DE3789664T3

DE3789664T3 - Neue thrombolytische proteine.

Info

Publication number: DE3789664T3
Application number: DE3789664T
Authority: DE
Inventors: Glenn R. Sudbury LARSEN; Tim J. Cambridge AHERN
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1986-01-31
Filing date: 1987-01-30
Publication date: 2004-09-16
Anticipated expiration: 2007-01-31
Also published as: DK511887A; DE3789664D1; JPH05268959A; EP0293394A1; JPS63501335A; AU7239587A; DK511887D0; JP2679915B2; AU612974B2; WO1987004722A1; DK175784B1; EP0293394B2; EP0293394A4; DE3789664T2; JPH104960A; EP0293394B1; JP2527454B2; JP2568382B2; JPH0746989A

Description

Diese Erfindung betrifft Substanzen, die eine GewebePlasminogenaktivator-artige (t-PA) Aktivität aufweisen. Insbesondere betrifft diese Erfindung "rekombinante" thrombolytische Proteine, ein Verfahren zur Gewinnung der Proteine aus gentechnisch behandelten Zellen und die therapeutische Verwendung der Substanzen als thrombolytische Wirkstoffe.
Diese Proteine sind aktive thrombolytische Wirkstoffe, die verbesserte fibrinolytische Profile im Vergleich zu nativem menschlichem t-PA aufweisen sollten. Dies kann an einer erhöhten Fibrin-Affinität, einer geringeren Reaktivität mit t-PAInhibitoren, einer beschleunigten Thrombolyse, einer erhöhten fibrinolytischen Aktivität und/oder einer verlängerten biologischen Halbwertszeit erkennbar sein. Die erfindungsgemäßen Proteine sollten außerdem leichter in einer homogeneren Form als natives menschliches t-PA hergestellt werden können. Diese Proteine sollten ein verbessertes pharmakokinetisches Gesamtprofil aufweisen.
Die Struktur von nativem menschlichem t-PA umfaßt einen Amino-(N-)-Terminus von etwa 91 Aminosäureresten, zwei als "Kringel" bezeichnete Bereiche und am Carboxy-Terminus eine Serin-Protease-artige Domäne. Es wurde festgestellt, daß der NTerminus mehrere Subdomänen enthält, die unter anderem bei der Bindung an Fibrin und bei der Ausscheidung des Proteins in vivo eine funktionelle Rolle spielen. Kürzlich wurde die Isolierung einer weiteren t-PA-Form beschrieben, der der native N-Terminus und der erste Kringel-Bereich fehlen, vgl. die veröffentlichte Europäische Patentanmeldung Nr. 0 196 920 (am B. Oktober 1986 veröffentlicht). Gemäß dieser Veröffentlichung ist die verkürzte Form von t-PA, die mit Ala-160 von nativem menschlichem t-PA beginnt, fibrinolytisch aktiv.
Wie hier nachstehend genauer beschrieben, stellt diese Erfindung neue Proteinanaloge von menschlichem t-PA bereit, die beide Kringelbereiche von nativem menschlichem t-PA behalten, jedoch innerhalb des N-Terminus modifiziert sind. Während bei bestimmten Ausführungsformen die Modifikationen Deletionen am N-Terminus umfassen, bleibt der erste Kringelbereich intakt, und am N-Terminus sind niemals mehr als 94 Aminosäuren deletiert. Die meisten Ausführungsformen sind in weitaus geringerem Umfang deletiert und/oder durch Aminosäuresubstitution(en) verändert. Durch Beibehaltung eines größeren Teils der Struktur von nativem menschlichem t-PA sollten die erfindungsgemäßen Proteine entsprechend einen größeren Teil der gewünschten biologischen Aktivitäten von nativem menschlichem t-PA behalten und weniger immunogen als stärker modifizierte t-PA-Analoge sein. Die erfindungsgemäßen Proteine sollten somit verglichen sowohl mit nativem menschlichem t-PA als auch mit dem verkürzten Ala-160t-PA sowie weiteren modifizierten t-PA-Formen verbesserte fibrinolytische und pharmakokinetische Profile aufweisen.
Das Polypeptidrückgrat von natürlichem menschlichem t-PA enthält außerdem vier Konsensus-Asn-Glykosylierungsstellen. Es wurde gezeigt, daß zwei dieser Stellen im t-PA von Säugerzellen, die von Melanomzellen stammen, typischerweise glykosyliert sind, d. h., am Asn117 und Asn448 Asn184 ist gelegentlich glykosyliert und Asn₂₁₈ ist typischerweise nicht glykosyliert. t-PA aus Säugerzellen, die von Melanomzellen stammen, z. B. Bowes- Zellen, wird hier nachstehend auch als "natives" oder "natürliches" menschliches t-PA bezeichnet.
Diese Erfindung betrifft, wie vorstehend beschrieben, die neuen Proteinanaloge von menschlichem t-PA, die in den Ansprüchen gekennzeichnet sind. Die Merkmale der erfindungsgemäßen Proteine sind nachstehend genauer beschrieben. Ungeachtet der verschiedenen Modifikationen wird die Nummerierung von Aminosäuren, deren Sequenz im Ein-Buchstabencode in Tabelle 1 dargestellt ist, beibehalten.
A. Modifikationen am N-Terminus
In einer Ausführungsform der Erfindung sind Proteine durch eine Deletion von Cys-51 bis Asp-87 im Vergleich zu nativem menschlichem t-PA gekennzeichnet. In einer weiteren besonderen Ausführungsform sind Cys-6 bis Ile-86 deletiert. In einer anderen Ausführungsform sind Cys-6 bis Cys-51 deletiert. In anderen Ausführungsformen sind im Nterminalen Bereich der Proteine mehr konservative Modifikationen vorhanden. Bestimmte erfindungsgemäße Proteine enthalten beispielsweise eine oder mehrere Aminosäuredeletionen oder -substitutionen innerhalb der Unterbereiche, auf die in den Ansprüchen Bezug genommen wird. Die Unterbereiche von menschlichem t-PA lauten wie folgt:
Die beanspruchten Modifikationen innerhalb des N-Terminus sind hier nachstehend genauer beschrieben.
B. Modifikationen an N-Glykosylierungsstellen
Die erfindungsgemäßen Proteinvarianten enthalten außerdem im Vergleich zu natürlichem menschlichem t-PA keine N-gebundenen Kohlenhydrateinheiten oder sind nur partiell glykosyliert. Ein hier nachstehend als "partiell glykosyliert" bezeichnetes Protein ist ein Protein, das weniger N-gebundene Kohlenhydrateinheiten als vollständig glykosylierter nativer menschlicher t-PA enthält. Diese fehlende oder nur partielle Glykosylierung wird durch eine Aminosäuresubstitution oder -deletion an einer oder mehreren der Konsensus-N-Glykosylierungserkennungsstellen im nativen t-PA-Molekül verursacht. Es wurde festgestellt, daß erfindungsgemäße Proteinvarianten, die eine solche Modifikation an einer oder mehreren N-Glykosylierungsstellen aufweisen, eine t-PA-artige thrombolytische Aktivität mit einer gelegentlich sogar größeren fibrinolytischen Aktivität aufweisen, wobei sie leichter in homogenerer Form als natives t-PA produziert werden können und häufig längere in vivo-Halbwertszeiten als natives t-PA aufweisen.
Es wird gegenwärtig angenommen, daß N-Glykosylierungserkennungsstellen Tripeptidsequenzen umfassen, die durch die geeigneten zellulären Glykosylierungsenzyme spezifisch erkannt werden. Diese Tripeptidsequenzen sind entweder Asparagin-X-Threonin oder Asparagin-X-Serin, wobei X meistens jede Aminosäure sein kann. Ihre Lage innerhalb der t-PA-Peptidsequenz ist in Tabelle 1 dargestellt. Durch einige Austausche oder Deletionen von Aminosäuren an einer oder mehreren der drei Stellen einer Glykosylierungserkennungsstelle wird die Glykosylierung der modifizierten Sequenz verhindert. Asn₁₁₇ und Asn₁₈₄ im t-PA sind beispielsweise in einer Ausführungsform beide durch Thr und in einer weiteren Ausführungsform durch Gln ausgetauscht worden. Zumindest wenn Gln zweimal eingetauscht wird, sollte das erhaltene Glykoprotein (Gln₁₁₇Gln₁₈₄) auf jeden Fall nur eine N-gebundene Kohlenhydrateinheit (an Asn₄₄₈) und nicht zwei oder drei solcher Einheiten wie im nativen t-PA enthalten. Der Fachmann wird erkennen, daß analoge Glykoproteine mit der gleichen Asn₄₄₈-Monoglykosylierung hergestellt werden können durch Deletion von Aminosäuren oder Austausch gegen andere Aminosäuren an den Positionen 117 und 184 und/oder durch Deletion oder Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren an anderen Positionen innerhalb der jeweiligen Glykosylierungserkennungsstellen, z. B. an Ser₁₁₉ und Ser₁₈₆, vorstehend beschrieben, und/oder durch Substitution oder stärker bevorzugt durch Deletion an einer oder mehreren "X"-Positionen der Tripeptidstellen. In einer anderen Ausführungsform ist Asn an den Positionen 117, 184 und 448 durch Gln ersetzt. Die erhaltenen Varianten sollten im Unterschied zu nativem t-PA mit zwei oder drei solcher Einheiten keine N-gebundenen Kohlenhydrateinheiten enthalten.
In anderen Ausführungsformen sind potentielle Glykosylierungsstellen individuell modifiziert worden, beispielsweise durch Austausch von Asn, z. B. gegen Gln an Position 117 in einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform, an Position 184 in einer anderen Ausführungsform und an Position 448 in einer weiteren Ausführungsform. Die Erfindung umfaßt solche nicht-glykosylierten, monoglykosylierten, diglykosylierten und triglykosylierten t-PA-Varianten.
Beispiele für Modifikationen an einer oder mehreren der drei Konsensus-N-Glykosylierungssequenzen, R₁, R₂ und R₃, wie in mehreren erfindungsgemäßen Ausführungsformen festgestellt, sind nachstehend dargestellt:
Beispiele für Modifikationen an n-Glykosylierungsstellen
C. Modifikation an der Arg-275/Ile-276-Spaltstelle
Ein erfindungsgemäßer Aspekt betrifft die Modifikation von Varianten gegebenenfalls an der proteolytischen Spaltstelle im Bereich von Arg-275 bis Ile-276, wobei Arg-275 deletiert oder gegen eine weitere Aminosäure, vorzugsweise eine Aminosäure außer Lys oder His, ausgetauscht ist. Thr ist gegenwärtig eine besonders bevorzugte Aminosäure zum Austausch von Arg-275 in den verschiedenen erfindungsgemäßen Ausführungsformen. Eine proteolytische Spaltung am Arg-275 von nativem t-PA liefert das so genannte "Zwei-Ketten"-Molekül, wie es im Stand der Technik bekannt ist. Die durch eine Modifikation dieser Spaltstelle gekennzeichneten erfindungsgemäßen Proteine können auf eine einfachere Weise mit größerer Homogenität als das entsprechende, an der Spaltstelle nicht modifizierte Protein hergestellt werden und, vielleicht wichtiger noch, dürften ein verbessertes fibrinolytisches Profil und verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften aufweisen.
Diese Erfindung stellt daher eine Familie von neuen, mit menschlichem t-PA verwandten, thrombolytischen Proteinen bereit. Diese Familie umfaßt mehrere Gattungen von Proteinen.
In einer Ausführungsform sind die Proteine durch eine in den Ansprüchen gekennzeichnete Peptidsequenz charakterisiert, in der Arg-275 deletiert oder durch eine andere Aminosäure, vorzugsweise durch eine andere als Lysin oder Histidin, ersetzt ist, und mindestens eine der Konsensus-Asn-Glykosylierungsstellen deletiert oder zu einer von der Konsensus-Asn-Glykosylierungssequenz abweichenden Sequenz modifiziert ist. Beispiele für Proteine dieser Ausführungsform sind nachstehend in Tabelle 1 dargestellt. Die erfindungsgemäßen Proteine sind t-PA-Analoge, die durch die verschiedenen Modifikationen oder Kombinationen von Modifikationen, wie hier offenbart, gekennzeichnet sind, die auch noch weitere Variationen mit einer noch vorhandenen thrombolytischen Aktivität, z. B. allele Variationen, oder (eine) weitere Deletion(en), Substitution(en) oder Insertion(en) von Aminosäuren enthalten können, sofern die diese Proteine codierende DNA (vor der erfindungsgemäßen Modifikation) mit einer menschlichen t-PA codierenden DNA-Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann.
Tabelle 1 Beispiele für Proteine, die eine Modifikation am Arg-275 enthalten und an mindestens einer N-Glykosylierungs-stelle
In einer zweiten Ausführungsform sind die Proteine durch eine im wesentlichen der Peptidsequenz von menschlichem t-PA entsprechenden Peptidsequenz gekennzeichnet, in der eine oder mehrere Aminosäuren innerhalb des N-Terminus im Bereich von Val-4 bis Val-72 deletiert sind und in der (a) eine oder mehrere Asn-Glykosylierungsstellen deletiert oder auf andere Weise zu einer anderen als einer Konsensus-Asn-Glykosylierungsstelle modifiziert sind und/oder (b) Arg-275 gegebenenfalls durch eine andere Aminosäure, vorzugsweise nicht durch Lysin oder Histidin, deletiert oder ersetzt ist. Beispiele für Proteine dieser Ausführungsform sind nachstehend dargestellt:
Beispiele für Proteine mit N-terminalen Deletionen
Die nachstehend dargestellten Proteine weisen die in Tabelle 1 dargestellte Peptidsequenz auf, in der R¹, R² und R³ die wt-Tripeptidsequenzen sind, in der jedoch die N-Termini (Gly-(-3) bis Thr-91) wie folgt ausgetauscht sind:
Diese Ausführungsform schließt eine Untergattung von Proteinen ein, in der 1 bis etwa 69 Aminosäuren des Bereichs Val-4 bis Val-72 deletiert sind, und eine oder mehrere Asn-Glykosylierungsstellen deletiert oder auf andere Weise zu einer anderen als einer Konsensus-Asn-Glykosylierungssequenz, wie vorstehend beschrieben, modifiziert sind. Dazu gehört außerdem eine Untergattung von Verbindungen, in der 1 bis etwa 69 Aminosäuren im Bereich Val-4 bis Val-72 deletiert sind und Arg-275 deletiert oder durch eine andere Aminosäure, vorzugsweise nicht durch Lysin oder Histidin, ersetzt ist. Eine weitere Untergattung dieser Ausführungsform ist durch eine Deletion von 1 bis etwa 69 Aminosäuren innerhalb des Bereichs Val-4 bis Val-72, durch eine Deletion oder Modifikation einer oder mehrerer Asn-Glykosylierungsstellen (vgl. z. B. die Tabelle auf Seite 6) und durch eine Deletion von Arg-275 oder sein Austausch gegen eine andere Aminosäure gekennzeichnet. Beispiele für die Proteine dieser Untergattungen sind nachstehend in den Tabellen 2 und 2.5 dargestellt.
Diese Ausführungsform schließt außerdem eine Untergattung von Proteinen ein, wobei die Deletion am N-Terminus eine Deletion von einer oder mehrerer Aminosäuren im Bereich Val-4 bis Ser-50 umfasst. Außerdem ist eine Untergattung von Proteinen eingeschlossen, wobei eine oder mehrere Aminosäuren im Bereich Val-4 bis Ser-50 deletiert und eine oder mehrere Glykosylierungsstellen, wie vorstehend beschrieben, modifiziert sind. Eine weitere Untergattung umfaßt Proteine, in denen Aminosäuren im Bereich Val-4 bis Ser-50 deletiert sind, wobei Arg-275 deletiert oder durch eine andere Aminosäure ersetzt ist. Außerdem ist eine Untergattung eingeschlossen, in der eine oder mehrere Aminosäuren im Bereich Val-4 bis Ser-50 deletiert sind und in der gegebenenfalls sowohl (a) eine oder mehrere Glykosylierungsstellen als auch (b) Arg-275, wie vorstehend beschrieben, modifiziert sind. Beispiele für die Proteine dieser Untergattungen sind nachstehend in Tabelle 3 sowie in den Tabellen 2 und 2.5 dargestellt.
