DE3821757A1 - Neue polypeptide, ihre herstellung und verwendung - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Polypeptide mit Plasminogen
aktivatoraktivität, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
bei der Bekämpfung von Krankheiten.
Der humane, gereifte Gewebe-Plasminogenaktivator (tPA) ist ein Polypeptid
aus 527 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von etwa 68 kD (Pennica et al.
1983, Nature 301, 214-221 und Ny et al. 1984, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 81, 5355-5359) (vgl. Abb. 1a-1c). Das Molekül enthält mehrere
distinkte Regionen, sogenannte Domänen, denen verschiedene Funktionen zugeordnet
werden. Der N-Terminus wird durch eine Finger-Region gebildet, die dem
Fibronektin homolog ist. Anschließend folgt eine Region, die Ähnlichkeit
mit mehreren Wachstumsfaktoren besitzt. Im Anschluß daran folgen zwei
Kringel-Domänen. Nach einer Spaltstelle, an der das einkettige Molekül in
zwei Ketten gespalten werden kann, schließt sich die Protease-Domäne an;
diese enthält das aktive Zentrum und besitzt Homologie zu anderen
Serin-Proteasen.
Mehrere Eigenschaften machen das Gewebe-Plasminogenaktivator zu einem
interessanten Molekül: tPA besitzt eine starke Affinität zu Fibrin, die
Plasminogen-Aktivierung ist fibrinabhängig; als Protease spaltet tPA
Plasminogen zu Plasmin, das wiederum Fibrin zu Spaltprodukten abbaut. tPA
ist durch Plasminogenaktivator-Inhibitoren hemmbar. Ferner hat tPA eine
relativ kurze Halbwertzeit; das Molekül wird in der Leber rasch abgebaut.
Diese Faktoren bewirken, daß tPA in vivo spezifisch an Blutgerinnseln
Plasminogen zu Plasmin aktiviert und durch Abbau des Fibrins die Wiederherstellung
des Gefäßstromes bewirkt. tPA kann deshalb in der
fibrinolytischen Therapie, z. B. nach einem Herzinfarkt, eingesetzt
werden.
Es wurde nun gefunden, daß Polypeptide der Formel
A-tPA1-111-X-tPA112-527 ,
worin
tPA1-111 und tPA112-527 die Aminosäuren 1-111 bzw. 112-527 des humanen, gereiften Gewebe-Plasminogenaktivators sind und
A ein Wasserstoffatom oder die Aminosäuresequenz
Ser-Tyr-Ala-Val-Thr-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro-Arg und
X eine der Aminosäuresequenzen
Pro-Trp-Ser-Glu-Trp-Thr-Ser-Cys-Ser-Thr-Ser-Cys-Gly-Asn-Gly-Ala oder
Asn-Pro-Asp-Gln-Ala-Asp-Ser-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Gly-Arg-Gly-Asp-Ala--Cys- Asp-Asp-Ile-Asp-Asn-Asp-Gly-Ile-Pro-Asp-Glu-Asp-Asn-Cys-Pro-Gly-Ala oder
Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Ala oder
eine direkte Bindung bedeuten, wobei jedoch X keine direkte Bindung sein darf, wenn A ein Wasserstoffatom ist, sowie deren Allelvarianten oder Derivate mit am N- und/oder C-Terminus von A und/oder X um ein bis sechs Aminosäuren verkürzten oder verlängerten Sequenzen verbesserte Eigenschaften besitzen.
tPA1-111 und tPA112-527 die Aminosäuren 1-111 bzw. 112-527 des humanen, gereiften Gewebe-Plasminogenaktivators sind und
A ein Wasserstoffatom oder die Aminosäuresequenz
Ser-Tyr-Ala-Val-Thr-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro-Arg und
X eine der Aminosäuresequenzen
Pro-Trp-Ser-Glu-Trp-Thr-Ser-Cys-Ser-Thr-Ser-Cys-Gly-Asn-Gly-Ala oder
Asn-Pro-Asp-Gln-Ala-Asp-Ser-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Gly-Arg-Gly-Asp-Ala--Cys- Asp-Asp-Ile-Asp-Asn-Asp-Gly-Ile-Pro-Asp-Glu-Asp-Asn-Cys-Pro-Gly-Ala oder
Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Ala oder
eine direkte Bindung bedeuten, wobei jedoch X keine direkte Bindung sein darf, wenn A ein Wasserstoffatom ist, sowie deren Allelvarianten oder Derivate mit am N- und/oder C-Terminus von A und/oder X um ein bis sechs Aminosäuren verkürzten oder verlängerten Sequenzen verbesserte Eigenschaften besitzen.
