DE3708681C2 - Human-Gewebeplasminogen-Aktivator, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Arzneistoff - Google Patents

Human-Gewebeplasminogen-Aktivator, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Arzneistoff

Info

Publication number
DE3708681C2
DE3708681C2 DE3708681A DE3708681A DE3708681C2 DE 3708681 C2 DE3708681 C2 DE 3708681C2 DE 3708681 A DE3708681 A DE 3708681A DE 3708681 A DE3708681 A DE 3708681A DE 3708681 C2 DE3708681 C2 DE 3708681C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
human tissue
tissue plasminogen
plasminogen activator
amino acid
encoded
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE3708681A
Other languages
English (en)
Other versions
DE3708681A1 (de
Inventor
Adair John Hotchkiss
John Vincent O'connor
Michael Walter Spellman
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genentech Inc
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of DE3708681A1 publication Critical patent/DE3708681A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE3708681C2 publication Critical patent/DE3708681C2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Die Erfindung betrifft neue Human-Gewebeplasminogen-Aktivatoren, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Arzneistoffe, insbesondere als thrombolytisch wirksame Arzneimittel.
Human-Gewebeplasminogen-Aktivator überführt Plasminogen in Plasmin. Das so entstandene Plasmin spaltet proteolytisch das Fibringerüst, aus welchem Blutgerinnsel aufgebaut sind. Der Human-Gewebeplasminogen-Aktivator bewirkt dabei die Auflösung der Blutgerinnsel und eignet sich deshalb zur Behandlung verschiedener thrombolytischer Unregelmäßigkeiten.
Die Abkürzung t-PA für den Human-Gewebeplasminogen-Aktivator entspricht einem Vorschlag des XXVIII. Meeting of the International Committee on Thrombosis and Hemostatis, Bergamo, Italien, vom 27. Juli 1982. Die Ausdrücke "Human- Gewebeplasminogen-Aktivator", "t-PA", "Human-t-PA" oder "Gewebeplasminogen-Aktivator" bezeichnen hier extrinsischen (Gewebetyp) Human-Plasminogenaktivator, der z. B. erhalten wurde aus natürlichen Quellen durch Extraktion und Reinigung (siehe Collen et al., EP-A-41 766; und Rÿken et al., Journal of Biol. Chem., Bd. 256, 7035 (1981)) und mit Hilfe von rekombinanten Zellkultursystemen, welche zusammen mit der Aminosäuresequenz und den physikalischen und biologischen Eigenschaften z. B. in EP-A-93 619 beschrieben sind.
In der US-A-43 26 033 wird über die Verlängerung der Halbwertszeit von Urokinase durch chemische Modifizierung der Kohlenhydratstruktur berichtet. Urokinase ist jedoch immunologisch verschieden von Human-Gewebeplasminogen- Aktivator. Es besteht kein berechtigter Grund, aus der US-A-43 26 033 oder einer anderen Literaturstelle abzuleiten, daß derartige Kohlenhydrat-Modifizierungen von Urokinase auf andere Glykoproteine übertragen werden könnten. Tatsächlich verringert z. B. das Abtrennen von Sialsäure aus Ceruloplasmin dessen Halbwertszeit dramatisch, während der identische Schritt bei Transferin, einem anderen Serum-Glykoprotein, keinen signifikanten Einfluß auf die Halbwertszeit hat (Sharon, Complex Carbohydrates, Addison-Wesley Publ. Co., S. 194-196 (1975); Ashwell et al., Adv. Enzymology, Bd. 41, 99 (1974); und Alexander et al., Science, Bd. 226, 1328 (1984).
In der internationalen Patentanmeldung WO84/01 786 ist eine wahllose Modifizierung von Gewebeplasminogen-Aktivator beschrieben, bei der ein Molekül mit reduzierter biologischer Aktivität und angeblich erhöhter Halbwertszeit im Vergleich zum unmodifizierten Polypeptid entsteht. In dem einzigen Beispiel wird ein teilweise gereinigter Human- Gewebeplasminogen-Aktivator mit Natriumperjodat behandelt, wobei ein Produkt entsteht, das angeblich etwa 70 bis 90% der ursprünglichen (unmodifizierten) Aktivität hat. In der WO84/01 786 findet sich jedoch keine Angabe über die Natur und die Charakterisierung der Kohlenhydratstrukturen, die in dem nativen Material und vor allem in der modifizierten Form vorhanden sind. Bekanntlich modifizieren bzw. zerstören Perjodate durch Oxidation alle Kohlenhydratstrukturen, ohne daß sie gleichzeitig und weitgehend aus der Aminosäurebindung entfernt werden.
In der WO84/01 786 ist auch nicht angegeben, wieviele derartige Strukturen Human-Gewebeplasminogen-Aktivator hat oder welches der tatsächliche Kohlenhydrataufbau in der unmodifizierten oder modifizierten Form ist. Das beschriebene, mit Perjodat behandelte Molekül ist daher höchstwahrscheinlich durch Oxidation aller Kohlenhydratstrukturen wahllos und ohne Zielrichtung auf eine bestimmte Stelle modifiziert worden.
Kürzlich ist berichtet worden, daß die in vivo-Clearance- Geschwindigkeiten von glykosyliertem und deglykosyliertem Human-Gewebeplasminogen-Aktivator nicht signifikant verschieden sind, woraus der Schluß gezogen werden muß, daß die Clearance- Geschwindigkeit von Human-Gewebeplasminogen-Aktivator durch die Abwesenheit von Kohlenhydraten nicht beeinflußt wird (Larsen et al., Proteases in Biological Control and Biotechnology, UCLA Symposium Park City, Utah, 9.-14. Februar 1986; Little et al., Biochemistry, Bd. 23, 6191 (1984)).
Es wurde nun gefunden, daß Human-Gewebeplasminogen-Aktivator am Aminosäurerest 117 eine spezifische Kohlenhydratstruktur aufweist, die erheblich verschieden ist von den Kohlenhydratstrukturen an den Aminosäureresten 184 und 448, und daß man bei der vollständigen Entfernung (oder bis auf die N-Acetylglucosamin-Einheit, die an die Aminosäure Asn gebunden ist) neuartige Human-Gewebeplasminogen-Aktivatoren erhält, die im wesentlichen die volle biologische Aktivität bewahrt haben, jedoch überraschenderweise eine erhöhte in vivo-Halbwertszeit aufweisen.
Gegenstand der Erfindung sind daher neue Human-Gewebeplasminogen- Aktivatoren, die keine funktionelle Kohlenhydratstruktur am Aminosäurerest 117 aufweisen, im übrigen jedoch funktionell unmodifizierte Kohlenhydratstrukturen (an den Aminosäureresten 184 und/oder 448) aufweisen und im wesentlichen die volle biologische Aktivität bewahrt haben, jedoch eine erhöhte in vivo-Halbwertszeit besitzen (jeweils im Vergleich zu "nativem" Human-Gewebeplasminogen-Aktivator mit einer intakten Kohlenhydratstruktur am Aminosäurerest 117).
Gegenstand der Erfindung sind ferner biologisch aktive Human- Gewebeplasminogen-Aktivator-Äquivalente, die sich an einer oder mehreren Aminosäuren der Gesamtsequenz unterscheiden, jedoch dasselbe Kohlenhydratmuster wie die hier speziell genannten neuen Human-Gewebeplasminogen-Aktivatoren aufweisen. Ein derartiges Human-Gewebeplasminogen-Aktivator-Äquivalent ist z. B. eine sogenannte einkettige Mutante, bei der die Spaltungsstelle zwischen den Aminosäuren 275 und 276 durch Eliminierung der von proteolytischen Enzymen erkannten Aminosäuresequenz zerstört worden ist. Die Eliminierung der Sequenz erfolgt durch Ändern spezifischer Aminosäuren, z. B. durch stellengerichtete Mutagenese der zugrundeliegenden DNA- Codons gemäß dem nachstehend beschriebenen Verfahren.
Gegenstand der Erfindung sind schließlich auch die entsprechenden rekombinanten Vektoren, Kulturen sowie Verfahren zur Herstellung der neuen Human-Gewebeplasminogen-Aktivatoren.
In der Zeichnung bedeuten:
Fig. 1 ein Comassie-angefärbtes SAS-PAGE von unbehandeltem (Spur 1) und Endo H-behandeltem (Spur 2) Human- Gewebeplasminogen-Aktivator. Die hochmolekulare Bande ist einkettiger t-PA; die anderen Hauptbanden sind Kringle-Typ I (KI), Kringle-Typ II (KII) und Protease (P);
Fig. 2 zeigt den Glykosidase-Abbau von reduziertem, carboxymethyliertem t-PA. Spur 1: -N-Glykanase; Spur 2: +N-Glykanase; Spur 3: -Endo H; Spur 4: +Endo H. Bandenidentifikation wie in Fig. 1;
