-PA como cadena molde para la mutagénesis.

II. Transformación bacteriana y preparación del ADN

Las construcciones de mutantes de t-PA generadas utilizando el protocolo anterior fueron transformadas en el huésped E. coli cepa MM294tonA utilizando el procedimiento tipo de CaCl_{2} (secciones 1.76-1.84 Sambrook y col., Supra) para la preparación y transformación de células competentes. La cepa de MM294tonA E. coli fue preparada mediante la inserción y la subsiguiente excisión imprecisa del trasposón Tn10 en el gen tonA. A continuación este gen se insertó, utilizando mutagénesis por inserción de trasposón [Kleckner y col., J. Mol. Biol., 116: 125-159 (1977)], en el huésped E. coli MM294 (ATCC 31.446).

El ADN se extrajo de colonias individuales de transformantes bacterianos utilizando el procedimiento tipo de miniprep que aparece en Maniatis y col., Supra. Posteriormente se purificaron los plásmidos pasándolos por una columna de rotación Sefacril CL6B y se analizaron por secuenciación y por digestión con endonucleasas de restricción y electroforesis en gel de agarosa.

Alternativamente, la secuencia fue determinada a nivel de cadena simple y los plásmidos de cadena doble se purificaron a partir de transformantes bacterianos con el juego de reactivos para purificación de plásmidos de Qiagen, siguiendo las instrucciones del fabricante.

III. Transformación de las células 293 de riñón de embrión humano

Las células 293 de riñón de embrión humano fueron cultivadas hasta alcanzar una confluencia del 70% en placas de 6 pocillos. Se disolvieron 2,5 \mug del plásmido que codifica el mutante del t-PA en 150 \mul de Tris-HCl 1 mM, de EDTA 0,1 mM, CaCl_{2} 0,227 M. A esto se le añadieron (por goteo mientras se agita en un vórtex) 150 \mul de solución tamponada de HEPES 50 mM (pH 7,35), de NaCl 280 mM , de NaPO_{4} 1,5 mM y se esperó diez minutos a 25ºC a que se formara el precipitado. Posteriormente se añadió el precipitado suspendido a las células en sus pocillos individuales de la placa de 6 pocillos y se dejaron en un incubador toda la noche. Después el medio fue aspirado se añadió 1 ml de glicerina al 20% en PBS (solución salina tamponada con fosfato). Entonces se añadieron 3 ml de medio libre de suero y se incubaron las células durante cinco días. Finalmente el medio fue recogido y ensayado.

La transfección para una producción a gran escala y purificación de las variantes del t-PA de la presente invención en las células 293 puede, por ejemplo, realizarse según se describe en el documento WO 90/02798, Supra.

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IV. Expresión y purificación en células de ovario de hámster Chino (CHO)

El vector pSV16B5 parenteral ampliamente empleado (cepa transformada de E. coli ATCC Nº. 68.151) se utilizó para la transfección y expresión de las variantes del t-PA de la presente invención en las células de ovario de hámster chino (CHO). La construcción del pSVl6B5 se describe en la patente de los EE.UU Nº. 5.087.572 expedida el 11 de febrero de 1992.

Las células CHO-dhfr (como las descritas por Urlaub y Chasin, Supra), que se han cultivado en medio no selectivo, fueron cotransfectadas con un vector de expresión basado en el pSVl6B5 en el que la secuencia de ADNc que codifica para la variante del t-PA deseada ha sido insertada en el sitio de poliunión y con un vector de selección dhfr PFD11 [Simonsen y Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2495-1499 (1983)], utilizando el procedimiento general de Graham y Van der Eb, Supra. Después de la transfección, las células fueron expuestas a medio selectivo: ya sea a) ausencia de glicina, hipoxantina y timidina, o b) ausencia de estos componentes y suplementado con metotrexato en concentraciones que van de 10 a 300 nM. De cada transfección se aislaron cerca de 50 colonias, preferencialmente de aquellas placas que ejercían mayor rigor de selección (con metotrexato). Los clones se extendieron en placas de 6 pocillos para el análisis de la expresión de la variante del t-PA recombinante. Los pocillos confluentes se expusieron a medio de producción libre de suero (modificado a partir de DMEM/F12 1:1 que contiene insulina y transferina) durante 5-6 días y se cuantificó el t-PA en el fluido del cultivo celular mediante un ensayo de ELISA con base policlonal. El mejor clon de producción de cada transfección se extendió para su escalado y producción. Las células se adaptaron a crecimiento en suspensión y las variantes del t-PA se prepararon en un cultivos rotatorios utilizando un medio libre de suero. El fluido del cultivo celular sedimentado se diafiltró y la variante del t-PA se purificó utilizando cromatografía de afinidad de lisina.