Die neuen Polypeptide sind also am N-Terminus und/oder in der ersten
Kringel-Region verändert.
Die Erfindung betrifft weiter DNA-Sequenzen, die für die mutierten
Polypeptide codieren, sowie Vektoren, die diese DNA-Sequenzen enthalten.
Die neuen Polypeptide lassen sich gentechnisch nach bekannten Verfahren
herstellen. Ausgangspunkt für die hier beschriebenen Konstruktionen ist
ein cDNA-Klon, im folgenden pUCtpa genannt, der die codierende Sequenz von
tPA und noch 5′- und 3′-nicht-translatierte Bereiche enthält. Nach einer
"leader"- und Prosequenz beginnt das reife Protein mit Ser(1) und endet
nach Pro(527).
pUCtPA wird wie folgt isoliert: Aus menschlichem Uterus-Gewebe wird mRNA
isoliert und in doppelsträngige cDNA umgeschrieben. Nach Einsetzen
dieser cDNA in den kommerziell erhältlichen Klonierungsvektor pUC9 wird
eine cDNA-Bibliothek angelegt. Die dabei verwendeten Methoden sind
beispielsweise in Maniatis et al., Molecular Cloning, CSH-press,
nachzulesen. Auch das "screening" solcher Genbanken mit radioaktiv
markierten Oligonukleotidsonden ist inzwischen eine vielfach verwendete
und beschriebene Methode. Nach diesem Verfahren kann ein cDNA-Klon, der
die kodierende Region und angrenzende Bereiche enthält, isoliert werden.
Teile der DNA-Sequenz von PUC9tPA sind mit Hilfe von Restriktionsenzymen
leicht zugänglich. Diese Fragmente, ggf. in Verbindung mit chemisch
synthetisierten Oligonukleotiden, Adaptoren oder Genfragmenten können
benutzt werden, um die DNA-Sequenzen, die für die neuen Polypeptide
codieren, zu klonieren. Der Einbau der Genfragmente bzw. synthetischen
DNA-Sequenzen in Klonierungsvektoren, z. B. die handelsüblichen Plasmide
pBR322, pUC8 oder 9, pUC18 oder 19, M13mp18 oder M13mp19 erfolgt in
bekannter Weise. Auch können die Gene oder Genfragmente mit geeigneten
chemisch synthetisierten oder aus Bakterien, Phagen, Eukaryontenzellen
oder deren Viren isolierten Kontrollregionen versehen werden, die die
Expression der Proteine ermöglichen. Die Transformation bzw. Transfektion
der so erhaltenen Hybridplasmide in geeignete Wirtsorganismen ist
ebenfalls bekannt und eingehend beschrieben. Auch können die Hybridplasmide
mit entsprechenden Signalsequenzen versehen werden, die die
Sekretion der Polypeptide ins Medium erlauben. Bei der Expression in
Säugerzellen kann man Vektoren verwenden, die das zu exprimierende Gen, in
diesem Fall die mutierte tPA-cDNA, unter die Kontrolle des Maus-Metallothionein-
oder des viralen SV40-Promoters setzt. Notwendig für die
Expression ist das Vorliegen des Methionin-Startcodons und der
Leader-/Sequenz des tPA-Gens. Man isoliert dann Klone, die Kopien
dieser Vektoren als Episome oder ins Genom integriert besitzen. Besonders
vorteilhaft sind z. B. die Integration und Expression des Fremdgens auf
der Basis des Rinderpapillom-Virus. In Verbindung mit prokaryontischen
Sequenzen, die für die Replikation in Bakterienzellen und eine
Antibiotika-Resistenz codieren, ist der Aufbau sogenannter "shuttle"-Vektoren
möglich. Konstruktion und Vermehrung des Plasmids erfolgen zunächst in
Bakterienzellen; anschließend erfolgt die Umsetzung in die
Eukaryontenzellen, z. B. in die Maus-Fibroblastenzellinie C127. Es ist
selbstverständlich, daß auch andere Zellsysteme, z. B. Hefe,
Insektenzellen und andere Säugerzellen, wie z. B. CHO-, L- und 293-Zellen,
für die Expression verwendet werden können.