Fig. 3 zeigt eine Restriktionskarte des eingesetzten Plasmids pUCPAΔHD;
Fig. 4 zeigt den zeitlichen Verlauf der Änderungen der mit Trichloressigsäure (TCA) ausfällbaren Radioaktivität für Kontroll-Human-Gewebeplasminogen- Aktivator (∎) und Human-Gewebeplasminogen-Aktivator, der dem Endo H-Verfahren ohne Enzym unterzogen worden ist (▲) bzw. Endo H-behandeltem Human- Gewebeplasminogen-Aktivator (⚫). Die Daten bezeichnen das Mittel +/- SA (n = 5);
Fig. 5 zeigt den zeitlichen Verlauf der Änderung der mit Trichloressigsäure (TCA) ausfällbaren Radioaktivität für Kontroll-Human-t-PA (○) und Glutamin117 t-PA ();
Fig. 6 zeigt den zeitlichen Verlauf der Änderung der mit Trichloressigsäure (TCA) ausfällbaren Radioaktivität für Kontroll-Human-t-PA () bzw. Glutamin117- Glutaminsäure275-t-PA (○).
A. Allgemeines
Es wurde gefunden, daß die Kohlenhydratstruktur am Aminosäurerest 117 von Human-Gewebeplasminogen-Aktivator die folgende Zusammensetzung hat:
während die Strukturen an den Aminosäureresten 184 und 448 die folgenden Zusammensetzungen haben:
Abkürzungen
Man = Mannose; Gal = Galactose; Fuc = Fucose; GlcNAc = N-Acetylglucosamin; Sia2 = Sialsäure; R = H oder Sia → 3Gal → 4GlcNAc.
Obwohl die oben gezeigten Strukturen repräsentativ sind für die Typen von N-verknüpften Oligosacchariden, die an Human- Gewebeplasminogen-Aktivator gefunden werden, ist die Erfindung nicht auf diese Struktur beschränkt. Jede Glykosilierungsstelle enthält vermutlich mehrere nahe verwandte, nicht-identische Strukturen. Dies ist als Mikroheterogenität bekannt und stellt ein gemeinsames Charakteristikum von Glykoprotein-Glykanen dar (siehe J. Biol. Chem., Bd. 260, 4046 (1985)). Beispielsweise können Oligosaccharide mit hohem Mannoseanteil hinsichtlich der Anzahl der vorhanden Mannose-Einheiten variieren. In komplexen Oligosacchariden kann die Mikroheterogenität in einem unterschiedlichen Verzweigungsgrad sowie einer unterschiedlichen Anzahl von Sialsäure-, Fucose-, Galactose- und N-Acetylglucosamin-Resten zum Ausdruck kommen. Auch eine derartige Mikroheterogenität wird von der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Die einen hohen Mannoseanteil enthaltende Struktur an der Aminosäure 117 erwies sich als einzigartig, nicht nur in der Struktur gegenüber den komplexeren Strukturen an den Aminosäureresten 184 und 448, sondern auch hinsichtlich der Tatsache, daß ihre vollständige funktionelle Entfernung ohne gleichzeitige funktionelle Modifizierung der Strukturen an den Positionen 184 und 448 einen voll biologisch aktiven Human-Gewebeplasminogen-Aktivator mit erhöhter in vivo- Halbwertszeit ergab.
Das Entfernen der funktionellen Kohlenhydratstruktur am Aminosäurerest 117 bedeutet ein vollständiges Entfernen, wie wenn das Glykosylierungssignal durch stellenspezifische Mutagenese wie hierin beschrieben zerstört wird, oder ein substantielles Entfernen, wie bei der Behandlung mit Endoglycosidase, bei der z. B. ein intakter N-Acetylglucosaminrest an Asn117 gebunden zurückbleibt. Eine funktionell unmodifizierte Kohlenhydratstruktur an den Aminosäureresten 184 und/oder 448 bedeutet entweder die Bewahrung der intakten Struktur(en) oder im wesentlichen der gesamten Struktur(en), so daß sie dem nativen Protein funktionell äquivalent sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Entfernen der funktionellen Kohlenhydratstruktur am Aminosäurerest 117 durch stellenspezifische Mutagenese der zugrundeliegenden DNA des Glykosylierungssignals Asn-X-Ser/Thr, wobei X eine beliebige Aminosäure sein kann. Im Falle des Gewebeplasminogen-Aktivators ist die dieses Signal repräsentierende Sequenz Asn117 (Ser118) Ser119. Das Entfernen der funktionellen Kohlenhydratstruktur am Aminosäurerest 117 gelingt daher z. B. durch Mutagenisieren der Codons, die diesen Aminosäureresten entsprechen, und Zerstören der Signalfunktionalität. Im einzelnen kann die Mutagenese an repräsentativen Codons des Signals durchgeführt werden, so daß z. B. ein Human-Gewebeplasminogen-Aktivator entsteht, der einen von Asparagin (Asn) verschiedenen Aminosäurerest in Position 117 und/oder einen von Serin (Ser) oder Threonin (Thr) verschiedenen Aminosäurerest in Position 119 oder ein Prolin (Pro) in Position 118 aufweist. In den am meisten bevorzugten Ausführungsformen ist Asparagin117 aufgrund der engen strukturellen Ähnlichkeit durch Glutamin ersetzt oder Serin119 ist angesichts der analogen Sequenz im zweiten Kringle-Bereich durch Methionin ersetzt.
Die Mutagenese erfolgt nach an sich bekannten Methoden, wie sie z. B. bei Zoller et al., Methods in Enzymology, Bd. 10, 468 (1983) beschrieben sind. Beispielsweise erhält man durch Abändern des für Asparagin kodierenden Codons AAC in Position 117 in CAA oder CAG (wozu zwei Nukleotid-Änderungen erforderlich sind) ein Expressionsprodukt, das Glutamin in Position 117 enthält. Andere, hier mögliche Mutationen ergeben sich aus einer Analyse des genetischen Codes.
Ein alternatives Verfahren zum Entfernen der funktionellen Kohlenhydratstruktur am Aminosäurerest 117 besteht in der Verwendung einer Endoglykosidase, wie Endoglykosidase H, die befähigt ist die Kohlenhydratstruktur mit hohem Mannoseanteil am Aminosäurerest 117 (Asn) ohne funktionelle Beeinflussung der komplexen Strukturen an den Aminosäureresten 184 und 448 (im wesentlichen) zu entfernen. Auch diese Behandlung erfolgt nach an sich bekannten Methoden, wie sie z. B. bei Tarentino et al., J. Biol. Chem., Bd. 249, 811 (1974) und Trimble et al., Anal. Biochem., Bd. 141, 515 (1984) beschrieben sind.
B. Beispiele Beispiel 1
Durch stellenspezifische Mutagenese wird auf die nachstehend beschriebene Weise ein Expressionsvektor hergestellt, der für Gewebeplasminogen-Aktivator mit dem Aminosäurerest Glutamin in Position 117 codierende DNA in funktionswirksamer Weise enthält:
A. Oligonucleotid-Aufbau
Ein 24-mer-Oligonucleotid mit der Sequenz 5′-TGC-ACC-AAC-TGG- C*A*A*-AGC-AGC-GCG-3′ (24-mer-Q117) wird nach der Phosphotriester-Methode von Crea et al., Nucleic Acids Research, Bd. 8, 2331 (1980) hergestellt. Die Sternchen bezeichnen das mutante (Asn → Gln) Codon.
B. Herstellung eines rekombinanten M13-Templates
Das Plasmid PuCPAΔHD (Fig. 3) ist ein Derivat des Plasmids pETPFR (auch als pPADHFR-6 bezeichnet und in der EP-A-93 619 beschrieben) mit den folgenden Modifikationen:
  • 1) 166 bp (Basenpaare) der 5′-untranslatierten DNA sind vom 5′-Ende des t-Pa-Gens unter Verwendung der Exonuklease Bal 31 abgeschnitten worden;
  • 2) An das neue 5′-Ende des t-PA-Gens ist eine Hind III-Stelle angefügt worden;
  • 3) Ein Polylinker, der Erkennungsstellen für EcoRI, Sac I, Sma I, Bam HI, Xba I, Sal I und Pvu II enthält, ist an das 5′-Ende des SV40-frühen-Promotors angefügt worden, der die t-PA-Expression betreibt;
  • 4) Die Hind III-Stelle in Position 3539 von pETPFR ist durch eine Klenow-fill-in-Reaktion zerstört worden.
Das Plasmid pUCPAΔHD (Fig. 3) wird mit Sma I verdaut und das ca. 2,0 kb-Fragment, welches das t-PA-Gen über das Codon Nr. 507 enthält, wird durch PAGE und Elektroelution des Fragments aus dem Gel isoliert. Der Vektor M13mp10 (Messing, Methods in Enzymology, Bd. 101, 20 (1983)) wird ebenfalls mit Sma I verdaut, einmal mit Phenol, Chloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und in 50 mM Tris pH 8,0, 1 m MEDIA (TE) resuspendiert. Das ca. 2,0 kb-Fragment aus pUCPAΔHD wird in das Sma I-geschnittene M13mp10 unter Verwendung von T4 DNA-Ligase eingefügt und die erhaltene DNA wird zur Transformation von E. coli JM101 verwendet. Der erhaltene Phage wird isoliert und die Anwesenheit des Inserts wird verifiziert. Seine Orientierung wird durch Restriktionsanalyse von Phagen-Minipräparationen bestimmt. Ein rekombinanter Phage, M13/t-Pa-Sma, wird als Template für die anschließende Mutagenese ausgewählt.