Ejemplo 2 Caracterización de las variantes del t-PA 1. Cuantificación del t-PA

Las concentraciones de proteínas eran determinadas de forma rutinaria mediante ELISA normalizada con la secuencia nativa del t-PA (ver el documento EP pat. publ. 093.619). La pureza proteica y homogeneidad fue analizada mediante electroforesis con gel de poliacrilamida en la presencia de dodecil sulfato sódico (PAGE-SDS) con el sistema de tampón de Laemmli, Nature, 227: 680 (1970). Típicamente, se utilizaron geles en gradientes del 10 al 20% y las proteínas se visualizaron por tinción con azul de Coomassie o la técnica de tinción con plata de Morrissey, Anal. Biochem., 117: 307 (1981). Se vio que la variante del t-PA preparada como se describe más arriba se obtenía pura y homogénea por este procedimiento.

2. Marcado de las variantes del t-PA para los estudios de eliminación y de ligamiento

El agente marcador del sitio activo se preparó por radioyodación catalizada por Cloramina-T de la clorometilcetona tirosil-propil-arginil (YPCck), utilizando una modificación del procedimiento descrito por Hunter y Greenwood [Nature 194, 495-496 (1962)]. En una reacción típica, se añadieron 50 \mul de Tris-HCl 1 M a pH 7,5 a 40 \mul de Na^{125}I (4 mCi; 1,8 nmol) en un vaso de reacción tapado. A este vaso se añadieron 8,3 \mul de YPRck (1,8 nmol en HCl 12 mM). La yodación fue iniciada mediante la adición de 12,5 \mul de Cloramina-T (1 mg/ml en NaP^{i} 0,1 M, pH 7,5). La yodación se paró después de 60 s a 24ºC con 25 \mul de metabisulfito de sodio (a mg/ml en NaP^{i} 0,1 M_{i}, pH 7,5). Posteriormente se diluyó la reacción mediante la adición de 2 ml de PBS y se añadieron alícuotas de 20 \mul del agente marcador diluido a alícuotas de 1 ml del sobrenadante del cultivo de células 293 transfectadas transitoriamente. Esta mezcla se incubó durante una hora y se separó el ^{125}I libre del ^{125}I ligado a proteína por filtración en gel en una columna PD-10 (Pharmacia). El ^{125}I enlazado a proteína se determinó mediante la precipitación con ácido tricloroacético al 10%. Estas condiciones de marcaje se optimizaron para una relación 1:1:1 molar de iodo: YPRck:t-PA. La radioactividad específica de las variantes del t-PA marcadas con ^{12I}I era de alrededor de 1 \muCi ^{125}I/\mug de t-PA.

3. Evaluación de la velocidad de eliminación Eliminación desde el plasma en ratón

La velocidad de eliminación de las variantes del t-PA fue determinada mediante una proteína derivada de las células 293 de riñón de embrión humano, inyectándola en el ratón y midiendo la radioactividad de la sangre del ratón a lo largo del tiempo. Cada experimento implica cuatro ratones. Los ratones se dividieron en dos grupos y los dos ratones de cada grupo fueron sangrados a tiempos prederteminados. Los datos obtenidos de ambos grupos fueron combinados y representados en una gráfica de tiempo frente a cpms en sangre. Se computó el área bajo la curva de eliminación desde el plasma (AUC) para cada ratón utilizando trapezoides sucesivos desde 1 a 40 minutos.

En la siguiente tabla,

N indica el número de experimentos requeridos para determinar la velocidad de eliminación.