Diese eukaryontischen Expressionssysteme besitzen den Vorteil, daß sie in
der Lage sind, ihre Produkte effektiv und meist in nativer Form zu
sezernieren. Ferner besitzen sie die Fähigkeit, ihre Produkte posttranslational
zu modifizieren. So enthält der Gewebe-Plasminogenaktivator
bei der Expression in Eukaryontenzellen noch Oligosaccharinseitenketten an
den Aminosäuren 117, 184 und 448 (Asn). Die neuen Polypeptide sind an den
entsprechenden Stellen im tPA 112-527-Rest ebenfalls glykosyliert. Die
Feinstruktur der Glykosylreste kann Unterschiede aufweisen, die von der
Art des verwendeten Expressionssystems abhängig sind.
Bakterien sind nicht in der Lage, Oligosaccharidseitenketten zu
synthetisieren. Die meisten in Bakterien exprimierten eukaryontischen
Proteine, wie auch tPA und die von ihr erfindungsgemäß abgeleiteten
Polypeptide, fallen in der Zelle als denaturierte Einschlußkörper an und
müssen proteinchemisch renaturiert werden. Ferner sind Bakterien oft nicht
in der Lage, die Initiatoraminosäure Methionin vom fertigen Protein
abzuspalten. Durch die Verwendung von Sekretionssystemen können diese
Schwierigkeiten umgangen werden.
Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes ist es aber auch möglich,
andere DNA-Sequenzen, z. B. chemisch synthetisierte Gene mit unterschiedlicher
DNA-Sequenz für die Expression der neuen Polypeptide zu benutzen.
Die Reinigung der neuen Polypeptide erfolgt durch deren Abtrennung aus dem
Kulturmedium durch Affinitäts- und Ionenaustausch-Chromatographie nach
bekannten Verfahren.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Polypeptide besitzen eine erhöhte
Gerinnselspezifität, längere Halbwertzeit, verringerte Inhibitorbindung
und/oder größere proteolytische Aktivität und können daher zur Thrombolyse
eingesetzt werden. Sie zeigen dabei verbesserte Eigenschaften gegenüber
humanem Gewebe-Plasminogenaktivator.
Gegenstand der Erfindung sind daher auch Arzneimittel, die mindestens
eines der neuen Polypeptide enthalten, ggf. in einem pharmazeutisch
verträglichen Träger oder Bindemittel. Die Arzneimittel können auch
Kombinationen der neuen Proteine mit anderen Fibrinolytika, wie
Prourokinase, Usrokinase oder Streptokinase oder deren Derivate, sowie mit
anderen Pharmaproteinen, z. B.Superoxiddismutase enthalten. Weitere
Ausgestaltungen der Erfindung sind in den folgenden Beispielen näher
beschrieben. Für gentechnische Methoden sei dazu z. B. auf das Handbuch
von Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory,
1982, verwiesen.
30 g tPA-produzierendes menschliches Uterus-Gewebe wurde in
6 M Guanidiniumthiocyanat, 5 mM Natriumcitrat (pH 7,0), 0,1 M 2-Mercaptoethanol,
0,5% Sarcosyl im Ultra-Turax® aufgeschlossen. Grobe Zelltrümmer
wurden bei 3000 rpm abzentrifugiert. Die RNA wurde durch Zentrifugation
durch ein 5,7 M CsCl-Kissen über Nacht bei 45 000 rpm abgetrennt.