Tabelle 2 Beispiele für Proteine, die eine Deletion von einer oder mehrerer Aminosäuren am N-Terminus und eine Modifikation an mindestens einer N-Glykosylierungsstelle und gegebenenfalls am Arg-275 enthalten (die allgemeine Sequenz ist in Tabelle 1 dargestellt)
Tabelle 2.5 Beispiele für N-Termini, die eine Deletion von einer oder mehrerer Aminosäuren enthalten
Die spezifischen erfindungsgemäßen Proteine erhalten eine 3-teilige Bezeichnung, die eine Verbindungsnummer von Tabelle 2 mit einer anschließenden Bezeichnung des N-Terminus und danach eine Angabe zu Position 275 umfaßt. Verbindung Nr. 2-11/N-6/Arg bezeichnet beispielsweise ein Protein, in dem die 3 Glykosylierungsstellen deletiert sind ("2–11", vgl. Tabelle 2), C-36 bis C-43 deletiert sind (N-Terminus #N-6) und Arg-275 erhalten bleibt.
Tabelle 3
Beispiele für Proteine, die eine Deletion von 1–45 Aminosäuren im Bereich Val-4 bis Ser-50 und eine Modifikation entweder nur (a) am Arg-275 oder (b) an mindestens einer N-Glykosylierungsstelle oder sowohl (a) am Arg-275 als auch (b) an mindestens einer N-Glykosylie-rungsstelle aufweisen (die allgemeine Sequenz ist in Tabelle 1 dargestellt)
Beispiele für Proteine entsprechen den in Tabelle 2 definierten, wobei allerdings die Wildtyp (wt)-Sequenz von Gly-(-3) bis Thr-91 gegen die nachstehend dargestellten N-Termini ausgetauscht ist:
Die in Tabelle 3 dargestellten modifizierten N-Termini zeigen, daß mehr als eine Aminosäure deletiert sein kann. Wenn mehrere Aminosäuren deletiert sind, können sie einander benachbart oder durch eine oder mehrere Aminosäuren getrennt sein. Bei der Bezeichnung der Verbindungen mit solchen N-Termini wird die Größe der Deletion durch "Δn" angezeigt, wobei "n" die Zahl der deletierten Aminosäuren ist. Beispielsweise kann der N-Terminus #27, in dem eine Aminosäure deletiert ist, wie in Tabelle 3 dargestellt, als "N-27Δ1" bezeichnet werden. Bei einer Deletion von zwei Aminosäuren, z. B. bei Y-4 und I-5, wird der N-Terminus als "N-27Δ2" etc. bezeichnet. Bei einer Kombination von Deletionen, wobei z. B. Y-4, I-5 und D-8 deletiert sind, kann der N-Terminus als "N-27Δ2", "N-31Δ1" bezeichnet werden. Wie im Text im Anschluß an Tabelle 2.5 beschrieben ist, besteht die Bezeichnung bestimmter Verbindungen aus einem dreiteiligen Code, der eine Verbindungsnummer aus Tabelle 2, anschließend eine Bezeichnung des N-Terminus #, z. B. von Tabelle 2.5, und danach eine Statusangabe der Position 275 umfaßt. Die Verbindung 2-26/N-N-27Δ2/N-31Δ1 bezeichnet somit das Protein, in dem alle drei Glykosylierungsstellen sowie R-275, S-1, Y-2 und I-5 deletiert sind.
Diese Ausführungsform schließt ferner eine Untergattung von Proteinen ein, in denen eine oder mehrere Aminosäuren im Bereich Val-4 bis Val-27 deletiert sind. Proteine dieser Untergattung können gegebenenfalls, so modifiziert werden, daß Arg-275 deletiert oder gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht ist, vorzugsweise nicht gegen Lysin oder Histidin. Proteine dieser Untergattung sind alternativ beispielsweise durch Entfernung einer oder mehrerer N-Glykosylierungsstellen, wie vorstehend beschrieben, modifiziert.
Beispiele von Proteinen dieser Untergattung sind in den Tabellen 2 und 3 dargestellt, sie enthalten jedoch N-Termini, wie sie beispielsweise nachstehend in Tabelle 4 angegeben sind.
Tabelle 4
Beispiele für Proteine, die eine Deletion von einer oder mehrerer Aminosäuren im Bereich Val-4 bis Val-72 aufweisen (die allgemeine Sequenz ist in Tabelle 1 dargestellt)
Beispiele für Proteine sind, wie in Tabelle 2 definiert, wobei jedoch die Wildtyp (wt)-Sequenz von Gly-(-3) bis Thr-91 gegen die nachstehend dargestellten N-Termini ausgetauscht ist:
Im Hinblick auf die vorstehende Tabelle 4 muß angemerkt werden, daß darin mehrere Untergruppen von Proteinen offenbart sind. Beispielsweise sind Proteine dargestellt, die eine Deletion von 1 bis 47 Aminosäuren (einzeln, aufeinander folgend oder kombiniert) von Val-4 bis Val-72 enthalten, sowie Proteine, die eine Deletion von 1 bis 22 Aminosäuren von Cys-51 bis Val-72 und eine Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren im Bereich von Val-4 bis Cys-51 (vgl. N-76) enthalten. Bei Verbindungen, die einen N-Terminus enthalten, der aus den N-Termini von N-76 bis N-97 ausgewählt sind, ist es selbstverständlich, daß mehr als eine Aminosäure deletiert sein kann. Beispielsweise kann N-77, in dem, wie in Tabelle 4 dargestellt, eine Aminosäure deletiert ist, als "N-77Δ1" bezeichnet werden. Bei einer Deletion von sechs Aminosäuren, z. B. S-52 bis F-57, wird der N-Terminus als "N-77Δ6"etc. bezeichnet. Bestimmte Proteine werden wie in den nachstehenden Tabellen 2 und 3 bezeichnet. Beispiele, in denen die drei Glykosylierungsstellen und Arg-275 deletiert sind, sind nachstehend dargestellt:
Beispiele für Verbindungen, die an der ersten N-Glykosylierungsstelle modifiziert sind, wobei Asn-117 durch Gln ausgetauscht ist, sind nachstehend aufgeführt:
2-1/N-424/Arg
2-1/N-425/Arg
2-1/N-426/Arg
2-1/N-427/Arg
2-1/N-428/Arg
2-1/N-63Δ2,N-92Δ3/Arg
2-1/N-63Δ1,N-92Δ2/Arg
2-1/N-63Δ1,N-92Δ1/Arg
Beispiele für Verbindungen mit den gleichen vorstehend beschriebenen Deletionen, die zudem an allen drei Glykosylierungsstellen modifiziert sind, wobei Asn jeweils durch Gln ausgetauscht ist, sind nachstehend aufgeführt:
2-7/N-424/Arg
2-7/N-425/Arg
2-7/N-426/Arg
2-7/N-427/Arg
2-7/N-428/Arg
2-7/N-63Δ2,N-92Δ3/Arg
2-7/N-63Δ1,N-92Δ2/Arg
2-7/N-63Δ1,N-92Δ1/Arg
Somit schließt diese Ausführungsform außerdem eine Untergattung von C-Proteinen ein, in denen eine oder mehrere Deletionen von weniger als etwa 20 Aminosäuren im Bereich Val-4 bis Val-72 vorhanden sind. Proteine dieser Untergattung sind an einer oder mehreren Asn-Glykosylierungsstellen und gegebenenfalls am Arg-275 modifiziert. Beispiele für Proteine dieser Untergattung entsprechen den in Tabellen 2 bis 4 dargestellten, sie enthalten jedoch anstelle des Wildtyp-N-Terminus einen N-Terminus, wie er beispielsweise nachstehend in Tabelle 5 dargestellt ist. Weitere Beispiele für Verbindungen dieser Untergattung sind ebenfalls vorstehend mit ihren aus einem dreiteiligen Code bestehenden Bezeichnungen aufgeführt.
In einer dritten Ausführungsform sind die Proteine durch eine Peptidsequenz gekennzeichnet, die im wesentlichen der Peptidsequenz von menschlichem t-PA entspricht, in der jedoch Aminosäuren im Bereich Arg-23 bis Val-72 durch verschiedene Aminosäuren ausgetauscht sind. Diese Ausführungsform schließt eine Untergattung von Verbindungen ein, die durch den Austausch von einer oder mehreren Aminosäuren innerhalb des vorstehend beschriebenen N-Terminus und durch eine Modifikation am Arg-275, wie vorstehend beschrieben, gekennzeichnet ist. Diese Ausführungsform von Verbindungen ist ebenfalls gekennzeichnet durch die Modifikation, wie vorstehend beschrieben, an einer oder mehreren der Konsensus-Asn-Glykosylierungsstellen. Eine weitere Untergattung dieser Ausführungsformen ist durch Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren innerhalb des N-Terminus und durch Modifikationen, wie vorstehend beschrieben, sowohl am Arg-275 als auch an einer oder mehreren der N-Glykosylierungsstellen gekennzeichnet. In einer weiteren Ausführungsform werden ein bis etwa elf, vorzugsweise ein bis etwa 6, Aminosäuren innerhalb eines oder mehrerer der nachstehend aufgeführten Bereiche ausgetauscht.
Ein weiterer Aspekt dieser Ausführungsform betrifft die Anwesenheit der Substitution(en) in einem oder in mehreren der nachstehend aufgeführten Bereiche: N-3' bis C-42 und H-44 bis S-50. Ein weiterer Gesichtspunkt dieser Ausführungsform betrifft die Modifikation des N-Terminus wiederum durch Austausch von einer bis etwa elf, vorzugsweise einer bis etwa sechs, Aminosäuren in einem oder in mehreren der vorstehend definierten Bereiche und außerdem durch Deletion von einer bis 50, vorzugsweise 1 bis etwa 45, und stärker bevorzugt 1 bis etwa 15, Aminosäuren.
Beispiele für Aminosäuresubstitutionen sind nachstehend in Tabelle 6-A und Beispiele für Proteine in Tabelle 6-B dargestellt. Von den in Tabelle 6-A dargestellten, anstelle , von R-40, A-41 und Q-42 eingesetzten Aminosäuren werden S bevorzugt anstelle von R-40 und V und L bevorzugt anstelle von A-41 bzw. Q-42 eingesetzt. Es soll darauf hingewiesen werden, daß die erfindungsgemäßen Ausführungsformen der Proteine, in denen R-40, A-41 und Q-42 entsprechend der Tabelle 6A ausgetauscht sind, kombiniert werden mit Modifikationen an mindestens einer Glykosylierungsstelle und gegebenenfalls mit (einer) weiteren Substitution en) und/oder Deletionen im NTerminus und/oder Modifikationen an R-275. Je mehr die Proteine durch Substitution statt durch Deletion modifiziert sind, desto mehr sollten die Proteine die native t-PA-Konformation und selektiv mehr der gewünschten biologischen Aktivitäten von nativem t-PA beibehalten.
Tabelle 5
Beispiele für Proteine mit einer oder mehreren Deletionen von weniger als –20 Aminosäuren innerhalb des Bereichs Val-4 bis Val-72
(Tabelle 1 zeigt die allgemeine Sequenz)
Die Beispiele für Proteine entsprechen den in Tabelle 2 definierten, sie weisen jedoch die nachstehend aufgeführten N-Termini auf, die die Wildtyp (wt)-Sequenz im Bereich Gly-(-3) bis Thr-91 ersetzen:
Tabelle 6-A Beispiele für Aminosäure-Substitutionen
Tabelle 6-B
Beispiele für Proteine, die Substitutionen für eine oder mehrere Aminosäuren im Bereich von Arg-23 bis Val-72 enthalten (die allgemeine Sequenz ist in Tabelle 1 dargestellt)
Beispiele für Proteine entsprechen den in Tabelle 2 definierten, wobei allerdings die Wildtyp (wt)-Sequenz von Gly-(-3) bis Thr-91 gegen die nachstehend dargestellten N-Termini ausgetauscht ist:
Erfindungsgemäße Ausführungsformen der Proteine, die (eine) Aminosäuresubstitution(en) enthalten, können, wie vorstehend beschrieben, mit einem dreiteiligen Code bezeichnet werden. Es kann selbstverständlich mehr als eine wt-Aminosäure ausgetauscht sein. Bei der Bezeichnung von Verbindungen mit solchen N-Termini wird die Zahl der Substitutionen durch "sn" angegeben, wobei "n" die Zahl der ausgetauschten Aminosäuren ist, wobei z. B. für den Austausch die in Tabelle 6-A aufgeführten Aminosäuren (jedoch nicht ausschließlich) verwendet werden können. Beispielsweise bezeichnet der N-Terminus #N-14451 den N-Terminus 144, wie in Tabelle 6-B dargestellt, während der N-Terminus #N-14454 den N-Terminus bezeichnet, in dem R-23 durch G ersetzt und die folgenden drei wt-Aminosäuren durch andere Aminosäuren ausgetauscht sind. Die Proteine dieser Ausführungsform, die mehrere Aminosäuresubstitutionen enthalten, können durch eine Aneinanderreihung von N-Terminus-Bezeichnungen, die spezifische Austausche anzeigen, wie nachstehend dargestellt, bezeichnet werden:
Beispiele von Verbindungen mit mehreren Substitutionen am N-Terminus, wobei Asn-117 durch Gln und Arg-275 durch Thr ersetzt ist:
Eine Untergattung von besonderem Interesse ist durch den Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren im Bereich von Y-67 bis S-69 gegebenenfalls mit Deletion und/oder Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren im Bereich von Arg-23 bis L-66 mit einer Modifikation, wie vorstehend beschrieben, an einer oder mehreren Glykosylierungsstellen und gegebenenfalls am Arg-275 gekennzeichnet.
In einem erfindungsgemäßen Gesichtspunkt enthalten die Proteine mindestens eine als "komplexes Kohlenhydrat" bezeichnete, für Säuger-Glykoproteine charakteristische Zuckereinheit. Wie nachstehend genauer beschrieben, können derartige, ein "komplexes Kohlenhydrat" enthaltende Glykoproteine durch Expression eines DNA-Moleküls, das die gewünschte Polypeptidsequenz codiert, in Wirtszellen von Säugern produziert werden. Geeignete Wirtszellen von Säugern und Verfahren zur Transformation, Kultur, Vermehrung, zum Absuchen, zur Herstellung und Reinigung des Produkts sind im Stand der Technik bekannt. Vgl. z. B. Gething und Sambrook, Nature 293 (1981), 620–625, oder auch Kaufman et al., Molecular and Cellular Biology 5 (7) (1985), 1750–1759, oder Howley et al., US-Patent Nr. 4,419,446.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft tPA-Varianten, wie vorstehend beschrieben, in denen jede Kohlenhydrateinheit eine prozessierte Form des anfänglichen Dolicolgebundenen Oligosaccharids ist, das für in Insektenzellen hergestellte Glykoproteine charakteristisch ist, im Gegensatz zu einem "komplexen Kohlenhydrat"-Substituenten, der für Säugerglykoproteine, einschließlich des Säuger-t-PAs, kennzeichnend ist. Eine derartige Glykosylierung wie bei Insektenzellen wird hier zur Vereinfachung als Kohlenhydrat mit "viel Mannose" bezeichnet. In dieser Beschreibung entsprechen die komplexen und viel Mannose enthaltenden Kohlehydrate der Definition von Kornfeld et al., Ann. Rev. Biochem. 54 (1985), 631–64. Erfindungsgemäße Varianten mit "viel Mannose" sind, wie vorstehend beschrieben, durch ein variables Polypeptidrückgrat charakterisiert, das mindestens eine besetzte N-Glykosylierungsstelle enthält. Derartige Varianten können durch Expression einer die Variante codierenden DNA-Sequenz in Insekten-Wirtszellen produziert werden. Geeignete Insekten-Wirtszellen sowie zur Durchführung dieses Gesichtspunktes der Erfindung nützliche Verfahren und Materialien zur Transformation/Transfektion, zur Züchtung von Insektenzellen, zum Absuchen und zur Herstellung und Reinigung des Produkts sind im Stand der Technik bekannt. So hergestellte Glykoproteine unterscheiden sich auch dadurch von natürlichem t-PA und von t-PA, das bisher durch Rekombinationsverfahren in Säugerzellen hergestellt wurde, daß die Varianten dieses erfindungsgemäßen Gesichtspunkts keine terminalen Sialinsäuren oder Galaktose-Substituenten auf den Kohlenhydrateinheiten oder andere Proteinmodifizierungen, die für von Säugern stammende Glykoproteine charakteristisch sind, enthalten.
Die erfindungsgemäßen Proteine, die keine N-gebundenen Kohlehydrateinheiten enthalten, können ebenfalls durch Expression eines DNA-Moleküls, das die gewünschte Variante codiert, z. B. die Verbindungen 1–6 bis 1–11 von Tabelle 1, in Wirtszellen produziert werden, die Säuger-, Insekten-, Hefe oder Bakterienzellen sind, wobei eukaryotische Wirtszellen gegenwärtig bevorzugt werden. Wie vorstehend angegeben, sind geeignete Säuger- und Insekten-Wirtszellen und ferner geeignete Hefe- und bakterielle Wirtszellen sowie bei der Durchführung dieses Gesichtspunktes der Erfindung nützliche Verfahren und Materialien zur Transformation/Transfektion, zur Zellkultur, zum Absuchen und zur Herstellung und Reinigung des Produkts ebenfalls im Stand der Technik bekannt.