C. Mutagenese-Reaktion
Der Mutagenese-Primer (24-mer-Q117) wird zu einer einzelsträngigen M13/t-PA-Sma-DNA verknüpft und mit E. coli DNA-Polymerase-Klenow-Fragment in Gegenwart von dNTPs und T4-DNA-Ligase behandelt, wobei in vitro Heteroduplex-RF- Moleküle entstehen (siehe Adelman et al., DNA, Bd. 2, 183 (1983)). Mit diesen Molekülen wird der E. Coli-Stamm JM101 (ATCC 33 876) transformiert und der Phage, der die gewünschte Mutation aufweist, wird durch Plaque-Hybridisierung unter Verwendung des Mutagenese-Primers als Sonde nachgewiesen (siehe Adelmann et al., DNA, Bd. 2, 183 (1983)). Ein mutanter Phage wird isoliert und als M13/t-PA-Sma-Gln117 bezeichnet.
D. Subklonierung der Gln117-t-PA-Mutante in das Expressionsplasmid pUCPAΔHD
Doppelsträngige DNA des Phagens M13/t-PA-Sma-Gln117 wird mit SmaI, BglII und ApaI verdaut, worauf man das ca. 1,4 kb- Fragment durch PAGE reinigt. Das Fragment wird dann dazu verwendet, das entsprechende Fragment in pUCPAΔHD zu ersetzen.
Rekombinante Plasmide, die das t-PA-Genfragment enthalten, werden identifiziert. Die Plasmide M119 und Q117 werden in CHO-Zellen mit DHFR-Mangel (Urlab et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 77, 4216 (1980)) wie folgt eingeführt und vermehrt:
  • 1) Die Plasmid-DNA wird in die Zellen nach der Calciumphosphat-Fällungsmethode von Graham et al., J. Virol., Bd. 52, 455 (1973) eingeführt;
  • 2) Kolonien, die in einem selektiven Medium wachsen (Medium, das kein Hypoxanthin, Glycin und Thymidin enthält, -HGT) werden indirekt auf t-PA-Expression untersucht, indem man die Plasminbildung nachweist, anhand des Abbaus von Fibrin in einer Agarplatte, die Fibrin und Plasminogen enthält (Granellia et al., J. Exp. Med., Bd. 148, 223 (1978);
  • 3) Fünf der am stärksten positiven Klone werden quantitativ in einem ELISA-Assay auf die pro Zelle sekretierte t-PA-Menge untersucht;
  • 4) Das Klon, daß das meiste t-PA sekretiert, wird in Methotrexat (MTX)-Platten wie folgt eingebracht: 2 × 105 Zellen werden in 100 mm-Platten eingebracht, die 50, 100 bzw. 250 nM MTX enthalten;
  • 5) Fünf Klone, die in MTX wachsen, werden extrahiert und quantitativ (mit ELISA) wie in Schritt 3) ausgewertet;
  • 6) Das Klon, das das meiste t-PA sekretiert, wird wie in Schritt 4) in Platten mit höheren MTX-Konzentrationen eingebracht, worauf man einen quantitativen Assay von fünf darauf wachsenden Klonen durchführt und den besten t-PA- Produzenten selektiert.
Das beschriebene Vermehrungs- und Screening-Verfahren wird wiederholt, bis bei der erhaltenen Zellinie keine Zunahme der t-PA-Produktion mehr zu beobachten ist, und die entsprechende t-PA-Mutante wird zur Verwendung abgetrennt.
Beispiel 2
Ein ähnliches Verfahren wie in Beispiel 1 wird angewandt, um die entsprechende Met119-Mutante unter Verwendung eines 24-mer mit der Sequenz 5′-CC-AAC-TGG-AAC-AGC-A*T*G*-GCG-TTG- G-3′ (24-mer M119) herzustellen, wobei pUCPAΔHD M119 erhalten wird. Die Herstellung der entsprechenden M119-Mutante durch Expression erfolgt wie in Beispiel 1.
Beispiel 3
Eine Glutamin117-Glutaminsäure275-t-PA-Mutante wird folgendermaßen hergestellt:
Das wie oben erhaltene Plasmid pUCPAΔHD wird mit Bgl II und Sca I verdaut und das ca. 763 bp-Fragment, das den Codons 1 bis 254 der Gewebeplasminogen-Aktivator-DNA-Sequenz entspricht, wird auf übliche Weise auf SDA-PAGE gereinigt.
Human-t-PA-DNA wird aus den Plasmiden pPADHFR-6 (auch als pETPFR bezeichnet) und pA25E10 erhalten. Die Herstellung dieser beiden t-PA-Plasmide ist in der EP-A-93 619 beschrieben.
Das Plasmid pA25E10 enthält Sequenzen, die für die letzten 508 Aminosäuren des t-PA-Gens codieren und 772 Basenpaare des 3′-nicht-translatierten Bereichs. Dieses Plasmid wird mit SacI und BglII verdaut, wobei ein 744 bp-Fragment entsteht, das nach den vorstehend beschriebenen üblichen Methoden isoliert wird. Dieses Fragment enthält die Codone für die t-PA-Aminosäuren 411 bis 527 und einen Teil des 3′-nicht- translatierten Bereichs.
Das Plasmid pPADHFR-6 enthält das gesamte Strukturgen für t-PA und einen Teil des 3′-nicht-translatierten Bereichs. Diese Plasmid wird mit SacI und BglII verdaut, wobei ein 1230 bp-Fragment entsteht das isoliert wird. Dieses Fragment enthält Codone für die ersten 410 Aminosäuren der reifen Form von t-PA.
Diese Fragmente werden nach üblichen Methoden miteinander verknüpft und mit BglII verdaut. Ein 1974 bp-Fragment, das Codone für die gesamte reife t-PA-Sequenz plus einen Teil des 3′-nicht-translatierten Bereichs enthält, wird isoliert. Doppelsträngiges M13mp8 (Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules Recombinant DNA, Editor A. Walter, Elsevier, Amsterdam (1981), S. 143) wird mit BamHI verdaut und mit der BglII-verdauten t-PA unter Bildung von M13mp8PABglII verknüpft. E. Coli JM101-Zellen (ATCC 33 876) werden mit der doppelsträngigen replikativen Form von M13mp8PABglII transformiert. Die einzelsträngigen und doppelsträngigen (RF) Formen von M13mp8PABglII werden aus E. coli JM101-Zellen isoliert, die mit diesem Phagen infiziert wurden. Die einzelsträngige Form wird für die stellenspezifische Mutagenese von t-PA verwendet.
Das Human-t-PA-Strukturgen wird durch stellenspezifische Mutagenese modifiziert, um t-PA mit Aminosäure-Substitutionen an verschiedenen Positionen zu exprimieren. Ein synthetisches Oligonucleotid wird auf diese Weise nach der Festphasen- Phosphotriestermethode von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 75, 5765 (1978) hergestellt und für die stellenspezifische Mutagenese verwendet:
Mit Hilfe des allgemeinen Verfahrens von Adelman et al., DNA, Bd. 2, 183 (1983) wird ein t-PA-Klon hergestellt, das die mutierte Sequenz des synthetischen Primers enthält. Das mutierte t-PA-Klon M13RF2C9 wird unter Verwendung des Primers, der die oben genannte Mutation für eine einzige Aminosäure enthält, erzeugt.
In dem Plasmid pPADHFR-6 (auch als pETPFR bezeichnet; siehe EP-A-93 619) wird die Expression des nativen t-PA-Strukturgens von dem frühen Promotor für SV40 T-Antigen kontrolliert. Dieser Promotor regelt auch die Expression des DHFR-Gens. Ein Vektorfragment 1 wird erhalten durch Isolieren des großen Fragments, das beim Verdauen von pPADHFR-6 mit BglII und BstEII entsteht. Ein anderes Fragment 2 wird erhalten durch Isolieren des 400 bp-t-PA-Fragments, das beim Verdauen von pPADHFR-6 mit BglII und BstXI entsteht. Ein 1141 bp-t-PA-Fragment 3, das die gewünschte Mutation enthält, wird erhalten durch Verdauen von RF-DNA aus dem mutanten t-PA-Klon M13RF2C9 mit BstXI und BstEII. Die Fragmente 1 und 2 werden mit dem Fragment 3 verknüpft. Das DNA-Gemisch wird dazu verwendet, E. coli zu transformieren, wobei ein eukaryotischer Expressionsvektor pPADHFR-6 2C9 erhalten wird.
Das auf die oben genannte Weise hergestellte und in der EP-A-1 99 574 beschriebene Plasmid pPADHFR-6 2C9 enthält eine DNA-Sequenz, die für die Glutaminsäure275-Gewebeplasminogen- Aktivator-Mutante codiert. Das Plasmid wird mit ScaI und ApaI verdaut und das ca. 630 bp-Fragment, das den Codonen 254 bis 466 der Gewebeplasminogen-Aktivator-DNA-Sequenz entspricht, wird auf übliche Weise auf SDS-PAGE gereinigt.