Anschließend wurde die polyA⁺-enthaltende RNA-Fraktion durch Affinitäts
chromatographie an oligo(dT)-Cellulose abgetrennt. Mit Hilfe des Enzyms
AMV-Reverse Transcriptase und oligo(dT)12-18 als Starter wurde die
polyA⁺-RNA in einsträngige cDNA umgeschrieben. Die Synthese des zweiten
Stranges erfolgte mit E.-coli-DNA-Polymerase I. An die doppelsträngige
cDNA wurden mit Hilfe des Enzyms T4-DNA-Ligase SalI-Linker angesetzt. Das
kommerziell erhältliche Plasmid pUC9 wurde mit dem Restriktionsenzym SalI
linearisiert. Beide DNAs wurden miteinander ligiert und mit dem so
erhaltenen Hybrid CaCl₂-behandelte, kompetente Zellen des E.-coli-Stammes
HB101 transformiert. Die Zellen wurden auf LB-Platten mit 100 µg/ml
Ampicillin plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Kolonien
wurden auf Nitrocellulose-Filter übertragen, Replika-plattiert, mit 0,5 N
NaOH/1,5 M NaCl lysiert und die denaturierte DNA durch 2stündiges Backen
bei 80°C fest an den Filter gebunden. Die Filter wurden in 6 × SET-Puffer
(1 × SET = 0,15 M NaCl, 15mM Tris/HCL pH 7,4, 1 mM EDTA), 0,1% SDS und
5×Denhardt's Lösung (100 × Denhardt = 1 g Ficoll, 1 g Polyvinyl
pyrrolidon, 1 g BSA pro 50 ml) für 4 h, bei 68°C vorhybridisiert. Mit
Hilfe eines DNA-Synthesizers wurden drei Oligonukleotid-Sonden, die
jeweils 17 Basen der tPA-DNA umfassen, hergestellt. Sie bestehen aus
folgenden Sequenzen:
Diese Sonden wurden am 5′-Ende mit γ-³²P-ATP markiert. Sie wurden dann mit
den vorhybridisierten Filtern in einer Lösung, die 6 × SET, 0,1% SDS,
5 × Denhardt's und 10% Dextransulfat enthält, über Nacht bei 42°C unter
leichtem Schütteln inkubiert. Die Filter werden danach mehrfach in
6 × SET/0,1% SDS bei 42°C gewaschen, angetrocknet und einem Röntgenfilm
exponiert. Klone, die beim "Screening" eine radioaktive Antwort gaben,
wurden isoliert und weitergezüchtet. Ein Klon, im folgenden pUCtPA
genannt, enthält ein etwa 2,1 kb großes Insert, das die codierende Region,
sowie 5′- und 3-nicht-codierende Bereiche enthält (Abb. 2). Plasmid-DNA
von pUCtPA wurde durch Lysozym-Aufschluß und SDS-Alkali-Behandlung der
Bakterienkultur sowie anschließende CsCl-Gradientenzentrifugation
präpariert.
Ausgangspunkt war das Plasmid pUCtPA. Es wurde präparativ mit BglII
geschnitten (Abb. 3). Anschließend erfolgte eine Behandlung mit
alkalischer Phosphatase.
Mit Hilfe eines DNA-Synthesizers wurden folgende Oligonukleotide
hergestellt und aufgereinigt:
Die Oligonukleotide wurden in einer "annealing"-Reaktion miteinander
hybridisiert und gleichzeitig durch Behandlung mit Polynukleotidkinase
phosphoryliert.
30 ng der vorbereiteten Oligonukleotide wurden dann mit 120 ng der
linearisierten DNA ligiert. Mit dem Gemisch wurden anschließend kompetente
HB101-Zellen transformiert, welche auf ampicillinhaltigem Medium auf
Plasmid-Gegenwart selektiert werden. Aus 2 ml Über-Nacht-Kulturen wurden
als sogenannte "Minilysate" kleine Mengen Plasmid-DNA freigesetzt und mit den
Restriktionsenzymen SacI + XmaIII (Ansatz 1), HaeII (Ansatz 2) oder
XmaIII + HindIII (Ansatz 3) gespalten. Die erhaltenen Fragmente wurden
durch Gelelektrophorese aufgetrennt. Das Vorliegen der korrekten und
einfachen Oligonukleotid-Insertion zeigte sich im Vergleich zur
Ausgangs-DNA durch teilweise veränderte Fragmentgrößen; auch die
Orientierung läßt sich auf diese Weise feststellen. Die abschließende
Untersuchung ist die Analyse der DNA-Sequenz, der Oligonukleotid-Insertion
und der angrenzenden Bereiche (nach Sanger et al. 1977, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 74, 5463-67). Große Mengen Plasmid-DNA eines Kandidaten mit
korrekter und einfacher Insertion wurde durch Aufschluß von 1 l
Über-Nacht-Kultur des betreffenden Stammes gewonnen. Die DNA ("pUCtPA-F")
wurde zweimal über CsCl-Gradienten gereinigt und ausgiebig gegen TE-Puffer
dialysiert.