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La media + la desviación estandard representa la velocidad de eliminación expresada en ml/min/Kg (de peso corporal), calculada mediante el área bajo la curva de eliminación desde el plasma tal y como se define arriba.

% C.V. es el coeficiente de variación expresado en porcentaje.

Norm. es el factor normalizado que representa la relación de eliminación de una variante del t-PA comparado con la eliminación del t-PA tipo salvaje (derivado de las células 293).

El asterisco indica las variantes que son ilustrativas de esta invención.

TABLA 4

Eliminación del plasma en ratones
Variantes del t-PA	N	Media \pm desviación tipo	%C.V	Norm
Wild-type t-PA	12	34,3 \pm 4,9	14,3	1,00
T103N	5	14,4 \pm 1,5	10,1	0,42
S105N, A107S	3	20,0 \pm 2,6	12,9	0,58
N117Q	4	20,2 \pm 3,7	18,6	0,59
KHRR	3	35,0 \pm 5,2	15,1	1,02
T103N, N117Q*	3	10,5 \pm 2,3	21,8	0,31
S105N, A107S, N117Q*	3	12,1 \pm 2,2	18,3	0,35
T103N, KHRR	4	14,4 \pm 1,6	10,8	0,42
S105N, A107S, KHRR	2	19,2 \pm 0,8	4,2	0,56
N117Q, KHRR	5	20,3 \pm 3,9	19,4	0,59
T103N, N117Q, KHRR*	2	9,7 \pm 0,7	7,3	0,28
S105N, A107S, N117Q, KHRR*	1	10,0 n.a.	n.a.	0,30
KHRR = KHRR(296-299)AAAA t-PA

Eliminación desde el plasma en conejos

El análisis farmacocinético del t-PA y de las variantes del t-PA en conejos se realizó utilizando el protocolo experimental del modelo de desvío arterio-venoso (AVS) en trombólisis descrito en la Sección 5 más adelante. Se colocó un catéter de teflón 20G con regulador de flujo (Viggo) en la arteria del oído medio de un conejo blanco de Nueva Zelanda macho, anestesiado, con un peso de 2,5 a 3,5 Kg cada uno. Se colocó un catéter 22G con un tapón de inyección en una vena marginal del oído opuesto. Los catéteres fueron enjuagados y bloqueados con solución salina heparinizada.

La Activase® t-PA y las variantes del t-PA fueron administradas como bolos o infusión por la vía del catéter venoso. La infusión intravenosa se inició con un bolo cargado con un 15% seguido de una infusión con el 85% restante de la dosis a lo largo de 120 minutos. Se ensayaron varias dosis de t-PA Activado® o de variantes del t-PA en el protocolo AVS: 60 \mug/Kg, 180 \mug/Kg y 540 \mug/Kg. La variante T103N, KHRR (296-299)AAAA se ensayó en cuatro dosis: 20 \mug/Kg, 60 \mug/Kg, 180 \mug/Kg y 540 \mug/Kg. Se tomaron muestras de sangre a 30 min., 60 min. y 90 min. durante el protocolo de infusión. Se tomaron muestras a los 2, 10, 20, 30, 45, 60, 90 y 120 minutos después de la administración de la inyección de bolo. Se preparó plasma anticoagulador a partir de las muestras de sangre y la concentración en plasma del t-PA o del variante del t-PA fue determinada mediante un ELISA policlonal. Se evaluaron los valores de velocidad de eliminación en cinco animales en cada una de las múltiples dosis.

En la siguiente tabla, Tabla 5, se muestran la eliminación desde el plasma de las variantes del t-PA de la presente invención en comparación con Activasa® t-PA y variantes del t-PA conocidas. El asterisco indica una variante que es ilustrativa de esta invención.