Die beiden BglII-ScaI-(pUCPAΔHD) und ScaI-ApaI-(pPADHFR-6 2C9)-Fragmente werden mit dem großen BglII (531 bp)-ApaI (1926 bp)-Fragment aus verdautem pUCPAΔHD verknüpft und das erhaltene Plasmid, das Glutamin117-Glutaminsäure275-t-PA- Mutanten-DNA enthält, wird auf übliche Weise gescreent. Das erhaltene Plasmid wird in die oben beschriebenen CHO-Zellen mit DHFR-Mangel eingeschleust und vermehrt und die entsprechende t-PA-Mutante wird zur Verwendung abgetrennt.
Beispiel 4
Die Aminosäuresequenz von t-PA umfaßt vier potentielle N-verknüpfte Glykosylierungsstellen [Asn-X-Ser/Thr; Ann. Rev. Biochem., Bd. 41, 673 (1972)]. Dieses sind die Asparaginreste 117, 184, 218 und 448 (Nature, Bd. 301, 214 (1983)). Es wurde jedoch gefunden, daß die Position 218 des t-PA nicht glykosyliert ist. Die Position 184 ist in t-PA-Typ I glykosyliert, jedoch nicht in t-PA-Typ II (Biochemistry, Bd. 23, 3701 (1984)).
Bei der Gelfiltrationschromatographie von mit Pronase verdautem t-PA werden zwei Klassen von N-verknüpften Oligosacchariden aufgelöst (Tabelle 1). Die Zusammensetzung des höhermolekularen Materials stimmt überein mit fucosylierten komplexen Oligosacchariden. Das niedermolekulare Material hat die erwartete Zusammensetzung für ein kleines Oligosaccharid mit hohem Mannoseanteil (vermutlich Man6GlcNac2).
Die Bindungsstelle des Oligosaccharids mit hohem Mannoseanteil wird unter Verwendung von glykosidischen Enzymen von unterschiedlicher Spezifität bestimmt. Die verwendeten Enzyme sind endo-β-N-Acetylglucosaminidase H (Endo H; Genzyme Inc.), welche die Oligosaccharide mit hohem Mannoseanteil entfernt, jedoch keinen Einfluß auf die komplexartigen Oligosaccharide ausübt, und Peptid-N-glykosidase F (N-Glykanase; Genzyme Inc.), welche sowohl Oligosaccharide mit hohem Mannoseanteil als auch die komplexartigen Oligosaccharide abtrennt. Der für diese Experimente verwendete t-PA wird mit Plasmin in die zweikettige Form überführt und dann reduziert und carboxymethyliert.
Mit SDS-PAGE wird der reduzierte carboxymethylierte zweikettige rt-PA in Kringle-Typ I (Glykosylierung in Position 117 und 184), Kringle-Typ II (Glykosylierung in Position 117) und Protease (Glykosylierung in Position 448) aufgetrennt. Beim Verdauen des t-PA mit N-Glykanase fließen die Kringle- Banden in einer Position von etwas größerer Mobilität als Kringle-Typ II zusammen und es wird auch eine erhöhte Mobilität der Protease beobachtet (Spur 2, Fig. 2). Die Verdauung von t-PA mit Endo H erhöht die elektrophoretische Mobilität jeder Kringle-Bande, hat jedoch keinen Einfluß auf die Mobilität der Protease-Bande (Spur 4, Fig. 2). Das Endo H-Ergebnisse zeigt, daß die Kringle-Typen I und II jeweils ein Oligosaccharid mit hohem Mannoseanteil enthalten und zwar in der Position 117, da dies die einzige Stelle ist, an der sowohl der Kringle-Typ I als auch der Typ II glykosyliert sind. Die Endo H-Behandlung überführt den Kringle-Typ I nicht in den Typ II. Deshalb enthält der Rest 184, der in Typ I, nicht jedoch in Type II glykosyliert ist, ein komplexes Oligosaccharid. Die Position 448 muß ebenfalls eine komplexe Struktur enthalten, da die N-Glykanase-Behandlung die Mobilität des Proteaseteils von rt-PA erhöht, während Endo H keinen Effekt zeigt.
Tabelle 1
Kohlenhydrat-Zusammensetzung der Oligosaccharid-Fraktionen aus Pronase-verdautem t-PAa
Beispiel 5
Es wird Endo-β-N-Acetylglucosaminidase H (Endo H) von der Genzyme Inc. eingesetzt. Die SDS-PAGE wird wie bei Laemmli, Nature, Bd. 227, 680 (1970) beschrieben durchgeführt. 0,8 mg Human-Gewebeplasminogen-Aktivator (hergestellt gemäß EP-A-93 619) in 0,2 ml Formulierungspuffer, der aus 0,2 M Argininphosphat (pH 6) besteht und 0,01% Tween 80 enthält, wird mit Endo H (0,1 Einheit in 0,05 ml 25 mM Natriumphosphat, pH 6) und Natriumazid (0,02%) vermischt. Die Probe wird 20 Stunden bei 37°C inkubiert. Eine Human-Gewebeplasminogen- Aktivator-Kontrollprobe wird hergestellt und auf dieselbe Weise inkubiert, jedoch verwendet man 0,05 ml 25 mM Natriumphosphatpuffer anstelle der Endo H-Lösung. Nach der Inkubation werden die Proben mit Formulierungspuffer auf ein Gesamtvolumen von 0,75 ml verdünnt und in demselben Formulierungspuffer ausgiebig dialysiert. Die Proben werden filtriert (0,4 µm HV-Filter von Amicon) und bei 4°C aufbewahrt.
Nach der Reduktion und Carboxymethylierung wird die Deglykosylierung durch SDS-PAGE überwacht. Aliquote des erhaltenen Human-Gewebeplasminogen-Aktivators (0,05 mg in 0,01 ml Formulierungspuffer) werden mit 25 mM Natriumphosphatpuffer von pH 6 (0,015 ml) und 2 × Laemmli- Puffer, der 20 mM Dithiothreit enthält (0,025 ml), vermischt. Die Proben werden 5 Minuten auf 95°C erhitzt und dann abgekühlt. Jodessigsäure (0,015 ml einer 0,67 M Lösung in 1 N NH4OH) wird zugegeben und die Proben werden 3 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die reduzierten, carboxymethylierten Proben werden durch SDS-PAGE analysiert.
Bei dieser Analyse trennt sich der unbehandelte, zweikettige Kontroll-Human-Gewebeplasminogen-Aktivator in drei hauptsächliche Banden, die dem Kringle-Typ I (Glykosylierung in Position 117 und 184), Kringle-Typ II (Glykosylierung in Position 117) und Protease (Spur 1, Fig. 1) entsprechen. Die Endo H-Verdauung von Human-Gewebeplasminogen-Aktivator erhöht die elektrophoretische Mobilität jeder Kringle-Bande, hat jedoch keinen Einfluß auf die Mobilität der Protease-Bande (Spur 2, Fig. 1).
Die fibrinolytische Aktivität des Endo H-behandelten Human- Gewebeplasminogen-Aktivators wird durch den in vitro- Gerinnsel-Auflösungsassay von Collen et al., J. Clin. Path., Bd. 21, 705 (1968) untersucht. Die Aktivität des Endo H- behandelten Human-Gewebeplasminogen-Aktivators ist in diesem Assay von der der unbehandelten Kontrolle nicht unterscheidbar.
Proben von Human-Gewebeplasminogen werden nach dem Iodobead- Verfahren (Markwell, Anal. Biochem., Bd. 125, 427 (1982)) auf eine spezifische Aktivität von ca. 2 µCi/µg jodiert. Als Puffer wird stets 0,2 M Arginin, 0,1 M Citrat (pH 6,0) und 0,01% Tween 80 verwendet. Alle Proben werden vor der Jodierung in diesem Puffer dialysiert. Der pH wird vor der Jodierung mit Tris-Base auf 8,2 eingestellt. Das Jodierungsgemisch wird durch eine PD-10-Kolonne (Pharmacia) geleitet, die mit pH 6,0-Puffer äquilibriert ist, worauf man die radioaktiven Fraktionen aus dem Leervolumen sammelt, einen SDS-PAGE durchführt und das getrocknete Gel einer Autoradiographie unterwirft. Die Autoradiographie der markierten Human-Gewebeplasminogen-Aktivatoren zeigt, daß mehr als 95% der Radioaktivität in den Human- Gewebeplasminogen-Aktivator eingebaut sind.
Jeder markierte Human-Gewebeplasminogen-Aktivator wird mit nicht-markiertem Material in einem Verhältnis von 1 : 200 (markiert : unmarkiert; G/G) vermischt und als Bolus in Kaninchen injiziert, die einen Arterienkatheder im Ohr hatten. Jedes Kaninchen erhält 1 mg/kg unmarkierten und 10 µCi/kg markierten Human-Gewebeplasminogen-Aktivator. Der unmarkierte Human-Gewebeplasminogen-Aktivator wird als Träger für die Spurenmenge von markiertem Human-Gewebeplasminogen-Aktivator verwendet, um therapeutische Dosen zu erzielen und Änderungen in der Pharmakokinetik zu vermeiden, die durch eine Konzentrationsabhängigkeit der Clearance-Wege hervorgerufen werden könnten. Innerhalb einer Zeitspanne von 26 Minuten entnommene arterielle Blutproben werden sofort in Röhrchen eingebracht, die ein lyophilisiertes Gemisch aus D-Phe-Pro- Arg-Chlormethylketen (PPACK) und EDTA in Endkonzentrationen von 1 µM bzw. 4,8 mM enthalten. Die Röhrchen werden auf Eis gelegt und das Plasma wird abgetrennt. Der mit Trichloressigsäure (TCA) ausfällbare Anteil (intakter Human- Gewebeplasminogen-Aktivator) und die Gesamtradioaktivität werden bei jeder Plasmaprobe gemessen. Der immunreaktive Human-Gewebeplasminogen-Aktivator wird ebenfalls nach einer ELISA-Sandwichmethode unter Verwendung von polyklonalen Antikörpern bei einer effektiven Empfindlichkeit von mindestens 30 ng/ml bestimmt.