Wie es jedem Durchschnittsfachmann verständlich sein sollte; schließt die Erfindung darüberhinaus weitere t-PA-Varianten ein, die anstelle einer Aminosäure-Deletion im Bereich Val-4 bis Val-72 durch eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen innerhalb des Bereichs, insbesondere im Bereich Val-4 bis Val-72 oder durch eine Kombination einer Deletion und Substitution gekennzeichnet sind. Die diese Verbindungen codierenden cDNAs können z. B. durch Verfahren, die den hier beschriebenen Mutageneseverfahren entsprechen, unter Verwendung von geeigneten Mutagenese-Oligonucleotiden einfach hergestellt werden. Die cDNAs werden an einem oder mehreren der Codons für R¹, R² und R³ und gegebenenfalls am Arg-275 mutagenisiert und können durch die hier beschriebenen Verfahren in Expressionsvektoren inseriert und in Wirtszellen exprimiert werden. Diese Proteine sollten die vorteilhaften pharmakokinetischen Eigenschaften der anderen erfindungsgemäßen Verbindungen aufweisen, und durch sie sollte eine schädliche Antigenität nach der Verabreichung in Arzneimitteln, die den hier beschriebenen entsprechen, möglicherweise vermieden werden.
Wie der vorstehenden Beschreibung zu entnehmen ist, werden sämtliche erfindungsgemäßen Varianten durch Rekombinationsverfahren unter Verwendung von DNA-Sequenzen hergestellt, die Analoge codieren, die auch weniger oder keine potentiellen Glykosylierungsstellen im Vergleich zu natürlichem menschlichem t-PA enthalten und gegebenenfalls eine Deletion oder einen Austausch des Arg-275 enthalten. Derartige DNA-Sequenzen können durch eine übliche ortsspezifische Mutagenese von t-PA codierenden DNA-Sequenzen hergestellt werden.
t-PA codierende DNA-Sequenzen sind cloniert und charak terisiert worden: Vgl. z. B. D. Pennica et al., Nature (London) 301 (1983), 214, und R. Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 5(7) (1985), 1750. Clon ATCC 39891, der ein thrombolytisch aktives t-PA-Analogon codiert, ist insofern einzigartig, als er an Position 245 anstelle der Aminosäure Val einen Met-Rest enthält. Typischerweise codiert die DNA-Sequenz eine Leadersequenz, die prozessiert, d. h., durch die Wirtszelle erkannt und entfernt wird, worauf die Aminosäurereste des vollständigen Proteins, das mit Gly.Ala.Arg.Ser.Tyr.Gln. etc. beginnt, folgen. Je nachdem, in welchen Medien und welcher Wirtszelle die DNA-Sequenz exprimiert wird, kann das so produzierte Protein mit dem Aminoterminus G1y.Ala.Arg beginnen oder weiter. prozessiert werden, so dass die ersten drei Aminosäurereste proteolytisch entfernt werden. Im letzten Fall weist das reife Protein einen Aminoterminus auf, der Ser.Tyr.Gln.Leu. etc. umfaßt. t-PA-Varianten, die einen der Aminotermini aufweisen, sind thrombolytisch aktiv und Bestandteil der Erfindung. Zu den erfindungsgemäßen Varianten gehören auch Proteine, die entweder Met₂₄₅ oder Val 245 enthalten, sowie weitere Varianten, z. B. allele Varianten oder andere Aminosäuresubstitutionen oder Deletionen, die thrombolytische Aktivität beibehalten.
Wie vorstehend beschrieben, können individuelle erfindungsgemäße Varianten codierende DNA-Sequenzen durch übliche ortsspezifische Mutagenese einer DNA-Sequenz hergestellt werden, die menschliches t-PA oder Analoge oder ihre Varianten codiert. Zu derartigen Mutagenese-Verfahren gehört das M13System von Zoller und Smith, Nucleic Acids Res. 10 (1982), 6487–6500, Methods Enzymol. 100 (1983), 468–500, und DNA 3 (1984), 479–488, in dem einzelsträngige DNA verwendet wird, und das Verfahren von Morinaga et al., Bio/technology (Juli 1984), 636–639, in dem DNA als Heteroduplex verwendet wird. Mehrere Beispiele von Oligonucleotiden, die gemäß derartiger Verfahren zum Erhalt von Deletionen am N-Terminus oder zur Umwandlung eines Asparaginrestes in beispielsweise Threonin oder Glutamin verwendet werden, sind in Tabelle 7 dargestellt. Es ist natürlich selbstverständlich, daß eine DNA, die eines der erfindungsgemäßen Glykoproteine codiert, durch einen Fachmann durch eine ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung von zweckmäßig gewählten Oligonucleotiden bzw. eines Oligonucleotids analog produziert werden kann. Eine Expression der DNA durch übliche Verfahren in einem Wirtszellsystem aus Säuger-, Hefe-, Bakterien- oder Insektenzellen liefert die gewünschte Variante. Säuger-Expressionssysteme und die dadurch erhaltenen Varianten werden gegenwärtig bevorzugt.
Die hier beschriebenen Expressionsvektoren für Säugerzellen können durch dem Fachmann vertraute Verfahren synthetisiert werden. Die Bestandteile der Vektoren, beispielsweise die bakteriellen Replicons, Selektionsgene, Enhancer, Promotoren etc., können von natürlichen Quellen oder durch Synthese mit bekannten Verfahren erhalten werden. Vgl. Kaufman et al., J. Mol. Biol. 159 (1982), 51–521, und Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci. 82 (1985) 689–693.
Etablierte Zellinien, zu denen transformierte Zellinien gehören, sind als Wirte geeignet. Normale diploide Zellen, Zellstämme, die von einer in vitro-Kultur von primärem Gewebe stammen, sowie primäre Explantate (die relativ undifferenzierte Zellen, wie hämatopoetische Stammzellen, einschließen) sind ebenfalls geeignet. Die Kandidatenzellen müssen hinsichtlich des Selektionsgens nicht genotypisch defizient sein, wenn das Selektionsgen dominant ist.
Die Wirtszellen sind vorzugsweise etablierte Säugerzellinien. Zur stabilen Integration der Vektor-DNA in die chromosomale DNA und zur anschließenden Vermehrung der integrierten Vektor-DNA, jeweils durch übliche Verfahren, werden gegenwärtig CHO-Zellen (Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters) bevorzugt. In einer anderen Ausführungsform kann die Vektor-DNA das gesamte oder einen Teil des Genoms des Rinder-Papillomavirus enthalten (Lusky et al., Cell 36 (1984), 391–401) und als ein stabiles episomales Element in Zellinien, wie C127-Mauszellen, eingeführt werden. Weitere verwendbare Säuger-Zellinien schließen HeLa-Zellen, COS-1-Affenzellen, Maus-L-929-Zellen, 3T3-Linien, die von "Swiss"-, BALB/c- oder NIH-Mäusen stammen, BHK- oder HaK-Hamster-Zellinien etc. ein, sie sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Stabile Transformanten werden anschließend durch immunologische oder enzymatische Standardtests abgesucht, um festzustellen, ob das Produkt exprimiert wird. Die Gegenwart der die Proteinvarianten codierenden DNA kann durch Standardverfahren, wie dem Southern-Blot-Verfahren, nachgewiesen werden. Die vorübergehende Expression der die Varianten codierenden DNA während mehrerer Tage nach der Einführung der Expressions-Vektor-DNA in geeignete Wirtszellen, beispielsweise in COS-1Affenzellen, wird ohne Selektion durch einen Aktivitäts- oder Immuntest der Proteine im Kulturmedium gemessen.
Zur Expression in Bakterien kann die die Variante codierende DNA weiter modifiziert werden, wobei sie verschiedene, im Stand der Technik bekannte Codons zur Expression in Bakterien enthält und vorzugsweise im Leseraster mit einer Nucleotidsequenz funktionell verbunden wird, die ein sekretorisches Leader-Polypeptid codiert, das die Expression, Sekretion und das Prozessieren der reifen Proteinvariante in Bakterien ermöglicht, wie dies im Stand der Technik ebenfalls bekannt ist. Die in Säuger-, Insekten-, Hefe- oder bakteriellen Wirtszellen exprimierten Verbindungen können anschließend gewonnen, gereinigt und/oder im Hinblick auf physikalisch-chemische, biochemische und/oder klinische Parameter charakterisiert werden, wobei immer bekannte Verfahren verwendet werden.
Es wurde festgestellt, daß diese Verbindungen gegen menschliches t-PA gerichtete monoclonale Antikörper binden und daher durch Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung solcher Antikörper gewonnen und/oder gereinigt werden können. Ferner weisen diese Verbindungen eine t-PA-artige Enzymaktivität auf, d. h., die erfindungsgemäßen Verbindungen aktivieren Plasminogen in Gegenwart von Fibrin effektiv, wobei eine Fibrinolyse bewirkt wird, die durch einen im Stand der Technik bekannten indirekten Test unter Verwendung des chromogenen Substrats S-2251 für Plasmin gemessen werden kann.
Diese Erfindung schließt außerdem Zusammensetzungen zur thrombolytischen Therapie ein, die eine therapeutisch wirksame Menge einer vorstehend beschriebenen Variante zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen parenteralen Träger umfassen. Eine derartige Zusammensetzung kann dem menschlichen t-PA entsprechend verwendet werden und sollte bei Menschen oder niederen Tieren, beispielsweise Hunden, Katzen und anderen Säugern nützlich sein, bei denen bekanntermaßen thrombotische Probleme im Herzkreislaufsystem auftreten. Die Zusammensetzungen sollen sowohl zur Behandlung als auch, falls gewünscht, zur Verhinderung von thrombotischen Zuständen verwendet werden. Die genaue Dosierung und das Verabreichungsverfahren werden durch den behandelnden Arzt je nach Potenz und pharmakokinetischein Profil der jeweiligen Verbindung sowie nach verschiedenen Faktoren festgelegt, die die Wirkungen von Arzneimitteln modifizieren, beispielsweise das Körpergewicht, Geschlecht, die Ernährung, Zeit der Verabreichung, Arzneimittelkombination, Reaktionsempfindlichkeiten und die Schwere des jeweiligen Falls.
Die nachstehenden Beispiele sollen die erfindungsgemäßen Ausführungsformen erläutern. Es ist selbstverständlich, daß die Erfindung durch diese Beispiele lediglich erläutert wird und nicht auf sie beschränkt ist, es sei denn es ist in den beigefügten Ansprüchen entsprechend angegeben.
In allen Beispielen, in denen Insektenzellen zur Expression verwendet wurden, war das verwendete nukleäre Polyedervirus die L-1-Variante von Autographa Californica und die verwendete Insekten-Zellinie die Zellinie Spodoptera frugiperda IPLB-SF21 (J. L. Vaughn et al., In Vitro 13 (1977), 213–217). Die Manipulationen an den Zellen und Viren entsprachen den Angaben in den Veröffentlichungen (G. D. Pennock et al., a, a. 0., D. W. Miller, P. Safer und L. K. Miller, Genetic Engineering Bd. 8, Seite 277–298, J. K. Setlow und A. Hollaender (Hrsg.) Plenum Press (1986)). Die RF-m13-Vektoren, mp18 und mpll, sind von New England Biolabs erhältlich. Der Durchschnittsfachmann, den diese Erfindung betrifft, wird jedoch wissen, daß weitere Viren, Stämme, Wirtszellen, Promotoren und Vektoren, die, wie vorstehend beschrieben, die betreffende cDNA enthalten, zur Durchführung jeder erfindungsgemäßen Ausführungsform ebenfalls verwendet werden können. Die verwendeten DNA-Manipulationen entsprechen, sofern hier nicht gesondert angegeben, denen von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, NY 1982).
Tabelle 7 Beispiele für Oligonucleotide zur Mutagenese
Plasmidderivate
Eine Mutagenese von cDNAs an den verschiedenen Aminosäurencodons wurde durch das Verfahren von Zoller und Smith unter Verwendung eines geeigneten Restriktionsfragments der cDNA in M13-Plasmiden durchgeführt. Deletionen innerhalb der cDNA wurden durch eine "loopout"-Mutagenese unter Verwendung eines geeigneten Restriktionsfragments, z. B. des SacI-Fragments, der cDNA entweder in M13-Vektoren oder durch Heteroduplex-"loopout" im Plasmid pSVPA4 durchgeführt.
Das Plasmid pSVPA4 wurde konstruiert, damit das t-PAGlycoprotein in Säugerzellen exprimiert werden kann. Das Plasmid wurde hergestellt, indem zunächst die DNA, die das große SV40-T-Polypeptid codiert, vom Plasmid pspLT5 (Z. Zhu et al., J. Virology 51 (1984), 170–180) entfernt wurde. Dies wurde durch eine vollständige Spaltung mit XhoI erreicht, wonach anschließend mit der Restriktionsendonuclease BamHI partiell gespalten wurde. Der das große T codierende Bereich von SV40 in pspLT5 wurde durch die menschlichen t-PA codierende Sequenz ausgetauscht, indem ein t-PA codierendes SalI/BamHI-Restriktionsfragment mit überstehenden Enden, das durch Spaltung des Plasmids J205 (ATCC Nr. 39568) mit SalI und BamHI isoliert worden war, mit dem parentalen, mit XhoI/BamHI gespaltenen Vektor pspLT5, der wie vorstehend beschrieben hergestellt worden war, ligiert wurde. Daher wird das t-PA nach der Einführung in Säugerzellen in diesem Vektor unter der Kontrolle des späten Promotors von SV40 transkribiert. Diese schließlich erhaltene Konstruktion erhält die Bezeichnung pSVPA4.
Das Plasmid pLDSG ist ein amplifizierbarer Vektor, mit dem t-PA in Säugerzellen, beispielsweise in CHO-Zellen, exprimiert werden kann. pLDSG enthält eine Maus-DHFR-cDNA- Transkriptionseinheit, die den späten Hauptpromotor (MLP) des Typ 2-Adenovirus, den Affenvirus 40-(SV40)-Enhancer und -Replikationsursprung, den späten Promotor von SV40 (in der gleichen Orientierung wie der MLP von Adenovirus) verwendet, ein Gen, das eine Tetracyclinresistenz codiert, und eine cDNA, die menschliches t-PA (Met-245) in der richtigen Orientierung im Hinblick auf den MLP des Typ 2-Adenovirus. Die Herstellung von pLDSG aus pCVSVL2 (ATCC Nr. 39813) und einer t-PA codierenden cDNA ist genauer beschrieben worden, wie auch die gleichzeitige Transformation mit und Amplifikation von pLDSG in CHO-Zellen. Kaufman et al., Mol. and Cell. Bio. 5(7) (1985), 1750–1759.
Das Plasmid pWGSM ist mit der Ausnahme, daß die cDNAInsertion menschliches Val-245-t-PA codiert, mit pLDSG identisch. pWSGM kann unter Verwendung von cDNA vom Plasmid J205 (ATCC Nr. 39568) oder pIVPA/1 (ATCC Nr. 39891) konstruiert werden. In dieser Beschreibung können pWGSM und pLDSG austauschbar verwendet werden, obwohl, wie vorstehend beschrieben, der erste Vektor Val-245-Proteine und der letzte Met-245Proteine produziert.
pIVPA/I (ATCC Nr. 39891) ist ein baculoviraler Transplacement-Vektor, der eine t-PA codierende cDNA enthält. pIVPA/I und mutagenisierte Derivate davon werden zur Insertion einer gewünschten cDNA in ein baculovirales Genom verwendet, so dass die Transkription der cDNA vom baculoviralen PolyhedrinPromotor kontrolliert wird.
Heteroduplex-Mutagenese
Die Mutagenese mittels einer Heteroduplex-DNA in bestimmten Bereichen vom t-PA-Expressionsplasmid, pSVPA4, schließt die nachstehend beschriebenen Schritte ein:
Herstellung der Ampicillin-sensitiven pSVPA4-DNA