TABLA 5

Eliminación del plasma en conejos (ml/min/kg)
Muestra del t-PA	Infusión^{a}	Bolo^{b}
Activase® t-PA	20,7 \pm 3,9	23,9 \pm 6,4
KHRR(296-299)AAA	20,0 \pm 3,0	n.d.
T103N	n.d.	2,7 \pm 0,4
T103N, KHRR(296-299)AAAA	n.d.	3,3 \pm 0,2
N117Q, KHRR(296-299)AAAA	n.d.	22,7 \pm 1,2
T103N, N117Q, KHRR(296-299)AAAA*	n.d.	2,1 \pm 0,4

a: Para aquellas variantes del t-PA que carecen de mutaciones asociadas a una eliminación reducida [es decir, el tipo salvaje y KHRR(296-299)AAAA], la eliminación del plasma fue evaluado después de una infusión intravenosa continua de la proteína. La concentración en plasma en estado estacionario del variante de la t-PA se determinó al final de la infusión con un ELISA policlonal. La eliminación se calculó con la relación siguiente: Eliminación = velocidad de infusión/concentración en plasma en estado estacionario. Las velocidades de eliminación medias (\pm desv. tipo) fueron determinadas con análisis de replicación (n = 33 y n = 19) para Activasa® y KHRR [296-299]AAAA, respectivamente. b: Las características de las variantes del t-PA con una eliminación lenta (y Activasa® t-PA) fueron evaluadas en conejos después de una administración de la proteína en forma de bolo mediante una inyección intravenosa. La concentración en plasma del t-PA a diferentes tiempos después de la inyección se determinó con un ELISA policlonal. La velocidad de eliminación se calculó con la relación siguiente: velocidad de eliminación Dosis/área bajo la curva de eliminación del plasma. Las velocidades de eliminación medias (\pm desv. tipo) se determinaron con análisis de replicación (n = 5, 15, 16, 15 y n = 10) para el Activate®; T103N; T103N; KHRR(296-299)AAAA; N117Q, KHRR(296-299)AAAA y T103N; N117Q, KHRR(296-299)AAAA, respectivamente.

4. Unión a fibrina

Mutantes del t-PA purificados a partir de células CHO fueron marcados radioactivamente con I125-YPRck y convertidos a la forma de cadena doble con plásmido soluble utilizando el siguiente procedimiento. Se incubaron alícuotas (1,5 ml) que contenían t-PA (o las variantes) marcado con 0,15 \muCi de I^{125}-YPRck, en solución salina tamponada con fosfato con un 0,5% de seroalbúmina bovina y 0,01% de Tween 80, con plasmina humana (0,09 unidades de caseina en 15 \mul de solución salina tamponada con fosfato) durante dos horas a 25ºC con una agitación suave. La plasmina residual fue inhibida con aprotinina mediante la adición de 0,9 unidades de TI en 15 \mul de solución salina tamponada con fosfato.

La unión a fibrina se evaluó utilizando una modificación del procedimiento descrito por Rijken y col., J. Biol. Chem., 257: 2920-2925 (1982). Se prepararon en solución salina tamponada con fosfato, diluciones de fibrinógeno humano tratado con Sefarosa-lisina que abarcan un rango de 0,12 \mug/ml a 8 mg/ml. Se combinaron alícuotas de fibrinógeno (50 \mul) y t-PA (o sus variantes) marcado con ^{125}I-YPRck (100 \mul) en tubos de polipropileno de 1,2 ml y se mezclaron ligeramente. Mediante la adición de trombina humana se formaron coágulos de fibrina (50 \mul de 1 unidad/ml) y eran visibles a los 60 segundos. Después de 60 minutos a temperatura ambiente, se centrifugaron los coágulos a 13.000 r.p.m. durante 5 minutos a 4ºC. Se transfirieron alícuotas de sobrenadante (50 \mul) a tubos individuales para el contaje. Para contar la radioactividad total, también se contaron los tubos de polipropileno originales (que contienen los coágulos y el líquido restante). La cantidad de t-PA unido era la diferencia entre la radioactividad total (sumando los 50 \mul de la alícuota y los tubos que contienen el coágulo) y la radioactividad que queda sin ligarse que se calculó era una cantidad 4 veces mayor en 50 \mul de sobrenadante.

Los resultados del ensayo de unión de la fibrina realizados con los materiales tratados con plasmina, purificados derivados de CHO, se muestran en las Figuras 1 y 2. Los datos numéricos de unión de la fibrina para el t-PA (o sus variantes) de dos cadenas se presentan en la siguiente tabla, Tabla 6. El asterisco indica las variantes que son ilustrativos de la invención.