Zwei Typen von Daten werden bei den in vivo-Clearance- Untersuchungen an Kaninchen erhalten. Ein Datentyp stammt von dem immunreaktiven Human-Gewebeplasminogen-Aktivator und sollte ein Maß für die Clearance des unmarkierten Materials sein. Der zweite Datentyp ist die mit TCA ausfällbare Radioaktivität, die mehr als 95% des intakten Human- Gewebeplasminogen-Aktivators ausmacht. Die aus der Immunreaktivität und der TCA-Niederschlagszählung ermittelten Kurven der Plasmakonzentration gegen die Zeit werden an die geeigneten multiexponentiellen Modelle angepaßt und die abgeleiteten pahrmakokinetischen Parameter werden verglichen.
Beispiel 6 Pharmakokinetik des Endo-H-behandelten Human-Gewebeplasminogen-Aktivators
Die pharmakokinetischen Profile des Endo-H-behandelten Human- Gewebeplasminogen-Aktivators, des Kontroll-Human- Gewebeplasminogen-Aktivators und einer zweiten Kontrolle von Human-Gewebeplasminogen-Aktivator, der unter denselben Reaktionsbedingungen wie der Endo-H-behandelte Human- Gewebeplasminogen-Aktivator unterworfen wurde, jedoch in Abwesenheit des Enzyms, sind in Fig. 4 gezeigt. Die im wesentlichen identischen Profile der beiden Kontrollen zeigen, daß die zum Abtrennen des einfachen Zuckers in Position 117 erforderlichen Manipulationen zu der Änderung der Clearance des Human-Gewebeplasminogen-Aktivators nicht beitragen. Der Endo-H-behandelte Human-Gewebeplasminogen-Aktivator wird viel langsamer gecleart. Eine Analyse der Daten zeigt, daß eine Erhöhung der α-Phasen-Clearance-Geschwindigkeit zusätzlich zu einer Erhöhung der 0-Zeit-extrapulierten Konzentration für die β-Phase vorliegt. Der Endo-H-behandelte Human- Gewebeplasminogen-Aktivator zeigt eine erhöhte Bioverfügbarkeit, wie sich aus dem Integral des Produkts von Zeit und Konzentration ergibt. Dies stellt ein relativ annahmefreies Maß für die Bioverfügbarkeit dar (Fläche unter der Kurve), welche durch Endo H-Behandlung um einen Faktor von etwa 2 erhöht wird.
Jede Testgruppe erhält eine Trägerdosis von unmarkiertem Human-Gewebeplasminogen-Aktivator. In allen Fällen unterscheiden sich die pharmakokinetischen Profile des unmarkierten Human-Gewebeplasminogen-Aktivators nicht von den getesteten Gruppen. Dies dient der internen Kontrolle, um zu bestätigen, daß die für die jeweilige Gruppe ausgewählten Kaninchen nicht zufällig ungewöhnliche Clearance-Eigenschaften besitzen.
Pharmakokinetik von Gln117 t-PA- und Gln117Glu275 t-PA- Mutanten
Die Pharmakokinetik von Glutamin117 t-PA und Kontroll-Human- t-PA ist in Fig. 5 gezeigt. Der Glutamin117 t-PA wird viel langsamer gecleart als die Kontrolle.
Ein ähnliches Profil zeigt der Glutamin117-Glutaminsäure275 t-PA (hergestellt gemäß Beispiel 3) wie aus Fig. 6 hervorgeht.
Fibrin-Bindungseigenschaften
Die Fibrinbindung ist ein äußerst wichtiger Faktor, der vermutlich in direkter Beziehung zu der Fibrinspezifität steht, welche Human-Gewebeplasminogen-Aktivator in vivo besitzt. Die Fibrinbindung des Endo H-behandelten Human- Gewebeplasminogen-Aktivators wird nach zwei Methoden bestimmt. Bei der ersten Methode wird Human-Gewebeplasminogen-Aktivator durch Fibrin eingefangen, das in einer Mulde einer Standard- Mikrotiterplatte aufgetragen ist. Jede Mulde wird dann gewaschen und eine Lösung von Plasminogen und einem chromogenen Substrat für Plasmin (S-2251, Kabi) wird zugegeben. Die entwickelte Farbe ist proportional zur Menge des Human-Gewebeplasminogen-Aktivators, der im ersten Schritt eingefangen wird (Angles-Cano, Thrombosis and Haemostasis, Bd. 54, 171 (1985)). Bei der zweiten Methode zur Bestimmung der Fibrinbindung wird die Menge an Human-Gewebeplasminogen- Aktivator gemessen (durch ELISA), die in der Lösung zurückbleibt, wenn Thrombin zu einer Lösung von Plasminogenfreiem Fibrinogen und Human-Gewebeplasminogen-Aktivator gegeben wird (Rÿken et al., J. Biol. Chem., Bd. 257, 292 (1982)). Derzeit ist nicht bekannt, welche dieser Methoden die in vivo-Konsequenzen der geänderten Human- Gewebeplasminogen-Aktivator-Fibrinbindung geeignet voraussagt. Auf Basis der Daten jeder Methode kann jedoch geschlossen werden, daß der Endo H-behandelte Human-Gewebeplasminogen- Aktivator eine zumindest unveränderte, wenn nicht verbesserte Fibrinspezifität hat.
In ähnlicher Weise zeigen Fibrinbindungs-Testdaten des Glutamin117-Glutaminsäure275-t-PA aus Beispiel 3, daß der Glutamin117-Glutaminsäure275-t-PA hinsichtlich der Fibrinstimulierung und der spezifischen Aktivität dem Glutaminsäure275-t-PA ähnlich und der t-PA-Kontrolle überlegen ist.
Beispiel 7
Die Gln117- und Met119-Mutanten, die wie in den Beispielen 1 und 2 hergestellt wurden, werden mit ähnlichen Ergebnissen wie das Endo H-behandelte Material auf ihre fibrinolytische Aktivität getestet. Ihre Pharmakokinetik im Vergleich zu den oben beschriebenen Kontroll-Human-Gewebeplasminogen- Aktivatoren ist ebenfalls ähnlich dem Endo H-behandelten Material.
Beispiel 8 Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können nach bekannten Methoden zu pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden, wobei der Human-Gewebeplasminogen-Aktivator mit geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Trägern kombiniert wird. Geeignete Träger und ihre Formulierung, einschließlich von anderen Humanproteinen, wie Human-Serumalbumin, sind z. B. in Remington's Pharmaceutical Sciences von E. W. Martin beschrieben. Diese Zusammensetzungen enthalten eine wirksame Menge des erfindungsgemäßen Proteins zusammen mit einer geeigneten Menge eines Trägers, die eine Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung an den Patienten ermöglicht.
Der Human-Gewebeplasminogen-Aktivator kann z. B. parenteral Patienten appliziert werden, die an cardiovaskulären Störungen oder Krankheiten leiden. Die Dosierung und Dosisrate können ähnlich gewählt werden, wie sie derzeit bei klinischen Untersuchungen anderer cardiovaskulärer thrombolytischer Mittel angewandt werden, z. B. etwa 1 bis 2 mg/kg Körpergewicht als intravenöse oder intraarterielle Dosis über 1,5 bis 12 Stunden bei Patienten, die z. B. an Herzinfarkt oder Lungenembolie leiden.
Als Beispiel für eine geeignete Dosierungsform kann eine Ampulle angegeben werden, die 50 mg Human-Gewebeplasminogen- Aktivator, Arginin, Phosphorsäure und Polysorbat 80 enthält, mit 50 ml sterilem Wasser für die Injektion rekonstituiert und mit einem geeigneten Volumen 0,9% Natriumchloridlösung vermischt werden kann.
Die verlängerte Halbwertszeit des erfindungsgemäßen Human- Gewebeplasminogen-Aktivators ist ein Vorteil für die schnelle i. v.-Injektion. Es sind keine komplizierten Verabfolgungsmaßnahmen notwendig, so daß die Möglichkeit der Verwendung von t-PA an Orten mit beschränkter medizinischer Ausrüstung erhöht wird, z. B. in Notfall-Fahrzeugen ohne Vollmediziner in der Mannschaft. Eine verlängerte Halbwertszeit des Human-Gewebeplasminogen-Aktivators kann auch niedrigere und sicherere Anfangsdosen ermöglichen und die thrombolytisch wirksame Plasminkonzentration über bis zu 45 Minuten oder länger aufrechterhalten. Eine längere Halbwertszeit von Human-Gewebeplasminogen-Aktivator kann auch für eine Langzeittherapie mit geringen Dosen nützlich sein, die z. B. geboten sein kann, um eine Reokklusion nach erfolgreicher akuter Thrombolyse zu vermeiden, oder für eine längere Thrombolyse-Behandlung im Falle eines peripheren Gefäßverschlusses.