Ausgangspunkt war das Plasmid pUCtPA. Es wurde präparativ mit den
Restriktionsenzymen BamHI und HindIII gespalten, die 2,1-kb-Bande
gelelektrophoretisch isoliert und diese mit HaeII nachgeschnitten
(Abb. 4). Anschließend erfolgt eine Behandlung mit alkalischer
Phosphatase.
Mit Hilfe eines DNA-Synthesizers wurden folgende Oligonukleotide
hergestellt und aufgereinigt:
Die Oligonukleotide MN 13+14 (Ansatz a), MN 15-18 (Ansatz b),
MN 19+20 (Ansatz c) wurden jeweils in einer "annealing"-Reaktion
miteinander hybridisiert und gleichzeitig durch Behandlung mit
Polynukleotidkinase phosphoryliert.
140 (a) bzw. 160 (b) bzw. 100 ng (c) der vorbereiteten Oligonukleotide
wurden dann mit 200 (a) bzw. 400 ng (b und c) der linearisierten DNA
ligiert. Mit dem Gemisch wurden anschließend kompetente HB101-Zellen
tranformiert, welche auf ampicillinhaltigem Medium auf Plasmid-Gegenwart
selektiert wurden. Aus 2 ml Über-Nacht-Kulturen wurden als sogenannte
"Minilysate" kleine Mengen Plasmid-DNA freigesetzt und mit folgenden
Restriktionsenzymen gespalten:
Ansatz a:
- 1) PstI
- 2) BglII + NcoI
Ansatz b:
- 1) BamHI
- 2) EcoRI + BglII
- 3) EcoRI + BamHI
Ansatz c:
- 1) SphI + BamHI
- 2) PstI
Die erhaltenen Fragmente wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt. Das
Vorliegen der korrekten und einfachen Oligonukleotid-Insertion zeigte sich
im Vergleich zur Ausgangs-DNA durch teilweise veränderte Fragmentgrößen;
auch die Orientierung ließ sich auf diese Weise feststellen. Die
abschließende Untersuchung ist die Analyse der DNA-Sequenz analog
Beispiel 1. Große Mengen Plasmid-DNA jeweils eines Kandidaten mit
korrekter und einfacher Insertion wurden durch Aufschluß von 1 l
Über-Nacht-Kultur des betreffenden Stammes gewonnen. Die DNA
("pUCtPA-C (a), -T (b), -L (c)") wurde zweimal über CsCl-Gradienten
gereinigt und ausgiebig gegen TE-Puffer dialysiert.
DNA des Affenvirus SV40 wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und BclI
geschnitten und das 0,24-kb-Fragment gelelektrophoretisch präpariert
(Abb. 5). Die Enden wurden in Gegenwart der vier Desoxynulkeotidtriphosphate
dATP, dCTP, dGTP und DTTP mit dem Klenow-Fragment der
DNA-Polymerase I aufgefüllt. Anschließend wurden XhoI-Linker anligiert.
Parallel wurde der kommerziell erhältliche Vektor pUC18 mit dem Enzym SmaI
linearisiert. Dann wurden ebenfalls XhoI-Linker angesetzt. DNA dieses
Vektors ("pUC18Xho") wurde mit XhoI linearisiert, mit alkalischer
Phosphatase behandelt und mit dem 0,24 kb XhoI-SV40-Fragment (s. o.)
ligiert. Es entstand pSVpA. pSVpA-DNA wurde präparativ mit XhoI gespalten
und wie oben mit Klenow-Polymerase in Gegenwart der vier dNTPs inkubiert.
Das 0,24-kb-Fragment wurde gelisoliert. Gleichzeitig wurde der
Eukaryonten-Expressionsvektor CL28XhoBPV, entstanden durch Ligation von
CL28X und pB2-2 (nach Reddy et al. 1987, DNA 6, 461-72), partiell mit dem
Restriktionsenzym XbaI geschnitten, d. h. es wurde zeitlich derart
limitiert inkubiert, daß Moleküle entstanden, die nur an einer der beiden
XbaI-Erkennungssequenzen gespalten, also linearisiert sind (Abb. 6). Der
Ansatz wurde dann wie beschrieben mit Klenow-Polymerase und dNTPs
umgesetzt. Die linearen Moleküle wurden anschließend durch
Gelelektrophorese isoliert.