1. Plasmid pSVPA4 (15 μg) wurde mit PvuI vollständig linearisiert. Das Gemisch wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und die DNA unter Verwendung von zwei Volumina Ethanol sowie 0,1 M NaCl ausgefällt.
2. Die DNA wurde in 21 μ1 Wasser, 1 μ1 dNTP-Lösung (die 2 mM dATP, dGTP, dTTP und dCTP enthielt), 2,5 μ1 10 × NickTranslationspuffer (0,5 M Tris-Cl, pH 7,5, 0,1 M MgSO₄, 10 mM DTT, 500 μg/ml) und 0,5 μ1 (2 Einheiten) des großen Fragments der DNA-Polymerase I (New England Biolabs) resuspendiert. Dieses Gemisch wurde dreißig Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend mit Phenol/Chloroform extrahiert, woran sich, wie vorstehend beschrieben, eine Ethanolausfällung anschloss.
3. Die ausgefällte DNA wurde durch Zugabe von 75 μl Wasser zu 0,2 μg/μl resuspendiert.

Herstellung von Ampicillin-resistenter pSVPA4-DNA

1. Das Plasmid pSVPA4 (15 μg) wurde mit SacI gespalten, die dieses Plasmid zweimal innerhalb der t-PAcodierenden Sequenz spaltet, wobei zwei Restriktionsfragmente erzeugt werden, ein 1,4 kbp t-PAcodierendes Restriktionsfragment sowie der parentale Vektor. Nach der Restriktion wurde 1 μl (28 Einheiten) alkalische Phosphatase des Kälberdarms (Boehringer Mannheim) zugesetzt und anschließend 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Die beiden Banden wurden getrennt, indem dieses Gemisch auf ein 0,7 % Agarosegel aufgetragen wurde. Das Restriktionsfragment des parentalen Vektors wurde aus dem Gel ausgeschnitten und bei 4°C durch Adsorption an Siliziumdioxid extrahiert, wonach 30 Minuten bei 37°C mit 50 mM Tris/1 mM EDTA eluiert wurde. Die eluierte DNA wurde auf eine Endkonzentration von 0,2 μg/μl eingestellt.

Aneinanderlagerung zur Heteroduplex

1. Herstellung eines Gemisches aus 6 μl (1,2 μl) Ampicillin-sensitiver pSVPA4-DNA und 6 μl (1,2 μg) Ampicillin-resistenter pSVPA4-DNA.
2. Zugabe eines gleichen Volumens (12 μl) 0,4 M NaOH. Inkubation für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
3. Langsame Zugabe von 4,5 Volumina (108 μl) 0,1 M Tris-HCl bei einem pH-Wert von 7,5/20 mM HCl.
4. Zugabe von 50 picomol (5 μl) phosphoryliertes mutagenes Oligonucleotid zu 45 μl Heteroduplexgemisch.
5. Dieses Gemisch wurde zwei Stunden bei 68°C inkubiert und anschließend bei Raumtemperatur langsam abgekühlt.

Mutagenese

1. Zur Mutagenese wurde jede Reaktionslösung auf die nachstehend angegebenen Konzentrationen eingestellt, indem 7 μl 2 mM MgCl₂/0,2 mM ATP/60 μM dATP, dTTP, dGTP, dCTP/4 mM DTT/40 Einheiten/ml Klenowfragment der E. coli-DNA-Polymerase I (B. R. L.), 2000 Einheiten/ml T4-DNA-Ligase (N. E. B.) zu den Heteroduplexgemischen zugesetzt wurden. Dieses Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
2. Die Reaktionslösung wurde anschließend mit Phenol/Chloroform extrahiert, wonach mit Ethanol ausgefällt wurde. Die ausgefällte DNA wurde in 12 μl 50 mM Tris-Cl/1 mM EDTA resuspendiert. 4 μl wurden zur Transformation kompetenter HB101-Bakterien verwendet.
3. Ampicillin-resistente Kolonien wurden mit 1 × 10⁶ cpm/ml eines ³²P-markierten Oligonucleotids in 5 × SSC, 0,1 % SDS, 5 × Denhardt-Reagens und 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA abgesucht.
4. Die Filter wurden mit 5 × SSC und 0,1 % SDS bei einer Temperatur gewaschen, die 5°C unterhalb der berechneten Schmelztemperatur der Oligonucleotidsonde lag.
5. Die DNA wurde aus positiv hybridisierenden Clonen hergestellt und zu Beginn durch Spaltung mit verschiedenen Restriktionsenzymen und einer Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Die DNA wurde auf Nitrozellulose transferiert, die Filter wurden präpariert und mit den absuchenden Sonden hybridisiert, um sicherzustellen, dass das mutagene Oligonucleotid in das richtige Fragment eingeführt worden war.
6. Die DNA wurde anschließend erneut in E. coli transformiert und Ampicillin-resistente Kolonien wurden auf eine Hybridisierung mit der Oligonucleotidsonde getestet.
7. Mutationen wurden schließlich durch eine DNA-Sequenzierung (Sauger) überprüft.