Claims (14)

1. Human-Gewebeplasminogen-Aktivator, der
  • a) keine funktionelle Kohlenhydratstruktur am Aminosäurerest 117 aufweist,
  • b) im übrigen funktionell unmodifizierte Kohlenhydratstrukturen aufweist,
  • c) im wesentlichen die volle biologische Aktivität bewahrt und
  • d) eine erhöhte in vivo-Halbwertszeit besitzt.
2. Human-Gewebeplasminogen-Aktivator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er in Position 117 eine von Asparagin verschiedene Aminosäure enthält.
3. Human-Gewebeplasminogen-Aktivator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er in Position 119 eine von Serin oder Threonin verschiedene Aminosäure enthält.
4. Human-Gewebeplasminogen-Aktivator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er in Position 117 Glutamin enthält.
5. Human-Gewebeplasminogen-Aktivator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er in Position 119 Methionin enthält.
6. Human-Gewebeplasminogen-Aktivator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er in Position 118 Prolin enthält.
7. Mutagenisierter einkettiger Human-Gewebeplasminogen- Aktivator nach Anspruch 1.
8. Human-Gewebeplasminongen-Aktivator nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß er in Position 117 Glutamin und in Position 275 Glutaminsäure enthält.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen Human- Gewebeplasminogen-Aktivator nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
10. Verfahren zur Herstellung eines Human-Gewebeplasminogen- Aktivators, der im wesentlichen die volle biologische Aktivität bewahrt hat und eine erhöhte in vivo- Halbwertszeit aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß man die funktionelle Kohlenhydratstruktur am Aminosäurerest 117 entfernt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Human-Gewebeplasminogen-Aktivator hergestellt wird durch rekombinante DNA-Expression von DNA, die für den Human-Gewebeplasminogen-Aktivator codiert und in Position 117 ein Codon aufweist, das für eine andere Aminosäure als Asparagin codiert, oder in Position 119 ein Codon aufweist, das für eine andere Aminosäure als Serin oder Threonin codiert.
12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Human-Gewebeplasminogen-Aktivator hergestellt wird durch rekombinante DNA-Expression von DNA, die für den Human-Gewebeplasminogen-Aktivator codiert und in Position 117 ein für Glutamin codierendes Codon aufweist.
13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Human-Gewebeplasminogen-Aktivator hergestellt wird durch rekombinante DNA-Expression von DNA, die für den Human-Gewebeplasminogen-Aktivator codiert und in Position 119 ein für Methionin codierendes Codon aufweist.
14. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Human-Gewebeplasminogen-Aktivator hergestellt wird durch rekombinante DNA-Expression von DNA, die für den Human-Gewebeplasminogen-Aktivator codiert und in Position 117 ein für Glutamin codierendes Codon und in Position 275 ein für Glutaminsäure codierendes Codon aufweist.
DE3708681A 1986-03-18 1987-03-17 Human-Gewebeplasminogen-Aktivator, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Arzneistoff Expired - Lifetime DE3708681C2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US84107586A 1986-03-18 1986-03-18
US2189387A 1987-03-04 1987-03-04