Es erfolgte dann die Ligation der linearen pCL28XhoBPV-Fragmente mit dem
vorbehandelten 0,24-kb-Fragment aus SV40. Nach Transformation und
Screening von Minilysaten wurde ein Klon isoliert, der das SV40-Fragment
in der etwa 0,15 kB 3′-wärts der XhoI-Stelle gelegenen vormaligen
XbaI-Stelle trug; diese DNA ("pCL28XhoBPV-SVpolyA") trug die
SV40-Transkriptionsstopsignale der "frühen" Gene.
Plasmid-DNA von pCL28XhoBPV-SVpolyA wurde mit dem Restriktionsenzym XhoI
linearisiert und mit alkalischer Phosphatase behandelt. Gleichzeitig wurde
pUCtPA-F, -C, -T oder -L (aus den Beispielen 2 und 3) mit dem Enzym SalI
gespalten und das ca. 2,1 kb große Insert präpariert (Abb. 7). Beide
Fragmente wurden mittels T4-Ligase miteinander verbunden. Nach
Transformation und Minilysaten wurde ein Klon isoliert, der die mutierte
tPA-DNA einfach und in der korrekten Orientierung enthielt:
pCL28BPV-tPA-F, -C, -T oder -L.
C127I Zellen (J. Virol. 26 (1978) 292; ATCC catalogue of cell lines and
hybridomas 5th edition, 1985, p142) wurden mit BPV-Expressionsplasmiden
transfiziert mit der Calciumphosphat-Copräzipitationsmethode (Virology 52
(1973)/456, DNA cloning; volume II; ed. D. M. Glover IRL Press,
Seiten 143ff und 213 (1985)). 5×10⁵ C127I-Zellen wurden in DMEM
(Dulbecco's Modified Eagles Medium) +10% FCS (Foetales Kalbsserum) in
60 mm Petrischalen eingesät. Am nächsten Tag wurde das Medium gewechselt
auf MEM (Modified Eagles Medium) mit 25 mM Hepes +10% FCS. Mit 10 µg
CsCl-gereinigter Plasmid DNA wurde ein Ca-Phosphat-Copräzipitat gebildet,
welches vorsichtig auf die C127I-Zellen aufgebracht wurde. Die Zellen
wurden 4 h bei 37°C; 7% CO₂ inkubiert. Durch eine anschließende
Glycerin-Schock-Behandlung wurde die Effizienz der Transfektion erheblich
gesteigert. Hierzu wurde 4 h nach Aufbringen des Präzipitates das Medium
von den Zellen abgezogen. Die Zellen wurden 3 min mit je 2 ml 15%
Glycerin/HBS (DNA cloning Vol. II, Seite 152) pro 60 mm Petrischale bei
Raumtemperatur inkubiert. Die Glycerin-/HBS-Lösung wurde abgezogen, der
Zellrasen mit 3 ml DMEM +10% FCS gewaschen. Die Zellen wurden mit DMEM +10%
FCS bei 37°C; 7% CO₂ inkubiert. Dreimal in der Woche wurde das DMEM
+10% FCS abgezogen und durch frisches ersetzt. Nach 2-3 Wochen waren
transfizierte Zellen, die das BPV-Genom enthalten, als Ansammlungen
transformierte Zellen, sogenannte Foci, zu erkennen. Foci, die die oben
beschriebenen tPA-Muteine exprimieren, wurden durch einen Casein-Agar-Overlay
(siehe unten) identifiziert. Nach 2-3 h Inkubation bei 37°C; 7%
CO₂ waren im trüben Casein-Agar Lysehöfe an den Stellen zu erkennen, an
denen sich tPA-exprimierende Zellen befinden. Nach Entfernen des
Casein-Agar wurden die sich an diesen Stellen befindenden Zellen nach der
"cloning-cylinder"-Methode isoliert (DNA cloning Vol. II, S. 220). Die
erhaltenen Zellinien wurden anschließend mit Standardmethoden in DMEM +10%
FCS hochgezüchtet. Zur Produktion wurden die Zellinien nach Erreichen
der Konfluenz in serumfreien DMEM gehalten.