TABLA 6

Ensayo de unión a fibrina
Muestra de t-PA	[Fibrina] 50 (\mug/ml)^{b}	kd aparente (uM)^{c}
Activase® t-PA	72	0,21
KHRR(296-299)AAAA	87	0,26
T103N	830	2,5
T103N, N117Q*	63	0,19
T103N, KHRR(296-299)AAAA	620	1,8
T103N, N117Q, KHRR(296-299)AAAA*	120	0,35
S105N, A107S	210	0,63
S105N, A107S, N117Q*	97	0,29
S105N, A107S, N117Q, KHRR (296-299)AAAA*	85	0,25

a: Las muestras de t-PA marcadas con YPRck fueron tratadas con plasmina. Este ensayo de unión mide la afinidad de la fibrina al t-PA en forma de cadena doble. b: [fibrina]^{50} representa la concentración de fibrina requerida para observar el 50% de la proteína de la muestra unida a fibrina. c: app K_{d} representa la constante de afinidad aparente de la unión del t-PA a un coágulode fibrina como determina la concentración micromolar de fibrina requerida para unirse al 50% del t-PA. El peso molecular del monómero de fibrina utilizado en este cálculo fue 340 kilodaltons.

Como se deduce de los datos de arriba y de la Figura 1, la mutación T103N consistente en la adición de un sitio de glicosilación (extra) en la posición 103 de la molécula del t-PA humano tipo salvaje resulta en una pérdida significativa de unión a fibrina. Aunque se ha mostrado que el t-PA T103N exhibe una eliminación de 3 a 5 veces más reducida que el t-PA humano tipo salvaje, su valor terapéutico no ha mejorado significativamente debido a la pérdida de unión a fibrina.

Como demuestran los datos ajenos a este trabajo que se muestran en la figura 2, la unión a fibrina del t-PA T103N mejora substancialmente mediante la adición de una segunda mutación que resulta en la eliminación de la glicosilación de la posición 117 de la molécula t-PA humano tipo salvaje. Además, la variante del t-PA T103N, N117Q mantiene su eliminación reducida en comparación con el del t-PA humano tipo salvaje (o Activasa® t-PA).

La adición de una mutación posterior en las posiciones 296-299 de la molécula t-PA humano tipo salvaje, que se sabe produce una mejora remarcable en la especificidad por la fibrina [KHRR(296-299)AAAA], genera un triple mutante que es superior en comparación al t-PA humano tipo salvaje debido a su velocidad de eliminación significativamente reducida y a un aumento de especificidad por la fibrina sin una pérdida significativa de unión por la fibrina.

5. Ensayo de lisis de coágulos in vivo (modelo de trombólisis de desvío arterio-venoso en conejo)

Se formaron coágulos ex-vivo mediante la colocación de 0,2 ml tanto de sangre entera de conejo al 70% (diluida con NaCl 0,15 M) como de plasma de conejo rico en plaquetas recolectado en EDTA (0,8 X 10^{6} plaquetas/\mul) en el cilindro de una jeringuilla de 0,5 ml. Al plasma rico en plaquetas se le añadieron CaCl_{2} y trombina humana (las concentraciones finales fueron 0,2 \mug/ml y 15 mM, respectivamente). Las alícuotas de sangre completa y de plasma rico en plaquetas fueron salpicadas con fibrinógeno humano marcado con I^{125} antes de ser transferidas a las jeringuillas. Se pasó una tira de algodón por el cilindro de la jeringuilla, lo que sirvió como anclaje de los coágulos. Después de incubar los coágulos a 37ºC durante una hora, se retiró el émbolo y las jeringas (1 de sangre completa y otra rica en plaquetas) se encajaron a un tubo silástico. Este tubo se empalmó a un catéter que había sido anteriormente implantado en una arteria carótida y en una vena yugular de un conejo blanco de Nueva Zelanda de 2,5 a 3,5 Kg de peso. La sangre de procedencia arterial pasaba por encima del coágulo y regresaba por el lado venoso. El flujo de la sangre a través del desvío era de aproximadamente 20 ml/min. La Activasa®-PA fue administrada vía catéter venoso en forma de infusión durante 90 minutos (dosis al 15%). Los t-PAs T103N, N117Q y KHRR(296-299)AAAA fueron administrados en forma de bolo intravenoso. También se administró heparina 300 (U/Kg) como un bolo vía esta ruta a los 10 minutos y a los 45 minutos. La trombólisis fue seguida mediante un detector gamma externo durante los 120 minutos que dura el experimento. La potencia relativa fue determinada a partir de una gráfica semilogarítmica de las curvas de respuesta a dosis de los mutantes en relación a la curva tipo de la Activasa® t-PA. Al completar un día de experimentación, se retiró el circuito del coágulo y los catéteres fueron enjuagados con solución salina y bloqueados con heparina (500 unidades/catéter). Se utilizaron diez animales diarios durante cinco días consecutivos. Los resultados aparecen en las Figuras 3-6.