Herstellung von mutagenisierten cDNAs: M13-Verfahren
Die nachstehende schematische Restriktionskarte stellt eine menschlichen t-PA codierende cDNA (oberhalb) dar, wobei die Spaltstellen bestimmter Endonucleasen (unterhalb) angegeben sind:
Das Initiationscodon ATG und die (a) codierenden cDNABereiche
R¹, R² und R³ sind angegeben. Somit kann eine Mutagenese am N-Terminus beispielsweise unter Verwendung des SacI-Fragments oder des BglII/NarI-Fragments durchgeführt werden. Eine Mutagenese am Arg-275 und/oder R¹ und/oder R2 kann beispielsweise unter Verwendung des SacI-Fragments öder des BglII/SacI-Fragments durchgeführt werden. Eine Mutagenese am R³ kann unter Verwendung eines EcoRI/XmaI- oder EcoRI/ApaI-Fragments durchgeführt werden. Die Wahl des Restriktionsfragments kann davon abhängen, welche bestimmten Vektoren zur Mutagenese und/oder zur Konstruktion von Expressionsvektoren geeignet sind.
Üblicherweise kann das zu mutagenisierende cDNA-Restriktionsfragment aus der vollständigen cDNA, die z. B. in pWGSM, pIVPA/I oder pSVPA4 vorhanden ist, unter Verwendung der/des angegebenen Endonucleaseenzyms(e) ausgeschnitten und anschließend mutagenisiert werden, z. B. mit den in Tabelle 7 dargestellten Oligonucleotiden oder anderen, für die gewünschte Mutagenese konstruierten Oligonucleotiden.
Beispiele für mutagenisierte cDNA-Fragmente, die so hergestellt werden können, sind nachstehend in Tabelle 8 dargestellt.
Tabelle 8 Beispiele für mutagenisierte cDNA-Fragmente
Im Anschluss an die Mutagenese kann das Fragment, mit oder ohne weitere Mutagenese, aus dem M13-Vektor ausgeschnitten und in einen Expressionsvektor zurück ligiert werden, der die gesamte oder einen Teil der cDNA enthält und zuvor mit den (dem) gleichen zum Ausschneiden des mutagenisierten Fragments aus dem M13-Vektor verwendeten Enzym en) gespalten worden ist. Durch dieses Verfahren kann die vollständige, nach Wunsch mutagenisierte cDNA erneut unter Verwendung eines oder mehrerer mutagenisierter Fragmente als Restriktionsfragment-Kassetten erneut zusammengesetzt werden.
cDNAs, die die nachstehenden Verbindungsbeispiele codieren (vgl. die Tabelle auf Seite 9 und die Tabellen 2.0, 2.5 & 3) können, wie nachstehend beschrieben, aus den mutagenisierten Fragmenten von Tabelle 8 hergestellt werden:
Die Plasmide pIVPA oder pSVPA4 können neben ihrer Nützlichkeit als Expressionsvektoren auch als ein "Depot" zur Konstruktion von cDNAs, die jede gewünschte Permutation von mutagenisierten Stellen aufweisen, verwendet werden. Daher können die (mittels M13 oder Heteroduplexbildung) mutagenisierten Plasmide "pIVPA/Δ" oder "pSVPA4/Δ", die eine gewünschte Modifikation des den N-terminalen Bereich codierenden cDNA-Bereichs enthalten, mit NarI (partiell) und XmaI (SmaI) (vollständig) gespalten werden, um den cDNA-Bereich zu entfernen, der die R¹, R² und R³ umfassende Proteindomäne codiert.
Ein zweites Plasmid pIVPA oder pSVPA4, mutagenisiert, falls erwünscht, (mittels M13 oder Heteroduplexbildung) in jeder Kombination von Arg-275, R¹, R² und R³ codierenden Bereichen, kann anschließend mit NarI (vollständig) und XmaI (SmaI) (vollständig) gespalten und das NarI/XmaI (SmaI)-Fragment identifiziert, isoliert und mit dem NarI/XmaI (SmaI)-gespaltenen pIVPA/Δ oder pSVPA4/Δ ligiert werden. Unter Verwendung dieser NarI/XmaI (SmaI)-Restriktionsfragment-Kassette können beispielsweise die gewünschten mutagenisierten cDNAs in pIVPA oder pSVPA4 konstruiert werden. Die mutagenisierte cDNA kann anschließend, z. B. als eine BglII/XmaI-Restriktionsfragment-Kassette in das BglII/XmaI-gespaltene pWGSM zur Expression in Säugern, falls erwünscht, transferiert werden.
Beispiele
Beispiel 1
Herstellung von G1n₁₁₇-Deletionsvarianten
A. Herstellung von am Gln-117 verkürzter cDNA
cDNA-Moleküle, die die Polypeptidsequenz der Verbindungen 2-1/N-21/Arg codieren, wurden unter Verwendung des Oligonucleotid-gerichteten Mutageneseverfahrens von Zoller und Smith hergestellt. Insbesondere wurde der das t-PA-Gen enthaltende Mutagenesevektor RF-M13/t-PA aus dem Säuger-t-PA-Expressionsplasmid pSVPA4 konstruiert. RF M13/t-PA wurde konstruiert, indem zunächst pSVPA4 mit der Restriktionsendonuclease SacI vollständig gespalten wurde. Das etwa 1436 Basenpaar (bp)-SacI-Fragment codiert einen grossen Teil der Polypeptidsequenz von t-PA und schließt die Nucleotidsequenzen ein, die die Konsensus-N-Glykosylierungsstellen codieren, die die Asparaginreste 117, 184 und 218 enthalten. Dieses 1436 by (hier nachstehend als 1,4 kbp bezeichnet) Fragment wurde durch präparative Agarose-Gelelektrophorese gereinigt.
Das SacI-Fragment der t-PA-cDNA, das vorstehend als ein SacI-Fragment erhalten worden war, wurde mit einem linearisierten doppelsträngigen RF-M13mp18-DNA-Vektor ligiert, der zuvor mit SacI gespalten worden war. Das Ligierungsgemisch wurde verwendet, um Transformationskompetente bakterielle JM101-Zellen zu transformieren. M13-Plaques, die die von transformierten Zellen produzierte, von t-PA stammende DNA enthielten, wurden durch analytische DNA-Restriktionsanalyse und/oder Plaquehybridisierung identifiziert und isoliert. Radioaktiv-markierte Oligonucleotide (~17-mere, mit einer positiven Polarität), die einem Bereich zwischen den SacIRestriktionsstellen der t-PA codierenden, in Tabelle 1 dargestellten Nucleotidsequenz entsprachen, wurden als Sonden verwendet, wenn mittels Filterhybridisierung t-PA-DNA enthaltende virale Plaques nachgewiesen werden sollten. Sämtliche Oligonucleotide wurden nach Herstellerangaben durch automatisierte Synthese mit einem DNA-Synthesizer (Applied Biosystems) hergestellt.
Einige der durch Restriktions- oder Hybridisierungsanalyse nachgewiesenen positiven Plaques wurden anschließend durch eine übliche Plaquereinigung weiter geclont. Der durch das Plaque-Reinigungsverfahren erhaltene, gereinigte M13/t-PA-Bakteriophage wurde zur Infektion von JM101-Zellen verwendet. Diese infizierten Zellen produzieren eine cytoplasmatische doppelsträngige "RF"-M13/t-PA-Plasmid-DNA. Die infizierten Zellen produzieren im Kulturmedium auch Bakteriophagen, die einzelsträngige, zu dem 1,4 kbp-SacI-Fragment von t-PA und der M13-DNA komplementäre DNA enthalten. Die einzelsträngige DNA wurde aus dem M13/t-PA enthaltenden, aus dem Kulturmedium isolierten Phagen gereinigt. Diese einzelsträngige M13/t-PA-DNA wurde als Matrize in einer Mutagenesereaktion gemäß dem Verfahren von Zoller und Smith unter Verwendung des Oligonucleotids #3 von Tabelle 7 verwendet. Dieses Mutageneseereignis verursacht durch Umwandlung der DNA-Sequenz "AAC" in "CAG" einen Austausch des Asn-Codons zu einem Gln-Codon an Position 117 des dadurch erhaltenen codierenden DNA-Strangs. Nach der Mutagenesereaktion wurde die DNA in den bakteriellen Stamm JM101 transformiert. Zur Identifizierung von mutagenisierten cDNAs wurden die Plaques der Transformanten durch DNA-Hybridisierung unter Verwendung des radioaktiv-markierten Oligonucleotids #4 von Tabelle 7 abgesucht. Sämtliche Oligonucleotidbeispiele in Tabelle 7 weisen eine positive Polarität auf, d. h., sie stellen Teile eines codierenden und nicht eines nicht-codierenden DNA-Stranges dar. Sämtliche positiv hybridisierenden Plaques wurden durch anschließende sekundäre Infektionen von JM101-Zellen mit M13-Phagen, die die mutagenisierte DNA enthielten, weiter gereinigt.
RF-M13/t-PA-Plasmid-DNA wurde aus JM101-Zellen, die mit dem gereinigten, die mutagenisierte t-PA-cDNA enthaltenden M13Phagen infiziert worden waren, gereinigt. Das so erhaltene RFM13/t-PA-Plasmid enthält das am Gln₁₁₇ mutagenisierte SacIRestriktionsfragment der t-PA-DNA. Dieses mutagenisierte Restriktionsfragment kann anschließend weiter mutagenisiert werden, wiederum nach dem Verfahren von Zoller und Smith, allerdings unter Verwendung der nachstehend beschriebenen Oligonucleotide. Die nachstehend beschriebenen Oligonucleotide wurden konstruiert, um eine Deletion (Schleifenbildung) innerhalb des cDNA-Bereichs der N-terminalen Domäne zu induzieren.
Deletionsmutagenese 1: Das Oligonucleotid #8 in Tabelle 7 bewirkte eine Deletion der cDNA, die von Cys-6 bis einschließlich Ser-50 reichte. Im Anschluss an diese zweite Mutagenesereaktion wurde die DNA in JM101-Zellen transformiert. Zur Identifizierung von mutagenisierten cDNAs wurden die Plaques der Transformanten, wie vorstehend beschrieben, abgesucht, allerdings unter Verwendung des radioaktiv-markierten Oligonucleotids #9 von Tabelle 7. Die positiv hybridisierenden Plaques können durch anschließende erneute Infektionen vonJM101-Zellen mit dem M13-Phagen, der die zweifach mutagenisierte t-PAcDNA enthält, gereinigt werden. Die wie nachstehend beschrieben hergestellte cDNA, die dieses mutagenisierte Restriktionsfragment enthält, codiert Verbindung 2-1/N-21/Arg, in der Ile-5 über eine Peptidbindung mit Cys-51 kovalent verbunden ist.
Dieses mutagenisierte Restriktionsfragment kann als eine SacI-Kassette durch Verfahren, die den in Beispiel #3B beschriebenen entsprechen, erneut mit dem Säuger-Expressionsvektor pSVPA4 ligiert werden oder zur Insertion in den Insektenzellen-Expressionsvektor pIVPA/I (ATCC Nr. 39891) als eine BglII/SacI-Kassette, die von der modifizierten RF-M13/tPA-DNA stammt, verwendet werden.
B. Herstellung von Vektoren, die zur Expression von Gln₁₁₇-Deletionsvarianten mit viel Mannose verwendet werden
Das gereinigte RF-M13/tPA, das die modifizierte und verkürzte t-PA-cDNA enthält, die wie vorstehend beschrieben hergestellt wird, kann mit den Restriktionsendonucleasen BglII und SacI gespalten werden. Das etwa 1,2 kbp-BglII/SacIRestriktionsfragment wurde durch eine übliche präparative Gelelektrophorese gereinigt. Das so erhaltene BglII/SacIFragment stellt eine mutagenisierte Kassette dar, der ein 5'- und 3'-Bereich der DNA fehlt, die den Amino- und Carboxy-Terminus des translatierten Proteins codiert.
Der Insekten-Expressionsvektor pIVPA/I (ATCC Nr. 39891) enthält eine Wildtyp-t-PA-cDNA-Insertion, die mit einem Polyhedrin-Promotor sowie flankierenden DNA-Sequenzen des Baculovirus funktionell verbunden ist. pIVPA/I wurde mit BglII und SacI gespalten, wobei ein t-PA-codierender Bereich ausgeschnitten wird, der den N-Terminus und R1 und R2 umfasst. Die BglII/SacI-Kassette, die die mutagenisierten, am N-Terminus modifizierten t-PA-cDNA-Fragmente enthält, kann anschließend jeweils mit pIVPA/I-Expressionsvektor-DNA ligiert werden, die zuvor nach einer Spaltung mit BglII und SacI gereinigt wurde. Das erhaltene Plasmid pIVPA/Δ FBR, Gln₁₁₇ sollte die mutagenisierten cDNAs enthalten, die die Verbindung 2-1/N-21/Arg codieren, die nun mit dem Polyhedrin-Promotor funktionell verbunden ist. Die Nucleotidsequenz der mutagenisierten cDNA-Insertion kann durch Sequenzierung des Supercoils mit dem Plasmid als Substrat überprüft werden. Vgl. z. B. E. Y. Chen t al., DNA 4(2) (1985), 165–170.