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3708681A1 DE3708681A1 (de) 1987-10-01
DE3708681C2 true DE3708681C2 (de) 1995-08-17

Family

ID=26695219

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE3708681A Expired - Lifetime DE3708681C2 (de) 1986-03-18 1987-03-17 Human-Gewebeplasminogen-Aktivator, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Arzneistoff
DE3751842T Expired - Lifetime DE3751842T2 (de) 1986-03-18 1987-03-17 Modifizierter, menschlicher Gewebeplasminogenaktivator und seine Herstellung

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE3751842T Expired - Lifetime DE3751842T2 (de) 1986-03-18 1987-03-17 Modifizierter, menschlicher Gewebeplasminogenaktivator und seine Herstellung

Country Status (19)

Country Link
EP (1) EP0238304B1 (de)
JP (1) JP2972812B2 (de)
AT (1) ATE139569T1 (de)
AU (1) AU602510B2 (de)
CA (1) CA1341597C (de)
DD (1) DD258999A5 (de)
DE (2) DE3708681C2 (de)
DK (1) DK175490B1 (de)
ES (1) ES2088860T3 (de)
FI (1) FI100802B (de)
FR (1) FR2597883B1 (de)
GB (1) GB2189249B (de)
GR (1) GR3020850T3 (de)
HU (1) HU202276B (de)
IE (1) IE81073B1 (de)
IL (1) IL81937A (de)
NO (1) NO172133C (de)
NZ (1) NZ219654A (de)
PT (1) PT84493B (de)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH660742A5 (de) * 1982-10-29 1987-06-15 Mitsui Toatsu Chemicals Plasminogen-aktivator, verfahren zu seiner herstellung und diesen enthaltendes thrombolytisches agens.
FI89723C (fi) * 1984-10-01 1993-11-10 Genzyme Corp Foerfarande foer framstaellning av vaevnadsplasminogenaktivator, kodande rekombinant-dna daerav och en transformanscell
US5108909A (en) * 1985-03-22 1992-04-28 Chiron Corporation Expression of TPA in mammalian cells
AU605124B2 (en) * 1985-12-23 1991-01-10 Behringwerke Aktiengesellschaft Novel peptide plasminogen activators
JP2527454B2 (ja) * 1986-01-31 1996-08-21 ジェネティックス・インスチチュ−ト・インコ−ポレ−テッド 新しい血栓溶解タンパク質
US4927630A (en) * 1986-02-26 1990-05-22 Monsanto Company Tissue plasminogen activator from normal human colon cells
US4851517A (en) * 1986-02-26 1989-07-25 Monsanto Company Tissue plasminogen activator oligosaccharide from normal human colon cells
JPH084501B2 (ja) * 1987-03-20 1996-01-24 エーザイ株式会社 糖鎖に関する変異ｔＰＡ
EP0293934B1 (de) * 1987-06-04 1994-08-31 Zymogenetics, Inc. Mutierter t-PA mit Kringle-Ersatz
AU615919B2 (en) * 1987-07-01 1991-10-17 Beecham Group Plc Hybrid plasminogen activators
US5244676A (en) * 1987-10-09 1993-09-14 Monsanto Company Modified tissue plasminogen activator with modified glycosylation site
IL88247A0 (en) * 1987-11-06 1989-06-30 Genentech Inc Novel human tissue-type plasminogen activator variant
US5270198A (en) * 1988-05-20 1993-12-14 Genentech, Inc. DNA molecules encoding variants of tissue plasminogen activators, vectors, and host cells
IL90146A (en) * 1988-05-20 1994-10-07 Genentech Inc Glycosylation derivatives of tissue plasminogen activator
US5346824A (en) * 1988-05-20 1994-09-13 Genentech, Inc. DNA encoding variants of tissue plasminogen activators and expression vectors and hosts thereof
US5262170A (en) * 1988-09-02 1993-11-16 Genentech, Inc. Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties and substituted at amino acid positions 296-299, DNA molecules encoding them, vectors, and host cells
US5714145A (en) * 1988-09-02 1998-02-03 Genentech, Inc. Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties
US5108901A (en) * 1988-09-02 1992-04-28 Genentech, Inc. Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties
DE3841296A1 (de) * 1988-12-08 1990-06-13 Bosch Gmbh Robert Antiblockierregelsystem
US5070021A (en) * 1989-01-10 1991-12-03 Monsanto Company Method of modifying oligosaccharide structure of tissue plasminogen activator
US5242688A (en) * 1990-12-24 1993-09-07 Eli Lilly And Company Method of treating thromboembolic disorders by administration of diglycosylated t-pa variants
US5223408A (en) * 1991-07-11 1993-06-29 Genentech, Inc. Method for making variant secreted proteins with altered properties
EP0786257B1 (de) * 1992-06-03 2003-07-30 Genentech, Inc. Varianten des Gewebeplasminogenaktivators mit verbesserter therapeutischer Wirkung
US6706504B1 (en) 1996-11-12 2004-03-16 The Scripps Research Institute Tissue type plasminogen activator (t-PA) variants: compositions and methods of use
DE60032349T2 (de) 1999-04-26 2007-07-12 Genentech, Inc., South San Francisco Zellenzuchtverfahren für glycoproteine
US7084118B2 (en) 2002-02-22 2006-08-01 Genentech, Inc. Combination treatment with t-PA variant and low molecular weight heparin