Los datos in vivo muestran que la lisis de coágulos se consigue más rápidamente, de manera significativa, con el triple mutante T103N, N117Q, KHRR(296-299)AAAA t-PA que con la Activasa® t-PA, tanto en el total de coágulos de sangre como en los coágulos enriquecidos con plaquetas (Figuras 3 y 4). Los datos muestran, además, que la potencia in vivo de T103N, N117Q, KHRR(296-299)AAAA t-Paes 6,0 veces y 9,5 veces mayor que la de la Activasa® t-PA en el total de coágulos de transferencia y de coágulos enriquecidos en plaquetas, respectivamente (Figuras 5 y 6). Estos datos numéricos se determinaron en base a las curvas lineales paralelas ajustadas a partir de los puntos experimentales indicados en las Figuras 5 y 6.

Depósito de materiales

Las células de E. coli 294 transformadas con el vector pSVlB5 se depositaron en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC) el 25 de octubre de 1989 y se las asignó el número de acceso ATCC 68.151. El depósito se realizó bajo las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con el propósito de someterlos al procedimiento de patentes y las regulaciones consiguientes (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de cultivos viables durante 30 años desde el día del depósito. El microorganismo será administrado por la ATCC bajo los términos del tratado de Budapest y sujetos a un acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegura una disponibilidad permanente e irrestringida de la progenie del cultivo al público hasta que se emita la pertinente patente de los EE.UU o hasta que se exponga al público por cualquier solicitud de patente de los EE.UU o extranjera, cualquiera que venga primero, y asegure la disponibilidad de la progenie a uno determinado por el Comisionado de patentes y registros de los EE.UU para ser autorizado a ello de acuerdo al 35 USC 122 y las reglas del comisionado conformes a ello (incluyendo 37 CFR 1,14 con una referencia particular a 886 OG 638). Todas las restricciones de distribución del ATCC 68.151 se retiraron el 11 de febrero de 1992.

El solicitante de la presente patente está de acuerdo en que si el cultivo en depósito debe morir o, perderse o ser destruido cuando se cultiva bajo condiciones adecuadas, será reemplazado de inmediato bajo notificación con un especimen viable del mismo cultivo. La disponibilidad de las cepas depositadas no supone una licencia para practicar la invención en contra de los derechos acordados bajo la autoridad de cualquier gobierno en relación a sus leyes de patentes.

La especificación escrita precedente se considera suficiente como para permitir que un especialista en la materia pueda practicar la invención. La presente invención no ha de ser limitada en su alcance por la construcción depositada. El depósito de material aquí no constituye una admisión de que la descripción escrita aquí contenida es inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo al mejor y tampoco se ha de limitar el alcance de las reivindicaciones a la ilustración específica que representa.

Aunque lo precedente se refiere a realizaciones particulares preferidas, se entenderá que la presente invención no es tan limitada. Ocurrirá que aquéllos que sean especializados en la materia realizarán de forma ordinaria varias modificaciones a las formas de realización publicadas sin divergir del concepto global de la invención. Se pretende que todas esas modificaciones se consideren dentro del campo de la presente invención.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: GENENTECH, INC.

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(ii)

TITULO DE LA INVENCIÓN: Variantes de activador de plasminógeno tisular obtenidos por glicosilación, que presentan mejores propiedades terapéuticas.

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(iii)

NUMERO DE SECUENCIAS: 4

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(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: GENENTECH, INC.