B. Einführung der mutagenisierten cDNA in das Insektenvirus
Das pIVPA-Plasmid, das die mutagenisierte cDNA enthält, kann in das Insektenvirus durch gemeinsame Transfektion mit Wildtyp-AcNPV in Spodopterazellen eingeführt werden. 1 μg gereinigte Autographa californica NPV-DNA und 10 μg der gewünschten pIVPA-DNA werden durch ein CalciumphosphatTransfektionsverfahren (K. N. Potter und L. K. Miller, J. Invertebr. Path. 36 (1980), 431–432) in auf Gewebekulturgefäßen wachsende Spodoptera-Zellen eingeführt. Die gemeinsame Einführung dieser DNAs in die Zellen verursacht ein doppeltes Rekombinationsereignis zwischen dem pIVPA-Plasmid (das die mutagenisierten cDNAs enthält) und der viralen DNA zwischen den gemeinsamen Homologiebereichen, das heißt, der PolyhedrinGenbereich des von dem Rekombinationsereignis abstammenden Virus enthält die mutagenisierte cDNA-Insertion des pIVPA-Plasmids.
Isolierung des Virus, das die die erfindungsgemäßen Proteine codierende Nucleotidsequenz enthält.
Die in den Medien über den transfizierten Zellen vorhandenen Virusnachkommen werden auf frische einlagige Schichten von Zellen in mehreren verschiedenen Verdünnungen zur Plaquebildung transferiert. Die Plaques werden getestet und die Rekombinanten mit einem PIB-minus-Phänotyp, wie nachstehend beschrieben; ausgewählt: Ein Virus, das sein Polyhedrin-Gen verloren hat, wie beispielsweise ein Virus, das eine mutagenisierte cDNA enthält, produziert kein PIB. Scheinbar PIB-defiziente Plaques werden selektiert, ausgeschnitten und auf frischen Zellen vermehrt. Die Zellüberstände werden anschließend auf eine dem t-PA-artige Enzymaktivität getestet. Positive Testergebnisse zeigen an, dass das Glycoprotein tatsächlich produziert wird.
Ein alternatives Reinigungsverfahren für Viren mittels des Plaque-Lifting-Protokolls weicht nur geringfügig von der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise ab und ist nachstehend beschrieben. Die Nachkommen des transfizierten Virus werden in einer geeigneten Verdünnung auf Zellkulturen enthaltende Schalen zur Plaquebildung transferiert. Eine Kopie der einlagigen Schicht von Zellen und der Virus-Plaques werden auf Nitrozellulose hergestellt. Die Agaroseschicht über der Platte wird als Virusquelle aufbewahrt, nachdem die Ergebnisse der nachstehend beschriebenen Schritte erhalten worden sind.
Der Nitrozellulosefilter wird mit radioaktiven DNA-Fragmenten, die dem in das Virus-Genom eingebauten Gen entsprechen, abgesucht. Als positiv werden die gewertet, die das Fremdgen enthalten. Die hybridisierte Sonde wird entfernt. Der Filter wird erneut mit radioaktiver DNA abgesucht, die einem durch Fremd-DNA ersetzten Teil des Virus-Chromosoms entspricht. Als positiv werden die gewertet, die noch ein Polyhedrin-Gen enthalten.
Die hybridisierte Sonde wird entfernt. Der Filter wird mit einem radioaktiven DNA-Fragment, das Virus-Plaques ungeachtet des Status des Polyhedrin-Gens identifizieren kann, erneut abgesucht. Ein geeignetes Fragment kann das EcoRI-Fragment sein. Diese werden als Virus-Nachkommen bewertet. Die Plaques, die für die Fremdgen-DNA-Sonde positiv, für die Polyhedrin-Gen-Sonde negativ und für die Virus-DNA-Sonde positiv sind, werden ausgewählt. Diese weisen, mit großer Wahrscheinlichkeit den gewünschten Genotyp auf.
C. Herstellung und Charakterisierung von Glycoproteinen mit viel Mannose
Antikörper sind verwendet worden, um die Gegenwart der Proteinvarianten in den extrazellulären Medien von infizierten Zellen anzuzeigen. Das wie vorstehend beschrieben produzierte rekombinante Virus wird zur Infektion von Zellen verwendet, die in der üblichen TC-100 (Gibco)-Nährsalzlösung gezüchtet worden sind, die anstelle von 10% fötalem Kälberserum, wie in Standardmedien, mit 50% Eigelb angereichert ist (auf 1% Gesamtvolumen)(ScottBiologicals). Zuvor durchgeführte Experimente hatten gezeigt, daß unter diesen Bedingungen ein unversehrteres Protein erhalten wird. Der Überstand der infizierten Zellen wird auf einer Affinitätssäule fraktioniert, die einen gebundenen monoclonalen Antikörper gegen natürliches menschliches t-PA trägt. Das in dieser Säule spezifisch zurückgehaltene Protein wird eluiert und auf eine t-PA-Enzymaktivität getestet. Eine festgelegte Menge aktiver Einheiten davon und von t-PA-Präparaten als Kontrolle wird auf einem Acrylamidgel getrennt. Dieses Gel wird anschließend mit einem auf Silber basierenden Reagens gefärbt, um das Proteinmuster zu erhalten. Dieses zeigt, daß das Virus nach der Infektion von Insektenzellen ein Protein mit einer t-PAähnlichen Aktivität extrazellulär produziert.
Radioaktiv markiertes Protein wird zur. weiteren Charakterisierung produziert, indem zunächst mit dem Virus (m. o. i=1) infizierte Spodoptera frugiperda-Zellen 48 Stunden. inkubiert werden. Die Kulturplatten werden anschließend mit Methionin-defizienten Medien gewaschen. Mit ³⁵S-Methionin versetzte, Methionin-defiziente Medien werden danach den Kulturplatten zugesetzt. Die Zellkulturen werden 4 Stunden inkubiert. Der das radioaktiv-markierte Glykoprotein enthaltende Überstand kann durch SDS-PAGE (7,5 %) gegen in Insektenzellen analog produziertes Wildtyp-t-PA (d. h., mit vollständiger Länge und vollständig glykosyliert) und gegen Säuger-t-PA, das z. B. durch das Verfahren von R. Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 5 (7) (1985), 1750, produziert wird, allerdings in Gegenwart von Tunicamycin (nicht-glykosyliert), analysiert werden. Die in Beispiel 1 produzierten, partiell glykosylierten, verkürzten Proteine sollten im Vergleich zum vollständig glykosylierten Analogon und dem nicht-glykosylierten Analogon mit vollständiger Länge eine erhöhte Gelmobilität aufweisen.
Beispiel 2
Herstellung weiterer erfindungsgemäßer Proteine
A. Herstellung weiterer cDNAs
Die Mutageneseverfahren von Beispiel 1 können auch mit anderen, in üblicher Weise hergestellten, synthetischen Oligonucleotiden durchgeführt werden, die die ursprüngliche t-PA-DNA-Sequenz modifizieren, wobei Proteine produziert werden, die am N-Terminus und/oder gegebenenfalls an N-Glykosylierungsstellen und/oder am Arg-275 mit den(m) vorstehend beschriebenen, geeigneten Codonaustausch(en) modifiziert sind. Vgl. z. B. "Preparation of Mutagenized cDNAs: M13 Method" und die vorstehend beschriebenen Wege (a) bis (h).
Beispielsweise kann die cDNA, die die Verbindungen D- 6, D-1 und D-3 codiert, unter Verwendung des SacI-Restriktionsfragments in M13/t-PA und durch Mutagenisierung mit den Oligonucleotiden #8, 10 bzw. 12, jedoch ohne das Oligonucleotid #3, hergestellt werden. Arg-275 kann deletiert oder z. B. durch Thr unter Verwendung der Oligonucleotide 14 bzw. 15 ersetzt werden. Die Vektorkonstruktion, Transfektion und Expression kann, wie in Beispiel 1 für Insektenzellen oder, wie nachstehend in Beispiel 3 beschrieben, für Säugerzellen durchgeführt werden.
Eine einzelsträngige DNA, die aus dem wie in Beispiel 1 produzierten M13-Mutagenesevektor (RF-M13/t-PA) erzeugt wird, kann auch als Matrize verwendet werden, um ortsspezifisch Arg-275 und/oder die Glykosylierungsstelle(n) R¹ oder R² oder beide zu mutagenisieren. Der Bereich, der das Asn₂₁₈ enthaltende Konsensus-Tripeptid codiert, kann in ähnlicher Weise mutagenisiert werden. Zur Herstellung mehrerer Modifikationen des Proteins an diesen Stellen kann ein sich wiederholendes Verfahren verwendet werden. Beispielsweise kann im Anschluss an die Identifizierung und Reinigung des M13-Phagen, der eine modifizierte R¹-Stelle enthält, eine einzelsträngige DNA, die diese modifizierte Stelle enthält, von diesem Phagen gereinigt und als Matrize verwendet werden, um eine zweite Runde der Mutagenese innerhalb der R²-Stelle und/oder am Arg-275 zu initiieren. Dieses Verfahren kann wiederholt werden, bis alle gewünschten Modifikationen erhalten werden. Die cDNR, die die Verbindung 2-2/N-21/Arg codiert, kann somit durch das Verfahren von Beispiel 1 hergestellt werden, wobei jedoch das Mutagenese-Oligonucleotid #5 für das Oligonucleotid #3 substituiert ist und das Screening-Oligonucleotid #6 für Oligonucleotid #4. Die cDNA, die die Verbindung 2-6/N-21/Arg codiert, kann durch zweifache Mutagenisierung des SacI-Fragments, wie in Beispiel 1 beschrieben, und eine weitere Mutagenese und Absuchen mit den Oligonucleotiden #5 und #6 hergestellt werden. Die Vektorkonstruktion, Transfektion und Expression werden, wie in Beispiel 1 für Insektenzellen oder, wie nachstehend für Säugerzellen beschrieben, durchgeführt. Vgl. die vorstehend beschriebenen Wege (a) bis (h).
Der RF-M13/t-PA-Mutagenesevektor enthält keine DNA-Sequenz, die R³ codiert, wobei die N-Glykosylierungsstelle von t-PA dem Carboxyterminus des Proteins am nächsten liegt. Daher wurde zur Durchführung von DNA-Modifikationen an dieser Stelle ein neuer M13/t-PA-Mutagenese-RF-Vektor mit der Bezeichnung M13/t-PA:Rl-XmaI hergestellt. Dieser Vektor wurde durch vollständige Spaltung des M13-Vektors M13mpll mit EcoRI und XmaI konstruiert. Der RI/XmaI-gespaltene M13-Vektor wurde mit einem gereinigten EcoRI/XmaI-t-PA-Restriktionsfragment (etwa 439 bp, hier nachstehend als 0,4 kbp bezeichnet) ligiert, das einen die Glykosylierungsstelle R³ umfassenden Polypeptidbereich codiert. Dieses 0,4 kbp-Restriktionsfragment wurde nach der Spaltung des Plasmids pWGSM mit EcoRI und XmaI gereinigt. Das das t-PA-Gen codierende Säuger-Expressionsplasmid pWGSM entspricht innerhalb des 439 bp-EcoRI/XmaI-Fragments dem Plasmid pLDSG, das von Kaufman et al., Mol. Cell Biol. 5 (1985), 1750–1759, beschrieben ist.
Das Ligierungsgemisch wurde zur Transformation kompetenter JM101-Bakterienzellen verwendet. Mehrere Plaques wurden ausgewählt und durch eine übliche DNA-Restriktionsfragmentanalyse auf die Gegenwart des 0,4 kbp-t-PA-EcoRI/XmaI-Fragments getestet. Doppelsträngige RF-M13-DNA wurde aus Zellen, die das 0,4 kbp-t-PA-Fragment enthielten, gereinigt. Diese DNA erhielt die Bezeichnung RF-M13/t-PA RI--XmaI-Mutagenese-Vektor. Wie zuvor in Beispiel 1A beschrieben, kann dieser in kompetente JM101-Zellen transformierte Vektor zur Herstellung eines M13/t-PA RI-XmaI-Phagen verwendet werden, aus dem die einzelsträngige M13/t-PA RI-XmaI-DNA gereinigt werden kann. Diese einzelsträngige DNA kann als Matrize in der ortsspezifischen Mutagenesereaktion verwendet werden, um die t-PA-DNA an der N-Glykosylierungsstelle R³ zu modifizieren.