Für den oben erwähnten Agar Overlay Test werden folgende Lösungen
benötigt:
- 1) 8% Magermilchlösung in H₂O werden 30 min bei 100°C gekocht und anschließend im 37°C-Wasserbad abgekühlt.
- 2) Eine 2%ige Lösung von Low-melting Agarose in PBS wird nach Autoklavieren im 37°C-Wasserbad abgekühlt. Anschließend wird im Verhältnis 1 : 1 doppelt konzentriertes DMEM zugegeben.
- 3) 0,64 mg Plasminogen wird in 1 ml H₂O gelöst. Durch Zusammenpipettieren von 16 ml Lösung 2, 4 ml Lösung 1 und 0,4 ml Plasminogen wird die Overlay Agarose hergestellt. Diese wird nach Mischen im 37°C-Wasserbad gehalten.
Zur Durchführung des Tests werden die Zellen in 60 mm Petrischalen zweimal
mit serumfreiem Medium gewaschen. Anschließend werden je 2 ml
"Overlay-Agarose" vorsichtig in die Petrischalen pipettiert. Die
Petrischalen werden zum Abkühlen und Erstarren der Agarose bei
Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wird 2-3 h im Brutschrank bei
37°C unter Zugabe von 7% CO₂ inkubiert und die Größe und Anzahl der
Lysehöfe bestimmt.
Aus dem gemäß Beispiel 5 erhaltenen serumfreien Zellkulturüberstand wurde
das tPA-Mutein nach Sterilfiltration und Zugabe von 0,01% ®Tween 80 durch
eine Affinitätschromatographie an Erythrina-Trypsin-Inhibitor-Sepharose
(ETI-Sepharose, 1 cm × 3 cm) isoliert. Zur Herstellung der
Affinitätsmatrix wurden 5 mg ETI an 1 ml CNBR-aktivierte Sepharose 4B
gekoppelt. Das Gelmaterial wurde vor dem Auftragen des Zellüberstands mit
20 mM Na-phosphat, 0,15 mM NaCl, 0,01% ®Tween 80, pH 7,0 äquilibriert.
Nach dem Auftragen wurde das Gelmaterial mit demselben Puffer behandelt,
um unspezifisch gebundenes Material zu entfernen. Die Desorption des
spezifisch gebundenen Muteins erfolgte anschließend durch Elution mit
0,1 M Glycin, 0,1 M Arginin/HCl, 0,01% ®Tween 80, pH 3,0. Das Eluat wurde
vereinigt und mit 0,1 M Natronlauge auf pH 5,0 eingestellt.
5-10 µg des gemäß Beispiel 6 erhaltenen Muteins wurden durch SDS-Gelelektrophorese
aufgetrennt und anschließend auf Nitrozellulose-Membranen
transferiert. Nach dem Absättigen mit PBS-Puffer (2 mM Phosphat,
150 mM NaCl, pH 7,4), der 0,1% ®Tween 20, pH 7,4 enthielt, wurde die
Membran 2 h mit an Peroxidase gekoppeltem Lektin von Griffonia
Simplicifolia inkubiert. Nach dem Entfernen ungebundenen Materials mit
Hilfe von TBS-Puffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4) wurde die
Nitrozellulose 5-10 min in 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,02% H₂O₂ und
0,5 mg/ml 4-Chlor-1-naphthol inkubiert. Positive Reaktionen wurden durch
Blaufärbung der Proteinbande innerhalb von 5 min sichtbar. Die Reaktion
wurde dann durch Transferieren der Nitrozellulose-Membran in Wasser
gestoppt.
Die Oligosaccharid-Reste enthalten α-gebundene Galaktose-Reste, die gemäß
Abb. 8 mit β-gebundenen subterminalen Galaktose-Resten verknüpft sind.
Dabei sind die α-Galaktose-Reste bevorzugt an der Galaktose 6′
(Numerierung der Zuckerreste siehe Abb. 8) lokalisiert. Die anderen
subterminalen Galaktose-Reste sind entweder durch Sialinsäure oder weitere
α-gebundene Galaktose substituiert.