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(B)

CALLE: 460 Point San Bruno Blvd

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(C)

CIUDAD: SOUTH SAN FRANCISCO

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(D)

ESTADO: CALIFORNIA

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(E)

PAIS: USA

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(F)

CODIGO POSTAL: 94080

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(v)

FORMATO PARA LECTURA POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE SOPORTE: disquetera de 5,25, 360 kb

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: patin (Genentech)

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NUMERO DE SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE PRESENTACION:

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NUMERO DE SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL AGENTE/REPRESENTANTE:

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(A)

NOMBRE: Dreger, Ginger R.

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(B)

NUMERO DE REGISTRO: 33,055

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(C)

NUMERO DE ACTA/REFERENCIA: 757

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(ix)

INFORMACIÓN PARA COMUNICACIONES:

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(A)

TELEFONO: 415/266-3216

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(B)

TELEFAX: 415/952-9881

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(C)

TELEX: 910/371-7168

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 24

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGIA: lineal

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(iv)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Sec. Nº 1

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\dddseqskip

TGTGCTCCAA TTGCCCCTGT AGCT

\hfill

24

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 30 bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Sec. Nº 2

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\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCCACTCTCG GATGTATTCC ACGTGCCCCT

\hfill

30

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 24 bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

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(iv)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Sec. Nº 3

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\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CGCGCTGCTT TGCCAGTTGG TGCA

\hfill

24

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 4:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 36 bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGIA: lineal

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(iv)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Sec. Nº 4

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\vskip0.333000\baselineskip

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CCGCTCTCCG GGCGACGCCG CGGCCGCGGC AAAGAT

\hfill

36

Claims (10)

1. Composición farmacéutica para la administración de bolo que comprende una dosis de bolo terapéuticamente efectiva de una variante del activador de plasminógeno de tejido (t-PA), glicosilada en cualquiera de las posiciones 103-105 y que está exenta de una estructura de carbohidrato funcional en la posición 117 de una secuencia de aminoácidos del t-PA de tipo salvaje, exhibiendo dicha variante: a) una vida media en circulación más larga y una unión a fibrina sustancialmente retenida, o b) una potencia fibrinolítica mejorada in vivo cuando se compara con el t-PA humano de tipo salvaje, en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

2. Composición farmacéutica de la reivindicación 1 en donde dicha dosis de bolo satura sustancialmente el mecanismo de clarificación de dicha variante de t-PA.

3. Composición farmacéutica de la reivindicación 1 en donde dicha variante de t-PA tiene una vida media en circulación más larga y una unión a fibrina sustancialmente retenida cuando se compara con el t-PA humano de tipo salvaje.

4. Composición farmacéutica de la reivindicación 1 en donde dicha variante de la t-PA tiene asparagina como parte de una secuencia tripeptidil Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, en la posición 103 de la secuencia de aminoácidos del t-PA humano de tipo salvaje.

5. Composición farmacéutica de la reivindicación 4 en donde dicha variante tiene, adicionalmente, un aminoácido diferente de asparagina en la posición 117 de una secuencia de aminoácidos del t-PA humano de tipo salvaje.

6. Composición farmacéutica de la reivindicación 5 en donde dicha variante de t-PA tiene una glutamina sustituida en la posición aminoacídica 117 de una secuencia de aminoácidos del t-PA humano de tipo salvaje.

7. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 3-6 en donde dicha variante de la t-PA tiene una especificidad a fibrina mejorada cuando se compara con el t-PA humano de tipo salvaje.

8. Composición farmacéutica de la reivindicación 7 en donde dicha variante del t-PA tiene una sustitución aminoacídica en por lo menos una de las posiciones 296, 297, 298 y 299 del t-PA humano de tipo salvaje.

9. Composición farmacéutica de la reivindicación 8 en donde dicha variante del t-PA tiene una alananina sustituida en cada una de las posiciones aminoacídicas 296, 297, 298 y 299 del t-PA humano de tipo salvaje.

10. Composición farmacéutica de la reivindicación 4 que contiene una dosis de bolo terapéuticamente efectiva de T103N, N117Q, KHRR(296-299)AAAA t-PA.