Sequenzen, die ein modifiziertes R³ codieren, können verwendet werden, um die Wildtyp-R³-Sequenzen zu ersetzen, die entweder im modifizierten pIVPA/I, wie in Beispiel 1 hergestellt (am R¹ und/oder R² verkürzt und/oder modifiziert), oder in der Wildtyp-pIVPA/I-Plasmid-DNA vorhanden sind. Dies kann erreicht werden, indem der am R³ modifizierte M13/t-PA:RI/XmaIMutagenese-Plasmid-Vektor zunächst mit SacI/ApaI vollständig gespalten und das so produzierte am R³ modifizierte 165 bp-t-PA-Restriktionsfragment isoliert wird. Der Insekten-Expressionsvektor pIVPA/I oder die pIVPA/I-Plasmid-DNA, die z. B, wie in Beispiel 1 modifiziert ist, können in ähnlicher Weise mit SacI und ApaI vollständig gespalten werden, um das 165 bp-Wildtyp-t-PA-Restriktionsfragment, das die nicht modifizierte R3-Stelle codiert, auszuschneiden. Durch Ligierung des gereinigten Insekten-Expressionsvektors, dem das 165 bp-Fragment fehlt, mit dem modifizierten 165 bp-R³-Fragment wird ein neuer Insekten-Expressionsvektor erhalten. Durch Expression des Vektors wird ein verkürztes Protein erhalten, das an der R³-Stelle sowie an irgendeiner oder sämtlichen anderen Konsensus-N-Glykosylierungsstellen, die in natürlichem t-PA und/oder am Arg-275 vorhanden sind, modifiziert ist.
Das pIVPA-Plasmid, das die modifizierte cDNA enthält, kann ebenfalls verwendet werden, um das BglII/ApaI-Fragment der modifizierten t-PA-cDNA zu erzeugen, die den Deletionsbereich in der N-terminalen Domäne sowie den R¹, R² und R³ codierenden Bereich umfasst, oder das NarI/XmaI-Fragment, das R¹, R² und R³ umfasst. Jedes dieser Fragmente kann in Säuger-Expressionsvektoren, beispielsweise in pSVPA4 oder pWGSM, wie in Beispiel 3 beschrieben, inseriert werden.
Beispiel 3
Produktion der Verbindungen D-6, D-1 und D-3 in Säugerzellen
A. Herstellung von cDNA
cDNA-Moleküle, die die Polypeptidsequenzen der Verbindungen D-6, D-1 und D-3 codieren, wurden unter Verwendung der Mutagenese-Oligonucleotide #8, 10 bzw. 12 und des SacI-Fragments der t-PA-cDNA als Matrize durch das M13-Verfahren von Beispiel 1 oder durch Heteroduplex-Mutagenese (Moranaga-Heteroduplex-Mutagenesis-Protokoll) (beide, a.a.O.) hergestellt. Durch eine DNA-Sequenzanalyse wurde der Nachweis erbracht, dass Mutanten, die durch DNA-Hybridisierung unter Verwendung der Oligonucleotide 9, 11 bzw. 13 als Sonden selektiert worden waren, eine korrekt modifizierte DNA-Sequenz aufwiesen.
B. Herstellung des modifizierten t-PA-Vektors
Alle in Beispiel 1A hergestellten modifizierten cDNAs (ΔGln117) oder 3A (Δ) wurden zunächst aus dem M13-Mutagenese Vektor RF-M13/t-PA durch vollständige Spaltung des Vektors mit SacI entfernt. Das etwa 1,4 kbp-Restriktionsfragment jeder mutagenisierten cDNA wurde durch Gelelektrophorese gereinigt und anschließend, wie nachstehend beschrieben, mit pSVPA4 ligiert. Zunächst wurde pSVPA4 zur Entfernung des 1,4 kbp-Wildtyp-t-PA-Restriktionsfragments mit SacI gespalten. Der verbliebene Teil von SacI-gespaltenem pSVPA4 wurde anschließend mit dem 1,4 kbp-Restriktionsfragment der mutagenisierten cDNA ligiert. Durch dieses Ligierungsereignis können zwei Orientierungen des inserierten Fragments erhalten werden. Die geeignete Orientierung kann für jeden Fall unter Verwendung von EcoRI und PvuII als Enzyme in einer üblichen analytischen Restriktionsenzym-Analyse ermittelt werden. Durch diesen Austausch kann das SacI-Fragment als Kassettenfragment zwischen dem RF-M13/t-PA-Mutagenesevektor und dem pSVPA4-Säuger-Expressionsvektor verwendet werden. Modifizierte M13-SacI-Fragmente (verkürzt und gegebenenfalls am R¹ und/oder R² modifiziert) können in die SacI-gespaltene pSVPA4-DNA inseriert werden, die, falls erwünscht, zuvor am R³ modifiziert worden ist oder anschließend modifiziert wird. Alternativ kann die zuvor am R¹, R² und/oder R³ modifizierte DNA aus den Vektoren, beispielsweise aus pIVPA oder pSVPA4, als ein NarI/ApaI- oder NarI/XmaI-Fragment ausgeschnitten werden. Das so erhaltene Fragment kann anschließend in Vektoren inseriert werden, beispielsweise in pSVPA4 oder pWGSM, die zuvor mit NarI (partiell) und ApaI oder XmaI (vollständig) gespalten wurden. Durch dieses Verfahren kann jede Kombination von Nterminaler Deletion und/oder Substitution und/oder Mutagenese von Glykosylierungsstellen und/oder einer Mutagenese am Arg-275 erhalten werden.
C. Transfektion von COS-Zellen (SV40-transformierte Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze)
Die COS-1-Zellen (ATCC CRL 1650) wurden durch das Verfahren von M. A. Lopata et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 5707–5717, mit den in Beispiel 3B hergestellten Vektoren, d: h. mit modifiziertem pSVPA4, transfiziert.
Serum-enthaltendes Medium wurde 24 Stunden nach der Transfektion durch Serum freies Medium ausgetauscht und 48 und 72 Stunden nach der Transfektion das konditionierte Medium sowohl auf die Gegenwart der Plasminogenstimulierenden Aktivität unter Verwendung des chromogenen Substrats S-2251 als auch auf die Gegenwart des tPA-Antigens durch einen ELISA-Test untersucht.
D. Virus-Vermehrung in CV1-Zellen (Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze)
Ein modifiziertes komplexes Kohlenhydratprotein kann durch Infektion von CV1-Zellen (ATCC CCL 70) mit SV40-Virus-Stammlösungen, die wie von Gething und Sambrook (Nature 293 (1981), 620–625) beschrieben vermehrt wurden, produziert werden. Dies wurde zunächst durch vollständige Spaltung des modifizierten pSVPA4 mit der Restriktionsendonuclease BamHI durchgeführt, um den bakteriellen Shuttle-Vektor pXf3 von der viralen SV40-DNA zu entfernen. Vor der Transfektion dieser DNA zusammen mit der Helfervirus-SV40-rINS-pBR322-DNA (nachstehend beschrieben) in CVI-Zellen wird die mit BamHI linearisierte SV40/t-PA-DNA durch Ligierung mit verdünnten DNA-Konzentrationen (1 μg/ml) zirkularisiert. Dieses Verfahren wurde mit dem Insulin enthaltenden SV40-Vektor SV40-rINS-pBR322 (M. Horowitz et al., Eukaryotic Viral Vectors (1982), 47–53, Cold Spring Harbor Laboratory) wiederholt. Der bakterielle Shuttle-Vektor pBR322 in SV40-rINS-pBR322 wurde durch vollständige Spaltung mit EcoRI entfernt. Die linearisierte virale Insulin/SV40-DNA wurde anschließend durch Ligierung bei einer DNAKonzentration von 1 μg/ml zirkularisiert. Die transfizierten CV-1-Zellen müssen mit zirkulären ligierten pSVPA4- und SV40rINS-DNAs in äquimolaren Mengen ligiert werden, um einen Virus-Vorrat zu erzeugen. SV40-rINS wird zur Produktion der "späten" SV40-Proteine verwendet, während pSVPA4 die für die Virus-DNA-Produktion erforderlichen, "frühen" SV40-Proteine bereitstellt sowie die erfindungsgemäßen Proteine codiert. Wenn demnach Zellen mit beiden DNAs transfiziert werden, wie von Gething und Sambrook beschrieben, wird, das SV40-Virus produziert, das DNA von jedem Virus-Vektor enthält. Durch eine anschließende Infektion von CVI-Zellen mit dem vermehrten Virus wird ein Protein mit t-PA-artiger Aktivität erhalten, das 72 Stunden nach der Infektion, wie in Beispiel 3C beschrieben, getestet werden kann.
Beispiel 4
Herstellung von weiteren Proteinen
cDNAs, die verschiedene erfindungsgemäße Proteine codieren, sind durch die Verfahren der Beispiele 1, 2 und 3 hergestellt worden. Die BglII/XmaI-Restriktionsfragment-Kassette kann anschließend entweder aus dem pIVPA- oder pSVPA4-Vektor ausgeschnitten werden, der die cDNA enthält, die das verkürzte Protein mit oder ohne Modifikation an einer oder mehreren Glykosylierungsstellen codiert. Das ausgeschnittene BglII/XmaI-Fragment kann anschließend zur Einführung in Säugerzellen mit dem BglII/XmaI-gespaltenen pSVPA4 oder pWGSM ligiert werden. Die Expression derartiger cDNAs in Säuger-Wirtszellen, z. B., durch das Verfahren von Beispiel 3, durch das Verfahren von Kaufman et al., a.a.O., (CHO-Wirtszellen) oder durch das Verfahren von Howley et al., US-Patent Nr. 4,419,446 (1983) (BPV-Expressionssysteme), liefert die entsprechenden, von Säugern stammenden, verkürzten Proteine. So wurde cDNA, die die Verbindung 2-1/N-21/Arg (Δ FBR, G1n₁₁₇) codiert, wie vorstehend beschrieben, hergestellt und in pSVPA4 inseriert. In ähnlicher Weise wurden die cDNAs, die die Verbindungen D-1 (Δ FBR) und D-3 (Δ EGF/FBR) codieren, durch M13-Mutagenese, wie vorstehend beschrieben, hergestellt und als SacI-Fragment in das SacI-gespaltene pSVPA4 inseriert. Die cDNA, die die Verbindung D-6 (Δ EGF) codiert, wurde durch das vorstehend beschriebene Heteroduplexverfahren unter Verwendung von pSVPA4 als Matrize und des MutageneseOligonucleotids #12 und durch Absuchen mit dem Oligonucleotid # 13 hergestellt. Zur Vermehrung und Expression der die Proteine codierenden cDNAs in Säugerzellen wird die in pSVPA4 oder pIVPA enthaltene cDNA als ein BglII/XmaI-Fragment ausgeschnitten und mit dem gereinigten, mit BglII/XmaI-gespaltenen pWGSM ligiert. In jedem Fall wird der erhaltene pWGSM-Vektor in CHO-Zellen eingeführt und durch das Verfahren von Kaufman, a.a.O., vermehrt. Die transformierten und vermehrten CHO-Zellen produzieren die Verbindungen D-6, D-1, D-3 bzw. 2-1/N-21/Arg, die durch menschliche, t-PA-spezifische Antikörper, im Kulturmedium nachgewiesen wurden. Die Verbindungen können anschließend durch Immunaffinitätschromatographie gewonnen und gereinigt werden.
Beispiel 5
Beispiel 4 kann unter Verwendung der cDNA wiederholt werden, die die Proteine codiert, die innerhalb des N-Terminus und/oder am R-275 mit oder ohne Modifikation am R¹, R² und/oder R³ verändert sind, um das gewünschte Protein in CHO-Zellen zu produzieren. Die mutagenisierten cDNAs können, wie vorstehend beschrieben, hergestellt werden. Somit werden die cDNAs, die die Verbindung 2-7/N-21/Arg codieren, wie in Beispiel 2 beschrieben, durch pIVPR hergestellt. Die cDNAs können anschließend als BglII/XmaI-Fragment ausgeschnitten und mit gereinigtem, BglII/XmaI-gespaltenem pWGSM ligiert und der erhaltene Vektor in CHO-Zellen, wie in Beispiel 4, transformiert und vermehrt werden, um die Verbindung 2-7/N-21/Arg herzustellen.