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX197183A (es) * 1982-05-05 1994-02-28 Genentech Inc Activador de plasminogeno de tejido humano
EP0125254A1 (de) * 1982-10-28 1984-11-21 Beecham Group Plc Enzymderivate und deren verwendung bei der behandlung von trombosen
EP0125269A1 (de) * 1982-11-11 1984-11-21 Beecham Group Plc Pharmazeutisch aktive verbindungen
FI89723C (fi) * 1984-10-01 1993-11-10 Genzyme Corp Foerfarande foer framstaellning av vaevnadsplasminogenaktivator, kodande rekombinant-dna daerav och en transformanscell
JPS61247384A (ja) * 1984-10-18 1986-11-04 チモ−ジエネテイツクス　インコ−ポレ−テツド 酵母中でプラスミノ−ゲン活性化因子を発現する方法
DE3537176C2 (de) * 1984-10-18 1994-06-09 Zymogenetics Inc Gewebeplasminogenaktivator und Verfahren zu seiner Herstellung
PT82429B (pt) * 1985-04-22 1988-03-03 Genentech Inc Novos mutantes do activador de plasmionogenio de tecido humano
JPH0811066B2 (ja) * 1985-09-30 1996-02-07 インテグレーテッド・ジエネティックス・インコーポレーテッド 組換えｄｎａが生産するヒト子宮プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−
GB8528321D0 (en) * 1985-11-18 1985-12-24 Ciba Geigy Ag Modified fibrinolytic agents
AU605124B2 (en) * 1985-12-23 1991-01-10 Behringwerke Aktiengesellschaft Novel peptide plasminogen activators
JP2527454B2 (ja) * 1986-01-31 1996-08-21 ジェネティックス・インスチチュ−ト・インコ−ポレ−テッド 新しい血栓溶解タンパク質

Also Published As

Publication number Publication date
ES2088860T3 (es) 1996-10-01
NO871086D0 (no) 1987-03-17
IE870691L (en) 1987-09-18
DE3751842T2 (de) 1996-11-28
DE3751842D1 (de) 1996-07-25
FI871175A (fi) 1987-09-19
FI871175A0 (fi) 1987-03-18
GR3020850T3 (en) 1996-11-30
EP0238304A2 (de) 1987-09-23
NZ219654A (en) 1990-08-28
DK135887A (da) 1987-09-19
FI100802B (fi) 1998-02-27
AU7008887A (en) 1987-09-24
EP0238304A3 (en) 1988-07-06
ATE139569T1 (de) 1996-07-15
IE81073B1 (en) 2000-01-12
PT84493A (en) 1987-04-01
CA1341597C (en) 2009-06-23
HUT43108A (en) 1987-09-28
HU202276B (en) 1991-02-28
DD258999A5 (de) 1988-08-10
IL81937A0 (en) 1987-10-20
GB8706249D0 (en) 1987-04-23
FR2597883B1 (fr) 1990-04-20
IL81937A (en) 1994-07-31
JPS62282582A (ja) 1987-12-08
JP2972812B2 (ja) 1999-11-08
NO172133B (no) 1993-03-01
AU602510B2 (en) 1990-10-18
DE3708681A1 (de) 1987-10-01
DK135887D0 (da) 1987-03-17
FR2597883A1 (fr) 1987-10-30
GB2189249B (en) 1990-10-31
NO172133C (no) 1993-06-09
NO871086L (no) 1987-09-21
PT84493B (pt) 1989-11-10
EP0238304B1 (de) 1996-06-19
DK175490B1 (da) 2004-11-08
GB2189249A (en) 1987-10-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3708681C2 (de) Human-Gewebeplasminogen-Aktivator, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Arzneistoff
DE69126205T2 (de) Oxidationsresistente analoga des thrombomodulins
EP0382174B1 (de) Gewebs-Plasminogenaktivator-Derivat
DE69004966T2 (de) Antikoagulierendes protein.
DE69032600T2 (de) Rekombinanter abkömmling des menschlichen faktors iii
DE69333727T2 (de) Protein-C-Derivat
DE69006851T2 (de) Blutgerinnungshemmende zusammensetzungen aus faktor xa.
DE69333491T2 (de) Protease-Resistant Thrombomodulin Analogs
DE69032029T2 (de) Hybrides protein c
DE3853100T2 (de) Gewebs-Plasminogen-Aktivator-Analoge mit modifizierten Wachstumsfaktordomänen.
DE69132889T2 (de) Überlegende thrombomodulinanaloga zur pharmazeutischen verwendung
WO1999015196A1 (de) Pharmazeutisches präparat enthaltend vitamin k-abhängige einzelfaktoren
DE69226580T2 (de) Hemmstoff der Kollagen-induzierten Plättchenaggregation
DE69328992T2 (de) Mutanten von menschlichem Antithrombin III
DE3855874T2 (de) Neue variante von menschlichem gewebeplasminogenaktivator
EP0677107B1 (de) Thrombininhibitor aus speichel von protostomiern
DE69321134T2 (de) Plasminogen-derivate die durch thrombin aktivierbar sind
EP0361475A1 (de) Präparat von in Prokaryonten exprimiertem Plasminogenaktivator
DE4442665A1 (de) Chimäre Proteine mit fibrinolytischen und thrombinhemmenden Eigenschaften
DE4440892A1 (de) Proteine mit fibrinolytischen und gerinnungshemmenden Eigenschaften
DE3854195T2 (de) Polypeptid-verbindungen.
EP0400545B1 (de) Gewebs-Plasminogen-Aktivator-Derivat
WO1999009185A1 (de) Plasminogenaktivator mit verbesserter zymogenität

Legal Events

Date Code Title Description
8110 Request for examination paragraph 44
D2 Grant after examination
8328 Change in the person/name/address of the agent

Free format text: BARZ, P., DIPL.-CHEM. DR.RER.NAT., PAT.-ANW., 80803 MUENCHEN

8364 No opposition during term of opposition