Claims (8)
1. Polypeptide der Formel
A-tPA1-111-X-tPA112-527 ,worin
tPA1-111 und tPA112-527 die Aminosäuren 1-111 bzw. 112-527 des humanen, gereiften Gewebe-Plasminogenaktivators sind und
A ein Wasserstoffatom oder die Aminosäuresequenz
Ser-Tyr-Ala-Val-Thr-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro-Arg und
X eine der Aminosäuresequenzen
Pro-Trp-Ser-Glu-Trp-Thr-Ser-Cys-Ser-Thr-Ser-Cys-Gly-Asn-Gly-Ala oder
Asn-Pro-Asp-Gln-Ala-Asp-Ser-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Gly-Arg-Gly-Asp-Ala--Cys- Asp-Asp-Ile-Asp-Asn-Asp-Gly-Ile-Pro-Asp-Glu-Asp-Asn-Cys-Pro-Gly-Ala oder
Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Ala oder
eine direkte Bindung
bedeuten, wobei jedoch X keine direkte Bindung sein darf, wenn A ein Wasserstoffatom ist, sowie deren Allelvarianten oder Derivate mit am N- und/oder C-Terminus von A und/oder X um ein bis sechs Aminosäuren verkürzten oder verlängerten Sequenzen.
tPA1-111 und tPA112-527 die Aminosäuren 1-111 bzw. 112-527 des humanen, gereiften Gewebe-Plasminogenaktivators sind und
A ein Wasserstoffatom oder die Aminosäuresequenz
Ser-Tyr-Ala-Val-Thr-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro-Arg und
X eine der Aminosäuresequenzen
Pro-Trp-Ser-Glu-Trp-Thr-Ser-Cys-Ser-Thr-Ser-Cys-Gly-Asn-Gly-Ala oder
Asn-Pro-Asp-Gln-Ala-Asp-Ser-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Gly-Arg-Gly-Asp-Ala--Cys- Asp-Asp-Ile-Asp-Asn-Asp-Gly-Ile-Pro-Asp-Glu-Asp-Asn-Cys-Pro-Gly-Ala oder
Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Ala oder
eine direkte Bindung
bedeuten, wobei jedoch X keine direkte Bindung sein darf, wenn A ein Wasserstoffatom ist, sowie deren Allelvarianten oder Derivate mit am N- und/oder C-Terminus von A und/oder X um ein bis sechs Aminosäuren verkürzten oder verlängerten Sequenzen.
2. Polypeptide gemäß Anspruch 1 in glykosylierter Form.
3. Polypeptid gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die
Oligosaccharidseitenketten zum Teil terminale α-Galaktosereste tragen.
4. DNA-Sequenzen, die für die Polypeptide gemäß Anspruch 1 kodieren.
5. Vektoren, die Gensequenzen enthalten, die für die Polypeptide gemäß
Anspruch 1 kodieren.
6. Gentechnologisches Verfahren zur Herstellung von Peptidsequenzen nach
Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem Wirtsorganismus
ein Gen zur Expression bringt, das für die Peptidsequenzen nach
Anspruch 1 kodiert.
7. Arzneimittel, enthaltend mindestens ein Polypeptid gemäß Anspruch 1,
gegebenenfalls in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder
Bindemittel.
8. Arzneimittel nach Anspruch 7, enthaltend die Kombination aus
mindestens einem Polypeptid gemäß Anspruch 1 und einem anderen
Fibrinolytikum.
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19883821757 DE3821757A1 (de) | 1988-06-28 | 1988-06-28 | Neue polypeptide, ihre herstellung und verwendung |
EP89107287A EP0340573A3 (de) | 1988-04-30 | 1989-04-22 | Neue Proteine, ihre Herstellung und Verwendung |
JP1109241A JPH0213374A (ja) | 1988-04-30 | 1989-05-01 | 新規な蛋白質、その製法及び用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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DE3821757A1 true DE3821757A1 (de) | 1990-02-08 |
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DE19883821757 Withdrawn DE3821757A1 (de) | 1988-04-30 | 1988-06-28 | Neue polypeptide, ihre herstellung und verwendung |
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-
1988
- 1988-06-28 DE DE19883821757 patent/DE3821757A1/de not_active Withdrawn
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8130 | Withdrawal |