Claims

Thrombolytisches Protein mit Gewebe-Plasminogenaktivator-artiger Aktivität und mit verbessertem fibrinolytischem Profil verglichen mit natürlichem menschlichem t-PA, gekennzeichnet durch eine Peptidsequenz des menschlichen t-PA, welche beide Kringelregionen enthält, wobei mindestens eine der Konsensus-N-Glycosylierungsstellen zu etwas anderem modifiziert ist als zu einer Konsensus-N-Glycosyfierungsstelle und wobei (a) eine oder mehrere Aminosäuren aus der Region Val-4 bis Val-72 entfernt sind; oder (b) eine oder mehrere Aminosäuren in der Region Arg-23 bis Val-72 ersetzt sind; oder (c) die Merkmale (a) und (b) kombiniert sind; oder (d) die Aminosäuren Cys-6 bis Cys-51 entfernt sind; oder (e) die Aminosäuren Cys-51 bis Asp-87 entfernt sind; oder (f) die Aminosäuren Cys-6 bis Ile-86 entfernt sind.
Thrombolytisches Protein nach Anspruch 1(f), wobei die Peptidsequenz Asn-Ser-Ser, welche die Positionen 117 bis 119 in der Peptidsequenz des menschlichen t-PA umfaßt, zu etwas anderem als zu einer Konsensus-N-Glycosylierungsstelle modifiziert ist.
Thrombolytisches Protein nach Anspruch 2, wobei Asn-117 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.
Thrombolytisches Protein nach Anspruch 3, wobei die N-Glycosylierungsstelle an den Positionen 117 bis 119 so modifiziert ist, dass Asn-117 durch Gln ersetzt ist, wobei das thrombolytische Protein an mindestens einer nicht-modifizierten N-Glycosylierungsstelle glycosyliert ist.
Thrombolytisches Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Aminosäure an Position 245 der Peptidsequenz Met oder Val ist.
Thrombolytisches Protein nach Anspruch 5, wobei Arg-275 entfernt oder durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.
Thrombolytisches Protein nach Anspruch 1(f), wobei alle drei N-Giycosylierungsstellen, welche im menschlichen t-PA glycosyliert sind, zu etwas anderem als zu einer Konsensus-N-Glycosylierungsstelle modifiziert sind.
Thrombolytisches Protein nach Anspruch 7, wobei jedes der Asn's an Position 117, 184 und 448 durch unabhängig ausgewählte Ersatzaminosäuren ersetzt ist.
Thrombolytisches Protein nach Anspruch 8, wobei die N-Glyccsylierungsstellen an Positionen 117 bis 119, 184 bis 186 und 448 bis 450 so modifiziert sind, dass Asn-117, Asn-184 und Asn-448 durch Gln ersetzt sind.
Thrombolytisches Protein nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei die Aminosäure an Position 245 der Peptidsequenz Met oder Val ist.
Thrombolytisches Protein nach Anspruch 10, wobei Arg-275 entfernt ist oder durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.
DNA-Molekül, welches ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 11 codiert.
Thrombolytisches Protein mit Gewebe-Plasminogenaktivator-artiger Aktivität, hergestellt durch Expression eines DNA-Moleküls nach Anspruch 12 in einer Wirtszelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Säuger-, Hefe-, Insekten-, Pilz- und Bakterienzellen.
Therapeutische Zusammensetzung zur Behandlung von thrombotischen Zuständen, welche eine wirksame Menge eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 11 im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.